CN115074403B

CN115074403B - L-草铵膦的关键中间体4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸

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Publication number: CN115074403B
Application number: CN202210542637.8A
Authority: CN
Inventors: 田义群; 彭春雪; 胡付超; 覃立忠; 龚大春; 任立伟; 兰海闯; 杨潇; 吕育财
Original assignee: Hubei Taisheng Chemical Co Ltd
Current assignee: Hubei Taisheng Chemical Co Ltd
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2025-04-22
Anticipated expiration: 2042-05-18
Also published as: CN115074403A

Abstract

本发明提供L‑草铵膦的关键中间体4‑(甲基羟基磷酰基)‑2‑羰基丁酸，往醋酸乙烯酯中加入苯二酚后滴加甲基亚磷酸二乙酯，水解得到2‑（乙氧基‑甲基磷酰基）‑乙醇；在分散有氧化铜的载体中，通入氧气反应得到2‑（乙氧基‑甲基磷酰基）‑乙醛；2‑（乙氧基‑甲基磷酰基）‑乙醛和甘氨酸中，加入L‑苏氨酸缩醛酶、辅酶磷酸吡哆醛、MnCl₂，反应得到4‑（甲基羟基磷酰基）‑苏氨酸；4‑（甲基羟基磷酰基）‑苏氨酸和L‑苏氨酸脱氨酶反应经超滤得到4‑（甲基羟基磷酰基）‑2‑羰基丁酸。采用两步酶法，不用0℃以下的低温冷源、反应条件温和，酶促催化反应与超滤系统偶联，回收催化用酶，收率达86%以上。4‑（甲基羟基磷酰基）‑2‑羰基丁酸是合成L‑草铵膦的关键中间体。

Description

L-草铵膦的关键中间体4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸

技术领域

本发明属于涉及精细化工、基因工程与酶工程领域，涉及一种化学-酶法制备4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸的方法及其在精草铵膦合成中的应用。

背景技术

4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸(4-(methylhydroxyphosphroryl)2-carbonylbutyric acid，又称PPO)的结构式如下所示，它是合成新型除草剂精草铵膦(L-草铵膦)的关键中间体，因此PPO低成本高效合成对于精草铵膦的产业化至关重要。

目前关于PPO的合成方法很多，东南大学金竹丹在导师王明亮教授指导下进行了较为全面的综述。主要有5种方法：(1)以环磷酸酐、草酸二酯、氰化钠为原料合成，该方法需要使用剧毒物质氰化钠，存在危险性大(Starkov Vitalij Y,Freger Boris I,etal.Sodium saltas semiproduct for producing phosphine acid displayingherbicidal activity[P].European Patent Office,1583424.1990-08-07.)。(2)采用3-(羟基甲基乙氧基)丙氰与草酸二乙酯Claisen缩合，随后加碱水解后再酸化，获得中间体，中间体与N,N-二取代(三甲基硅)仲胺反应，生成产物不需分离，直接水解获得产物PPO，该法有两种顺反异构的烯氰，严重影响PPO的产率(Kazakov P V,Odinets I L,Antipin M Y,et al.Synthesis of 2-keto-4-phos phorylbutyric acids and their derivatives[J].Division of chemical science,1990,39(9):1931-1937.)。(3)刘善和等人 (刘善和,曾辉,高正华等.一种草胺膦的合成方法[P].中国专利CN105837624.2018-11-16.)报道了采用低温下向2-羰基-3-丁烯酸酯化合物中缓慢滴加甲基二氯化磷，搅拌下发生迈克尔加成，随后碱解后回流酸化得到PPO，但该法已经受到美国专利保护(Lothar Wilms,Hofheim.ETHOD FOR PRODUCING GLUFOSINATES AND INTERMEDIATE PRODUCTS FOR THESAMEUS 6,359,162 B1,2002-3-19)；(4)Tanaka等发表专利(Tanaka M,Sakakura T,Takigawa S,et al.Preparation of phosphinyl-2-oxobutyric acids asintermediates for herbicides[J]. Jpn Kokai Tokkyo Koho JP,1989,89(10):658-672.)，以2-(甲基膦酰基氯代乙氧基)氯乙烷为原料，与一氧化碳在羰基钴及氢氧化钙的催化作用下，制得PPO的氯代物，然后通过还原加氢得到PPO，该法存在路线长，用到贵金属催化剂，需要加氢等问题。(5)Hoechst公司在 1991年报道了以甲基亚磷酸二乙酯和丙烯酸酯加成反应后，在甲醇钠作用下与草酸二乙酯反应，合成PPO，总收率为65(Zeiss HJ.Enantioselective synthesis of both enantiomersof phosphinothricin viaasymmetric hydrogenation of-acylamidoacrylates[J].J.Org.Chem.，1991，56(5):1783-1788.)；我国安徽国星生物化学有限公司对其方法进行了适当改进，总收率可提高到85％(王红伟，曾辉，等.草铵膦关键中间体的合成新方法[J].浙江化工,2017,48(2):3-5)。(6)我国浙江工业大学郑裕国院士和浙江大学杨立荣教授申报相关专利(薛亚平,程峰,曹成浩,郑裕国.一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用[P].CN 111363775A,2020-03-18；杨立荣,王子渊,周海胜,等.一种ω-转氨酶的应用及生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法[P].CN 112553285 A,2021-03-26.)，利用DL-消旋体草铵膦，通过D-氨基酸氧化酶或ω-转氨酶将D-草铵膦氧化得到PPO，该法虽然简洁，但是原料受制于消旋体草铵膦生产企业的限制，无法规模制备PPO，主要过程如下所示：

由于上述方法均很难实现产业化，因此本发明以甘氨酸、醋酸乙烯酯和甲基亚磷酸二甲酯为原料，采用2步化学法和2步酶法的方法合成4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸PPO，具有原料易得、不用0℃以下的低温冷源、反应条件温和等优点，收率可达86％以上，具有较好的应用前景。

发明内容

为解决上述化学合成的原料不易得、反应条件苛刻、专利限制等问题，本发明提供一种化学-酶法制备4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸PPO的方法，并应用在精草铵膦的合成中。

本发明的的技术方案以甲基亚磷酸乙酯、醋酸乙烯酯为原料，添加适量的苯二酚，0-10℃反应、酸性水解得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇，然后经过二氧化硅负载的铜催化剂氧化，合成2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛，接着与甘氨酸混合，利用L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶双酶法，制取关键中间体4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸PPO；最后利用L- 谷氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，酶转化制备出精草膦，其中可以分批添加底物也可以一次添加。整个化学反应采用间歇式反应分批投料，酶法反应采用多级管式反应连续制备，可以避免酶和底物的交叉影响。精草膦铵盐通过D318阴离子交换树脂吸附、氨水洗脱获得。

技术路线如下所示：

本发明的技术方案包括如下：

本发明提供一种化学-酶法制备4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸的方法，包括如下步骤：

(1)在醋酸乙烯酯的无水乙醇反应器中，加入对苯二酚后滴加甲基亚磷酸二乙酯，在温度为 0-10℃下进行加成重排反应，反应后在盐酸中水解(质量浓度20-36％)，得到的产物经减压蒸馏，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇；

(2)将步骤(1)得到的2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇置于固定床式反应器中，二氧化硅为载体，将氧化铜分散在二氧化硅的载体中(上海迅凯新材料科技有限公司，型号为CuCAT-2508T，主要成分Cu-Si，圆柱5*3mm)，通入氧气后在温度为50-120℃、压力为 0.05-0.15MPa下进行反应得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛；

(3)将步骤(2)得到的2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛和甘氨酸通入管式反应器中，加入 L-苏氨酸缩醛酶、辅酶磷酸吡哆醛、MnCl₂，加入缓冲液构成醛缩反应酶转化反应体系，在温度为30-50℃下进行反应(优选反应温度为35℃)，反应完成后经超滤得到4-(甲基羟基磷酰基)-苏氨酸；该步骤中可以分批添加底物也可以一次添加；

(4)将步骤(3)得到的4-(甲基羟基磷酰基)-苏氨酸和L-苏氨酸脱氨酶通入管式反应器中，在缓冲液中，温度为20-45℃下进行反应(优选反应温度为40℃)，反应完成后经超滤得到4- (甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸；该步骤中可以分批添加底物也可以一次添加。

步骤(1)中醋酸乙烯酯与甲基亚磷酸二乙酯的摩尔比关系为(1.0～1.3):1；

对苯二酚的添加量为醋酸乙烯酯和甲基亚磷酸二乙酯原料总质量的1/10000～3/10000。

步骤(3)中2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛的浓度为100-200g/L；甘氨酸浓度为50-100g/L； L-苏氨酸缩醛酶为甘氨酸质量的2-5％；辅酶磷酸吡哆醛的浓度为50-100μmol/L；MnCl₂的浓度为50-100μmol/L；反应体系中，采用0.05-0.3mol/L Tris-HCl控制pH为6-9(优选缓冲液的浓度为0.1mol/L，控制pH为8.0)。

步骤(3)中所述的L-苏氨酸缩醛酶为重组酶ScTA，重组酶ScTA氨基酸序列为SEQID NO：1，DNA序列为SEQ ID NO：2。

L-苏氨酸醛缩酶：通过构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pet28a–L-ScTA表达带有组氨酸标签的来源于酿酒酵母TSHP的L-苏氨酸醛缩酶，酿酒酵母TSHP，分类命名：Saccharomyces cerevisiae TSHP，保藏编号CCTCC NO：M 2022499，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2022年4月27日。并采用Ni-Agarose亲和层析对重组酶 ScTA进行分离纯化。重组酶ScTA的基因序列全长1164bp，含有387个氨基酸，分子量在 42.815kD，比酶活为2.5U/mg。经过破碎、纯化后得到液态酶，其酶活为3500U/L。本发明方案中液态酶产品经破碎纯化后就可以作为液态酶，工业上一般会加储存稳定剂，以延长其实用时间)。

所述的L-苏氨酸缩醛酶替换为L-苏氨酸缩醛酶变体酶N294R，所述的L-苏氨酸缩醛酶变体酶N294R的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

L-苏氨酸醛缩酶突变体N294R，由生工(上海)生物工程有限公司合成自行设计引物N294R 2-f：F:gcagacaccaggtttgtctttattaacctgaaggccgctagaatg和N294R 2-r：R: taaagacaaacctggtgtctgctggagactctagcgggatg，采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的定点突变试剂盒Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2进行定点突变，构建突变酶N294R，经过破碎、纯化后得到液态酶，酶活提高2倍，其酶活为达到7000U/L。

所述的步骤(4)中4-(甲基羟基磷酰基)-苏氨酸的浓度为100-300g/L，L-苏氨酸脱氨酶的添加量为4-(甲基羟基磷酰基)-苏氨酸质量的1-3％；反应体系中，采用0.05-0.3mol/L Tris-HCl控制pH为6-9(优选缓冲液的浓度为0.1mol/L，控制pH为7.5)。

所述的L-苏氨酸脱氨酶为重组酶Kt-TDH，重组酶Kt-TDH的氨基酸序列为SEQ IDNO： 4，DNA序列为SEQ ID NO：5。

L-苏氨酸脱氨酶：通过构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pet28a–Kt-TDH，表达带有组氨酸标签的Kluyveromyces thermotolerans TDH苏氨酸脱氨酶基因，并采用Ni-Agarose亲和层析对重组酶Kt-TDH进行分离纯化。重组酶KtTDH的基因序列全长1722bp，含有573个氨基酸，分子量在63.199kD，比酶活为3.5U/mg。经过破碎、纯化后得到液态酶，其酶活为3800U/L。

本发明的技术方案还提供有L-谷氨酰胺脱氢酶：通过构建重组菌E.coliBL21(DE3)/ pet28a-GDH，表达带有组氨酸标签的谷氨酸棒杆菌CorynebacteriumglutamicumB1(谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicumB1取自公开专利109971676A，保藏号CCTCC NO：M 2019118)L-谷氨酰胺脱氢酶GDH基因，并采用Ni-Agarose亲和层析对重组酶CgGDH进行分离纯化研究。重组酶CgGDH基因序列全长1344bp，447个氨基酸，分子量为48.988kD，经过破碎、纯化后得到液态酶，其酶活为10300U/L，氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

L-谷氨酰胺脱氢酶突变体Q113E

由生工(上海)生物工程有限公司合成自行设计引物Q113E 2-f：TTTGAA TTCatgacagttgatgag caggtc和E218D 2-r：TTTCTCG AG ttagat gacgccctg tgcca，采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的定点突变试剂盒Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2进行定点突变，构建突变酶E218D，经过破碎、纯化后得到液态酶，酶活提高到18500U/L，氨基酸序列为SEQ ID NO：7。

葡萄糖脱氢酶由安琪酵母股份有限公司酶制剂事业部提供，授权专利为CN107779459 A，所述菌株为大肠杆菌Escherichiacoli.A149-170，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016102。分子量为30kD左右，提供的液态酶制剂(安琪酵母股份有限公司公司提供)酶活为5000U/L。

本发明进行反应过程中所用的反应器：多酶级联反应采用连续管式反应或间歇式反应，为了避免底物和产物对酶的反馈抑制，采用连续操作的管式反应器效果比间歇式反应好；化学加成和氧化反应采用间歇反应。

本发明的步骤中酶催化反应后均采用超滤浓缩：经过每级酶促反应后，可选用膜孔径10-35kD超滤设备，将酶和小分子产物分离，产物在透过液中进入下一级酶级反应，酶液可回收再利用，一般酶可以回收至少5次以上，酶活仍然有80％以上，第二次连续反应体系只需要补充20％左右的液态酶制剂。

本发明的酶反应制备PPO过程中，管式反应器中进行串联酶促反应的收率达到86％以上；间歇式反应收率达到75％以上。

本发明有益效果：

本发明以甲基亚磷酸二乙酯、醋酸乙烯酯、甘氨酸三种易得原料，利用收率高的化学加成和氧化反应，然后经过L-苏氨酸缩醛酶及其突变体N294R、L-苏氨酸脱氨酶两级酶促反应，低成本、高效率合成精草铵膦的关键中间体4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸PPO，最后通过L-谷氨酰胺脱氢酶还原酶及其突变体Q113E，进行第三级酶促反应，在串联的多级管式反应器(见本课题组自主申报的专利：龚大春,王德林,张书银.等人，多酶级联反应分离耦合系统和方法，CN 113088443 A)或间歇式反应器中进行催化合成精草铵膦，其中辅酶NADPH 采用葡萄糖脱氢酶进行再生，反应后的酶采用超滤技术进行浓缩回收利用，以进一步降低成本，本工艺具有原料易得、成本低、效率高的技术特点。

附图说明

图1为L-苏氨酸缩醛酶、L-苏氨酸脱氨酶和L-谷氨酰胺脱氢酶重组表达载体E.coliBL21(DE3) /pet28a–ScTA结构示意图。

图2为L-苏氨酸缩醛酶、L-苏氨酸脱氨酶和L-谷氨酰胺脱氢酶重组表达载体E.coliBL21 (DE3)/pet28a–KtTDH结构示意图。

图3为L-苏氨酸缩醛酶、L-苏氨酸脱氨酶和L-谷氨酰胺脱氢酶重组表达载体E.coliBL21(DE3) /pet28a–CgLGDH结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

突变菌株Saccharomyces cerevisiae L-苏氨酸醛缩酶的表达、纯化，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，DNA序列为SEQ ID NO：2。

(1)引物设计

利用SnapGene软件开展引物设计，由生工(上海)生物工程有限公司合成。

SEQ ID NO：8：F1:TTTGGA TCCatgactgaattcgaattgcc

SEQ ID NO：9：R1:TTTCTCGAGtcagtatttgtaggtttttatttcgc

(2)基因扩增

以分类命名酿酒酵母TSHP(酿酒酵母TSHP，分类命名：Saccharomyces cerevisiaeTSHP，保藏编号CCTCC NO：M 2022499，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2022年4月27日)的L-苏氨酸醛缩酶为模板，用引物对：SEQID NO： 8，SEQ ID NO：9，扩增ScTA基因。反应体系为：0.5μL基因组DNA模板，0.5μL PhusionDNA polymerase，10μL Phusion GC Buffer(5X)，2.5μL F/R(10μmol/L)，1μL dNTP(10μmol/L)， 1.5μL DMSO，1.5μL Mg²⁺，30μL ddH₂O。扩增条件：PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性10s；64.7℃退火20s；72℃延伸45s；共进行30个PCR循环；最后在72℃继续延伸5min。

(3)构建重组酶ScTA

ScTA扩增产物经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后定向克隆至表达载体，并转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞。转化后，取适量菌液涂布在含100μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃避光培养，筛选阳性转化子。培养提取质粒，经测序验证后，获得克隆载体，命名为pet28a-ScTA(如图1)。

挑取含有重组表达质粒的单菌落于含100μg/mL氯霉素的LB培养基中过夜培养。按OD₆₀₀值为4的比例接种至100mL诱导培养基(100μg/mL氯霉素，1mmol/L Mg²⁺、1mmol/L Zn²⁺)中，23℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6，加入IPTG使终浓度为0.4mmol/L， 23℃诱导16h。同时与空载体与未诱导大肠杆菌做对照。离心收集菌体，用适当体积的Buffer A(20mmol/LTris，500mmol/L NaCl，5％甘油，0.5mmol/L PMSF，pH 7.5)重悬后，超声破碎(工作2s，停6s，25min)，离心(12 000rpm，4℃，10min)取上清液。

粗蛋白使用Ni-Agarose柱分离纯化，将具有组氨酸标签的目的蛋白上清液经0.45μm滤膜过滤后上柱，分别用10倍柱体积Binding Buffer(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L咪唑， 500mmol/L NaCl，pH 8.0)进行洗杂，20mL Elution Buffer(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)洗脱，并按每1mL流出液分管收集，保存于4℃备用。蛋白样品经SDS-PAGE检测，得到比酶活高的重组酶ScTA。其氨基酸序列SEQ ID NO：1。重组酶ScTA的基因序列全长1164bp，DNA序列为SEQ ID NO：2，含有387个氨基酸，分子量在42.815kD，比酶活为2.5U/mg。

实施例2

突变体酶是采用定点突变技术，将294位的天冬酰胺N定点突变为精氨酸R，其氨基酸序列如SEQID NO.3，具体步骤如下：

(1)引物设计

SEQ ID NO：10：N294R 2-F:gcagacaccaggtttgtctttattaacctgaaggccgctagaatg

SEQ ID NO：11：N294R 2-R:taaagacaaacctggtgtctgctggagactctagcgggatg

(2)突变质粒扩增

使用Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase对pet28a-ScTA进行扩增，反应体系如下：1ng基因组DNA模板，1μL Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，25μLMax Buffer (2X)，2μL F/R引物(10μmol/L)，1μL dNTP(10μmol/L)，ddH2O补足至50μL。扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性15s，61℃退火15s，72℃延伸60s，30个循环，最后75℃保温5min。

(3)扩增产物Dpnl消化

为防止原始模板质粒在转化后形成假阳性转化子，需要在重组环化前进行Dpnl消化。反应体系如下：1μL Dpnl，50μL扩增的突变质粒。处理条件：37℃温育1h。

(4)重组反应

扩增后的突变质粒是线性的，需要在Exnase II酶的催化下使突变质粒发生同源重组，完成环化过程。

(5)构建突变酶N294R

采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的定点突变试剂盒Mut Express II FastMutagenesis Kit V2进行定点突变，得到突变点质粒，并转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建突变酶N294R基因工程菌。-80℃保存。

挑取含有重组表达质粒(重组酶ScTA)的单菌落于含100μg/mL氯霉素的LB培养基中过夜培养。按OD₆₀₀值为4的比例接种至100mL诱导培养基(100μg/mL氯霉素，1mmol/L Mg²⁺、1mmol/L Zn²⁺)中，23℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6，加入IPTG使终浓度为0.4mmol/L，23℃诱导16h。同时与空载体与未诱导大肠杆菌做对照。离心收集菌体，用适当体积的Buffer A(20mmol/LTris，500mmol/L NaCl，5％甘油，0.5mmol/L PMSF，pH 7.5) 重悬后，超声破碎(工作2s，停6s，25min)，离心(12 000rpm，4℃，10min)取上清液。

粗蛋白使用Ni-Agarose柱分离纯化，将具有组氨酸标签的目的蛋白上清液经0.45μm滤膜过滤后上柱，分别用10倍柱体积Binding Buffer(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L咪唑， 500mmol/L NaCl，pH 8.0)进行洗杂，20mL Elution Buffer(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)洗脱，并按每1mL流出液分管收集，保存于4℃备用。得到L-苏氨酸醛缩酶突变体酶N294R。其氨基酸序列SEQ ID NO.3，液态酶酶活提高2倍，达到7000U/L。

实施例3

所述的L-苏氨酸脱氨酶为重组酶Kt-TDH，重组酶Kt-TDH的氨基酸序列为SEQ IDNO：4，DNA序列为SEQ ID NO：5。

(1)引物设计

SEQ ID NO：12：F2：ATTGGATCCcgtgagtcatgagatccttta

SEQ ID NO：13：R2：ATTAAGCTTgcaacacctaacaaagtgatt

(2)基因扩增

L-苏氨酸脱氨酶：通过构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pet28a–Kt-TDH，表达带有组氨酸标签的耐热克鲁维酵母ST(分类命名：Kluyveromyces thermotolerans ST，保藏编号：CCTCC NO： M 2022498，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2022年4月27日)TDH苏氨酸脱氨酶基因为模板，扩增Kt-TDH基因。反应体系为：0.5μL 基因组DNA模板，0.5μL Phusion DNA polymerase，10μL Phusion GC Buffer(5X)，2.5μL F/R (10μmol/L)，1μL dNTP(10μmol/L)，1.5μL DMSO，1.5μL Mg²⁺，30μL ddH₂O。扩增条件：PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性10s；64.7℃退火20s；72℃延伸45s；共进行 30个PCR循环；最后在72℃继续延伸5min。

(3)构建重组酶Kt-TDH

KtTDH扩增产物经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后定向克隆至表达载体，并转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞。转化后，取适量菌液涂布在含100μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃避光培养，筛选阳性转化子。培养提取质粒，经测序验证后，获得克隆载体，命名为pet28a-KtTDH(如图2)。

挑取含有重组表达质粒的单菌落于含100μg/mL氯霉素的LB培养基中过夜培养。按OD₆₀₀值为4的比例接种至100mL诱导培养基(100μg/mL氯霉素，1mmol/L Mg²⁺、1mmol/L Zn²⁺)中，23℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6，加入IPTG使终浓度为0.4mmol/L， 23℃诱导16h。同时与空载体与未诱导大肠杆菌做对照。离心收集菌体，用适当体积的Buffer A (20mmol/L Tris，500mmol/L NaCl，5％甘油，0.5mmol/L PMSF，pH 7.5)重悬后，超声破碎(工作2s，停6s，25min)，离心(12 000rpm，4℃，10min)取上清液。

粗蛋白使用Ni-Agarose柱分离纯化，将具有组氨酸标签的目的蛋白上清液经0.45μm滤膜过滤后上柱，分别用10倍柱体积Binding Buffer(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L咪唑， 500mmol/L NaCl，pH 8.0)进行洗杂，20mL Elution Buffer(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)洗脱，并按每1mL流出液分管收集，保存于4℃备用。蛋白样品经SDS-PAGE检测，得到比酶活高的重组酶Kt-TDH。其氨基酸序列SEQ ID NO.4，DNA序列为SEQ ID NO：5。重组酶Kt-TDH的基因序列全长1722bp，含有573个氨基酸，分子量在63.199kD，比酶活为3.5U/mg。

实施例4

菌株Corynebacterium glutamicumB1 L-谷氨酸脱氢酶的表达、纯化及氨基酸序列SEQ ID NO：6。

(1)引物设计

SEQ ID NO：14：F3:TTTGGATCCatgactgaattcgaattgcc

SEQ ID NO：15：R3:TTTCTC GAGtcagtatttgtaggtttttatttcgc

(2)基因扩增

以Corynebacterium glutamicumB1(谷氨酸棒杆菌CorynebacteriumglutamicumB1取自公开专利109971676A，保藏号CCTCC NO：M 2019118)为模板，扩增CgGDH基因。反应体系为：0.5μL基因组DNA模板，0.5μL Phusion DNA polymerase，10μL PhusionGC Buffer (5X)，2.5μL F/R(10μmol/L)，1μL dNTP(10μmol/L)，1.5μL DMSO，1.5μL Mg²⁺，30μL ddH₂O。扩增条件：PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性10s；64.7℃退火20s； 72℃延伸45s；共进行30个PCR循环；最后在72℃继续延伸5min。

(3)构建重组酶CgGDH

GDH扩增产物经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后定向克隆至表达载体，并转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞。转化后，取适量菌液涂布在含100μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃避光培养，筛选阳性转化子。培养提取质粒，经测序验证后，获得克隆载体，命名为pet28a-GDH(如图3)。

粗蛋白使用Ni-Agarose柱分离纯化，将具有组氨酸标签的目的蛋白上清液经0.45μm滤膜过滤后上柱，分别用10倍柱体积Binding Buffer(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L咪唑， 500mmol/L NaCl，pH 8.0)进行洗杂，20mL Elution Buffer(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)洗脱，并按每1mL流出液分管收集，保存于4℃备用。蛋白样品经SDS-PAGE检测，得到比酶活高的重组酶CgGDH。其氨基酸序列SEQ ID NO： 6。重组酶CgGDH基因序列全长1344bp，447个氨基酸，分子量为48.988kD。

实施例5

L-谷氨酸脱氢酶突变体酶Q113E是采用定点突变技术，将113位的谷氨酰胺Q定点突变为谷氨酸E，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7，具体步骤如下：

(1)引物设计

SEQ ID NO：16：Q113E 2-f：TTTGAA TTCatg acagttgatgag caggtc

SEQ ID NO：17：Q113E 2-r：TTTCTCG AG ttagat gacgccctg tgcca

(2)突变质粒扩增

(3)扩增产物Dpnl消化

为防止原始模板质粒在转化后形成假阳性转化子，需要在重组环化前进行Dpnl消化。反应体系如下：1μLDpnl，50μL扩增的突变质粒。处理条件：37℃温育1h。

(4)重组反应

(5)构建突变酶Q113E

采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的定点突变试剂盒Mut Express II FastMutagenesis Kit V2进行定点突变，得到突变点质粒，并转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建突变酶Q113E基因工程菌。-80℃保存。

挑取含有重组表达质粒(重组酶CgGDH基因工程菌)的单菌落于含100μg/mL氯霉素的LB培养基中过夜培养。按OD₆₀₀值为4的比例接种至100mL诱导培养基(100μg/mL氯霉素，1mmol/L Mg²⁺、1mmol/L Zn²⁺)中，23℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6，加入 IPTG使终浓度为0.4mmol/L，23℃诱导16h。同时与空载体与未诱导大肠杆菌做对照。离心收集菌体，用适当体积的Buffer A(20mmol/L Tris，500mmol/L NaCl，5％甘油，0.5mmol/L PMSF，pH7.5)重悬后，超声破碎(工作2s，停6s，25min)，离心(12 000rpm，4℃，10min) 取上清液。

粗蛋白使用Ni-Agarose柱分离纯化，将具有组氨酸标签的目的蛋白上清液经0.45μm滤膜过滤后上柱，分别用10倍柱体积Binding Buffer(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)进行洗杂，20mL Elution Buffer(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)洗脱，并按每1mL流出液分管收集，保存于4℃备用。得到L-谷氨酰胺脱氢酶突变体酶Q113E。其氨基酸序列SEQ ID NO.7，液态酶制剂酶活提高 2倍，达到7000U/L。

实施例6

葡萄糖脱氢酶：由安琪酵母股份有限公司酶制剂事业部提供，授权专利为CN107779459 A，所述菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli.)A149-170，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016102。DNA分子编码氨基酸序列如SEQID NO.18，DNA序列为SEQID NO.19，分子量为30kD左右，提供的液体酶制剂酶活为5000U/L。

实施例7

2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇的合成

在100g/L的醋酸乙烯酯的无水乙醇反应器中，加入反应总质量的万分之二的苯二酚，控制温度5℃，滴加甲基亚磷酸二乙酯，进行加成重排反应3小时，然后在30％的盐酸中常压回流3小时，减压蒸馏，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇，产率96.5％，产品纯度为99.5％以上，¹HNMR(500MHz，DMSO),1.14(m,3H,-PCH₃),1.56-1.69(m,3H,CH₃CH₂-O-),1.93(t, 2H,-PCH₂CH₂-OH),2.3(s,H,-PCH₂CH₂-OH),4.13(m,2H,-PCH₂CH₂-OH),4.38-4.49 (m,2H,CH₃CH₂-O-).

因为甲基亚磷酸二乙酯遇到水后溶液分解，所以采用无水环境，因为是加成重排反应，所以用无水乙醇比较好，如果用无水甲醇，可能会增加副反应。

盐酸的质量浓度为30％，因为是常压回流，一般温度就在100℃左右，发生的反应如下：

温度过低如-5℃，反应速度慢，收率下降，反应温度过高，超过10度，反应释放的热量大，会导致副反应。

实施例8

2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛的合成

将实施例7制备得到的80g/L的2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇液体空速控制在0.8～2h^-1，加入固定床式反应器，反应器中装载的二氧化硅负载的氧化铜催化剂总用量为300g/L，其中 CuO的质量分数≥19％(上海迅凯新材料科技有限公司)，通入2.4L/h氧气，反应温度控制在100℃，反应压力控制在0.10MPa，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛，产率为98.4％，产品纯度99.8％，

¹HNMR(500MHz，DMSO),1.14(m,3H,-PCH₃),1.56-1.69(m,3H,CH₃CH₂-O-),2.83(t,2H,-PCH₂CH₂-CHO),4.13(m,2H,-PCH₂CH₂-OH),4.38-4.49(m,2H,CH₃CH₂-O-),10.2(m, H,-PCH₂CH₂-CHO).

实施例9

4-(甲基羟基磷酰基)-苏氨酸

(1)在管式反应器中，以100kg/h流速通入浓度为150g/L的2-(乙氧基-甲基磷酰基)- 乙醛(实施例8制备得到的)和浓度为75g/L的甘氨酸，2.25g/L的L-苏氨酸缩醛酶，20mg/L 辅酶磷酸吡哆醛(PLP)(85μmol/L)、9.5mg/LMnCl₂(75μmol/L)，利用0.1mol/LTris-HCl 控制pH为8，构成醛缩反应酶转化体系，反应温度为35℃，反应10小时，进入30kD的超滤系统，将反应物产物和酶分开，分离得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率98.1％及纯度为98.8％。

(2)上述步骤中分离得到的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有96.2％，以上述相同的步骤及工艺条件加入各原料(原料包括2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛、甘氨酸、辅酶磷酸吡哆醛、MnCl₂)，同时加入上述分离回收得到的L-苏氨酸缩醛酶，补充0.086g/L的L-苏氨酸缩醛酶，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率97.3％及纯度为98.6％，

(3)再次回收步骤(2)中的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有91.5％，补充0.19g/L的L- 苏氨酸缩醛酶，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率95.2％及纯度为98.6％.

(4)再次回收步骤(3)中的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有87.6％，补充0.28g/L的L- 苏氨酸缩醛酶，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率93.9％及纯度为98.5％，

(5)再次回收步骤(4)中的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有85.2％，补充0.33g/L的L- 苏氨酸缩醛酶，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率92.6％及纯度为97.8％，

(6)再次回收步骤(5)中的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有81.4％，补充0.42g/L的L- 苏氨酸缩醛酶，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率92.1％及纯度为97.3％，

实施例10

4-(甲基羟基磷酰基)-苏氨酸

(1)在管式反应器中，以100kg/h流速通入浓度为150g/L的2-(乙氧基-甲基磷酰基)- 乙醛(实施例8制备得到的)和浓度为75g/L的甘氨酸，1.2/L的L-苏氨酸缩醛酶突变体酶 N294R，20mg/L辅酶磷酸吡哆醛(PLP)(85μmol/L)、9.5mg/LMnCl₂(75μmol/L)，利用0.1mol/L Tris-HCl控制pH为8.2，构成醛缩反应酶转化体系，反应温度为35℃，反应10小时，进入 30kD的超滤系统，将反应物产物和酶分开，分离得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率98.5％及纯度为99.1％。

(2)上述步骤中分离得到的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有97.3％，以上述相同的步骤及工艺条件加入各原料(原料包括2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛、甘氨酸、辅酶磷酸吡哆醛、MnCl₂)，同时加入上述分离回收得到的L-苏氨酸缩醛酶，补充0.03g/L的L-苏氨酸缩醛酶突变体酶N294R，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率98.1％及纯度为98.7％，

(3)再次回收步骤(2)中的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有91.5％，补充0.1g/L的L- 苏氨酸缩醛酶突变体酶N294R，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率97.5％及纯度为98.3％，

(4)再次回收步骤(3)中的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有87.6％，补充0.15g/L的L- 苏氨酸缩醛酶突变体酶N294R，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率97.1％及纯度为98.1％，

(5)再次回收步骤(4)中的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有85.2％，补充0.18g/L的L- 苏氨酸缩醛酶突变体酶N294R，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率96.5％及纯度为97.8％，

(6)再次回收步骤(5)中的L-苏氨酸缩醛酶，酶活还保留有81.4％，补充0.22g/L的L- 苏氨酸缩醛酶突变体酶N294R，进行酶促反应，得到2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇产物，产物的收率95.3％及纯度为97.5％。

实施例11

4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基丁酸PPO的制备

2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛、甘氨酸、L-苏氨酸脱氨酶进料流速控制在80kg/h，其中 2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醛、甘氨酸底物浓度分别为197g/L、80g/L，添加3.94g/L的实施例3制备得到的L-苏氨酸脱氨酶(为底物的质量的2％)，反应温度为40℃，反应pH7.5，连续反应10小时，进入超滤系统，膜材料孔径为30kD，得到含有PPO的透过液经过减压浓缩，结晶得到PPO，产品纯度为99.5％，产率为92.5％。PPO的¹HNMR(500MHz，DMSO),1.32(d,J＝21.8,13.5,3H,-PCH₃),1.85-1.78(m,2H,-PCH₂CH₂CO-),2.52(d,J-9.8,7.5Hz,2H, -PCH2CH₂ CO-),10.91(s,2H,OH).

超滤系统酶回收率98.1％的L-苏氨酸脱氨酶，返回到管式反应器中，再次添加上述步骤中相同质量的2-(乙氧基-甲基磷酰基)-乙醇，L-苏氨酸脱氨酶回收利用6次时，L-苏氨酸脱氨酶的酶活仍然有86.3％，PPO产率为91.9％。

实施例12精草铵膦(L-草铵膦)的制备

在管式酶促反应器中，以150g/h的进料速度，料液中含有浓度为180g/L的底物PPO(实施例11制备得到的)，9g/L的L-谷氨酰胺脱氢酶突变体Q113E(PPO质量的5％)，100g/L的辅助底物葡萄糖，2g/L葡萄糖脱氢酶(葡萄糖的质量2％)，反应温度为30℃，反应pH8，连续反应7小时，进入超滤系统，膜材料孔径为30kD，得到精草铵膦(L-草铵膦)，管式反应转化率达到95.6％。反应结束后的混合液经过20kD的超滤，将残余酶和小分子物质分开，进口压力控制在0.1-1.0MPa，回流压力控制在0.05-0.1MPa，平均膜通量达80-120L/(m²·h)，收集含有产品的小分子透过液，减压浓缩，在离子交换柱上，进料浓度为100g/L，调整pH 为6，采用D318阴离子交换树脂，在25℃条件下，静态吸附，经30-60目的筛网分去其他液体，饱和树脂用超纯水去杂质，洗涤后树脂放至解吸柱用稀氨水解吸，解吸液用薄膜蒸发器进行浓缩，浓缩液再加活性炭脱色、过滤，滤液用喷雾干燥器干燥，最后得精草铵膦成品。收率在98％，产品光学纯度为99.6％。经过核磁检测为¹HNMR(300MHz,D ₂O)δ：1.12(d， J＝13.50Hz,3H)；1.86-1.94(m,2H)；1.34-1.58(m，2H)、3.64(t，J＝5.9Hz，1H)。mp 208.5-211℃， [α]_D ^19.5＝+16.02℃(c＝0.70,H₂O)，ee>99.6％。

采用超滤系统回收L-谷氨酰胺脱氢酶突变体Q113E，酶回收率97.6％，返回到管式反应器中，再次添加上述步骤中相同质量的PPO、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶，回收利用6次的时候，得到精草铵膦(L-草铵膦)，产物收率为87.8％以上，纯度为99.6％。

实施例13精草铵膦(L-草铵膦)的制备

在管式酶促反应器中，以150g/h的进料速度，料液中含有浓度为180g/L的底物PPO(实施例11制备得到的)，5.4g/L的L-谷氨酰胺脱氢酶，100g/L的辅助底物葡萄糖，2g/L葡萄糖脱氢酶(葡萄糖的质量2％)，反应温度为30℃，反应pH8.2，连续反应7小时，进入超滤系统，膜材料孔径为30kD，得到精草铵膦(L-草铵膦)。反应结束后的混合液经过20kD的超滤，将残余酶和小分子物质分开，进口压力控制在0.1-1.0MPa，回流压力控制在0.05-0.1MPa，平均膜通量达80-120L/(m²·h)，收集含有产品的小分子透过液，减压浓缩，在离子交换柱上，进料浓度为100g/L，调整pH为6，采用D318阴离子交换树脂，在25℃条件下，静态吸附，经30-60目的筛网分去其他液体，饱和树脂用超纯水去杂质，洗涤后树脂放至解吸柱用稀氨水解吸，解吸液用薄膜蒸发器进行浓缩，浓缩液再加活性炭脱色、过滤，滤液用喷雾干燥器干燥，最后得精草铵膦成品。收率在97.5％，产品光学纯度为99.4％。经过核磁检测为¹HNMR(300MHz,D₂O)δ：1.12(d，J＝13.50Hz,3H)；1.86-1.94(m,2H)；1.34-1.58(m，2H)、3.64 (t，J＝5.9Hz，1H)。mp 208.5-211℃，[α]_D ^19.5＝+16.02℃(c＝0.70,H₂O)，ee>99.6％。

采用超滤系统，每次酶回收率96.5％以上(酶活计)L-谷氨酰胺脱氢酶，返回到管式反应器中，再次添加上述步骤中相同质量的PPO、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶，回收利用6次的时候，得到精草铵膦(L-草铵膦)，产物收率为86.5％，纯度为99.5％。

以上所述实例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>湖北泰盛化工有限公司

<120>L-草铵膦的关键中间体4-(甲基羟基磷酰基)-2- 羰基丁酸

<160>总数目19

<210>1

<211>387

<212>PRT

<213>人工序列

<223>重组酶ScTA

<400>1

MTEFELPPKY ITAANDLRSD TFTTPTAEMM EAALEASIGD AVYGEDVDTV

RLEQTVARMA GKEAGLFCVS GTLSNQIAIR THLMQPPYSI LCDYRAHVYT

HEAAGLAILS QAMVVPVVPS NGDYLTLEDI KSHYVPDDGD IHGAPTRLIS

LENTLHGIVY PLEELVRIKA WCMENGLKLH CDGARIWNAA AQSGVPLKQY

GEIFDSISIC LSKSMGAPIG SVLVGNLKFV KKATHFRKQQ GGGIRQSGMM

ARMALVNINN DWKSQLLYSH SLAHELAEYC EAKGIPLESP ADTNFVFINL

KAARMDPDVL VKKGLKYNVK LMGGRVSFHY QVTRDTLEKV KLAISEAFDY

AKEHPFDCNG PTQIYRSEST EVDVDGNAIR EIKTYKY

<210>2

<211>1164

<212>DNA

<213>人工序列

<223>重组酶ScTA的DNA序列

<400>2

atgactgaat tcgaattgcc tccaaaatat atcaccgctg ctaacgactt gcggtcagac 60

acattcacca ctccaactgc agagatgatg gaggccgctt tagaggcctc tatcggtgac 120

gctgtctacg gtgaagatgt tgacaccgtt aggctcgaac agaccgttgc ccgcatggct 180

ggcaaagaag caggtttgtt ctgtgtctct gggactttgt ccaaccagat tgccatcaga 240

actcacttga tgcaacctcc atactctatt ctatgtgatt acagggctca cgtttacact 300

cacgaagccg ctggactggc gatcttgtct caagcgatgg tggttcctgt ggttccttcc 360

aacggtgact acttgacctt ggaagacatc aagtcacact acgtcccaga cgacggtgat 420

attcacggtg cccccaccag attgatttct ctggaaaaca ctttacacgg tattgtttat 480

ccattggaag aactggtccg catcaaagct tggtgtatgg aaaatggtct caaactacat 540

tgtgacggtg ccagaatctg gaatgccgct gcacaatctg gcgtgccatt aaagcaatat 600

ggggaaatct tcgactccat ctccatctgt ctatccaagt ctatgggtgc tcctattggg 660

tccgtcttgg ttgggaacct taagtttgtc aagaaggcca cccatttcag aaaacaacaa 720

ggtggtggta ttagacaatc tggtatgatg gctagaatgg ctcttgtaaa catcaacaac 780

gattggaagt cccaattgct gtactcgcac tctttggctc atgaattagc cgaatattgt 840

gaggcaaagg gcatcccgct agagtctcca gcagacacca actttgtctt tattaacctg 900

aaggccgcta gaatggaccc agatgtcctt gttaagaagg gtttgaagta caacgttaag 960

ctaatgggtg gtagagtctc gttccactat caagtcacca gagatacttt ggaaaaagtc 1020

aaattggcca tctccgaggc cttcgactat gctaaagaac atcctttcga ctgtaacgga 1080

cctacccaga tttaccgtag tgaatccacc gaggtcgacg ttgatggcaa cgctatccgc 1140

gaaataaaaa cctacaaata ctga 1164

<210>3

<211>387

<212>PRT

<213>人工序列

<223>L-苏氨酸醛缩酶突变体酶N294R

<400>3

MTEFELPPKY ITAANDLRSD TFTTPTAEMM EAALEASIGD AVYGEDVDTV

RLEQTVARMA GKEAGLFCVS GTLSNQIAIR THLMQPPYSI LCDYRAHVYT

HEAAGLAILS QAMVVPVVPS NGDYLTLEDI KSHYVPDDGD IHGAPTRLIS

LENTLHGIVY PLEELVRIKA WCMENGLKLH CDGARIWNAA AQSGVPLKQY

GEIFDSISIC LSKSMGAPIG SVLVGNLKFV KKATHFRKQQ GGGIRQSGMM

ARMALVNINN DWKSQLLYSH SLAHELAEYC EAKGIPLESP ADTRFVFINL

KAARMDPDVL VKKGLKYNVK LMGGRVSFHY QVTRDTLEKV KLAISEAFDY

AKEHPFDCNG PTQIYRSEST EVDVDGNAIR EIKTYKY

<210>4

<211>573

<212>PRT

<213>人工序列

<223>重组酶Kt-TDH

<400>4

MASKISSQEL KMSSTLLTRT RPALVSRFLL RYQSSAVANL QKLHAKLNPD

ELLPDSTPDY VRLILRSSVY DVIEESPITR GVGLSSRLNT NVQLKREDLL

PVFSFKLRGA YNMMAKLSEA QKNQGVIACS AGNHAQGVAF ASRHLNIPAI

IVMPVNTPSI KYQNVSRLGG QVVLYGNDFD EAKTECTRIS EERGLTNIPP

FDHPYVIAGQ GTVAMEILRQ VHNAAKIGAV FVPVGGGGLV AGVAAYLKRI

APHIKIIGVE TYDSATLKTS LEAGTRTPLS TVGTFADGTS VRMIGEETFR

ICQDLVDDVI LVNTDEICAA VKDIFEDTRS IVEPSGALAV AGLKKYVTQV

HPDVDHSKKT YVPILSGANM NFDRLRFVSE RAVLGEGKEV FMLVTIPDVP

GSFKQLQRVI HPRAVTEFSY RYNEHRHSSA SDVPKAYIYT SFSVVDREKE

IKQVLQQLHG LGFDAVDISD NEMAKSHGRY LVGGASKVPN EKIVSFEFPE

RPGALTKFLD GMSDSWNLTL FHYRNHGSDV GKVLAGVSVS AEDNEGFQKF

LDDLGYKYQD ETNNMVYQKF LKF

<210>5

<211>1722

<212>DNA

<213>人工序列

<223>重组酶Kt-TDH的DNA序列

<400>5

atggcatcaa agatctcgtc acaagagctc aagatgtctt cgacactgct gactcgcacg 60

aggcctgccc tcgtctcaag gttcttgcta cgctatcaat ctagcgccgt cgcaaacctt 120

caaaagttgc atgctaaact caaccctgat gagcttttgc ccgacagcac gccagactat 180

gtgcggttga tcttgaggtc ctcggtgtac gatgtcatag aagagtcacc aataacccgc 240

ggtgttggat tatcgtctcg cctcaacact aatgtccagc tcaaaagaga ggacttgctg 300

ccagttttct cgttcaagct gcgtggagca tacaacatga tggccaagct gtcagaagct 360

caaaaaaacc agggtgttat agcttgttct gccggtaacc atgcccaggg tgttgctttt 420

gcatccaggc atctaaacat acccgctatt atcgtcatgc ctgttaacac accttccatc 480

aagtaccaga atgtctccag acttggaggc caggtggtgc tgtacggtaa cgacttcgat 540

gaagccaaga ctgaatgcac cagaatctct gaagaaagag ggctgacaaa catccctcct 600

ttcgaccatc catatgtcat tgcgggacag ggcactgtcg ccatggaaat tttgagacag 660

gtccacaatg cggcaaagat cggcgcagtt ttcgtgccag ttggcggtgg cggtttagtc 720

gctggtgttg ctgcttactt gaagagaatt gcaccacaca tcaagatcat cggcgttgag 780

acttacgact ctgcaactct taagacatcg cttgaagctg gtactcgcac cccattgagc 840

actgttggaa cttttgctga tggtacttcc gttcgcatga tcggtgaaga gactttccgt 900

atctgccagg atcttgttga cgatgttatt ttggtgaaca cagacgaaat ctgcgctgca 960

gtaaaggata tcttcgaaga cactagaagc attgtcgagc catcaggcgc tctagctgtt 1020

gctggtctca aaaagtacgt tacacaagtg caccctgatg ttgaccactc caagaaaacc 1080

tatgtgccaa tcctgtcagg tgccaacatg aactttgaca gattgagatt cgtatccgag 1140

cgtgctgtgc ttggtgaggg taaggaagtc ttcatgcttg tcaccatccc agatgtccca 1200

ggttctttca agcagctgca gcgtgttatc cacccaagag ctgtcactga attctcctac 1260

cgttacaacg aacatcgtca cagcagcgca tctgatgtgc ccaaagccta catctacact 1320

tctttcagcg ttgtggaccg tgagaaggaa atcaagcagg ttttgcagca gcttcatggc 1380

ctcggatttg atgctgtgga catttccgac aatgagatgg ccaagagtca tggaaggtat 1440

ctcgttggag gcgcctccaa ggtcccaaac gagaagattg tgtcttttga attcccagag 1500

agacccggtg ctctaacgaa gtttctggat ggaatgagcg actcctggaa cctcacgctg 1560

ttccactaca gaaaccatgg ctccgatgtg ggcaaggtct tggctggtgt ttcggtatcg 1620

gcagaggaca atgaagggtt ccaaaagttt ttggatgacc tgggatacaa gtaccaggac 1680

gagaccaaca acatggttta ccagaaattc ttgaagtttt aa 1722

<210>6

<211>447

<212>PRT

<213>人工序列

<223>重组酶CgGDH

<400>6

MTVDEQVSNY YDMLLKRNAG EPEFHQAVAE VLESLKIVLE

KDPHYADYGL IQRLCEPERQ LIFRVPWVDD QGQVHVNRGF

RVQFNSALGP YKGGLRFHPS VNLGIVKFLG FEQIFKNSLT

GLPIGGGKGG SDFDPKGKSD LEIMRFCQSF MTELHRHIGE

YRDVPAGDIG VGGREIGYLF GHYRRMANQH ESGVLTGKGL

TWGGSLVRTE ATGYGCVYFV SEMIKAKGES ISGQKIIVSG

SGNVATYAIE KAQELGATVI GFSDSSGWVH TPNGVDVAKL

REIKEVRRAR VSVYADEVEG ATYHTDGSIW DLKCDIALPC

ATQNELNGEN AKTLADNGCR FVAEGANMPS TPEAVEVFRE

RDIRFGPGKA ANAGGVATSA LEMQQNASRD SWSFEYTDER

LQVIMKNIFK TCAETAAEYG HENDYVVGAN IAGFKKVADA

MLAQGVI

<210>7

<211>447

<212>PRT

<213>人工序列

<223>L-谷氨酰胺脱氢酶突变体酶Q113E

<400>7

MTVDEQVSNY YDMLLKRNAG EPEFHQAVAE VLESLKIVLE

KDPHYADYGL IQRLCEPERQ LIFRVPWVDD QGQVHVNRGF

RVQFNSALGP YKGGLRFHPS VNLGIVKFLG FEEIFKNSLT

GLPIGGGKGG SDFDPKGKSD LEIMRFCQSF MTELHRHIGE

YRDVPAGDIG VGGREIGYLF GHYRRMANQH ESGVLTGKGL

TWGGSLVRTE ATGYGCVYFV SEMIKAKGES ISGQKIIVSG

SGNVATYAIE KAQELGATVI GFSDSSGWVH TPNGVDVAKL

REIKEVRRAR VSVYADEVEG ATYHTDGSIW DLKCDIALPC

ATQNELNGEN AKTLADNGCR FVAEGANMPS TPEAVEVFRE

RDIRFGPGKA ANAGGVATSA LEMQQNASRD SWSFEYTDER

LQVIMKNIFK TCAETAAEYG HENDYVVGAN IAGFKKVADA

MLAQGVI

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物F1

<400>8

TTTGGA TCCatgactgaattcgaattgcc

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物R1

<400>9

TTTCTCGAGtcagtatttgtaggtttttatttcgc

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>N294R 2-F

<400>10

gcagacaccaggtttgtctttattaacctgaaggccgctagaatg

<210>11

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<223>N294R 2-R

<400>11

taaagacaaacctggtgtctgctggagactctagcgggatg

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<223>F2

<400>12

ATTGGATCCcgtgagtcatgagatccttta

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<223>R2

<400>13

ATTAAGCTTgcaacacctaacaaagtgatt

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<223>F3

<400>14

TTTGGATCCatgactgaattcgaattgcc

<210>15

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<223>R3

<400>15

TTTCTC GAGtcagtatttgtaggtttttatttcgc

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<223>Q113E 2-f

<400>16

TTTGAA TTCatg acagttgatgag caggtc

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<223>Q113E 2-r

<400>17

TTTCTCG AG ttagat gacgccctg tgcca

<210>18

<211>261

<212>PRT

<213>人工序列

<223>葡萄糖脱氢酶DNA分子编码氨基酸序列

<400>18

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala

Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val

Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val

Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

Ser Val His Glu Leu Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Cys Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

Gln Ala Gly Arg Gly

<210>19

<211>786

<212>DNA

<213>人工序列

<223>葡萄糖脱氢酶DNA序列

<400>18

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120

aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180

gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240

aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300

tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360

tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420

attaacatgt ccagtgtgca cgaactaatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg ggataaagct gatgacaaag acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540

attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600

gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660

ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720

ggcatcacgt tattcgcgga cggctgtatg acactatatc cttcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

Claims

1.化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）在醋酸乙烯酯的无水乙醇反应器中，加入对苯二酚后滴加甲基亚磷酸二乙酯，进行加成重排反应，反应后在盐酸中水解，得到的产物经减压蒸馏，得到2-（乙氧基-甲基磷酰基）-乙醇；

（2）将步骤（1）得到的2-（乙氧基-甲基磷酰基）-乙醇置于固定床式反应器中，二氧化硅为载体，将氧化铜分散在二氧化硅的载体中，通入氧气进行反应得到2-（乙氧基-甲基磷酰基）-乙醛；

（3）将步骤（2）得到的2-（乙氧基-甲基磷酰基）-乙醛和甘氨酸通入管式反应器中，加入L-苏氨酸缩醛酶、辅酶磷酸吡哆醛、MnCl2，加入缓冲液构成醛缩反应酶转化反应体系，反应完成后经超滤得到4-（甲基羟基磷酰基）-苏氨酸；

（4）将步骤（3）得到的4-（甲基羟基磷酰基）-苏氨酸和L-苏氨酸脱氨酶通入管式反应器中，在缓冲液中进行反应，反应完成后经超滤得到4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸。

2.根据权利要求1所述的化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，步骤（1）中醋酸乙烯酯与甲基亚磷酸二乙酯的摩尔比关系为(1.0～1.3):1；

对苯二酚的添加量为醋酸乙烯酯和甲基亚磷酸二乙酯原料总质量的1/10000~3/10000；

盐酸的质量浓度为20-36%。

3.根据权利要求1所述的化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，步骤（2）中氧气的通入流量为2-4L/h，反应温度控制为50-120℃，反应压力控制为0.05-0.15MPa。

4.根据权利要求1所述的化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，步骤（3）中2-（乙氧基-甲基磷酰基）-乙醛的浓度为100-200g/L；甘氨酸浓度为50-100g/L；L-苏氨酸缩醛酶为甘氨酸质量的2-5%；辅酶磷酸吡哆醛的浓度为50-100μmol/L；MnCl2的浓度为50-100μmol/L；反应体系中，采用0.05-0.3 mol/LTris-HCl控制pH为6-9。

5.根据权利要求4所述的化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的L-苏氨酸缩醛酶为重组酶ScTA，重组酶ScTA氨基酸序列为SEQ ID NO：1，DNA序列为SEQ ID NO：2。

6.根据权利要求5所述的化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，所述的L-苏氨酸缩醛酶替换为L-苏氨酸缩醛酶变体酶N294R，所述的L-苏氨酸缩醛酶变体酶N294R的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

7.根据权利要求1所述的化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的4-（甲基羟基磷酰基）-苏氨酸的浓度为100-300g/L，L-苏氨酸脱氨酶的添加量为4-（甲基羟基磷酰基）-苏氨酸质量的1-3%；反应体系中，采用0.05-0.3 mol/L Tris-HCl控制pH为6-9。

8.根据权利要求6所述的化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，所述的L-苏氨酸脱氨酶为重组酶Kt-TDH，重组酶Kt-TDH的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，DNA序列为SEQ ID NO：5。

9.根据权利要求1所述的化学-酶法制备L-草铵膦的关键中间体4-（甲基羟基磷酰基）-2- 羰基丁酸的方法，其特征在于，步骤（1）中反应温度为0-10℃；步骤（2）中反应温度为50-120℃，压力为0.05-0.15MPa；步骤（3）中反应温度为30-50℃；步骤（4）中反应温度为20-45℃。

10.一种精草铵膦的制备方法，其特征在于，包括根据权利要求1-9任一项所述的方法制备4-（甲基羟基磷酰基）-2-羰基丁酸。