CN115803436A

CN115803436A - 免疫原性降低的新型移植细胞

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Publication number: CN115803436A
Application number: CN202180048711.4A
Authority: CN
Inventors: 金炫娥; 金承玟; 许正贤; 赵晟林; 金孝珍; 林虎勇; 赵诚唯; 黄琉炅
Original assignee: Gc Cell
Current assignee: Gc Cell
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2023-03-14
Also published as: EP4177344A1; JP2023532645A; US20230242894A1; EP4177344A4; KR20220005208A; WO2022010220A1

Abstract

本发明涉及一种用于抑制哺乳动物细胞免疫原性的组合物，以及使用该组合物产生低免疫原性哺乳动物细胞的方法。本发明涉及为治疗目的进行异体移植的细胞，例如干细胞或免疫细胞，所述细胞可有效地用作有效的细胞治疗试剂，其在受体体内具有最小化的免疫排斥与长期维持的活性。

Description

免疫原性降低的新型移植细胞

技术领域

本发明涉及一种通过基因编辑获得的用于细胞治疗的新型组合物，其具有用于高效异体移植的抑制的免疫原性。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是淋巴细胞，约占血细胞的10％，在免疫应答中起着重要作用。NK细胞具有多种功能，特别是能够杀死癌细胞或感染外源性病原体的细胞，从而消除可能受损的异常细胞。

大多数NK细胞在体内通常以失活状态存在，但需要激活的NK细胞才能用于治疗，因此激活来源于正常血液或病人血液中的NK细胞的研究正在积极开展。研究发现，当NK细胞在体外被激活时，NK细胞表现出较高的细胞毒性，因此可用于免疫细胞治疗。此外，研究发现，当通过异体骨髓移植，将体外激活的NK细胞施用于各种癌症患者，特别是白血病等血癌患者时，它们可产生治疗效果(《血细胞分子&疾病(Blood Cells Molecules&Disease)》，33：p261-266，2004)。

同时，目前使用NK细胞的抗癌免疫治疗主要集中在NK细胞抑制性受体上，即，其旨在通过阻断抑制NK细胞活性的抑制受体的功能来提高NK细胞的活性。为此，主要使用利用来自与受体主要组织相容性复合体(MHC)不匹配的供体的异体NK细胞或用抗体阻断抑制性受体功能的方法。由于供体和受体的MHC I类基因型不同，供体NK细胞的抑制性受体(如KIR)不识别受体的MHC I类，因此异体NK细胞的活性没有受到抑制。因此，预计异体NK细胞可能不受可能仍然存在于癌细胞中的MHC I类活性的抑制，因此，它们可能比不能免受MHCI类活性抑制的患者自身的NK细胞更有效地表现出抗癌活性。事实上，异体NK细胞在抗癌治疗方面有很多优势，其最早是在异体造血干细胞移植(HSCT)对血液肿瘤患者的有效治疗中发现的。其他的研究表明，在异体造血干细胞移植中，移植物抗白血病(GVL)反应的很大一部分是由于NK细胞。基于这一事实，许多人尝试将NK细胞给药给癌症患者，这些NK细胞通过体外培养和激活大量从健康供体中分离和纯化的异体NK细胞来获得，这些NK细胞对急性髓系白血病(AML)、多发性髓瘤(MM)等表现出有效的抗癌活性。然而，据报道，完全不匹配的MHC I类异体造血干细胞移植在许多情况下，在一些患者中并没有表现出预期的抗癌活性，并且存在严重的副作用，如“调理疗法”中包含的免疫抑制剂引起的感染。此外，就NK细胞而言，最近的研究表明，在NK细胞分化过程中，抑制性受体与靶细胞MHC I类之间的相互作用(“教导”或“许可过程”)是获得足够的抗癌活性所必需的。因此，预计供体的MHC I类与受体的MHC I类在一定程度上匹配，才能获得具有足够抗癌活性的成熟NK细胞。因此，由于这种影响，目前许多尝试使用与不同MHC I类基因型和NK细胞相匹配的单倍体相合造血干细胞移植治疗血液肿瘤，并发现由此产生的临床预后相对较好。此外，当异体免疫细胞被用作细胞治疗产品时，不可避免地会产生攻击受体自身细胞的移植物抗宿主病(GVHD)等副作用，而在异体NK细胞的情况下，这一问题鲜有报道。据了解，与癌细胞不同，正常细胞几乎不表达NK细胞激活受体的配体，因此不诱导NK细胞激活。目前，除血癌外，将异体NK细胞作为其他实体瘤的细胞治疗产品的研究正在积极开展(Kim,HS，《汉阳医学评论(Hanyang MedRev)》，33：59-64，2013)。

异体NK细胞移植的另一个问题是移植的NK细胞不能在受体体内长时间存活。为了克服这一问题，尝试了在移植后定期添加能够诱导NK细胞增殖的细胞因子IL-2的方法。然而，IL-2会成为一个大问题，因为除了NK细胞外，它可以扩大抑制抗癌免疫反应的调节T细胞(Treg)(Romagne F,Vivier E.,《F1000医学报道(F1000 Med Rep)》，3:9，2011；WaldmannTA.,《自然综述免疫学(Nat Rev Immunol)》，6:595-601，2006)。

通过本说明书，参考和引用了许多出版物和专利文件。所引用出版物和专利文件的公开内容全文以引用方式并入本文中，以更清楚地描述相关技术的状态和本发明。

发明内容

技术问题

本发明人已经进行了广泛的研究，以开发一种有效的细胞治疗产品，该产品在患者体内具有长期的活性，同时显示最小的免疫排斥反应。结果，本发明人发现，当靶向II型HLA基因或其激活蛋白的基因编辑组件，特别是免疫原性诱导剂CIITA的特定部分和B2M基因的特定部分被引入细胞治疗时，抑制细胞的免疫原性的效率最大化，使细胞可以作为极好的异体移植的细胞治疗产品，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种用于抑制哺乳动物细胞免疫原性的组合物，和使用该组合物产生的低免疫原性哺乳动物细胞。

本发明的另一目的是提供一种生产低免疫原性哺乳动物细胞的方法。

从以下对本发明的详细说明、所附权利要求书和附图中，本发明的其他目的和优点将更加明显。

技术方案

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抑制哺乳动物细胞免疫原性的组合物，所述组合物包含作为活性成分的抑制II型HLA蛋白表达的核酸分子。

本发明人已经进行了广泛的研究，以开发一种有效的细胞治疗产品，该产品在患者体内表现出长期活性，同时显示出最小化的免疫排斥。结果，本发明人发现，当靶向II型HLA基因或其激活蛋白的基因编辑组件，特别是免疫原性诱导剂CIITA的特定部分和B2M基因的特定部分被引入治疗细胞时，抑制细胞免疫原性的效率最大化，使细胞可以作为一个极好的用于异体移植的细胞治疗产品。

如本文所述，术语“核酸分子”一词的含义全面包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子，以及核苷酸，而核苷酸作为核酸分子的基本结构单位，不仅包括天然核苷酸，还包括糖或碱基位点被修饰的类似物(Scheit，《核苷酸类似物(Nucleotide Analogs)》，John Wiley，纽约(1980)；Uhlman和Peyman，《化学综述(Chemical Reviews)》，90：543-584(1990))。

如本文所述，术语“表达抑制”是指通过降低靶基因的活性或表达，使靶基因的活性或表达无法被检测，或靶基因的存在水平不显著，或靶基因的生物学功能显著降低。根据本发明，用于抑制表达的核酸分子具体是与所述感兴趣的基因序列互补的核酸分子，并且其实例包括但不限于shRNA、siRNA、miRNA、向导RNA(gRNA)和反义寡核苷酸。此外，本领域中任何已知的核酸分子都可以作为抑制基因表达的手段。

根据本发明的一个具体实施方案，所述核酸分子是向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核苷酸序列，所述向导RNA特异性识别编码II型HLA蛋白或其激活蛋白的核苷酸序列。

如本文所述，术语“向导RNA(gRNA)”是指用于基因编辑系统的RNA分子，它能识别靶基因并诱导核酸酶特异性地切割识别的位点。这种基因编辑系统的一个典型示例是CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复)系统。

如本文所述，“特异性识别”意味着gRNA可通过具有与靶核苷酸序列互补的序列来选择性地与靶核苷酸序列杂交。术语“互补”是指gRNA在一定的退火或杂交条件下，具有足够的互补能力，可以选择性地与靶序列杂交。术语“互补”意指包括基本上互补和完全互补的两者，并且优选地指完全互补的。如本文所述，术语“基本上互补的序列”指的是一个完全匹配的序列，但也包括一个在gRNA可以退火到特定序列并作为gRNA使用的范围内与比较序列部分不匹配的序列。

当考虑到具有生物等效活性的变体时，将在本发明中被特异性识别以抑制其表达的核苷酸序列解释为包括与II型HLA基因的已知序列具有实质上同一性的序列。术语“实质上同一性”指的是，当将核苷酸序列与任何其他序列对比，以便尽可能紧密地相互对应，并使用本领域中常用的算法分析对齐后的序列时，一个序列具有至少70％的同源性，具体地至少80％，更具体地至少90％，最具体地至少95％。序列比较的对齐方法在本领域是众所周知的。在Huang等人，《计算机应用生物科学(Comp.Appl.BioSci.)》，8：155-65(1992)和Pearson等人，《分子生物学方法(Meth.Mol.Biol.)》，24：307-31(1994)中描述了各种对齐的方法和算法。NCBI基于局部对齐搜索工具(BLAST)(Altschul等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，215：403-10(1990))可通过NCBI或类似工具访问，并可与互联网上的blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx等序列分析程序结合使用。

更具体地，所述的II型HLA蛋白的激活蛋白是II型HLA蛋白的反式激活因子，更具体地，是一种II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)蛋白。

根据本发明的具体实施方案，所述组合物还包括RNA导向的内切核酸酶或编码RNA导向的内切核酸酶的核苷酸序列。“RNA导向的内切核酸酶”是一种由识别靶基因位点的gRNA引导并切割靶基因的酶，这种RNA导向的内切核酸酶可以以mRNA或蛋白质的形式传递，也可以通过装载编码其的DNA的载体转化传递到靶细胞。当以蛋白质形式存在的核酸内切酶被使用时，所述核酸内切酶可与向导RNA形成核糖核蛋白复合体(RNP)。

如本文所用，术语“RNP复合体”包括作为活性成分的向导RNA和RNA导向的内切核酸酶，并且所述复合体可以识别和结合靶序列，并选择性地切割或剪切靶序列。例如，所述RNA复合体可以是Cas9-gRNA复合体，但不限于此。

在本发明的一个实施方案中，所述的RNA导向的内切核酸酶可以是选自下组的任何一种：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas 13a、Cas 13b、Cas 13c、Cas 13d、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和MAD7。具体地，所述的RNA导向的内切核酸酶是Cas9(CRISPR相关蛋白9)、Cpf1(来自普雷沃氏菌和弗兰西斯菌1的CRISPR)或MAD7。

如本文所用，术语“核苷酸序列”一词的含义全面包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子。核苷酸是核酸分子的基本结构单位，不仅包括天然核苷酸，也包括糖或碱基位点被修饰的类似物。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在本发明中编码gRNA或RNA导向的内切核酸酶的核苷酸的序列不限于所附序列表中列出的核苷酸序列。核苷酸序列的突变可能不会导致蛋白质(例如内切核酸酶)的改变，并且这种核苷酸序列的示例包括所有含有功能上等同的密码子、编码同一氨基酸的密码子(通过密码子的简并)或编码生物学上等效的氨基酸的密码子的核酸分子。

根据本发明一个具体的实施方案，gRNA特异性识别选自下组的核苷酸序列：SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:40和SEQ ID NO:44，或与其互补的序列。

根据本发明一个具体的实施方案，本发明所述的组合物还包括抑制β2-微球蛋白表达的核酸分子。

更具体地，所述的核酸分子是向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核苷酸，所述向导RNA特异性识别编码β2-微球蛋白的核苷酸序列。

更具体地，所述的核酸分子是向导RNA(gRNA)特异性识别选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14，或与其互补的序列。

根据本发明一个具体的实施方案，所述组合物还包括编码I型HLA蛋白的核酸分子。更具体地，所述的I型HLA蛋白是HLA-E蛋白。

异体细胞移植的另一个问题是移植的治疗细胞不能在受体体内长时间存活。为了克服这一问题，已经提出了一种移植后定期注射能够诱导细胞增殖的特定细胞因子的方法，但细胞因子如IL-2可能在抗癌治疗中引起不良反应，因为它们可以扩增抑制抗癌免疫反应的调节性T细胞(Romagne F，Vivier E.，《F1000医学报道(F1000Med Rep)》，3:9，2011；Waldmann TA.，《自然免疫学综述(Nat Rev Immunol)》，6:595-601，2006)。因此，本发明人尝试引入HLA-E，其可通过刺激免疫细胞或干细胞等治疗细胞上的抑制性受体CD94/NKG2A来防止细胞死亡。如下实施例所示，经证实，引入HLA-E可以防止根据本发明进行治疗的移植细胞被受体的免疫反应杀死，说明这些细胞可能在受体体内长期存活的同时表现出药理作用。

如本文所用，术语“表达”是指允许靶细胞表达外源基因或使用基因传递系统人工引入内源基因，以提高内源基因的自然表达水平，使基因作为染色体外因子或通过染色体整合到受试者的细胞中进行复制。因此，术语“表达”与“转化”、“转染”过“转导”具有相同的含义。

如本文所用，术语“基因传递系统”是指将基因传递到细胞内的任何方法，并且所述的基因传递与基因的细胞内转导具有相同的含义。在组织水平上，术语“基因转移”与基因的传播具有相同的含义。因此，本发明所述的基因传递系统可被描述为基因转导系统和基因传播系统。

为了产生本发明的基因传递系统，本发明所述的核苷酸序列优选地存在于合适的表达结构中。在表达结构中，本发明所述的核苷酸序列优选地可操作地连接到启动子。如本文所用，术语“可操作地连接”是指一个核酸表达调控序列(如启动子、信号序列或转录调控因子结合位点阵列)与另一个核酸序列的功能连接，并且通过该连接，所述的调控序列调节另一个核酸序列的转录和/或翻译。本发明所述的与核苷酸序列连接的启动子是可以通过在动物细胞(更具体地说，是哺乳动物细胞)中特定作用来调节HLA-E基因的转录的启动子，例如，包括从哺乳动物病毒衍生的启动子和从哺乳动物细胞基因组衍生的启动子。所述的启动子包括但不限于，哺乳动物巨细胞病毒(CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子和人GM-CSF基因启动子。

HLA-E基因的核苷酸序列可应用于任何用于普通基因导入的基因传递系统。优选地，所述的HLA-E基因的核苷酸序列可应用于质粒、腺病毒(Lockett LJ等人，《临癌症研究(Clin.Cancer Res.)》，3:2075-2080(1997))，腺相关病毒(AAV)(Lashford LS等人，《基因治疗技术、应用和调控(Gene Therapy Technologies,Applications and Regulations)》A.Meager编，1999)、逆转录病毒(Gunzburg WH等人，逆转录病毒载体，《基因治疗技术、应用和调控(Gene Therapy Technologies,Applications and Regulations)》A.Meager编，1999)、慢病毒(Wang G等人，《临床调查杂志(J.Clin.Invest.)》，104(11)：R55-62(1999))、单纯疱疹病毒(Chamber R等人，《美国国家科学杂志(Proc.Natl.Act.Sci USA)》，92：1411-1415(1995))、痘苗病毒(Puhlmann M等人，《人类基因治疗(Human Gene Therapy)》，10:649-657(1999))、脂质体(《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》，199，S.C.Basu和M.Basu(编)，人类出版社2002)或类脂质体。具体地，本发明所述的基因传递系统可通过将本发明的核苷酸分子应用于慢病毒而制备。

在本发明中，当基于病毒载体构建基因传递系统时，根据本领域已知的病毒感染方法执行接触步骤。利用病毒载体感染宿主细胞的方法在上文引用的文献中有描述。

根据本发明的一个具体实施方案，本发明所述的组合物所引入的细胞是用于移植的异体或自体细胞，更具体地，是用于移植的异体细胞。

更具体地，所述的细胞是干细胞或免疫细胞。

如本文所用，术语“干细胞”是指处于分化为构成组织的各种类型细胞之前阶段的未分化细胞，并统称为在特定分化刺激(环境)下具有分化为特定类型细胞的能力的细胞。与停止细胞分裂的分化细胞不同，所述的干细胞可以通过细胞分裂(自我更新)产生与自己相同的细胞，并且当施加分化刺激时，所述的干细胞具有分化的可塑性，可以根据刺激的性质分化为不同类型的细胞。

应用于本发明的干细胞是不受限制的，且具有干细胞特征，即未分化、不确定增殖和能够分化为特定类型细胞的细胞是可应用于本发明的细胞。具体地，在本发明中所使用的干细胞是间充质干细胞或多功能性干细胞。

如本文所用，术语“间充质干细胞”是指具有分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞及心肌细胞的多能性的干细胞。间充质干细胞可通过纺锤形等形态学特征和基本细胞表面标记物CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)的表达水平进行鉴定。间充质干细胞的一个重要特征是还具有调节免疫反应的功能。据报道，间充质细胞具有分化为骨组织、中枢神经系统组织、皮肤组织和肌肉组织的能力，因此可通过适当的分化诱导剂用于这些生理上已丢失的组织的再生，并通过抑制T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突状细胞的增殖、功能和活性，表现出较强的免疫调节作用。说明它们也可用于治疗各种疾病，如排斥反应、自身免疫疾病、炎症和过敏性疾病，这些疾病都是由不必要的或过度的免疫反应引起的。因此，当本发明应用于间充质干细胞时，可将其应用于各种退行性疾病的再生治疗或自身免疫/炎症疾病的治疗。

如本文所用，术语“多能干细胞”是指比受精卵发育得更成熟，且能够分化为由内胚层、间充质和外胚层构成的细胞的干细胞。根据本发明的一个具体实施方案，在本发明中所用的多能干细胞是胚胎干细胞(ESCs)、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞或诱导多能干细胞(iPSCs)。更具体地，所述多能干细胞是诱导多能干细胞。

如本文所用，术语“诱导多能干细胞”是一种通过插入与未分化的或多能表型相关的特定基因，从非多能干细胞(如体细胞)中人工获得的多能干细胞。在本领域中，诱导多能干细胞被认为具有与天然多能干细胞(如胚胎干细胞)相同的表型、生理特征和发育特征，因为其具有干细胞基因和蛋白表达、染色体甲基化、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、活嵌合体形成、杂交能力和分化能力。

如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与免疫反应的启动或提升的任何细胞，更具体地是指免疫效应细胞。免疫细胞包括但不限于，例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和肥大细胞。更具体地，所述免疫细胞是自然杀伤细胞。

当本发明应用于免疫细胞时，可将其应用于肿瘤和感染性疾病的治疗。根据本发明的方法产生的NK细胞可以应用于所有类型的肿瘤，包括实体癌和血液癌。与血液癌不同，实体癌是指在器官中形成块状的癌症，包括发生在大多数器官中的癌症。可以使用根据本发明的NK细胞治疗的肿瘤没有特别限制，包括胃癌、肝癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓性白血病、脑肿瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌、淋巴瘤等，但不限于此。可以使用本发明的免疫细胞治疗的感染性疾病是由病毒或病原体感染引起的疾病，并且包括可能由呼吸器官、血液、皮肤接触等感染引起的所有疾病。这些感染性疾病包括但不限于，例如，乙型和丙型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)感染、巨细胞病毒感染、病毒性呼吸道疾病和流感。

如本文所用，术语“治疗”是指(a)抑制疾病、紊乱或症状的发展；(b)减轻疾病、紊乱或症状；或(c)消除疾病、紊乱或症状。当将导入了本发明的免疫原性抑制组合物的干细胞给药给受试者时，它们用于抑制由过度或不需要的免疫反应引起的症状的发展，或消除，或减轻症状，并且当将导入了本发明的免疫原性抑制组合物的免疫细胞给药给受试者时，它们用于诱导癌细胞或感染细胞的死亡，从而抑制由肿瘤或传染病引起的症状的发展，或消除或减轻症状。因此，本发明的组合物本身可以作为疾病的细胞治疗组合物，也可以与其他药学成分一起给药，作为疾病的治疗辅助剂使用。因此，如本文所用，术语“治疗”或“治疗剂”包括“治疗佐剂”或“治疗辅助剂”的含义。

如本文所用，术语“给药”或“施用”是指将治疗有效量的本发明的组合物直接给药给受试者，使得在受试者体内形成相同的量。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以向本发明的组合物将被给药的受试者提供治疗或预防效果的组合物的量，并且因此所述术语旨在包括“预防有效量”。

如本文所用，术语“受试者”包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴。具体地，本发明所述的受试者是人。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了使用本发明的上述组合物产生的低免疫原性哺乳动物细胞。

由于上文已经描述了根据本发明的用于抑制免疫原性的组合物和导入所述组合物的靶细胞，因此将省略其描述以避免过度重复。

根据本发明的另一个方面，提供了一种用于产生低免疫原性(免疫原性低的)哺乳动物细胞的方法，包括：

(a)抑制分离自哺乳动物受试者的细胞中的蛋白的表达，其中所述蛋白选自下组：β2-微球蛋白、II型HLA蛋白、II型HLA蛋白的激活蛋白及其组合；和

(b)将HLA-E基因导入细胞。

根据本发明，研究发现，在根据本发明的用于同种异体移植的具有长期维持的活性同时具有降低的免疫原性的治疗性细胞的生产中，依次进行抑制免疫原性基因的过程和引入抑制受体NK细胞攻击的基因的过程，所生产的细胞具有优异的生长特性、生存能力和活性。

如后述的实施例所示，经证实，当首先进行HLA-E导入时，具有HLA-ABC-/HLA-E⁺表型的细胞的产量非常低，这与预期的即使移除B2M基因，因为HLA-E的表达仍在继续，具有HLA-ABC-/HLA-E⁺表型的NK细胞也能培养过程中维持生存和生长相反，然而去除免疫原性基因，然后引入HLA-E的过程中显示出较高的产量，在培养结束前，具有HLA-ABC-/HLA-E⁺表型的细胞的产量为96％或以上，表明该工艺序列是生产本发明的低免疫原性哺乳动物细胞的最佳工艺序列。

根据本发明的一个具体实施方案，可以使用用于抑制上述每种蛋白表达的核酸分子并使用上述核酸内切酶来执行步骤(a)。由于这些核酸分子和核酸内切酶已在上文进行了描述，因此将省略对其的描述以避免过度重复。

根据本发明的一个具体实施方案，步骤(b)可以在步骤(a)完成后1-5天内执行，更优地2-5天，最佳地3天。

有利效果

本发明的特征和优点总结如下：

(a)本发明提供了一种用于抑制哺乳动物细胞免疫原性的组合物以及使用该组合物产生低免疫原性哺乳动物细胞的方法。

(b)本发明的用于疾病治疗的异体移植细胞，如干细胞或免疫细胞，可以用作有效的细胞治疗产品，其具有长期活性并使受体的免疫排斥最小化。

附图简述

图1显示了B2M基因经gRNA处理3天后，用FACS检测HLA-ABC表达水平的结果。

图2显示了测量根据用于本发明基因编辑系统的用于传递的穿梭剂的浓度B2M基因敲除效率的结果。

图3显示了根据B2M基因敲除NK细胞培养的HLA-ABC表达率的变化。

图4显示的结果表明，通过HLA-E转导B2M-NK细胞的活性提高。

图5显示了B2M敲除或HLA-E转化的NK细胞的活力和生长速率。

图6显示了根据一种生产方法的Log-NK表型和生产效率。

图7显示了根据Log-NK的培养时间的HLA-ABC和HLA-E的表达水平。

图8显示了在Log-NK培养结束时，NK特异性标志物的表达水平。

图9显示了根据Log-NK培养的细胞的活力和生长速率。

图10显示了Log-NK杀伤癌细胞系能力的评估结果。图10a显示了K562癌细胞系被野生型NK细胞或Log-NK细胞裂解的程度，图10b显示了野生型NK细胞或Log-NK细胞与K562靶细胞接触后细胞因子的表达水平。

图11a显示了使用钙黄素AM观察经CD8(+)T细胞裂解的野生型NK细胞的比例的结果，图11b显示了使用CFSE观察经CD8(+)细胞长时间裂解的野生型NK细胞和Log-NK的比例的结果。

图12显示了流式细胞术检测CIITA基因敲除对NK细胞中抑制II型HLA基因表达的结果。

图13显示了流式细胞术检测CIITA基因敲除后各培养时间点NK细胞中抑制II型HLA基因表达的结果。

图14a显示了同时去除B2M和CIITA基因的NK细胞的制备过程的示意图，图14b显示了用图14a所示的每种方法产生的NK细胞中双敲除B2M和CIITA的效率。图14c和14f分别显示了B2M和CIITA基因中预测的gRNA靶区和脱靶区的序列。图14d和14e显示了在B2M的三个预测脱靶区没有出现插入/删除。图14g和14h显示了在CIITA的两个预测脱靶区没有出现插入/删除。

图15显示了通过图14a所示的生产方法1(图15a)和图14a所示的生产方法2(图15b)所产生的Log-NK-CIITA KO细胞的扩增率和活力。

图16显示了培养期间Log-NK-CIITA KO细胞表型的验证结果。图16a显示了抑制HLA-ABC和HLA-DR/DP/DQ的表达，图16b显示了HLA-E的表达。

图17显示了分别使用钙黄素-AM(图17a)和CFSE(图17b)细胞染色方法测定的Log-NK-CIITA KO细胞杀伤癌细胞能力的结果。

图18显示了通过各种gRNA传递方法对B2M(图18a)和CIITA(图18b)基因敲除效率的验证结果。

图19显示了检查本发明的Log-NK-CIITA KO细胞是否可以逃避受体CD8(+)T细胞(图19a)和CD4(+)T细胞(图19b)的攻击的结果。

发明方式

在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。这些实施例只是为了更详细地说明本发明，而且对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的是，根据本发明的主题的本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例

实施例1：使用基因剪刀敲除B2M基因

使用从供体捐赠的脐带血中分离出的脐带血自然杀伤(CBNK)细胞产生低免疫原性NK细胞。

β2m对存在于细胞表面的人类白细胞抗原HLA-A、HLA-B和HLA-C来说是常见的，由B2M基因表达产生。对于不表达HLA-ABC的NK细胞的制备，通过以下方法采用基因剪刀技术切割NK细胞基因组中B2M基因的所需部分以抑制β2m的表达。

首先，如下所述，在1.5mL离心管中制备RNP(核糖核蛋白)(gRNA和核酸酶的复合物)的反应溶液，使其在室温下反应5分钟或更长时间，然后在60分钟内使用。

将具有用于切割B2M基因的不同序列的每种20μL gRNA(由IDT合成，10μM)与26.84μL的1X PBS中的3.32μL的40μM Cpf1核酸酶(Feldan治疗(Feldan Therapeutics))或与26μL的1X PBS中的4μL的MAD7核酸酶(Feldan治疗)混合，然后使其在室温下反应5分钟或更长时间，以获得RNP反应溶液。制备的RNP反应溶液最多可用于1-4X 10⁶个细胞，在该实施例中，使用ADAM细胞计数系统(纳诺恩泰(NanoEntek))计数细胞，然后使用2×10⁶个NK细胞。将2x10⁶个NK细胞置于单独的1.5mL离心管中，以2,000rpm的转速离心3分钟，然后去除上清液。向其中加入500μL 1X PBS，然后以2,000rpm离心3分钟，去除上清液，仅留下细胞。将2μL的Feldan穿梭剂(Feldan shuttle)(Feldan治疗，5μM)加入到另一个1.5mL离心管中的48μL的αMEM培养基(西格玛(Sigma)，M8042)中，然后向其中加入50μL的RNP反应溶液并混合。然后，将混合溶液加入到去除了上清液的NK细胞中，使其在室温下静置反应1分30秒。接下来，加入含有1％(v/v)人血浆和1000IU hIL-2(阿地白介素注射液(Proleukin Inj.)，韩国诺华(Novartis Korea))的Cellgro培养基(Cellgenix，20802-0500)2mL，悬浮NK细胞，并转移到6孔板中培养。

静置培养72小时后，收集2X 10⁵个NK细胞，并以1,200rpm离心5分钟，然后去除培养基。接下来，将细胞悬浮于含有2mL 2％FBS的FACS缓冲液中，并以2,000rpm离心3分钟，去除上清液，仅留下NK细胞。接下来，将100μL的FACS缓冲液加入到细胞中，然后在细胞中加入下表1所示的用于分析的抗体，并在4℃下反应30分钟。将2mL FACS缓冲液加到细胞中，然后以2,000rpm离心3分钟。去除上清液，并加入300μL固定液(BD，554655)固定NK细胞。然后，使用流式细胞仪LSRFortessa(BD生物科学(BD Bioscience))分析染色的NK细胞表面上的表达。

作为能够使用Cpf1或MAD7核酸酶切割B2M基因的导向RNA(gRNA)，使用benchling(ttps://benchling.com)和CRISPR RGEN工具(www.rgenome.net)程序选择的gRNA候选序列如下表2所示。通过FACS分析HLA-ABC的表达来评估各gRNA的敲除效率。

[表1]用于NK细胞表型的FACS分析的抗体

[表2]靶向B2M的gRNA候选序列

结果证实，在19条gRNA序列中，4条gRNA序列中B2M基因被敲除率最高，分别为#1(ATCCATCCGACATTGAAGTT)、#8(AGTGGGGGTGAATTCAGTGTA)、#9(AGTGGGGGTGAATTCAGTGTAGT)和#14(AGCAAGGACTGGTCTTTCTAT)(图1)。在这4条序列中，筛选出效率最高的#9gRNA，将其用于用Cpf1进行B2M基因敲除。当使用Cpf1时，gRNA的长度适用范围为19～23bp，并且当靶向同一区域时，脱靶现象可以随着序列长度的增加而减小。与此同时，对于MAD7核酸酶，使用了21bp的gRNA，因此使用了与#9gRNA序列切割相同区域，但长度缩短了2bp的#8gRNA。

使用#8和#9gRNA和Cpf1或MAD7切割NK细胞中的B2M基因，然后分离基因组DNA并进行全基因组测序。如果基因组DNA序列中有4个或更少的核酸序列与gRNA序列不匹配，则认为这是一个潜在的脱靶区，并检测脱靶区是否确实发生了插入/缺失。结果，鉴定了3个预测的脱靶区，并对基因插入/缺失进行了测序，结果证实在两个预测区域没有插入/缺失。在4号染色体区域有插入/缺失，但这些是在对照NK相同的位置观察到的插入/缺失。结果证实，使用#8和#9gRNA敲除B2M不会导致预测的脱靶区发生突变(附录1)。

在这个实施例中，使用穿梭剂(Feldan治疗)作为肽载体将RNP反应溶液输运到细胞中，但也可以使用各种输运方法，如电穿孔、脂质体或阳离子聚合物(如聚精氨酸)。

实施例2：用于B2M基因敲除的穿梭剂效率的评价

使用穿梭蛋白敲除B2M基因。所用的穿梭剂的序列如下表3所示，并且以与实施例1中所述相同的方式进行B2M基因敲除。

[表3]使用的穿梭剂的序列

穿梭剂	氨基酸序列
		FSD64d1	LLKIWSRLIKIWTQGRRLGGSGGGSARAARQAR(SEQ ID NO:45)

检测了使用5μM和10μM穿梭剂敲除CBNK细胞中B2M基因的效率，结果证实，5μM的FSD64d1穿梭剂在B2M敲除效率和细胞活力方面优于10μM(图2)。因此，在以下实施例中，使用5μM的FSD64d1穿梭剂进行B2M敲除。

实施例3：低免疫原性NK细胞的制备和体外评价

在培养敲除B2M基因的NK细胞时，确认了B2M和HLA-ABC的表达，结果证实，不同时表达B2M和HLA-ABC的细胞在总细胞中所占的比例随着时间的推移而下降(图3)。为了证实图3的结果是否由于敲除B2M基因而抑制HLA-ABC表达的NK细胞受到了表达HLA-ABC的NK细胞的攻击，制备以下各组并进行体外凋亡测定：野生型CBNK；分离仅B2M基因敲除的NK细胞获得的一组(B2M KO NK)；将scHLA-E转导至野生型CBNK而获得的一组(HLA-E TD NK)；分离仅B2M基因敲除的NK细胞并向其中转导scHLA-E而获得的一组(B2M KO/HLA-E TD NK)。由于已知HLA-E基因抑制外源细胞受到宿主NK细胞的攻击，因此将其引入B2M基因敲除的NK细胞中。可以预期，这种具有B2M-/HLA-E⁺表达特征的异体低免疫原性的NK细胞在体内注射时，可以逃避宿主细胞中CD8(+)T细胞和NK细胞的攻击。

3-1)B2M KO NK细胞(B2M^-NK)的制备

敲除第3天，当不表达HLA-ABC的细胞比例维持在最高水平时，分离出B2M基因敲除的NK细胞。通过离心收集B2M基因敲除的NK细胞，然后去除取上清。将细胞以1×10⁷个细胞/100μL的浓度悬浮于含有MACS缓冲液(0.5％FBS(GIBCO)、2mM EDTA(英杰公司(Invitrogen)))的PBS(龙沙(Lonza))中，每100μL细胞悬液中加入10μg生物素结合的B2M抗体(英杰公司,MA1-19506)，随后4℃染色15分钟。接下来，加入MACS缓冲液2ml,1200rpm离心5分钟，然后去除上清液。随后，将成球的NK细胞悬浮于80μL的MACS缓冲液中，在细胞悬液中加入20μL的抗生物素微珠(美天旎生物技术(Miltenyi Biotec),130-090-485)，使其在4℃反应15分钟。接下来，在细胞悬浮液中加入2ml洗涤缓冲液(美天旎生物技术,130-091-222)，以1200rpm离心10分钟，然后取出上清。将NK细胞悬浮于500μL洗涤缓冲液中。将LS柱(美天旎生物技术)固定在QuadroMACS^TM分离器(美天旎生物技术)上，并用2mL洗涤缓冲液洗涤，使悬浮的NK细胞通过色谱柱。然后，用3ml洗涤缓冲液通过柱，回收未与柱结合的B2M敲除细胞。计数细胞后，将细胞以1×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮于NK细胞培养基中，并置于适当大小的孔板容器中培养。

3-2)HLA-E TD NK细胞(HLA-E⁺NK)的制备

使用慢病毒载体在NK细胞中表达单链HLA-E三聚体(scHLA-E)。作为本发明使用的单链HLA-E三聚体，在对其编码核酸序列(SEQ ID NO：46)的密码子进行优化后，使用US20050196404A1中公开的氨基酸序列。表达密码子优化的单链三聚体序列的慢病毒载体由Flash疗法(Flash Therapeutics，法国)生产。

为了将scHLA-E转导到NK细胞，制备了50MOI(多重感染)scHLA-E慢病毒载体和10μg/mL促转导素-A(Protransduzin-A)(免疫诊断(immunodiagnostik)/A 2115AG.1)的复合物，在室温下静置5分钟以上，然后用该复合物处理培养容器中的NK细胞。用6μM的5Z-7-氧杂烯醇(TOCRIS#360420)和20ng/mL的IL-21(百进(Biolegend)/571204)共同处理培养基，以促进慢病毒载体在细胞中的导入和表达。

3-3)B2M KO/HLA-E TD NK细胞(B2M-/HLA-E⁺NK)的制备

将上述3-1)所述生产的B2M KO NK细胞置于培养容器中，然后用上述3-2)中所述的scHLA-E转导。最后，获得经基因工程改造以具有HLA-ABC^-/HLS-E⁺或HLA-ABC^-/HLS-E⁺的低免疫原性NK细胞，并且本发明人将所获得的NK细胞命名为“Log-NK”(Log-持续的NK)。使用下表4所示的抗体，通过流式细胞仪分析产生的NK细胞。

[表4]用于NK细胞表型FACS分析的抗体

标志物	抗体信息(荧光/生产商/货号)	使用抗体的量
			人CD56	APC/BD生物科学/555518	5μL
人HLA-ABC	BV421/BD生物科学/565332	0.5μL
			人CD3	FITC/BD生物科学/555332	5μL
人HLA-E	PE/百进/342604	1μL
			7-AAD	PerCp-Cy5.5/贝克曼库尔特/A07704	5μL

实施例4：低免疫原性NK细胞的体外表征

用1X PBS洗涤4组作为靶细胞的NK细胞(野生型CBNK、B2M^-NK、HLA-E⁺NK和B2M^-/HLA-E⁺NK)，然后去除上清液。将细胞以1x10⁶细胞/ml的浓度悬浮于1mL的检测培养基中(含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(Gibco，11875093))，然后向其加入30μL的钙黄素-AM(分子探针(Molecular probe)，C34852)，接下来在37℃CO₂培养箱中培养1小时。接下来，用检测培养基将细胞洗涤两次，然后以1x10⁵细胞/ml的浓度悬浮在10mL检测培养基中。与此同时，也用1X PBS洗涤作为效应细胞的PBNK(来自供者外周血NK细胞)或CBNK(来自供者脐带NK细胞)，然后去除上清液，将细胞以3x10⁶细胞/ml的浓度、30:1的效应细胞：靶细胞比例，或1x10⁶细胞/ml的浓度、10:1的效应细胞：靶细胞比例悬浮于检测培养基中。在圆底96孔板的三孔中分别加入按30:1或10:1的比例制备的效应细胞100μL，然后在每孔中加入浓度为1×10⁵/mL的靶细胞100μL。制备自发释放孔和最大释放孔，通过公式计算细胞杀伤能力。向跨孔中加入100μL染色的靶细胞，各加入100μL检测培养基。在每个自发释放孔中加入100μL染色的靶细胞和100μL检测培养基。在每个最大释放孔中加入100μL染色的靶细胞和100μL 2％Triton-X 100溶液。为了校正检测培养基和2％Triton-X 100溶液中存在的自身荧光值，加入200μL的检测培养基以制备培养基值，并加入100μL 2％Triton-X 100溶液至100μL的检测培养基中以制备两种溶液的混合溶液的值。将培养基的值减去混合溶液的值得到差值(A)，并将差值(A)与最大释放培养基的值相加，来校正自身荧光值。将平板置于CO₂培养箱中，37℃避光孵育4小时，然后以2,000rpm离心3分钟。在96孔黑色板的每个孔中加入100μL上清液，并使用荧光酶标仪(珀金埃尔默(Perkin Elmer)，VICTOR Nivo)测定荧光值(OD_480/535nm)。根据荧光值，使用以下公式计算效应细胞杀伤靶细胞的能力：

细胞杀伤能力(％)＝(样品孔的平均荧光值-自发孔的平均荧光值)/{(最大释放孔的平均荧光值+A)-自发孔的平均荧光值}x100

经证实，B2M敲除(KO)NK组(供体1)容易被来自另一个供体(供体A或供体B)的PBNK细胞或来自同一供体(供体1)的野生型NK细胞攻击。另一方面，观察到表达HLA-E的HLA-ETD NK或B2M KO/HLA-E TD NK组中攻击程度明显降低，表明表达HLA-E的NK细胞可以有效地躲避来自其他供体NK细胞或表达HLA-ABC的野生型NK细胞的攻击(图4)。下表5给出了用FACS分析方法测定效应细胞表面HLA-E结合受体NKG2A和NKG2C表达的结果。

[表5]效应细胞上NKG2A和NKG2C的表达

效应细胞	NKG2A表达(％)	NKG2C表达(％)
			PBNK(供体A)	31	48
PBNK(供体B)	76	17
			CBNK(供体1)	96	17

此外，研究显示，当将生产的基因工程化NK细胞组单独培养时，各组间存活率无显著差异，但B2M KO NK组的生长速度明显低于其他各组(图5a和5b)。

实施例5：Log-NK细胞(B2M^-/HLA-E⁺NK细胞)制备方法的优化

通过如下表6所示的四种不同方法，制备因B2M基因敲除而抑制HLA-ABC表达并转导HLA-E基因的Log-NK细胞。

[表6]Log-NK制备方法

每个过程的详细实验方法和表达特性的FACS分析方法如实施例1和实施例3所示。在图6中，每个图的第二象限(粗体实线)区域代表Log-NK细胞。在制备方法1中，在NK细胞培养的起始时间第7天，用B2M gRNA处理细胞，3天后，只分离B2M^-细胞，然后将scHLA-E转导到细胞中表达。结果证实，直到培养结束前，Log-NK细胞的存在率达到96％或以上。

在制备方法2中，第14天，即整个培养周期的1/3，将scHLA-E转入细胞并表达，3天后敲除B2M，不进行B2M^-细胞的分离过程。由于表达HLA-E的细胞可以躲避其他NK细胞的攻击，因此可以预期，即使敲除B2M基因，HLA-E的表达仍会继续，细胞的生存和生长也能得到维持。然而，实际结果显示，Log-NK细胞的产生效率较低(约13％)，且随着培养时间的延长，Log-NK细胞呈现下降趋势，因此在终点时已无Log-NK细胞残留。

在制备方法3中，与制备方法1中一样，在培养的第7天开始生产过程，并且以相反的顺序进行B2M敲除和HLA-E转导，然后分离B2M^-细胞，从而产生Log-NK细胞。结果证实，Log-NK细胞的生产效率(87％)高于制备方法2，但在培养结束时，Log-NK细胞减少到20％左右，产量非常低。

在制备方法4中，在培养第7天敲除B2M，并在不进行分离B2M^-细胞的过程而转导HLA-E，然后进行培养。经证实，与前三种制备方法相比，Log-NK细胞难以获得(约3％)。

由以上结果证实，本发明的抑制B2M基因表达以通过抑制HLA-ABC表达来消除免疫原性，并表达HLA-E以逃避其他NK细胞的攻击的Log-NK细胞，用制备方法1获得的效果最好。

实施例6：NK或Log-NK细胞的培养和表征

在培养的起始日、培养第14天和培养第28天，使用饲养细胞进行再刺激培养CBNK或Log-NK细胞。培养中使用的饲养细胞为用4-1BBL、mbIL-21(膜结合型IL-21)和mTNF-α(膜TNF-α)基因转化的CD4+T细胞。每隔14至16天，可使用饲养细胞进行再刺激。在合适的培养容器中静止培养的Log-NK细胞在培养长达39天后被冷冻，并且可以根据细胞生长速率培养长达42天。如果需要超过42天的培养，则可以在培养的第42天用饲养细胞重新刺激进行连续培养。用表7所示的抗体对NK或Log-NK细胞进行染色，检测纯CD3^-/CD56⁺的NK细胞是否保持Log-NK(HLA-ABC-/HLA-E⁺)表型，直至培养结束。结果，经证实，Log-NK细胞中HLA-ABC基因的表达维持在5％或更低，并且各类型细胞中的HLA-E表达水平(平均荧光强度，MFI)保持高于野生型NK细胞(图7)。培养结束时，为了鉴定NK细胞特异性标记物，使用表7所列标志物对应的抗体与表4所示的人CD56、人CD3和7AAD抗体共制成14个染色管，然后以与实施例3中所述相同的方式，通过流式细胞术分析标志物的表达。结果证实，与野生型相比，活性标志物没有显著降低或抑制性标记物没有显著增加(图8)。

在培养第10天(即生产过程结束)到培养第39天(即培养结束)期间，用制备方法1生产的Log-NK细胞与野生型NK细胞相比显示出类似的细胞活力。Log-NK细胞在培养第10天到第14天出现活力和生长速率的下降，是由于未被HLA-E慢病毒载体转化的B2M-NK细胞死亡而暂时出现的现象，并且可以确认地是，在第14天用饲养细胞重新刺激后，生长速率和活力均恢复(图9)。

[表7]用于FACS分析NK特性的抗体列表

标志物(人)	抗体信息(荧光/生产商/货号)	使用抗体的量
			人CD16	PE/BD生物科学/555407	5μL
人NKG2A	PE/美天旎生物技术/130-113-566	1μL
			人NKG2C	PE/R&D系统/FAB138P	1μL
人NKG2D	PE/BD生物科学/557940	1μL
			人NKp30	PE/BD生物科学/557940	1μL
人NKp44	PE/BD生物科学/558563	5μL
			人NKp46	PE/BD生物科学/557991	5μL
人DNAM1	PE/BD生物科学/559789	5μL
			人CD25	PE/BD生物科学/555432	5μL
人CD62L	PE/英杰公司/12-0629-42	1μL
			人CD69	PE/R&D系统/FAB23591P	1μL
人CXCR3	PE/BD生物科学/557185	5μL
			人CD57	PE/BD生物科学/560844	1μL
小鼠IgG1k	PE/BD生物科学/555749	5μL

实施例7：Log-NK细胞的肿瘤细胞毒性评价

为了评价野生型NK细胞或Log-NK细胞的肿瘤杀伤能力，以K562血液肿瘤细胞系为靶细胞。用1X PBS冲洗K562细胞，然后去除上清液。将细胞以1×10⁶细胞/ml的浓度悬浮于检测培养基(含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基)中，然后向其加入30μL钙黄素-AM(分子探针，C34852)，在37℃CO₂培养箱中培养1小时。接下来，用10mL的检测培养基洗涤细胞两次，然后以1x10⁵个细胞/mL的浓度悬浮于10mL的检测培养基中。用1X PBS洗涤野生型NK细胞或Log-NK细胞，然后除去上清，将细胞以1×10⁶细胞/ml的浓度、10:1的效应细胞：靶细胞比例，或3×10⁵细胞/ml的浓度、3:1的效应细胞：靶细胞比例，或1×10⁵细胞/ml的浓度、1:1的效应细胞：靶细胞比例，或者3×10⁴细胞/ml的浓度、0.3:1的效应细胞：靶细胞比例悬浮于检测培养基中。在圆底96孔板的三孔中，每孔加入按4种比例制备的效应细胞100μL，然后在每孔中分别加入浓度为1×10⁵/mL的靶细胞100μL。以与实施例4中相同的方式开展后续的实验步骤和肿瘤细胞杀伤能力的计算。通过对K562细胞系杀伤能力的评估，证实了在高E:T比值时，NK细胞和Log-NK细胞的癌细胞杀伤能力无显著差异，随着E:T比值的降低，NK细胞和Log-NK细胞的癌细胞杀伤能力的差异完全消失(图10a)。

实施例8：Log-NK细胞分泌细胞因子的检测

采用细胞内细胞因子染色(ICS)法检测NK细胞分泌的杀伤癌细胞的主要细胞因子CD107a、IFN-γ和TNF-α的分泌量。ICS实验所用抗体见下表8，并且每种细胞染色方法所用抗体种类见下表9。

[表8]用于ICS的抗体列表

抗体	抗体信息(荧光/生产商/货号)	使用抗体的量
			人IFN-γ	FITC/BD生物科学/554700	1μL
人TNF-α	PE-CY7/e生物科学/25-7349-82	1μL
			人CD3	PerCP-Cy5.5/e生物科学/45-0036-42	5μL
人CD56	APC-Cy6/e生物科学/47-0567-42	1μL
			人CD107a	APC/BD生物科学/560664	1μL
7-AAD	PerCp-Cy5.5/贝克曼库尔特/A07704	5μL
			小鼠IgG1k	FITC/BD生物科学/555748	5μL
小鼠IgG1k	PE-Cy7/BD生物科学/557872	5μL
			小鼠IgG1k	APC/BD生物科学/555751	5μL

[表9]每种细胞染色方法的抗体列表

用1X PBS洗涤作为效应细胞的野生型NK细胞或Log-NK细胞，然后移除上清液。将细胞以2.5×10⁶细胞/ml的浓度、1:1的效应细胞：靶细胞比例悬浮于检测培养基(含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基)中。接下来，取1.2mL悬浮液置于新鲜试管中，向其中加入高尔基阻断剂(BD,554724)1.56μL和高尔基塞剂(Golgi-plug)(BD,555029)2.4μL。

同时，将K562细胞作为靶细胞，以2.5×10⁶细胞/ml的浓度悬浮于检测培养基中。制备96孔圆形底板，在(-)和靶孔中加入APC-CD107a抗体，在iso孔中加入APC-IgG1k抗体。在每个(-)孔中加入含10％FBS的RPMI 1640培养基100μL，在每个靶孔和iso孔中加入靶细胞100μL。每个孔中加入效应细胞100μL，然后在37℃CO₂培养箱中孵育4小时。将平板在4℃下以2000rpm离心3min，并用200μL的烫/洗缓冲液(BD,554723)冲洗2次，然后每孔加入200μL的固定/透化缓冲液(BD,554655)，随后4℃孵育30分钟。将平板在4℃下以2000rpm离心3min，并用200μL的烫/洗缓冲液(BD,554723)冲洗2次，然后每孔加100μL的烫/洗缓冲液(BD,554723)。在(-)孔和靶孔中加入IFN-γ和TNF-α抗体，在iso孔中加入FITC-IgG1k和PE-Cy7-IgG1k抗体，然后在4℃孵育30分钟。每孔加100μL 1X烫/洗缓冲液，4℃2000rpm离心3min，移除上清液。将平板在4℃下以2000rpm离心3min，并用200μL的烫/洗缓冲液(BD,554723)冲洗2次，然后每孔加200μL的1X烫/洗缓冲液。将细胞颗粒转移到FACS管(BDfalcon,352052)中，并通过流式细胞术分析细胞因子的表达。结果证实，当NK细胞和Log-NK细胞与K562靶细胞接触时，NK细胞和Log-NK细胞中的主要细胞因子CD107a、IFN-γ和TNF-α均增加60％以上，而NK细胞组与Log-NK细胞组的细胞因子无明显差异(图10b)。

实施例9：Log-NK细胞低免疫原性的体外评价

采用体外混合淋巴细胞反应(MLR)试验评价产生的Log-NK细胞在体内的低免疫原性。使用CD8(+)T细胞分离试剂盒(美天旎生物科技,130-096-495)，按如下方法分离CD8(+)T细胞。用含有MACS缓冲液0.5％FBS(GIBCO)和2mM EDTA(英杰公司)的PBS(龙沙)洗涤从供者血液中获取的PBMC一次，然后将获得的细胞颗粒悬浮在MACS缓冲液中至细胞浓度为1x10⁷细胞/10μL。将生物素-抗体混合物加入悬液中，使其浓度达到1×10⁷细胞/10μL，混合均匀，在4℃孵育5分钟。反应完成后，加入MACS缓冲液，使每孔细胞浓度达到1×10⁷细胞/30μL，每1×10⁷细胞中加入20μLCD8(+)T细胞微珠混合物，4℃孵育10分钟。孵育完成后，将细胞悬液通过LS柱(美天旎生物科技)，仅分离表达CD8的T细胞。

为了培养分离的CD8(+)T细胞，另一供体捐献的PBMC经2000cGy照射后，然后与CD8(+)T细胞按1：1的比例混合，培养7天。以同样的方法制备PBMC，与培养了7天的CD4(+)T细胞和CD8(+)T细胞按1:1的比例混合。用含有抗-CD3(1μg/mL,英杰公司)、IL-2(100U/mL)和10％BBS的RPMI 1640培养基培养细胞7天。进一步培养细胞7天(共培养14天)，用于实验。将上述所用的同一供体来源的PBMC再次照射2000cGy，以1：1的比例与培养的CD8(+)T细胞混合，继续培养一周。以共培养14天的CD8(+)T细胞为效应细胞，以NK或Log-NK细胞为靶细胞，用与实施例3相同的方法测定细胞死亡，检验Log-NK细胞是否能逃避CD8(+)T细胞的攻击。如图11a所示，证实了NK细胞中CD8(+)T细胞裂解的细胞比例是Log-NK细胞的3倍，说明Log-NK可以逃避CD8(+)T细胞的攻击。为了促进MLR反应，在CD8(+)T细胞的HLA-A、B、C型与NK或Log-NK细胞100％不匹配的条件下，用于培养CD8(+)T细胞的辐照PBMC与NK或Log-NK细胞的HLA-A、B和C型的一致性为83％的条件下开展实验。

另外，用CFSE(赛默科技(Thermo scientific),C34554)染色NK和Log-NK细胞，然后在96孔平板的3个孔中每孔加入100μL在RPMI 1640(10％胎牛血清，1000IU IL-2)培养基中浓度为1.2×10⁶细胞/mL的CD8(+)T细胞和100μL在培养基中浓度为4×10⁴细胞/mL的NK细胞或Log-NK细胞，使CD8(+)T细胞与NK细胞或Log-NK细胞的比例为30：1。使用细胞培养箱内提供的

系统(赛多利斯(Sartorius))对平板进行分析，在实时状态下每小时保存一次图像，然后只对图像上CFSE荧光阳性的细胞进行计数。结果证实，当NK细胞与CD8(+)T细胞共培养时，随着时间的推移，培养的NK细胞与初始加入孔中的NK细胞的比例下降，而对于Log-NK细胞，初始加入孔的细胞数量保持不变(图11b)。

实施例10：用于CIITA基因敲除的最优gRNA序列的选择

10-1)使用基因剪刀敲除CIITA和RFXANK基因

人类主要组织相容性复合体(MHC)II类基因包括HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。为了产生不表达HLA-DR/DQ/DP的NK细胞，通过以下方式使用基因剪刀技术传递所需的II类反式激活剂(CIITA)主控制器或转录因子RFXANK(RFX相关锚蛋白含蛋白基因)，以抑制CIITA或RFXANK的表达。

下表10中列出的靶向CIITA或RFXANK的gRNA候选序列均采用实施例1中相同的方法用RNP反应液制备，并且在室温下反应5分钟或更长时间后60分钟内使用该反应溶液。

制备的RNP反应液最多可用于1～4x10⁶细胞，使用ADAM细胞计数系统(纳诺恩泰)计数NK细胞，然后使用2x10⁶个NK细胞。后续的实验步骤和细胞培养按照实施例1的方法进行。

[表10]靶向CIITA或RFXANK的gRNA候选序列

10-2)用于流式细胞术的NK细胞染色

为了检测NK细胞中CIITA或RFXANK基因的敲除程度，用实施例10-1)中CIITA RNP反应液处理的NK细胞进行染色，然后用流式细胞术分析。将2×10⁵个NK细胞悬浮在2ml含2％FBS的FACS缓冲液中，以2000rpm离心3分钟。将细胞置于100μLFACS缓冲液中，加入荧光标记抗体(表11)，4℃孵育30min。30min后，加入2mL FACS缓冲液，以2000rpm离心3min。然后在细胞中加入300μL固定液，用BD LSRFortessa(BD生物科学)流式细胞仪对细胞进行分析，结果如图12所示。

[表11]用于FACS分析的抗体列表

标志物	抗体信息(荧光/生产商/货号)	使用抗体的量
			人B2M	APC/BD生物科学/316312	0.5μL
人HLA-DR	PE/英杰公司/12-9956-42	1μL
			人CD56	BV421/BD生物科学/562751	0.5μL
人CD3	FITC/BD生物科学/555332	5μL
			7-AAD	PerCp-Cy5.5/贝克曼库尔特/A07704	5μL

基于HLA-DR的表达情况检测II型HLA的敲除程度。经证实，在共检测的25条gRNA序列中，与对照野生型NK细胞相比，用Cpf1-#1gRNA处理的NK细胞显示了28.2％的CIITA基因敲除效率，用Cpf1-#5gRNA处理的NK细胞显示了17.7％的敲除效率，以及用Cpf1-#8gRNA处理的NK细胞显示了19.9％的敲除效率。此外，用MAD7-#21gRNA处理的NK细胞显示了15.5％的敲除效率，以及用MAD7-#25gRNA处理的NK细胞显示了40.1％的敲除效率。因此，选择CIITA基因敲除效率最好的MAD7核酸酶和#25gRNA用于后续实验。此外，如图13所示，在RNP反应液传递后培养第3～第7天检测CIITA敲除效率，与对照组NK细胞相比，CIITA敲除效率从培养第3天的21.3％提高到培养第7天的50.4％。这些结果表明，在NK细胞中CIITA敲除后，敲除效率随着培养时间的增加而增加。

实施例11：敲除B2M和CIITA基因的NK细胞制备条件的优化

为了制备B2M和CIITA基因敲除的NK细胞，采用图14a所示的两种方法制备细胞，并比较两种方法对B2M和CIITA基因双敲除的效率。在制备方法1中，在1.5-mL离心管中，将13μL的1X PBS、2μL的3.2μM MAD7和10μL的10μM B2M gRNA混合在一起，室温孵育5分钟以上，制备RNP反应溶液管1。在另一个1.5-mL离心管中，将13μL的1X PBS、2μL的3.2μM MAD7和10μL的10μM B2M CIITA gRNA室温孵育5分钟以上，制备RNP反应溶液管2。将制备好的RNP反应溶液管1和管2混合在一起，共制备出50μL的RNP反应溶液。使用与实施例10相同的方法，在2x10⁶个NK细胞(培养第7天)上进行后续实验。在制备方法2中，在培养第7天敲除2x10⁶个NK细胞中的CIITA，接着培养4天，然后在培养第11天敲除2x10⁶个NK细胞中的B2M。具体的实验过程和细胞培养方法与实施例1中相同。按照实施例10-2)中同样的方法，敲除后培养的NK细胞用FACS抗体染色，然后用流式细胞术检测B2M和CIITA基因的敲除效率。

从图14b中可以看出，利用上述制备方法对分离自3个供体的NK细胞进行实验，证实了与对照NK细胞相比，制备方法1制备的供体1的NK细胞中B2M和CIITA的双敲除效率为32.4％，制备方法2制备的NK细胞中双敲除效率为17％。对于从另外两个供体中分离出的NK细胞，制备方法1的双敲除效率高于制备方法2。

从制备方法1制备的B2M和CIITA双敲除NK细胞中分离基因组DNA，然后进行全基因组测序。如果基因组DNA序列中有四个或更少的核酸序列与B2M和CIITA各自的gRNA序列不匹配，则被认为是一个潜在的脱靶区，并检查脱靶区是否存在插入/缺失。结果，在B2M gRNA序列中识别出三个预测脱靶区(图14c)，在CIITA gRNA序列中识别出两个预测脱靶区(图14f)。对基因插入/缺失进行测序，结果证实，在任何预测的脱靶区均未出现插入/缺失，因此，可以确认使用#8gRNA(SEQ ID NO:8)和#25gRNA(SEQ ID NO:44)对B2M和CIITA进行双敲除，在预测的脱靶区没有引起突变(图14d、14e、14g和14h)。

实施例12：Log-NK-CIITA KO细胞(B2M-/CIITA-/HLA-E+NK细胞)的制备

采用图14a所示的制备方法1或制备方法2制备具有HLA-ABC^-/HLA^-DR/DP/DQ^-/HLA-E⁺表型NK细胞，其是由通过敲除具有B2M-/HLA-E+表达特征的Log-NK细胞中的CIITA基因，抑制II型HLA蛋白HLA-DR/DP/DQ表达而产生的，并将制备的NK细胞命名为“Log-NK-CIITAKO”细胞。按照预期，体内注射抑制I型HLA和II型HLA表达的异体低免疫原性NK细胞，可以逃避宿主体内CD8(+)T细胞、CD4(+)T细胞和NK细胞引起的免疫应答。按照实施例11中的制备方法1中相同的方法制备B2M和CIITA敲除的NK细胞，并使用MACS(磁活化细胞分选)系统分离不表达B2M的NK细胞，然后分离不表达HLA-DR的细胞。将细胞与生物素标记的B2M抗体(英杰公司)于4℃孵育20分钟，然后加入2mL MACS缓冲液(0.5％胎牛血清(FBS)，PBS中有2mMEDTA)，接下来在1200rpm离心10分钟。去除上清液后，将80μL MACS缓冲液加到细胞中，然后加入20μL的抗生物素磁珠(美天旎生物科技)，随后在4℃下孵育15分钟。接下来，向细胞中加入2mL MACS缓冲液，随后以1200rpm离心10分钟。将NK细胞悬浮于500μL洗涤缓冲液中，使细胞通过LS柱(美天旎生物科技)，该柱与QuadroMACS^TM分离器(美天旎生物科技)连接。然后，使3mL洗涤缓冲液通过柱两次，以回收未结合在柱上的B2M-细胞。回收的细胞以1200rpm离心10分钟，去除上清液。接下来，向颗粒状细胞中加入80μL洗涤缓冲液，并向其中加入20μL的抗-HLA-DR磁珠(美天旎生物科技)，随后在4℃下孵育15分钟，并向细胞中加入2mL的洗涤缓冲液，随后以1200rpm离心10分钟。将NK细胞悬浮于500μL的缓冲液中，然后使其通过LD柱(美天旎生物科技)，该柱与QuadroMACS^TM分离器(美天旎生物科技)连接，并且使1mL洗涤缓冲液通过柱两次，最终回收B2M^-/HLA-DR^-NK细胞。将分离的B2M^-/HLA-DR^-NK细胞进行计数，然后立即使用慢病毒载体将单链HLA-E三聚体(scHLA-E)引入细胞，方法与实施例3-2)中相同。将NK细胞以浓度1×10⁶细胞/mL悬浮于培养液中，并培养于尺寸合适的孔板中。

实施例13：Log-NK-CIITA KO细胞的培养及表型表达的验证

13-1)Log-NK-CIITA KO细胞扩增能力的测定

如图15所示，为了验证实施12中制备的Log-NK-CIITA KO细胞的扩增能力，在培养期间对细胞扩增和细胞活力进行了测定。结果证实，制备方法1产生的Log-NK-CIITA KO细胞的活力与对照NK细胞的活力差异不显著，在培养第43天后，对照NK细胞的增殖继续增加，培养第43天Log-NK-CIITA KO细胞的数量较开始培养时增加了约268倍(图15a)。经证实，在实施例12的细胞分离过程后，用制备方法2生产的Log-NK-CIITA KO细胞数量减少，但细胞恢复了扩增直到培养第39天，培养第39天的细胞数量较开始培养时增加了约936倍(图15b)。

13-2)培养期间Log-NK-CIITA KO细胞表型的分析

为了检测Log-NK-CIITA KO细胞产生后，培养43天是否持续抑制HLA-ABC和HLA-DR/DP/DQ的表达，对实施例11中的方法产生的NK细胞进行染色，然后用流式细胞术分析细胞内的表达情况。将2mL含2％胎牛血清的FACS缓冲液加入2×10⁵个NK细胞中，随后以2000rpm离心3分钟，去除上清液。将细胞悬浮于100μL的FACS缓冲液中，并与表12所示抗体在4℃孵育30分钟。接下来，向细胞中加入2mL的FACS缓冲液，以2000rpm离心3分钟，去除上清液。在细胞中加入300μL固定液，用BD LSRFortessa(BD生物科学)流式细胞仪检测细胞表达。结果如图16a所示，经证实，在所有3个供体中，在培养22天后，HLA-ABC和HLA-DR/DP/DQ均表达抑制的细胞占总细胞数的60％以上，而在供体1和2中，在培养43天时，该类细胞数量增加到总细胞数的90％以上。另外，在培养第43天对Log-NK-CIITA KO细胞HLA-E的表达进行分析，与对照NK细胞相比，HLA-E在供体1中表达增加69.1％，在供体2中表达增加72.3％，在供体3中表达增加53.8％(图16b)。

[表12]用于FACS分析的抗体列表

实施例14：Log-NK-CIITA KO细胞抗癌活性的分析

14-1)使用钙黄素-AM检测癌细胞杀伤能力

以K562(慢性髓系白血病)、DU145(前列腺癌)、HepG2(肝癌)、HCC1954(乳腺癌)、MDA-MB-231(乳腺癌)、MDA-MB-468(乳腺癌)和SKOV3(卵巢癌)癌细胞为靶细胞，将每种类型的细胞以以1×10⁶细胞/mL的浓度悬浮于1mL的检测培养基中，该培养基为含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基，然后用30μL钙黄素-AM(英杰公司)处理，在37℃CO₂培养箱中孵育1小时。孵育后，用检测培养基洗涤细胞两次，然后以1x10⁵个细胞/mL的浓度制备细胞。以NK或Log-NK-CIITA KO细胞作为效应细胞，将细胞以3×10⁶细胞/mL的浓度、效应细胞：靶细胞3:1的比例悬浮于检测培养基中，或将细胞以1×10⁶细胞/mL的浓度、效应细胞：靶细胞1:1的比例悬浮于检测培养基中。在圆底96孔板的3孔中每孔分别加入制备的效应细胞100μL，然后在每孔中加入浓度为1×10⁵细胞/mL的靶细胞100μL。后续实验步骤和测量值计算方法与实施例4相同进行。

如图17a所示，与对照NK细胞相比，Log-NK-CIITA KO细胞对各种癌细胞的杀伤能力类似或增强。

14-2)使用CFSE染色检测癌细胞杀伤能力

将每种类型的癌细胞(DU145、HepG2、HCC1954、MDA-MB-231、MDA-MB-468和SKOV3)以4×10⁴细胞/mL的浓度悬浮于检测培养基(含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基)中，然后在96孔板的每孔中加入100μL细胞悬液，并培养18～22小时，然后加入效应细胞。将NK或Log-NK-CIITA KO细胞作为效应细胞，将细胞以8X 10⁴细胞/mL的浓度、效应细胞：靶细胞2:1的比例悬浮于含10％胎牛血清和1000IU IL-2的RPMI 1640培养基中，然后在培养的96孔板的3孔中每孔加入100μL的靶细胞。将细胞置于37℃的CO₂培养箱中培养7天，利用培养箱内提供的实时细胞图像分析仪

系统(赛多利斯)每2小时存储一次细胞图像，并通过分析细胞图像评估细胞的杀伤癌细胞能力。结果证实，与对照NK细胞相比，Log-NK-CIITA KO细胞对DU145和MDA-MB-231的杀伤癌细胞能力增强，对其他癌细胞系的杀伤能力与对照NK细胞相似(图17b)。以上结果表明，即使对该基因进行编辑导入，产生Log-NK-CIITA KO细胞，但NK细胞本身的杀伤癌细胞能力并没有下降。

实施例15：使用各种gRNA传递方法敲除B2M和CIITA基因

为了进一步验证除穿梭剂外的传递系统是否也能产生同样的敲除效果，通过多种方法将B2M gRNA或CIITA gRNA和MAD7核酸酶的RNP传递给NK细胞，以验证各基因敲除的效率。对于B2M基因，使用#8gRNA(SEQ ID NO:8)；对于CIITA基因，使用#25gRNA(SEQ ID NO:44)。每种给药方法使用相同数量的NK细胞(1x10⁶细胞)。敲除当日，将细胞悬浮于500μL的opti-MEM(Gibco,31985062)培养液中，置于12孔板中培养，次日，每孔加1mL NK细胞培养基。

在方法1中，将26μL PBS、4μL 40μM MAD7核酸酶和2μL 100μM B2M或2μLCIITAgRNA混合在一起，使其在室温下反应5分钟或以上，从而制备RNP反应溶液。将2μL的5μMFSD64d1穿梭剂加入48μLα-MEM培养基中，再与50μL RNP反应液混合。接下来，用该混合物处理NK细胞并在室温下孵育1分钟30秒。详细的传递方法按照实施例1中描述的相同方式进行。

在方法2中，采用电穿孔法将gRNA传递到NK细胞，使用核转染(Nucleofector)(龙沙)系统和人自然杀伤细胞核转染试剂盒(龙沙,VPA-1005)。向试剂盒中提供的100μL溶液中加入与实施例1中相同量的gRNA和MAD7核酸酶以及NK细胞，将混合物置于比色皿中，使用用U-01程序进行电穿孔。

在方法3中，使用Lipofectamine CRISPRMAX转染试剂(英杰公司,CMAX00008)。将1×10⁶个NK细胞预悬于12孔板中，将与方法1中相同量的gRNA和MAD7核酸酶，2.5μL Cas9加试剂和25μL opti-MEM加入1.5-mL管中，制备试管1，并让其反应。将1.5μL CRISPRMAX试剂和25μL opti-MEM加入另一1.5-mL试管中，制备试管2。接下来，将试管1中制备的反应液与试管2混合，让混合物在室温下反应5分钟，然后用混合物处理NK细胞。

在方法4中，使用Lipofectamine 2000转染试剂(英杰公司,11668027)。将1×10⁶NK细胞预悬于12孔板中，将与方法1中相同量的gRNA和MAD7核酸酶以及25μL的opti-MEM加入1.5mL的试管中，制备试管1。将2.5μL的Lipofectamine 2000和25μL的opti-MEM加入另一1.5mL的试管中，制备试管2。接下来，将试管1中制备的反应液与试管2混合，让混合物在室温下反应5分钟，然后用混合物处理NK细胞。

为了验证基因表达的降低，在培养第3天后，用B2M抗体通过流式细胞术分析B2M基因敲除的NK细胞，在培养第7天后用HLA-DR抗体通过流式细胞术分析CIITA基因敲除的NK细胞。将流式细胞术检测到的野生型NK中的基因表达水平换算为1，然后将敲除B2M或CIITA基因的NK细胞中表达水平计算为与野生型NK细胞中表达水平的比值，从而确定基因表达减少的效率。如图18a所示，当对照组NK细胞B2M表达水平为1时，方法1中B2M表达水平下降至0.46，方法2中B2M表达水平下降至0.74，方法3中B2M表达水平下降至0.89，方法4中B2M表达水平下降至0.74，不同给药方法间表达水平的下降值无统计学显著差异。如图18b所示，当对照组NK细胞中HLA-DR的表达水平为1时，通过CIITA敲除，方法1中HLA-DR的表达水平下降到0.48，方法2中下降到0.53，方法3中下降到0.67，方法4中下降到0.66，且不同给药方法之间表达水平下降值无统计学显著差异。从实施例14的结果可以确认，本发明使用的包括B2MgRNA或CIITA gRNA在内的基因编辑系统可以通过各种传递方式传递到靶细胞。

实施例16：Log-NK-CIITA KO细胞低免疫原性的体外评价

Log-NK-CIITA KO细胞是在其表面抑制I型HLA和II型HLA表达的NK细胞，因此被认为具有低免疫原性特征。为了检验细胞在体内注射时是否能通过躲避受体CD4(+)T细胞和CD8(+)T细胞的攻击而长期存活，进行了体外混合淋巴细胞反应(MLR)试验。为了促进MLR反应，在CD8(+)T细胞或CD4(+)T细胞的HLA-A、B、C和DRB1型与野生型NK或Log-NK-CIITA KO细胞100％错配，用于培养CD8(+)T细胞或CD4(+)T细胞的辐照PBMCs与野生型NK或Log-NK-CIITA KO细胞的HLA-A、B、C、DRB1型的一致性为37.5％的条件下开展实验。从PBMC中分离CD8(+)T细胞的方法与实施例9中描述的步骤相同，为了分离CD4(+)T细胞，使用CD4(+)T细胞分离试剂盒(美天旎生物科技,130-096-533)，方法如下。用MACS缓冲液冲洗PBMC 1次，然后将细胞颗粒悬浮至1×10⁷细胞/40μL浓度，加入1×10⁷细胞/10μL的生物素抗体混合物，4℃孵育5分钟。然后再次向细胞中加入MACS缓冲液，使浓度为1×10⁷细胞/30μL，再加入浓度为1×10⁷细胞/20μL的CD4(+)T细胞微珠混合物，随后于4℃下孵育10分钟。孵育完成后，将细胞悬浮液通过LS柱(美天旎生物科技)，只分离出表达CD4的细胞。将HLA型匹配率为37.5％的PBMC用2000cGy照射后，与分离的CD4(+)T细胞或CD8(+)T细胞按1：1的比例混合，培养7天。以同样的方法制备PBMC，与培养了7天的CD4(+)T细胞和CD8(+)T细胞按1：1的比例混合。进一步培养细胞7天(共培养14天)，并将其用于实验。对照NK细胞和Log-NK-CIITA KO细胞用CFSE荧光染色，然后按实施例9的方法稀释CD8(+)T细胞或CD4(+)T细胞，使效应细胞：靶细胞比例为10：1，将细胞加入96平孔板。在加入CD4(+)T细胞的孔中，加入与CD4(+)T细胞相同数量的PBMC(已被2000cGy辐照并从中去除CD3 T细胞)。将添加细胞制备的96孔板置于37℃的CO₂培养箱中培养，使用

系统(赛多利斯)每2小时计数一次仅CFSE荧光阳性细胞。结果如图19a所示，与CD8(+)T细胞共培养4天后，Log-NK-CIITA KO细胞的数量比对照NK细胞多5倍。此外，还证实了，Log-NK-CIITA KO细胞与CD4(+)T细胞和辐照过的PBMC共培养4天后，Log-NK-CIITA KO细胞的数量比对照NK细胞多1.6倍(图19b)。上述结果表明，Log-NK-CIITA KO细胞能有效地逃避CD4(+)T细胞和CD8(+)T细胞的攻击，且效率明显高于野生型NK细胞。

尽管已经详细描述了本发明的具体特征，但对于本领域的技术人员来说，很明显，本描述只是本发明的优选实施方式，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等价物来定义。

<110> 株式社会GC细胞

<120> 免疫原性降低的新型移植细胞

<130> POPB214311PCTCN

<150> KR 10-2020-0082748

<151> 2020-07-06

<160> 46

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA -1

<400> 1

atccatccga cattgaagtt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA -2

<400> 2

atccatccga cattgaagtt g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-3

<400> 3

atccatccga cattgaagtt gac 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-4

<400> 4

ttagagtctc gtgatgttta ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-5

<400> 5

ccgauauucc ucagguacuc ca 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-6

<400> 6

atataagtgg aggcgtcgcg c 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-7

<400> 7

atataagtgg aggcgtcgcg ctg 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-8

<400> 8

agtgggggtg aattcagtgt a 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-9

<400> 9

agtgggggtg aattcagtgt agt 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-10

<400> 10

ctgaattgct atgtgtctgg g 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-11

<400> 11

ctgaattgct atgtgtctgg gtt 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-12

<400> 12

ctcacgtcat ccagcagaga a 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-13

<400> 13

ctcacgtcat ccagcagaga atg 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-14

<400> 14

agcaaggact ggtctttcta t 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-15

<400> 15

agcaaggact ggtctttcta tct 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-16

<400> 16

cattctctgc tggatgacgt gag 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-17

<400> 17

tcagtggggg tgaattcagt gta 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-18

<400> 18

cagtgggggt gaattcagtg tag 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B2M-gRNA-19

<400> 19

tcacagccca agatagttaa gtg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-1

<400> 20

ccttggggct ctgacaggta gga 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-2

<400> 21

ccggcctttt taccttgggg ctc 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-3

<400> 22

ctcccagaac ccgacacaga cac 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-4

<400> 23

cttgtctggg cagcggaact gga 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-5

<400> 24

tgcccaactt ctgctggcat ctc 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-6

<400> 25

tgacttttct gcccaacttc tgc 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-7

<400> 26

tccaggcgca tctggccgga ggc 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-8

<400> 27

tccccaccat ctccactctg ccc 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-9

<400> 28

tccagttcct cgttgagctg cct 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-10

<400> 29

ccagagccca tggggcagag tgg 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-11

<400> 30

ctcgggaggt cagggcaggt tca 23

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-12

<400> 31

gaagcttgtt ggagacctct cca 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-13

<400> 32

gcagcacgtg gtacaggagc tcc 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-14

<400> 33

gccatcgccc aggtcctcac gtc 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-15

<400> 34

agagctcagg gatgacagag cac 23

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-16

<400> 35

cagtaggagt agtcgtcgcg tat 23

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-17

<400> 36

cagggcaagg gtgcgcaggc gca 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-18

<400> 37

cgagatctac tgaaccagaa aag 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-19

<400> 38

tggttcagta gatctcgtaa aga 23

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-20

<400> 39

ggacaaggtt ctctgcaacc tga 23

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-21

<400> 40

ccttggggct ctgacaggta g 21

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-22

<400> 41

gggctctgac aggtaggacc c 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-23

<400> 42

cctcccaggc agctcacagt g 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-24

<400> 43

tatgaccaga tggacctggc t 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CIITA-gRNA-25

<400> 44

tgcccaactt ctgctggcat c 21

<210> 45

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FSD64d1

<400> 45

Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg

1 5 10 15

Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala

20 25 30

Arg

<210> 46

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的 HLA-E

<400> 46

atgtctcgct ccgtggctct ggctgtcctg gctctgctga gtctgtctgg gctggaagct 60

gtgatggcac caagaaccct gatcctggga ggaggaggat ccggaggagg aggatctggc 120

ggcggcggca gcatccagcg cacccctaag atccaggtgt atagccggca cccagccgag 180

aacggcaagt ccaacttcct gaattgctac gtgtccggct ttcacccatc tgacatcgag 240

gtggatctgc tgaagaatgg cgagagaatc gagaaggtgg agcactctga cctgtctttc 300

agcaaggatt ggagctttta tctgctgtac tataccgagt tcacccctac agagaaggac 360

gagtacgcct gtcgcgtgaa ccacgtgaca ctgagccagc caaagatcgt gaagtgggac 420

cgggatatgg gaggaggagg aagcggagga ggaggaagcg gcggcggcgg ctctggcggc 480

ggcggctccg gctctcacag cctgaagtat ttccacacct ccgtgtctag gccaggaagg 540

ggagagccac ggttcatcag cgtgggctac gtggacgata cacagttcgt gaggtttgac 600

aatgatgcag cctccccaag aatggtgcct agggcaccat ggatggagca ggagggatcc 660

gagtactggg accgggagac aagatctgcc agggatacag cccagatctt tcgcgtgaac 720

ctgcgcaccc tgaggggata ctataatcag tctgaggccg gcagccacac actgcagtgg 780

atgcacggat gcgagctggg acctgatcgg agattcctgc gcggctacga gcagtttgcc 840

tatgacggca aggattacct gaccctgaac gaggacctgc ggagctggac cgcagtggat 900

acagcagccc agatctccga gcagaagtct aatgacgcca gcgaggcaga gcaccagagg 960

gcatatctgg aggatacctg cgtggagtgg ctgcacaagt acctggagaa gggcaaggag 1020

acactgctgc acctggagcc ccctaagacc cacgtgacac accacccaat ctccgaccac 1080

gaggccaccc tgagatgttg ggccctgggc ttctatcccg ccgagatcac cctgacatgg 1140

cagcaggacg gagagggaca cacccaggat acagagctgg tggagacacg gcccgcaggc 1200

gatggcacat ttcagaagtg ggcagcagtg gtggtgcctt ctggagagga gcagagatac 1260

acatgtcacg tgcagcacga gggcctgcca gagccagtga ccctgaggtg gaagcctgcc 1320

tcccagccca caatccctat cgtgggaatc atcgcaggcc tggtgctgct gggcagcgtg 1380

gtgtccggag cagtggtggc agccgtgatc tggaggaaga agagctccgg cggcaagggc 1440

gggtcctact acaaagcaga atggtccgac tccgcacagg ggtccgagag ccactcactg 1500

taa 1503

Claims

1.一种用于抑制哺乳动物细胞免疫原性的组合物，其包含抑制II型HLA蛋白表达的核酸分子作为活性成分。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的核酸分子是向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核苷酸，所述gRNA特异性识别编码II型HLA蛋白或其激活蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述II型HLA蛋白的激活蛋白是II类主要组织相容性复合体反式激活蛋白(CIITA)。

4.根据权利要求2所述的组合物，所述组合物还包括RNA导向的核酸内切酶或编码该RNA导向的核酸内切酶的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述gRNA特异性识别选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44，或与其互补的序列。

6.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含抑制β2-微球蛋白表达的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述的核酸分子是向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核苷酸，所述gRNA特异性识别编码β2-微球蛋白的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物还包括RNA导向的核酸内切酶或编码RNA导向的核酸内切酶的核苷酸序列。

9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述的向导RNA(gRNA)特异性识别选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14，或与其互补的序列。

10.根据权利要求4或8所述的组合物，其中所述的RNA导向的核酸内切酶选自下组：Cas9(CRISPR相关蛋白9)、Cpf1(来自普雷沃氏菌(Prevotella)和弗兰西斯菌(Francisella)1的CRISPR)和MAD7。

11.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括编码I型HLA蛋白的核酸分子。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述的I型HLA蛋白为HLA-E蛋白。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的细胞为是用于移植的异体或自体细胞。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的细胞是干细胞或免疫细胞。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述的免疫细胞是自然杀伤细胞。

16.一种使用根据权利要求1-9和11-15中任一所述的组合物产生的低免疫原性哺乳动物细胞。

17.一种产生低免疫原性哺乳动物细胞的方法，包括：

(a)抑制分离自哺乳动物受试者的细胞中的选自下组的蛋白的表达：β2-微球蛋白、II型HLA蛋白、II型HLA蛋白的激活蛋白及其组合，在分离自哺乳动物受试者的细胞中的表达；和

(b)将HLA-E基因导入细胞。

18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(a)是通过将特异性识别编码所述蛋白的核苷酸序列的向导RNA(gRNA)、或编码所述gRNA的核苷酸序列；以及RNA导向的核酸内切酶或编码所述RNA导向的核酸内切酶的核苷酸序列导入细胞中进行的。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述特异性识别编码β2-微球蛋白的核苷酸序列的向导RNA(gRNA)特异性识别选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：14，或与其互补的序列。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述II型HLA蛋白的激活蛋白是II类主要组织相容性复合体反式激活(CIITA)蛋白。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述特异性识别编码CIITA蛋白的核苷酸序列的向导RNA(gRNA)特异性识别选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：44，或与其互补的序列。

22.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)完成后2至4天进行。

23.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之后分离所述蛋白表达被抑制的细胞。

24.一种抑制哺乳动物细胞免疫原性的方法，包括步骤：将根据权利要求1-15中任一所述的组合物导入所述哺乳动物细胞。