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CN119452076A - 免疫细胞的产生 - Google Patents

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CN119452076A
CN119452076A CN202380046039.4A CN202380046039A CN119452076A CN 119452076 A CN119452076 A CN 119452076A CN 202380046039 A CN202380046039 A CN 202380046039A CN 119452076 A CN119452076 A CN 119452076A
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CN
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cell
cells
tcr
expression cassette
immune
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CN202380046039.4A
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G·汉密尔顿
N·法特赫季诺夫
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Adaptimmune Ltd
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Adaptimmune Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及用于产生表达治疗性抗原受体的免疫细胞的方法。提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞包含异源表达盒。所述异源表达盒包含(a)用于产生TCR的编码序列，(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，(c)5'靶向位点，以及任选地(d)3'靶向位点。然后将表达构建体在所述异源表达盒的所述位点处引入到所述免疫细胞中。所述表达构建体包含用于治疗性抗原受体的编码序列，并且然后所述治疗性抗原受体在所述免疫细胞中表达。提供了方法、用于所述方法的试剂以及通过所述方法产生的免疫细胞。

Description

免疫细胞的产生
技术领域
本发明涉及免疫细胞的产生，例如用于免疫疗法。
背景技术
免疫疗法有望改变癌症治疗前景，有望实现长期存活(McDermott等人,《癌症治疗综述(Cancer Treat Rev.)》2014年10月；40(9):1056-64)。目前，对扩大患者群体资格的范围和肿瘤类型的范围的新型免疫调节药物的医疗需求显然尚未得到满足。另外，需要新的药剂来增强抗肿瘤应答的量级和持续时间。由于在过去二十年中对控制T细胞免疫的基本原理的深入了解，这些药剂的开发已经成为可能(Sharma和Allison,《细胞(Cell)》2015年4月9日；161(2):205-14)。这通常需要肿瘤特异性免疫细胞，如CD4+和CD8+T细胞，从而识别由MHC分子呈递的肿瘤相关肽抗原。在一些情况下，不同的疫苗接种策略和体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞的过继性转移已经证明了肿瘤特异性免疫细胞治疗晚期癌症的能力(Rosenberg等人,《自然医学(Nat Med)》2004年9月；10(9):909-15)。
然而，目前的过继性免疫细胞疗法受到缺乏合适的患者和肿瘤特异性免疫细胞的限制，并且需要治疗上足够的和有功能的抗原特异性免疫细胞以有效用于免疫疗法。
发明内容
本发明人已经开发了涉及产生免疫细胞的方法，所述免疫细胞包含用于“占位符”产生T细胞受体(TCR)的异源表达盒。在产生之后，通过用编码治疗性抗原受体的表达构建体替代异源表达盒，免疫细胞然后可以被致敏以用于患者的治疗性使用，所述治疗性抗原受体例如是与患者的癌细胞结合的抗原受体。这些方法可以用于例如产生用于免疫疗法的免疫细胞，如同种异体免疫细胞，具体地产生具有治疗性抗原受体的“个性化”免疫细胞，所述治疗性抗原受体被选择用于与患者的癌细胞结合。
本发明的第一方面提供了一种用于产生表达治疗性抗原受体的免疫细胞的方法，所述方法包含：
(i)提供包含异源表达盒的免疫细胞，
其中所述异源表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，
(c)靶向位点，以及
(ii)将包含用于治疗性抗原受体的编码序列的表达构建体在所述异源表达盒的位点处引入到所述免疫细胞中，
使得所述治疗性抗原受体在所述免疫细胞中表达。
在本发明的第一方面的一些实施例中，所述异源表达盒可以被包含用于所述治疗性抗原受体的所述编码序列的所述表达构建体替代。例如，一种用于产生表达治疗性抗原受体的免疫细胞的方法可以包含：
(i)提供包含异源表达盒的免疫细胞，
其中所述异源表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点，以及
(ii)用包含用于治疗性抗原受体的编码序列的表达构建体替代所述免疫细胞中的所述异源表达盒，
使得所述治疗性抗原受体在所述免疫细胞中表达。
本发明的第二方面提供了一种用于产生表达治疗性抗原受体的免疫细胞的方法，所述方法包含：
(i)提供诱导多能干细胞(iPSC)，所述iPSC在所述iPSC的基因组中的位点处包含异源表达盒，
其中所述异源表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点，
(ii)使所述iPSC分化为免疫细胞，以及
(iii)将包含用于治疗性抗原受体的编码序列的表达构建体在所述异源表达盒的位点处引入到所述免疫细胞中，
使得所述治疗性抗原在所述免疫细胞中表达。
例如，一种用于产生表达治疗性抗原受体的免疫细胞的方法可以包含：
(i)提供诱导多能干细胞(iPSC)，所述iPSC在所述iPSC的基因组中的位点处包含异源表达盒，
其中所述异源表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点，
(ii)使所述iPSC分化为免疫细胞，以及
(iii)用包含用于治疗性抗原受体的编码序列的表达构建体替代所述免疫细胞中的所述异源表达盒，
使得用于所述治疗性抗原的所述编码序列在所述免疫细胞中表达，
由此产生表达治疗性抗原受体的免疫细胞。
iPSC可以在根据第二方面所述的方法中通过以下提供：用包含所述异源表达盒的核酸转染IPSC，使得所述异源表达盒整合到所述IPSC的基因组中。
本发明的第三方面提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞包含整合到其基因组中的异源表达盒，
其中所述异源表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点。
在第一方面至第三方面的一些实施例中，所述治疗性抗原受体可以与癌细胞特异性地结合。
本发明的第四方面提供了一种IPSC，所述IPSC包含整合到其基因组中的异源表达盒，
其中所述异源表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点。
在第一方面至第四方面的一些实施例中，所述靶向位点可以是5'靶向位点。所述异源表达盒可以进一步包含3'靶向位点。
根据第一方面至第四方面所述的异源表达盒可以进一步包含用于poly(A)序列的编码序列。
本发明的第五方面提供了通过根据第一方面或第二方面所述的方法产生的免疫细胞群体。
本发明的第六方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含根据第五方面所述的免疫细胞群体和药学上可接受的赋形剂。
本发明的第七方面提供了一种治疗方法，所述治疗方法包含对有需要的个体施用治疗有效剂量的根据第五方面所述的免疫细胞群体。
所述个体可能患有癌症病状。
下文更详细地描述了本发明的其它方面和实施例。
附图说明
图1示出了用于由iPSC产生T细胞的六阶段方法的实例的示意图。
在4阶段在15F2_AAVS1-/A2M10LP和16D5_AAVS1A2M10LP/A2M10LP早期iT细胞祖细胞中进行了占位符A2M10变为A2M4的交换。在用CD3/28激活后的第6阶段进行了晚期iT细胞祖细胞上的占位符交换。
图2示出了TCR“着陆垫”的实例的示意图。使用CRISPR+AAV将‘占位符’TCR整合到基因组内。在组成型启动子的控制下，此表达盒驱动促进完全iT细胞分化所需的TCR表达。候选治疗性TCR在iT-cell的最终编辑步骤期间替代了“占位符”TCR。TRAC的CRISPR/Cas9靶向导致两(2)个同时事件：(i)切除“占位符”TCR并用将在内源性启动子的控制下的功能候选TCR替代，以及(ii)敲除天然内源性TRAC基因座。
图3描述了将TCR“着陆垫”插入到编码基因的最后一个外显子中的靶向策略。靶向载体含有与CRISPR向导RNA的基因组DNA5'和3'的300-1000个核苷酸相对应的左和右同源臂(HA)、含有5'着陆垫切除序列的截短的TRAC结构域、poly A信号(PA)、外源性启动子、2A“样”跳跃序列、“占位符”TCR和另外的PA序列。TRAC结构域“占位符”TCR含有着陆垫3'切除位点。在单等位基因整合到期望的基因组位置中后，第二靶向载体被设计成在使用靶向切除位点的向导RNA切除着陆垫后整合。次级靶向载体含有左和右同源臂(HA)、2A“样”跳跃序列和治疗性TCR。治疗性TCR的TCRα链含有截短的TRAC结构域。当治疗性TCR被敲入到着陆垫中时，全长TRAC结构域被重构。
图4描述了将TCR“着陆垫”插入到编码基因的最后一个外显子的替代性靶向策略。在此场景中，5'和3'切除序列与含有向导RNA识别序列的B2M区域(Chr 15 44715435至44715475)相对应。切除序列侧接于占位符TCR。侧接区可以被修饰以含有任何所关注的向导序列。靶向载体含有与来自整合位点的基因组DNA5'和3'的300-1000个核苷酸相对应的左和右同源臂(HA)、poly A信号(PA)、外源性启动子、2A“样”跳跃序列、“占位符”TCR和另外的PA序列。在单等位基因整合到期望的基因组位置中后，第二靶向载体被设计成在使用靶向切除位点的向导RNA切除着陆垫后整合。次级靶向载体含有左和右同源臂(HA)、2A“样”跳跃序列和治疗性TCR。
图5描述了将TCR“着陆垫”插入到基因组“安全港”基因座中的靶向策略。靶向载体包含与来自整合位点的基因组DNA 5'和3'的300-1000个核苷酸相对应的左和右同源臂(HA)、包含5'着陆垫切除序列的截短的TRAC结构域、poly A信号(PA)、外源性启动子、2A“样”跳跃序列、“占位符”TCR和另外的PA序列。“占位符”TCR内的TRAC结构域含有着陆垫3'切除位点。在单等位基因整合到期望的基因座中后，第二靶向载体被设计成在使用靶向切除位点的向导RNA切除着陆垫后整合。次级靶向载体含有左和右同源臂(HA)、外源性启动子、2A“样”跳跃序列和治疗性TCR。治疗性TCR的TCRα链含有截短的TRAC结构域。当治疗性TCR被敲入到着陆垫中时，全长TRAC结构域被重构。
图6描述了将TCR“着陆垫”插入到基因组“安全港”基因座中的靶向策略。在此场景中，5'和3'切除序列与含有向导RNA识别序列的B2M区域(Chr 15 44715435至44715475)相对应。切除序列侧接于占位符TCR。侧接区可以被修饰以含有任何所关注的向导序列。靶向载体含有与来自整合位点的基因组DNA5'和3'的300-1000个核苷酸相对应的左和右同源臂(HA)、切除结构域、poly A信号(PA)、外源性启动子、2A“样”跳跃序列、“占位符”TCR和另外的PA序列。在单等位基因整合到期望的基因组位置中后，第二靶向载体被设计成在使用靶向切除位点的向导RNA切除着陆垫后整合。次级靶向载体含有左和右同源臂(HA)、2A“样”跳跃序列和治疗性TCR。
图7描述了用于将带有TRAC向导RNA的TCR着陆垫插入到PTPRC外显子33中的AAV靶向载体。左和右同源臂分别与染色体一198755130-198756201和染色体一198,756,132-198,757,230(Ensembl 104版-20210年5月)相对应。LHA内的向导RNA序列已突变以防止切割修复模板。MAGE-A10 TCR ADB796通过外源性启动子(EF1a短)表达。着陆垫TCR盒含有两个源自TRAC外显子1的向导RNA序列。5'位点是截短的TRAC结构域(Chr14：22,547,508-22,547,560)内所含的位点，并且3'位点定位于MAGE-A10 TCR ADB796的TRAC结构域内。用单向导RNA进行编辑允许切除着陆垫TCR。
图8描述了用于将带有TRAC向导RNA的TCR着陆垫插入到AAVS1安全港位点PPP1r12C内含子1中的AAV靶向载体。左和右同源臂分别与染色体Chr 19：55115776-55116775和Chr 19：55114775-55115775(Ensembl104版-2021年5月)相对应。MAGE-A10 TCRADB796通过外源性启动子(EF1a短)表达。着陆垫TCR盒含有两个源自TRAC外显子1的向导RNA序列。5'位点是截短的TRAC结构域(Chr14：22,547,508-22,547,560)内所含的位点，并且3'位点定位于MAGE-A10 TCR ADB796的TRAC结构域内。用单向导RNA进行编辑允许切除着陆垫TCR。在所示替代性变化中，α链和β链的位置可以相反。
图9描述了用于将治疗性TCR(MAGE-A4/B2 ADB959)插入到PTPRC外显子33内的TCR着陆垫中的靶向载体。左同源臂同源臂靶向Chr1：198,754,605-198,756,226(Ensembl 104版-2021年5月)并且右同源臂靶向TCRαTRAC结构域BGH polyA和与Chr 1：198,756,132-198,757,230(Ensembl104版-2021年5月)相对应的基因组DNA。ABD959的TRAC结构域内的核苷酸序列已突变以防止被用于切除占位符TCR的向导RNA切割。靶向载体的设计允许2A样跳跃序列标记的TCR插入到具有PTPRC外显子33的框内。
图10描述了用于将治疗性TCR(MAGE-A4/B2 ADB959)插入到PPP1r12C内含子1内的TCR着陆垫中的靶向载体。左同源臂同源臂靶向Chr 19：55,115,701-55,117,349(Ensembl104版-2021年5月)并且右同源臂靶向TCRαTRAC结构域BGH polyA和与Chr19：55,114,725-55,115,825(Ensembl 104版-2021年5月)相对应的基因组DNA。ABD959的TRAC结构域内的核苷酸序列已突变以防止被用于切除占位符TCR的向导RNA切割。ADB959的表达通过外源性启动子调控。
图11示出了着陆垫策略的概述。占位符TCR被敲入到iPSC细胞中以支持分化为CD8+T细胞。在分化后，对iT细胞进行基因编辑以将占位符TCR交换为患者特异性治疗性TCR。
图12示出了本发明的编辑策略。图12A示出了使用rAAV修复模板ADB00794_001将占位符TCR(A2M10)盒敲入到PPP1R12C(AAVS1)基因座中来产生新颖的通用细胞库。突出显示了用于TCR切除的B2M向导序列。TCRα和TCRβ链被P2A跳跃序列分开。图12B示出了使用rAAV修复模板ADB01032_026用交换TCR(A2M4)盒替代占位符TCR(A2M10)盒。TCRα和TCRβ链被P2A跳跃序列分开。
图13示出了A2M10占位符TCR在早期祖细胞iT细胞系中的表达，所述细胞系是由单等位基因占位符TCR敲入iPSC克隆(15F2_AAVS1-/A2M10LP)和双等位基因占位符TCR敲入iPSC克隆(16D5_AAVS1A2M10PL/A2M10LP)分化的。
图14示出了在基于CRISPR-Cas9的基因编辑后，早期15F2_AAVS1-/A2M10LP祖细胞iT细胞中的A2M10占位符TCR的表达和交换为A2M4 TCR的。A)对细胞进行模拟电穿孔，并以5000vg/细胞的感染复数(MOI)用A2M4 rAAV修复模板转导。B)用靶向占位符TCR转基因盒中的B2M靶位点的核糖核蛋白(RNP)复合物对iT祖细胞进行电穿孔。C)用靶向占位符转基因的B2M靶位点的RNP复合物对iT祖细胞进行电穿孔，并以5000vg/细胞的MOI用编码A2M4修复模板的rAAV转导。D)用靶向占位符转基因的B2M靶位点的RNP复合物对细胞进行电穿孔，以5000vg/细胞的MOI用编码ADB01032_026A2M4修复模板的rAAV转导，并用0.3μM M3814处理。电穿孔后72小时通过流式细胞术分析TCR表达。
图15示出了在基于CRISPR-Cas9的基因编辑后，早期15F2_AAVS1-/A2M10LP祖细胞iT细胞中的占位符TCR基因编辑结果的定量。A)A2M10Vβ13.2占位符TCR表达的缺失作为CRISPR Cas9敲除效率的量度。B)用A2M4 Vα24TCR替代A2M10 Vβ13.2占位符TCR的测量。C)活祖细胞iT细胞中的A2M4 Vα24TCR表达的频率。D)活祖细胞iT细胞中的A2M10Vβ13.2占位符TCR表达的频率。
图16示出了在基于CRISPR-Cas9的基因编辑后，早期16D5_AAVS1A2M10LP/A2M10LP祖细胞iT细胞中的A2M10占位符TCR和A2M4TCR的表达。A)对细胞进行模拟电穿孔，并以5000vg/细胞的MOI用A2M4rAAV-ADB01032_026修复模板转导。B)用靶向占位符TCR转基因盒中的B2M靶位点的RNP复合物对iT祖细胞进行电穿孔。C)用靶向占位符转基因的B2M靶位点的RNP复合物对iT祖细胞进行电穿孔，并以5000vg/细胞的MOI用编码A2M4修复模板的rAAV(ADB01032_026)转导。D)用靶向占位符转基因的B2M靶位点的RNP复合物对细胞进行电穿孔，以5000vg/细胞的MOI用编码A2M4修复模板的rAAV转导，并用1μM M3814处理。电穿孔后72小时通过流式细胞术分析TCR表达。
图17示出了在基于CRISPR-Cas9的基因编辑后，早期16D5_AAVS1A2M10LP/A2M10LP祖细胞iT细胞中的占位符TCR基因编辑结果的定量。A)A2M10占位符TCR表达的缺失作为CRISPRCas9敲除效率的量度。B)用A2M4 Vα24TCR替代A2M10 Vβ13.2占位符TCR的测量。C)活祖细胞iT细胞中的A2M4 Vα24TCR表达的频率。D)活祖细胞iT细胞中的A2M10 Vβ13.2占位符TCR表达的频率。
图18示出了在基于CRISPR-Cas9的基因编辑后，CD3/CD28激活的晚期15F2_AAVS1-/A2M10LP祖细胞iT细胞中的A2M10占位符TCR和A2M4 TCR的表达。A)对细胞进行模拟电穿孔，并以5000vg/细胞的MOI用A2M4rAAV-ADB01032_026修复模板转导。B)用靶向占位符TCR转基因盒中的B2M靶位点的RNP复合物对iT祖细胞进行电穿孔。C)用靶向占位符转基因的B2M靶位点的RNP复合物对iT祖细胞进行电穿孔，并以5000vg/细胞的MOI用编码A2M4-ADB01032_026修复模板的rAAV转导。D)用靶向占位符转基因的B2M靶位点的RNP复合物对细胞进行电穿孔，以5000vg/细胞的MOI用编码A2M4修复模板的rAAV转导，并用0.6μM M3814处理。电穿孔后72小时通过流式细胞术分析TCR表达。
图19示出了在基于CRISPR-Cas9的基因编辑后，在CD3/CD28激活的晚期15F2_AAVS1-/A2M10LP祖细胞iT细胞中的占位符TCR基因编辑结果的定量。A)A2M10占位符TCR表达的缺失作为CRISPR Cas9敲除效率的量度。B)用A2M4 Vα24TCR替代A2M10 Vβ13.2占位符TCR的测量。C)活祖细胞iT细胞中的A2M4 Vα24TCR表达的频率。D)活祖细胞iT细胞中的A2M10 Vβ13.2占位符TCR表达的频率。
具体实施方式
本发明涉及表达如T细胞受体(TCR)等治疗性抗原受体的免疫细胞的产生。免疫细胞由包含异源表达盒的iPSCs产生，所述异源表达盒表达“占位符”产生TCR。在细胞中产生TCR的表达避免了分化停滞，并允许产生成熟的免疫细胞，例如CD3+T细胞。然后可以使用异源表达盒作为用于包含编码治疗性抗原受体的核苷酸序列的表达构建体的“着陆垫”来致敏免疫细胞。将表达构建体在异源表达盒的位点处插入到免疫细胞的基因组中。例如，表达构建体可以替代免疫细胞中的异源表达盒。表达构建体替代免疫细胞中的异源表达盒，所述免疫细胞然后表达治疗性抗原受体。如本文所描述地产生的免疫细胞可以用于免疫疗法。
例如，本文所描述的方法可以用于快速产生用于治疗患者的癌症的免疫细胞。由免疫细胞表达的治疗性抗原受体可以被选择为与患者的癌细胞具有反应性。抗原受体例如可以是由从患者获得的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表达的TCR或其它抗原受体，或者可以是已知与被鉴定为由患者体内的癌细胞表达的肿瘤抗原具有反应性的抗原受体。包含编码抗原受体的核苷酸序列的表达构建体可以用于替代异源表达盒以产生与患者的癌细胞具有特异性地反应性的免疫细胞，并且可以用于治疗患者的癌症。
适于如本文所描述的用途的免疫细胞包括T细胞，如αβ+T细胞、γδ+T细胞、粘膜相关恒定型(MAIT)T细胞和NK T细胞。
T细胞(也称为T淋巴细胞)是白细胞，所述白细胞在细胞介导的免疫中发挥核心作用。T细胞可以通过细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而与其它淋巴细胞区分开。存在若干种类型的T细胞，每个类型都具有不同的功能。
T辅助细胞(TH细胞)被称为CD4+T细胞，因为其表达CD4表面糖蛋白。CD4+T细胞在适应性免疫系统中发挥重要作用，并通过释放T细胞细胞因子并帮助抑制或调控免疫应答来帮助其它免疫细胞的活性。其对于CD8+T细胞的激活和生长至关重要。CD8+T细胞(TC细胞、CTL、杀伤T细胞、CD8+T细胞)表达CD8表面糖蛋白。CD8+T细胞用于破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。大多数CD8+T细胞表达TCR，所述TCR可以识别由I类MHC分子展示在受感染或受损细胞的表面上的特异性抗原。TCR和CD8糖蛋白与抗原和MHC分子的特异性结合导致受感染或受损细胞的T细胞介导的破坏。
如本文所描述地单阳性产生的T细胞可以是双阳性CD4+CD8+T细胞或CD4+或CD8+T细胞。优选T细胞包括CD8+T细胞。
优选T细胞可以包括TCRαβ+T细胞。如本文所描述地产生的TCRαβ+T细胞可以是成熟的CD3+T细胞。例如，T细胞可以具有αβTCR+CD3+CD45+CD28+表型。
在本文所描述的方法中，通过在编码产生TCR的异源表达盒的位点处插入编码治疗性TCR的表达构建体，免疫细胞被致敏以用于治疗用途。例如，可以用编码治疗性TCR的表达构建体替代编码产生TCR的异源表达盒。
TCR是二硫键连接的膜锚定异源二聚体蛋白，其包含表达为与恒定型CD3链分子的复合物的高度可变的α(alpha)和β(beta)链或δ(delta)和γ(gamma)链。表达这些类型TCR的T细胞可以被称为αβ(或α:β)T细胞和δγ(或δ:γ)T细胞。
TCR与细胞表面上的展示靶抗原的肽片段的主要组织相容性复合物(MHC)特异性地结合。例如，TCR可以与癌细胞表面上的展示肿瘤抗原的肽片段的主要组织相容性复合物(MHC)特异性地结合。可替代地，TCR可以识别独立于MHC呈递的特异性抗原或其肽。可以根据本发明的方法产生包含此类TCR的T细胞。MHC是一组细胞表面蛋白，其允许所获取的免疫系统识别‘外源’分子。蛋白质在细胞内降解，并通过MHC呈递在细胞表面上。展示‘外源’肽(如病毒或癌症相关肽)的MHC被具有适当TCR的T细胞识别，从而促进细胞破坏通路。癌细胞的表面上的MHC可以展示肿瘤抗原(即存在于癌细胞上但不存在于对应的非癌细胞上的抗原)的肽片段。识别这些肽片段的T细胞可以对癌细胞施加CD8+作用。
本文所描述的产生和治疗性TCR不由本文所描述的iPSC或免疫细胞天然表达(即TCR是外源性或异源的)。合适的异源TCR可以与展示靶抗原的肽片段的I类或II类MHC分子特异性地结合。产生和治疗性TCR可以是合成的或人工的TCR(即TCR不存在于自然界中)。
产生TCR和治疗性TCR可以由异源核酸编码。术语“异源的”是指对于特定的生物系统(如宿主细胞)来说是外源的并且不是天然存在于所述系统中的多肽或核酸。可以通过人工手段(例如使用重组技术)将异源多肽或核酸引入到生物系统。例如，可以将编码多肽的异源核酸插入到合适的表达构建体中，所述表达构建体进而用于转化宿主细胞以产生多肽。异源多肽或核酸可以是合成的或人工的，或者可以存在于不同的生物系统(如不同的物种或细胞类型)中。内源性多肽或核酸对特定生物系统(如宿主细胞)是天然的，并天然存在于所述系统中。重组多肽是由异源核酸表达的，所述异源核酸已经通过人工手段(例如使用重组技术)引入到细胞中。重组多肽可以与天然存在于细胞中的多肽相同，或者可以与天然存在于所述细胞中的多肽不同。
针对TCR(如产生TCR或治疗性抗原受体)的编码序列可以包含用于α(alpha)和β(beta)链或δ(delta)和γ(gamma)链的编码序列，所述编码序列被编码自切割肽(如2A肽)的核苷酸序列分开。这允许根据单个转录物中化学计量地表达两条链。
异源表达盒是并入到免疫细胞和其前体的基因组中的重组核酸。异源表达盒通过允许产生TCR的表达来支持成熟免疫细胞的产生。例如，产生TCR的表达允许祖细胞分化为T细胞。在成熟免疫细胞产生后，异源表达盒形成“着陆垫”，所述着陆垫允许表达构建体在基因组中的相同位点处替代异源表达盒。如下文所描述的，表达盒可以包含任何合适的核酸序列。优选的异源表达盒可以用单向导RNA切除，以完全去除产生TCR。
由免疫细胞和其前体在TCR产生期间表达产生TCR。在缺乏TCR表达的细胞中，分化为免疫细胞被停滞。产生TCR的表达可以促进如T细胞等成熟免疫细胞的产生。例如，在免疫细胞中产生TCR的表达可以诱导或促进CD3的表面表达，并允许分化为如CD3+T细胞等淋巴细胞生成谱系。在已产生分化的CD3+免疫细胞之后，可以将治疗性抗原受体插入到产生TCR的位点处。例如，产生TCR可以在细胞中用治疗性抗原受体替代。
合适的产生TCR包括支持T细胞分化和CD3的表面表达并防止分化停滞的任何TCR。与治疗性抗原受体不同，产生TCR不是患者特异性的并且不介导患者的免疫细胞的任何治疗性作用。
在一些实施例中，产生TCR可能缺乏结合活性。例如，产生TCR可能是功能上惰性的，并且除了促进T细胞分化和表面CD3表达外，可能缺乏TCR功能。这可以用于例如减少在替代产生TCR后分离或纯化表达治疗性抗原受体的T细胞的需要。合适的功能上惰性的产生TCR可能例如缺少一个或两个TCR可变区。例如，产生TCR可能缺少α链可变区和/或β链可变区。
在一些实施例中，产生TCR可能与展示无临床相关性的抗原片段的1类MHC结合。例如，产生TCR可以显示出与肿瘤抗原或其它临床相关抗原的不结合或基本上不结合，并且可以不与患者的癌细胞结合。在一些实施例中，产生TCR可以被工程化以降低或消除其对抗原的亲和力或亲合力。
合适的产生TCR可以包含α链和β链或其变体，或γ链和δ链或其变体的各种不同组合。产生TCR可以是人或非人的，例如鼠类TCR。例如，产生TCR可以包含以下或由以下组成：(i)全长α链和β链；(ii)α和β恒定结构域(TRAC(P01848-1)和TRBC(P01850-1))；(iii)单链αβTCR(例如，具有通过肽接头连接的α链和β链的TCR)；(iv)β链和嵌合链，所述嵌合链包含与前α链的跨膜结构域和细胞质结构域稠合的α链的可变结构域和恒定结构域；(v)全长β链和全长前α链；(vi)全长β链和在C端处缺失48aa的截短的前α链(Δ48)；(vii)包含或由残基125-176组成的β链的片段(P01850-1；TRBC1_人aa 125-176；)和包含或由残基126至281组成的前α链的片段(PTCRA_人aa 126-281(A0A087WTE9-1))；或(viii)β链的恒定结构域和全长前α链。
在一些优选实施例中，产生TCR可以包含以下或由以下组成：(i)全长α链和β链或(ii)全长β链和全长前α链。
在其它优选实施例中，产生TCR可以包含以下或由以下组成：(i)β链和嵌合链，所述嵌合链包含与前α链的细胞质结构域稠合的α链的可变结构域、恒定结构域和跨膜结构域，或(ii)β链和嵌合链，所述嵌合链包含与前α链的跨膜结构域和细胞质结构域稠合的α链的可变结构域和恒定结构域。
合适的α链、前α链和β链以及其结构域的氨基酸和编码核苷酸序列是本领域众所周知的。
适于如本文所描述的用途的产生TCR在本领域中很容易获得，并且包括MAGE-A10αβTCR克隆796(SEQ ID NO:14至17；SEQ ID NO:60)；MR1 TCR MC.7.G5克隆-αβTCR(TRAV38.2/DV8 TRAJ31α-链；TRBV25.1TRBJ2.3β-链)(Crowther等人,2020《自然免疫学(Nature Immunology)》21 178-185；恒定型NKTαβTCR(Vα24-Jα18与Vβ11成对)；γδTCR Vγ5Vδ1或Vγ1Vδ4(Ribot等人,(2021)《自然免疫学综述(Nature Rev Immunology)》21 221-232)；γδTCR Vγ9JPVδ2(Ravens等人,(2018)《免疫学前沿(Fron Immunol)》9 510；DiLorenzo等人,(2019)《科学数据(Sci Data)》6 115；Xu等人,2021《细胞与分子免疫学(CellMol Immunol.)》2021年2月；18(2):427-439)；以及针对病毒抗原(如CMV和HIV)的HLA-E限制性TCR(Yang等人,(2021)《科学免疫学(Sci.Immunol.)》6 57；Pietra等人,(2003)《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》100(19)10896-10901)。在一些优选实施例中，可以采用具有SEQ ID NO:14的α链氨基酸序列和SEQ ID NO:15的β链氨基酸序列的MAGE-A10αβTCR克隆796或具有SEQ ID NO:67的α链氨基酸序列和SEQ ID NO:72的β链氨基酸序列的MAGE-A10αβTCR克隆794。合适的α链可以由SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:66的核苷酸序列编码，并且合适的β链可以由SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:71的核苷酸序列编码。
合适的核苷酸序列是本领域众所周知的。异源表达盒可以包含一个或多个编码产生TCR的核酸。编码TCR的异源核酸可以编码受体的所有亚基。优选地，产生TCR的链在单个转录物中表达。例如，编码TCR的核酸可以包含编码TCRα链的第一核苷酸序列和编码TCRβ链的第二核苷酸序列，或者编码TCRδ链的第一核苷酸序列和编码TCRγ链的第二核苷酸序列。编码核酸可以进一步包含编码3'poly(A)序列的核苷酸序列。编码poly(A)序列的合适核苷酸序列示出于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:40中。
在一些实施例中，异源表达盒可以包含编码CD3嵌合融合受体而不是产生TCR的一个或多个核酸。
自切割肽编码序列可以定位于编码TCRα或TCRδ链的第一核苷酸序列与编码TCRβ链或TCRγ链的第二核苷酸序列之间。自切割肽在翻译期间通过核糖体跳跃引起新生肽链的切割，并使TCR链分离。合适的2A肽可以包括T2A肽、P2A肽、E2A肽和F2A肽(Poddar等人,(2018)同上；Kim等人,(2011)《公共科学图书馆·综合(PLoS ONE)》6,e18556)。优选的2A肽可以包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:69的氨基酸序列。自切割肽编码序列可以包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:70和SEQID NO:80的核苷酸序列。
编码弗林蛋白酶切割位点的核酸可以定位于邻近自切割肽编码序列。这可能有助于从TCR链上去除自切割肽残基。合适的弗林蛋白酶切割位点和编码序列示出于SEQ ID No11、12、24至27和68中。
表达盒可以进一步包含与用于产生TCR的编码序列可操作地连接的启动子。启动子可以驱动免疫细胞中的产生TCR的表达。合适的启动子包括组成型启动子，如SV40、CMV、UBC、EF1A、EF1AS、PGK、JeT、MND或CAGG启动子或其变体。合适的EF1A启动子的核苷酸序列示出于SEQ ID NO:3、36和65中。A2M10产生TCR的表达盒的核苷酸序列的实例示出于SEQ IDNO:58和76中。
异源表达盒包含靶向位点。靶向位点是介导表达构建体在表达盒的位点处的插入的核苷酸序列。例如，靶向位点可以介导用表达构建体替代免疫细胞基因组中的异源表达盒。在一些实施例中，靶向位点可以定位于异源表达盒中的组成型启动子的上游。优选地，靶向位点可以定位于盒的5'端处。在其它实施例中，靶向位点可以定位于用于产生TCR的编码序列内。
在一些实施例中，异源表达盒可以包含5'和3'靶向位点。例如，可以在5'和3'靶向位点处切割异源表达盒，并从免疫细胞的基因组中切除所述异源表达盒。在一些实施例中，靶向位点或5'和3'靶向位点的核苷酸序列在免疫细胞的基因组中是唯一的。
在一些实施例中，5'靶向位点可以定位于异源表达盒中组成型启动子的上游。优选地，5'靶向位点可以定位于盒的5'端处。
在一些实施例中，3'靶向位点可以定位于编码序列的下游或定位于编码序列的3'端处。优选地，3'靶向位点可以定位于盒的3'端处。
5'和3'靶向位点之一可以定位于用于产生TCR的编码序列内。
5'和3'靶向位点的选择可以取决于选择用于替代表达盒的技术。例如，合适的5'和3'靶向位点可以包括用于CRISPR介导的替代的CRISPR向导RNA识别序列、用于CRE-LOXP介导的替代的loxP位点、用于FLP-FRT介导的替代的FRT位点；以及用于如转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)等位点特异性核酸酶的识别位点。
可以使用任何合适的技术将表达构建体在表达盒的位点处插入到细胞基因组中。在一些优选实施例中，可以使用CRISPR介导的替代技术将表达盒替代为表达构建体。例如，5'和3'靶向位点可以包括CRISPR向导RNA识别序列。合适的向导RNA识别序列可以例如含有19个至21个核苷酸。优选地，向导RNA识别序列在免疫细胞基因组中是唯一的，以避免脱靶效应。合适的向导RNA识别序列的实例包括SEQ ID NO:5至9。设计适用于CRISPR介导的替代的向导RNA识别序列的方法在本领域中已得到公认。
在一些实施例中，靶向位点或5'和3'靶向位点之一，优选地3'靶向位点，可以定位于用于产生TCR的编码序列内，例如定位于TCR链恒定区编码序列，如TCRα链恒定区编码序列(TRAC)或TCRβ链恒定区编码序列(TRBC)内。包含来自MAGE-A10 c796 TCRα链(TRAC)编码序列的序列的优选的5'靶向位点的实例示出于SEQ ID NO:13中。对应的3'靶向位点定位于表达盒的MAGE-A10 c796 TCRα链编码序列内(参见SEQ ID NO:16)。
在其它实施例中，靶向位点或5'和3'靶向位点之一，优选地3'靶向位点，可以包含来自表达盒所插入到的基因座的核苷酸序列。
在一些实施例中，5'和3'靶向位点可以包含相同的核苷酸序列。这可以促进例如使用单向导RNA去除异源表达盒。例如，相同的靶向位点可以定位于表达盒的5'和3'端两者处。例如，表达盒可以在其5'和3'端处包含TRAC或TRBC序列。
用于插入A2M10产生TCR的质粒的核苷酸序列的实例示出于SEQ ID NO:59中。
异源表达盒可以并入到免疫细胞的基因组中。在一些实施例中，异源表达盒可以并入到包含内源性启动子的基因座内的免疫细胞的基因组中。例如，异源表达盒可以被整合到基因座中的基因的外显子内或紧邻所述外显子，优选地被整合到基因座中的基因的最后一个外显子内。整合保留了基因的天然阅读框架，使得在用如本文所描述的表达构建体替代异源表达盒后，治疗性抗原受体的表达由内源性启动子驱动。合适的基因座可以在分化的T细胞中具有活性，并且可以包括TRAC、PTPRC、EEF1A1、CD3E、CD3D、CD3G、CD8A和CD2。
在其它实施例中，异源表达盒可以并入到安全港基因座内的免疫细胞的基因组中。这允许治疗性抗原受体的表达要由表达构建体中所含的组成型启动子驱动。合适的表达构建体可以例如包含编码poly(A)序列的核酸和组成型启动子。合适的安全港基因座包括AAVS1并如表1所示。
在表达盒的位点处插入表达构建体后，治疗性抗原受体由免疫细胞表达。例如，受体可以在用表达构建体替代表达盒后表达。
治疗性抗原受体介导免疫细胞的治疗效果。优选地，治疗性抗原受体与患者的癌细胞结合。例如，治疗性T抗原受体可以与I类或II类MHC分子特异性地结合，所述分子展示由癌症患者的癌细胞表达的肿瘤抗原的肽片段。在一些实施例中，治疗性T抗原受体可以识别癌细胞上的独立于MHC呈递的靶抗原或靶抗原的肽片段。可以使用标准技术鉴定由癌症患者的癌细胞表达的肿瘤抗原。优选的肿瘤抗原包括NY-ESO1、PRAME、α-胎儿蛋白(AFP)、MAGE A4、MAGE A1、MAGE A10和MAGE B2，最优选地NY-ESO-1、MAGE-A4和MAGE-A10。
在一些实施例中，可以鉴定患者的肿瘤抗原，并选择与肿瘤抗原结合的治疗性抗原受体以用于表达构建体。
在一些实施例中，治疗性抗原受体可以是嵌合抗原受体(CAR)。CAR是被工程化以含有免疫球蛋白抗原结合结构域，如单链可变片段(scFv)的人工受体。CAR可以例如包含与TCR CD3跨膜区和内结构域稠合的scFv。scFv是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其可以与大约10个至25个氨基酸的短接头肽连接(Huston J.S.等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》1988；85(16):5879–5883)。接头可以富含甘氨酸以提高柔性，并且富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度，并且可以将VH的N端与VL的C端连接，或者反之亦然。scFv之前可能有信号肽，以引导蛋白质到达内质网，并且随后到达T细胞表面。在CAR中，scFv可以与TCR跨膜和内结构域稠合。在scFv与TCR跨膜结构域之间可以包括柔性间隔子，以允许可变的取向和抗原结合。内结构域是受体的功能性信号传输结构域。CAR的内结构域可以包含例如来自CD3ζ链或来自如CD28、41BB或ICOS等受体的细胞内信号传导结构域。CAR可以包含多个信号传导结构域，例如但不限于CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40。
CAR可以与由癌细胞表达的肿瘤特异性抗原特异性地结合。例如，T细胞可以被修饰以表达与由特定癌症患者的癌细胞表达的肿瘤抗原特异性地结合的CAR。可以使用标准技术鉴定由癌症患者的癌细胞表达的肿瘤抗原。
在其它实施例中，治疗性抗原受体可以是NK细胞受体(NKCR)。
在其它实施例中，治疗性抗原受体可以是T细胞受体(TCR)。TCR在本文其它地方有描述，并且可以包括αβTCR异二聚体和γδTCR异二聚体。合适的异源TCR可以与展示靶抗原的肽片段的I类或II类MHC分子特异性地结合。例如，T细胞可以被修饰以表达异源TCR，所述异源TCR与展示由癌症患者的癌细胞表达的肿瘤抗原的肽片段的I类或II类MHC分子特异性地结合。可以用标准技术鉴定由癌症患者的癌细胞表达的肿瘤抗原。优选的肿瘤抗原包括NY-ESO1、PRAME、α-胎儿蛋白(AFP)、MAGE A4、MAGE A1、MAGE A10和MAGE B2，最优选地NY-ESO-1、MAGE-A4和MAGE-A10。
在一些优选实施例中，异源TCR可以与展示MAGEA4肽片段GVYDGREHTV的HLA-A*02:01特异性地结合。
合适的治疗性TCR可以包括非常规的TCR，例如结合由单态抗原呈递分子展示的识别非肽抗原的非MHC依赖性TCR，如CD1和MR1；NKT细胞TCR和上皮内淋巴细胞(IEL)TCR。在一些实施例中，治疗性TCR可以识别癌细胞上的独立于MHC呈递的靶抗原或靶抗原的肽片段。
合适的治疗性TCR包括来自患者的TCR。例如，治疗性TCR可以是来自从供体个体获得的如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等免疫细胞的TCR。例如，可以对患者的肿瘤进行分析以鉴定由肿瘤中的癌细胞表达的肿瘤抗原。与所鉴定的肿瘤抗原具有反应性的TCR可以被鉴定，并将其插入到表达构建体中，以用作如本文所描述的治疗性TCR。在其它实施例中，可以对由从患者获得的如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等免疫细胞表达的TCR进行测序并将其克隆到表达构建体中。例如，如本文所描述的，可以将来自患者的各种TCR库克隆到表达构建体中，以用于插入到免疫细胞中。本领域确立了用于获自从患者获得的如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等免疫细胞的TCR编码序列并将其插入到表达构建体中的合适技术。来自TIL的TCR的靶肿瘤抗原可以被鉴定，或者也可以保持未被鉴定。供体个体可以是与接受者个体相同的人，将在如本文所描述的产生后向所述接受者个体施用免疫细胞，即治疗性TCR可以是源自施用了免疫细胞的患者。
在一些实施例中，治疗性TCR可以被工程化以增加其对肿瘤抗原的亲和力或亲合力(即亲和力增强的TCR)。相对于天然存在的TCR，亲和力增强的TCR可以包含一个或多个突变，例如，TCRα和β链的可变区的高变互补决定区(CDR)中的一个或多个突变。这些突变可以增加TCR对展示由癌细胞表达的肿瘤抗原的肽片段的MHC的亲和力。所产生的亲和力增强的TCR的合适方法包括使用噬菌体或酵母展示筛选TCR突变体的文库，并且所述合适方法是本领域众所周知的(参见例如Robbins等人,《免疫学杂志(J Immunol)》(2008)180(9):6116；San Miguel等人,(2015)《癌细胞(Cancer Cell)》28(3)281-283；Schmitt等人,(2013)《血液(Blood)》122 348-256；Jiang等人,(2015)《癌症发现(Cancer Discovery)》5 901)。
A2M4 TCRα的氨基酸序列的实例示出于SEQ ID NO:79中，并且A2M4TCRβ的氨基酸序列的实例示出于SEQ ID NO:82中。治疗性TCR的氨基酸序列的实例示出于SEQ ID NO:62中。
表达构建体是在异源表达盒的位点处并入到免疫细胞的基因组中的重组核酸。例如，表达构建体可以替代异源表达盒。表达构建体包含用于治疗性TCR的编码序列。用于治疗性TCR的编码序列可以例如包含编码TCRα链的第一核苷酸序列和编码TCRβ链的第二核苷酸序列或者编码TCRγ链的第一核苷酸序列和编码TCRδ链的第二核苷酸序列。编码ADB959TCRα的合适的第一核苷酸序列的实例示出于SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:38中。编码ADB959TCRβ的合适的第二核苷酸序列的实例示出于SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37中。编码A2M4TCRα的合适的第一核苷酸序列的实例示出于SEQ ID NO:78中，并且编码A2M4 TCRβ的合适的第二核苷酸序列的实例示出于SEQ ID NO:81中。
第一和第二核苷酸序列可以定位于单个开放阅读框中，并且可以被编码自切割肽，如2A肽和/或弗林蛋白酶接头的第三核苷酸序列分开。上文更详细地描述了合适的自切割肽。
由表达构建体编码的氨基酸序列(PTPRC外显子33_T2A_ADB959_TCRβ_P2A_TCRα)的实例示出于SEQ ID NO:34中。氨基酸序列包括T2A和P2A序列以分开ADB959 TCR链和PTPRC外显子序列。
在一些实施例中，表达构建体可以进一步包含与用于治疗性抗原受体的编码序列可操作地连接的启动子。启动子可以驱动免疫细胞中的治疗性抗原受体的表达。合适的启动子包括组成型启动子，如SV40、CMV、UBC、EF1A、EF1AS、PGK、JeT、MND或CAGG启动子或其变体。合适的EF1A启动子的核苷酸序列示出于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:36中。
表达构建体可以在与异源表达盒相同的位点处插入到免疫细胞基因组中。例如，异源表达盒可以在免疫细胞中被替代为表达构建体。这针对个体的治疗用途致敏免疫细胞。优选地，异源表达盒被完全切除，使得在替代后没有来自异源表达盒的序列保留在免疫细胞中。可以使用任何合适的技术来实现用表达构建体替代异源表达盒。
用于插入A2M4治疗性TCR的质粒的核苷酸序列的实例示出于SEQ ID NO:61中。
合适的技术包括如基于CRISPR/Cas9的技术等HR介导的基因替代技术和如Cre-Lox、FLP-FRT或phiC31整合酶技术等重组酶介导的基因取代技术。合适的技术是本领域众所周知的(参见例如Yamamoto等人,《染色体(Chromosoma.)》(2018)127(4):405-420；Sakuma等人,(2016)《自然实验手册(Nat Protoc)》11(1)118-133)。
在一些优选实施例中，表达盒可以通过HR介导的靶基因替代进行替代。例如，异源表达盒可以通过包含以下的方法进行替代：
将如DNA分子等核酸分子引入到免疫细胞中，所述核酸分子包含侧接有5'和3'同源臂的表达构建体，其中所述5'和3'同源臂与异源表达盒5'和3'端处的核苷酸序列和/或侧接于异源表达盒的基因组序列互补，
使得所述表达构建体替代所述免疫细胞的基因组中的所述表达盒。
在5'和3'靶向位点处切割异源表达盒后，同源臂介导用表达构建体替代异源表达盒。合适的同源臂可以包含300个至500个核苷酸的序列，所述序列与异源表达盒的核苷酸序列和/或侧接于异源表达盒的基因组序列互补，所述基因组序列分别作为5'和3'靶向位点的5'或3'，使得同源臂与去除或切除靶向位点之间的异源表达盒序列后的基因座或安全港基因座处的序列互补。
在一些实施例中，HR介导的靶基因替代可以由可编程核酸酶介导，例如位点特异性核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶，或RNA向导的核酸酶，如成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)核酸酶。
锌指核酸酶(ZFN)包含一个或多个Cys2-His2锌指DNA结合结构域和切割结构域(即，核酸酶)。可以使用常规技术将DNA结合结构域工程化以识别任何核酸序列并与其结合(参见例如Qu等人,(2013)《核酸研究(Nucl Ac Res)》41(16):7771-7782)。使用ZFN将突变引入到靶基因中是本领域众所周知的(参见例如Beerli等人,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》,2002；20:135–141；Maeder等人,《分子细胞(Mol.Cell.)》2008；31:294–301；Gupta等人,《自然方法(Nat.Methods)》2012；9:588–590)并且经工程化的ZFN可商购获得(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。
转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)包含与DNA结合结构域稠合的非特异性DNA切割核酸酶，所述DNA结合结构域包含一系列连接在一起的模块化TALEN重复序列以识别连续的核苷酸序列。TALEN靶向核酸酶的使用是本领域众所周知的(例如，Joung和Sander(2013)《分子细胞生物学自然综述(Nat Rev Mol Cell Biol.)》14:49-55；Kim等人,《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》(2013)；31:251–258。Miller JC等人,《自然生物技术》(2011)29:143-148。Reyon D等人,《自然生物技术》(2012)；30:460–465)。
大范围核酸酶是以大识别位点为特征的脱氧核糖核酸内切酶(12个至40个碱基对的双链DNA序列)；因此此位点通常在任何给定的基因组中出现仅一次(例如参见Silva等人,(2011)《当代基因疗法(Curr Gene Ther)》11(1):11-27)。
CRISPR靶向核酸酶(例如，Cas9)与向导RNA(gRNA)混合，从而以序列特异性方式切割基因组DNA。向导RNA的crRNA和tracrRNA可以单独使用，或者可以组合成单RNA，使得能够在表达盒的5'和3'靶向位点处进行位点特异性哺乳动物基因组切割。例如作为引入转基因的一种方式，使用CRISPR/Cas9系统将双链断裂引入到基因座中是本领域众所周知的(参见例如Cader等人,《自然免疫学》2016 17(9)1046-1056，Hwang等人,(2013)《自然生物技术》31:227-229；Xiao等人,(2013)《核酸研究》1-11；Horvath等人,《科学(Science)》(2010)327:167–170；Jinek M等人,《科学》(2012)337:816-821；Cong L等人,《科学》(2013)339:819–823；Jinek M等人,(2013)《电子生命(eLife)》2:e00471；Mali P等人,(2013)《科学》,339:823-826；Qi LS等人,(2013)《细胞》,152:1173-1183；Gilbert LA等人,(2013)《细胞》,154:442–451；Yang H等人,(2013)《细胞》154:1370–1379；以及Wang H等人,(2013)《细胞》153:910-918)。
在一些优选实施例中，可靶向的核酸酶是Cas核酸内切酶，其在免疫细胞中与向导RNA组合表达，所述向导RNA靶向Cas核酸内切酶以在5'和3'靶向位点处切割异源表达盒。
优选地，HR介导的靶基因替代由CRISPR/Cas9介导。例如，可以通过CRISPR/Cas9系统诱导靶位点处的DNA双链断裂(DSB),并且DSB的修复可以将表达构建体在靶位点处引入到细胞基因组中，或者可以使用rAAV载体引入核酸(AAV介导的基因编辑；Hirsch等人,2014《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》1114 291-307)。例如，异源表达盒可以通过包含以下的方法进行替代：
将如DNA分子等核酸分子中引入到免疫细胞中，所述核酸分子包含侧接有5'和3'同源臂的表达构建体，其中所述5'和3'同源臂与异源表达盒5'和3'端处的核苷酸序列和/或侧接于异源表达盒的基因组序列互补，以及
将靶向5'和3'靶向位点的CRISPR/Cas9引入到免疫细胞中，
使得所述表达构建体替代所述免疫细胞的基因组中的所述表达盒。
合适的同源臂如上文所描述的，并且可以包含300-500个核苷酸的序列，所述序列与异源表达盒5'和3'端处的核苷酸序列和/或侧接于异源表达盒的基因组序列互补。
PTPRC的外显子33中的用于DNA分子的合适同源臂或用于表达盒的靶向载体示出于SEQ ID NO:22和23中。PPP1R12C(AAVS1)的内含子1中的用于DNA分子的合适同源臂或用于表达盒的靶向载体示出于SEQ ID NO:35和41中。其它合适的同源臂示出于SEQ ID NO:64和74或SEQ ID NO:77和83中或者如本文其它部分所描述。
包含表达构建体的DNA分子可以是单链DNA分子。合适的单链DNA分子可以含在重组腺相关病毒(rAAV)载体中。通过用rAAV载体转染细胞，可以将单链DNA分子引入到免疫细胞中。
如5'和3'靶向序列等合适的靶向位点可以包含与CRISPR/Cas9的向导RNA互补的核苷酸序列。合适的序列可以例如由17个至24个核苷酸组成。靶向位点可以进一步包含侧接于互补核苷酸序列的另外的核苷酸序列。当去除异源表达盒时，这可能是提高功效所需的。例如，在互补核苷酸序列的5'和3'端处，靶向位点可以包含另外的1个至15个核苷酸，优选地约12个核苷酸。
在一些实施例中，3'靶向位点可以是定位于用于表达盒内的TCRα链的恒定区的编码序列内的核苷酸序列。例如，3'靶向位点可以是编码TCRα链的恒定区的序列的3'端。5'靶向位点与3'靶向位点具有相同的核苷酸序列，即5'靶向位点可以是编码TCRα链的恒定区的序列的3'端的拷贝。5'靶向位点可以定位于表达盒内的启动子的上游。
可以将CRISPR/Cas9作为蛋白质和gRNA直接引入到细胞中，例如引入在脂质纳米颗粒内，或者可以将其作为编码CRISPR/Cas9(如mRNA、质粒或病毒载体)的核酸引入，然后在细胞中表达。可以通过如RNP电穿孔等任何方便的方法将编码CRISPR/Cas9的核酸引入到免疫细胞中。
因为其具有相同序列，单向导RNA可以将CRISPR/Cas9靶向5'和3'靶向位点两者，由此在其5'和3'端处切割表达盒并将其从基因组中切除。在5'与3'靶向位点之间的表达盒的序列被切除后，5'和3'同源臂(其是靶向位点外的基因座或安全港基因座处的互补序列)介导表达构建体并入到基因座中。
可以使用标准技术设计用于CRISPR-Cas9介导的基因替代的合适的向导RNA序列。例如，靶向TRAC1的合适的向导RNA序列包括SEQ ID NO:5和6。靶向AAVS1安全港序列的合适的向导RNA序列包括SEQ ID NO:7。靶向B2M序列的外显子2的合适的向导RNA序列包括SEQID NO:8。靶向PTPRC序列的合适的向导RNA序列包括SEQ ID NO:9。
本文所描述的方法可以进一步包含例如通过使内源性TCR基因或内源性RAG1或RAG2基因失活来减少细胞中内源性TCR的表达或使其沉默。例如，所述方法可以进一步包含使内源性TCRα(TRAC)链基因或TCRβ(TRBC1或2)链基因或内源性RAG1或RAG2基因失活。这可以用于减少或防止免疫细胞的脱靶毒性。内源性基因可以在如IPSC等免疫细胞或祖细胞中失活。例如，在并入异源表达盒之前，可以使内源性基因在IPSC中失活。
可以使用任何合适的技术来使内源性TCR基因失活。方便地，使内源性TCR基因在异源表达盒被替代的同时失活。在一些优选实施例中，使用靶向编码TCRα链的恒定区的盒内的序列的CRISPR/Cas9替代表达盒。CRISPR/Cas9也可以靶向编码TCRα链的恒定区的内源性基因内的序列。这可能会将一个或多个失活突变引入到内源性TCRα链恒定区(TRAC)基因中。
本文所描述的方法可以进一步包含例如通过使内源性B2M或CIITA基因失活来减少II类转录激活因子(CIITA)和/或β-2-微球蛋白(B2M)的表达或使其沉默。内源性基因可以在如IPSC等免疫细胞或祖细胞中失活。这可能有助于减少同种异体反应效应并提高免疫细胞在体内的持久性。在一些实施例中，本文所描述的方法可以进一步包含在免疫细胞中表达异源B2M-HLA-E(mBE)和B2M-HLA-G(mBG)融合蛋白。可以将包含与合适的启动子可操作地连接的编码融合蛋白的异源核酸的构建体插入到如IPSC等免疫细胞或祖细胞中。这可能有助于保护细胞免受同种异体NK细胞介导的裂解。
免疫细胞可以展示一个治疗性TCR或多个治疗性TCR的表达，但不展示内源性TCR的表达。
可以通过从诱导多能干细胞(iPSC)定向分化来产生包含异源表达盒的免疫细胞。例如，用于产生包含异源表达盒的免疫细胞的方法可以包含：
(i)用包含异源表达盒的核酸转染iPSC，使得所述盒整合到所述iPSC的基因组中，
其中所述表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点，以及
(ii)使所述iPSC分化为包含所述表达盒的免疫细胞。
在一些实施例中，靶向位点可以是5'靶向位点，并且盒可以进一步包含3'靶向位点。
异源表达盒可以通过包含以下的方法整合到iPSC的靶基因座中：
将如DNA分子等核酸分子引入到iPSC中，所述核酸分子包含侧接有5'和3'同源臂的表达盒，其中所述5'和3'同源臂与侧接于靶基因座中的整合位点的核苷酸序列互补，以及
将靶向靶基因座中的整合位点的CRISPR/Cas9引入到免疫细胞中，
使得表达盒在靶基因座中的整合位点处整合到免疫细胞的基因组中。
合适的同源臂如上文所描述，并且可以包含300个至500个核苷酸的序列，所述序列与侧接于靶基因座中的整合位点的核苷酸序列互补。可以使用标准技术为任何靶基因座设计同源臂。
合适的靶位基因座如上文所描述并且如表1所示。在一些实施例中，异源表达盒可以整合到PTPRC的外显子33中。用于DNA分子的合适同源臂或用于PTPRC的外显子33的靶向载体示出于SEQ ID NO:18和19中。在其它实施例中，异源表达盒可以整合到PPP1R12C(AAVS1)的内含子1中。用于DNA分子的合适同源臂或用于PPP1R12C(AAVS1)的内含子1的靶向载体示出于SEQ ID NO:20和21中。
包含异源表达盒的DNA分子可以是单链DNA分子。合适的单链DNA分子可以含在重组腺相关病毒(rAAV)载体中。通过用rAAV载体转染细胞，可以将单链DNA分子引入到免疫细胞中。
诱导多能干细胞(iPSC)是源自非多能干性、完全分化的供体或先前细胞的多能干细胞。iPSC能够在体外自我更新并表现出未分化的表型，以及潜在地能够分化成三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)中的任何一层的任何胎儿或成人细胞类型。iPSC的群体可以是克隆的，即遗传上相同的细胞是单个共同祖先细胞的后代。iPSC可以表达以下多能性相关标志物中的一种或多种：POU5f1(Oct4)、Sox2、碱性磷酸酶、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF4和c-myc，优选地POU5f1、NANOG和SOX2中的一种或多种。iPSC可能缺乏与特定分化命运相关的标志物，如Bra、Sox17、FoxA2、αFP、Sox1、NCAM、GATA6、GATA4、Hand1和CDX2。具体地，iPSC可能缺乏与内胚层命运相关的标志物。
优选地，iPSC是人IPSC(hiPSC)。
在一些实施例中，iPSC可以是基因编辑的，例如使HLA基因或其它与免疫原性或GVHD相关的基因失活或缺失。
可以从供体细胞衍生或重新编程IPSC，所述供体细胞可以是体细胞或从如供体个体等来源获得的其它先前细胞。供体细胞可以是哺乳动物细胞，优选地人细胞。合适的供体细胞包括成人成纤维细胞和血细胞，例如外周血细胞，如HPC或单核细胞。如本文所描述，用于重新编程为iPSC的合适供体细胞可以从供体个体获得。在优选实施例中，供体个体可以是与患者或接受者个体不同的人，将在如本文所描述的产生(同种异体治疗)后向所述患者或接受者个体施用免疫细胞。例如，供体个体可以是健康个体，所述健康个体是与患有癌症的接受者个体相匹配(捐献之前或之后)的人白细胞抗原(HLA)。在其它实施例中，供体个体可能不是与接受者个体相匹配的HLA。优选地，供体个体可以是婴儿(新生儿)，例如供体细胞可以从脐带血样品中获得。
合适的供体个体优选地不含传染性病毒(例如，HIV、HPV、CMV)和外来因子(例如，细菌、支原体)，并且不含已知的遗传异常。
在一些实施例中，可以从获自供体个体的血液样品，优选地脐带样品中分离用于重新编程的如HPC等外周血细胞群体。用于分离HPC和其它外周血细胞的合适方法是本领域众所周知的，并且包括例如磁性激活的细胞分选(参见例如Gaudernack等人,1986《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》90 179)、荧光激活的细胞分选(FACS：参见例如Rheinherz等人,(1979)《美国国家科学院院刊(PNAS)》76-4061)和细胞淘选(参见例如Lum等人,(1982)《细胞免疫学》72-122)。可以通过CD34的表达在血细胞样品中鉴定HPC。在其它实施例中，在使用胶原酶或胰蛋白酶分散并在合适的细胞培养条件下向外生长之后，可以从皮肤活检中分离出用于重新编程的成纤维细胞群体。
通常通过将如Oct4、Sox2和Klf4等重新编程因子引入到细胞中来使供体细胞重新编程为iPSC。重新编程因子可以是蛋白质或编码核酸，并且可以通过任何合适的技术(包括质粒、转座子或更优选地，通过病毒转染或直接蛋白质递送)引入到分化细胞中。还可以将其它重新编程因子，例如Klf基因，如Klf-1、-2、-4和-5；Myc基因，如C-myc、L-myc和N-myc；Nanog；SV40大T抗原；Lin28；和靶向如p53等基因的短发夹(shRNA)引入到细胞中以增加诱导效率。在引入重新编程因子后，可以培养供体细胞。表达多能性标志物的细胞可以被分离和/或纯化以产生iPSC群体。用于产生iPSC的技术是本领域众所周知的(Yamanaka等人,《自然(Nature)》2007；448:313-7；Yamanaka,62007年6月7日；1(1):39-49；Kim等人,《自然》2008年7月31日；454(7204):646-50；Takahashi,《细胞》2007年11月30日；131(5):861-72.Park等人,《自然》2008年1月10日；451(7175):141-6；Kimet等人,《细胞：干细胞(CellStem Cell)》2009年6月5日；4(6):472-6；Vallier,L.等人,《干细胞(Stem Cells)》,2009.9999(999A):p.N/A；Baghbaderani等人,2016；《干细胞综述(Stem Cell Rev.)》2016年8月；12(4):394-420；Baghbaderani等人,(2015)《干细胞报告(Stem Cell Reports)》,5(4),647-659)。
可以采用常规技术来培养和维持iPSC(Vallier,L.等人,《发育生物学(Dev.Biol.)》275,403-421(2004)；Cowan,C.A.等人,《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》350,1353-1356(2004)，Joannides,A.等人,《干细胞》24,230-235(2006)，Klimanskaya,I.等人,《柳叶刀(Lancet)》365,1636-1641(2005)，Ludwig,T.E.等人,《自然生物技术》24,185-187(2006))。用于本发明方法的IPSC可以在所定义的条件下或饲养细胞上生长。例如，可以常规地以适当的密度(例如，105至106个细胞/60mm培养皿)在如经照射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)等饲养细胞层上的培养皿中、或者在饲养调节的或定义的iPSC维持培养基中的适当的底物上培养iPSC。用于本发明方法的iPSC可以通过酶促或机械方式进行传代。在一些实施例中，可以在如mTeSRTM1或TeSRTM2(干细胞技术公司(StemCell Technologies))或E8 flex(赛默生命技术公司(Life Thermo))培养基等iPSC维持培养基中，在matrigelTM或如玻连蛋白等ECM蛋白上传代iPSC。
可以用包含异源表达盒的核酸转染IPSC，使得所述盒整合到IPSC的基因组中。合适的技术是本领域中众所周知的。在iPSC阶段的转染允许单克隆的分离和同质细胞群体的分化。
可以通过任何方便的技术将核酸引入到细胞中。用于将异源表达盒转运到iPSC中的合适技术是本领域众所周知的，并且包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染、通过基因编辑进入到特定位置中的基因编辑(例如，AAV介导的基因编辑)以及使用逆转录病毒或其它病毒(例如，痘苗病毒或慢病毒)的转导。在一些实施例中，可以通过电穿孔递送CAS9向导RNA核糖核蛋白复合物(RNP)，并且编码表达盒的如靶向载体等核酸分子(例如DNA分子)将被包装为rAAV(血清型6)。可替代地，编码表达盒(如ssDNA)的RNA和DNA分子可以通过电穿孔共递送。
通过组合使用CRISPR/Cas9以产生双链断裂和核酸分子内的同源臂，提供了对iPSC的基因组中整合位点的靶向。合适的整合位点包括基因座和安全港基因座，并在上文有更详细的描述。可以筛选所有克隆以确认在正确位点处的整合。
当将异源核酸引入或并入到iPSC中时，必须考虑某些因素。待插入的核酸应装配在含有有效调控元件的构建体或载体中，所述元件将驱动T细胞中的转录。用于例如在制备核酸构建体、将DNA引入到细胞中以及基因表达等操控和转换核酸的许多已知技术和方案在《分子生物学实验指南(Protocols in Molecular Biology)》第二版,Ausubel等人编辑,约翰威立父子公司(John Wiley&Sons),1992中有详细描述。在一些实施例中，可以通过基因编辑将核酸引入到细胞中。例如，可以通过CRISPR/Cas9系统诱导靶位点处的DNA双链断裂(DSB),并且DSB的修复可以将异源核酸在靶位点处引入到细胞基因组中，或者可以使用rAAV载体引入核酸(AAV介导的基因编辑；Hirsch等人,2014《分子生物学方法》1114 291-307)。
还提供了一种IPSC，其包含整合到其基因组中的异源表达盒，
其中所述表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点。
靶向位点可以是5'靶向位点，并且盒可以进一步包含3'靶向位点。
上文更详细地描述了异源表达盒。
可以在一系列步骤中使iPSC分化和成熟为如T细胞等免疫细胞。这些步骤中的细胞群体的分化和成熟是通过在补充有一组分化因子的培养基中培养细胞来诱导的。每种培养基的所述一组分化因子优选地是详尽的，并且培养基可以缺乏其它分化因子。在优选实施例中，培养基是化学限定的培养基。例如，如下文所描述，培养基可以由化学限定的营养培养基组成，所述化学限定的营养培养基补充有有效量的一种或多种分化因子。化学限定的营养培养基可以包含补充有一种或多种无血清培养基补充物的基础培养基。
分化因子是调节，例如促进或抑制介导哺乳动物的细胞分化的信号传导通路的因子。分化因子可以包括调节激活素/结、FGF、Wnt或BMP或其信号传导通路中的一种或多种的生长因子、细胞因子和小分子。分化因子的实例包括激活素/结、FGF、BMP、视黄酸、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞因子(SCF)、TGFβ配体、GDF、LIF、白介素、GSK-3抑制剂和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂。
本文所描述的培养基中的一种或多种使用的分化因子包括TGFβ配体，如激活素、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、干细胞因子(SCF)、血管内皮生长因子(VEGF)、GSK-3抑制剂(如CHIR-99021)、白介素和如IGF-1和血管紧张素II等激素。分化因子可以以有效调节在培养基中培养的细胞中的信号传导通路的量存在于本文所描述的培养基中。
在一些实施例中，上文或下文列出的分化因子可以在培养基中被替代为对相同信号传导通路具有相同作用(即刺激或抑制)的因子。合适的因子是本领域已知的，并且包括蛋白质、核酸、抗体和小分子。
通过监测和/或检测分化细胞群体中的一种或多种细胞标志物的表达，可以确定每个步骤期间的细胞群体的分化程度。例如，可以确定分化程度更高的细胞类型的标志物特性表达增加或分化程度较低的细胞类型的标志物特性表达减少。细胞标志物的表达可以通过任何合适的技术来确定，所述合适的技术包括免疫细胞化学、免疫荧光、RT-PCR、免疫印迹、荧光激活的细胞分选(FACS)和酶促分析。在优选实施例中，如果标志物可在细胞表面检测到，则可以说细胞表达所述标志物。例如，本文所陈述的不表达标志物的细胞可以展示标志物基因的活性转录和细胞内表达，但细胞表面上可能不存在可检测水平的标志物。
可以在下一分化步骤之前培养、维持或扩增通过本文所描述的方法中的步骤产生的部分分化的细胞(例如，中胚层细胞、造血内皮(HE；即造血内皮细胞或HEC)、HPC或T细胞祖细胞)群体。可以通过任何方便的技术扩增部分分化的细胞。
在每个步骤之后，通过所述步骤产生的部分分化的细胞群体可以不含或基本上不含其它细胞类型。例如，在培养基中培养后，群体可以含有60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多部分分化的细胞。优选地，细胞群体充分不含其它细胞类型，因此不需要纯化。如果需要，部分分化的细胞群体可以通过如MAC或FACS等任何方便的技术进行纯化。
在没有饲养细胞的情况下，可以在用如纤连蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白等细胞外基质蛋白涂覆的表面或底物上将细胞培养成单层。用于细胞培养的合适技术是本领域众所周知的(参见例如《基础细胞培养方案(Basic Cell Culture Protocols)》,C.Helgason,美国胡马纳出版社(Humana Press Inc.U.S.)(2004年10月15日)ISBN:1588295451；人细胞培养方案(Human Cell Culture Protocols)(《分子医学方法系列(Methods in MolecularMedicine.S.)》)美国胡马纳出版社(2004年12月9日)ISBN:1588292223；《动物细胞培养：基础技术手册(Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique)》,R.Freshney,约翰威立父子公司(2005年8月2日)ISBN:0471453293，Ho WY等人,《免疫学方法杂志》(2006)310:40-52,《干细胞手册(Handbook of Stem Cells)》(R.Lanza编辑)ISBN:0124366430)。J.Pollard和J.M.Walker(1997)的《基础细胞培养方案》,A.Doyle和J.B.Griffiths(1997)的‘哺乳动物细胞培养：基本技术(Mammalian Cell Culture:Essential Techniques)’,A.Chiu和M.Rao(2003)的‘人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells)’,A.Bongso(2005)的‘干细胞：从工作台到床边(Stem Cells:From Bench to Bedside)’，Peterson和Loring(2012)《人干细胞手册：实验室指南(Human Stem Cell Manual:A LaboratoryGuide)》学术出版社(Academic Press)和K.Turksen(2006)的‘人胚胎干细胞方案(HumanEmbryonic Stem Cell Protocols)’。培养基和其成分可以从商业来源(例如，吉博科公司(Gibco)、罗氏公司(Roche)、西格玛公司(Sigma)、Europa生物产物公司(Europabioproducts)、R&D系统公司(R&D Systems))获得。标准哺乳动物细胞培养条件可以用于上述培养步骤，例如，37℃、5％或21％氧气、5％二氧化碳。优选地每两天更换一次培养基，并且允许细胞通过重力沉降。
可以在培养容器中培养细胞。合适的细胞培养容器是本领域众所周知的，并且包括培养板、培养皿、烧瓶、生物反应器和多孔板，例如，6孔板、12孔板或96孔板。
优选地对培养容器进行组织培养处理，例如通过用如纤连蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白等细胞外基质蛋白涂覆容器的一个或多个表面。可以使用标准技术(例如通过用如本文所描述的涂层溶液温育)对培养容器进行组织培养处理，或者可以从商业供应商获得预处理的培养容器。
可以使用包含以下的多步骤过程使iPSC分化为免疫细胞：
(i)使所述iPSC分化为中胚层细胞，
(ii)使所述中胚层细胞分化为造血内皮细胞(HEC)，
(iii)使HEC分化为造血祖细胞(HPC)群体，
(iv)使所述HPC分化为免疫细胞祖细胞；以及
(v)使祖细胞免疫细胞群体成熟以产生表达异源表达盒的免疫细胞群体。
在第一阶段，可以使iPSC群体分化为中胚层细胞。可以例如通过在合适的条件下培养iPSC群体来促进中胚层分化，从而将iPSC分化为中胚层细胞。例如，iPSC细胞可以依序在第一中胚层诱导培养基、第二中胚层诱导培养基和第三中胚层诱导培养基中培养以诱导分化为中胚层细胞。在优选实施例中，第一中胚层诱导培养基、第二中胚层诱导培养基和第三中胚层诱导培养基是化学限定的培养基。例如，第一中胚层诱导培养基可以由化学限定的营养培养基组成，所述化学限定的营养培养基补充有有效量的激活素，优选地激活素A，例如，50ng/ml的激活素A；第二中胚层诱导培养基可以由化学限定的营养培养基组成，所述化学限定的营养培养基补充有有效量的以下：激活素，优选地激活素A，例如，5ng/ml激活素A；BMP，优选地BMP4，例如，10ng/ml BMP4；以及FGF，优选地bFGF(FGF2)，例如，5ng/ml bFGF；并且第三中胚层诱导培养基可以由化学限定的营养培养基组成，所述化学限定的营养培养基补充有有效量的以下：激活素，优选地激活素A，例如，5ng/ml激活素A；BMP，优选地BMP4，例如，10ng/ml BMP4；FGF，优选地bFGF(FGF2)，例如，5ng/ml bFGF；以及GSK3抑制剂，优选地CHIR-99021，例如，10μM CHIR-99021。
在第二阶段，可以使中胚层细胞分化为造血内皮细胞。可以通过在促进HE分化的合适的条件下培养中胚层细胞群体来使中胚层细胞被分化为造血内皮(HE)细胞。例如，中胚层细胞可以在HE诱导培养基中培养。在优选实施例中，HE诱导培养基是化学限定的培养基。例如，HE诱导培养基可以由化学限定的营养培养基组成，所述化学限定的营养培养基补充有有效量VEGF，例如，15ng/ml VEGF；和SCF，例如，100ng/ml SCF。优选地，在由化学限定的营养培养基和两种分化因子组成的HE诱导培养基中培养中胚层细胞，其中所述两种分化因子是SCF和VEGF。
在第三阶段，可以使造血内皮细胞分化为造血祖细胞(HPC)。可以通过在促进造血分化的合适的条件下培养HE细胞群体来使造血内皮(HE)细胞分化为造血祖细胞(HPC)。例如，HE细胞可以在造血诱导培养基中培养。在优选实施例中，造血诱导培养基是化学限定的培养基。例如，造血诱导培养基可以由化学限定的营养培养基组成，所述化学限定的营养培养基补充有有效量的以下：VEGF，例如，15ng/ml；SCF，例如，100ng/ml；促血小板生成素(TPO)，例如，30ng/ml；Flt3配体(FLT3L)，例如，25ng/ml；IL-3，例如，25ng/ml；IL-6，例如，10ng/ml；IL-7，例如，10ng/ml；IL-11，例如，5ng/ml；IGF-1，例如，25ng/ml；BMP，例如，10ng/ml的BMP4；FGF，例如，5ng/ml的bFGF；音猬因子(SHH)，例如，25ng/ml；促红细胞生成素(EPO)，例如2u/ml；血管紧张素II，例如，10μg/ml，以及血管紧张素II 1型受体(AT1)拮抗剂，例如，氯沙坦(losartan)，100μM。
在第四阶段，可以使HPC分化为如T细胞祖细胞等免疫细胞祖细胞。可以通过在促进淋巴分化的合适的条件下培养HPC群体来使造血祖细胞(HPC)分化为祖细胞免疫细胞。例如，造血祖细胞可以在淋巴扩增培养基中培养。在优选实施例中，淋巴扩增培养基是化学限定的培养基。例如，淋巴扩增培养基可以由补充有有效量的上述分化因子的化学限定的营养培养基组成。合适的淋巴扩增培养基是本领域众所周知的并且包括StemspanTM SFEMII(目录号9605；加利福尼亚州干细胞技术公司)与StemspanTM淋巴扩增补充剂(目录号9915；加利福尼亚州干细胞技术公司)。
在第五阶段，可以使祖细胞免疫细胞成熟为如TCRαβ+T细胞等TCRαβ+免疫细胞。可以通过在促进成熟的合适的条件下培养祖细胞免疫细胞群体来使祖细胞免疫细胞成熟为TCRαβ+免疫细胞。例如，祖细胞免疫细胞可以在成熟培养基中培养。在优选实施例中，T细胞成熟培养基是化学限定的培养基。例如，T细胞成熟培养基可以由补充有有效量的上述分化因子的化学限定的营养培养基组成。合适的T细胞成熟培养基是本领域众所周知的，并且包括StemspanTM SFEMII(目录号9605；加利福尼亚州干细胞技术公司)与StemspanTM T细胞成熟补充剂(目录号9930；加利福尼亚州干细胞技术公司)和其它适于扩增PBMC和CD3+细胞的培养基，如ExCellerate人T细胞扩增培养基(美国R&D系统公司)。其它合适的T细胞成熟培养基可以包括如本文其它地方所描述的补充有ITS、白蛋白和脂质以及进一步补充有有效量的上述分化因子的基础培养基，如IMDM。
在第六阶段，可以激活和/或扩增如TCRαβ+T细胞等TCRαβ+免疫细胞群体，以产生或增加单阳性CD4+免疫细胞的比例，或更优选地产生或增加单阳性CD8+免疫细胞的比例。用于激活和扩增如T细胞等免疫细胞的合适方法是本领域众所周知的。例如，可以在适当的培养条件下使T细胞暴露于T细胞受体(TCR)激动剂。合适的TCR激动剂包括配体，如展示在珠粒或如树突状细胞等抗原呈递细胞的表面上的I类或II类MHC分子(MHC-肽复合物)上的肽，以及如抗TCR抗体等可溶性因子，例如抗CD28抗体，以及如MHC-肽四聚体、五聚体或右旋体等多聚体MHC-肽复合物。
用于第1阶段至第6阶段的合适条件和培养基是本领域已知的。WO2021/032836、WO2021/032855、WO2021/032851和WO2021/032852中公开了一些优选条件和培养基，所述文献的内容(包括条件和培养基)通过引用并入本文。
如上文所描述的定向分化和成熟产生包含异源表达盒的免疫细胞。还提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞包含整合到其基因组中的异源表达盒，
其中所述表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点。
靶向位点可以是5'靶向位点，并且盒可以进一步包含3'靶向位点。
本文其它地方描述了免疫细胞。例如，免疫细胞可以是TCRαβ+免疫细胞，如TCRαβ+T细胞。
在产生后，包含异源表达盒的免疫细胞可以被储存或致敏以用于疗法，如过继性细胞疗法或过继性免疫疗法。如本文所描述的，通过将编码治疗性TCR的表达构建体引入到异源表达盒的位点处的细胞基因组中来致敏免疫细胞。例如，可以通过用编码如本文所描述的治疗性TCR的表达构建体替代异源表达盒来致敏免疫细胞。表达治疗性TCR的致敏免疫细胞群体可以用作药物。例如，表达治疗性TCR的免疫细胞群体可以用于免疫疗法，例如过继性细胞疗法或过继性免疫疗法。
过继性细胞疗法或过继性免疫疗法是指如T淋巴细胞等人免疫细胞的过继性转移，所述人免疫细胞表达对患者的靶细胞上表达的抗原或其肽具有特异性的TCR和/或对靶细胞上表达的肽MHC复合物具有特异性的TCR。这可以用于治疗一系列疾病，取决于所选择的靶，例如，用于治疗癌症的肿瘤特异性抗原。过继性细胞疗法(ACT)涉及去除捐献者的一部分细胞，例如白细胞。然后将这些细胞用于体外产生iPSC，并将这些iPSC用异源表达盒转染，并且用于高效地产生免疫细胞。免疫细胞可以被扩增、洗涤、浓缩和/或然后冷冻，以便有时间进行测试、运送和储存，直至患者准备好接受免疫细胞的输注为止。如本文所描述的，然后通过将编码治疗性TCR的表达构建体在异源表达盒的位点处插入在患者体内来致敏免疫细胞，所述治疗性TCR对如癌细胞等靶细胞上表达的抗原或其肽具有特异性，和/或对如癌细胞等靶细胞上的肽MHC复合物具有特异性。表达构建体可以替代异源表达盒。编码治疗性TCR的核苷酸序列可以源自从患者获得的如肿瘤浸润淋巴细胞等癌症反应性免疫细胞。
在一些实施例中，如本文所描述的，可以通过将编码治疗性TCR的表达构建体群体在异源表达盒的位点处插入在群体中的免疫细胞中来致敏免疫细胞群体，所述治疗性TCR对如癌细胞等靶细胞上表达的不同抗原或其肽具有特异性，和/或对患者的如癌细胞等靶细胞上的不同肽MHC复合物具有特异性。例如，可以将异源表达盒替代为表达构建体。由表达构建体群体编码的治疗性TCR可以与患者的不同的肿瘤抗原具有反应性。表达构建体群体中编码不同治疗性TCR的核苷酸序列可以源自从患者获得的如肿瘤浸润淋巴细胞等癌症反应性免疫细胞。以这种方式致敏的免疫细胞群体可以与患者的多种不同肿瘤抗原具有反应性。
在产生和致敏之后，表达如本文所描述地产生的一个治疗性TCR或多个治疗性TCR的免疫细胞群体可以与其它如缓冲液、载剂、稀释剂、防腐剂和/或药学上可接受的赋形剂等试剂共混。下文更详细地描述了合适的试剂。本文所描述的方法可以包含将免疫细胞群体与药学上可接受的赋形剂共混。
适于施用(例如，通过输注)的药物组合物包括水性和非水性等渗、无热原、无菌注射溶液，所述注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、防腐剂、稳定剂、抑菌剂以及使所述调配物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，所述悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。用于此类调配物的合适的等渗媒剂的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液(Ringer'sSolution)或乳酸林格氏注射液。可以在标准药学文献中，例如：《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第18版,美国宾夕法尼亚州伊斯顿市马克出版公司(Mack Publishing Company,Easton,Pa.),1990中找到合适的媒剂。
在一些优选实施例中，免疫细胞可以被调配成适于静脉输注到个体中的药物组合物。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适用于与受试者(例如，人)的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。在与调配物的其它组分相容的意义上，每种载剂、赋形剂等也必须是“可接受的”。
本发明的其它方面提供了表达如本文所描述地产生的一个治疗性TCR或多个治疗性TCR的免疫细胞群体的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物；表达如本文所描述地产生的一个治疗性TCR或多个治疗性TCR的免疫细胞群体，其用于治疗癌症；以及治疗癌症的方法，所述方法包含向有需要的个体施用表达如本文所描述地产生的一个治疗性TCR或多个治疗性TCR的免疫细胞群体。
免疫细胞群体可以是同种异体的，即免疫细胞最初是从与其随后施用于的个体不同的个体中获得的(即，供体个体和接受者个体不同)。同种异体是指源自相同物种的不同动物的移植物。
供体个体和接受者个体可以进行HLA匹配以避免GVHD和其它不期望的免疫效应，如排斥。可替代地，供体个体和接受者个体可以不进行HLA匹配，或者可以例如通过基因编辑对来自供体个体的细胞中的HLA基因进行修饰，以去除任何与接受者的HLA错配。
用于向接受者个体施用的合适的免疫细胞群体可以通过包含以下的方法产生：提供从供体个体获得的细胞，优选地T细胞的初始群体，将细胞重新编程为iPSC，用异源表达盒转染iPSC，使iPSC分化为免疫细胞，以及通过以下来致敏免疫细胞：在接受者个体中，用编码治疗性TCR的表达构建体替代异源表达盒，所述治疗性TCR与由癌细胞和/或由癌细胞呈递的任选地与MHC复合的抗原或其肽特异性地结合；或者在接受者个体中，用表达构建体群体替代免疫细胞中的异源表达盒，每个表达构建体编码治疗性TCR，所述治疗性TCR与由癌细胞呈递的任选地与MHC复合的不同抗原或其肽特异性地结合。
在施用表达一个治疗性TCR或多个治疗性TCR的免疫细胞后，接受者个体可以表现出针对接受者个体的癌细胞的细胞介导的免疫应答。这对个体的癌症病状可能具有有益作用。
如本文所使用的，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”并且呈单数或复数形式，是指经历了恶性转化的细胞，所述恶性转化使得其对宿主生物体是病理性的。
通过成熟的技术，特别是组织学检查，可以容易地将原发性癌细胞与非癌细胞区分开。癌细胞不仅包括原代癌细胞，还包括源自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及源自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的一种类型的癌症时,“可临床检测到的”肿瘤是基于肿瘤质量可检测的肿瘤；例如通过如计算机断层扫描(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、X射线、超声波或体检触诊等程序，和/或由于可从患者获得的样品中的一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测的肿瘤。
癌症病状的特征可以在于恶性癌细胞的异常增殖，并且可以包括：白血病，如AML、CML、ALL和CLL；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)和多发性骨髓瘤；以及实体癌症，如肉瘤、皮肤癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌以及未知原发性癌症(CUP)。
个体的癌细胞与个体中的正常体细胞可以在免疫上不同(即，癌症肿瘤可以是免疫原性的)。例如，癌细胞可能能够在个体中引发针对由癌细胞表达的一种或多种抗原的全身免疫应答。引发免疫应答的肿瘤抗原可以对癌细胞具有特异性的，或者可以由个体中的一个或多个正常细胞共享。
适于如本文所描述的治疗的个体的癌细胞可以表达抗原和/或可以是正确的HLA类型，以与由T细胞表达的αβTCR结合。
适于如上文所描述治疗的个体可以是哺乳动物。在优选实施例中，所述个体是人。在其它优选实施例中，可以采用非人哺乳动物，特别是常规用作用于展示在人体内的治疗功效的模型的哺乳动物(例如，鼠科动物、灵长类动物、猪科动物、犬科动物或兔动物)。
在一些实施例中，在初始癌症治疗之后，个体可能具有微小残留疾病(MRD)。
患有癌症的个体可以表现出至少一种足以根据本领域已知的临床标准做出癌症诊断的可鉴定的体征、症状或实验室发现。可以在医学教科书中找到此类临床标准的实例，如《哈里森内科医学原理(Harrison's Principles of Internal Medicine)》,第15版,Fauci AS等人编辑,纽约的麦格劳·希尔公司(McGraw-Hill,New York),2001。在一些实例中，对个体癌症的诊断可以包括在从个体获得的体液或组织样品中鉴定特定的细胞类型(例如，癌细胞)。
抗肿瘤效果是一种生物学效果，其可以表现为肿瘤生长速率的降低、肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数量的减少、转移瘤数量的减少、预期寿命的增加或与癌症病状相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤效果”也可以通过根据本发明的方法产生的肽、多核苷酸、细胞(具体地T细胞)，以及本文所描述的抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。
治疗可以是任何治疗和/或疗法，无论是对人还是对动物(例如在兽医应用中)，其中实现了一些期望的治疗效果，例如抑制或延缓病状的进展，并且包括进展速率的降低、进展速率的停滞、病状的改善、病状的治愈或缓解(无论是部分还是全部)、预防、延缓、减轻或阻止病状的一种或多种症状和/或体征，或者将受试者或患者的存活期延长至超出不进行治疗情况下的预期时间。
治疗也可以是预防性的(即预防法)。例如，可以如本文所描述地治疗易患癌症或有癌症发生或复发风险的个体。这种治疗可以预防或延缓个体的癌症的发生或复发。
具体地，治疗可以包括抑制癌症生长，包括癌症完全缓解和/或抑制癌症转移。癌症生长通常是指指示癌症向更严重形式变化的许多指标中的任何一个指标。因此，用于测量癌症生长抑制的指标包括癌细胞存活的减少、肿瘤体积或形态的减少(例如，如使用计算机断层扫描(CT)、超声波扫描或其它成像方法所确定的)、肿瘤生长延缓、肿瘤脉管系统的破坏、迟发型超敏反应皮肤试验中的性能的改善、T细胞活性的增加和肿瘤特异性抗原水平的降低。施用如本文所描述的经修饰的免疫细胞可以提高个体抵抗癌症生长的能力，具体地已经存在于受试者中的癌症的生长，和/或降低个体中的癌症生长的倾向。
免疫细胞或包含免疫细胞的药物组合物可以通过任何方便的施用途径(例如，通过输注)施用于受试者，无论是全身/外周还是在所需作用的部位处，包括但不限于肠胃外。输注涉及通过针或导管施用合适组合物中的T细胞。通常，通过静脉内或皮下输注T细胞，尽管T细胞可以通过其它非口服途径输注，如肌肉内注射和硬膜外途径。合适的输注技术是本领域已知的，并且通常在疗法中使用(参见例如Rosenberg等人,《新英格兰医学杂志(NewEng.J.of Med.)》319:1676,1988)。
通常，所施用的细胞数量为每Kg体重约105至约1010个细胞，例如每个个体约1、2、3、4、5、6、7、8或9、x105、x106、x107、x108、x109或x1010个细胞中的任一种，通常每个个体2x108至2x1010个细胞，通常在30分钟内，根据需要重复治疗，例如间隔数天至数周。应当理解，TCRαβ+T细胞和包含免疫细胞的组合物的合适剂量可以因患者而异。确定最佳剂量将通常涉及平衡本发明的治疗的治疗益处水平与任何风险或有害副作用。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定细胞的活性、细胞因子释放综合征(CRS)、施用途径、施用时间、细胞损失或失活的速率、治疗持续时间、组合使用的其它药物、化合物和/或材料，以及患者的年龄、性别、体重、病状、总体健康状况和既往病史。细胞的量和施用途径最终将由医生决定，尽管通常剂量将达到在作用位点实现期望的效果而不引起实质性的有害或有害的副作用的局部浓度。
虽然免疫细胞可以单独施用，但在一些情况下，免疫细胞可以与靶抗原、展示靶抗原的APC、CD3/CD28珠粒、IL-2、IL7和/或IL15组合施用，以促进免疫细胞群体的体内扩增。组合施用可以通过分开、同时或顺序施用组合组分来进行。
免疫细胞群体可以与一种或多种其它疗法组合施用，如细胞因子，例如IL-2、CD4+CD8+化疗、放射和免疫肿瘤剂，包括检查点抑制剂，如抗B7-H3、抗B7-H4、抗TIM3、抗KIR、抗LAG3、抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA4抗体。组合施用可以通过分开、同时或顺序施用组合组分来进行。
所述一种或多种其它疗法可以通过任何方便的方式施用，优选地在与免疫细胞施用部位分开的部位处施用。
免疫细胞的施用可以在整个治疗过程中以一次剂量、连续或间歇的方式(例如，以适当的间隔分剂量)进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，并且将随着用于疗法的组合物、疗法目的、被治疗的靶细胞和被治疗的受试者而异。单次或多次施用可以由治疗医生选择剂量水平和模式来进行。优选地，免疫细胞在单次输血中施用，例如5亿、10亿、20亿、30亿、40亿、50亿、60亿、70亿、80亿、90亿、100亿、110亿、120亿、130亿、140亿、150亿个T细胞中的任一种，例如至少1x109个细胞。
本发明的其它方面和实施例提供了上文所描述的术语“包含”被术语“由……组成”替代的方面和实施例和上文所描述的术语“包含”被术语“基本上由……组成”替代的方面和实施例。
应当理解，本申请公开了上面彼此描述的以上任何方面和实施例的所有组合，除非上下文另有要求。类似地，除非上下文另有要求，否则本申请公开了单独的优选特征和/或任选特征或与其它方面中的任一个的所有组合。
通过阅读本公开，对上述实施例、另外的实施例和其修订的修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的，因此，这些都在本发明的范围内。
本说明书中所引用的所有文档和序列数据库条目出于所有目的通过引用整体并入本文。
本文使用的“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下明确公开了两个指定特征或组分中的每一个。例如，“A和/或B”将被视为明确地公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种，就像本文单独列出的每一种情况一样。
实验
IPSC细胞培养
TCR着陆垫构建体的敲入(图7和图8)在iPSC系GR1.1中进行(Baghbaderani等人2015；同上)。对于编辑实验，将GR1.1 iPSC系维持在涂覆有Matriclone(0.25μg/cm2)(Solemtim)的具有完整的mTeSRTMPlus培养基(干细胞技术公司)的组织培养处理的板上。将GR1.1 iPSC系细胞每4-5天用Versene(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))或Accutase(干细胞技术公司)传代一次。将iPSC培养物维持在潮湿的37℃、5％O2、5％CO2温育箱中。通过FACS分析常规监测多能性标志物(POU5F1、NANOG、TRA-160和SOX2)的表达和分化标志物SSEA-1的缺失。在分化之前，经编辑的iPSC克隆在Synthemax Matrrix(康宁公司(Corning))上适应生长维持。所有其它培养条件都是相同的。
rAAV靶向载体的产生。
通过Gibson组装产生AAV靶向构建体(图7和8)。从基因组DNA对同源臂区进行PCR扩增，并且合成地合成靶向载体的剩余组分。rAAV载体(血清型6)是通过用靶向载体和pDP6包装质粒(Plasmid Factory公司(Plasmid Factory))瞬时转染HEK293T细胞而产生的。HEK293T是以1μg质粒:1μl PEI的质粒:PEI比率转染的。根据标准方案，使用碘克沙醇梯度超速离心来纯化rAAV(Strobel等人,(2015)《人类基因疗法方法(Hum Gen Ther Methods)》26(4)147-157)。
向导RNA序列
PTPRC外显子33是用向导RNAGCAAGTCCAGCTTTAAATCA(SEQ ID NO:9)靶向的。(Chr1 198756152至198756171(人GRCh38-Ensembl104版-2021年5月)，PPP1r12C内含子1是用向导RNA GTCCCCTCCACCCCACAGTG(SEQ ID NO:7)(Chr19：55,115,770-55,115,790人GRCh38(Ensembl 104版-2021年5月)靶向的。TRAC外显子1是用向导RNA AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:6)(Chr1422547530至22547549人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)靶向的。向导RNA序列由IDT合成。
核糖核蛋白(RNP)复合物的制备
在冷却至室温之前，通过在95℃下初始变性5分钟来粘接crRNA和tracrRNA。将等摩尔量的经粘接的crRNA/tracrRNA双链体和Cas9蛋白(IDT)在室温下温育15分钟，以产生10μM核糖核蛋白(RNP)复合物。
ADB796着陆垫的敲入-靶向PTPRC外显子33或PPP1R12C内含子1
通过使用16孔NucleocuvetteTM条(龙沙公司(Lonza))进行4D-NucleofectorTM的核转染将靶向PTPRC外显子33或PPP1R12C内含子1的RNP复合物引入到iPSC细胞中。将200x103GR1.1重悬于缓冲液P3(龙沙公司P3原代细胞4D-NucleofectorTM)中(10x106/ml)。将3μl RNP复合物(10μM)添加到20μl细胞悬浮液中。用程序CA-137进行核转染。在核转染后，立即将细胞接种到补充有1x CloneRTM(干细胞技术公司)的完全mTESR Plus中。细胞接种后6-8小时进行AAV转导(2x103载体基因组/细胞)。经编辑的GR1.1细胞随后培养完全mTESR Plus。在分离源自单细胞的iPSC克隆并对经编辑的克隆进行基因分型之前，将细胞扩增以用于一次传代。使用来自Solentim的VIPS仪器将单细胞接种到96孔板中，并扩增10-14天。使用与同源臂区外和TCR转基因内的基因组DNA相对应的引物，根据标准方案对经编辑的克隆进行PCR基因分型。另外，使用TLA分析(Cergentis公司(Cergentis))确认ADB796TCR着陆垫整合到期望的基因组位置(PTPRC外显子33或PPP1R12C(内含子1))中。
将MAGE-A10 TCR ADB796交换为MAGE-A4/B2 TCR ADB959
用含有TGTACCAGCTGAGAGACTCT向导RNA的RNP切除ADB796TCR着陆垫。将PTPRCWT/ADB796着陆垫或PPP1R12CWT/ADB796着陆垫iPSC细胞分化为iT细胞。在分化结束时(第5阶段)采集CD4/CD8双阳性iT细胞。使用16孔NucleocuvetteTM条，用P2原代细胞4D-Nucleofector X kit STM进行核转染。将1x106个iT细胞重悬于20μl P2中。将3μl RNP复合物(10μM)添加到20μl细胞悬浮液中。用程序EH100进行核转染。细胞接种后6-8小时进行AAV转导(5x103载体基因组/细胞)。在通过FACS进行表型之前将细胞培养72小时。通过用抗Vβ13.2(对ADB796具有特异性)、抗TCR Vα24(对ADB959具有特异性)染色，通过FACS分析细胞中的ADB796和ADB959的表达。
着陆垫策略1TCR A2M10占位符构建体(ADB00794_001)的设计和产生。
编码重组AAV产生载体的rAAV修复模板被设计成允许来自EF-1a启动子的A2M10TCR的组成型表达。表达盒侧接有存在于人B2M中的41bp序列。占位符盒由6个元件构成，如图12所示：
○右同源臂，基于同源定向修复(HDR)的将盒整合到PPP1R12C(AAVS1)基因座(存在于人，Chr19：55115773-55115274GRCh38.p14)中所需。
○存在于人B2M中的B2M靶位点(Chr15：44715435-44715475，GRCh38.p14)，其用作将占位符TCR替代为交换TCR(A2M4)的可靶向DNA序列。
○EF-1α启动子。
○A2M10 TCR序列(Border等人,《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》,2018)
○SV40多腺苷酸化信号
○左同源臂，基于同源定向修复(HDR)的将盒整合到PPP1R12C(AAVS1)基因座(存在于人PPP1R12C，Chr19：55116272-55115774，GRCh38.p14)中所需。
此构建体被设计成使用Gibson克隆克隆到rAAV产生主链(安捷伦公司(Agilent)pAAV_MCS)中。
着陆垫策略1TCR A2M10占位符构建体的产生：ADB00794_001
A2M10表达盒是由Twist生物科学公司(Twist Biosciences)合成，并插入到pTwist-puro主链中。接下来，使用含有41bp B2M(Chr15：44715435-44715475，GRCh38.p14)靶序列(SEQ ID NO:42和43)的引物对A2M10表达盒进行PCR扩增。
使用SEQ ID NO 44和45的FWD和REV引物由从GR1.1 iPSC(Baghbaderani等人,《干细胞报告》,2015)细胞中分离的基因组DNA扩增左同源臂(LHA)(存在于人中，Chr19：55115774-55116274GRCh38.p14)中所需。
使用SEQ ID NO 46和47的FWD和REV引物从GR1.1 iPSC细胞的基因组DNA扩增右同源臂(RHA)(存在于人中，Chr19：55115773-55115274GRCh38.p14)：
根据标准方案，用Q5 DNA聚合酶(NEB，M0491L)进行所有PCR。PCR产物-侧接有B2M靶序列、RHA和LHA的A2M10表达盒是根据制造商的说明，使用NucleoSpin凝胶和PCR清洁试剂盒(Macherey-Nagel，740609.50)，通过凝胶提取纯化的，并使用Gibson克隆试剂盒(NEB，E5510S)组装到使用等摩尔比的DNA片段的NotI消化的腺相关病毒载体主链(安捷伦公司pAAV-MCS)中。通过限制性酶消化来筛选克隆，并通过桑格测序(Sangersequencing)验证序列。
着陆垫策略1TCR A2M4交换构建体的产生：ADB01032_026
通过GeneART合成A2M4TCR_BGHpolyA表达质粒。使用SEQ ID NO 48和49的FWD和REV引物对A2M4TCR_BGHpolyA(Sanderson等人,《肿瘤免疫学》,2019)进行PCR扩增。
使用SEQ ID NO 50和51的FWD和REV引物从ADB00794_001扩增含有500bp序列的左同源臂(LHA)(存在于人PPP1R12C中，Chr19：55116273-55115793GRCh38.p14)。
使用SEQ ID NO 52和53的FWD和REV引物从ADB00794_001扩增含有501bp序列的右同源臂(RHA)(存在于人PPP1R12C中，Chr19：55115775-55115274GRCh38.p14)。
根据标准方案，用Q5 DNA聚合酶(NEB，M0491L)进行所有PCR。PCR产物-A2M4TCR_BGHpolyA、RHA和LHA以及EF-1α启动子是通过使用NucleoSpin凝胶和PCR清洁试剂盒(Macherey-Nagel，740609.50)，通过凝胶提取纯化的，并使用Gibson克隆试剂盒(NEB，E5510S)组装到使用等摩尔比的DNA片段的NotI消化的腺相关病毒载体主链(pAAV-MCS)中。通过限制性酶消化来筛选克隆，并通过桑格测序验证。使用正向引物(GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGC)和反向引物(GGTGGCGGCAAGCTTGGCAGCGGC)从ADB00794-001扩增EF-1α启动子。
iPSC细胞培养
TCR着陆垫结构(图2)的敲入是在iPSC系GR1.1(Baghbaderani等人,2015)中进行的。对于编辑实验，将GR1.1 iPSC系维持在涂覆有玻连蛋白(0.5μg/cm2)(吉博科公司，A14700)的具有完整的mTeSRTMPlus培养基(干细胞技术公司，100-0276)的组织培养处理的板上。将GR1.1 iPSC系细胞每4-5天用Versene(赛默飞世尔公司，15040066)或Accutase(干细胞技术公司，07920)传代一次。将iPSC培养物维持在潮湿的37℃、5％ O2、5％CO2温育箱中。
A2M10占位符TCR敲入iPSC细胞的产生。
具有序列GTCCCCTCCACCCCACAGTG(SEQ ID NO:7；Chr19：55,115,770-55,115,790人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)的向导RNA靶向内含子1PPP1R12C基因座由Synthego合成为单向导RNA。ADB00794_001修复模板被包装到AAV6中并由Virovek公司纯化。使用CRISPR-Cas9使用纯化的AAV6-ADB00794_001病毒将占位符盒敲入GR1.1iPSC细胞。简而言之，用62皮摩尔的具有1.2摩尔比的向导RNA的高保真SpyFi Cas9(Aldevron公司(Aldevron)，9214-0.25MG)对250,000个细胞进行电穿孔，从而在4D-NucleofectorTM系统上使用CA-137程序靶向PPP12R1C基因座。使用16孔NucleocuvetteTM条，用P3原代细胞4D-Nucleofector X kit STM进行电穿孔。在电穿孔后，将细胞悬浮液转移到含有500μl完整mTESRTMPlus的24孔板中，所述板补充有1x CloneRTM2(干细胞技术公司，100-0691)并添加有1.25x109AAV6-ADB01032_026vg。然后将细胞培养两周，并使用Solentim验证的原位平板接种(VIPS)平台将单细胞接种到96孔板中。使用接合点PCR筛选细胞的靶向转基因整合(Geisinger,2016,《核酸研究》)。使用SEQ ID NO 54-57的接合点PCR引物。
在5'和3'端两者处都确认了整合，以最大化对正确基因编辑结果的信心。通过扩增子PCR随后通过琼脂糖凝胶电泳确认了经整合的着陆垫盒的等位基因频率。
rAAV6-A2M4交换修复模板产生。
使用双质粒系统通过悬浮HEK293T的瞬时转染产生rAAV。转染后24小时包括2mM丁酸钠。转染后48小时通过离心(350g，5分钟)采集细胞，用PBS洗涤，并重悬于5mM Tris pH8.5，150mM NaCl(18ml/250ml原始培养体积)中。通过冻融使重悬的细胞裂解(在干冰上冷冻，并在37℃水浴中解冻)。在37℃下用全能核酸酶(250U/ml，将MgCl2添加至2mM的浓度)处理细胞裂解物1小时。通过离心(4000xg，持续30分钟)来澄清经全能核酸酶处理的裂解物，并且在通过()上的色谱法纯化之前，将上清液过滤0.45um。将澄清的裂解物以0.5毫升/分钟的流速加载到POROS Capture Select AAVX 1ml柱上，用高盐缓冲液(10mM Tris pH 8，1M NaCl)洗涤，并用低pH甘氨酸缓冲液(50mM甘氨酸pH 2.7，500mM NaCl)洗脱。通过添加Tris pH 8至80mM的浓度来中和洗脱的AAV，并通过SDS-PAGE和dPCR进行分析。
携带A2M10占位符的祖细胞T细胞的产生。
使iPSC克隆分化为CD34+造血祖细胞干细胞，并且然后按照内部方案分化为CD3+iT细胞祖细胞。通过流式细胞术来确认A2M10占位符TCR的表达(图13)。
早期T细胞祖细胞中的A2M10占位符TCR交换为A2M4。
在从iPSC克隆15F2_AAVS1-/A2M10LP和16D5_AAVS1A2M10LP/A2M10LP分化并且处于不同分化阶段的iT细胞中进行A2M10 TCR交换为A2M4 TCR。用Cas9-向导RNA核糖核蛋白(RNP)对15F2_AAVS1-/A2M10LP3.5x105个iT祖细胞进行电穿孔(SEQ ID NO:63：ucacgucauccagcagagaa)并且在电穿孔后立即用rAAV6-ADB01032_026转导(如图12所描述的)。在转导之后48小时更换培养基，并且24小时后进行流式细胞分析(图14、15)。所使用的抗体列表可以在表2中找到。DNA PK抑制剂(M3814，S8586，塞莱克化学公司(Selleckchem))用于改善HDR编辑结果(Riesenberg等人,2019《核酸研究》，Fu等人,2021《核酸研究》)。A2M10占位符TCR交换在独立细胞系16D5_AAVS1A2M10LP/A2M10LPGR1.1系中得以重现(图16、17)。
晚期T细胞祖细胞中的A2M10占位符TCR交换为A2M4。
用Cas9-向导RNA RNP(SEQ ID NO:63：ucacgucauccagcagagaa)对1x106个晚期15F2_AAVS1-/A2M10LPT细胞祖细胞进行电穿孔，并在第35天用ImmunoCultTM人CD3/CD28 T细胞激活剂(干细胞技术公司(STEMCELL TECHNOLOGIES)，10971)激活后，在第38天用AAV6-A2M4转导。用DZ100程序，使用96孔NucleocuvetteTM板，用P3原代细胞4D-Nucleofector X kitTM进行电穿孔。在转导之后48小时更换培养基，并且48小时后进行流式细胞分析(图18、19)。所使用的抗体列表可以在表2中找到。
表1-安全港基因座
表2
序列
GSGATNFSLL KQAGDVEENP GP
SEQ ID NO:1-P2A切割序列
GGAAGCGGAGCT ACTAACTTCA GCCTGCTGAA GCAGGCTGGA GACGTGGAGG AGAACCCTGGGCCT
SEQ ID NO:2-编码P2A肽的核苷酸序列
GCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG
SEQ ID NO:3-Ef1a短启动子
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
SEQ ID NO:4-牛生长激素PolyA信号
TCTCTCAGCTGGTACACGGC
SEQ ID NO:5-TRAC外显子1Chr14 22547526至22547545(-)(人GRCh38-Ensembl104版-2021年5月)
AGAGTCTCTCAGCTGGTACA
SEQ ID NO:6-TRAC外显子1Chr14 22547530至22547549(-)(人GRCh38-Ensembl104版-2021年5月)
GTCCCCTCCACCCCACAGTG
SEQ ID NO:7-PPP1R12C内含子1Chr19：55,115,770-55,115,790(人GRCh38(Ensembl 104版-2021年5月)
TCACGTCATCCAGCAGAGAA
SEQ ID NO:8-B2M外显子2CHr15 44715446至44715465(人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)
GCAAGTCCAGCTTTAAATCA
SEQ ID NO:9-PTPRCChr 1 198756152至198756171(+)(人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
SEQ ID NO:10-SV40 PolyA序列
CGGGCCAAGAGAAGCGGATCCGGC
SEQ ID NO:11-编码弗林蛋白酶切割位点和SG接头的核苷酸序列
RAKRSGSG
SEQ ID NO:12-编码弗林蛋白酶切割位点和SG接头的肽序列
CAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGT
SEQ ID NO:13-截短的TRAC结构域-核苷酸序列
ATGTCTCTGGGCCTGCTGTGCTGTGGCGTGTTCTCCCTGCTGTGGGCCGGACCTGTGAATGCCGGCGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCGGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACACTGCTGTGCGCCCAGGACATGAACCACGACTACATGTATTGGTACAGACAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTATTCTGTGGGCGAGGGCACCACCGCCAAGGGCGAAGTGCCTGATGGCTACAACGTGTCCCGGCTGAAGAAGCAGAACTTCCTGCTGGGCCTGGAAAGCGCCGCTCCTAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTTCACCGACACCCAGTACTTCGGCCCTGGCACCAGACTGACCGTGCTGGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCCTCTGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAAGCCACCCTGGTCTGCCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTGAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCAGCACCGACCCTCAGCCCCTGAAAGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGCGGGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCTGTGACCCAGATCGTGTCTGCCGAAGCATGGGGGCGCGCCGATTGCGGCTTCACAAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCTCTGGTGCTGATGGCCATGGTGAAACGGAAGGACAGCCGGGGC
SEQ ID NO:14-MAGE-A10 c796 TCRβ链核苷酸序列
MSLGLLCCGVFSLLWAGPVNAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHDYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASSFTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:15-MAGE-A10 c796 TCRβ链氨基酸序列
ATGATGAAGTCCCTGCGGGTGCTGCTGGTCATCCTGTGGCTGCAGCTGTCCTGGGTCTGGTCCCAGCAGAAAGAGGTGGAGCAGAACAGCGGCCCTCTGAGCGTGCCCGAGGGCGCTATCGCCAGCCTGAACTGCACCTACAGCGACAGAGGCAGCCAGAGCTTCTTCTGGTACAGACAGTACAGCGGCAAGAGCCCCGAGCTGATCATGAGCATCTACAGCAACGGCGACAAAGAGGACGGCCGGTTCACCGCCCAGCTGAACAAGGCCAGCCAGTACGTGTCCCTGCTGATCCGGGACAGCCAGCCCAGCGACAGCGCCACCTACCTGTGCGCCGTGAGAGGCACAGGCAGAAGGGCCCTGACATTTGGCAGCGGCACCAGACTGCAGGTGCAGCCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:16-MAGE-A10 c796 TCRα链核苷酸序列
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVRGTGRRALTFGSGTRLQVQPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:17-MAGE-A10 c796 TCRα链氨基酸序列
CAAATTCACATTGCAAAGAAATGTGGATACAGGAAGGAAAATAAGTTTTATATTCTTGTAATCGATCTATCGTGTATACCCTCTATGTGGTAGTAACTGTAGATGGTCATCTGGGAATTAATCCTTATTCACAGTGTAAACTTAATTACTCACTAAAATATATAAAGCTTTTAATCATGTATGATATTGAGATTTCATATCTTGGTACTTAAAAATGTATCAAATGCTTGCTATGTGCTCTTGCTATAAAGAGCTAATTGGTATGAGGGAAAGCCAGGTATTTACTAATCAATGTAGTGAGTAAAATGACAGAAAAATTATAAGAAGAACATGAATGAGGGCATTTAATTTAAACTTTAGGAATCAAGAAACGCTTCTCGAAGCAGTGATTCCTGCCCTGATTCTTAAATAATGTGTAGGCATTAGACAGGAGGATAAGTACAAAACGTGGCATCATGAGCAAAGGCATGGAAATGGCCCATGAGCGGAGTGAACACTGGTTTGGGGTTGCTCCAAGGTAAAGTTCAAAAAGTATCCTGCAGTCAACCCTTTAGCACCATAAAGAAACTAAATTATTTAGATGTTTTTATGAGAACATATCAAAAAGTACTTTTCTGTCATCCAATACTTCCACAAATAAATCATTAGTTCTTGCTAATCTTCATCTGGCATAAAAATAATGACATCAACTTTCTTCATGTAATTTCCCACTTAATTCCTTTACTAGGAGCAATATCAATTCCTATATGACGTCATTGCCAGCACCTACCCTGCTCAGAATGGACAAGTAAAGAAAAACAACCATCAAGAAGATAAAATTGAATTTGATAATGAAGTGGACAAAGTAAAGCAGGATGCTAATTGTGTTAATCCACTTGGTGCCCCAGAAAAGCTCCCTGAAGCAAAGGAACAGGCTGAAGGTTCTGAACCCACGAGTGGCACTGAGGGGCCAGAACATTCTGTCAATGGTCCTGCTAGCCCTGCATTGAACCAAGGTTCA
SEQ ID NO:18-PTPRC外显子33靶向载体-左同源臂(Chr1：198755130-198756201人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)
GAAAAGACATAAATGAGGAAACTCCAAACCTCCTGTTAGCTGTTATTTCTATTTTTGTAGAAGTAGGAAGTGAAAATAGGTATACAGTGGATTAATTAAATGCAGCGAACCAATATTTGTAGAAGGGTTATATTTTACTACTGTGGAAAAATATTTAAGATAGTTTTGCCAGAACAGTTTGTACAGACGTATGCTTATTTTAAAATTTTATCTCTTATTCAGTAAAAAACAACTTCTTTGTAATCGTTATGTGTGTATATGTATGTGTGTATGGGTGTGTGTTTGTGTGAGAGACAGAGAAAGAGAGAGAATTCTTTCAAGTGAATCTAAAAGCTTTTGCTTTTCCTTTGTTTTTATGAAGAAAAAATACATTTTATATTAGAAGTGTTAACTTAGCTTGAAGGATCTGTTTTTAAAAATCATAAACTGTGTGCAGACTCAATAAAATCATGTACATTTCTGAAATGACCTCAAGATGTCCTCCTTGTTCTACTCATATATATCTATCTTATATAGTTTACTATTTTACTTCTAGAGATAGTACATAAAGGTGGTATGTGTGTGTATGCTACTACAAAAAAGTTGTTAACTAAATTAACATTGGGAAATCTTATATTCCATATATTAGCATTTAGTCCAATGTCTTTTTAAGCTTATTTAATTAAAAAATTTCCAGTGAGCTTATCATGCTGTCTTTACATGGGGTTTTCAATTTTGCATGCTCGATTATTCCCTGTACAATATTTAAAATTTATTGCTTGATACTTTTGACAACAAATTAGGTTTTGTACAATTGAACTTAAATAAATGTCATTAAAATAAATAAATGCAATATGTATTAATATTCATTGTATAAAAATAGAAGAATACAAACATATTTGTTAAATATTTACATATGAAATTTAATATAGCTATTTTTATGGAATTTTTCATTGATATGAAAAATATGATATTGCATATGCATAGTTCCCATGTTAAATCCCATTCATAACTTTCATTA
SEQ ID NO:19-PTPRC外显子33靶向载体-右同源臂(染色体1：198,756,132-198,757,230人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)
GCTCCCATAGCTCAGTCTGGTCTATCTGCCTGGCCCTGGCCATTGTCACTTTGCGCTGCCCTCCTCTCGCCCCCGAGTGCCCTTGCTGTGCCGCCGGAACTCTGCCCTCTAACGCTGCCGTCTCTCTCCTGAGTCCGGACCACTTTGAGCTCTACTGGCTTCTGCGCCGCCTCTGGCCCACTGTTTCCCCTTCCCAGGCAGGTCCTGCTTTCTCTGACCTGCATTCTCTCCCCTGGGCCTGTGCCGCTTTCTGTCTGCAGCTTGTGGCCTGGGTCACCTCTACGGCTGGCCCAGATCCTTCCCTGCCGCCTCCTTCAGGTTCCGTCTTCCTCCACTCCCTCTTCCCCTTGCTCTCTGCTGTGTTGCTGCCCAAGGATGCTCTTTCCGGAGCACTTCCTTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGTCCTCTGAGCGGATCCTCCCCGTGTCTGGGTCCTCTCCGGGCATCTCTCCTCCCTCACCCAACCCCATGCCGTCTTCACTCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTTAGCCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCA
SEQ ID NO:20-AAVS1内含子1靶向载体-左同源臂(CHr 19：55115776-55116775人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)
CAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCCGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGTCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTAGCCAGCCCCGTCCTGGCAGGGCTGTGGTGAGGAGGGGGGTGTCCGTGTGGAAAACTCCCTTTGTGAGAATGGTGCGTCCTAGGTGTTCACCAGGTCGTGGCCGCCTCTACTCCCTTTCTCTTTCTCCATCCTTCTTTCCTTAAAGAGTCCCCAGTGCTATCTGGGACATATTCCTCCGCCCAGAGCAGGGTCCCGCTTCCCTAAGGCCCTGCTCTGGGCTTCTGGGTTTGAGTCCTTGGCAAGCCCAGGAGAGGCGCTCAGGCTTCCCTGTCCCCCTTCCTCGTCCACCATCTCATGCCCCTGGCTCTCCTGCCCCTTCCCTACAGGGGTTCCTGGCTCTGCTCTTCAGACTGAGCCCCGTTCCCCTGCATCCCCGTTCCCCTGCATCCCCCTTCCCCTGCATCCCCCAGAGGCCCCAGGCCACCTACTTGGCCTGGACCCCACGAGAGGCCACCCCAGCCCTGTCTACCAGGCTGCCTTTTGGGTGGATTCTCCTCCA
SEQ ID NO:21-AAVS1内含子1靶向载体-右同源臂(Chr 19：55114775-55115775人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)
TTAATTTTCTTTCCTTCACTCCTGTATCGATTTGTGTTGTGTAACAAACCACCCCCAAATTTGGGAGCCTAAACAAATAACATTTATTATGGTTCAGTAGTCTAATGATATGCTGGAATGTTCTGCTGGTGCCCTCAGGCTCAGGCAATAGAGACCAGGCTGACTCATGTGTCTGCCTTCAGCTGATGTGTGCCCTACAGTTTGGCTGGTCTAAAGTGACCTACACTGCCAGTAGGCTGGCATGTGGCTGCCATTTAGCTATGGCAACAACAGTGAGTGGGCCACATGTCCCTCCTCATCCAGAAGACTAGCCCAGGCCTATTCACATTAAAGCAGCAAGTTCCACAAGGGAAAGAAGACTTGTGTGAGACCACTTGAGGCCCAGGCTTAAAAGTGACACACATGTCTTCTTCTGTATGTTATTAGCCAAATAAATAAGTCATAAAGCCTGCCCAGATTCAAGGGGTAGGGAAATAGACTCCACTTCTTGAGAGGGCCTGCAAATTCACATTGCAAAGAAATGTGGATACAGGAAGGAAAATAAGTTTTATATTCTTGTAATCGATCTATCGTGTATACCCTCTATGTGGTAGTAACTGTAGATGGTCATCTGGGAATTAATCCTTATTCACAGTGTAAACTTAATTACTCACTAAAATATATAAAGCTTTTAATCATGTATGATATTGAGATTTCATATCTTGGTACTTAAAAATGTATCAAATGCTTGCTATGTGCTCTTGCTATAAAGAGCTAATTGGTATGAGGGAAAGCCAGGTATTTACTAATCAATGTAGTGAGTAAAATGACAGAAAAATTATAAGAAGAACATGAATGAGGGCATTTAATTTAAACTTTAGGAATCAAGAAACGCTTCTCGAAGCAGTGATTCCTGCCCTGATTCTTAAATAATGTGTAGGCATTAGACAGGAGGATAAGTACAAAACGTGGCATCATGAGCAAAGGCATGGAAATGGCCCATGAGCGGAGTGAACACTGGTTTGGGGTTGCTCCAAGGTAAAGTTCAAAAAGTATCCTGCAGTCAACCCTTTAGCACCATAAAGAAACTAAATTATTTAGATGTTTTTATGAGAACATATCAAAAAGTACTTTTCTGTCATCCAATACTTCCACAAATAAATCATTAGTTCTTGCTAATCTTCATCTGGCATAAAAATAATGACATCAACTTTCTTCATGTAATTTCCCACTTAATTCCTTTACTAGGAGCAATATCAATTCCTATATGACGTCATTGCCAGCACCTACCCTGCTCAGAATGGACAAGTAAAGAAAAACAACCATCAAGAAGATAAAATTGAATTTGATAATGAAGTGGACAAAGTAAAGCAGGATGCTAATTGTGTTAATCCACTTGGTGCCCCAGAAAAGCTCCCTGAAGCAAAGGAACAGGCTGAAGGTTCTGAACCCACGAGTGGCACTGAGGGGCCAGAACATTCTGTCAATGGTCCTGCTAGCCCTGCATTGAACCAAGGTTCA
SEQ ID NO:22将MAGE-B2/A4 ADB959敲入到PTPRC外显子33TCR着陆垫中-左同源臂Chr1：198,754,605-198,756,226(人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)
CAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGAAAAGACATAAATGAGGAAACTCCAAACCTCCTGTTAGCTGTTATTTCTATTTTTGTAGAAGTAGGAAGTGAAAATAGGTATACAGTGGATTAATTAAATGCAGCGAACCAATATTTGTAGAAGGGTTATATTTTACTACTGTGGAAAAATATTTAAGATAGTTTTGCCAGAACAGTTTGTACAGACGTATGCTTATTTTAAAATTTTATCTCTTATTCAGTAAAAAACAACTTCTTTGTAATCGTTATGTGTGTATATGTATGTGTGTATGGGTGTGTGTTTGTGTGAGAGACAGAGAAAGAGAGAGAATTCTTTCAAGTGAATCTAAAAGCTTTTGCTTTTCCTTTGTTTTTATGAAGAAAAAATACATTTTATATTAGAAGTGTTAACTTAGCTTGAAGGATCTGTTTTTAAAAATCATAAACTGTGTGCAGACTCAATAAAATCATGTACATTTCTGAAATGACCTCAAGATGTCCTCCTTGTTCTACTCATATATATCTATCTTATATAGTTTACTATTTTACTTCTAGAGATAGTACATAAAGGTGGTATGTGTGTGTATGCTACTACAAAAAAGTTGTTAACTAAATTAACATTGGGAAATCTTATATTCCATATATTAGCATTTAGTCCAATGTCTTTTTAAGCTTATTTAATTAAAAAATTTCCAGTGAGCTTATCATGCTGTCTTTACATGGGGTTTTCAATTTTGCATGCTCGATTATTCCCTGTACAATATTTAAAATTTATTGCTTGATACTTTTGACAACAAATTAGGTTTTGTACAATTGAACTTAAATAAATGTCATTAAAATAAATAAATGCAATATGTATTAATATTCATTGTATAAAAATAGAAGAATACAAACATATTTGTTAAATATTTACATATGAAATTTAATATAGCTATTTTTATGGAATTTTTCATTGATATGAAAAATATGATATTGCATATGCATAGTTCCCATGTTAAATCCCATTCATAACTTTCATTA
SEQ ID NO:23将MAGE-B2/A4 ADB959敲入到PTPRC外显子33TCR着陆垫中-右同源臂；包括TRAC结构域序列(核苷酸1-396)、BGH polyA信号(397-621)和与染色体1：198,756,132-198,757,230(人GRCh38-Ensembl104版-2021年5月)相对应的核苷酸
AGTTCAGGTTCAAGAGCTAAAAGGAGCGGATCAGGT
SEQ ID NO:24-弗林蛋白酶SG接头
GGCAGCCGGGCCAAGAGATCTGGATCCGGC
SEQ ID NO:25-弗林蛋白酶SG接头
SSGSRAKRSGS
SEQ ID NO:26弗林蛋白酶SG接头
GSRAKRSGSG
SEQ ID NO:27弗林蛋白酶SG接头
GAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCT
SEQ ID NO:28-T2A跳跃样序列核苷酸序列
EGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:29-T2A跳跃样序列氨基酸序列
GCTACCAACTTTAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCT
SEQ ID NO:30-P2A跳跃样序列核苷酸序列
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:31-P2A跳跃样序列氨基酸序列
ATGGCCAGCCTGCTGTTCTTCTGCGGCGCCTTCTACCTGCTGGGCACCGGCTCTATGGATGCCGACGTGACCCAGACCCCCCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCTCCCAGACCAAGGGCCACGACCGGATGTACTGGTACAGACAGGACCCTGGCCTGGGCCTGCGGCTGATCTACTACAGCTTCGACGTGAAGGACATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCCAGACAGGCTCAGGCCAAGTTCAGCCTGTCCCTGGAAAGCGCCATCCCCAACCAGACCGCCCTGTACTTTTGTGCCACAAGCGGCCAGGGCGCCTACAACGAGCAGTTCTTTGGCCCTGGCACCCGGCTGACAGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAAATCAGCCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCTTGGGGGCGCGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGAAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGC
SEQ ID NO:32-ADB959 TCRβ链核苷酸序列
ATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATCCTGTGGCTGTACTTCTACCGGGGCAACGGCAAGAACCAGGTGGAACAGAGCCCCCAGAGCCTGATCATCCTGGAAGGCAAGAACTGCACCCTGCAGTGCAACTACACCGTGTCCCCCTTCAGCAACCTGCGGTGGTACAAGCAGGACACCGGCAGAGGCCCTGTGTCCCTGACCATCGTGACCTTCAGCGAGAACACCAAGAGCAACGGCCGGTACACCGCCACCCTGGACGCCGATACAAAGCAGAGCAGCCTGCACATCACCGCCAGCCAGCTGAGCGATAGCGCCAGCTACATCTGCGTGGTGTCCGGCGGCACAGACAGCTGGGGCAAGCTGCAGTTTGGCGCCGGAACACAGGTGGTCGTGACCCCCGACATCCAGAACCCTGACCCTGCAGTATATCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA
SEQ ID NO:33-ADB959 TCRα链核苷酸序列
EQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGSSSGSRAKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIVTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:34-经翻译的序列PTPRC外显子
33_T2A_ADB959_TCRβ_P2A_TCRα
CCCGCGCCGTGCTGGACTCCACCAACGCCGACGGTATCAGCGCCCTGCACCAGGTCAGCGCCCCCCGCCCGGCGTCTCCCGGGGCCAGGTCCACCCTCTGCTGCGCCACCTGGGGCATCCTCCTTCCCCGTTGCCAGTCTCGATCCGCCCCGTCGTTCCTGGCCCTGGGCTTTGCCACCCTATGCTGACACCCCGTCCCAGTCCCCCTTACCATTCCCCTTCGACCACCCCACTTCCGAATTGGAGCCGCTTCAACTGGCCCTGGGCTTAGCCACTCTGTGCTGACCACTCTGCCCCAGGCCTCCTTACCATTCCCCTTCGACCTACTCTCTTCCGCATTGGAGTCGCTTTAACTGGCCCTGGCTTTGGCAGCCTGTGCTGACCCATGCAGTCCTCCTTACCATCCCTCCCTCGACTTCCCCTCTTCCGATGTTGAGCCCCTCCAGCCGGTCCTGGACTTTGTCTCCTTCCCTGCCCTGCCCTCTCCTGAACCTGAGCCAGCTCCCATAGCTCAGTCTGGTCTATCTGCCTGGCCCTGGCCATTGTCACTTTGCGCTGCCCTCCTCTCGCCCCCGAGTGCCCTTGCTGTGCCGCCGGAACTCTGCCCTCTAACGCTGCCGTCTCTCTCCTGAGTCCGGACCACTTTGAGCTCTACTGGCTTCTGCGCCGCCTCTGGCCCACTGTTTCCCCTTCCCAGGCAGGTCCTGCTTTCTCTGACCTGCATTCTCTCCCCTGGGCCTGTGCCGCTTTCTGTCTGCAGCTTGTGGCCTGGGTCACCTCTACGGCTGGCCCAGATCCTTCCCTGCCGCCTCCTTCAGGTTCCGTCTTCCTCCACTCCCTCTTCCCCTTGCTCTCTGCTGTGTTGCTGCCCAAGGATGCTCTTTCCGGAGCACTTCCTTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGTCCTCTGAGCGGATCCTCCCCGTGTCTGGGTCCTCTCCGGGCATCTCTCCTCCCTCACCCAACCCCATGCCGTCTTCACTCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTTAGCCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCA
SEQ ID NO:35-将MAGE-B2/A4 ADB959敲入到AAVS1 TCR着陆垫中-左同源臂(Chr19：55,115,701-55,117,349人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)
GCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG
SEQ ID NO:36-EF1A短启动子
ATGGCCAGCCTGCTGTTCTTCTGCGGCGCCTTCTACCTGCTGGGCACCGGCTCTATGGATGCCGACGTGACCCAGACCCCCCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCTCCCAGACCAAGGGCCACGACCGGATGTACTGGTACAGACAGGACCCTGGCCTGGGCCTGCGGCTGATCTACTACAGCTTCGACGTGAAGGACATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCCAGACAGGCTCAGGCCAAGTTCAGCCTGTCCCTGGAAAGCGCCATCCCCAACCAGACCGCCCTGTACTTTTGTGCCACAAGCGGCCAGGGCGCCTACAACGAGCAGTTCTTTGGCCCTGGCACCCGGCTGACAGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAAATCAGCCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCTTGGGGGCGCGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGAAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGC
SEQ ID NO:37-ADB959 TCRβ链核苷酸序列
ATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATCCTGTGGCTGTACTTCTACCGGGGCAACGGCAAGAACCAGGTGGAACAGAGCCCCCAGAGCCTGATCATCCTGGAAGGCAAGAACTGCACCCTGCAGTGCAACTACACCGTGTCCCCCTTCAGCAACCTGCGGTGGTACAAGCAGGACACCGGCAGAGGCCCTGTGTCCCTGACCATCGTGACCTTCAGCGAGAACACCAAGAGCAACGGCCGGTACACCGCCACCCTGGACGCCGATACAAAGCAGAGCAGCCTGCACATCACCGCCAGCCAGCTGAGCGATAGCGCCAGCTACATCTGCGTGGTGTCCGGCGGCACAGACAGCTGGGGCAAGCTGCAGTTTGGCGCCGGAACACAGGTGGTCGTGACCCCCGACATCCAGAACCCTGACCCTGCAGTATATCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA
SEQ ID NO:38-ADB959 TCRα链核苷酸序列
MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIVTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS-
SEQ ID NO:39-ADB959 TCRΒ_P2A_TCRΑ氨基酸序列
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
SEQ ID NO:40-BGH POLY A信号
CAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCCGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGTCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTAGCCAGCCCCGTCCTGGCAGGGCTGTGGTGAGGAGGGGGGTGTCCGTGTGGAAAACTCCCTTTGTGAGAATGGTGCGTCCTAGGTGTTCACCAGGTCGTGGCCGCCTCTACTCCCTTTCTCTTTCTCCATCCTTCTTTCCTTAAAGAGTCCCCAGTGCTATCTGGGACATATTCCTCCGCCCAGAGCAGGGTCCCGCTTCCCTAAGGCCCTGCTCTGGGCTTCTGGGTTTGAGTCCTTGGCAAGCCCAGGAGAGGCGCTCAGGCTTCCCTGTCCCCCTTCCTCGTCCACCATCTCATGCCCCTGGCTCTCCTGCCCCTTCCCTACAGGGGTTCCTGGCTCTGCTCTTCAGACTGAGCCCCGTTCCCCTGCATCCCCGTTCCCCTGCATCCCCCTTCCCCTGCATCCCCCAGAGGCCCCAGGCCACCTACTTGGCCTGGACCCCACGAGAGGCCACCCCAGCCCTGTCTACCAGGCTGCCTTTTGGGTGGATTCTCCTCCA
SEQ ID NO:41-将MAGE-B2/A4 ADB959敲入到AAVS1 TCR着陆垫中-右同源臂-含有TRAC结构域序列(核苷酸1-396)、BGH polyA信号(397-621)和与Chr19：55,114,725-55,115,825(人GRCh38-Ensembl 104版-2021年5月)相对应的核苷酸
5'-TTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAGGCTCCGGTGCCCGTCA-3'
SEQ ID NO:42(带下划线的B2M FWD靶序列)
5'-TGACTTTCCATTCTCTGCTGGATGACGTGAGTAAACCTGAAAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG-3'
SEQ ID NO:43(带下划线的B2M FWD靶序列)
5'CGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTC 3'
SEQ ID NO:44(FWD；结合Chr19：55116254-55116274GRCh38.p14)
5'-GACTTTCCATTCTCTGCTGGATGACGTGAGTAAACCTGAATGTGGGGTGGAGGGGACAG–3'
SEQ ID NO:45(REV结合Chr 19：55115774-55115792GRCh38.p14)。
5'-TCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTG-3'SEQ ID NO:46(FWD结合Chr19：55115750-55115773GRCh38.p14)
5'-GAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCTACTGGCCTTATCTCACAG-3'
SEQ ID NO:47(REV结合Chr19：55115274-55115292GRCh38.p14)
5'GTCGATCCTACCATCCACTCGACACACCCGCCAGCGGCCGCTGCCAAGCTTGCCGCCACCATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATC-3'
SEQ ID NO:48(FWD)
5'-CCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCACTGACTTTCCATTCCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAG-3'SEQ ID NO:49(REV)
5'CGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTC-3'
SEQ ID NO:50(FWD)
5'GTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCCTCTGCTGGATGACGTGAGTAAACCTGAATGTGGGGTGGAGGGGACAG–3'
SEQ ID NO:51(REV)
5'-GAATGGAAAGTCAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGG-3'
SEQ ID NO:52(FWD)
5'TTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCTACTGGCCTTATCTCACAG-3'
SEQ ID NO:53(REV)
5'-GGATGCTCTTTCCGGAGCAC-3'
SEQ ID NO:54(5'FWD；结合Chr19：55116402-55116383GRCh38.p14)5'-GCACCGGTTCAATTGCCGAC-3'
SEQ ID NO:55(5'REV；结合ADB00794_001的EF1-α)
5'-TGGTGAACACCTAGGACGCA-3'
SEQ ID NO:56(3'FWD；结合Chr19：55115182-55115201GRCh38.p14)
5'-GGCTCTCGGAGAATGACGA-3'
SEQ ID NO:57(3'REV；结合ADB00794_001的A2M10)
SEQ ID NO:58(A2M10 TCR盒ADB00794_001下划线＝EF-1α启动子；点状下划线＝SV40聚腺苷酸化信号虚线下划线＝A2M10 TCR双下划线＝弗林蛋白酶切割位点，P2A)
SEQ ID NO:59(含有A2M10占位符TCR盒的质粒(ADB00794_001)完整下划线＝同源臂；波浪下划线＝B2M靶位点；虚线下划线＝A2M10 TCR虚线下划线＝EF-1α启动子；双下划线＝弗林蛋白酶切割位点，P2A；点状下划线＝SV40 polyA信号)
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVRGTGRRALTFGSGTRLQVQPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMSLGLLCCGVFSLLWAGPVNAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVAEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASSFTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:60(A2M10占位符TCR的蛋白质序列)
SEQ ID NO:61(含有A2M4交换TCR盒的质粒(ADB01032_026)虚线下划线＝同源臂；完整下划线＝EF-1α启动子；虚线下划线＝A2M10 TCR；双下划线＝弗林蛋白酶切割位点，P2A；点状下划线＝BGH polyA信号)
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTILTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYEEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:62(A2M4交换TCR的蛋白质序列)
UCACGUCAUCCAGCAGAGAA
SEQ ID NO:63(CRISPR-Cas9向导RNA)
CTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTTAGCCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACA
SEQ ID NO:64-质粒ADB00794_001左同源臂(Chr 19：55115774至55116272人GRCh38.p14初级组装
GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCACTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGTGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGTGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCAGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGCCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCACAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCCAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
SEQ ID NO:65-EF1α启动子DNA序列
ATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTAGTGATCCTGTGGCTTCAGTTGAGCTGGGTTTGGAGCCAACAGAAGGAGGTGGAGCAGAATTCTGGACCCCTCAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGCCTCTCTCAACTGCACTTACAGTGACCGAGGTTCCCAGTCCTTCTTCTGGTACAGACAATATTCTGGGAAAAGCCCTGAGTTGATAATGTCCATATACTCCAATGGTGACAAAGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGCTCAATAAAGCCAGCCAGTATGTTTCTCTGCTCATCAGAGACTCCCAGCCCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGCCGTGAGAGGCACGGGCAGGAGAGCACTTACTTTTGGGAGTGGAACAAGACTCCAAGTGCAACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:66-A2M10 c794 TCRα链核苷酸序列(来自ADB00794_001)
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVRGTGRRALTFGSGTRLQVQPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:67-A2M10 c794α链氨基酸序列(来自ADB00794_001)
GGCAGCCGGGCCAAGAGAAGCGGATCCGGC
SEQ ID NO:68-弗林蛋白酶SG接头核苷酸序列
GCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAAAACCCTGGCCCTAGG
SEQ ID NO:69-P2A跳跃样序列核苷酸序列
ATNFSLLKQAGDVEENPGPR
SEQ ID NO:70-P2A跳跃样序列氨基酸序列
ATGAGCCTCGGGCTCCTGTGCTGTGGGGTGTTTTCTCTCCTGTGGGCAGGTCCAGTGAATGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAAATTCCGGGTCCTGAAGACAGGACAGAGCATGACACTGCTGTGTGCCCAGGATATGAACCATGAATACATGTACTGGTATCGACAAGACCCAGGCATGGGGCTGAGGCTGATTCATTACTCAGTTGCCGAGGGTACAACTGCCAAAGGAGAGGTCCCTGATGGCTACAATGTCTCCAGATTAAAAAAACAGAATTTCCTGCTGGGGTTGGAGTCGGCTGCTCCCTCCCAAACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTTTCACAGATACGCAGTATTTTGGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:71-A2M10 c794 TCRβ链核苷酸序列(来自ADB00794_001)
MSLGLLCCGVFSLLWAGPVNAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVAEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASSFTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:72-A2M10 c794 TCRβ氨基酸序列(来自ADB00794_001)
TAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTT
SEQ ID NO:73-SV40 polyA信号核苷酸序列
GTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCTGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGTCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTA
SEQ ID NO:74-质粒ADB00794_001右同源臂(Chr 19：55115274至55115773人GRCh38.p14初级组装)
GACTTTCCATTCTCTGCTGGATGACGTGAGTAAACCTGAATGTGGGGTGGAGGGGACAG
SEQ ID NO:75-用于扩增策略1质粒ADB00794_001左同源臂的反向引物(结合Chr19：55115774-55115792GRCh38.p14)。下划线-B2M sgRNA靶位点。
SEQ ID NO:76-A2M10 TCR盒的核苷酸序列。下划线＝EF-1α启动子。点状下划线＝SV40聚腺苷酸化信号。虚线下划线＝A2M10 TCR。双下划线＝弗林蛋白酶切割位点，P2A
GCTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTTAGCCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGA
SEQ ID NO:77-质粒ADB01032_026左同源臂(人Chr19：55115774至55116273，Chr15：44715434至44715462GRCh38.p14初级组装)
ATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATCCTGTGGCTGTACTTCTACCGGGGCAACGGCAAGAACCAGGTGGAACAGAGCCCCCAGAGCCTGATCATCCTGGAAGGCAAGAACTGCACCCTGCAGTGCAACTACACCGTGTCCCCCTTCAGCAACCTGCGGTGGTACAAGCAGGACACCGGCAGAGGCCCTGTGTCCCTGACCATCCTGACCTTCAGCGAGAACACCAAGAGCAACGGCCGGTACACCGCCACCCTGGACGCCGATACAAAGCAGAGCAGCCTGCACATCACCGCCAGCCAGCTGAGCGATAGCGCCAGCTACATCTGCGTGGTGTCCGGCGGCACAGACAGCTGGGGCAAGCTGCAGTTTGGCGCCGGAACACAGGTGGTCGTGACCCCCGACATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAATAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTCAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGAGACTGTGG
SEQ ID NO:78-A2M4 c1032 TCRα链核苷酸序列(来自ADB01032_026)
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTILTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW
SEQ ID NO:79-A2M4 c1032 TCRα链氨基酸序列(来自ADB01032_026)
GCTACCAACTTTAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCTAGG
SEQ ID NO:80-P2A跳跃样序列核苷酸序列
ATGGCCAGCCTGCTGTTCTTCTGCGGCGCCTTCTACCTGCTGGGCACCGGCTCTATGGATGCCGACGTGACCCAGACCCCCCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCTCCCAGACCAAGGGCCACGACCGGATGTACTGGTACAGACAGGACCCTGGCCTGGGCCTGCGGCTGATCTACTACAGCTTCGACGTGAAGGACATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCCAGACAGGCTCAGGCCAAGTTCAGCCTGTCCCTGGAAAGCGCCATCCCCAACCAGACCGCCCTGTACTTTTGTGCCACAAGCGGCCAGGGCGCCTACGAGGAGCAGTTCTTTGGCCCTGGCACCCGGCTGACAGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAAATCAGCCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCTTGGGGGCGCGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGAAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTAA
SEQ ID NO:81-A2M4 c1032 TCRβ链核苷酸序列(来自ADB01032_026)
MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYEEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:82-A2M4 c1032 TCRβ氨基酸序列(来自ADB01032_026)
GAATGGAAAGTCAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCTGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGTCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTA
SEQ ID NO:83-质粒ADB01032_026右同源臂(人Chr19：55115274至
55115775GRCh38.p14初级组装)
GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGC
SEQ ID NO:84-用于扩增EF1α启动子的正向引物
GGTGGCGGCAAGCTTGGCAGCGGC
SEQ ID NO:85-用于扩增EF1α启动子的反向引物

Claims (38)

1.一种用于产生表达治疗性抗原受体的免疫细胞的方法，所述方法包含：
(i)提供包含异源表达盒的免疫细胞，
其中所述表达盒包含：
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，
(c)靶向位点，以及
(ii)用包含用于治疗性抗原受体的编码序列的表达构建体替代所述免疫细胞中的所述异源表达盒，
使得所述治疗性抗原受体在所述免疫细胞中表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗性抗原受体与展示由细胞表达的靶抗原的肽片段的MHC特异性地结合，或者与独立于MHC呈递的由细胞表达的靶抗原或其肽特异性地结合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述治疗性抗原受体与展示由癌细胞表达的肿瘤抗原的肽片段的MHC特异性地结合，或者与独立于MHC呈递的由癌细胞表达的肿瘤抗原或其肽片段特异性地结合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞中的所述异源表达盒是通过包含以下的方法替代的：
将包含所述表达构建体和5'同源臂的核酸分子引入到所述免疫细胞中，其中所述5'同源臂与所述异源表达盒的5'靶向位点互补，
使得所述表达构建体替代所述免疫细胞的基因组中的所述表达盒。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法进一步包含将包含核酸的载体引入到所述免疫细胞中，所述核酸编码靶向所述靶向位点的CRISPR/Cas9。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向位点是5'靶向位点。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述盒进一步包含3'靶向位点。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫细胞中的所述异源表达盒是通过包含以下的方法替代的：
将如DNA分子等核酸分子引入到所述免疫细胞中，所述核酸分子包含侧接有5'和3'同源臂的表达构建体，其中所述5'和3'同源臂与所述异源表达盒的所述5'和3'靶向位点互补，
使得所述表达构建体替代所述免疫细胞的基因组中的所述表达盒。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法进一步包含将包含核酸的载体引入到所述免疫细胞中，所述核酸编码靶向所述5'和3'靶向位点的CRISPR/Cas9。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗性抗原受体是T细胞受体(TCR)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述治疗性TCR与癌细胞特异性地结合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达盒包含5'和3'靶向位点，并且所述靶向位点包含来自TCRα链恒定区的核苷酸序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述3'靶向位点定位于用于所述产生TCR的所述编码序列内。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述异源表达盒的所述免疫细胞是通过包含以下的方法产生的：
(i)用包含异源表达盒的核酸转染iPSC，使得所述盒整合到所述iPSC的基因组中，
其中所述表达盒包含
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点，以及
(ii)使所述iPSC分化为包含所述异源表达盒的免疫细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶向位点是5'靶向位点。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述盒进一步包含3'靶向位点。
18.根据权利要求15、16或17所述的方法，其中所述iPSC是通过包含以下的方法分化为免疫细胞的：
(i)使所述iPSC分化为中胚层细胞，
(ii)使所述中胚层细胞分化为造血内皮细胞，
(iii)使所述造血内皮细胞分化为HPC群体，
(iv)使所述HPC分化为免疫细胞祖细胞；以及
(v)使祖细胞免疫细胞群体成熟以产生免疫细胞群体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述iPSC依序在第一中胚层诱导培养基、第二中胚层诱导培养基和第三中胚层诱导培养基中培养以诱导分化为中胚层细胞，
所述第一中胚层诱导培养基由补充有一种或多种分化因子的化学限定的营养培养基组成，其中所述一种或多种分化因子由激活素组成，
所述第二中胚层诱导培养基由补充有一种或多种分化因子的化学限定的营养培养基组成，其中所述一种或多种分化因子由激活素、BMP和FGF组成，并且
所述第三中胚层诱导培养基由补充有一种或多种分化因子的化学限定的营养培养基组成，其中所述一种或多种分化因子由激活素、BMP、FGF和GSK3抑制剂组成。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述中胚层细胞在HE诱导培养基中培养以诱导分化为HEC；所述HE诱导培养基由补充有一种或多种分化因子的化学限定的营养培养基组成，其中所述一种或多种分化因子由SCF和VEGF组成。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述HEC在造血诱导培养基中培养以诱导分化为HPC；所述造血诱导培养基由补充有一种或多种分化因子的化学限定的营养培养基组成，其中所述一种或多种分化因子由以下组成：VEGF、SCF、促血小板生成素(TPO)、Flt3配体(Flt3L)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IGF-1、BMP、FGF、音猬因子(SHH)、促红细胞生成素(EPO)、血管紧张素II和血管紧张素II 1型受体(AT1)拮抗剂。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述HPC在淋巴扩增培养基中培养以产生所述祖细胞免疫细胞；所述淋巴扩增培养基由补充有一种或多种分化因子的化学限定的营养培养基组成，其中所述一种或多种分化因子由SCF、FLT3L、TPO和IL7组成。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述祖细胞免疫细胞是通过包含以下的方法成熟的：将所述祖细胞免疫细胞群体在成熟培养基中培养以产生所述免疫细胞；所述成熟培养基由补充有一种或多种分化因子的化学限定的营养培养基组成，其中所述一种或多种分化因子由SCF、FLT3L和IL7组成。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含使表达所述治疗性抗原受体的所述免疫细胞群体浓缩。
25.根据根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含储存表达所述治疗性抗原受体的所述免疫细胞群体。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含用药学上可接受的赋形剂调配表达所述治疗性抗原受体的所述免疫细胞群体。
27.一种通过根据权利要求1至26中任一项所述的方法产生的表达一种或多种治疗性抗原受体的免疫细胞群体。
28.一种药物组合物，其包含通过根据权利要求1至26中任一项所述的方法产生的表达一种或多种治疗性抗原受体的免疫细胞群体和药学上可接受的赋形剂。
29.一种通过根据权利要求1至26中任一项所述的方法产生的表达一种或多种治疗性抗原受体的免疫细胞群体，所述免疫细胞群体用于治疗方法中。
30.一种通过根据权利要求1至26中任一项所述的方法产生的表达一种或多种治疗性抗原受体的免疫细胞群体，所述免疫细胞群体用于治疗癌症的方法中。
31.一种治疗癌症的方法，所述方法包含向有需要的个体施用通过根据权利要求1至26中任一项所述的方法产生的表达一种或多种治疗性抗原受体的免疫细胞群体。
32.一种通过根据权利要求1至26中任一项所述的方法产生的表达一种或多种治疗性抗原受体的免疫细胞群体的用途，所述免疫细胞群体用于制备用于治疗癌症的药物。
33.一种免疫细胞，其包含整合到其基因组中的异源表达盒，
其中所述表达盒包含
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点。
34.根据权利要求31所述的免疫细胞，其中所述靶向位点是5'靶向位点。
35.根据权利要求34所述的免疫细胞，其中所述盒进一步包含3'靶向位点。
36.一种iPSC，其包含整合到其基因组中的异源表达盒，
其中所述表达盒包含
(a)用于产生T细胞受体(TCR)的编码序列，
(b)与所述编码序列可操作地连接的组成型启动子，以及
(c)靶向位点。
37.根据权利要求33所述的iPSC，其中所述靶向位点是5'靶向位点。
38.根据权利要求37所述的iPSC，其中所述盒进一步包含3'靶向位点。
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