CN103936816A - 一种模拟移动床色谱从丹参粗提物中提纯丹参酮iia的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种模拟移动床色谱从丹参粗提物中提纯丹参酮IIA的方法。该方法设置SMBC的基本区带为洗脱带、精制带和吸附带，洗脱带独立，以十八烷基硅烷键合硅胶ODS为固定相，乙醇与水的混合溶液为流动相，进行SMBC分离，从萃余液出口除去各种前杂质；从萃取液出口得到丹参酮IIA萃取液，经浓缩、水沉醇溶处理后得到纯度为98.5%丹参酮IIA产品。本发明能够用SMBC规模化、稳健和连续高效地从丹参的乙醇提取液中提纯丹参酮IIA，萃取液中丹参酮IIA最高回收率达到99.2%，HPLC纯度达到95%，固定相和流动相能反复利用，降低成本，属于绿色环保分离过程。
Description
技术领域
本发明涉及天然植物有效组分的提纯方法，尤其是一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的的方法。
背景技术
丹参酮IIA是丹参的有效成分之一，具有非常广阔的临床应用前景，除了传统的活血调经、祛瘀止痛、养心安神之功效外，近年药理研究表明丹参酮IIA还具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑菌、保肝及降低血液粘度、抑制凝血、促进纤溶、抑制血小板聚集、延长血栓形成及促进血栓溶解，调节机体免疫功能，改善抗糖尿病微血管并发症等药理活性（时珍国医国药.2010，21：7，1770-1772）。
丹参酮IIA是丹参的脂溶性成分。除丹参酮IIA之外，丹参的脂溶性成分中还有其它的丹参酮型的二萜类化合物，如：丹参酮I、丹参酮IIB、隐丹参酮、羟基丹参酮、丹参羟甲酯、二氢丹参酮I，以及异丹参酮I、异丹参酮II、异隐丹参酮、二氢异丹参酮I等。
目前，获得高纯度（高于90%）丹参酮IIA单体的主要技术有：超临界二氧化碳萃取法，高速逆流色谱法，制备液相色谱法。
中国专利公开（公告）号：CN1369485，给出了“一种超临界二氧化碳萃取精制丹参酮IIA的方法”，采用超临界CO2从丹参中萃取丹参酮IIA，一次性进行萃取和分离精制，具有无毒、快速、价廉、低温操作、符合环保要求等优点，但提取高纯度（高于90%）丹参酮IIA单体时，收率低。
高速逆流色谱法不需使用固体填料，应用两相互不混溶的溶剂系统在支撑管内高速行星运动来分离天然产物，中国专利公开（公告）号：CN1337397，“应用高速逆流色谱分离纯化丹参酮的方法”中溶剂体系为正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，经二次HSCCC色谱仪分离后获得丹参酮IIA，每次分离时间需要5～6小时，分离时间长；中国专利公开（公告）号：CN1394870，“一种分离纯化丹参酮的方法”的溶剂体系为石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水，采用HSCCC色谱仪，一次分离可得隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA，但获得丹参酮IIA的时间8～9小时，仍很长；Min Zhang等，在“Development of a strategy and process parameters for agreen process in counter-current chromatography:Purification of tanshinone IIA andcryptotanshinone from Salvia miltiorrhiza Bunge as a case study”（Journal ofChromatography A,2011,1218:6031–6037）一文中用正己烷-二氯甲烷-甲醇-水，及正己烷-乙醇-水的二次逆流色谱法（CCC）提取丹参酮IIA，分离时间缩短，产品纯度高，但收率很低。虽然高速逆流色谱法无不可逆吸附，但或者分离时间长，或者回收率低，效率尚需进一步提高。
在制备液相色谱法中，中国专利公开（公告）号：CN101210041，给出“一种丹参酮ⅡA化学对照品的分离制备方法”，以重量含量50～97%丹参酮IIA提取物为原料，以甲醇-水溶液为洗脱液，以C8或C18键合填料为固定相提纯丹参酮ⅡA化学对照品；中国专利公开（公告）号：CN1670019，提出的“一种丹参酮的提取方法”将丹参的醇提取液加至大孔吸附树脂柱上，分别采用一定浓度的醇梯度洗脱，得到提取物中丹参酮IIA；中国专利公开（公告）号：CN101200490，“高纯度丹参酮ⅡA的制备方法”主要将丹参总酮原料采用正相层析（以硅胶或氧化铝为固定相，石油醚/二氯甲烷为流动相），通过多功能层析系统进行分离，洗脱液浓缩，重结晶，得高纯度丹参酮IIA。这些柱色谱法都为批处理工艺，洗脱剂耗量大，不能连续自动生产。
模拟移动床色谱在制备色谱的基础上，引进了连续、逆流、精馏的运行机制，使色谱分离由间歇工作变为连续运行，能够进行自动化、规模化、高效分离，是提纯化合物的有效手段。目前尚未发现模拟移动床色谱技术分离提纯丹参酮IIA的报道。
发明内容
本发明提供了一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，可以连续、自动、高效地提纯丹参酮IIA。
本发明提供的一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，利用模拟移动床色谱简称SMBC从丹参粗提物中提纯丹参酮IIA，该方法的内容如下：
（1）SMBC设备
包括3～10根色谱柱、洗脱带流动相输送泵、精制带流动相输送泵、进料液输送泵、阀、多通、连接管线和储液罐；
色谱柱的固定相使用十八烷基硅烷键合硅胶ODS，10～60μm；
（2）SMBC工作条件
运行模式：设置三带SMBC，三带包括洗脱带，精制带和吸附带，a为洗脱带色谱柱数目，1≤a≤2；b为精制带色谱柱数目，1≤b≤4；c为吸附带色谱柱数目，2≤c≤4，运行模式用a-b-c表示；
流动相组成：洗脱带的流动相P为乙醇与水的混合溶液，乙醇的百分含量CP为50～100％；精制带和吸附带的流动相D为乙醇与水的混合溶液，乙醇的百分含量CD为50～80％；进样液：丹参原料药粉碎后用5～20倍质量的乙醇浸渍后得到滤液，即丹参粗提物的溶液，滤液或者直接作为进样液，或者与含乙醇0～50%的水溶液混合为进样液，所需含乙醇0～50%的水溶液体积小于2倍滤液体积；
流动相流速：在精制带和吸附带中，洗脱液D流速QD为每小时4～30倍柱体积，即4～30BV/h，当洗脱液D流速QD单位为mL/min，色谱柱半径r单位为cm，色谱柱柱长L单位为cm时，则1个BV/h相当于60QD/(πr2L)；进样液F流速QF为0.1QD～1.5QD，萃余液R流速QR=QD+QF；在洗脱带中，洗脱液P流速Qp为0.5QD～2QD，萃取液E流速QE＝Qp；
切换时间TS：9～40min；
模拟移动床操作温度：室温；
进样模式：连续进样，或者分段进样；
（3）SMBC提纯步骤
使用如（1）所述SMBC设备在如（2）所述的SMBC工作条件下，进行SMBC分离，从萃余液R出口，除去各种前杂质；从萃取液E出口，得到丹参酮IIA萃取液；
（4）萃取液后处理
将含丹参酮IIA萃取液浓缩，经水沉醇溶处理，即将浓缩液加水，得到沉淀，再加乙醇溶解沉淀，结晶，得到丹参酮IIA产品。
（5）检测方法
高效液相色谱仪：日立L-2000；分析色谱柱：Agilent Extend-C18，5μm，150mm×4.6mm I.D.；流动相：V（甲醇）:V（水）=85:15；检测波长：270nm流速：1.0mL/min；柱温：30℃。由丹参酮IIA标准品来标定待测液丹参酮IIA的含量。
所述的SMBC提纯丹参酮IIA的方法，在每个切换周期0～TS内，连续进样。
所述的SMBC提纯丹参酮IIA的方法，在每个切换周期0～TS内，分段进样，0＜t＜Ts，在0～t(min)内进样，0.25min＜Ts-t＜2min。
所述的SMBC提纯丹参酮IIA的方法，在每个切换周期0～TS内，分段进样，0＜t＜Ts，在t～TS(min)内进样，0.5min＜t＜5min。
所述的SMBC提纯丹参酮IIA的方法，在每个切换周期0～TS内，分段进样，0＜t1＜t2＜Ts，在t1～t2(min)内进样，0.5min＜t1＜5min，0.25min＜Ts-t2＜2min。
所述的SMBC提纯丹参酮IIA的方法，在萃取液后处理过程中，将含丹参酮IIA萃取液浓缩后加水，得到沉淀物，用水清洗沉淀物后，加乙醇溶解沉淀物，重结晶，得到纯度≥98%的丹参酮IIA产品。
所述的SMBC提纯丹参酮IIA的方法，在SMBC工作条件中，采用甲醇与水的混合溶液作为流动相；在SMBC工作条件中，丹参原料药粉碎后用甲醇浸渍后得到滤液；在萃取液后处理过程中，采用甲醇溶解并结晶沉淀物。。
本发明与现有制备色谱分离技术相比，其显著的有益效果体现在：
三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，能够规模化、稳健、连续和自动高效地从丹参中提纯丹参酮IIA，产品回收率达到99.2%，HPLC纯度达到95%，固定相和流动相能反复利用，降低了提纯成本，属于绿色环保分离工程。
附图说明
图1是丹参原料药A的进样液的HPLC谱图(4—丹参酮IIA色谱峰)。
图2是丹参原料药B的进样液的HPLC谱图(4—丹参酮IIA色谱峰)。
图3是三带模拟移动床色谱体系。
图4是SMBC萃余液的HPLC谱图。
图5是SMBC萃取液的HPLC谱图。
图6是SMBC萃取液经浓缩、水沉醇溶、重结晶处理后得到的丹参酮IIA的HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合附图用实施例详细描述本发明。
实施例1
一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，利用SMBC从丹参的乙醇提取物中提纯丹参酮IIA，该方法的内容如下：
（1）SMBC设备
SMBC设备由6根色谱柱、流动相D输送泵、原料液F泵、流动相P输送泵、36个自控阀、一套单片机自动控制系统、5个储液罐和多通及连接管线组成，其中原料液F泵流量和流动相P输送泵的流量均为0～10mL/min，压力均为0～30Mpa，流动相D、原料液F、流动相P、萃取液E和萃余液R各用一个储液罐；
色谱柱规格：直径1cm，长10cm；
固定相使用十八烷基硅烷键合硅胶ODS，20～30μm。
（2）SMBC工作条件
运行模式为2-2-2，即洗脱带：2根色谱柱；精制带：2根色谱柱；吸附带：2根色谱柱；
流动相组成：洗脱带的流动相P为95％乙醇；精制带和吸附带的流动相D为乙醇与水的混合溶液，乙醇的百分含量CD为75％；进样液：30g丹参原料药A用120mL乙醇提取后的滤液，其中丹参酮IIA浓度为0.42mg/mL，滤液按流动相D的配比稀释后作为进样液，进样液的HPLC谱图见图1；
流动相流速：在洗脱带中，洗脱液P流速Qp为1.5mL/min，萃取液E流速QE＝Qp；在精制带和吸附带中，洗脱液D流速QD为1.5mL/min，进样液F流速QF为0.2mL/min，萃余液R流速QR=QD+QF；
切换时间：12.1min；
模拟移动床操作温度：室温；
进样模式：连续进样，如图3所示。
（3）SMBC提纯步骤
使用如（1）所述SMBC设备在如（2）所述的SMBC工作条件下，进行SMBC提纯。从萃余液出口，即R口，除去各种前杂质，萃余液HPLC谱图如图4所示；从萃取液出口，即E口，得到丹参酮IIA萃取液，其HPLC谱图如图5所示，丹参酮IIA的色谱纯度为94.5%，收率98.8%。
（4）萃取液后处理
将含丹参酮IIA萃余液浓缩后加水，得到沉淀，用水洗涤沉淀后，用乙醇溶解沉淀，重结晶2次，得到纯度为98.7%的丹参酮IIA产品，其HPLC谱图如图6所示。
（5）检测方法
高效液相色谱仪：日立L-2000；分析色谱柱：Agilent Extend-C18，5μm，150mm×4.6mm I.D.；流动相：V（甲醇）：V（水）=85：15；检测波长：270nm流速：1.0mL/min；柱温：30℃。由丹参酮IIA标准品来标定待测液丹参酮IIA的含量。
实施例2
除下述条件外，其它条件均同实施例1；
运行模式：1-3-2；
切换时间Ts：11min；
SMBC提纯结果：萃取液丹参酮IIA的色谱纯度为93%，收率为92%。
实施例3
除下述条件外，其它条件均同实施例1；
5根色谱柱，30个自控阀；
色谱柱规格：直径2cm，长20cm；
运行模式：1-2-2；
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶ODS，30～40μm；
流动相流速：洗脱液D流速QD为6mL/min，进样液F流速QF为0.8mL/min，洗脱液P流速Qp为6mL/min；
切换时间Ts：19min；
SMBC提纯结果：萃取液丹参酮IIA的色谱纯度为96%，收率为92.7%。
实施例4
除下述条件外，其它条件均同实施例1；
5根色谱柱，30个自控阀；
色谱柱规格：直径2cm，长20cm；
运行模式：1-2-2；
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶ODS，30～40μm；
流动相组成：精制带和吸附带的流动相D中乙醇的百分含量CD为77％；
流动相流速：洗脱液D流速QD为6mL/min，进样液F流速QF为0.8mL/min，洗脱液P流速Qp为6mL/min；
切换时间Ts：16.5min；
SMBC分离结果：萃取液丹参酮IIA的色谱纯度为92.5%，收率为100.0%。
实施例5
除下述条件外，其它条件均同实施例1；
进样液：24g丹参原料药B用120mL乙醇提取后的滤液，直接作为进样液，进样液的HPLC谱图见图2，其中丹参酮IIA浓度为0.21mg/mL；
进样液F流速QF：0.1mL/min
切换时间Ts：10.5min；
进样模式：分段进样，1.5min至10min期间进样；
SMBC分离结果：萃取液丹参酮IIA的色谱纯度为90.6%，收率为94.6%。
实施例6
除下述条件外，其它条件均同实施例1；
进样液：36g丹参原料药B用120mL乙醇提取后的滤液，直接作为进样液，其中丹参酮IIA浓度为0.30mg/mL；
进样液F流速QF为0.1mL/min；
切换时间Ts：10min；
进样模式：分段进样，1min至9.5min期间进样；
SMBC提纯结果：萃取液丹参酮IIA的色谱纯度为90.4%，收率为98.2%。
实施例7
除下述条件外，其它条件均同实施例1；
4根色谱柱，24个自控阀；
运行模式：1-1-2；
流动相组成：精制带和吸附带的流动相D为乙醇与水的混合溶液，乙醇的百分含量CD为60％；进样液：24g丹参原料药A用120mL乙醇提取后的滤液，其中丹参酮IIA浓度为0.33mg/mL，将滤液加水配置进样液，加水体积为1倍滤液体积；
流动相流速：洗脱液D流速QD为3mL/min，进样液F流速QF为3mL/min，洗脱液P流速Qp为3mL/min；
切换时间Ts：17min；
进样模式：分段进样，0～16.5min期间进样；
SMBC分离结果：萃取液丹参酮IIA的色谱纯度为93.9%，收率为95.1%。
实施例8
除下述条件外，其它条件均同实施例1；
色谱柱规格：直径1cm，长20cm；
进样液：24g丹参原料药B用120mL乙醇提取后的滤液，其中丹参酮IIA浓度为0.21mg/mL，直接作为进样液；
流动相组成：精制带和吸附带的流动相D中乙醇的百分含量CD为70％；
流动相流速：洗脱液D流速QD为3mL/min，进样液F流速QF为0.3mL/min，洗脱液P流速Qp为3mL/min；
切换时间Ts：13.7min；
进样模式：分段进样，4min至13.2min期间进样；
SMBC分离结果：萃取液丹参酮IIA的色谱纯度为95.0%，收率为99.2%。
Claims (7)
1.一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，其特征是利用模拟移动床色谱简称SMBC从丹参粗提物中提纯丹参酮IIA，该方法的内容如下：
（1）SMBC设备
包括3～10根色谱柱、洗脱带流动相输送泵、精制带流动相输送泵、进料液输送泵、阀、多通、连接管线和储液罐；
色谱柱的固定相使用十八烷基硅烷键合硅胶ODS，10～60μm；
（2）SMBC工作条件
运行模式：设置三带SMBC，三带包括洗脱带，精制带和吸附带，a为洗脱带色谱柱数目，1≤a≤2；b为精制带色谱柱数目，1≤b≤4；c为吸附带色谱柱数目，2≤c≤4，运行模式用a-b-c表示；
流动相组成：洗脱带的流动相P为乙醇与水的混合溶液，乙醇的百分含量CP为50～100％；精制带和吸附带的流动相D为乙醇与水的混合溶液，乙醇的百分含量CD为50～80％；进样液：丹参原料药粉碎后用5～20倍质量的乙醇浸渍后得到滤液，即丹参粗提物的溶液，滤液或者直接作为进样液，或者与含乙醇0～50%的水溶液混合为进样液，所需含乙醇0～50%的水溶液体积小于2倍滤液体积；
流动相流速：在精制带和吸附带中，洗脱液D流速QD为每小时4～30倍柱体积，即4～30BV/h，当洗脱液D流速QD单位为mL/min，色谱柱半径r单位为cm，色谱柱柱长L单位为cm时，则1个BV/h相当于60QD/(πr2L)；进样液F流速QF为0.1QD～1.5QD，萃余液R流速QR=QD+QF；在洗脱带中，洗脱液P流速Qp为0.5QD～2QD，萃取液E流速QE＝Qp；
切换时间TS：9～40min；
模拟移动床操作温度：室温；
进样模式：连续进样，或者分段进样；
（3）SMBC提纯步骤
使用如（1）所述SMBC设备在如（2）所述的SMBC工作条件下，进行SMBC分离，从萃余液R出口，除去各种前杂质；从萃取液E出口，得到丹参酮IIA萃取液；
（4）萃取液后处理
将含丹参酮IIA萃取液浓缩，经水沉醇溶处理，即将浓缩液加水，得到沉淀，再加乙醇溶解，结晶，得到丹参酮IIA产品。
2.根据权利要求1所述的一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，其特征是在每个切换周期0～TS内，连续进样。
3.根据权利要求1所述的一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，其特征是在每个切换周期0～TS内，分段进样，0＜t＜Ts，在0～t时间段内进样。
4.根据权利要求3所述的一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，其特征是在每个切换周期0～TS内，分段进样，0＜t＜Ts，在t～TS时间段内进样。
5.根据权利要求3所述的一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，其特征是在每个切换周期0～TS内，分段进样，0＜t1＜t2＜Ts，在t1～t2时间段内进样。
6.根据权利要求1所述的一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，其特征是在萃取液后处理过程中，将含丹参酮IIA萃取液浓缩后加水，得到沉淀物，用水清洗沉淀物后，加乙醇溶解沉淀物，重结晶，得到纯度≥98%的丹参酮IIA产品。
7.根据权利要求1所述的一种三带模拟移动床色谱提纯丹参酮IIA的方法，其特征是在SMBC工作条件中，采用甲醇与水的混合溶液作为流动相；在SMBC工作条件中，丹参原料药粉碎后用甲醇浸渍后得到滤液；在萃取液后处理过程中，采用甲醇溶解并结晶沉淀物。
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