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CN111909907A - 天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化-还原偶联制备精草铵膦中的应用 - Google Patents

天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化-还原偶联制备精草铵膦中的应用 Download PDF

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CN111909907A CN202010649552.0A CN202010649552A CN111909907A CN 111909907 A CN111909907 A CN 111909907A CN 202010649552 A CN202010649552 A CN 202010649552A CN 111909907 A CN111909907 A CN 111909907A
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Abstract

本发明公开了一种天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化‑还原偶联制备精草铵膦中的应用，以D,L‑草铵膦为底物，在有氧环境及过氧化氢酶存在的情况下，利用氨基酸氧化酶突变体或含有氨基酸氧化酶突变体的细胞作为生物催化剂，进行氧化反应，获得L‑草铵膦的前体酮2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸再在草铵膦脱氢酶的作用下，催化生成L‑草铵膦，本发明方法原料转化率和收率高，产物易于分离提纯且手性纯度较高；与其他催化工艺相比，工艺相对简单，转化率高达99％。

Description

天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化-还原偶联制备精 草铵膦中的应用
(一)技术领域
本发明涉及生物化工领域，涉及一种精草铵膦(手性纯L-草铵膦)的生产方法；是一种利用来源于微生物的氨基酸氧化酶生产光学纯L-草铵膦的方法。
(二)技术背景
草铵膦(glufosinate-ammonium)化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。
众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；中国农业部已发布公告说明，百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；全球越来越多国家禁用或限用。而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。
草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。
Figure BDA0002574385020000011
目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。
手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。
手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。
化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。
生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：
(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。
(2)以外消旋草铵膦的前提为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如一种采用α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙氨膦乙酯制备L-草铵膦的方法，该法首先经过3步反应将外消旋的草铵膦合成双丙氨膦二乙酯，接着用碱性mesinterico肽酶将其C端脂基水解。再经α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键。在该步反应中，α-胰凝乳蛋白酶能选择性水解L-双丙氨膦乙酯，生成L-草铵膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解P端酯基得到L-草铵膦。
(3)以α-酮酸(2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)为底物，通过酶的不对称合成获得，主要涉及的酶包括转氨酶与氨基酸氧化酶。早在研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时就已经发现，L-草铵膦在转氨酶的作用下，发生转氨作用被分解成一种α-酮酸(2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，简称PPO)。SchμLz A等(Stereospeciric production orthe herbicide phosphinothricin(glurosinate)by transamination:isolation andcharacterization or a phosphinothricin-speciric transaminase from Escherichiacoli[J].Applied&Environmental Microbiology,1990,56(1):1-6.)在上世纪90年代就利用从大肠杆菌中克隆的转氨酶，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，催化转氨反应生产L-草铵膦。该在转氨酶经固定化并安装至生物反应器，催化制备L-草铵膦，其产物浓度可达76.1g/L，最高产率为50g/(L·h)，L-草铵膦的ee值超过99.9％。但利用转氨酶制备L-草铵膦有两大缺陷，其一是原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸给L-草铵膦的分离带来了很大的麻烦。
(4)以D,L-草铵膦为原料，其中的D-草铵膦经D-氨基酸氧化酶催化得到L-草铵膦前体酮2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，再经草铵膦脱氢酶催化得到L-草铵膦，该方法不仅解决了消旋化的问题，也节约了成本。
D-氨基酸氧化酶是一类特异选择性的将D-氨基酸及其衍生物催化生成α-酮酸的酶，反应由其本身自带的辅酶FAD催化完成，因其表现处的优良催化效率和选择性，D-氨基酸氧化酶被广泛用于生物拆分L-氨基酸和α酮酸的生产。例如，D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸。
氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.-，AADH)是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的酶，其反应需要核苷类辅酶的参与(NAD(P)+)。因其表现出的优良催化效率与选择性，氨基酸脱氢酶被广泛的应用于还原胺化生成天然与非天然α-氨基酸中。前期通过挖掘到的谷氨酸脱氢酶经过改造后催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸生成L-草铵膦具有较高活力，因此命名为草铵膦脱氢酶。
在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线。
发明内容
本发明提供了一种天冬氨酸氧化酶突变体、包含天冬氨酸氧化酶突变体的基因工程菌以及在制备精草铵膦(L-草铵膦)中的应用，该天冬氨酸氧化酶突变体对催化活性进行改造，活力有了较大提升，将突变体进一步的组合，获得高活力菌株，转化率高、收率高、产物易于分离提纯且显著缩短了反应进程。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种天冬氨酸氧化酶突变体，所述天冬氨酸氧化酶突变体是将SEQID NO.2所示氨基酸序列第16、34、50、54、57、58、210、219、312或313位氨基酸进行单突变或多突变获得的。
进一步，优选所述天冬氨酸氧化酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第219位精氨酸突变为赖氨酸且第312位天冬酰胺突变为组氨酸，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明还提供了所述的天冬氨酸氧化酶突变体的编码基因，重组载体及工程菌。所述工程菌是将天冬氨酸氧化酶突变体的编码基因转入pETDuet-1质粒，导入宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)获得的。
本发明还提供了所述天冬氨酸氧化酶突变体在氧化-还原偶联制备L-草铵膦中的应用，所述的应用为：以含天冬氨酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以D,L-草铵膦为底物，加入过氧化氢酶，以pH值7.0-8.0的磷酸缓冲液(20mM)为反应介质构成反应体系，在30℃、通气量1-3L/min、600rpm下进行反应，再加入作为辅助催化剂的含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、葡萄糖和无机氨基供体，在30℃、600rpm下反应完全后，获得含L-草铵膦的反应液，反应液分离纯化，获得L-草铵膦(L-PPT)；所述草铵膦脱氢酶突变体基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示；所述葡萄糖脱氢酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示。所述无机氨基供体为硫酸铵。
进一步，所述催化剂加入量以反应体系体积计为10-30g/L(优选20g/L)；所述底物加入量以反应体系体积计为200-800mM(优选600mM)，所述过氧化氢酶加入量以反应体系体积计为30-50万U/L；辅助催化剂加入量以反应体系体积计为10-30g/L(优选25g/L)，所述葡萄糖加入量以反应体系体积计为100-500mM(优选360mM)，所述无机氨基供体加入量以反应体系体积计为200-1000mM(优选300mM)。
进一步，所述的反应按如下步骤进行：将含天冬氨酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体(优选E.coliBL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H)与过氧化氢酶，D,L-草铵膦和pH＝8.0的磷酸缓冲液混合构成反应体系，在通气量1L/min、30℃、600rpm磁力搅拌转速下反应8h，流加氨水使反应液pH维持在8.0，接着加入含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体(优选E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH)、葡萄糖、硫酸铵，在40℃、600rpm磁力搅拌转速下反应，流加氨水使反应液pH维持在7.5，获得含L-草铵膦的反应液。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含天冬氨酸氧化酶突变体基因的工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，28℃下诱导培养14h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，获得湿菌体。
进一步，所述辅助催化剂按如下方法制备：将含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，22℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PB)洗涤两次，即获得含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌的湿菌体。
本发明以D,L-草铵膦为底物，以所述含天冬氨酸氧化酶突变体基因的工程菌以及过氧化氢酶进行氧化脱氨反应，制备获得草铵膦前体酮2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)；再经转氨酶或草铵膦还原胺化生成L-草铵膦。
本发明产物L-PPT的分离：将含L-草铵膦的反应液通过多次离心方式除去反应混合物中的细胞，每500mL上清液中加入20mL、6M HCl水溶液使蛋白变性并使蛋白失活，然后加入20mL的6M NaOH水溶液中和后，旋蒸浓缩至50mL，将浓缩液以0.5-2BV/h(优选1BV/h)的速度上样001×7Resin弱阳离子交换树脂层析柱(离子交换柱高径比为2-20:1，优选10：1)，以超纯水为洗脱液，以0.5-2BV/h(优选1BV/h)的速度洗脱，根据茚三酮显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，用吹风机吹干，若滤纸上出现紫色，则表示流出液含有L-草铵膦，若无紫色则表示流出液没有L-草铵膦)，收集含L-草铵膦的流出液(茚三酮反应显紫色的一段时间的洗脱液)，并调节pH值至2.0，获得流出液；将流出液以0.5-2BV/h(优选1BV/h)的速度上样001×7Resin阳离子交换树脂(001×7Resin)层析柱(离子交换柱高径比为2-20:1，优选10：1)，以0.5-2BV/h(优选1BV/h)的速度用1-2mol/L NH3·H2O洗脱，收集L-PPT的流出液，在50-65℃下减压浓缩至恒重，用重结晶溶液0-25℃(优选4℃)搅拌析晶，过滤，取晶体冷冻干燥，得到L-PPT晶体，并通过液相及核磁进行分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过定点饱和突变技术，构建获得天冬氨酸氧化酶突变体的基因文库，并从中筛选获得酶活、催化性能和立体选择性均高的天冬氨酸氧化酶突变体；该天冬氨酸氧化酶的突变体活性较野生酶有了较大的提升，最终完全催化300mM D-草铵膦(600mM的D,L-草铵膦)生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸仅需要6小时，反应时间明显缩短，转化率明显提升，时空产率上升至216g·L-1·d-1，是目前文献报道最高水平。本发明也是第一个将天冬氨酸氧化酶用于精草铵膦制备的报道。
(2)本发明提供的制备方法原料转化率高达99.5％、ee值高达99.5％，收率高。
(3)本发明提供的制备方法与化学法等催化工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高，转化率大于99％，且获得的产物易于从反应液中分离提纯。
附图说明
图1为一锅法制备L-草铵膦的反应示意图。
图2为实施例4E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H的反应进程图。
图3为实施例5天冬氨酸氧化酶突变体和草铵膦脱氢酶突变体一锅法制备L-草铵膦的第一步反应进程图。
图4为实施例6天冬氨酸氧化酶突变体和草铵膦脱氢酶突变体一锅法制备L-草铵膦的第一步反应进程图。
图5为实施例7天冬氨酸氧化酶突变体和草铵膦脱氢酶突变体一锅法制备L-草铵膦的第一步反应进程图。
图6为实施例8天冬氨酸氧化酶突变体和草铵膦脱氢酶突变体一锅法制备L-草铵膦的第一步反应进程图。
图7为产物L-PPT的液相检测图。
图8为产物L-PPT核磁分析图，A为1H NMR，B为13C NMR。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒等购自上海生工；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
下游催化工艺所用试剂：D,L-草铵膦、L-草铵膦标准品购自Sigma-Aldrich公司；NADPH购于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
Figure BDA0002574385020000061
下列实施例中高效液相色谱的检测方法如下：
高效液相色谱(HPLC)检测2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)浓度，分析方法为：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：将50mM磷酸二氢胺溶于800mL超纯水中，加入10mL四丁基氢氧化铵(10％)用水稀释并定容至1000mL，用磷酸调pH到3.8，与乙腈以体积比88:12混合。检测波长为232nm，流速：1.0mL/min。柱温：40℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸出峰时间为：9.7min。
D,L-草铵膦的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：
(1)色谱条件：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：50mM乙酸铵溶液：甲醇＝10:1。荧光检测波长：λex＝340nm，λem＝455nm。流速：1mL/min。柱温：30℃，L-草铵膦出峰时间为8.5min，D-草铵膦出峰时间为10.2min。
(2)衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12g N-乙酰-L-半胱氨酸，用10mL乙醇助溶，再加入40mL 0.1moL/L硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。
(3)衍生化反应与测定：取100μL样品加入400μL衍生化试剂，在振荡器上500rpm，30℃震荡5min，再加入400μL超纯水混匀，进样10μL进行HPLC分析。
LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母提取物5g/L，溶剂为水，pH7.4。
LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母提取物5g/L，琼脂18g/L，溶剂为水，pH 7.4。
实施例1表达载体和工程菌的构建
一、重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO
根据基因库中来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的D-天冬氨酸氧化酶基因(NCBI登录号：NP_001370668.1)核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)设计引物，并分别在引物中引入了NcoI和XhoI限制性酶切位点：
上游引物：5’-TATACCATGGCGAACATCATCCCGAAAATC-3’；
下游引物：5’-CTCGAGTTACAGACCCAGCGCGGTTTTAAC-3’；
以pET-28b(+)质粒为表达载体，构建E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO：在上述引物的引发下，以D-天冬氨酸氧化酶基因序列为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得带有酶切位点的D-天冬氨酸氧化酶的基因序列，测序后利用NcoI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET-28b(+)进行连接，构建pET28b-CeDAAO质粒。
感受态细胞的制备：从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coli BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5mL的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养9h；从试管中取200μL菌液，接种到50mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD600至0.4-0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm离心10min；将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，取100μL重悬细胞分装至灭菌的1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱，需要时取出。
D-天冬氨酸氧化酶工程菌的获得：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内加入5μL的pET28b-CeDAAO质粒，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-CeDAAO。
二、重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH。
通过在NCBI数据库中挑选了1株来源于细纹文氏菌(Ventosimonas gracilis)的草铵膦脱氢酶，NCBI登录号为WP_068388615.1，并进行基因合成，氨基酸序列为SEQ IDNO.4所示。
根据核苷酸序列设计引物，并分别在引物中引入了Sac I和NotI限制性酶切位点：
上游引物：5’-GAGCTCATGACTGTATCTGTTGACTCCTT-3’；
下游引物：5’-GCGGCCGCTTAAACCACGCCTTGCTCCA-3’；
以pETDuet-1质粒为表达载体，构建质粒pETDuet-1-VgPPTDH：在上述引物的引发下，以目的基因核酸序列为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得草铵膦脱氢酶的基因序列，测序后利用Sac I和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建质粒pETDuet-1-VgPPTDH。
重组大肠杆菌的获得：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内加入5μL的质粒pETDuet-1-VgPPTDH，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH。
三、葡萄糖脱氢酶和草铵膦脱氢酶重组构建，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH。
为了进一步降低工业化生产成本，构建葡萄糖-葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统，采用一步克隆法将葡萄糖脱氢酶(NCBI登录号：KM817194.1，氨基酸序列SEQ ID NO.6所示，)克隆到表达载体pETDuet-1的第二个多克隆位点上，葡萄糖脱氢酶为NADPH/NADH双作用的脱氢酶。通过一步克隆构建筛选获得含有草铵膦脱氢酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH。
四、定点饱和突变
通过对VgPPTDH进行同源建模与分子对接，选取91、111、115、238、240、241、261位点进行定点饱和突变。以pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH为出发质粒，引物设计如表1所示。
表1引物设计
Figure BDA0002574385020000081
1、高通量筛选方法的建立
配制50mL衍生化试剂：邻苯二甲醛0.013g，N乙酰-L-半胱氨酸0.032g，用pH＝9.8硼酸缓冲液溶解定容到50mL，作为高通量工作液。用pH＝9.8硼酸缓冲液配置1mM外消旋草铵膦溶液50μL与50μL工作液震荡反应30s，再加入100μL ddH2O。
2、高通量筛选
以pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH为出发质粒，构建定点饱和突变文库，将获得的突变体文库转入大肠杆菌E.coLi BL21(DE3)的感受态细胞中，转化条件：将PCR产物加入到感受态细胞中，冰浴30min，热击温度42℃，热击90s，在含有50μg/mL氨苄霉素的LB抗性平板上挑取单克隆，用灭菌的牙签挑取单菌落到灭好菌的96深孔板中，每孔有1mL含有50μg/mL氨苄抗性的LB培养基，在37℃、200rpm摇床上培养8h后，每孔吸取500μL的菌液，转移到另一每孔有500μL的含有终浓度为50μg/mL氨苄和终浓度为24μg/mL IPTG诱导剂的LB培养基的96深孔板中，然后放在22℃、200rpm的摇床上培养16h后，离心，收取菌体于96孔板底。
3、初筛：
配置反应液：终浓度20mM底物PPO(2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)，50mM的硫酸铵和24mM的葡萄糖，以pH7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。96深孔板每孔加入500μL的反应液，同时用移液枪反复吹打，将96孔板收集的菌体重悬，然后将96深孔板放入40℃、200rpm的摇床上反应4小时后，离心取上清，测荧光值，λex＝340nm，λem＝455nm，筛选荧光值高于原始菌株的菌株。
4、复筛：
将初筛获得的菌株培养获得的菌体作为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物。反应体系选择为30mL，催化剂用量以湿菌体重量计25g/L，底物终浓度300mM，葡萄糖终浓度360mM，硫酸铵终浓度500mM，40℃、控制pH为7.5，600转/分钟反应3h取反应液100μL，加5μL盐酸终止反应，以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，稀释后的样品先经过衍生化处理，取200μL稀释后的反应液加400μL衍生化试剂30℃衍生化5min，再加400μL超纯水补足至1mL，12000转/分钟离心1分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品，HPLC检测2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸、L-草铵膦、D-草铵膦及ee值。以产物L-草铵膦和ee(％)值为指标，筛选优势突变体，复筛实验结果示于表2。
表2液相复筛结果
Figure BDA0002574385020000091
对筛选结果进行分析，G91A、Q111S活力提高是因为催化活性的改变，N240K、D261Q突变体活力提高是因为辅酶依赖性的改变，由NADPH依赖性改为NADH/NADPH双依赖性的，VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q活性最高(氨基酸序列SEQ ID NO.5所示)。通过高通量筛选获得含草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶基因的工程菌，即高活力菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH。
实施例2：草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组菌、天冬氨酸氧化酶重组菌的诱导表达
(1)含D-天冬氨酸氧化酶的湿菌体：将实施例1构建的含有D-天冬氨酸氧化酶基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，28℃下诱导培养14h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，获得湿菌体。
(2)含草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶的湿菌体：将实施例2获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，22℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PB)洗涤两次，即获得含草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶基因的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH的湿菌体。
实施例3：天冬氨酸氧化酶基因突变文库的构建及其高通量筛选
通过对CeDAAO进行同源建模与分子对接，选取SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第16、34、50、54、57、58、210、219、312、313位点进行定点饱和突变，引物设计如表3所示。
表3引物设计
Figure BDA0002574385020000101
Figure BDA0002574385020000111
1、高通量筛选方法的建立
草铵膦的结构显示其是一种氨基酸结构，缺乏紫外吸收基团，在紫外检测器下很难被检测到，为了检测L-PPT的浓度以及光学纯度，利用衍生化试剂邻苯二甲醛与N-乙酰-L-半胱氨酸与草铵膦发生衍生化反应，生成具有荧光吸收特性的物质异吲哚，可在荧光检测器下被检测到，可用于高通量筛选方法以及液相检测。
配制50mL衍生化试剂：邻苯二甲醛0.013g，N-乙酰-L-半胱氨酸0.032g，用pH＝9.8硼酸缓冲液溶解定容到50mL，作为高通量工作液。用pH＝9.8硼酸缓冲液配置1mM外消旋草铵膦溶液50μL与50μL工作液震荡反应30s，再加入100μL ddH2O。
2、高通量筛选
以pET28b-CeDAAO为出发质粒，将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第16、34、50、54、57、58、210、219、312、313分别进行单点的定点饱和突变，构建定点饱和突变文库，将获得的突变体文库转入大肠杆菌E.coLi BL21(DE3)的感受态细胞中，转化条件：将PCR产物加入到感受态细胞中，冰浴30min，热击温度42℃，热击90s，在含有50μg/mL卡那霉素的LB抗性平板上挑取单克隆，用灭菌的牙签挑取单菌落到灭好菌的96深孔板中，每孔有1mL含有50μg/mL卡那抗性的LB培养基，在37℃、200rpm摇床上培养8h后，每孔吸取500μL的菌液，转移到另一每孔有500μL的含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和终浓度为24μg/mL IPTG诱导剂的LB培养基的96深孔板中，然后放在28℃、200rpm的摇床上培养12h后，离心，收取菌体于96孔板底。
3、初筛：
配置反应液：终浓度30mM底物D,L-草铵膦，终浓度0.1g/L过氧化氢酶(3000U/mg)，以pH＝8的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。96深孔板每孔加入500μL的反应液，同时用移液枪反复吹打，将96孔板收集的菌体重悬，然后将96深孔板放入30℃、200rpm的摇床上反应4小时后，接着每孔加入终浓度为15g/L实施例2方法制备的的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH湿菌体，终浓度为18mM的葡萄糖，终浓度为20mM的硫酸铵，接着将96深孔板放入40℃、200rpm的摇床上反应0.5小时后离心取上清，测荧光值，λex＝340nm，λem＝455nm，筛选荧光值低于原始菌株的突变体菌株。
4、复筛：
将初筛获得的突变体菌株培养获得的菌体作为催化剂，以D,L-草铵膦为底物。反应体系选择为30mL，以pH＝8的磷酸缓冲液，催化剂用量以湿菌体重量计20g/L，底物终浓度300mM，过氧化氢酶(3000units/mg)终浓度为0.1g/L，通气量80mL/min，30℃、pH为8.0，600转/分钟反应6h，取反应液100μL，加5μL盐酸终止反应，以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，稀释后的样品作为液相样品，HPLC检测2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，复筛实验结果示于表4。
表4液相复筛结果
Figure BDA0002574385020000121
筛选到天冬氨酸氧化酶的第16、54、57、219、312单点突变体活力提高菌株，并将单点突变菌株进行组合突变(2点组合突变、3点组合突变，4点组合突变，5点组合突变)，并通过筛选获得高活力菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H(CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示)，活力较原始菌株有了较大的提升，产物ee值达99％。
实施例4：E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H氧化脱氨制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。
将实施例4构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，28℃下诱导培养14h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，获得湿菌体。
E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H湿菌体添加量为10g，加入终浓度600mM的D,L-草铵膦，过氧化氢酶(3000U/mg)终浓度为0.1g/L，pH＝8.0(20mM)的磷酸缓冲液，构成反应体系500mL，通气量1L/min，在30℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在8.0。通过液相方法检测反应过程中产物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的浓度反应进程曲线如图2所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，8h内反应完成，底物转化率达到98.5％，产物ee值达98％。
实施例5：D-天冬氨酸氨氧化酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H、草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH以D,L-草铵膦为底物，采用一锅法制备L-草铵膦。
本实施例中终浓度均以反应体系体积计。
(1)实施例4方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H湿菌体10g、终浓度为0.1g/L过氧化氢酶(3000U/mg)，终浓度600mM的D,L-草铵膦，与pH＝8.0(20mM)的磷酸缓冲液构成反应体系500mL，通气量1L/min，在30℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在8.0，反应8h后，获得反应液；(2)接着向步骤(1)反应液中加入实施例2方法制备的草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH 12.5g，终浓度360mM的葡萄糖，终浓度300mM的硫酸铵，在40℃、磁力搅拌转速为600rpm下反应3h，流加氨水使反应液pH维持在7.5。通过液相方法检测反应过程中2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的消耗、L-草铵膦的生成和ee值的变化，第二步反应进程曲线如图3所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，第一步反应在8h内完全反应，第二步反应在3h内反应完成，底物D,L-草铵膦转化率达到98.6％，产物ee值达98.2％。
实施例6：D-天冬氨酸氨氧化酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H、草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH以D,L-草铵膦为底物，采用一锅法制备L-草铵膦。
本实施例中终浓度均以反应液体积计。
(1)实施例4方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H湿菌体10g、终浓度为0.1g/L过氧化氢酶(3000U/mg)，终浓度600mM的D,L-草铵膦，以pH＝8.0(20mM)的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系500mL，通气量1.5L/min，在30℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在8.0，反应8h后，获得反应液；(2)向步骤(1)反应液中接着加入实施例2方法制备的草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH12.5g，终浓度360mM的葡萄糖，终浓度300mM的硫酸铵，在40℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应3h，流加氨水使反应液pH维持在7.5。通过液相方法检测反应过程中2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的消耗、L-草铵膦的生成和ee值的变化，第一步反应进程曲线如图4所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，第一步反应在7h内完全反应，第二步反应在3h内反应完成，底物D,L-草铵膦转化率达到98.6％，产物ee值达99％。
实施例7：D-天冬氨酸氨氧化酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H、草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH以D,L-草铵膦为底物，采用一锅法制备L-草铵膦。
本实施例中终浓度均以反应液体积计。
(1)实施例4方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H湿菌体10g、终浓度为0.15g/L过氧化氢酶(3000U/mg)，终浓度600mM的D,L-草铵膦，以pH＝8.0(20mM)的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系500mL，通气量1L/min，在30℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在8.0，反应8h后，获得反应液；(2)接着向步骤(1)反应液中加入实施例2方法制备的草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH12.5g，终浓度360mM的葡萄糖，终浓度300mM的硫酸铵，在40℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应3h，流加氨水使反应液pH维持在7.5。通过液相方法检测反应过程中2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的消耗、L-草铵膦的生成和ee值的变化，第一步反应进程曲线如图5所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，第一步反应在7h内完全反应，第二步反应在3h内反应完成，底物D,L-草铵膦转化率达到98.8％，产物ee值达99％。
实施例8：D-天冬氨酸氨氧化酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H、草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH以D,L-草铵膦为底物，采用一锅法制备L-草铵膦。
本实施例中终浓度均以反应液体积计。
(1)实施例4方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CeDAAO-I16F-R54H-Y57N-R219K-N312H湿菌体10g、终浓度为0.15g/L过氧化氢酶(3000U/mg)，终浓度600mM的D,L-草铵膦，以pH＝8.0(20mM)的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系500mL，通气量1.5L/min，在30℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在8.0，反应8h后，获得反应液；(2)接着向步骤(1)反应液中加入实施例2方法制备的草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH 12.5g，终浓度360mM的葡萄糖，终浓度300mM的硫酸铵，在40℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应3h，流加氨水使反应液pH维持在7.5。通过液相方法检测反应过程中2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的消耗、L-草铵膦的生成和ee值的变化，第一步反应进程曲线如图6所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，第一步反应在6h内完全反应，时空产率上升至216g·L-1·d-1，第二步反应在3h内反应完成，底物D,L-草铵膦转化率达到99％，产物ee值达99.5％。
实施例9：产物L-草铵膦的分离纯化
产物L-PPT的分离：将实施例5步骤(2)反应过后的反应液通过多次离心方式除去反应混合物中的细胞，500mL上清液中加入20mL、6M HCl水溶液使蛋白变性并使蛋白失活，然后加入20mL的6M NaOH水溶液中和后，旋蒸浓缩至50mL，将浓缩液以1BV/h的速度上样001×7Resin弱阳离子交换树脂层析柱(离子交换柱高径比为10:1)，以超纯水为洗脱液，以1BV/h的速度洗脱，根据茚三酮显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，用吹风机吹干，若滤纸上出现紫色，则表示流出液含有L-草铵膦，若无紫色则表示流出液没有L-草铵膦)，收集含L-草铵膦的流出液(茚三酮反应显紫色的一段时间的洗脱液)，并调节pH值至2.0，获得流出液；将流出液以1BV/h的速度上样001×7Resin阳离子交换树脂(001×7Resin)层析柱(离子交换柱高径比为10:1)，以1BV/h的速度用1mol/L NH3·H2O洗脱，收集L-PPT的流出液，在50-65℃下减压浓缩至恒重，用重结晶溶液4℃搅拌析晶，过滤，取晶体冷冻干燥，得到固体L-PPT 49克，并通过液相及核磁进行分析(图7和图8)。图8中A为L-PPT的H谱数据(500MHz,D2O):δ3.93(s,1H),2.08(d,J＝8.0Hz,2H),1.86–1.46(m,2H),1.34(d,J＝13.5Hz,3H).图8中B为L-PPT的C谱数据:(126MHz,D2O)δ172.60,54.00,26.08,23.42,14.25。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化-还原偶联制备精草铵膦中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1005
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atggcgaaca tcatcccgaa aatcgcgatc atcggtgaag gtgttatcgg ttgcacctct 60
gcgctgcaga tctctaaagc gatcccgaac gcgaaaatca ccgttctgca cgacaaaccg 120
ttcaaaaaat cttgctctgc gggtccggcg ggtctgttcc gtatcgacta cgaagaaaac 180
accgaatacg gtcgtgcgtc tttcgcgtgg ttctctcacc tgtaccgtac caccaaaggt 240
tctgaaaccg gtgttaaact ggtttctggt cacatccagt ctgacaacct ggaatctctg 300
aaacagcagc agcgtgcgta cggtgacatc gtttacaact tccgtttcct ggacgaccgt 360
gaacgtctgg acatcttccc ggaaccgtct aaacactgca tccactacac cgcgtacgcg 420
tctgaaggta acaaatacgt tccgtacctg aaaaacctgc tgctggaaca gaaaatcgaa 480
ttcaaacagc aggaagttac ctctctggac gcggttgcgg acgcgggtta cgacgttatc 540
gttaactgcg cgggtctgta cggtggtaaa ctggcgggtg acgacgacac ctgctacccg 600
atccgtggtg ttatcctgga agttgacgcg ccgtggcaca aacacttcaa ctaccgtgac 660
ttcaccacct tcaccatccc gaaagaacac tctgttgttg ttggttctac caaacaggac 720
aaccgttggg acctggaaat caccgacgaa gaccgtaacg acatcctgaa acgttacatc 780
gcgctgcacc cgggtatgcg tgaaccgaaa atcatcaaag aatggtctgc gctgcgtccg 840
ggtcgtaaac acgttcgtat cgaagcgcag aaacgtacct ctgttggtaa ctctaaagac 900
tacatggttg ttcaccacta cggtcacggt tctaacggtt tcaccctggg ttggggtacc 960
gcgatcgaag cgaccaaact ggttaaaacc gcgctgggtc tgtaa 1005
<210> 2
<211> 334
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
Met Ala Asn Ile Ile Pro Lys Ile Ala Ile Ile Gly Glu Gly Val Ile
1 5 10 15
Gly Cys Thr Ser Ala Leu Gln Ile Ser Lys Ala Ile Pro Asn Ala Lys
20 25 30
Ile Thr Val Leu His Asp Lys Pro Phe Lys Lys Ser Cys Ser Ala Gly
35 40 45
Pro Ala Gly Leu Phe Arg Ile Asp Tyr Glu Glu Asn Thr Glu Tyr Gly
50 55 60
Arg Ala Ser Phe Ala Trp Phe Ser His Leu Tyr Arg Thr Thr Lys Gly
65 70 75 80
Ser Glu Thr Gly Val Lys Leu Val Ser Gly His Ile Gln Ser Asp Asn
85 90 95
Leu Glu Ser Leu Lys Gln Gln Gln Arg Ala Tyr Gly Asp Ile Val Tyr
100 105 110
Asn Phe Arg Phe Leu Asp Asp Arg Glu Arg Leu Asp Ile Phe Pro Glu
115 120 125
Pro Ser Lys His Cys Ile His Tyr Thr Ala Tyr Ala Ser Glu Gly Asn
130 135 140
Lys Tyr Val Pro Tyr Leu Lys Asn Leu Leu Leu Glu Gln Lys Ile Glu
145 150 155 160
Phe Lys Gln Gln Glu Val Thr Ser Leu Asp Ala Val Ala Asp Ala Gly
165 170 175
Tyr Asp Val Ile Val Asn Cys Ala Gly Leu Tyr Gly Gly Lys Leu Ala
180 185 190
Gly Asp Asp Asp Thr Cys Tyr Pro Ile Arg Gly Val Ile Leu Glu Val
195 200 205
Asp Ala Pro Trp His Lys His Phe Asn Tyr Arg Asp Phe Thr Thr Phe
210 215 220
Thr Ile Pro Lys Glu His Ser Val Val Val Gly Ser Thr Lys Gln Asp
225 230 235 240
Asn Arg Trp Asp Leu Glu Ile Thr Asp Glu Asp Arg Asn Asp Ile Leu
245 250 255
Lys Arg Tyr Ile Ala Leu His Pro Gly Met Arg Glu Pro Lys Ile Ile
260 265 270
Lys Glu Trp Ser Ala Leu Arg Pro Gly Arg Lys His Val Arg Ile Glu
275 280 285
Ala Gln Lys Arg Thr Ser Val Gly Asn Ser Lys Asp Tyr Met Val Val
290 295 300
His His Tyr Gly His Gly Ser Asn Gly Phe Thr Leu Gly Trp Gly Thr
305 310 315 320
Ala Ile Glu Ala Thr Lys Leu Val Lys Thr Ala Leu Gly Leu
325 330
<210> 3
<211> 334
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
Met Ala Asn Ile Ile Pro Lys Ile Ala Ile Ile Gly Glu Gly Val Phe
1 5 10 15
Gly Cys Thr Ser Ala Leu Gln Ile Ser Lys Ala Ile Pro Asn Ala Lys
20 25 30
Ile Thr Val Leu His Asp Lys Pro Phe Lys Lys Ser Cys Ser Ala Gly
35 40 45
Pro Ala Gly Leu Phe His Ile Asp Asn Glu Glu Asn Thr Glu Tyr Gly
50 55 60
Arg Ala Ser Phe Ala Trp Phe Ser His Leu Tyr Arg Thr Thr Lys Gly
65 70 75 80
Ser Glu Thr Gly Val Lys Leu Val Ser Gly His Ile Gln Ser Asp Asn
85 90 95
Leu Glu Ser Leu Lys Gln Gln Gln Arg Ala Tyr Gly Asp Ile Val Tyr
100 105 110
Asn Phe Arg Phe Leu Asp Asp Arg Glu Arg Leu Asp Ile Phe Pro Glu
115 120 125
Pro Ser Lys His Cys Ile His Tyr Thr Ala Tyr Ala Ser Glu Gly Asn
130 135 140
Lys Tyr Val Pro Tyr Leu Lys Asn Leu Leu Leu Glu Gln Lys Ile Glu
145 150 155 160
Phe Lys Gln Gln Glu Val Thr Ser Leu Asp Ala Val Ala Asp Ala Gly
165 170 175
Tyr Asp Val Ile Val Asn Cys Ala Gly Leu Tyr Gly Gly Lys Leu Ala
180 185 190
Gly Asp Asp Asp Thr Cys Tyr Pro Ile Arg Gly Val Ile Leu Glu Val
195 200 205
Asp Ala Pro Trp His Lys His Phe Asn Tyr Lys Asp Phe Thr Thr Phe
210 215 220
Thr Ile Pro Lys Glu His Ser Val Val Val Gly Ser Thr Lys Gln Asp
225 230 235 240
Asn Arg Trp Asp Leu Glu Ile Thr Asp Glu Asp Arg Asn Asp Ile Leu
245 250 255
Lys Arg Tyr Ile Ala Leu His Pro Gly Met Arg Glu Pro Lys Ile Ile
260 265 270
Lys Glu Trp Ser Ala Leu Arg Pro Gly Arg Lys His Val Arg Ile Glu
275 280 285
Ala Gln Lys Arg Thr Ser Val Gly Asn Ser Lys Asp Tyr Met Val Val
290 295 300
His His Tyr Gly His Gly Ser His Gly Phe Thr Leu Gly Trp Gly Thr
305 310 315 320
Ala Ile Glu Ala Thr Lys Leu Val Lys Thr Ala Leu Gly Leu
325 330
<210> 4
<211> 445
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Met Thr Val Ser Val Asp Ser Phe Leu Ala Arg Ile Lys Gln Arg Asp
1 5 10 15
Pro His Gln Thr Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser
20 25 30
Leu Trp Pro Phe Leu Gln Asp Asn Pro His Tyr Ala Lys Ala Gly Ile
35 40 45
Leu Glu Arg Leu Val Glu Pro Glu Arg Ala Ile Gln Phe Arg Val Pro
50 55 60
Trp Val Asp Asp Gln Gly Val Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His
85 90 95
Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val
100 105 110
Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly
115 120 125
Ala Asp Phe Asn Pro Lys Gly Lys Ser Asp Gly Glu Val Met Arg Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asn Leu
145 150 155 160
Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr
165 170 175
Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Glu Phe Ala Ser Val Leu
180 185 190
Thr Gly Lys Gly Leu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala
195 200 205
Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Lys
210 215 220
Gln Leu Gly Phe Glu Gly Lys Lys Val Cys Ile Ser Gly Ser Gly Asn
225 230 235 240
Val Ser Gln Tyr Ala Ala Gln Lys Val Met Glu Leu Gly Gly Arg Val
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Asp Ser Gln Gly Thr Leu Val Ile Glu Ala Gly Leu
260 265 270
Asp Gln Glu Gln Trp His Tyr Leu Met Asp Leu Lys Asn Arg Arg Arg
275 280 285
Gly Arg Ile Arg Glu Met Ala Glu His Phe Ala Leu Pro Phe Leu Glu
290 295 300
Gly Gln Thr Pro Trp His Leu Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala
305 310 315 320
Thr Gln Asn Glu Leu Ser Ser Glu Asp Ala Arg Thr Leu Leu Lys Asn
325 330 335
Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ala Thr Leu Glu
340 345 350
Ala Val Glu Val Phe Ile Glu Ala Gly Thr Leu Tyr Ala Pro Gly Lys
355 360 365
Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln
370 375 380
Asn Ala Met Arg Leu His Trp Ser Gly Gly Glu Val Asp Glu Lys Leu
385 390 395 400
His Asn Ile Met Gln Asn Ile His Gln Ala Cys Val Arg Tyr Gly Glu
405 410 415
Glu Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe
420 425 430
Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Glu Gln Gly Val Val
435 440 445
<210> 5
<211> 445
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
Met Thr Val Ser Val Asp Ser Phe Leu Ala Arg Ile Lys Gln Arg Asp
1 5 10 15
Pro His Gln Thr Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser
20 25 30
Leu Trp Pro Phe Leu Gln Asp Asn Pro His Tyr Ala Lys Ala Gly Ile
35 40 45
Leu Glu Arg Leu Val Glu Pro Glu Arg Ala Ile Gln Phe Arg Val Pro
50 55 60
Trp Val Asp Asp Gln Gly Val Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Ala Gly Leu Arg Phe His
85 90 95
Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Ser Val
100 105 110
Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly
115 120 125
Ala Asp Phe Asn Pro Lys Gly Lys Ser Asp Gly Glu Val Met Arg Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asn Leu
145 150 155 160
Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr
165 170 175
Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Glu Phe Ala Ser Val Leu
180 185 190
Thr Gly Lys Gly Leu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala
195 200 205
Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Lys
210 215 220
Gln Leu Gly Phe Glu Gly Lys Lys Val Cys Ile Ser Gly Ser Gly Lys
225 230 235 240
Val Ser Gln Tyr Ala Ala Gln Lys Val Met Glu Leu Gly Gly Arg Val
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Gln Ser Gln Gly Thr Leu Val Ile Glu Ala Gly Leu
260 265 270
Asp Gln Glu Gln Trp His Tyr Leu Met Asp Leu Lys Asn Arg Arg Arg
275 280 285
Gly Arg Ile Arg Glu Met Ala Glu His Phe Ala Leu Pro Phe Leu Glu
290 295 300
Gly Gln Thr Pro Trp His Leu Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala
305 310 315 320
Thr Gln Asn Glu Leu Ser Ser Glu Asp Ala Arg Thr Leu Leu Lys Asn
325 330 335
Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ala Thr Leu Glu
340 345 350
Ala Val Glu Val Phe Ile Glu Ala Gly Thr Leu Tyr Ala Pro Gly Lys
355 360 365
Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln
370 375 380
Asn Ala Met Arg Leu His Trp Ser Gly Gly Glu Val Asp Glu Lys Leu
385 390 395 400
His Asn Ile Met Gln Asn Ile His Gln Ala Cys Val Arg Tyr Gly Glu
405 410 415
Glu Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe
420 425 430
Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Glu Gln Gly Val Val
435 440 445
<210> 6
<211> 262
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly
20 25 30
Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys
35 40 45
Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln
50 55 60
Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr
65 70 75 80
Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val
85 90 95
Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys
100 105 110
Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala
115 120 125
Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met
130 135 140
Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala
145 150 155 160
Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu
165 170 175
Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile
180 185 190
Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala
195 200 205
Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu
210 215 220
Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser
245 250 255
Phe Gln Ala Gly Arg Gly
260

Claims (10)

1.一种天冬氨酸氧化酶突变体，其特征在于所述天冬氨酸氧化酶突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第16、34、50、54、57、58、210、219、312或313位氨基酸进行单突变或多突变获得的。
2.如权利要求1所述天冬氨酸氧化酶突变体，其特征在于所述氨基酸氧化酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第219位精氨酸突变为赖氨酸且第312位天冬酰胺突变为组氨酸。
3.一种权利要求1所述天冬氨酸氧化酶突变体在氧化-还原偶联制备L-草铵膦中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含天冬氨酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以D,L-草铵膦为底物，加入过氧化氢酶，以pH值7.0-8.0的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃、通气量1-3L/min、600rpm下进行反应，再加入作为辅助催化剂的含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、葡萄糖和无机氨基供体，在30℃、600rpm下反应完全后，获得含L-草铵膦的反应液，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述草铵膦脱氢酶突变体基因编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示；所述葡萄糖脱氢酶基因编码蛋白氨基酸序列为SEQID NO.6所示。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述无机氨基供体为硫酸铵。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述催化剂加入量以反应体系体积计为10-30g/L；所述底物加入量以反应体系体积计为200-800mM，所述过氧化氢酶加入量以反应体系体积计为30-50万U/L。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述辅助催化剂加入量以反应体系体积计为10-30g/L，所述葡萄糖加入量以反应体系体积计为100-500mM，所述无机氨基供体加入量以反应体系体积计为200-1000mM；所述无机氨基供体加入量以反应体系体积计为200-1000mM。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的反应按如下步骤进行：将含氨基酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体与过氧化氢酶，D,L-草铵膦和pH＝8.0的磷酸缓冲液混合，在通气量1L/min、30℃、600rpm磁力搅拌转速下反应8h，流加氨水使反应液pH维持在8.0，接着加入含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、葡萄糖、硫酸铵，在40℃、600rpm磁力搅拌转速下反应，流加氨水使反应液pH维持在7.5，获得含L-草铵膦的反应液。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含氨基酸氧化酶突变体基因的工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，28℃下诱导培养14h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，获得湿菌体。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述辅助催化剂按如下方法制备：将含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，22℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，即获得含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌的湿菌体。
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