JP2015172675A - 観察装置、観察方法、及び照明装置 - Google Patents

Abstract

【課題】ポイントスキャン又はＺスキャンをせずに観察対象領域の３次元像構造データを取得する。
【解決手段】
本発明を例示する観察装置の一態様は、観察対象領域の深さ方向にかけて縞ピッチの異なる３次元の縞パターンで前記観察対象領域を照明する照明部と、前記縞パターンで照明された前記観察対象領域の画像を生成する観察部と、前記観察対象領域を前記縞パターンで走査する走査部と、互いに異なる走査位置で生成された複数の前記画像に基づき、前記観察対象領域の互いに異なる深さに関する複数の画像成分を互いに分離する分離部とを備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、観察装置、観察方法、及び照明装置に関する。

従来、試料の３次元構造を顕微鏡で観測する顕微鏡としてポイントスキャン型又はＺスキャン型の顕微鏡が知られている。

特開２００４−２１２６００号公報

本発明は、ポイントスキャン又はＺスキャンをせずに観察対象領域の３次元像構造データを取得する観察装置、観察方法、及びそれに適した照明装置を提案する。

本発明を例示する観察装置の一態様は、観察対象領域の深さ方向にかけて縞ピッチの異なる３次元の縞パターンで前記観察対象領域を照明する照明部と、前記縞パターンで照明された前記観察対象領域の画像を生成する観察部と、前記観察対象領域を前記縞パターンで走査する走査部と、互いに異なる走査位置で生成された複数の前記画像に基づき、前記観察対象領域の互いに異なる深さに関する複数の画像成分を互いに分離する分離部とを備える。

本発明を例示する観察方法の一態様は、観察対象領域の深さ方向にかけて縞ピッチの異なる３次元の縞パターンで前記観察対象領域を照明する手順と、前記縞パターンで照明された前記観察対象領域の画像を生成する手順と、前記観察対象領域を前記縞パターンで走査する手順と、互いに異なる走査位置で生成された複数の前記画像に基づき、前記観察対象領域の互いに異なる深さに関する複数の画像成分を、互いに分離する手順とを含む。

本発明を例示する照明装置の一態様は、観察対象領域の深さ方向にかけて縞ピッチの異なる３次元の縞パターンで前記観察対象領域を照明する。

本発明によれば、ポイントスキャン又はＺスキャンをせずに観察対象領域の３次元像構造データを取得する観察装置、観察方法、及びそれに適した照明装置を提案する。

３Ｄ照明顕微鏡装置の構成図である。 スリットマスク１８を示す図である。 観察対象面５−１、５−２、５−３を説明する図である。 縞パターンＦ_１、Ｆ_２、Ｆ_３の模式図である。 Ｎ枚の画像Ｉ_１，Ｉ_２，…．Ｉ_Ｎの概念図である。 着目画素の輝度変化波形の概念図である。 輝度変化波形のフーリエスペクトルの概念図である。 着目画素における蛍光物質の密度分布データの概念図である。 座標（ｘ，ｚ）における縞ピッチＰ（ｘ，ｚ）を説明する図である。 深さｚと縞周波数ｆとの関係を示す縞周波数特性カーブである。 量子化された縞周波数特性カーブである。

［実施形態］
以下、本発明の実施形態として３Ｄ照明顕微鏡装置を説明する。

図１は、３Ｄ照明顕微鏡装置の構成図である。図１に示すとおり３Ｄ照明顕微鏡装置１には、レーザ光源１０１と、光ファイバ１１と、コリメートレンズ１２と、１次元回折格子１３と、シリンドリカルレンズ１６と、スリットマスク１８と、リレーレンズを構成するレンズ２５、２７と、試料５と、ダイクロイックミラー２８と、結像レンズ２９と、撮像素子３５と、試料ステージ１３Ａと、制御装置３９と、演算装置４０とが配置される。

以下、光ファイバ１１の出射端、コリメートレンズ１２、１次元回折格子１３、シリンドリカルレンズ１６、スリットマスク１８、レンズ２５、ダイクロイックミラー２８、レンズ２７の全体を「照明光学系１０」と称す。また、レンズ２７、ダイクロイックミラー２８、結像レンズ２９の全体を「観察光学系２０」と称す。これらの照明光学系１０と観察光学系２０とは、レンズ２７及びダイクロイックミラー２８を共有している。

レーザ光源１０１は、可干渉性を有した光源である。レーザ光源１０１の発光波長は、試料５に含まれる蛍光物質の励起波長と同じに設定されている。レーザ光源１０１から射出したレーザ光は、光ファイバ１１を伝搬すると、光ファイバ１１の出射端に点光源を形成する。

点光源から射出したレーザ光は、コリメートレンズ１２にて径の太い平行光束となり、１次元回折格子１３へ入射する。１次元回折格子１３へ入射した平行光束は、１次元回折格子１３の回折作用により、次数の異なる複数の回折光に分岐される。
以下、１次元回折格子１３の格子線方向を、照明光学系１０の光軸方向（ｚ方向）に垂直な所定方向（ｙ方向）とする。この場合、複数の回折光の分岐方向は、ｚ方向とｙ方向との双方に垂直な方向（ｘ方向）となる。

１次元回折格子１３で分岐した複数の回折光は、シリンドリカルレンズ１６の集光作用を受け、シリンドリカルレンズ１６の焦点面６Ａの互いに異なる位置に集光ライン（ライン光源）を形成する。
ここで、シリンドリカルレンズ１６のレンズ面の母線方向は、１次元回折格子１３の格子線方向（ｙ方向）と同じに設定される。この場合、焦点面６Ａに形成されるライン光源の長手方向はｙ方向となり、複数の回折光が個別に形成する複数のライン光源の配列方向は、ｘ方向となる。なお、図１では、複数の回折光のうち０次回折光及び±１次回折光のみを図示した。

焦点面６Ａに向かった複数の回折光は、焦点面６Ａの近傍に配置されたスリットマスク１８へ入射する。スリットマスク１８には、図２に示すとおり１対のスリット１８ａ、１８ｂが形成されている。１対のスリット１８ａ、１８ｂの各々の長手方向はｙ方向であり、１対のスリット１８ａ、１８ｂの配列方向はｘ方向である。また、１対のスリット１８ａ、１８ｂの中心間隔は、±１次回折光が個別に形成する１対のライン光源の間隔に一致している。また、１対のスリット１８ａ、１８ｂの各々の短手方向の幅は、１対のライン光源の各々の短手方向の幅（前述した点光源のサイズによって決まる）と同等である。
図１に示すとおり、スリットマスク１８に入射した複数の回折光のうち、０次回折光及び２次以降の高次回折光はスリットマスク１８の遮光部で遮光され、±１次回折光はスリットマスク１８の１対のスリット１８ａ、１８ｂを個別に通過する。１対のスリット１８ａ、１８ｂを個別に通過した±１次回折光の各々は円筒波であり、これら円筒波の波面の母線方向はｙ方向である。つまり、１対のスリット１８ａ、１８ｂのレンズ２５側には１対のライン光源が個別に形成される。１対のライン光源から個別に射出する１対の円筒波の拡がり角度は、図１に示す角度と同じとは限らない。

１対のスリット１８ａ、１８ｂ（１対のライン光源）から個別に射出した１対の円筒波は、レンズ２５、ダイクロイックミラー２８、レンズ２７を順に通過すると、レンズ２５、２７に関して焦点面６Ａと共役な面６Ａ’に１対のライン光源１８ａ’、１８ｂ’を形成する。

１対のライン光源１８ａ’、１８ｂ’のうち、ライン光源１８ａ’は、スリット１８ａのレンズ２５側に形成されたライン光源の像（２次ライン光源）であり、ライン光源１８ｂ’は、スリット１８ｂのレンズ２５側に形成されたライン光源の像（２次ライン光源）である。

１対の２次ライン光源１８ａ’、１８ｂ’からは、１対の円筒波が個別に射出する。１対の円筒波の波面の母線方向は、ｙ方向である。

１対の２次ライン光源１８ａ’、１８ｂ’から個別に射出した１対の円筒波は、試料５の近傍で互いに干渉して３次元の干渉縞を形成する。これら１対の円筒波の波面の母線方向はｙ方向であるので、試料５の近傍に形成される干渉縞は、ｘ方向及びｚ方向にかけて強度分布を有しているが、干渉縞のｙ方向の強度は、一様となる。

このような干渉縞によると、試料５のうちｚ座標の異なる複数のｘｙ断面には、縞ピッチの互いに異なる複数の縞パターンが個別に形成される。

以下、試料５の観察対象領域５０に着目する。「観察対象領域５０」とは、観察光学系２０の視野内であって、観察光学系２０の焦点深度内に収まる領域のことである。また、観察対象領域５０の様々なｘｙ断面を代表して、図３（Ａ）に示すような３つの観察対象面５−１、５−２、５−３を想定し、観察対象領域５０の他のｘｙ断面を無視する。

このうち、観察対象面５−２のｚ座標ｚ_２は、観察光学系２０の焦点面に位置し、観察対象面５−１のｚ座標ｚ_１は、観察光学系２０の側から見て座標ｚ_２よりも奥に位置し、観察対象面５−３のｚ座標ｚ_３は、観察光学系２０の側から見て座標ｚ_２よりも手前に位置する。

よって、図３（Ｂ）に示すとおり観察対象面５−１に形成される縞パターンＦ_１の空間周波数（以下、「縞周波数」と称す。）ｆ_１、観察対象面５−２に形成される縞パターンＦ_２の縞周波数ｆ_２、観察対象面５−３に形成される縞パターンＦ_３の縞周波数ｆ_３の関係は、ｆ_１＜ｆ_２＜ｆ_３となる。

なお、図４（Ａ）〜（Ｃ）は、観察光学系２０から見た縞パターンＦ_１、Ｆ_２、Ｆ_３の模式図であり、図４（Ｄ）は、観察光学系２０から見た縞パターンＦ_１、Ｆ_２、Ｆ_３の全体の模式図である。
図１に戻り、試料５は、蛍光物質で標識された生体細胞などを含む。この蛍光物質は、干渉縞で照明されると蛍光を発する。観察対象領域５０から射出する蛍光の強度分布は、観察対象領域５０に存在する蛍光物質の３次元密度分布と、観察対象領域５０を照明した干渉縞の３次元強度分布との双方に応じて決まる。

観察対象領域５０から射出した蛍光は、レンズ２７を介してビームスプリッタ２８へ入射し、ビームスプリッタ２８を反射する。ビームスプリッタ２８を反射した蛍光は、結像レンズ２９を通過すると、撮像素子３５の撮像面上に観察対象領域５０の蛍光像を形成する。

ここで、撮像素子３５の撮像面は、観察光学系２０に関して観察対象面５−２（図３参照）と共役であって、観察対象面５−１、５−３は、観察光学系２０の焦点深度内に収まっている。よって、撮像面上の蛍光像には、図３に示した縞パターンＦ_１、Ｆ_２、Ｆ_３の全部がボケることなく写る。

撮像素子３５は、撮像面上の蛍光像を撮像することにより画像を生成すると、制御装置３９へ画像を出力する。

ここで、試料５は、試料ステージ１３Ａにより少なくともｘ方向にかけてシフト可能である。このシフトによると、観察対象領域５０が干渉縞によりｘ方向にかけて走査（縞走査）される。

なお、ここでは観察対象領域５０を縞走査するために試料５をシフトさせたが、試料５の代わりに干渉縞をシフトさせてもよい。干渉縞をシフトさせるためには、例えば照明光学系１０の全体をｘ方向にシフトさせればよい。
制御装置３９は、試料ステージ１３Ａを駆動することにより試料５をｘ方向に等ピッチで縞走査し、縞走査の位置（縞走査位置）が各位置にあるときに撮像素子３５を駆動することによりＮ枚の画像を取得すると、Ｎ枚の画像を演算装置４０へ出力する。Ｎ枚の画像は縞走査位置が互いに異なるが、Ｎ枚の画像の間で縞走査ピッチは均一である。

演算装置４０は、制御装置３９から転送されたＮ枚の画像へ演算処理（後述）を施すことにより、観察対象領域５０に存在する蛍光物質の３次元密度分布を算出し、その３次元密度分布を不図示の画像表示装置へ表示する。

次に、演算装置４０による演算処理を詳しく説明する。

図５に示すのは、Ｎ枚の画像Ｉ_１，Ｉ_２，…．Ｉ_Ｎの概念図である。Ｎ枚の画像Ｉ_１，Ｉ_２，…．Ｉ_Ｎの間では縞走査位置Ｓが互いに異なり、Ｎ枚の画像Ｉ_１，Ｉ_２，…．Ｉ_Ｎのフレーム番号がＮ枚の画像Ｉ_１，Ｉ_２，…．Ｉ_Ｎの縞走査位置Ｓを表している。よって、フレーム番号の隣接する２枚の画像Ｉ_ｉ，Ｉ_{（ｉ＋１）}間における縞走査位置ＳのズレをΔＳとおくと、第ｉフレームの画像Ｉ_ｉの縞走査位置Ｓ_ｉはＳ_ｉ＝（Ｎ−１）×ΔＳで表される。これらＮ枚の画像Ｉ_１，Ｉ_２，…．Ｉ_Ｎについて、演算装置４０は以下の手順（１）〜（４）を実行する。

（１）演算装置４０は、Ｎ枚の画像Ｉ_１，Ｉ_２，…．Ｉ_Ｎのうち、着目座標（ｘ，ｙ）に関するＮ個の画素値Ｉ_１（ｘ，ｙ），Ｉ_２（ｘ，ｙ），…．Ｉ_Ｎ（ｘ，ｙ）を参照する。Ｎ個の画素値Ｉ_１（ｘ，ｙ），Ｉ_２（ｘ，ｙ），…．Ｉ_Ｎ（ｘ，ｙ）をフレーム番号順にプロットすると、例えば図６に示すような輝度変化波形が描ける。図６の横軸はフレーム番号（すなわち縞走査位置Ｓ）を示しており、図６の縦軸は画素値（輝度値）を示している。なお、図６の輝度変化波形は実際の輝度変化波形を簡略化したものであり、実際の輝度変化波形は図６の輝度変化波形より多くの周波数成分を含んでいる。

図６の輝度変化波形には、図３の観察対象面５−１に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_１における蛍光物質の密度を示す輝度成分）と、図３の観察対象面５−２に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_２における蛍光物質の密度を示す輝度成分）と、図３の観察対象面５−３に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_３における蛍光物質の密度を示す輝度成分）とが含まれている。

このうち図３の観察対象面５−１は、縞走査中、縞周波数ｆ_１の縞パターンＦ_１で走査される。よって、図６の輝度変化波形のうち、周波数ｆ_１で変化する輝度成分が、観察対象面５−１に関する輝度成分である。

また、図３の観察対象面５−２は、縞走査中、縞周波数ｆ_２の縞パターンＦ_２で走査される。よって、図６の輝度変化波形のうち、周波数ｆ_２で変化する輝度成分が、観察対象面５−２に関する輝度成分である。

また、図３の観察対象面５−３は、縞走査中、縞周波数ｆ_３の縞パターンＦ_３で走査される。よって、図６の輝度変化波形のうち、周波数ｆ_３で変化する輝度成分が、観察対象面５−３に関する輝度成分である。

（２）演算装置４０は、図６の輝度変化波形（すなわちＮ個の画素値Ｉ_１（ｘ，ｙ），Ｉ_２（ｘ，ｙ），…．Ｉ_Ｎ（ｘ，ｙ））に対してＳ方向のフーリエ変換を施すことにより、例えば図７に示すようなフーリエスペクトルを取得する。但し、図７では、観察対象領域５０のうち観察対象面５−１、５−２、５−３以外のｘｙ断面には蛍光物質が存在しなかった場合を想定した。

図７のフーリエスペクトルのうち、周波数ｆ_１に現れたピークの高さは、観察対象面５−１に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_１における蛍光物質の密度）を示している。

また、図７のフーリエスペクトルのうち、周波数ｆ_２に現れたピークの高さは、観察対象面５−２に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_２における蛍光物質の密度）を示している。

また、図７のフーリエスペクトルのうち、周波数ｆ_３に現れたピークの高さは、観察対象面５−３に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_３における蛍光物質の密度）を示している。

また、図７のフーリエスペクトルのうち、周波数０に現れたピークの高さは、干渉縞のベース輝度（ＤＣ成分）を示している。

したがって、手順（２）のフーリエ変換によると、ＤＣ成分と、観察対象面５−１に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_１における蛍光物質の密度）と、観察対象面５−２に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_２における蛍光物質の密度）と、観察対象面５−３に関する輝度成分（ｚ＝ｚ_３における蛍光物質の密度）とが互いに分離される。

（３）演算装置４０は、図７のフーリエスペクトルから周波数０に現れたピークを消去し、かつ、フーリエスペクトルの周波数軸ｆを、試料５の深さ軸ｚへと座標変換することにより、着目座標（ｘ，ｙ）の深さ方向における蛍光物質の密度分布データ（図８参照）を取得する。

なお、手順（３）の座標変換は、周波数ｆ_１が座標ｚ_１に変換され、周波数ｆ_２が座標ｚ_２に変換され、周波数ｆ_３が座標ｚ_３に変換されるような座標変換である。

（４）演算装置４０は、手順（１）〜（３）を全ての着目座標（ｘ，ｙ）について実行することにより、全ての着目座標（ｘ，ｙ）における深さ方向の密度分布データ（図８参照）を取得する。その結果、観察対象領域５０の全域における蛍光物質の３次元密度分布が求まる（以上、手順（４））。

したがって、本実施形態の３Ｄ照明顕微鏡装置１によれば、ポイントスキャン又はＺスキャンをすることなく観察対象領域５０の３次元構造を観察することができる。

また、本実施形態の観察光学系２０として、焦点深度の長い低倍の結像光学系を使用すれば、観察対象領域５０のｚ方向の幅（イメージ深度）を大きく確保することができる。

なお、上述した説明では、図４（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に示したとおり、縞パターンＦ_１、Ｆ_２、Ｆ_３の各々の縞周波数ｆ_１、ｆ_２、ｆ_３を、ｘ方向にかけて一様と仮定したが、実際にはｘ方向にかけて非一様である。

以下、干渉縞の座標（ｘ，ｚ）における縞周波数ｆ（ｘ，ｚ）が如何なる値になるかを説明する。

ここでは、座標（ｘ，ｚ）における縞周波数ｆ（ｘ，ｚ）を、座標（ｘ，ｚ）における縞ピッチＰ（ｘ，ｚ）によって説明する。縞ピッチＰ（ｘ，ｚ）は、縞周波数ｆ（ｘ，ｚ）の逆数である。

図９に示すとおり、１対の２次ライン光源１８ａ’、１８ｂ’の中心をｘｚ座標の原点とし、１対の２次ライン光源１８ａ’、１８ｂ’の間隔をｄとおくと、座標（ｘ，ｚ）における縞ピッチＰ（ｘ，ｚ）は、以下の式（１）で表される。

よって、例えば、観察対象面５−１上の縞ピッチＰ（ｘ，ｚ_１）は、式（１）にｚ＝ｚ_１を当てはめることによって求めることができる。

また、例えば、観察対象面５−２上の縞ピッチＰ（ｘ，ｚ_２）は、式（１）にｚ＝ｚ_２を当てはめることによって求めることができる。

また、例えば、観察対象面５−３上の縞ピッチＰ（ｘ，ｚ_３）は、式（１）にｚ＝ｚ_３を当てはめることによって求めることができる。

次に、３Ｄ照明顕微鏡装置１のｚ分解能を説明する。

３Ｄ照明顕微鏡装置１のｚ分解能を高めるためには、縞パターンの縞本数差が１本以上である２つの観察対象面の間隔を狭めればよい。そのためには、ｚ方向にかけて縞周波数が大きく変化するような干渉縞を生成すればよい。

その一方で、近接した２つの観察対象面の輝度成分を互いに分離するためには、フーリエスペクトル（図７参照）のｆ軸方向の分解能Δｆを高くする必要がある。そのためには、輝度変化波形（図６参照）のＳ軸方向のデータ範囲（サンプリング範囲）Ｔを大きく確保すればよい（なぜならΔｆ＝１／（２Ｔ）の関係が成り立つ。）。

以上を踏まえ、３Ｄ照明顕微鏡装置１の数値例を以下に説明する。

・光源波長λ：６００ｎｍ
・２次ライン光源１８ａ’、１８ｂ’の間隔ｄ：０．１ｍｍ
・媒質の屈折率ｎ：１．３３
・観察対象領域５０のｘｙ断面サイズ（＝縞ピッチが一様とみなせる観察光学系２０の視野範囲）：４００μｍ×４００μｍ
図１０は、本数値例において、試料５の深さｚと縞周波数ｆとの関係を示す特性カーブ（縞周波数特性カーブ）である。なお、この特性カーブは、式（１）に基づき計算されたものである。

図１０に示すとおりｚ＝１〜ｚ＝１．５［ｍｍ］のｚ座標範囲Ａでは、深さｚの変化量に対する縞周波数ｆの変化量が比較的大きいのに対して、ｚ＝２〜２．５［ｍｍ］のｚ座標範囲Ｂでは、深さｚの変化量に対する縞周波数ｆの変化量が比較的小さい。つまり、干渉縞のうち、２次ライン光源１８ａ’、１８ｂ’に近い部分ほど、高いｚ分解能を実現できる可能性が高い。

図１１（Ａ）は、ｚ座標範囲Ａにおける縞周波数特性カーブを示したものであり、図１１（Ｂ）は、ｚ座標範囲Ｂにおける縞周波数特性カーブを示したものである。なお、図１１（Ａ）、（Ｂ）に示したデータは、量子化されたデータである。この量子化では、データ範囲Ｔで決まるΔｆの値が、ちょうど１（本／ｍｍ）である場合を想定した。

図１１（Ａ）に示すとおり、ｚ座標範囲Ａにおいては、隣接する２つの観察対象面の間隔、すなわちｚ分解能Δｚは、約２０μｍであり、図１１（Ｂ）に示すとおり、ｚ座標範囲Ｂにおいては、隣接する２つの観察対象面の間隔、すなわちｚ分解能Δｚは、約５０μｍであることがわかる。

もちろん、データ範囲Ｔを増加させ、Δｆの値を小さくすれば（分解能を向上させれば）、Δｚはさらに向上することになる。

［実施形態の補足］
なお、本実施形態では、３Ｄ照明顕微鏡装置１の照明光学系１０のタイプを落射照明としたが透過照明としてもよい。その場合は、ビームスプリッタ２８は不要となる。また、リレーレンズ２５、２７も非必須である。

また、本実施形態では、１対のスリット１８ａ、１８ｂへ入射させる光を集光光束としたので、スリットマスク１８における光量ロスが最小限に抑えられる。但し、スリットマスク１８における光量ロスを許容できる場合には、１対のスリット１８ａ、１８ｂへ入射させる光を、集光光束ではなく平行光束としてもよい。

また、本実施形態では、試料５の深さ方向にかけて縞周波数の異なる干渉縞を生成するために、１対の発散する円筒波を使用したが、１対の収束する円筒波を使用してもよい。

また、本実施形態では、試料５の深さ方向にかけて縞周波数の異なる干渉縞を生成するために、１対の発散する円筒波を使用したが、１対の収束する球面波又は１対の発散する球面波を使用してもよい。

また、本実施形態では、試料５の深さ方向にかけて縞周波数の異なる３次元の縞パターンで試料５を照明するために、干渉縞を生成したが、干渉縞を生成する代わりに、２次元の縞パターンが表示されたマスクの像を試料へ投影してもよい。例えば、縞パターンの表示されたマスクの像を、非平行な照明光（発散又は収束光）によって試料５へ投影すれば、試料５の深さ方向にかけて縞周波数の異なる３次元の縞パターンで試料５を照明することができる。なお、マスクとしては、透過型又は反射型の液晶表示素子などを使用することができる。

［実施形態の作用効果］
本実施形態の観察装置（３Ｄ照明顕微鏡装置１）は、観察対象領域（５０）の深さ方向（ｚ方向）にかけて縞ピッチの異なる３次元の縞パターン（干渉縞）で前記観察対象領域（５０）を照明する照明部（照明光学系１０）と、前記縞パターン（干渉縞）で照明された前記観察対象領域の画像を生成する観察部（観察光学系２０、撮像素子３５）と、前記観察対象領域（５０）を前記縞パターン（干渉縞）で走査する走査部（試料ステージ１３Ａ、制御装置３９）と、互いに異なる走査位置で生成された複数の前記画像に基づき、前記観察対象領域（５０）の互いに異なる深さに関する複数の画像成分（輝度成分）を互いに分離する分離部（演算装置４０）とを備える。

したがって、本実施形態の観察装置（３Ｄ照明顕微鏡装置１）は、ポイントスキャン又はＺスキャンせずに前記観察対象領域（５０）の３次元構造を観察することができる。

また、前記照明部（照明光学系１０）は、可干渉な１対の非平行光を前記観察対象領域（５０）で互いに干渉させることにより前記縞パターン（干渉縞）を生成する。

また、前記照明部（照明光学系１０）は、１対のスリット（１８ａ、１８ｂ）を有したスリットマスク（１８）により前記１対の非平行光を生成する。

また、前記分離部（演算装置４０）は、複数の前記画像を走査方向にかけてフーリエ変換することにより前記分離を行う。

１…３Ｄ照明顕微鏡装置、１０１…レーザ光源、１１…光ファイバ、１２…コリメートレンズ、１３…１次元回折格子、１６…シリンドリカルレンズ、１８…スリットマスク、２５、２７…レンズ、５…試料、２８…ダイクロイックミラー、２９…結像レンズ、３５…撮像素子、１３Ａ…試料ステージ、３９…制御装置、４０…演算装置

Claims (6)

1. 観察対象領域の深さ方向にかけて縞ピッチの異なる３次元の縞パターンで前記観察対象領域を照明する照明部と、
   前記縞パターンで照明された前記観察対象領域の画像を生成する観察部と、
   前記観察対象領域を前記縞パターンで走査する走査部と、
   互いに異なる走査位置で生成された複数の前記画像に基づき、前記観察対象領域の互いに異なる深さに関する複数の画像成分を互いに分離する分離部と
   を備えることを特徴とする観察装置。
2. 請求項１に記載の観察装置において、
   前記照明部は、
   可干渉な１対の非平行光を前記観察対象領域で互いに干渉させることにより前記縞パターンを生成する
   ことを特徴とする観察装置。
3. 請求項２に記載の観察装置において、
   前記照明部は、
   １対のスリットを有したスリットマスクにより前記１対の非平行光を生成する
   ことを特徴とする観察装置。
4. 請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の観察装置において、
   前記分離部は、
   複数の前記画像を走査方向にかけてフーリエ変換することにより前記分離を行う
   ことを特徴とする観察装置。
5. 観察対象領域の深さ方向にかけて縞ピッチの異なる３次元の縞パターンで前記観察対象領域を照明する手順と、
   前記縞パターンで照明された前記観察対象領域の画像を生成する手順と、
   前記観察対象領域を前記縞パターンで走査する手順と、
   互いに異なる走査位置で生成された複数の前記画像に基づき、前記観察対象領域の互いに異なる深さに関する複数の画像成分を互いに分離する手順と
   を含むことを特徴とする観察方法。
6. 観察対象領域の深さ方向にかけて縞ピッチの異なる３次元の縞パターンで前記観察対象領域を照明することを特徴とする照明装置。

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