JP7530461B1 - 観察装置および観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を非染色で観察することができる観察装置を提供する。
【解決手段】観察装置１Ａは、光源１１、ミラー２２、コンデンサレンズ２４、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、撮像部４３および解析部５０などを備える。解析部５０は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させ、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得し、これらの干渉強度画像に基づいて所要の処理をすることにより観察対象物の位相微分画像を求める。
【選択図】図１

Description

本発明は、観察装置および観察方法に関するものである。

近年、スフェロイドやオルガノイドと呼ばれる３次元の細胞組織を作製する技術が進歩している。また、これらの３次元細胞組織を創薬や再生医療などに応用する研究が進んでいる。これらの３次元細胞組織は光学的に透明な多重散乱体である。このような光学的に透明な散乱体をイメージングする技術として、これまでに多種多様な手法が提案されている。そのうち蛍光プローブを用いるイメージング技術としては、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡が挙げられる。

多光子顕微鏡は、蛍光プローブを励起し得る光の波長の整数倍の波長の励起光を観察対象物に照射することで、多重散乱や収差の影響を低減し得るものであり、深達度が高く、この点では好ましい。しかし、観察対象物を蛍光プローブで標識する必要があることから、この点では好ましくない。一方、蛍光プローブを用いない非染色・非侵襲のイメージング技術としては、光コヒーレンス・トモグラフィ（Optical Coherence Tomography、ＯＣＴ）などが知られている。

スフェロイドやオルガノイドなどのような観察対象物については非染色・非侵襲のイメージングが望まれる場合が多いものの、これらの観察対象物のイメージングにＯＣＴが適用されたという報告例は多くない。その理由としては、ＯＣＴによるイメージングの分解能が低いこと、および、ＯＣＴによるイメージングにより得られた信号の解釈が難しいこと、が考えられる。したがって、現時点では、ゴールドスタンダードとなりうる非染色の３次元細胞組織のイメージング技術は確立されていないと言ってよい。

観察対象物の光路長を非染色・非侵襲でイメージングすることができる技術として、定量位相イメージング（Quantitative Phase Imaging、ＱＰＩ）も知られている。ＱＰＩは、観察対象物（例えば細胞）の光路長という物理的な情報を取得することができることから、生物分野で応用が進んでいる。ＱＰＩにより取得した画像を用いて、微分干渉画像や位相差顕微鏡画像などの他の種類の画像を生成することができる。ＱＰＩは、情報量が比較的多い画像を取得することができる技術であり、従来の明視野画像を用いた解析よりハイコンテントな解析にも適用することができると期待されている。また、近年の機械学習による画像認識精度の向上により非染色のイメージング技術を使ったハイコンテントな解析が盛んに研究されており、今後、多重散乱体の非染色イメージングは重要な役割を担うことが期待される。しかし、ＱＰＩは、取得される画像があくまで光路長の２次元への投影であるので、真の３次元の構造を把握できない。

また、観察対象物の光路長を非染色・非侵襲でイメージングすることができる技術として、特許文献１に記載されている光回折トモグラフィ（Optical Diffraction Tomography、ＯＤＴ）も知られている。ＯＤＴは、ＱＰＩを３次元イメージング可能な技術に発展させたものであり、観察対象物の３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。ＯＤＴを用いて細胞観察を行うことにより、細胞核やミトコンドリアなどの細胞小器官の同定が可能になり、また、３次元的な形態変化の追跡が可能になって、ＱＰＩより更にハイコンテントな解析ができることが期待されている。

特開２０１７－２１９８２６号公報

Pritam Pai, et al, "Optical transmissionmatrix measurement sampled on a dense hexagonal lattice," OSA Continuum,Vol.3, No.3, pp.637-648 (2020). Duygu Akbulut, et al,"Optical transmission matrix as a probe of the photonic strength,"PHYSICAL REVIEW A 94, 043817 (2016). Elbert G. van Putten, at al."The information age in optics: Measuring the transmission matrix", ［online］，［令和４年１２月２１日検索］，インターネット＜URL：https://physics.aps.org/articles/v3/22?referer=apshome＞

しかしながら、従来のＯＤＴは、数個からなる細胞の観察に適用され得るものの、上記のような３次元細胞組織などの多重散乱体の観察には適用が困難である。何故なら、従来のＯＤＴでは、観察対象物で生じる多重散乱光が多い場合に、取得される画像に多重散乱光の影響が大きく現れるからである。

光の散乱とは、光が対象物と相互作用することによって光の進行方向が変えられる現象をいう。特に対象物の屈折率の空間的な不均一さが増大すると、光は対象物を通過する間に対象物と多数回相互作用するようになる。このように対象物と多数回相互作用した光は多重散乱光と呼ばれる。これに対して、対象物と一回のみ相互作用した光は単一散乱光と呼ばれる。多重散乱光は、スペックルの増大および単一散乱-多重散乱比（Single-scattering to Multi-scatteringRatio、ＳＭＲ）の悪化の原因となり、測定の障壁となることが知られている。

スペックルは、光が時間的かつ空間的にコヒーレントである場合に、多重散乱光の干渉によって空間的に強度または位相の大きな変化が引き起こされることにより生じる。スペックル発生を抑制するには、時間的または空間的にインコヒーレントである光を出力する光源を用いればよい。例えば、位相差顕微鏡などの通常の明視野顕微鏡は、ハロゲンランプや発光ダイオードなどの空間的かつ時間的にインコヒーレントな光源を用いることで、スペックルのない画像を取得している。

ＳＭＲの悪化は、単一散乱光よりも多重散乱光が支配的になって、単一散乱光が多重散乱光の中に埋もれてしまうことにより生じる。観察対象物が大きくなって観察深度が深いほど、単一散乱光の成分は指数関数的に減少する一方で、これと対照的に多重散乱光の成分が増大する。単一散乱光は、その散乱方向が対象物の構造と直接的な対応関係を持っていることから、対象物の構造の測定に用いやすい。一方で、多重散乱光は、対象物の構造との関係が複雑であり、対象物の構造の情報を抽出することが難しい。それ故、単一散乱光を利用したイメージング技術では、多重散乱光の中に単一散乱光が埋もれると（すなわち、ＳＭＲが悪化すると）測定が失敗することが知られている。

ＳＭＲ悪化の抑制は、単一散乱光および多重散乱光のうち単一散乱光を選択的に検出するゲーティングと呼ばれる技術により可能である。ゲーティングにより多重散乱光が抑制されるので、ＳＭＲ悪化の抑制と同時にスペックルの抑制も可能である。ゲーティングは、空間、時間および偏光などの自由度を用いて実現される。共焦点顕微鏡は、空間的ゲーティングの一例である。ＯＣＴは、時間的および空間的なゲーティングの一例である。

従来のＯＤＴは、多重散乱光の影響を除去していないことから、観察対象物で生じる多重散乱光が多い場合に、取得される画像においてスペックルが増大し、また、ＳＭＲが悪化する。それ故、従来のＯＤＴは、多重散乱光の発生が少ない数個からなる細胞の観察に適用され得るものの、多重散乱光の発生が多い３次元細胞組織などの多重散乱体の観察には適用が困難である。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を非染色で観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。

本発明の観察装置の第１態様は、(1) 複数の光照射方向それぞれに沿って光が照射された観察対象物の干渉強度画像を取得する干渉強度画像取得部と、(2) 複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する複素振幅画像生成部と、(3) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、観察対象物が存在しない場合の第１面上の各位置ｒ_inの光の波面に対して、観察対象物が存在する場合の第１面と同じ第２面上の各位置ｒ_outの光の波面を関係づけるトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）を生成するトランスミッション行列生成部と、(4) トランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）に基づいて、Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）とＴ_rr ^*（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）との要素ごとの積であるＣ（ｒ_out；ｒ_in）を生成し、要素ごとにＣ（ｒ_out；ｒ_in）の振幅でＣ（ｒ_out；ｒ_in）を重み付けし、第１面上の各位置ｒ_inについて第２面において、または、第２面上の各位置ｒ_outについて第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成部と、(5) 複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成部と、を備える。

本発明の観察装置は次のような態様としてもよい。
第２態様では、第１態様に加えて、干渉強度画像取得部は、複数の光照射方向それぞれに沿って光が照射された観察対象物の干渉強度画像を取得する。

第３態様では、第２態様に加えて、干渉強度画像取得部は、波数空間において光照射方向を表す波数ベクトルの位置が離散的かつ周期的に分布する複数の光照射方向それぞれに沿って光が観察対象物に照射されたときに干渉強度画像を撮像した撮像部から、複数の光照射方向それぞれの干渉強度画像を取得する。そして、複素微分干渉画像生成部は、複数の光照射方向それぞれの波数ベクトルの波数空間における位置の周期的分布に基づいて区分される第２面の複数の領域それぞれにおいて、第１面上の各位置ｒ_inについて、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成する。

第４態様では、第１態様に加えて、干渉強度画像取得部は、複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光と、一定の照射方向に沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光と、の干渉による干渉強度画像を取得する。

第５態様では、第１～第３の態様の何れかに加えて、位相微分画像生成部は、(a) 撮像部に対し相対的に遠い位置については、第１面上の各位置ｒ_inについて、第２面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成し、(b) 撮像部に対し相対的に近い位置については、第２面上の各位置ｒ_outについて、第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成する。

第６態様では、第１～第５の態様の何れかに加えて、位相微分画像生成部は、撮像部の光軸に沿った各位置における位相微分画像を生成することで、３次元位相微分画像を生成する。

第７態様では、第１～第６の態様の何れかに加えて、観察装置は、３次元位相微分画像に基づいて観察対象物の３次元屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成部を更に備える。

本発明の観察方法の第１態様は、(1) 複数の光照射方向それぞれに沿って光が照射された観察対象物の干渉強度画像を取得する干渉強度画像取得ステップと、(2) 複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する複素振幅画像生成ステップと、(3) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、観察対象物が存在しない場合の第１面上の各位置ｒ_inの光の波面に対して、観察対象物が存在する場合の第１面と同じ第２面上の各位置ｒ_outの光の波面を関係づけるトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）を生成するトランスミッション行列生成ステップと、(4) トランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）に基づいて、Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）とＴ_rr ^*（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）との要素ごとの積であるＣ（ｒ_out；ｒ_in）を生成し、要素ごとにＣ（ｒ_out；ｒ_in）の振幅でＣ（ｒ_out；ｒ_in）を重み付けし、第１面上の各位置ｒ_inについて第２面において、または、第２面上の各位置ｒ_outについて第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成ステップと、(5) 複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成ステップと、を備える。

本発明の観察方法は次のような態様としてもよい。
第２態様では、第１態様に加えて、干渉強度画像取得部は、複数の光照射方向それぞれに沿って光が照射された観察対象物の干渉強度画像を取得する。

第３態様では、第２態様に加えて、干渉強度画像取得ステップにおいて、波数空間において光照射方向を表す波数ベクトルの位置が離散的かつ周期的に分布する複数の光照射方向それぞれに沿って光が観察対象物に照射されたときに干渉強度画像を撮像した撮像部から、複数の光照射方向それぞれの干渉強度画像を取得する。そして、複素微分干渉画像生成ステップにおいて、複数の光照射方向それぞれの波数ベクトルの波数空間における位置の周期的分布に基づいて区分される第２面の複数の領域それぞれにおいて、第１面上の各位置ｒ_inについて、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成する。

第４態様では、第１態様に加えて、干渉強度画像取得ステップにおいて、複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光と、一定の照射方向に沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光と、の干渉による干渉強度画像を取得する。

第５態様では、第１～第４の態様の何れかに加えて、位相微分画像生成ステップにおいて、(a)撮像部に対し相対的に遠い位置については、第１面上の各位置ｒ_inについて、第２面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成し、(b) 撮像部に対し相対的に近い位置については、第２面上の各位置ｒ_outについて、第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成する。

第６態様では、第１～第５の態様の何れかに加えて、位相微分画像生成ステップにおいて、撮像部の光軸に沿った各位置における位相微分画像を生成することで、３次元位相微分画像を生成する。

第７態様では、第１～第６の態様の何れかに加えて、観察方法は、３次元位相微分画像に基づいて観察対象物の３次元屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成ステップを更に備える。

本発明のプログラムは、上記の本発明の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのものである。本発明の記録媒体は、上記の本発明のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能なものである。

本発明によれば、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を非染色で観察することができる。

図１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。 図２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。 図３は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。 図４は、観察装置１Ａ～１Ｃの解析部５０の構成を示す図である。 図５は、観察方法のフローチャートである。 図６は、干渉強度画像取得ステップＳ５１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。 図７は、撮像部により干渉強度画像を撮像するときの入力光Ｕ_in（ｋ_in）および出力光ｕ_out（ｒ_out）を示す図である。 図８は、観察方法の他のフローチャートである。 図９は、光照射方向の数が複素振幅画像の画素数と等しい場合の（ａ）ｋ_ｘｋ_ｙ波数空間での光照射方向の分布および（ｂ）或る１点ｒ_０に光を集光照射したときのトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in＝ｒ_０）のｘｙ空間での分布を示す図である。 図１０は、光照射方向の数が複素振幅画像の画素数より少ない場合の（ａ）ｋ_ｘｋ_ｙ波数空間での光照射方向の分布および（ｂ）或る１点ｒ_０に光を集光照射したときのトランスミッション行列Ｔ’_rr（ｒ_out；ｒ_in＝ｒ_０）のｘｙ空間での分布を示す図である。 図１１は、光照射方向の数が複素振幅画像の画素数より少ない場合に複素微分干渉画像Ｗ（ｒ_in）を生成する方法を説明する図である。 図１２は、シミュレーション Ａ時の配置を模式的に説明する図である。 図１３は、シミュレーションＡの結果を示す図である。 図１４は、シミュレーションＡの結果を示す図である。 図１５は、シミュレーションＢ時の配置を模式的に説明する図である。 図１６は、シミュレーションＢの結果を示す図である。 図１７は、シミュレーションＢの結果を示す図である。 図１８は、観察装置１００の構成を示す図である。 図１９は、観察装置１００において、観察対象物Ｓへの第１分岐光および第２分岐光の入射、ならびに、観察対象物Ｓを経た後の撮像部１５０への第１分岐光および第２分岐光の入射、を模式的に示す図である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

図１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。この観察装置１Ａは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、コンデンサレンズ２４、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、レンズ４２、撮像部４３および解析部５０などを備える。

光源１１は、空間的・時間的にコヒーレントな光を出力するものであり、好適にはレーザ光源である。レンズ１２は、光源１１と光学的に接続されており、光源１１から出力された光を光ファイバ１４の光入射端１３に集光して、その光を光入射端１３に入射させる。光ファイバ１４は、レンズ１２により光入射端１３に入射された光をファイバカプラ１５へ導光する。ファイバカプラ１５は、光ファイバ１４と光ファイバ１６，１７との間で光を結合するものであり、光ファイバ１４により導光されて到達した光を２分岐して、一方の分岐光を光ファイバ１６により導光させ、他方の分岐光を光ファイバ１７により導光させる。光ファイバ１６により導光された光は光出射端１８から発散光として出射される。光ファイバ１７により導光された光は光出射端１９から発散光として出射される。

レンズ２１は、光出射端１８と光学的に接続されており、光出射端１８から発散光として出力された光をコリメートする。ミラー２２は、レンズ２１と光学的に接続されており、レンズ２１から到達した光をレンズ２３へ反射させる。ミラー２２の反射面の方位は可変である。レンズ２３は、ミラー２２と光学的に接続されている。コンデンサレンズ２４は、レンズ２３と光学的に接続されている。レンズ２３およびコンデンサレンズ２４は、好適には４ｆ光学系を構成している。レンズ２３およびコンデンサレンズ２４は、ミラー２２の反射面の方位に応じた光照射方向から観察対象物Ｓに対して光を照射する。対物レンズ２５は、コンデンサレンズ２４と光学的に接続されている。対物レンズ２５とコンデンサレンズ２４との間に観察対象物Ｓが配置される。対物レンズ２５は、コンデンサレンズ２４から出力されて観察対象物Ｓを経た光（物体光）を入力し、その光をビームスプリッタ４１へ出力する。

ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５と光学的に接続され、また、光出射端１９とも光学的に接続されている。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、光出射端１９から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光をレンズ４２へ出力する。レンズ４２は、ビームスプリッタ４１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ４１から到達した物体光および参照光それぞれをコリメートして撮像部４３へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２と光学的に接続されており、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は傾斜している。ビームスプリッタ４１により物体光と参照光とが合波される位置は、結像レンズより後段であってもよいが、収差の影響を考慮すると、図に示されるように対物レンズ２５とレンズ４２との間であるのが望ましい。

解析部５０は、撮像部４３と電気的に接続されており、撮像部４３により撮像された干渉強度画像を入力して、この干渉強度画像に基づいて所要の処理をする。解析部５０の詳細については後述する。

図２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。この図２に示される観察装置１Ｂは、図１に示された観察装置１Ａの構成に加えて、レンズ３１、ミラー３２およびレンズ３４などを備える。

レンズ３１は、光出射端１９と光学的に接続されており、光出射端１９から発散光として出力された光（参照光）をコリメートする。ミラー３２は、レンズ３１と光学的に接続されており、レンズ３１から到達した光をレンズ３４へ反射させる。レンズ３４は、ミラー３２と光学的に接続されており、ミラー３２から到達した光をビームスプリッタ４１へ出力する。レンズ３４から出力された光は、ビームスプリッタ４１の手前で一旦集光された後、発散光としてビームスプリッタ４１に入力される。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、レンズ３４から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光を同軸にしてレンズ４２へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は平行である。

駆動部３３は、ミラー３２の反射面に垂直な方向にミラー３２を移動させる。駆動部３３は例えばピエゾアクチュエータである。このミラー３２の移動により、ファイバカプラ１５における光分岐からビームスプリッタ４１における合波に至るまでの物体光および参照光それぞれの光路長の差（位相差）を変化させる。この光路長差が異なると、撮像部４３により撮像される干渉強度画像も異なる。

観察装置は、図１および図２の構成例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。観察装置１Ａ（図１）および観察装置１Ｂ（図２）の構成では観察対象物Ｓを透過した光を物体光としたが、以下に説明する観察装置１Ｃ（図３）の構成のように観察対象物Ｓで反射された光を物体光としてもよい。

図３は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。観察装置１Ｃは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、レンズ４２、撮像部４３および解析部５０などを備える。以下では、観察装置１Ａ（図１）と相違する点について主に説明する。

レンズ２１は、光ファイバ１６の光出射端１８と光学的に接続されており、光出射端１８から発散光として出力された光をコリメートする。ミラー２２は、レンズ２１と光学的に接続されており、レンズ２１から到達した光をレンズ２３へ反射させる。ミラー２２の反射面の方位は可変である。レンズ２３は、ミラー２２と光学的に接続されている。対物レンズ２５は、レンズ２３と光学的に接続されている。レンズ２３と対物レンズ２５との間にビームスプリッタ４１が配置されている。レンズ２３および対物レンズ２５は、好適には４ｆ光学系を構成している。レンズ２３および対物レンズ２５は、ミラー２２の反射面の方位に応じた光照射方向から観察対象物Ｓに対して光を照射する。対物レンズ２５は、観察対象物Ｓで反射された光（物体光）を入力し、その光をビームスプリッタ４１へ出力する。

ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５と光学的に接続され、また、光ファイバ１７の光出射端１９とも光学的に接続されている。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、光出射端１９から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光をレンズ４２へ出力する。レンズ４２は、ビームスプリッタ４１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ４１から到達した物体光および参照光それぞれをコリメートして撮像部４３へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２と光学的に接続されており、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は傾斜している。ビームスプリッタ４１により物体光と参照光とが合波される位置は、結像レンズより後段であってもよいが、収差の影響を考慮すると、図に示されるように対物レンズ２５とレンズ４２との間であるのが望ましい。

観察装置１Ｃ（図３）の構成において、観察装置１Ｂ（図２）と同様に参照光の光路長を変化させる機構（図２中のレンズ３１、ミラー３２、駆動部３３およびレンズ３４）を設けて、ファイバカプラ１５における光分岐からビームスプリッタ４１における合波に至るまでの物体光および参照光それぞれの光路長の差（位相差）を変化させてもよい。この場合、撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は平行であってよい。

図４は、観察装置１Ａ～１Ｃの解析部５０の構成を示す図である。解析部５０は、干渉強度画像取得部５１、複素振幅画像生成部５２、トランスミッション行列生成部５３、複素微分干渉画像生成部５４、位相微分画像生成部５５、屈折率分布画像生成部５６、表示部５７および記憶部５８を備える。解析部５０はコンピュータであってよい。解析部５０は、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰまたはＦＰＧＡ等の処理装置、および、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭまたはＲＯＭ等の記憶装置を含む。

干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。また、干渉強度画像取得部５１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させる為の制御信号を出力する出力ポートを有し、また、撮像部４３から干渉強度画像を入力する入力ポートを有する。対物レンズ２５を光軸方向に移動させる必要はない。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。

複素振幅画像生成部５２、トランスミッション行列生成部５３、複素微分干渉画像生成部５４、位相微分画像生成部５５および屈折率分布画像生成部５６は、干渉強度画像に基づいて処理を行う。表示部５７は、処理すべき画像、処理途中の画像および処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部５８は、各種の画像のデータを記憶する。複素振幅画像生成部５２、トランスミッション行列生成部５３、複素微分干渉画像生成部５４、位相微分画像生成部５５、屈折率分布画像生成部５６、表示部５７および記憶部５８は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。

記憶部５８は、干渉強度画像取得部５１、複素振幅画像生成部５２、トランスミッション行列生成部５３、複素微分干渉画像生成部５４、位相微分画像生成部５５および屈折率分布画像生成部５６に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置の製造時または出荷時に記憶部５８に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部５８に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部５８に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ、ＢＤ-ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。

干渉強度画像取得部５１、複素振幅画像生成部５２、トランスミッション行列生成部５３、複素微分干渉画像生成部５４、位相微分画像生成部５５および屈折率分布画像生成部５６それぞれの処理の詳細については後述する。

図５は、観察方法のフローチャートである。このフローチャートに示される観察方法は、観察装置１Ａ（図１）、観察装置１Ｂ（図２）および観察装置１Ｃ（図３）の何れを用いた場合においても可能なものである。この観察方法は、位相微分画像を生成するものであって、干渉強度画像取得ステップＳ５１、複素振幅画像生成ステップＳ５２、トランスミッション行列生成ステップＳ５３、複素微分干渉画像生成ステップＳ５４および位相微分画像生成ステップＳ５５を備える。

干渉強度画像取得ステップＳ５１の処理は干渉強度画像取得部５１により行われる。複素振幅画像生成ステップＳ５２の処理は複素振幅画像生成部５２により行われる。トランスミッション行列生成ステップＳ５３の処理はトランスミッション行列生成部５３により行われる。複素微分干渉画像生成ステップＳ５４の処理は複素微分干渉画像生成部５４により行われる。位相微分画像生成ステップＳ５５の処理は位相微分画像生成部５５により行われる。

干渉強度画像取得ステップＳ５１において、干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。そして、干渉強度画像取得部５１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。

図１，図２および図３それぞれにおいて説明の便宜のためにｘｙｚ直交座標系が示されている。ｚ軸は対物レンズ２５の光軸に対し平行である。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。この位置をｚ＝０とする。観察対象物Ｓへの光照射方向は、その照射光の波数ベクトル（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ，ｋ_ｚ）のうちのｋ_ｘ及びｋ_ｙにより表すことができる。

図６は、干渉強度画像取得ステップＳ５１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。この図では、横軸をｋ_ｘとし縦軸をｋ_ｙとしたｋ_ｘｋ_ｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。光照射方向の走査は、ｋ_ｘｋ_ｙ平面において、（ａ）矩形格子状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｂ）ハニカム状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｃ）六方格子状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｄ）同心の複数の円それぞれの周上に離散的に配置されるようなものであってもよいし、（ｅ）螺旋状に離散的に配置されるようなものであってもよい。何れの場合にも、図１および図２の構成におけるコンデンサレンズ２４または図３の構成における対物レンズ２５のＮＡの許す限りで光照射方向の走査が可能である。ラスタスキャンおよびランダムスキャンの何れであってもよい。ラスタスキャンの場合には、戻りスキャンが有ってもよいし無くてもよい。

複素振幅画像生成ステップＳ５２において、複素振幅画像生成部５２は、複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像取得部５１により取得された干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する。観察装置１Ａ（図１）および観察装置１Ｃ（図３）の場合には、複素振幅画像生成部５２は、フーリエ縞解析法により、１枚の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。観察装置１Ｂ（図２）の場合には、複素振幅画像生成部５２は、位相シフト法により、物体光と参照光との間の光路長差（位相差）が互いに異なる３枚以上の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。

トランスミッション行列生成ステップＳ５３において、トランスミッション行列生成部５３は、複素振幅画像生成部５２により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、次のようにしてトランスミッション行列を生成する。図７は、撮像部により干渉強度画像を撮像するときの入力光Ｕ_in（ｋ_in）および出力光ｕ_out（ｒ_out）を示す図である。Ｕ_in（ｋ_in）は、観察対象物へ平面波として照射される光の波数ｋ_inの複素振幅を表す。ｕ_out（ｒ_out）は、観察対象物から出力される光の位置ｒ_outの複素振幅を表す。

Ｕ_in（ｋ_in）とｕ_out（ｒ_out）との間の関係は、下記（１）式で表される。列ベクトルＵ_inの第ｎ要素Ｕ_in（ｋ_in ⁿ）は、波数ｋ_in ⁿの平面波の複素振幅を表す。列ベクトルｕ_outの第ｎ要素ｕ_out（ｒ_out ⁿ）は、位置ｒ_out ⁿで観測される光の複素振幅を表す。この式にあるＮ行Ｎ列の行列Ｔ_rk（ｒ_out；ｋ_in）は、Ｕ_in（ｋ_in）とｕ_out（ｒ_out）との間の線形な関係を表すものであって、トランスミッション行列と呼ばれる。このようなトランスミッション行列により、観察対象物における光の散乱過程を表すことができる。行列Ｔ_rk（ｒ_out；ｋ_in）の第ｎ１行第ｎ２列の要素Ｔ_n1,n2は、波数ｋ_in ⁿ²で振幅１の平面波が入力されたときに位置ｒ_out ⁿ¹で観測される光の複素振幅を表す。

複数の光照射方向それぞれについて撮像部により干渉強度画像を撮像するときの第ｎの光照射方向の入力光のベクトルＵ_in ⁿ（ｋ_in）は、下記（２）式で表され、第ｎ要素の値のみが１であって、他の要素の値が０である。この入力光Ｕ_in ⁿ（ｋ_in）に対して、出力光ｕ_out ⁿ（ｒ_out）は、下記（３）式で表される。この（３）式は、第ｎの光照射方向の際に得られた複素振幅に対応する。

この（２）式および上記（１）式から、下記（４）式が得られる。そして、複数の光照射方向それぞれについて同様に求めると、下記（５）式が得られる。このようにして、トランスミッション行列Ｔ_rk（ｒ_out；ｋ_in）を求めることができる。

このトランスミッション行列Ｔ_rk（ｒ_out；ｋ_in）は、入力が波数基底であって、出力が位置基底のものである。下記（６）式により、このトランスミッション行列Ｔ_rk（ｒ_out；ｋ_in）を入力に関してフーリエ変換することで、入力および出力の双方が位置基底であるトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）を生成することができる。

このようにして生成されたトランスミッション行列Ｔ_rk（ｒ_out；ｋ_in），Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）は、次のような光学的意味を有するものである（非特許文献１～３）。入力が波数基底であって出力が位置基底であるトランスミッション行列Ｔ_rk（ｒ_out；ｋ_in）は、観察対象物が存在しない場合（入力）の第１面上の各波数ｋ_inの光の波面に対して、観察対象物が存在する場合（出力）の第２面上の各位置ｒ_outの光の波面に対する透過率を与える行列である。入力および出力の双方が位置基底であるトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）は、観察対象物が存在しない場合（入力）の第１面上の各位置ｒ_inの光の波面に対して、観察対象物が存在する場合（出力）の第２面上の各位置ｒ_outの光の波面に対する透過率を与える行列である。

複素微分干渉画像生成ステップＳ５４において、複素微分干渉画像生成部５４は、トランスミッション行列生成部５３により生成されたトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）に基づいて、次のようにして複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_out）または複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_in）を生成する。

まず、Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）に対してｒ_outおよびｒ_inの双方をδｒだけシアーしたＴ_rr（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）の複素共役をＴ_rr ^*（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）とする。Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）とＴ_rr ^*（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）との要素ごとの積をＣ（ｒ_out；ｒ_in）とする（下記（７）式）。δｒのｘ成分δｘおよびｙ成分δｙのうち少なくとも一方は非０である。δｘ≠０，δｙ＝０であれば、ｘ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。δｘ＝０，δｙ≠０であれば、ｙ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。δｘ≠０，δｙ≠０であれば、δｘとδｙとの比に応じた方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。

第２面上の各位置ｒ_outについて、第１面において、要素ごとにＣ（ｒ_out；ｒ_in）の振幅で重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_out）を生成する（下記（８）式）。或いは、第１面上の各位置ｒ_inについて、第２面において、要素ごとにＣ（ｒ_out；ｒ_in）の振幅で重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_in）を生成する（下記（９）式）。これらの式で表されるように、Ｃ（ｒ_out；ｒ_in）の重み付けは、Ｃ（ｒ_out；ｒ_in）の振幅（絶対値）のｎ乗で与えられるのが好適である。ｎは１より大きい実数である。

上記（８）式の総和計算は、出力側空間分解の複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_out）を生成するものである。すなわち、入力に関しては空間分解能を有しない一方で、出力に関しては空間分解能を有するとして、入力の基底について総和を求める。これは、観察対象物の全体に同時に光を照射する（すなわち、入力に関しては空間分解能を有しない）こととし、観察対象物の二次元像を取得する（すなわち、出力に関しては空間分解能を有する）系と相似している。

上記（９）式の総和計算は、入力側空間分解の複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_in）を生成するものである。すなわち、入力に関しては空間分解能を有する一方で、出力に関しては空間分解能を有しないとして、出力の基底について総和を求める。これは、観察対象物上の各位置に光を集光照射するとともに当該集光点を走査する（すなわち、入力に関しては空間分解能を有する）こととし、各集光点について観察対象物を経た光の全光量を測定する（すなわち、出力に関しては空間分解能を有しない）系と相似している。この系では、観察対象物と受光部との間に存在する散乱体の影響が抑制された観察対象物の画像を取得することができる。

位相微分画像生成ステップＳ５５において、位相微分画像生成部５５は、複素微分干渉画像生成部５４により生成された出力側空間分解の複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_out）に基づいて、下記（１０）式により、位相微分画像を生成する。或いは、入力側空間分解の複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_in）に基づいて、下記（１１）式により、位相微分画像を生成する。複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_out），Ｗ_ｎ（ｒ_in）の位相が位相微分画像に相当する。

図８は、観察方法の他のフローチャートである。このフローチャートに示される観察方法は、観察装置１Ａ（図１）、観察装置１Ｂ（図２）および観察装置１Ｃ（図３）の何れを用いた場合においても可能なものである。この観察方法は、ｚ方向の複数の位置それぞれにおける位相微分画像を生成し更に３次元屈折率分布画像を生成するものであって、干渉強度画像取得ステップＳ５１、複素振幅画像生成ステップＳ５２、トランスミッション行列生成ステップＳ５３、複素微分干渉画像生成ステップＳ５４および位相微分画像生成ステップＳ５５に加えて、屈折率分布画像生成ステップＳ５６およびステップＳ５７～Ｓ５９を備える。

干渉強度画像取得ステップＳ５１および複素振幅画像生成ステップＳ５２の各処理の後に、ステップＳ５７において、複数の光照射方向それぞれについて、位置ｚに光波面を自由伝搬させて、位置ｚにおける複素振幅画像ｕを求める。例えば、ｚ＝０の位置からｚ＝ｄの位置への光波面の自由伝搬を想定する場合、ｚ＝０の位置の複素振幅画像をｕ（ｘ，ｙ，０）とし、このｕ（ｘ，ｙ，０）の２次元フーリエ変換をＵ（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ，０）とし、ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像をｕ（ｘ，ｙ，ｄ）とし、このｕ（ｘ，ｙ，ｄ）の２次元フーリエ変換をＵ（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ，ｄ）とすると、自由伝搬は下記（１２）式，（１３）式を含む処理により計算で求めることができる。ｉは虚数単位であり、ｋ_０は観察対象物中における光の波数である。

ステップＳ５７の後に、トランスミッション行列生成ステップＳ５３および複素微分干渉画像生成ステップＳ５４の各処理を行う。その後、ステップＳ５８において、ｚにδｚを加算したものを新たなｚとし、ステップＳ５９において、その新たなｚが最終値ｚ_endに達したか否かを判定する。新たなｚが最終値ｚ_endに達していないとステップＳ５９において判定された場合には、ステップＳ５７に戻る。新たなｚが最終値ｚ_endに達したとステップＳ５９において判定された場合には、位相微分画像生成ステップＳ５５へ進む。

ステップＳ５７からステップＳ５９までの各処理は、ｚの初期値から最終値ｚ_endまでδｚ刻みで繰り返し行われる。この繰り返し処理により、複素微分干渉画像生成部５４は、ｚの初期値から最終値ｚ_endまでのδｚ刻みの各ｚ位置における複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_out，ｚ）またはＷ_ｎ（ｒ_in，ｚ）、すなわち、３次元複素微分干渉画像を生成する。

ステップＳ５９から進んだ位相微分画像生成ステップＳ５５において、位相微分画像生成部５５は、ｚの初期値から最終値ｚ_endまでのδｚ刻みの各ｚ位置における位相微分画像、すなわち、３次元位相微分画像を生成する。そして、屈折率分布画像生成ステップＳ５６において、屈折率分布画像生成部５６は、位相微分画像生成部５５により生成された３次元位相微分画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布画像を生成する。

ところで、干渉強度画像取得ステップＳ５１の際の観察対象物への光照射方向の数と、複素振幅画像の画素数とは、互いに等しいことが理想的である。しかし、現実的には、光照射方向の数は複素振幅画像の画素数より少ない（アンダーサンプリング）。例えば、複素振幅画像の画素数が１０２４×１０２４であるとすると、これと同数の光照射方向を実現するのは、可能ではあっても、容易でない。或いは、撮像部により得られた画像のうち一部範囲の画像（光照射方向の数と同数の画素）のみを以降の処理に用いることも考えられるが、解像度の低下につながるので、好ましくない。

入力および出力の双方が位置基底であるトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）を求める上記（６）式の積分計算は、実際の数値計算の際には下記（１４）式のような総和計算となる。光照射方向の数が複素振幅画像の画素数より少ない場合、観察対象物への光照射方向の走査が図６の（ａ）～（ｃ）に示されるようにｋ_ｘｋ_ｙ平面において離散的かつ周期的であると、理想的なトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）ではなく、これに替えて下記（１５）式で表されるようなトランスミッション行列Ｔ’_rr（ｒ_out；ｒ_in）が得られる。（１５）式中のｒ_ｐは、波数空間における複数の光照射方向の位置の周期的分布に応じたものであり、その周期の逆数に相当する。（１５）式のＴ’_rr（ｒ_out；ｒ_in）は、理想的なＴ_rr（ｒ_out；ｒ_in）をｒ_ｐだけ繰り返してシフトさせて足し合わせたものに相当する。

図９は、光照射方向の数が複素振幅画像の画素数と等しい場合の（ａ）ｋ_ｘｋ_ｙ波数空間での光照射方向の分布および（ｂ）或る１点ｒ_０に光を集光照射したときのトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in＝ｒ_０）のｘｙ空間での分布を示す図である。図１０は、光照射方向の数が複素振幅画像の画素数より少ない場合の（ａ）ｋ_ｘｋ_ｙ波数空間での光照射方向の分布および（ｂ）或る１点ｒ_０に光を集光照射したときのトランスミッション行列Ｔ’_rr（ｒ_out；ｒ_in＝ｒ_０）のｘｙ空間での分布を示す図である。図１０中のｒ_px，ｒ_pyは、波数空間における複数の光照射方向の位置の周期的分布に応じたものであり、その周期の逆数に相当する。この図に示されるように、光照射方向の数が複素振幅画像の画素数より少ない場合、多点照射の場合の出力となっている。このような（１５）式のトランスミッション行列Ｔ’_rr（ｒ_out；ｒ_in）を用いて以降の各ステップの処理を行うと、空間の複数の点の結果が足し合わされてしまうことになって、複素微分干渉画像、位相微分画像および屈折率分布画像を正しく求めることができない。

そこで、このようなアンダーサンプリングの場合には、干渉強度画像取得ステップＳ５１において、干渉強度画像取得部５１は、図６の（ａ）～（ｃ）に示されるように波数空間において光照射方向を表す波数ベクトルの位置が離散的かつ周期的に分布する複数の光照射方向それぞれに沿って光が観察対象物に照射されたときに干渉強度画像を撮像した撮像部から、複数の光照射方向それぞれの干渉強度画像を取得する。そして、複素微分干渉画像生成ステップＳ５４において、複素微分干渉画像生成部５４は、複数の光照射方向それぞれの波数ベクトルの波数空間における位置の周期的分布に基づいて区分される第２面の複数の領域それぞれにおいて、第１面上の各位置ｒ_inについて、重み付けしたＣ’（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、入力側空間分解の複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_in）を生成する。なお、Ｔ′_rr（ｒ_out；ｒ_in）に対してｒ_outおよびｒ_inの双方をδｒだけシフトしたＴ′_rr（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）の複素共役をＴ′_rr ^*（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）とする。Ｔ′_rr（ｒ_out；ｒ_in）とＴ′_rr ^*（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）との要素ごとの積をＣ′（ｒ_out；ｒ_in）とする（下記（１６）式）。

すなわち、アンダーサンプリングの場合、複素微分干渉画像生成ステップＳ５４において、図１１に示されるように、トランスミッション行列Ｔ’_rr（ｒ_out；ｒ_in＝ｒ_０）のｘｙ空間を、各照射点を含む領域Ｄ（ｒ_in－ｒ_ｐ）に分割する。そして、これら複数の領域Ｄ（ｒ_in－ｒ_ｐ）それぞれでの総和を求めることで、入力側空間分解の複素微分干渉画像Ｗ_ｎ（ｒ_in）を生成する（下記（１７）式）。

次に、シミュレーション結果について説明する。以下に説明するシミュレーションＡ，Ｂは、図２に示される測定系を用い、図８に示される手順に従った。

シミュレーションＡでは、図１２に示されるように、５種類の位相画像を互いに間隔をあけて並列配置したものを観察対象物として用いてシミュレーションを行った。図１２は、シミュレーションＡ時の配置を模式的に説明する図である。図１３は、出力側空間分解（上記（８）式）の場合に生成された位相微分画像を示す図である。図１４は、入力側空間分解（上記（９）式）の場合に生成された位相微分画像を示す図である。

図１３および図１４それぞれにおいて、最上段は厳密解の位相微分画像を示し、第２段はｎ＝１とした場合の位相微分画像を示し、第３段はｎ＝２とした場合の位相微分画像を示し、最下段はｎ＝３とした場合の位相微分画像を示す。

図１３と図１４とを対比して分かるように、出力側空間分解の場合には撮像部に近いほど鮮明な位相微分画像が得られ、入力側空間分解の場合には撮像部から遠いほど鮮明な位相微分画像が得られた。また、ｎ＝１，２，３それぞれの場合を比較すると、ｎ＝３の場合に最も鮮明な位相微分画像が得られた。

シミュレーションＢでは、図１５に示されるように、細胞塊を模擬したものを観察対象物として用いてシミュレーションを行った。図１５は、シミュレーションＢ時の配置を模式的に説明する図である。ここでは、出力側空間分解（上記（８）式）の場合の結果を示す。図１６および図１７それぞれは、シミュレーションＢの結果を示す図である。

図１６において、上段はｎ＝１とした場合の位相微分画像を示し、中段はｎ＝２とした場合の位相微分画像を示し、下段はｎ＝３とした場合の位相微分画像を示す。また、図１６において、左端はｚ軸に平行な断面における位相微分画像を示し、その他はｚ方向の三つの位置それぞれにおけるｘｙ断面における位相微分画像を示す。

図１７において、最上段は厳密解の屈折率分布画像を示し、第２段はｎ＝１とした場合の屈折率分布画像を示し、第２段はｎ＝２とした場合の屈折率分布画像を示し、最下段はｎ＝３とした場合の屈折率分布画像を示す。また、図１７において、左端はｙ方向への最大値投影画像を示し、その他はｚ方向の三つの位置それぞれにおけるｘｙ断面における屈折率分布画像を示す。

このシミュレーションＢでも、ｎ＝１，２，３それぞれの場合を比較すると、ｎ＝３の場合に最も鮮明な位相微分画像および屈折率分布画像が得られた。

シミュレーションＡの結果から、位相微分画像生成ステップＳ５５において、位相微分画像生成部５５は、撮像部に対し相対的に遠い位置については、第１面上の各位置ｒ_inについて、第２面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成するのが好ましい。逆に、撮像部に対し相対的に近い位置については、第２面上の各位置ｒ_outについて、第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成するのが好ましい。

以上のとおり、本実施形態によれば、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、良好な深達度を有することができ、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を非染色で観察することができる。

これまで説明してきた観察装置および観察方法は、光源から出力されて２分岐された第１分岐光および第２分岐光のうち、一方の第１分岐光については観察対象物を経ることなく参照光として撮像部により受光し、他方の第２分岐光については観察対象物を経て物体光として撮像部により受光して、第２分岐光（物体光）の複数の光照射方向それぞれについて、第１分岐光（参照光）と第２分岐光（物体光）との干渉による干渉強度画像を撮像し、この干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成するものであった。

これに限られず、以下に図１８および図１９を用いて説明するように、光源から出力されて２分岐された第１分岐光および第２分岐光の双方について観察対象物を経た後に撮像部により受光して、第２分岐光の複数の光照射方向それぞれについて、第１分岐光と第２分岐光との干渉による干渉強度画像を撮像し、この干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する構成としてもよい。

図１８は、観察装置１００の構成を示す図である。この観察装置１００は、光源１１０、照射部１３１および撮像部１５０等を備える。光源１１０は、空間的にコヒーレントな光を出力する。光源１１０から出力される光は、時間的にコヒーレントであってもよいし、時間的にコヒーレントでなくてもよい。光源１１０は、レーザ光源であってもよいし、例えばＳＬＤ（Super Luminescent Diode）、ＳＣ（Super Continuum）光源および光周波数コム光源などの光源であってよい。また、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）や水銀ランプなどから出力された空間インコヒーレントな光を、ピンホール等を通すことで空間的なコヒーレンスを高めてもよい。

レンズ１２１は、光源１１０と光学的に接続されており、光源１１０から出力された光を光ファイバ１２３の光入射端１２２に集光して、その光を光入射端１２２に入射させる。光ファイバ１２３は、光入射端１２２に入射された光を光出射端１２４まで導光する。光ファイバ１２３により導光された光は光出射端１２４から発散光として出射される。レンズ１２５は、光出射端１２４と光学的に接続されており、光出射端１２４から発散光として出力された光を入力してコリメートし、そのコリメートした光を照射部１３１へ出力する。

照射部１３１は、光源１１０から出力されてレンズ１２１，光ファイバ１２３およびレンズ１２５を経た光を入力し、その入力した光を２分岐して第１分岐光および第２分岐光とする。照射部１３１は、これら第１分岐光および第２分岐光を互いに重ね合わせて観察対象物Ｓに照射する。照射部１３１は、観察対象物Ｓに対して第１分岐光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物Ｓに対して第２分岐光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。

照射部１３１は、ビームスプリッタ３１１、位相変調型の空間光変調器３１３、偏光子３１４、２分の１波長板３１５、偏光子３１６、レンズ３１８および対物レンズ３１９を含む。

ビームスプリッタ３１１は、レンズ１２５との間に設けられた偏光子３１４および２分の１波長板３１５を経て到達した光を空間光変調器３１３へ反射させる。また、ビームスプリッタ３１１は、空間光変調器３１３から到達した光を入力して、この光を偏光子３１６へ出力する。

空間光変調器３１３は、変調面に入射される互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち、第１方位の直線偏光の光に対して位相変調することなく、第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する。偏光子３１４および２分の１波長板３１５は、ビームスプリッタ３１１から空間光変調器３１３の変調面へ入射される光が第１方位および第２方位それぞれの直線偏光成分を互いに同程度に含むように、光の偏光状態を設定する。

偏光子３１６は、空間光変調器３１３からビームスプリッタ３１１を経て到達した光を入力し、その光に含まれる第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光を干渉可能とする。レンズ３１８および対物レンズ３１９は、偏光子３１６から出力された第１分岐光および第２分岐光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。

このような構成を有する照射部１３１は、空間光変調器３１３により位相変調されなかった第１方位の直線偏光の光を第１分岐光として、この第１分岐光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部１３１は、空間光変調器３１３により位相変調された第２方位の直線偏光の光を第２分岐光として、この第２分岐光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２分岐光の光照射方向は、空間光変調器３１３の変調面における位相変調パターンの向き及び間隔により設定することができる。また、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差は、空間光変調器３１３の変調面における位相変調パターンのシフトにより設定することができる。

なお、空間光変調器３１３の位置により位相差を調整することもできる。しかし、空間光変調器３１３の変調面における位相変調パターンのシフトにより位相差を設定する場合の方が、構成要素の機械的な移動がない点で好ましい。

対物レンズ１４１は、照射部１３１により観察対象物Ｓに照射されて観察対象物Ｓを経た光（第１分岐光、第２分岐光）を入力し、その光をミラー１４２へ出力する。レンズ１４３は、対物レンズ１４１から出力されてミラー１４２により反射された光を入力し、その光を撮像部１５０の撮像面に入射させる。

撮像部１５０は、レンズ１４３から撮像面に到達した第１分岐光および第２分岐光の双方を受光して、第１分岐光と第２分岐光との干渉による干渉強度画像を撮像する。撮像部１５０は、第２分岐光の複数の光照射方向それぞれについて、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像する。この撮像部１５０により撮像された干渉強度画像に基づいて所要の処理をすることで、複素振幅画像などを生成することができる。

この観察装置１００（図１８）を用いた場合の複素振幅画像生成部の処理の内容は次のとおりである。図１９は、観察装置１００において、観察対象物Ｓへの第１分岐光および第２分岐光の入射、ならびに、観察対象物Ｓを経た後の撮像部１５０への第１分岐光および第２分岐光の入射、を模式的に示す図である。照射部１３１は、観察対象物Ｓに対して第１分岐光および第２分岐光を重ねて照射する。このとき、観察対象物Ｓに対する第１分岐光の光照射方向を一定とし、観察対象物Ｓに対する第２分岐光の光照射方向を複数の光照射方向それぞれとし、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差φを各値に設定する。

観察対象物Ｓへ入射する第１分岐光の波面をｕ_０,in（ｒ）と表す。第２分岐光の複数（Ｎ個）の光照射方向のうち第ｎ光照射方向（ｎ＝１～Ｎ）に沿って観察対象物Ｓへ入射する第２分岐光の波面をｕ_ｎ,in（ｒ）exp（ｉφ）と表す。ｒは位置を表す変数である。φは、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差である。撮像部１５０の撮像面または焦点面（撮像面に対して光学的に共役な面）における第１分岐光の波面をｕ_０（ｒ）と表し、第２分岐光の波面をｕ_ｎ（ｒ）exp（ｉφ）と表す。

撮像部１５０による撮像により取得される干渉強度画像Ｉ_ｎ（ｒ，φ）は、ｕ_０（ｒ）とｕ_ｎ（ｒ）exp（ｉφ）との和の絶対値の二乗で表される。干渉強度画像Ｉ_ｎ（ｒ，φ）は、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差をφとして、観察対象物に対して第１分岐光を一定の光照射方向に沿って観察対象物Ｓへ入射させ、観察対象物に対して第２分岐光を第ｎ光照射方向に沿って入射させたときに、撮像部１５０による撮像により取得される干渉強度画像である。焦点面（撮像面に対して光学的に共役な面）は、観察対象物Ｓにあってもよいし、観察対象物Ｓより撮像部１５０側にあってもよいし、観察対象物Ｓより照射部１３１側にあってもよい。

第２分岐光の複数の光照射方向それぞれについて、複数の位相差φそれぞれに設定されたときに撮像部１５０により取得された干渉強度画像に基づいて、位相シフト法により干渉項Ｃ_ｎ（ｒ）＝ｕ_０ ^＊（ｒ）・ｕ_ｎ（ｒ）を求める。干渉項ｕ_０（ｒ）・ｕ_ｎ ^＊（ｒ）を求めてもよい。この干渉項Ｃ_ｎ（ｒ）を第２分岐光の複数の光照射方向それぞれについて（すなわち、各ｎ（＝１～Ｎ））について求める。

第２分岐光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項Ｃ_ｎ（ｒ）に基づいて、第１分岐光の複素振幅画像を生成する。第１分岐光の複素振幅ｕ_０（ｒ）の位相φ_０（ｒ）は、第１分岐光と第２分岐光との間の位相傾き（光入射方向の差異）を補正した後、その補正後の干渉項のコヒーレント和Ｃ_sum（ｒ）を求め、このコヒーレント和Ｃ_sum（ｒ）の位相で近似的に表すことができる。第１分岐光の複素振幅ｕ_０（ｒ）の振幅Ａ_０（ｒ）は、第２分岐光を観察対象物Ｓに照射せずに、第１分岐光のみを観察対象物Ｓに照射したときに、撮像部１５０により撮像された強度画像｜ｕ_０（ｒ）｜^２から求めることができる。または、第１分岐光の複素振幅ｕ_０（ｒ）の振幅Ａ_０（ｒ）は、干渉項Ｃ_ｎ（ｒ）の強度和Ｉ_sum（ｒ）の平方根で近似的に表すことができる。

以上のようにして求めた第１分岐光の複素振幅ｕ_０（ｒ）の位相φ_０（ｒ）および振幅Ａ_０（ｒ）に基づいて、第１分岐光の複素振幅画像ｕ_０（ｒ）を生成することができる。そして、第１分岐光の複素振幅画像ｕ_０（ｒ）および干渉項Ｃ_ｎ（ｒ）に基づいて、複数の光照射方向それぞれの第２分岐光の複素振幅画像ｕ_ｎ（ｒ）を生成することができる。以降の処理は、既に説明したものと同様である。

１Ａ～１Ｃ…観察装置、２…記録媒体、１１…光源、１２…レンズ、１３…光入射端、１４…光ファイバ、１５…ファイバカプラ、１６，１７…光ファイバ、１８，１９…光出射端、２１…レンズ、２２…ミラー、２３…レンズ、２４…コンデンサレンズ、２５…対物レンズ、３１…レンズ、３２…ミラー、３３…駆動部、３４…レンズ、４１…ビームスプリッタ、４２…レンズ、４３…撮像部、５０…解析部、５１…干渉強度画像取得部、５２…複素振幅画像生成部、５３…トランスミッション行列生成部、５４…複素微分干渉画像生成部、５５…位相微分画像生成部、５６…屈折率分布画像生成部、５７…表示部、５８…記憶部、１００…観察装置、１１０…光源、１３１…照射部、１５０…撮像部。

Claims (16)

1. 複数の光照射方向それぞれに沿って光が照射された観察対象物の干渉強度画像を取得する干渉強度画像取得部と、
   前記複数の光照射方向それぞれについて、前記干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する複素振幅画像生成部と、
   前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて、前記観察対象物が存在しない場合の第１面上の各位置ｒ_inの光の波面に対して、前記観察対象物が存在する場合の前記第１面と同じ第２面上の各位置ｒ_outの光の波面を関係づけるトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）を生成するトランスミッション行列生成部と、
   前記トランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）に基づいて、Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）とＴ_rr ^*（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）との要素ごとの積であるＣ（ｒ_out；ｒ_in）を生成し、要素ごとにＣ（ｒ_out；ｒ_in）の振幅でＣ（ｒ_out；ｒ_in）を重み付けし、前記第１面上の各位置ｒ_inについて前記第２面において、または、前記第２面上の各位置ｒ_outについて前記第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成部と、
   前記複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成部と、
   を備える観察装置。
2. 前記干渉強度画像取得部は、複数の光照射方向それぞれに沿って前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像した撮像部から、前記複数の光照射方向それぞれの前記干渉強度画像を取得する、
   請求項１記載の観察装置。
3. 前記干渉強度画像取得部は、波数空間において光照射方向を表す波数ベクトルの位置が離散的かつ周期的に分布する前記複数の光照射方向それぞれに沿って光が観察対象物に照射されたときに前記干渉強度画像を撮像した撮像部から、前記複数の光照射方向それぞれの前記干渉強度画像を取得し、
   前記複素微分干渉画像生成部は、前記複数の光照射方向それぞれの波数ベクトルの前記波数空間における位置の周期的分布に基づいて区分される前記第２面の複数の領域それぞれにおいて、前記第１面上の各位置ｒ_inについて、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、前記複素微分干渉画像を生成する、
   請求項２に記載の観察装置。
4. 前記干渉強度画像取得部は、複数の光照射方向それぞれに沿って前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と、一定の照射方向に沿って前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と、の干渉による干渉強度画像を取得する、
   請求項１に記載の観察装置。
5. 前記位相微分画像生成部は、
   撮像部に対し相対的に遠い位置については、前記第１面上の各位置ｒ_inについて、前記第２面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、前記複素微分干渉画像を生成し、
   撮像部に対し相対的に近い位置については、前記第２面上の各位置ｒ_outについて、前記第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、前記複素微分干渉画像を生成する、
   請求項１～４いずれか一項に記載の観察装置。
6. 前記位相微分画像生成部は、撮像部の光軸に沿った各位置における位相微分画像を生成することで、３次元位相微分画像を生成する、
   請求項１～４いずれか一項に記載の観察装置。
7. 前記３次元位相微分画像に基づいて前記観察対象物の３次元屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成部を更に備える、
   請求項６に記載の観察装置。
8. 複数の光照射方向それぞれに沿って光が照射された観察対象物の干渉強度画像を取得する干渉強度画像取得ステップと、
   前記複数の光照射方向それぞれについて、前記干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成する複素振幅画像生成ステップと、
   前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて、前記観察対象物が存在しない場合の第１面上の各位置ｒ_inの光の波面に対して、前記観察対象物が存在する場合の前記第１面と同じ第２面上の各位置ｒ_outの光の波面を関係づけるトランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）を生成するトランスミッション行列生成ステップと、
   前記トランスミッション行列Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）に基づいて、Ｔ_rr（ｒ_out；ｒ_in）とＴ_rr ^*（ｒ_out－δｒ；ｒ_in－δｒ）との要素ごとの積であるＣ（ｒ_out；ｒ_in）を生成し、要素ごとにＣ（ｒ_out；ｒ_in）の振幅でＣ（ｒ_out；ｒ_in）を重み付けし、前記第１面上の各位置ｒ_inについて前記第２面において、または、前記第２面上の各位置ｒ_outについて前記第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成ステップと、
   前記複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成ステップと、
   を備える観察方法。
9. 前記干渉強度画像取得ステップにおいて、複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像した撮像部から、前記複数の光照射方向それぞれの前記干渉強度画像を取得する、
   請求項８記載の観察方法。
10. 前記干渉強度画像取得ステップにおいて、波数空間において光照射方向を表す波数ベクトルの位置が離散的かつ周期的に分布する前記複数の光照射方向それぞれに沿って光が観察対象物に照射されたときに前記干渉強度画像を撮像した撮像部から、前記複数の光照射方向それぞれの前記干渉強度画像を取得し、
    前記複素微分干渉画像生成ステップにおいて、前記複数の光照射方向それぞれの波数ベクトルの前記波数空間における位置の周期的分布に基づいて区分される前記第２面の複数の領域それぞれにおいて、前記第１面上の各位置ｒ_inについて、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、前記複素微分干渉画像を生成する、
    請求項９に記載の観察方法。
11. 前記干渉強度画像取得ステップにおいて、複数の光照射方向それぞれに沿って前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と、一定の照射方向に沿って前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と、の干渉による干渉強度画像を取得する、
    請求項８に記載の観察方法。
12. 前記位相微分画像生成ステップにおいて、
    撮像部に対し相対的に遠い位置については、前記第１面上の各位置ｒ_inについて、前記第２面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、前記複素微分干渉画像を生成し、
    撮像部に対し相対的に近い位置については、前記第２面上の各位置ｒ_outについて、前記第１面において、重み付けしたＣ（ｒ_out；ｒ_in）の総和を求めることで、前記複素微分干渉画像を生成する、
    請求項８に記載の観察方法。
13. 前記位相微分画像生成ステップにおいて、撮像部の光軸に沿った各位置における位相微分画像を生成することで、３次元位相微分画像を生成する、
    請求項８に記載の観察方法。
14. 前記３次元位相微分画像に基づいて前記観察対象物の３次元屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成ステップを更に備える、
    請求項１３に記載の観察方法。
15. 請求項８～１４の何れか１項に記載の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのプログラム。
16. 請求項１５に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。

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