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CN111088206A - 一种酶法生产d-泛酸的方法 - Google Patents

一种酶法生产d-泛酸的方法 Download PDF

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CN111088206A
CN111088206A CN202010012725.8A CN202010012725A CN111088206A CN 111088206 A CN111088206 A CN 111088206A CN 202010012725 A CN202010012725 A CN 202010012725A CN 111088206 A CN111088206 A CN 111088206A
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CN
China
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pantothenic acid
fermentation
recombinant
acid
alanine
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CN202010012725.8A
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刘立明
马玉玉
刘佳
宋伟
高聪
罗秋玲
陈修来
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Jiangnan University
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Jiangnan University
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Publication date
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Abstract

本发明涉及一种酶法生产D‑泛酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明是使用来源于藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的泛酸合成酶在大肠杆菌中的异源表达，并且以此重组菌株边发酵边转化D‑泛解酸和β‑丙氨酸生产D‑泛酸，与现有的技术相比，本发明采用的方法，反应条件温和，对设备要求低，边发酵边转化52h，产量能达到52.1g/L，摩尔转化率为70.6％。转化体系简单使得下游纯化简易，极大的降低了生产成本，能够满足工业化需求。

Description

一种酶法生产D-泛酸的方法
技术领域
本发明涉及一种酶法生产D-泛酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
泛酸又称维生素B5，是一种水溶性维生素。由泛解酸和β-丙氨酸经酶催化缩合而成，具有旋光性，仅D型有生物活性。纯游离泛酸是一种黄色粘稠油状物，有酸性，易溶于水和乙醇，不溶于苯及氯仿。泛酸在酸、碱以及光、热条件下都不能稳定存在。泛酸具有制造抗体的功能，在维护头发、皮肤以及血液健康方面都有着重要的作用。一般是参加体内能量的制造，并且可以控制脂肪的新陈代谢，是大脑和神经的必需营养物质。泛酸目前广泛用于制药行业，食品工业，化妆品，并且广泛用作饲料添加剂。
目前市场上对泛酸及其盐类的生产多采用两种方法，第一种是方法是诱导结晶法，此方法利用混旋泛酸钙溶解度比D-型或L-型都大这一特点采用诱导结晶法。第二种是化学拆分法，其缺点是拆分剂价格过高，分离困难，还存在毒性和环境污染问题。D-泛解酸与β-丙氨酸需要在腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的辅助下进行反应生成D-泛酸。
本发明旨在通过异源表达一种泛酸合成酶用于转化生产D-泛酸，这种转化条件温和，对设备要求低，只需一步反应，简便快捷，效率高。边发酵边转化的过程中不需要额外添加ATP，降低了成本，减轻了对环境的污染。反应具有高选择性，产品纯度高，方便后期的分离与纯化，有利于大规模工业化生产。
发明内容
本发明找到了一种泛酸合成酶并且能在异源宿主中高效表达，进而通过边发酵边转化方法使D-泛解酸和β-丙氨酸反应生成D-泛酸。
本发明提供了一种高产D-泛酸的重组菌，所述重组菌表达了来源于藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的泛酸合成酶，编码所述泛酸合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种高产D-泛酸的基因工程菌的构建方法，所述方法是以E.coliBL21(DE3)为宿主，以pET-28a(+)为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建方法是化学合成核苷酸如SEQ ID NO.1所示的目的泛酸合成酶基因PS，将获得的泛酸合成酶基因PS连接到表达载体pET-28a(+)中得到重组质粒，将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，在含有卡那抗性的平板上筛选得到阳性转化子。
本发明提供了一种生产高酶活泛酸合成酶的方法，所述方法是以所述重组菌为发酵菌株进行产酶。
在本发明的一种实施方式中，将所述重组菌接种至种子培养基中，在30～40℃、150～250r/min过夜培养。
在本发明的一种实施方式中，将过夜培养后的重组菌以10～30mL/L的接种量转接到发酵培养基，在30～40℃中以150～250rpm培养至OD600为0.6～0.8后，加入IPTG在20～30℃下诱导10～14h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基中含有Yeast Extract 5g/L，Tryptone 10g/L，NaCl 10g/L，所述发酵培养基中含有：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 9g/L，NaCO3 2g/L，KH2PO4 6.67g/L，(NH4)2HPO4 4g/L，MgSO4.7H2O 0.8g/L，柠檬酸0.8g/L，酵母粉2g/L，NaHCO3 2g/L，微量金属溶液5mL/L。其中金属离子液的成分为：FeSO4·7H2O 10g/L，CaCl2 2g/L，ZnSO4·7H2O 2.2g/L，MnSO4·4H2O 0.5g/L，CuSO4.5H2O 1g/L，NaMoO4.H2O0.5g/L，NaB4O7.H2O 0.02g/L，HCl 5M。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基中还含有90～110μmol/L卡那抗性。
在本发明的一种实施方式中，所述IPTG的终浓度为0.3～0.5mM。
本发明提供了一种提高D-泛酸产量的生产方法，所述方法是以所述基因工程菌为生产菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将所述基因工程菌按照100～150mL/L的接种量接种于发酵培养基，通气量2.0～5.0vvm，温度28～35℃，搅拌速率400～700rpm；当培养基中葡萄糖浓度低于5g/L时，开始添加补料培养基，控制培养基中葡萄糖浓度为0.3～2g/L；当培养至OD600在10～40时，加入0.1～0.3g/L IPTG诱导泛酸合成酶的表达，并同时向罐内投入D-泛解酸和β-丙氨酸作为底物，进行边发酵边转化，总共发酵50～54h后结束发酵，发酵过程中通过补加氨水控制pH在6.0～8.0。
在本发明的一种实施方式中，所述OD600浓度优选为18～22。
在本发明的一种实施方式中，所述D-泛解酸和β-丙氨酸的浓度分别为30～70g/L和10～50g/L，优选浓度分别为45～55g/L和15～25g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述IPTG的诱导在30℃～40℃进行，优选为33～37℃。
本发明提供了一种所述重组菌制备的催化剂，所述催化剂应用于泛酸合成。
本发明提供了一种所述重组菌在食品、化工领域及医药领域制备泛酸中的应用。
本发明提供了一种提高D-泛酸产量的生产方法在食品、化工领域及医药领域制备泛酸中的应用。
本发明的有益效果：本发明是使用来源于藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的泛酸合成酶在大肠杆菌中的异源表达，并且以此重组菌株边发酵边转化D-泛解酸和β-丙氨酸生产D-泛酸，与现有的技术相比，本发明采用的方法，反应条件温和，对设备要求低，反应52h，产量能达到52.1g/L，摩尔转化率为70.6％。转化体系简单使得下游纯化简易，极大的降低了生产成本，能够满足工业化需求。
附图说明
图1为边发酵边转化优化结果图，a为D-泛解酸浓度对转化的影响，b为β-丙氨酸浓度对转化的影响，c为底物投入时OD600对转化的影响，d为诱导温度对转化的影响。
图2为反应过程中随时间变化产量的变化，注：箭头表示底物投入时间。
具体实施方式
下述实验都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。
样品预处理：取发酵得到的转化液1mL于12000rpm离心10min收集上清液，并以泛解酸钠0.1g和泛酸钙0.1g作为标准品，配制成浓度为1g/L的标准溶液。将稀释100倍后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法检测。
D-泛酸含量的测定：高效液相色谱法，流动相成分：95％50mM NH4H2PO4缓冲液(用磷酸调pH至3.0)和5％乙腈，流速0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：25℃色谱柱：E clipseXDB-C18 Column(5μm，4.6×250mm)；检测器：紫外检测器，波长为210nm。
生产D-泛酸的发酵培养基组分：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 9g/L，NaCO3 2g/L，KH2PO46.67g/L，(NH4)2HPO4 4g/L，MgSO4.7H2O 0.8g/L，柠檬酸0.8g/L，酵母粉2g/L，NaHCO3 2g/L，微量金属溶液5mL/L。其中金属离子液的成分为：FeSO4·7H2O 10g/L，CaCl2 2g/L，ZnSO4·7H2O 2.2g/L，MnSO4·4H2O 0.5g/L，CuSO4.5H2O 1g/L，NaMoO4.H2O 0.5g/L，NaB4O7.H2O0.02g/L，HCl 5M。
补料培养基的成分为：葡萄糖400～700g/L，(NH4)2HPO4 70～90g/L，MgSO4·7H2O 6～10g/L。
配制LB培养基：在1L去离子水中加入10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl，用1mol/L NaOH调节pH至7.4，高压下蒸汽灭菌20min。
实施例1：泛酸合成酶重组质粒的构建
化学合成核苷酸如SEQ ID NO.1所示的目的泛酸合成酶基因PS。
PCR扩增反应体系为：PrimerSTAR酶0.5μL、5×PrimerSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL两条引物各1μL、，模板(泛酸合成酶基因PS)4μL、水32.5μL。
表达载体pET-28a(+)酶切体系为：BamH I和EcoR I酶各1μL、质粒8μL、Buffer 2μL，ddH2O 8μL反应条件为：37℃、3h。
酶切产物和PCR产物经过回收(采用购自于上海生物工程公司的胶回收试剂盒)后，将PCR产物与酶切后的表达载体pET-28a(+)相连接，构建获得重组质粒pET-28a-ps，酶切体系为：BamH I和EcoR I酶各1μL、质粒8μL、Buffer 2μL，ddH2O 8μL反应条件为：37℃、3h。
实施例2：重组大肠杆菌的构建
将实施例1中得到的重组质粒pET-28a-ps通过化学转化法转入克隆宿主E.coliJM109，化学转化法具体步骤：
(1)将10μl同源重组产物导入100μl JM109感受态；
(2)冰浴15-20min；
(3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；
(4)加入800μl无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1-2h；
(5)5000rpm离心2min收菌；
(6)移去上清，剩余100-200μl吹吸混匀涂布至添加卡那抗性平板上。
将转化后的菌液涂布于含100μmol/L卡那抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取在LB卡那抗性平板上生长的单菌落，利用T7通用引物进行菌落PCR验证，然后挑选阳性转化子接种于含卡那抗性的液体LB培养基中，37℃培养12h，后提取质粒，双酶切验证正确后送去测序，序列正确的通过化学转化方法转化表达宿主E.coli BL21(DE3)，具体步骤参照本实施例中上述化学转化法具体步骤。
将转化得到的E.coli BL21(DE3)涂布于含100μmol/L卡那抗性的平板，于37℃培养12h，获得单菌落。
实施例3：重组大肠杆菌诱导表达泛酸合成酶
从实施例2中重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的平板上挑取单菌落，接种到含100μmol/L卡那抗性的LB种子培养基中，37℃、200r/min过夜培养，以2％(v/v)的接种量转接到100mL含100μmol/L卡那抗性的发酵培养基，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，25℃下诱导12h后收集菌体用于酶活测定。
酶的纯化方法：步骤参照碧云天His标签蛋白纯化试剂盒操作手册。
(1)标准活性测定混合物包含：0.83μg纯化后的泛酸合成酶，50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，25mM D-泛解酸钠盐，25mM β-丙氨酸，4.5mM ATP，10mM MgCl2，15mM KCl，总体积1.1mL。
(2)加入泛酸合成酶开始反应，37℃下培养20min，随后添加1N HCl和1N NaOH停止反应。
酶活测定方法为：步骤参照Tigu F等《Tigu F,Zhang J L,Liu G X,et al.Ahighly active pantothenate synthetase from Corynebacterium glutamicum enablesthe production of D-pantothenic acid with high productivity》(公开日2018年)。
酶活定义：一个单位的酶活为在37℃条件下每分钟催化形成1μmol D-泛酸的酶量。
测定结果为，泛酸合成酶酶活为946.5U/g。
实施例4：重组大肠杆菌边发酵边转化生产D-泛酸条件的优化
从实施例2中重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的平板上挑取单菌落，接种到含100μmol/L卡那抗性的LB种子培养基中，37℃、200r/min过夜培养，以2％(v/v)的接种量转接到100mL含100μmol/L卡那抗性的发酵培养基，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8。
在5L发酵罐中进行发酵，装液量为2L。将上述OD600为0.6～0.8的重组菌按照10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，通气量4.0vvm，温度30℃，搅拌速率500～600rpm，此时设定溶氧为100％。当培养基中葡萄糖浓度低于5g/L时，开始添加补料培养基，控制培养基中葡萄糖浓度为0.5～1.5g/L，当培养至OD600在15～25时，加入终浓度为0.1～0.3g/L IPTG诱导泛酸合成酶的表达。
(1)发酵底物浓度的优化
在加入IPTG进行诱导的同时，向罐内投入D-泛解酸和β-丙氨酸作为底物，对D-泛解酸和β-丙氨酸的最适终浓度进行探究。
①将D-泛解酸的终浓度控制为80g/L，调节β-丙氨酸的终浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L，发酵过程中通过补加氨水控制pH在6.5～7.5。
在30℃边发酵边转化总共发酵52h，发酵结束后测定D-泛酸产量并计算转化率，结果如表1所示，可见β-丙氨酸的终浓度在30g/L时，D-泛酸产量可达24.9g/L、转化率可达33.7％。
转化率计算公式为：
Figure BDA0002357740080000051
或
Figure BDA0002357740080000052
C1为D-泛酸浓度，C2为β-丙氨酸浓度或D-泛解酸浓度，D-泛酸分子量为219.23，β-丙氨酸分子量为89.09，D-泛解酸分子量为148，β-丙氨酸与D-泛解酸在反应中是以摩尔比1:1的量进行反应，故在计算转化率时根据β-丙氨酸与D-泛解酸实际的用量来选择摩尔数较低的物质量进行计算。
表1不同β-丙氨酸浓度下D-泛酸产量及转化率
Figure BDA0002357740080000053
②将β-丙氨酸的终浓度控制为30g/L，调节D-泛解酸的终浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L，发酵过程中通过补加氨水控制pH在6.5～7.5。
在30℃边发酵边转化总共发酵52h，发酵结束后测定D-泛酸产量并计算转化率，结果如表2所示，可见D-泛解酸的终浓度在50g/L时，D-泛酸产量可达30.4g/L，转化率为41.2％。
表2不同D-泛解酸浓度下D-泛酸产量及转化率
Figure BDA0002357740080000063
(2)发酵菌体浓度的优化
以底物浓度D-泛解酸50g/L，β-丙氨酸30g/L时，分别在不同菌体浓度(OD600分别为10，15，20，25，30，35，40)条件下投入底物，边发酵边转化52h，考察底物投入时菌体浓度对产量的影响，最优底物投入时菌体OD600为20，D-泛酸产量为50.1g/L，转化率为67.9％。
表3不同菌体浓度下D-泛酸产量及转化率
Figure BDA0002357740080000061
实施例5：重组大肠杆菌边发酵边转化生产D-泛酸过程中诱导温度的优化
从实施例2中重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的平板上挑取单菌落，接种到含100μmol/L卡那抗性的LB种子培养基中，37℃、200r/min过夜培养，以2％(v/v)的接种量转接到100mL含100μmol/L卡那抗性的发酵培养基，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8。
初始装生产D-泛酸的发酵培养基1.35L，温度30℃，将上述OD600为0.6～0.8的重组菌按照10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，整个发酵过程中控制pH为7.0，搅拌转速550rpm，通气量2vvm，当培养基中葡萄糖浓度低于5～8g/L时，开始添加补料培养基，控制培养基中葡萄糖浓度为0.5～1.5g/L，发酵至OD600达到20后投入终浓度为0.1g/L IPTG诱导酶的表达，并在反应过程中处于持续诱导状态，同时对酶的诱导温度进行控制(调节诱导温度分别为25℃，28℃，30℃，35℃，37℃)，研究不同诱导温度对产量的影响，最佳诱导温度为35℃，D-泛酸产量为52.1g/L，转化率为70.6％。
表4不同诱导温度下D-泛酸产量及转化率
Figure BDA0002357740080000062
对比例1
具体实施步骤参照实施例3，区别在于，将实施例3中的重组菌替换为帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)来源的泛酸合成酶重组菌，测定其酶活为521.4U/g。
对比例2
具体实施步骤参照实施例4和5，区别在于，将实施例4中的重组菌替换为使用帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)来源、黄色考克氏菌(Kocuria flava)来源和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)来源的泛酸合成酶构建的重组菌，在菌的OD600为20时加入，使其在D-泛解酸50g/L和β-丙氨酸30g/L、诱导温度为30℃时，进行发酵转化，测定D-泛酸产量和转化率，结果见表5。
表5不同菌株的D-泛酸产量及转化率
Figure BDA0002357740080000071
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种酶法生产D-泛酸的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1032
<212> DNA
<213> Micrococcus luteus
<400> 1
atgacccctc tcgaccgcgt ccccgaccag cgtcccgtcc ccgccggcac cggcctcacc 60
ctcgaggacg ccctccccgc tcccgtggag tccgaggccg acggcgtctc cgcgcgcccg 120
cgtctggccc ggaccgtcgc cgagatgcgc tcggctctcc gtgagctcgt cgcccatgcc 180
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cgcaacaccc gcctggacgc cgcgggcctg gaacacgcgc tcgtcctcag ccgcgccctg 780
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ttcgccgagc tcggtccgga gctgctgtgc cagccgctgc gccgcgaggc cctcgccctc 960
gtggccgcgc acgtgccgcc cgtccggttg atcgacacca tggtgctgcc cgccgcgggg 1020
ccgctgccgt ga 1032

Claims (10)

1.一种产D-泛酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达泛酸合成酶。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，编码所述泛酸合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种高产D-泛酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的基因连接到表达载体pET-28a(+)中得到重组质粒，将重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)。
4.一种生产高酶活泛酸合成酶的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述重组菌为发酵菌株进行发酵产酶。
5.一种提高泛酸合成酶生产D-泛酸的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述重组菌添加至含有D-泛解酸和β-丙氨酸的反应液进行反应，得到D-泛酸发酵液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为：将所述重组菌按照体积比为10～15％的接种量接种于发酵培养基，通气量2.0～5.0vvm，温度28～35℃，搅拌速率400～700rpm；当培养基中葡萄糖浓度低于5～8g/L时，补料控制培养基中葡萄糖浓度为0.3～2g/L；当培养至OD600在10～40时，加入IPTG、D-泛解酸和β-丙氨酸继续进行诱导培养，得到发酵液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵时间不低于50h，发酵过程中控制pH在6.0～8.0。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述IPTG、D-泛解酸和β-丙氨酸的终浓度分别为0.1～0.3g/L、30～70g/L和10～50g/L，诱导培养的温度30℃～40℃。
9.一种用于生产D-泛酸的催化剂，其特征在于，含有权利要求1所述重组菌。
10.权利要求1所述重组菌、权利要求4～8任一所述方法和权利要求9所述催化剂在制备D-泛酸中的应用。
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