CN103502816A - 用于监测整个身体中组织稳态扰乱的方法和手段 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医疗诊断领域。本发明提供了方法和试剂盒，其使用循环中组织巨噬细胞(CTM)作为扰乱组织稳态和疾病的反映用于确定对象的健康状况、早期检测组织损伤、早期诊断和监测疾病和／或在对象中评价治疗有效性。

Description

用于监测整个身体中组织稳态扰乱的方法和手段

技术领域

本发明涉及医疗诊断领域。它提供了新的工具，包括用于全身扫描的诊断试剂盒和方法，所述全身扫描旨在特别地评价生理过程，生活方式相关暴露和环境暴露，疾病的早期诊断和监测及其治疗。

全身扫描是扫描对象的整个身体以支持健康状况和疾病的诊断与治疗。如果使用计算机断层扫描(CAT)技术，它也可被称为全身CT扫描，尽管有多种类型的医学影像技术可以进行全身扫描。全身扫描理论上可以捕捉到早期阶段的致命疾病(如癌症)，其可以挽救生命。然而在实践中，目前已知的全身扫描的好处可能无法抵消其风险和成本。因此，对于在没有被诊断出患有疾病或没有提示疾病之征兆的患者上使用全身扫描产生了争议。正如任何筛选疾病的测试一样，需要针对在早期阶段鉴定可治疗疾病的益处来权衡全身CT扫描的风险。相对于大多数其他X射线诊断方法，CT扫描导致相对高的辐射暴露，这可能与非常小但显著增加个人生命晚年患癌症的可能性相关。重要地是，目前的影像技术需要昂贵的设备，使用其每次只能分析一个对象。与此相反，血液测试可以对许多个体平行进行并且所需要的仪器在许多诊断实验室中是广泛可得的。此外，对于血液测试，病人并不需要前往筛选中心，在当地采集并随后运输血液样品就足够了。

本发明人意识到对于扫描对象整个身体的可替代方法和手段的需求，其中早期阶段识别可治疗疾病的益处大大超过了风险。他们开发了一种用于全身扫描的概念上的新系统，旨在评价生理过程，筛查一般健康状况，以及疾病的早期诊断和监测与处置(例如治疗)。它涉及到流式细胞术身体扫描(Flow Cytometric Body Scan，FlowBoScan)或组织巨噬细胞扫描(Tissue Macrophage Scan，TiMaScan)，其使用血液中的组织巨噬细胞作为被扰乱的组织稳态和疾病的反映。所述新的工具并不涉及任何对有害辐射的身体暴露。与此相反，TiMaScan可以对容易获得的身体样品(例如外周血)上进行。

人体和动物体内的所有组织区室通过精巧的细胞增殖和细胞死亡的稳态平衡所维持，细胞死亡主要是通过细胞凋亡(I型)和自噬(II型)的程序性细胞死亡。根据组织类型，稳态活动(activities)较高或较低。例如，肠中的上皮细胞，骨髓中的造血干细胞和皮肤上皮细胞有较高的周转(turnover)，然而该周转在其他组织(如神经系统，肝脏，肾脏和肌肉)中较低。然而在所有的组织中细胞的稳态被维持，无论是在一个较高或较低水平的稳态。在稳态的基本水平之上，活化，再生和衰老进程影响增殖和细胞死亡的稳态，导致扩张或退化。例如，频繁使用所致的激活将会使稳态提升到一个更高的稳态水平，例如在运动中经过特定的体育锻炼使肌肉量和组成增加，以及当训练终止时这些肌肉退化。另外通过艰苦劳动的皮肤磨损或化学品的接触磨损会使手掌和脚掌的皮肤变厚，当磨损消除时胼胝会消失。

特定条件可以改变或甚至扰乱细胞的稳态水平，例如：

-组织损伤(外伤或手术介入)和随后的修复；

-器官系统的功能压力，如酒精滥用和肝功能不全或者参与马拉松和铁人三项和肌肉疲劳；

-(过早的)年龄相关的退化(衰老)；

-抑制和随后的再生，例如通过药物(像糖皮质激素)；

-炎症和随后的修复(通过再生和／或纤维化)，例如在自身免疫性疾病中；

-具有持续郁积和潜伏特征的传染性疾病，如结核病，莱姆病(lyme’s disease)，Q热(Q fever)等；

-增殖失调，然后是增生，以及潜在的再然后是发育不良和恶性转化。

尽管稳态增殖和凋亡的水平很高，但是很少在组织切片中观察到死细胞或将死的细胞(dying cells)。显然，死细胞和凋亡细胞通过组织巨噬细胞(tissue macrophage)被快速和有效地除去。有理由假设，每个单独的组织巨噬细胞在所涉及的组织中服务一个特定的(有限的)区域并且能有效的移除凋亡细胞和其他组织损伤。由于每个组织巨噬细胞最多能处理凋亡细胞的数量有限(例如20至40个细胞，取决于细胞的大小和类型)，所以监视区域的体积／大小取决于组织类型和所涉及组织的体内稳态活动水平。稳态水平越高或者修复或增殖水平越高，需要越多的组织巨噬细胞，以保持所涉及的组织无残渣并且避免伴随组织功能损伤的组织结构改变。因此，每单位组织体积的组织巨噬细胞数量可根据组织的类型，组织的活跃性，炎症的发生或损伤后的修复等而变化。一旦组织巨噬细胞在它们发挥作用的空间已履行它们的本地任务，那么这些终末期的巨噬细胞离开它们发挥作用的空间并通过淋巴管到达血液流，被从体内去除，很可能是在脾脏中。

单核细胞分化途径在骨髓中不断产生CD14高／CD16-经典单核细胞(“组织涌入(tissue-influx)”单核细胞)，其成为血液中可获得的并且可作为炎症单核细胞被募集到受影响的组织中，在那里它们成熟为CD14高／CD16+和CD14高／CD16高组织巨噬细胞的混杂(heterogeneous)(het)群体(图1)。一旦这些细胞完成其监视和吞噬任务，那么它们成为末期巨噬细胞并经由淋巴管系统迁移，由于CD14het／CD16het CTM到血液流(“组织流出(tissue-efflux)”单核细胞／巨噬细胞)，在那里他们是脆弱的细胞并具有短的寿命(图1)。

至少部分地，CTM(circulating tissue macrophage)在外周血中是可检测的。在正常的血液中，可检测到小群体的CTM，具有混杂的CD14和CD16表达。在衰老过程中以及特定的临床条件(例如干细胞移植(stemcell transplantation，SCT)和炎症、败血症、癌症以及运动过度的情况)下这些CTM增加(图2)。

假定的迁移和再循环过程被下述发现所支持，所述发现为不同位点的经典单核细胞和CTM的相对频率：在骨髓和血液中混杂的CD14+／CD16+和CD14dim／CD16高的频率低，但在淋巴液中频率较高(表1)(Orfao等，未发表结果)。

表1经典单核细胞和CTM的相对频率

^＊Orfao等，未发表结果

有理由假设，在健康者和在疾病条件下，由于组织巨噬细胞的监视区域有可能被限制在一种组织类型，甚至非常有可能限制在所涉及组织内的一个小的组织区域，所以每个组织巨噬细胞的吞噬体中蛋白质片段和肽的集合构成了组织特异性肽。因此，在给定时间血液中CTM的总群体(totalpopulation)反映了全身中所有组织的稳态水平。基于吞噬体肽的集合，每一CTM应该可以被指定到其来源组织。循环中的组织特异性巨噬细胞(CTSM，circulating tissue specific macrophage)的相对组成可能在血液中的相对和绝对数目上以及在它们的不同组织来源的蛋白质片段和肽含量上是稳定的，尽管会出现年龄相关的，性别相关的，代谢活性相关的差异，这是因为这些差异影响细胞的稳态。重要的是，在体内任何部位的体内稳态的变化(如组织损伤)，将会导致在循环中组织巨噬细胞中蛋白质片段和肽的细胞内水平的相对和绝对数量的变化以及相对组成的变化。这样的变化可能涉及一个或更多个不同的CTM和CTSM子集，并且它们可以包括正常表达的表位的缺乏，通常不存在的表位的异常表达或者正常表达的表位的表达水平改变。

在本发明中，我们开发了一种系统，其采用了细胞表面标志物的独特组合，用于检测和鉴定循环中组织巨噬细胞(CTM)和它们在血液中专注于识别已被单个CTM在组织局部捕获的源自细胞内蛋白质(如肽)的加工和降解(例如通过一个或更多个蛋白酶)产物之表位的子集。所述新系统特殊的能力涉及针对各个CTM子集来源筛查血液样品中整个CTM区室以及根据多种组织特异性的蛋白质片段或肽的组合来定义这些子集的能力；此外，这些循环中组织特异性巨噬细胞(CTSM)的进一步子集化可以基于其它肽，例如源自那些异常表达的蛋白质(如癌基因)。以这种方式，总CTM区室(compartment)反映(反映)全身的多种组织中的进行过程，无论稳态或扰乱的。这些CTM子集测量允许用于健康状况的监测和筛选特定的疾病，包括这些疾病的组织定位。一旦做出诊断，相关子集的CTM监测可用于随时间随访个体状态，例如评价疾病的消失或稳定性/或评价治疗效果。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了使用循环中组织巨噬细胞(CTM)作为扰乱组织稳态和疾病的反映用于确定对象健康状况、早期检测组织损伤、早期诊断和监测疾病和／或在对象中评价治疗有效性的方法，该方法包括以下步骤：

h)提供来自所述对象(优选人对象)的生物测试样品，其包含循环中组织巨噬细胞(CTM)；

i)使用一组针对核心标志物的差异标记的不同抗体对所述CTM进行染色，以用于对至少一个优选至少两个CTM子集的鉴定和计数，其中所述核心标志物是CD14、CD16和IREM2(CD300e)并且优选还有HLA-DR和/或CD45；

j)使用一种或更多种检测抗体对所述CTM进行固定、透化和染色，所述检测抗体针对蛋白酶诱导的至少一种蛋白质片段上之一个或更多个表位，所述蛋白酶诱导的蛋白质片段衍生自其来源组织中的各CTM对非CTM蛋白质的细胞内降解，由此鉴定至少一个循环中组织特异性巨噬细胞(CTSM)的子集；

k)对所述染色的CTM和CTSM进行多参数流式细胞分析以确定与各个细胞相连的每种不同的带标记抗体的信号的量；

l)确定在CTM子集和表达每个所测细胞内表位的CTSM特定子集内的各细胞的相对和绝对数量；

m)计算(i)在每个源自不同的正常和已改变组织的所述CTM子集和所述CTSM特定子集内细胞的相对和绝对数量，所述CTM子集和所述CTSM特定子集为所评价的蛋白酶诱导的各个蛋白质片段的集合所限定，以及ii)与所评价的各细胞内肽中每一个相关的抗体关联信号的量，以得到受试CTSM染色谱(profile)，和；

n)针对每种所评价的组织，将受试CTSM染色谱和正常CTSM染色谱进行比较，其中异常受试染色谱指示了组织损伤、改变的组织稳态、疾病的存在和／或治疗的有效性与耐受性(treatmenteffectiveness versus resistance)。

IREM2代表“髓样细胞2表达的免疫受体(immune receptorexpressed by myeloid cells2)”。在CD抗原的命名中，该蛋白质已被命名为CD300E或CD300e。该蛋白质也被称为CD300LE[CD300分子样家族成员LE(CD300molecule-like family member LE)]。IREM2的表达似乎限制于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，并且在分化后发生下调。

HLADR是MHC II类细胞表面受体，其由第6号染色体上的区域6p21.31的人白细胞抗原复合物编码。HLADR是αβ异源二聚体，细胞表面受体，每个亚基含有2个胞外结构域、1个跨膜结构域和1个胞质尾区。α和β链都锚定在膜中。HLADR及其配体(长度为9个氨基酸或更长的肽)的复合物构成了T细胞受体(TCR)的配体。

本文所用的缩写“CTM”代表循环中组织巨噬细胞。“CTM的子集”是指CTM的各子集，包括CD14高／CD16+、CD14高／CD16高、CD14+／CD16高、CD14低／CD16高、CD14-／CD16高、CD14-／CD16低CTM、CD11c+／CD16+、CD11c+／CD16高、CD11c+／CD16低CTM、CD33高／CD16+、CD33高／CD16高、CD33+／CD16高、CD33+／CD16低CTM、CD300e+／CD16+、CD300e+／CD16高、CD300e+／CD16低CTM、CD16+、CD16高、CD16低CTM、CD14高／CD16+／CD300e+／HLADR+、CD14高／CD16高／CD300e+／HLADR+、CD14+／CD16高／CD300e+／HLADR+、CD14-／CD16高／CD300e+／HLADR+、和CD14-／CD16低／CD300e+／HLADR+CTM。

“CTSM”是指循环中组织特异性巨噬细胞，其组织特异性由来自组织特异性蛋白的蛋白酶消化片段(肽)的细胞内染色所限定。“蛋白酶诱导的蛋白质片段”是衍生自已经在巨噬细胞的吞噬体中被摄取、加工和被蛋白酶消化的非CTM蛋白质的片段或肽。表述“核心标志物”指一组反复出现的标志物，其用于CTM区室和CTM子集的鉴定和计数，在这些标志物之外，可使用另外的膜标志物和细胞内染色来鉴定CTM子集，特别是组织特异性巨噬细胞，所谓的CTSM子集。

根据本发明，核心标志物组包括至少针对标志物CD14、CD16和CD300e，优选补充HLADR和／或CD45的抗体。在一个实施方案中，使用CD14、CD16和CD300e的组合。在另一个实施方案中，使用、CD14、CD16、CD300e和HLADR的组合。优选地，它还包括针对CD11c、CD33、CD35、CD36、CD45和CD64标志物中一个或更多个的抗体。CD45、CD36和/或CD64的抗体是特别优选的。非常有用的抗体组包括针对以下的抗体或由其组成：CD14、CD16、CD300e和CD64，CD14、CD16、HLADR和CD64，CD14、CD16、CD300e、HLADR和CD64，CD14、CD16、CD300e、HLADR和CD45，CD14、CD16、CD300e、HLADR、CD64和CD36。在一个方面，使用一组带差异标记(differently-labled)的针对标志物CD14、CD16、CD11c、CD33、CD36、CD45、CD64、CD123、CD86、CD300e和HLA-DR的不同抗体进行CTM的染色。在一个特定的方面，使用一组带差异标记的针对标志物CD14、CD16、CD300e、HLADR、CD45、CD64和CD36的不同抗体进行CTM的染色。这允许精确的选通(gating)所有的单核细胞和所有的CTM，准确的区分单核细胞和CTM，并且将CTM分成子集(subsetting)(图3)。

本领域中已经描述了对巨噬细胞的所摄取非巨噬细胞来源蛋白质进行的分析。然而，从来没有描述或提出根据本发明的基于表达至少三个特定表面标志物(CD14、CD16、CD300e以及HLA-DR和／或CD45)的细胞的正选择通过流式细胞术将巨噬细胞目标群体分成子集的优点。

Japink等人(Gastroenterology，Elsevier，Vol.134，no.4，(2008-04-01)，page A-487)公开了，通过流式细胞术测定来自血液样品的CD14+／CD16+细胞中检测细胞内癌胚抗原(carcinoemyonic antigen，CEA)，用于结直肠肿瘤的早期检测或复发。

Herwig等人(European Urology Suppl.，Vol.5，No.2，(2006-04-01)，page275，XP005522982；and J.of Urology，Vol.181，No.4(2009-04-01)，pg.653，XP025979386)公开了在前列腺癌诊断中针对细胞内PSA的多色流式细胞术分析CD14+／CD16+的外周血单核细胞。

WO2010／015633描述了表征被血液巨噬细胞从组织吸收到细胞内的分子标志物的方法，所述巨噬细胞为从所述组织再循环到循环系统的巨噬细胞。为此，限定了CD14／CD16-阳性目标群体，任选地结合CD56、CD57和／或CD161表达细胞的负选择。

WO2009／1000953涉及对于激活的巨噬细胞(CD14／CD16)的细胞内Aβ片段的分析。通过在细胞裂解以产生汇集的细胞裂解物和免疫沉淀后的MALDI-TOF-MS检测Aβ片段。使用针对CD45、CD14、CD16和CD19的抗体组合来鉴定激活的巨噬细胞和B细胞群。

Almeida等人(Clin.Immunol.Vol.100，No.3，pp.325-338，2001)进行了正常人外周血谱系(-)／CD16(+)／HLADR(+)／CD14(低)细胞、CD14+单核细胞和CD16(-)树突状细胞的形态学、细胞化学、免疫表型和功能特性的比较分析。公开了单个核细胞(mononuclear cell)的细胞分选，使用针对CD14、CD16和HLADR的抗体组合再加上其他谱系特异性标志物(例如CD3以排除T淋巴细胞，CD19以排除B细胞，和CD56以排除NK细胞)。随后通过单核细胞特异性特征的形态和细胞化学检查来分析所分选的细胞。没有提到或建议对所处理的组织组织特异性蛋白的细胞内染色。

本文提供的多色流式细胞术方法优选地包括基于CD14、CD16和CD300e(IREM2)，优选地CD14、CD16、CD300e(IREM2)和HLADR，细胞表面表达的特别选通策略，结合侧向散射(side scatter，SSC)分析(图4)。用于单核细胞-巨噬细胞群体的选通策略包括纳入步骤和子集鉴定步骤。纳入步骤的目的是纳入“经典单核细胞”(“组织涌入”单核细胞)加上组织巨噬细胞(“组织外排”单核细胞／巨噬细胞=循环中组织巨噬细胞；CTM)。后续的步骤应该将经典单核细胞与CTM相区分并且应该特别地鉴定CTM群体内的子集。因此，在本发明的一个实施方案中，选通策略包括(i)纳入选通策略，以包含经典单核细胞和CTM，随后的(ii)子集鉴定选通策略，从而将经典单核细胞与CTM相区分并鉴定CTM中的一个或更多个子集。

可以设想各种选通策略。用于检测所有经典单核细胞和绝大多数CTM以及一些CTM子集的最简单的策略包括对至少CD14、CD16和CD300e的染色。通过选通结合侧向散射(SSC)加CD300e(IREM2)+细胞(选择表达CD300e的具有低至中等SSC的细胞)来检测所有经典单核细胞和绝大多数(不是全部)CTM。用于检测所有经典单核细胞和几乎所有CTM以及一些CTM子集的更准确的策略包括对至少CD14、CD16、CD300e和HLADR染色。通过选通结合侧向散射(SSC)加CD300e和HLADR(即选择同时共表达CD300e和HLADR且具有低至中等SSC的细胞)检测所有经典单核细胞加上几乎所有的CTM。更准确的用于检测所有经典单核细胞和几乎所有CTM以及一些CTM子集的策略，包括对至少CD14、CD16、CD45、CD300e和HLADR的染色。可通过结合侧向散射(SSC)以及CD45、CD300e和HLADR阳性的细胞进行筛选所有流入和所有外排的单核细胞／巨噬细胞。更具体地，选择具有CD45以及低至中等SSC并且同时共表达CD300e和HLADR的细胞(图4A和B)。因此，纳入步骤可包括以下的任一个：

(i)对至少CD14、CD16和CD300e染色并且对SSC加CD300e+细胞的组合选通来选择表达CD300e的具有低至中等SSC的细胞；

(ii)对至少CD14、CD16、CD300e和HLADR染色并且对侧向散射(SSC)加CD300e和HLADR+细胞的组合选通来选择同时共表达CD300e和HLADR的具有低至中等SSC的细胞；

(iii)对至少CD14、CD16、CD45、CD300e和HLADR染色并且对SSC加CD45、CD300e和HLADR阳性细胞的组合选通，优选地对同时共表达CD300e和HLADR的具有CD45且低至中等SSC的细胞选通(图4A到D)。

本发明还提供了一些针对CTM子集鉴定的选通策略。在一个实施方案中，该策略允许鉴定经典单核细胞(CD14+／CD16-)和一些CTM子集。CTM的子集被限定在上述纳入选通之一中，优选使用至少SSC、CD300e和HLADR，其基于另外的使用至少CD14和CD16。因此，在一个实施方案中，选通策略包括鉴定经典(CD14+／CD16-)单核细胞和两个主要的CTM子集，其被鉴定为CD14高／CD16低至CD14高／CD16高，和CD14低／CD16高至CD14-／CD16高与CD14-／CD16低(图4D)。

在另一个实施方案中，子集选通策略由三个步骤组成，其允许更准确地检测经典单核细胞和在上述纳入选通(优选使用至少SSC、CD300e和HLADR)之一中的一些CTM子集，其基于另外使用至少CD14、CD16和CD64。

在第一个步骤中，通过针对CD64低(晚期CTM)与CD64高(经典的单核细胞以及早期CTM)的选通来鉴定经典单核细胞和更成熟的CTM期。第二个步骤旨在区分单核细胞和CTM，其根据带有CD16+／CD14+表型的事件选择所有其他早期CTM细胞(相对经典单核细胞)。因此，定义为CD64低和CD16+／CD64高的所选细胞将构成整个CTM区室，而其他所有在一般选通步骤中选择的选通细胞将对应经典单核细胞。在第三个步骤中，根据基于所选CTM细胞中CD64、CD14和CD16的表达水平，其可进一步细分为不同功能或成熟相关的区室：从CD64高／CD14高／CD16低至CD64高／CD14高／CD16高、CD64高／CD14低／CD16高、CD64低／CD14-／CD16高和CD64低／CD14-／CD16低。因此，在一个方面中，子集鉴定步骤包括：

-针对CD64低(代表后期CTM)与CD64高(代表经典单核细胞以及早期CTM)选通，然后

-区分单核细胞和CTM，其根据带有CD16+／CD14+表型的事件选择所有其他早期CTM细胞(相对经典单核细胞)，并且将整个CTM区室限定为CD64低和限定为CD16+／CD64高，然后

-基于CD64、CD14和CD16的表达水平进一步将所选CTM细胞细分为不同功能或成熟相关的区室，优选地其中不同的区室为：CD64高／CD14高／CD16低至CD64高／CD14高／CD16高、CD64高／CD14低／CD16高、CD64低／CD14-／CD16高和CD64低／CD14-／CD16低。

在又一个实施方案中，本发明提供了一种策略，其允许将CTM群体另外地分成子集，这在包含经典单核细胞前体的特定样品(如儿童外周血或成人骨髓)的情况下可能是有价值的。在前述策略的第三步骤中，使用CD36结合CD64有助于更好地鉴定具有以下的亚群的经典单核细胞和CTM的所有成熟阶段(图4E到H)：

-经典单核细胞：CD64高／CD36低(经典单核细胞的前体)至CD64高／CD36高细胞(真正成熟的单核细胞)；

-CTM子集：从CD64高／CD36高／CD14高／CD16低至CD64高CD36高／CD14高／CD16高、CD64高／CD36高CD14低／CD16高、和CD64低／CD36高／CD14-／CD16高到CD64低／CD14-／CD16低／CD36-至低的细胞。

此外，还提供了包括以下步骤的方法，所述步骤即基于CD14、CD16、CD36和CD64进一步细分所选的CTM、、，优选包括鉴定以下CTM子集中的至少之一：从CD64高／CD36高／CD14高／CD16低至CD64高／CD36高／CD14高／CD16高、CD64高／CD36高／CD14低／CD16高、CD64低／CD36高/CD14-／CD16高和CD64低／CD14-／CD16低／CD36-至低的细胞(图4和图5)。

可使用从哺乳动物对象(通常是人类对象)分离的任何类型的已知或怀疑含有循环中组织巨噬细胞的生物样品。例如，生物检测样品包括外周血、腹水、胸腔积液、脑脊液、骨髓、淋巴结、淋巴液、滑膜液或从实体组织制备的单细胞悬液。外周血是特别合适的，因为它可以很容易地通过微创手术(例如静脉穿刺)从对象获得。

有利地，本发明的一种方法以多管形式(muti-tube format)进行，其提供了将针对CTSM子集的信息组合在一起的可能性。这是基于以下合理的假设，在正常稳态条件下，每个单独CTSM可以仅对来自单个组织的肽(蛋白质片段)是阳性的。因此，还提供以下方法：其中使用用于CTM子集鉴定的相同核心标志物平行地对同一生物测试样品的两个或更多个等分试样进行染色，但根据组织起源使用不同的另外的抗体试剂用于更详细地将各CTSM群分成子集，其基于对衍生自组织相关蛋白的蛋白酶诱导蛋白片段的检测，目的在于对整个身体组织中稳态状态和组织稳态扰乱进行扫描。

Herwig等人(2004，2005，EP1516182)和Leers等人(2008)公开了在前列腺癌患者中检测到存在循环中CD14het／CD16het组织巨噬细胞，其作者宣称所述巨噬细胞包含细胞内前列腺特异性抗原(PSA)。Leers等人(2008)得出结论，相对于局部前列腺癌与转移的前列腺癌患者，在具有良性增生的患者中，血液中PSA阳性组织巨噬细胞的频率逐步增加(Leerset al，Am J Clin Pathol2008)。然而，他们所给出的流式细胞术数据针对PSA染色似乎含有假阳性结果：

-PSA阳性细胞不是作为分离的群体而检出，而是通过“带对照”标志物设置作为CTM群体的截止值而检出；

-看似PSA阳性CD14模糊(dim)／CD16高组织巨噬细胞的高频率在光散射图和CD14相对CD16图中都位于不正常的位置，指示了双粘体(doublet)的形成，并且因此指示了可能的PSA假阳性。

因此，尽管CTM的频率增加可能源自前列腺，但是通过PSA染色的最终证明是不能令人信服的。这非常有可能是所施加的针对在CTSM群中存在的PSA肽的PSA抗体反应不充分引起的。在本文中应该指出的是，将所施加的PSA抗体选择为识别完整的PSA蛋白质，而不是片段上的表位或衍生自PSA经细胞内加工和降解的片段。因此，在CTSM存在的PSA肽中，所述PSA抗体所识别的原始PSA表位非常有可能丢失的，因此无法检出。

Herwig等(European Urology Suppl.，Vol.5，No.2，(2006-04-01)，page275，XP005522982；和J.of Urology，Vol.181，No.4(2009-04-01)，pg.653，XP025979386)，Leers等(2008)，Brozek(WO2010／015633)，和Japink等(Gastroenterology，Elsevier，Vol.134，no.4，(2008-04-01)，pageA-487)的选通策略不足以纳入所有的CTM并且不足以排除所有非CTM。这主要是由于实际上上述科学家们所选的纳入选通仅基于SSC和CD45或基于CD19、CD56、CD57和/或CD161的负选择，而没有证实适当的排除了细胞多粘体(multiplet)。这种选通策略导致假阳性结果并且也可能导致假阴性结果。

与他人以及我们自己之前的工作(Herwig等，Leers等和Japink等)不同，在这里我们提出了用于鉴定经典单核细胞和CTM所有不同子集的方法，该方法基于选择另外的阳性标志物(CD300e+细胞以及优选地还有HLADR+)，无需排除其他细胞如T、NK和B淋巴细胞。这样的方法，允许容易的直接排除CD300e-淋巴细胞，同时，所述方法有利于鉴定晚期CD14-／CD16低CTM(如果CTM的选择完全是基于CD14+和／或CD16+细胞，上述CTM通常是被排除的)(图4和图5)。

不含本文提出纳入标志物和CTM子集标志物的CTM诊断试剂盒无法可靠地应用于需要准确地相对和绝对定量细胞群体的常规诊断实践中。

本文提供的方法的步骤c)涉及鉴定组织特异性巨噬细胞(CTSM)中至少一个子集，其使用针对衍生自蛋白质细胞内降解的至少一种蛋白酶诱导蛋白质片段上一个或更多个表位的一种或更多种检测抗体，所述蛋白质细胞内降解是由其来源组织中的各个CTM所致。本领域的技术人员应该理解，根据构成本发明的基本概念，可以采用多种方法。例如，检测抗体试剂包括对下述项进行细胞内染色的抗体(图6)：

a.蛋白酶诱导的单一蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自经细胞内加工的组织相关蛋白质；

b.蛋白酶诱导的两种或更多种不同的蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自一种经细胞内加工的组织相关蛋白质；

c.蛋白酶诱导的两种或更多种不同的蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自两种或更多种来自单个器官或组织的正常细胞的经细胞内加工蛋白质；

d.蛋白酶诱导的两种或更多种不同的蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自两种或更多种来自单个器官或组织的不正常细胞的经细胞内加工蛋白质；

e.蛋白酶诱导的两种或更多种不同的蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自两种或更多种来自单个器官或组织的正常和不正常细胞的经细胞内加工之蛋白质，包括至少一种针对正常蛋白质之肽表位的抗体和至少一种针对非正常蛋白质之肽表位的抗体的组合；

f.蛋白酶诱导的两种或更多种不同的蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自两个或更多个器官或组织的正常和不正常细胞的经细胞内加工之蛋白质。

在一个实施方案中，所使用的用于将CTM分成子集的核心试剂组与下述试剂相组合：所述试剂为针对衍生自两种或更多种经细胞内加工蛋白质的蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白片段的一个或更多个表位的一种或多种试剂，所述经细胞内加工蛋白质来自两个或更多个器官或组织的正常或不正常细胞。所使用的用于将CTM分成子集的试剂组可以与下述试剂相组合：所述试剂为针对衍生自两种或更多种经细胞内加工蛋白质的蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白片段的一个或更多个表位的一种或多种试剂，所述经细胞内加工蛋白质来自两个或更多个不同器官或组织的正常和不正常细胞，包括各自针对来自不同器官或组织(其中至少之一是改变的组织)的不同蛋白质之肽表位的至少两种试剂的组合。

在一个实施方案中，至少一种检测抗体允许用于检测衍生自异常蛋白质的一个或更多个肽表位，优选地，其中的异常蛋白质选自：原癌基因蛋白、突变蛋白、融合蛋白、源自过敏原的蛋白质和源自病原体(如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的蛋白质。

根据存在于巨噬细胞的蛋白酶以及组织特异性和疾病特异性蛋白质，可能(至少部分地)预测哪些肽将存在于每个CTSM子集的吞噬体中。针对相关组织特异性蛋白质片段或肽的抗体的产生将允许详细表征循环中组织巨噬细胞并鉴定不同CTSM的多个子集。一旦评估了总体CTM和CTSM区室的组成，将可能检测和鉴定与例如组织稳态、衰老相关、组织胁迫(tissue stress)、特定疾病或治疗中变化有关的CTM和CTSM群体大小和相对组成的改变。

通过这种方式，对CTM-CTSM区室组织的大小和组成的解析提供了对组织稳态和任何组织稳态扰乱的反映。因此，随时间的监测将了解任何由特定的活动、衰老、疾病、治疗、等引起的稳态改变的发生。因此CTSM子集的流式细胞术分析提供了用于评价组织完整性和/或组织破坏的诊断工具。由此，流式细胞术CTSM子集筛选成为用于全身扫描的灵敏方法，即所谓的“流式细胞术全身扫描”(FlowBoScan)或“组织巨噬细胞扫描”(TiMaScan)。

FlowBoScan或TiMaScan非常有可能比传统的CT扫描或其他全身扫描和成像系统更灵敏，因为CTSM区室通过收集浓缩于单个细胞的来自所有组织的“组织垃圾”(凋亡细胞和死细胞)提供了一个放大的全身扫描，特别关注稳态破坏(例如损伤、炎症、癌症等)的组织。因此，本文中所公开的基于CTSM的扫描将由此能够在早期阶段检测到组织损伤或疾病，无论缺陷是以较低水平广泛分布还是以小病灶损伤存在。此外，一旦做出诊断并已开始治疗，可以监测有关的CTSM子集以了解治疗的有效性，即与疾病进程相关的CTSM消失(与否)。

在监测治疗有效性的同时，还可以通过分析源自其他组织的CTSM子集来监测所提供治疗的毒性，所述其他组织更倾向于作为不必要的副作用被所述治疗靶向，例如细胞毒性药物的造血细胞相关毒性。因此，甚至可能根据合并的CTSM结果来指导治疗强度。这种个体化的用药形式正在变得越来越重要，以防止后期的后遗症并由此提高生活质量(Alllison，Nature Biotechnol2008)。

在根据本发明的方法中提出的对组织稳态扰乱的测量乍一看似乎类似于对血清蛋白的测量。然而，在血清中只有一部分的组织蛋白质可以被检测(如肝转氨酶、PSA和其它激肽释放酶家族的丝氨酸蛋白酶，或肌红蛋白)。而且，只有在显著的组织损伤(如心肌梗死或肝损害)的情况下，这些血清蛋白才显示出升高的水平。其他组织蛋白在血清中不易被检出，这是与以下生理机制相符合的：通过专门的转运蛋白(C-反应蛋白(CRP)和其他血浆蛋白)以及通过由局部细胞蛋白酶和炎症或吞噬细胞(例如，组织巨噬细胞)所致的组织蛋白破坏来隐藏自身抗原以避开免疫监视。最后，所释放的组织特异性蛋白在遍布身体的大体积的组织液(例如淋巴)和血清中稀释，在正常稳态和正常稳态扰乱的早期阶段通常达到无法检出的浓度。

本文所述的用于检测和鉴定CTSM子集的系统专注于检测单个CTSM细胞中衍生自经细胞内加工和消化蛋白质的片段(如肽)上的表位。该系统被称为“FlowBoScan”或“TiMaScan”，其是通过评价CTM和CTM子集的相对和绝对频率以及这些CTM的组织特异性子集(称为CTSM和CTSM子集)的流式细胞术身体扫描。所描述系统的特殊能力涉及以下可能性：针对各个CTSM子集的来源筛选血液样品中整个CTSM区室，以及基于多个组织特异性蛋白衍生片段(肽)的组合来定义这些子集，所述蛋白衍生片段包括源自异常表达或疾病相关蛋白质的那些，例如原癌基因蛋白、融合蛋白、过敏原来源的蛋白质和微生物来源的蛋白质。以这种方式，总CTSM区室反映(反映)全身多个组织正在进行的过程，无论稳态或是扰乱。

血液中的靶细胞包括CD16+组织巨噬细胞(例如CD14het／CD16hetCTM)以及CD14++／CD16-单核细胞和循环中树突状细胞的不同群体例如髓系(CD11c+／CD14-／CD16-／HLADR+)和浆系(CD11c-／CD123++／CD14-／CD16-／HLADR+)树突状细胞和树突状细胞前体。来自不同器官和组织的CTSM在正常生理条件下通过淋巴管系统和血液循环。这样，除了存在于血液中，它们也可以被发现在其来源组织中以及其他相关的体液，例如腹水、胸腔积液、流入局部或区域淋巴结的淋巴液等。在本发明中，我们主要(但不限于)专注于血液中的CTSM区室。

对于血液中CTSM的鉴定和列举，适合使用多参数流式细胞术。流式细胞术方法将旨在同时鉴定血液样品中CTM的所有群体以及在单细胞水平上对下述方面进行表征：细胞内存在来自组织和／或疾病相关蛋白的一个或多个片段或肽的一个或更多个表位，所述组织和／或疾病相关蛋白在一个或更多个器官和组织被组织巨噬细胞所处理(CTSM子集的鉴定)。

为了这个目的，用两组差异标记的抗体标志物的组合对血液样品进行染色(见表2)：

1.第一组(核心)标志物，其旨在鉴定和列举CTM的不同子集；

2.第二组标志物，其用于同时细胞内检测蛋白质片段或肽上的一个或更多个表位，所述蛋白质片段或肽源自一种或更多种蛋白质的降解，所述蛋白质在其来源组织被各个CTM所处理。

提供了具有可检测标签的抗体，所述标签允许对其单独检测和定量。可检测的(例如，荧光染料)标签在本领域中是已知的。例如，差异标记抗体反应试剂的组包括选自以下的相容荧光染料的组合：异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(peridin chlorophyllprotein，PerCP)、别藻蓝蛋白(APC)、alexa fluor(alexa fluor)488、alexa647，alexa710、alexa fluor405、花青素5(Cy5)、花青素5.5(Cy5.5)、太平洋蓝(PacB)、亮紫(如BV421)、地平线紫450(HV450)、太平洋橙(PacO)、HV500、克罗梅橙(Krome Orange)、OC515、量子点及其与PE、APC或PerCP(例如PE／Cy5、PE／Cy5.5、PE／Cy7、PerCP／Cy5.5、APC／Cy7、PE-德州红、APCCy750)偶联的缀合物或者任何其他相容性荧光染料或荧光染料的串联。

在另一个实施方案中，差异标记抗体反应试剂的组包括兼容性染料的放射性同位素的组合。

表2用于样品制备以及CTM和CTSM多色染色的示例性步骤步骤A.CTM和CTSM的细胞表面标志物的染色

1.加入适当体积的针对细胞表面标志物的抗体，如所建议的针对每个特定的CTM或CTSM抗体组。

2.如有必要，使用PBS+0.5％BSA，以达到每管100μL的最终体积。

3.充分混合。

4.在室温(RT)下避光孵育15分钟。

5.添加2mL的1X FACS裂解液(将10X FACS裂解液以1／10体积／体积在蒸馏水中(dH₂O)稀释；Becton Dickinson，San Jose，CA)。

6.充分混合。

7.在RT下避光孵育10分钟。

8.以540g离心5分钟。

9.在不扰动细胞沉淀的情况下使用巴斯德吸管或真空系统弃去上清，每管中留下约50μL的残留量。

10.向细胞沉淀加入2mL的PBS+0.5％BSA。

11.充分混合。

12.以540g离心5分钟。

13.在不扰动细胞沉淀的情况下使用巴斯德吸管或真空系统弃去上清，每管中留下约50μL的残留量。

14.在200μL的PBS+0.5％BSA中重悬细胞沉淀。

15.获取染色后的细胞或(如果不立即获取)在4℃保存至多3小时直到在多色流式细胞仪中测量。

程序B.对细胞表面膜的染色和细胞内标志物CTM和CTSM的染色

16.接程序A的步骤13。

17.添加适当量的抗体，如所建议的针对每个特定的CTM或CTSM抗体组。

18.如果有必要，用PBS+0.5％BSA以达到每管100μL的体积。

19.充分混合。

20.在RT下避光孵育15分钟。

21.向细胞沉淀加入2mL的PBS+0.5％BSA。

22.充分混合。

23.以540g离心5分钟。

24.在不扰动细胞沉淀的情况下使用巴斯德吸管或真空系统弃去上清，每管中留下约50μL的残留量。

25.轻轻地混合以重悬细胞沉淀。

26.加100μL试剂A(固定用，Fix&Perm^TM，An der Grub，Vienna，Austria)^＊

27.在RT下避光孵育15分钟。

28.向细胞沉淀加入2mL的PBS+0.5％BSA。

29.充分混合。

30.以540g离心5分钟。

31.在不扰动细胞沉淀的情况下使用巴斯德吸管或真空系统弃去上清，每管中留下约50μL的残留量。

32.轻轻地混合以重悬细胞沉淀。

33.加入100μL试剂B(透化溶液；Fix&Perm^TM)^＊

34.充分混合。

35.加入适当量的针对细胞内肽(蛋白片段)的抗体。

36.充分混合。

37.在RT下避光孵育15分钟。

38.向细胞沉淀加入2mL的PBS+0.5％BSA。

39.充分混合。

40.以540g离心5分钟。

41.在不扰动细胞沉淀的情况下使用巴斯德吸管或真空系统弃去上清，每管中留下约50μL的残留量。

42.在200μL的PBS+0.5％BSA中重悬细胞沉淀。

43.收获染色后的细胞或(如果不立即收获)在4℃保存最多3小时直到在多色流式细胞仪中测量。

^＊也可使用其他的固定和透化方法，例如FACS裂解解决方案。

需要至少3个，优选为4个核心标志物来鉴定CTM。这组核心标志物包含至少CD14、CD16和CD300e，以及优选地还有HLADR。有用的其他标志物包括CD11c、CD33、CD36、CD45和／或CD64细胞表面白细胞抗原(例如CD14／CD16、CD11c／CD16、CD33／CD16、CD64／CD16、CD11c／CD14／CD16、CD33／CD14／CD16、CD33／CD11c／CD16、CD300e／CD14／CD16、CD300e／HLADR／CD14／CD16、CD300e／HLADR／CD64／CD16／CD14、CD300e／CD11c／CD16／CD64、CD300e／HLADR／CD64／CD36／CD16／CD14或添加CD45的这些标志物的标志物组合)。一般来说，单个细胞表面标志物(或者甚至两个标志物)表达中的微妙差异可能并不总是足以准确识别所有CTM和CTM子集(图2C)，但当多个标志物的整体特征谱通过多因素分析(例如主成分分析(PCA))评价时，例如使用自动群体分离-Infinicyt软件中APS视图，或多维排列(MDS)分析可以更准确地鉴定CTM和CTM子集(图3)。如图3所示的实例中，在APS1、APS2视图中，显示了针对CD14、CD16和其他多个核心标志物染色的CD14het／CD16het细胞的第一相对第二主成分和第三相对第四主成分的二维图像。通过降低主成分1、2、3和4中的数值来使用区分经典单核细胞和CTM的最有力的参数组合。

因此，本发明还提供使用循环中组织巨噬细胞(CTM)作为扰乱组织稳态和疾病的反映用于确定对象的健康状况、早期检测组织损伤、早期诊断和监测疾病和／或在对象中评价治疗有效性的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供取自对象的生物实验(test)样品，其中包含循环中组织巨噬细胞(CTM)；

b)使用差异标记的不同抗体的组染色所述CTM，所述抗体针对核心标志物CD14、CD16、CD300e以及优选地还针对HLADR、CD64和CD36，以鉴定和列举不同的CTM子集(图4和5)；

c)所述经染色的CTM的多参数流式细胞术分析以确定与单个细胞相关的每个经不同标记的抗体之信号的量，其中所述分析涉及多变量分析，优选主成分分析(PCA)，例如使用自动群体分离一在Infinicyt软件中APS视图，或多维排列(MDS)分析(图4和5)；

d)确定每个CTM子集内各个细胞的相对和绝对数量；

e)计算(i)每个CTM子集内细胞的相对和绝对数量，以及；

f)对于每种评价的组织，将测试CTM染色特征谱和正常CTM染色特征谱进行比较，其中异常的测试染色特征谱表明组织损伤、改变的组织稳态、疾病的存在和/或治疗有效性与耐受性。

PCA是使用正交变换的数学过程，将一组可能相关之变量的观察结果转换成一组被称为主成分的不相关变量。主成分的数目小于或等于初始变量的数目。该变换以以下方式定义，第一主成分有尽可能高的变异性(variance)(即，描述数据中尽可能多的可变性)，并且每个随后的成分在与以上成分正交(不相关)的限制下依次具有尽可能最高的变异性。保证主成分是独立的，除非数据组联合正态分布。PCA对原变量的相对缩放是敏感的。根据应用的领域，它也被称为离散卡亨南洛维(Karhunen-Loève)变换(KLT)，霍特林(Hotelling)变换或本征正交分解(POD)。可选择PCA、MDS或可以使用的任何其他类型的已被大家接受的多变量分析。

在一个优选的实施方案中，上述染色的评价包括：≥4色流式细胞术和，在更优选的实施方案中，≥5色流式细胞术的方法，其中所用标志物(颜色)中≥1个对应于下述标志物，其鉴定源自一个或更多个组织相关和／或疾病相关蛋白质降解的肽或片段上的细胞内表位，所述蛋白质已在它们来源组织局部被捕获并经过CTM处理，并且其中所述其他标志物分别是核心标志物。

除了上面列出的核心标志物之外，可使用其他标志物来特别地排除其他非CTM细胞群体，例如CD15和/或CD24可用于排除嗜中性粒细胞，CD56和/或CD7可用于排除NK-细胞，CD3可用于排除T淋巴细胞，CD19和/或CD20可用于排除B细胞以及CD123可用于排除浆细胞样树突状细胞。

对样品中的CTM和其他细胞群体染色，包括对细胞表面膜标志物和细胞内标志物两者染色，其使用传统的直接免疫荧光技术并结合不同的已有充分描述的细胞固定、细胞透化和红细胞裂解方法与试剂(见表2)。

值得注意的是，对于个体的外周血样品，由于所使用的流式细胞仪有限的多色分析能力，从来自经过CTM处理的一个或多个组织相关和/或疾病相关蛋白质的蛋白质片段或肽表位的数目可能大于允许其与所选的核心标志物一起被测量的数目。在这种情况下，需要多个等分试样的同一外周血液样品，其每一个被针对相同的核心标志物组以及针对不同的(部分重叠或不重叠)表位组染色，所述表位来自经过CTM处理的一个或多个组织相关和/或疾病相关的蛋白质。

在流式细胞仪测定后使用传统的数据采集方法，在这种情况下，有利地使用Infinicyt软件(Cytognos SL，Salamanca，Spain)的合并和计算工具来创建单个数据文件，其包含对存在于样品中CTM群体内所含的单个细胞所有的蛋白质片段相关的表位的测量。对于CTM细胞和感兴趣的它们的(亚)群体的鉴定，多维选通策略例如那些在Infinicyt软件中执行的，基于序列布尔选通原理组分分析和多维缩放，可分别用在核心标志物和特征标志物的基础上。有用的选通策略如上所述。

此外，评价每单位样品体积中所鉴定的整个CTM群体及其不同亚群的常规方法可平行的使用以计算每单位样品体积中确切细胞数目。这样的方法可能会使用测定体积的方法或市售的内参比(internal reference)珠，例如TrueCOUNT(Becton Dickinson Biosciences，San JoséCA，USA)、FlowCOUNT(Beckman Coulter，Miami，FL，USA)或PerfectCOUNT(Cytognos SL)珠。

本领域技术人员将了解和理解，本发明涉及流式细胞术在CTM分析上的研究，可用于(早期检测)多种疾病、紊乱或其他生理变化和异常。本文提供了诊断试剂盒，其包括用于执行基于本文所公开的概念之分析的试剂。

所述诊断试剂盒可以包括在第一容器中的一组核心标志物，所述标志物组包括旨在鉴定和计数下述至少两个(优选至少三个)不同子集的经差异标记的抗体：CD14高／CD16+、CD14高／CD16高、CD14+／CD16高、CD14低／CD16高、CD14-／CD16高、CD14-／CD16低、CD11c+／CD16+、CD11c+／CD16高、CD11c+／CD16低、CD33高／CD16+、CD33高／CD16高、CD33+／CD16高、CD33+／CD16低、CD300e+／CD16+、CD300e+／CD16++和CD300e+／CD16低的CTM子集。提供了诊断试剂盒，其包含在第一容器中的一组核心标志物，所述标志物组包括经差异标记的抗体，其中核心标志物为CD300e、CD14和CD16以及优选地还有HLADR。所述试剂盒任选的使用试剂盒的说明书，以用于鉴定和计数至少一个，优选至少两个，更优选至少三个CTM子集，优选地根据本文所公开的方法。

所述第一容器包含：针对标志物CD14、CD16和CD300e，优选地CD14、CD16、CD300e和HLADR的抗体。更优选地，存在至少一个另外的抗体，其选自针对标志物CD36、CD64或CD45的抗体。例如，使用针对CD14、CD16、CD300e、HLADR和CD45的至少一组抗体，任选地与抗-CD64抗体相组合。在一个特定的方面，第一容器包含针对下述标志物的抗体：CD14、CD16、CD300e、HLADR、CD64和CD36。

在一个优选的实施方案中，诊断试剂盒包括在第一容器中的一组核心标志物，其包括为了识别和计数至少一个，优选至少两个，更优选至少三个CTM子集的差异标志物之抗体，其中核心标志物为CD14、CD16、CD300e并且优选也HLADR。在一个特别优选的方面中，本发明提供一种试剂盒，其包含抗CD14、CD16、CD300e、HLADR、CD45、CD64和CD36的抗体组合(图4)，其中每种抗体与不同的可检测标记相缀合。例如，试剂盒包括与荧光染料1(fluorochrome1，FL1)相缀合的CD14抗体、与荧光染料2(fluorochrome2，FL2)相缀合的CDl6抗体、与荧光染料3(fluorochrome3，FL3)相缀合的CD300e抗体、与荧光染料4(fluorochrome4，FL4)相缀合的HLADR抗体、与荧光染料5(fluorochrome5，FL5)才目缀合的CD45抗体、与荧光染料6(fluorochrome6，FL6)相缀合的CD64抗体和与荧光染料7(fluorochrome7，FL7)相缀合的CD36抗体。本领域的技术人员应该理解，可以使用任何有用的荧光染料的组合。例如，该试剂盒包含荧光染料组合APCH7(例如，抗CDl4-APCH7)、PECy7(例如，抗-CDl6-PECy7)、APC(例如，抗-CD300e-APC)，、PacB(例如，抗-HLADR-PACB)、FITC(例如，抗CD36-FITC)和PE(例如，抗-CD64-PE)。

为了鉴定组织特异性循环中巨噬细胞，该试剂盒可包含在第二个容器中的至少一个标记的检测抗体，其允许检测至少一个蛋白酶诱导的蛋白质片段上的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自在它们的来源组织中各个CTM对蛋白质的细胞内降解。

如将被理解的，可以根据具体情况或感兴趣的疾病选择检测抗体的靶标。有用的(结合荧光标志物的)抗体是市售的。图7仅仅示出一个任意的不同应用的组，每个都需要不同的检测抗体。WO2010／015633(通过参考并入本文)公开了权利要求9中有用抗体的靶标列表。

选择抗体检测靶标的有用注意事项包括以下。优选地，所述抗原不是分泌蛋白，例如PSA、CEA等，因为此蛋白质的高血清水平在CTM的子集中或上提供了一个扩散“背景”。另外，优选地，所述组织特异性蛋白应在同一组织的未成熟细胞上表达。还另外，优选地，所选择的蛋白质结构域／表位不应发生在“蛋白质组”的其他地方，即在其它蛋白质中。

需要考虑到另一个相关因素是以下事实，由于细胞增殖和凋亡之间的稳态活动水平，大多数组织提供了血液中组织标志物阳性CTM的正常背景。然而，一些外部的上皮层很有可能不提供这一“正常背景”。例如，在健康个体中，不断更新的肠上皮将主要脱落进入肠道管腔，意味着几乎没有含肠道特异性蛋白片段的CTM预期存在于血液中。然而，如果肠上皮细胞转化为恶性侵袭性细胞，局部(local)CTM将吞噬凋亡的恶性细胞并且作为具有肠(例如结肠)特异性蛋白质片段的CTSM将在血液中成为可检出的。(增加的)具有结肠特异性蛋白质片段的循环中CTSM的检测可用于结肠癌早期发现的全国范围筛查(screening)项目。其同样非常有可能有效地用于肺上皮细胞，肺上皮细胞将会脱落进入肺泡和支气管并且非常有可能被肺泡巨噬细胞吞噬，肺泡巨噬细胞通过支气管从我们的身体中被去除(粘液通过纤毛移除至痰)。然而，侵入性上皮细胞(如肺癌)会导致血液中的肺上皮阳性CTSM。最后，一个相当的过程将发生在皮肤上，正常的黑色素细胞从皮肤表面丢失，与之不同，黑素瘤细胞通过穿越基底膜变为侵入性。只有在这样的情况下，才可能会在血液中在源自视网膜的MELAN-A-阳性细胞的低背景之上检测到Melan-A-阳性CTSM。

根据本发明的方法或试剂盒的一个非常重要的附加应用是检测非自身(即外源性的)蛋白质片段，如潜伏的(insidious)传染病的情况下。特别是在潜伏的传染病的情况下，这非常难以诊断。例如，很难诊断(肺外)结核病，因为目前使用的所有的血清学和PCR测试显示高水平的错误结果。在血液CTM子集中检测结核分枝杆菌特异性蛋白片段提供了一个极好的替代的和潜在的更为可靠的诊断工具，也可评价疾病在全身的散播。对其他病原体引起的疾病例如曲菌病、莱姆病和Q热也同样有效。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种诊断试剂盒，其中第二容器包括至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个表位，所述表位衍生自心肌特异性蛋白(例如肌钙蛋白或CK-MB)，肾／肾小球特异性蛋白，肝细胞特异性蛋白或肺特异性蛋白质的细胞内降解，旨在用于在分别经历了心、肾、肝或肺移植的患者中评估移植后器官存活和移植排斥过程。

在又一个实施方案中，诊断试剂盒其中第二容器包括至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个表位，所述表位衍生自心肌特异性蛋白的细胞内降解，这提供了用于检测心绞痛或心脏广泛缺血(心肌梗塞)的手段和方法。来自受损心肌的终末期TSM经淋巴管系统迁移到血液中，在那里他们可作为CTSM以相对和绝对高的数量被检测到，该CTSM含有心肌特异性蛋白的蛋白质片段(图7A)。这样的分析可用于进行型心绞痛中的早期诊断和/或心肌梗死程度和修复的监测。

在另一个实施方案中，在本发明试剂盒中的第二容器包括至少一种检测抗体，其允许检测衍生自骨蛋白质(例如骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨特异性碱性磷酸酯酶)细胞内降解的一个或更多个表位，允许评价骨折的复杂性和程度以及评价骨折与外科手术后骨重塑的进展。例如，可以实现骨重塑的监测，例如在复杂骨折的患者中。包含来自骨特异性蛋白(例如骨钙蛋白、骨桥蛋白和/或骨碱性磷酸酶肽)片段的CTSM之定期计数允许这种监测(图7B)。

在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，例如用于恶性肿瘤的早期诊断和监测，其中第二容器包括至少一种检测抗体，针对一种或多种蛋白酶诱导的源自上皮蛋白细胞内降解的蛋白质片段，上皮蛋白优选为乳腺上皮蛋白、食道上皮蛋白、胃上皮蛋白质、胰上皮蛋白、结肠上皮蛋白、乙状结肠直肠上皮蛋白、甲状腺上皮蛋白、肺或支气管上皮蛋白、前列腺上皮蛋白、膀胱上皮蛋白、宫颈上皮蛋白、子宫上皮蛋白、黑素瘤蛋白、肾脏肾小球蛋白、或针对另一上皮细胞标志物。可以通过检测血液中含有结肠上皮特异性蛋白片段的CTSM实现侵入性结肠癌的早期诊断和监测(图7C)。这样的应用对于家族性结肠息肉病的患者是特别有价值的，因为定期监测(如每半年或每6个月)可允许结肠息肉病进展为侵入性结肠癌的早期诊断。

在第五实施方案中，本发明提供了一种用于早期检测乳腺癌在肝脏中转移的手段和方法。将有可能通过扫描(screening)同时包含源自乳腺上皮蛋白质和肝细胞特异性蛋白的蛋白质片段的CTSM来筛选乳腺癌患者肝脏(或在其他器官，例如骨和肺)中的转移(图7D)。源自两个完全不同组织的两种不同类型蛋白质片段共同存在于一个单独的CTSM指示转移的存在，例如转移到肝、骨、肺或中枢神经系统(CNS)。在一个实施方案中，本发明的方法包括源自肝脏或骨组织以及癌细胞的特异性蛋白片段的联合检测，用于监测乳腺癌，前列腺癌等的肝或骨转移。

进行性和侵入性(Progressive and invasive)前列腺癌需要在早期阶段被检测。本发明提供手段和方法用于扫描前列腺癌患者的包含来自前列腺上皮蛋白和骨特异性蛋白两者(图7E)或其他类型蛋白质(例如肝、肺和中枢神经系统)的CTSM的存在情况。针对所有类型癌症检测和监测转移的类似方法是可能的。

另一个实施方案涉及动脉粥样硬化，其中组织巨噬细胞穿透动脉粥样硬化斑块并且一旦它们的任务完成后最有可能直接返回到血管。这种CTSM将包含来自内皮细胞的蛋白质，如内皮素1(图7F)的蛋白质片段。对于在这样的分析中使用的诊断试剂盒(例如针对动脉粥样硬化患者的动脉粥样硬化和血管内皮损伤程度的评价)可能因此包括至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个衍生自内皮细胞(如内皮素1(endothelin1)蛋白质细胞内降解的表位。

再一个实施方案涉及到用于脑或神经疾病之早期诊断和监测的方法和试剂盒，特别是老年痴呆症，其中至少一种检测抗体允许检测一个或更多个表位，所述表位衍生自脑或神经特异性蛋白(例如apoε4或淀粉样前体蛋白质(APP))的细胞内降解。老年痴呆症的诊断经常被延迟并且难以确认。疾病进展的监测也很复杂。因此，本发明的一个单个的诊断检测，可以支持老年痴呆症患者和他们的家属的关注(care)，例如早期支持性治疗以及及时的财务管理。这可以通过增加的或增加中的CTSM检测实现，CTSM中包含来自Apoε4消化APP和/或其他中枢神经系统(CNS)的组织和疾病相关蛋白质(图7G)的片段或肽。APP肽阳性CTSM的数目升高可能指示了早期老年痴呆症并且这样的APP阳性CTSM的进一步增加可能指示了疾病进展。

试剂盒包括至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个源自大脑特异性蛋白细胞内降解的表位，还发现了它在脑血管意外(cerebrovascularaccident，CVA)早期诊断中的用途，例如在短暂性脑缺血(transientischemic attach，TIA)复发的患者中以及随后的脑梗塞严重程度和恢复的监测。

另一个实施方案涉及多发性硬化症(MS)。MS的诊断是复杂的并且可能受益于独立的诊断分析，其也可用于监测疾病的进展。这可以通过本文提供的方法实现，涉及含有髓鞘特异肽的CTSM的相对或绝对频率的精确检测(图7H)，其来源于覆盖神经之髓鞘的降解。

提供了诊断试剂盒，其适用于自身免疫性疾病的早期诊断和确认以及自身免疫性疾病(例如再生障碍性贫血症、I型糖尿病、甲状腺炎、自身免疫性膀胱炎、舍格伦综合征、自身免疫性肾小球肾炎、类风湿性关节炎、系统性硬化症和其他自身免疫性结缔组织疾病)的监测。这样的试剂盒在第二容器中可包括至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个来源于选自以下的蛋白质细胞内降解的表位：内因子(intrinsic factor)、郎格罕小岛特异性蛋白或胰岛素、甲状腺上皮蛋白、膀胱上皮蛋白、泪腺和／或唾液腺的特异蛋白质、肾脏肾小球特异蛋白质、滑膜特异蛋白质、肌肉和结缔组织特异蛋白质。例如，通过检测含有源自甲状腺组织特异性蛋白质的蛋白质片段之CTSM的相对和绝对频率可以进行中毒性或自身免疫性甲状腺炎的早期诊断或确认(图7I)。

舍格伦综合征的诊断是困难的并且通常在显著延后得出，也因为复杂的鉴别诊断。含有来自腮腺或泪腺蛋白质片段的CTSM的计数增加可以显著支持诊断过程(图7J)。

来自频繁发生I型糖尿病之家庭的年轻儿童，可由包含源自郎格罕胰岛或其他特异蛋白质(如胰岛素(图7K))的片段或肽的CTSM之存在监测。这种筛选将允许在已经发展成为显性糖尿病之前的早期诊断，从而允许使用免疫调节或免疫抑制的早期干预。

此外，在有系统性硬化症的患者中，总是无法轻易进行诊断。因此CTM系统可能被用于纤维化和血管病变的早期检测，通过结缔组织蛋白和血管内皮细胞蛋白质(图7L)片段的存在。

系统性红斑狼疮(SLE)的患者经常发生渐进性肾小球肾炎，最终导致不可逆转的肾功能衰竭。这种肾损伤通常在晚期(大多数肾功能已经丧失以致不允许免疫抑制治疗的时候)发现。因此，我们建议所有的SLE患者定期监测包含肾脏特异性蛋白(图7M条)片段之CTSM的存在和增加。肾脏损伤的早期诊断(远远早于发现肌酐水平上升)将允许免疫调节或其他免疫抑制剂治疗的早期干预。

还有一个实施方案涉及由微生物引起(感染)的疾病(莱姆病的)。莱姆病的诊断常常很复杂，因非典型临床图片和／或缺乏典型症状(例如蜱咬相关的皮肤损害)。在具有莱姆病的患者中并发症诊断的延迟可导致不可逆的器官损伤。因此，它是临床相关的具有可用于莱姆病诊断的单个诊断检测。这可以通过检测CTSM实现，其含有疏螺旋体属特异蛋白质的肽(图7N)。优选地，所选择的用于抗体升高的表位应该不依赖于疏螺旋体属菌株，这样可以使用单个反应来检测到疏螺旋体属菌株感染的每一种类型。否则可使用多个针对来自几种不同类型的疏螺旋体属菌株的肽的抗体来识别所涉及的在一个具体患者中引起莱姆病的疏螺旋体属菌株。

结核病的常规诊断测试有许多限制，特别是在肺外结核的情况下。已经开发了几个基于抗体的血清检测，但他们都漏掉了至少部分肺外结核的诊断。然而，检测含结核分枝杆菌的片段的CTSM可以致力于肺外结核的准确诊断(图7O)。

粒细胞减少的患者对曲霉病是高度敏感的。曲霉病的诊断越早，疾病的预后越好。因此，针对独立于所涉及菌株的含来自曲霉之片段的CTSM的存在(增加)，监测所有粒细胞减少的患者是明智的(图7P)。

因此，还提供了诊断试剂盒，其中第二容器包含至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个衍生自病原体如病毒、细菌、真菌(例如肝炎病毒、疏螺旋体属、分枝杆菌属、曲霉)的蛋白质细胞内降解的表位，用于肝炎、莱姆病、结核病、麻风或曲霉病的早期诊断(或诊断的确认)和监测。在一个具体的方面中，所述诊断试剂盒旨在早期诊断和监测结核病和曲霉病骨定位，并且所述诊断试剂盒在第二个容器中包括至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个衍生自骨蛋白细胞内降解的表位，以及至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个衍生自结核分枝杆菌或曲霉菌蛋白质细胞内降解的表位。

本发明还发现其用于在运动员耐力训练中监测训练的作用，更具体地确定一个人是训练不足还是过度训练。耐力运动需要周密的训练计划，从而在比赛的适当时候达到正确的训练状态。最佳训练的频率和强度可能在个人之间有显著差异并且可能依赖于身体的、环境的和遗传的(种族)因素，这目前还是未知。此外，高水平体育锻炼后的休息在个别运动员之间可能不同。可通过仔细监测对源自骨骼蛋白质的肽是阳性的CTSM区室来支持对运动员在耐力运动中的训练和休息的指导(图7Q)。这可能会导致在运动员的训练计划中更好的指导它们，以防止训练过度和训练不足两者，并可能导致在个人运动成绩的显着改善。

另一个实施方案涉及组织损伤的评价，例如，为了评价在外科手术中住院医师的手术技术或者评价对于相同状况时两种或更多种不同的外科手术方案。CTM或CTSM的检测和计数(具有源自骨骼肌肉或结缔组织的肽，比如胶原蛋白衍生肽)可以起到这样的评价(图7R)。提供了下述诊断试剂盒，即其中第二容器包含至少一种检测抗体，其允许检测一个或更多个源自骨骼肌细胞内降解的表位。这样的试剂盒具有在体育赛事如耐力运动(例如马拉松、铁人三项、滑冰、游泳、骑自行车、越野滑雪)中监督和指导训练以及运动员恢复中的用途。

在又一个实施方案中，本发明可用于提供评价健康状态的个人CTSM特征谱。不同个体之间，CTSM的子集分布最有可能略有不同，因为这样的组分依赖于年龄和其他参数，像生活方式习惯(如吸烟和酒精滥用)，以及活动如体育。个人的定期(如每年或每6个月)监测可良好的了解健康状况并允许疾病的早期发现和诊断。本发明允许个体化的CTSM档案，可用于筛选特定的风险和危险，例如：

●职业暴露(工业毒素等)；

●生活方式习惯(吸烟、饮食、饮酒等)；

●家族相关疾病(心血管疾病、癌症、老年痴呆等)

可以监视每个个体特定的组织来源之肽的个体化组合，目的是预防和／或早期诊断。

附图说明

图1.血液中CD16+组织巨噬细胞不直接衍生自经典的CD14++／CD16-单核细胞，而是衍生自组织巨噬细胞，其已经积极地投身于组织中的监视和吞噬作用，并且其已通过淋巴管系统再循环至血流(VanDongen和Orfao，未发表的数据)。

图2.可以通过精确的流式细胞术选通策略来检测单核细胞／巨噬细胞亚群的几种类型，然后分析CD14和CD16的染色模式。A.健康捐赠者中经典的单核细胞为CD14+／CD16-，而CTM群体显示CD14和CD16的混杂(heterogeneous，het)表达，表明这个群体由多个子集组成。B.在传染性疾病的患者中(如土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis))，CD14^het／CD16^het的子集是相对和绝对增加的。C.在土拉弗朗西斯菌感染之病人的CD14-CD16散点图中可鉴定几种CTM子集(A.Orfao等，未发表的结果)。

图3.可以通过所有所评价标志物(例如CD14、CD16、CD33、CD45、CD64、CD123、CD300e和HLADR)的主成分分析(通过Infinicyt软件的APS视图；Cytognos，Salamanca，ES)提高CD14^高／CD16^-经典单核细胞和更多混杂的CTM之间的精确区分。A.CD14／CD16的散点图和CD14／CD123的散点图表明经典的单核细胞和CTM呈现为连续统一体。B.所有8个标志物的主成分分析，在APS1显示，经典的单核细胞和CTM是分离的群体。在APS2中显示，两个群体似乎密切相关。

图4.血液白细胞上CD14、CD16、CD36、CD45、CD64、CD300e和HLADR之表达的染色使得高度准确的识别经典的单核细胞和至少三个CTM子集：早期CTM、晚期CD36+CTM子集和晚期CD36-CTM子集。在所呈现的染色中，进行针对中等SSC和CD45的第一选通(A图)，随后是基于CD300e和HLADR阳性的纳入选通(B图)。所纳入的细胞代表了所有经典的单核细胞和所有CTM，可进一步通过CD14和CD16标志物对其进行评价(C图)，产生三个主要的子集：经典单核细胞、早期CTM和晚期CTM(D图)。可以用CD64和CD36准确识别早期CTM和CTM的进一步子集化(E和F图)。CD64在早期CTM上(以及在经典单核细胞上)表达较高的水平，而所有其他CTM亚群以较低的水平表达CD64(F图)。CD64低CTM(晚期CTM)有从高至阴性的混杂CD36表达(E和F图)。评价所有七个标记的APS视图显示出各种单核细胞／巨噬细胞的细胞群(G图)，即经典单核细胞、早期CTM、晚期CTM的子集，包括CD36-晚期CTM子集(H图)的清晰分离。

图5.在血液白细胞上CD14、CD16、CD36、CD45、CD64、CD300e和HLADR的染色导致了经典单核细胞和CTM子集的准确识别。根据年龄(儿童、青春期、成年、老年)、疾病类型(局部、全身等)、疾病阶段(急性、慢性、闷烧(smoldering)等)，这些单核细胞和CTM的子集可能会在它们的组成上有所不同。A图显示通常在成人体内发现的典型的CD300e／HLADR细胞群体的格局。与此相反，在B图中生病的孩子的血液试样显示不同的模式，其显著具有CD16低／CD14-／CD36-／CD64低的CTM群体，而在成年人血液中很少或不存在。注意：大多数CD36-晚期CTM在成人血液中高水平表达CD16。

图6.对9名健康对照和9名诊断的脑胶质瘤患者的血液样品染色CD14／CD16／CD45／CD300e／HLADR/GFAP的结果。抗GFAP抗体针对蛋白质的N-末端表位。A图：GFAP染色的实例，在健康对照(左组)和神经胶质瘤患者(右组)。在胶质瘤患者中，鉴定到一簇GFAP阳性早期CTM，而这种细胞在健康对照组中未检测到。B图：所绘制的GFAP+细胞在早期CTM群体内的百分比针对早期CTM相对总CD300e+细胞(单核细胞和CTM)的百分比和针对胶质瘤大小的百分比。几乎所有的胶质瘤患者(7／9)有超过1％GFAP+早期CTM。重要的是，GFAP阳性细胞的频率，也显示了与胶质瘤肿块之大小的一定之相关性。

图7.在不同类型的疾病或医疗状况下的CTSM增加的实施例。A.心肌梗死、B.骨折、C.结肠癌、D.转移性乳腺癌、E.骨转移癌、F.动脉粥样硬化、G.阿尔茨海默病、H.多发性硬化症、I.自身免疫性甲状腺炎。J.舍格伦综合征、K.1型糖尿病、L.系统性硬化症、M.SLE患者中血管球性肾炎、N.莱姆病、O.结核病、P.肺曲霉、Q.肌肉训练、R.组织损伤的手术干预。

具体实施方式

实施例1：

基于CTSM的流式细胞术健康扫描的应用：确定CTSM子集的分布，由此在细胞更新、维持、修复、衰老和凋亡之稳态的生理和非生理性变化。

1、生理条件：生长、老化、怀孕、更年期、身体活动、昼夜节律；

●儿童生长：婴儿期的器官发育，儿童期，青春期，例如骨区室高活性(增长和重塑)和随之而来的骨源性肽的CTSM子集增加；

●在年幼的孩子中高度活跃的用于产生大量B和T淋巴细胞的淋巴前体细胞区室，其表现为这些年幼的孩子中巨大的胸腺；

●老化：伴随器官退化和CTSM子集增加的衰老；

●妊娠：胎盘功能与功能紊乱(胎盘中毒和分娩时间的早期检测)；

●胸腺退化和T细胞生产减少：许多T细胞(约90％)是在胸腺中负性选择的；

●卵巢功能：通过卵巢CTSM的下降检测(早熟)更年期。

●骨形成和骨密度：评价衰老过程中的骨形成和骨重吸收，例如在青春期／青春期，衰老和更年期提前。

2、生活习惯：例如：

●吸烟：通过测量粘膜和上皮细胞的平衡评价肺损伤；

●酒精：评价肝损害与酒精摄入量的关系；

●体育：在持久的运动(如马拉松，铁人三项)中评价肌源性CTSM，从而为恢复能力有差别的顶尖运动员设计个体化培训计划；

●太阳／紫外线照射的皮肤：测量皮肤上皮细胞的肽和黑色素肽来评价紫外线照射水平及相关的损害(表面程度和紫外线照射的强度)。

3、暴露于环境物质

在组织巨噬细胞中毒性成分的直接评价或在所涉及的组织中间接毒性测量，例如这样的情况：

●石棉；

●油漆中的神经毒性材料；

●核事故后的放射后果。

4、一般的组织损伤(皮肤、粘膜、肌肉和/或骨)：

●创伤：创伤程度和恢复进展的监测；

●外科手术：例如评价手术后组织损伤作为“手术质量”的衡量，例如评价住院医在手术中的专业技能。

●具有全身性多重损伤的败血症的影响。

●器官损伤和其他医疗干预有害的毒副作用，例如在癌症治疗中。

●在特定组织上的温度影响，例如烧伤创面(大小、深度和体表)；

●骨折以及骨折的复杂性和延伸(例如测量骨钙蛋白肽和/或骨桥蛋白肽和／或骨碱性磷酸酶肽)。

5、炎性和自身免疫性疾病：

●自身免疫疾病的扩展，例如系统性硬化症；

●舍格伦病：通过测量特定的上皮肽，更早期诊断和更清晰的定义泪腺和唾液腺的受累；

●自身免疫性膀胱炎；测量含膀胱上皮细胞肽的CTSM；

●肾小球肾炎：自身免疫性肾炎的肾损害或在患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者中肾损伤的早期检测或肾移植术后在患者中排斥反应过程的早期检测；

●类风湿关节炎：CTSM中连接组分(滑膜肽)的检测；

●血管炎：例如具有含有内皮细胞肽的CTSM的颞动脉炎。

6、神经和神经退行性疾病：

●阿尔茨海默病：通过具有来自疾病相关蛋白质(例如突变的Apoε4和APP)之肽的CTSM的早期诊断。

●多发性硬化症：例如CTSM中髓鞘肽的检测。

●帕金森病

●朊病毒疾病，例如雅各布-克罗伊茨菲尔德病。

7、传染病(尤其是持续性闷烧和隐袭特征)

●在同一个TSM子集中联合检测组织特异性肽和微生物特异性肽：

●分枝杆菌感染：在BCG阳性患者和在儿童中难以诊断；

●Q热：难以诊断且难以评价治疗效果；

●莱姆病：在含糊抱怨的患者中检测疏螺旋体属衍生肽，疾病的诊断仍然是一个挑战；

●乙型肝炎和丙型肝炎：肝脏损害和/或病毒蛋白衍生肽的监测。

●侵袭性真菌和酵母菌感染的诊断：曲霉菌感染难以诊断；检测循环中组织巨噬细胞中的真菌抗原和通过鉴定所涉及的CTSM鉴定所涉及的组织。

8、代谢紊乱：

●肥胖：例如脂肪细胞源蛋白质片段的不同疾病的特异性谱；

●1型糖尿病(青少年胰岛素依赖型糖尿病)：在早期阶段的检测，在胰腺中胰岛素产生细胞的主要破坏已经发生之前；

●2型糖尿病(晚发)：CD14模糊(dim)／CD16+组织巨噬细胞增加伴随功能下降(细胞因子的产生)，如果存在动脉粥样硬化并发症；

●性腺功能低下的睾酮治疗：组织巨噬细胞增加，但功能降低。

9、不明起因的疾病：

例如：肌源性肽和其他疾病标志物(例如病毒组分)的检测：

●纤维肌痛；

●慢性疲劳综合征：在组织巨噬细胞中检测病毒的成分。

●不明原因发热(特发性)：CTSM谱的定义作为组织相关损害的直接反映。

10、恶性肿瘤：

对于大多数癌，上皮膜抗原可用作一般标志物与一个或更多个组织特异标志物相组合

●癌，一般性的：例如来自EMA的肽(上皮细胞膜抗原)；

●乳腺癌：例如来自CA15-3抗原的肽；

●甲状腺癌：例如来自RET的肽作为肿瘤标志物；

●食道癌；

●胃癌；

●结肠癌：例如来自癌胚抗原(CEA)的肽；

●直肠／乙状结肠癌；

●肺癌；

●宫颈癌或子宫癌：

●前列腺癌：例如PSA和ERG的肽；

●膀胱癌；

●黑素瘤：例如黑色素肽；MART-1／MELAN-A

●胰腺癌；

●肾癌等；

●神经母细胞瘤：例如从双唾液酸神经节苷脂GD2的；

●脑瘤，例如GFAP(图6)；

●间皮瘤：筛查石棉作业工人并且通过循环中组织巨噬细胞中源自间皮的肽早期诊断；

●罕见癌症，其难以诊断，例如垂体瘤。

11、肿瘤转移的早期检测和监测：

相同CTSM子集中肿瘤衍生肽和来自浸润组织之肽的联合检测，例如：

●乳房癌在骨或肝中转移：乳房源性肽和骨或肝源性肽，在相同TSM子集中的联合检测；

●结肠癌肝转移：在相同CTSM子集中结肠癌衍生肽和肝源性肽的联合检测；

●前列腺癌骨转移：在同一CTSM的子集中前列腺衍生肽和骨衍生肽的联合检测；

●血管内B细胞淋巴瘤：在相同的CTSM子集中内皮源性肽和B细胞衍生肽的联合检测(检测到高水平的组织巨噬细胞：>10％血液白细胞)

●脑淋巴瘤：在相同CTSM中对CNS的肽和B细胞的肽的联合检测。

12、心血管疾病：

●心绞痛：有或无心肌梗死的ECG失常；

●有血栓形成风险的患者中的凝血病症

●II型糖尿病患者的动脉粥样硬化病变

实施例2：在神经胶质瘤患者和健康对照组的CTM中染色胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)

材料与方法

首先对从诊断的(手术干预前)胶质瘤患者(9例)和健康对照组(n=9)新鲜采集的血液样品进行膜表面染色，使用CD300e(UP-H2)-APC(Imm unostep，Salamanca，Spain)、CD14(MO-P9)-APCH7(BDBiosciences San Jose，CA，USA)、CD16(3G8)-PECy7(BD Biosciences SanJose，CA，USA)、CD45(HI30)-PACO(InVitrogen，Grand Island，NY，USA)、HLADR(L243)PacB(BioLegend，San Diego，CA，USA)按照表2中所述的染色方法(方法A，步骤1到13)。样品的表面膜染色后经过使用抗GFAP抗体(N-18)-PE的细胞内染色，染色方法按照表2中描述的(方法B，步骤16至43)。抗GFAP抗体直接针对蛋白质的N-末端表位并且从Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz，CA，USA)得到。使用Fix&Perm(An der Grub，Vienna，AT)进行细胞的固定和透化。染色的细胞使用FACSCantoII多色流式细胞仪(BD Biosciences)测量并且所得的数据使用Infinicyt软件(Cytognos，Salamanca，Spain)进行分析。单核细胞和CTM的选通基于中等SSC和CD45表达的选通以及随后对CD300e和HLADR阳性进行选通(见图4，对于一般的染色图案)。还进行了对于CD16和CD14表达的分析，随后评价细胞内GFAP染色(见图6A)。

结果

早期CTM的百分比表示为每总评价的群体(经典单核细胞+所有CTM)，GFAP阳性细胞表示为阳性细胞在早期CTM群体内的百分比。所有健康对照组有少于10％的早期CTM并且6／9健康对照组有少于5％的早期CTM。在9名健康对照中GFAP阳性早期CTM的百分比小于1％(0.6％、0.7％和7次0％)(见图6B)。胶质瘤患者在9例中有8例为大于5％的早期CTM并且9例中有4例为大于10％。GFAP阳性早期CTM的百分比变化从约1％至约31％(0.9％、1.0％、1.3％、1.4％、2.5％、4.5％、8.7％、29.9％、30.7％)。GFAP阳性的CTM百分比显示出与胶质瘤肿瘤质量(参见图6B)有一定的相关性。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种使用循环中组织巨噬细胞(CTM)作为扰乱组织稳态和疾病的反映来确定对象的健康状况、早期检测组织损伤、早期诊断和监测疾病和／或在对象中评价治疗有效性的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述对象的生物测试样品，其包含循环中组织巨噬细胞(CTM)；

b)使用一组针对核心标志物CD14、CD16和CD300e以及优选还有HLADR的差异标记的不同抗体对所述CTM进行染色，以用于对不同CTM子集的鉴定和计数；

c)使用一种或更多种检测抗体对所述CTM进行固定、透化和染色，所述检测抗体针对蛋白酶诱导的至少一种蛋白质片段上一个或更多个表位，所述蛋白酶诱导的蛋白质片段衍生自其来源组织中的各CTM对非CTM蛋白质的细胞内降解，由此鉴定循环中组织特异性巨噬细胞(CTSM)的至少一个子集；

d)通过选通核心标志物CD14、CD16和CD300e对所述染色的CTM和CTSM进行多参数流式细胞分析以确定与各个细胞相连的每种不同的带标记抗体的信号的量；

e)确定在每个CTM子集和表达每个所测细胞内表位的每个CTSM特定子集内的各细胞的相对和绝对数量；

f)计算(i)在每个源自不同的正常和已改变组织的每个CTM子集和每个CTSM特定子集内细胞的相对和绝对数量，所述CTM子集和所述CTSM特定子集根据所评价的蛋白酶诱导的各个蛋白质片段的集合所限定，以及ii)与所评价的各细胞内肽中每一个相关的抗体关联信号的量，以得到受试CTSM染色谱，和；

g)针对每种所评价的组织，将受试CTSM染色谱和正常CTSM染色谱进行比较，其中异常受试染色谱指示了组织损伤、改变的组织稳态、疾病的存在和/或治疗的有效性与耐受性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中b)包括使用针对标志物CD300e、CD14、CD16和HLADR的抗体进行染色。

3.根据权利要求1和2所述的方法，其中步骤b)还包括使用针对标志物CD45、CD64和CD36中一个或更多个的抗体进行染色。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤d)包括：基于以下实施选通策略：细胞表面表达CD300e、CD14和CD16，优选地CD300e、CD14、CD16和HLADR，并结合侧向散射(SSC)分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其中选通策略由以下构成：(i)纳入步骤，以纳入经典的单核细胞和CTM二者，其基于CD300e表达，优选CD300e和HLADR表达，结合侧向散射(SSC)分析，和(ii)随后的子集鉴定步骤，以区分经典的CD14高／CD16-单核细胞和CTM，并鉴定CTM群体内的子集。

6.根据权利要求5所述的方法，其包括下列任一：

(i)至少对CD300e、CD14和CD16染色并且对SSC加CD300e+细胞之组合进行选通以选择具有低至中等SSC的表达CD300e的细胞；

(ii)至少对CD300e、CD14、CD16和HLADR染色并且对侧向散射(SSC)加CD300e+和HLADR+细胞之组合进行选通以选择具有低至中等SSC的同时共表达CD300e和HLADR的细胞；或者

(iv)至少对CD300e、CD14、CD16、CD45和HLADR染色并且对SSC加CD300e+、CD45+和HLADR+细胞之组合进行选通，优选地对具有CD45以及低至中等SSC的同时共表达CD300e和HLADR的细胞进行选通。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述子集鉴定步骤包括：经典的(CD14高／CD16-)单核细胞和两个主要的CTM子集的鉴定，其鉴定为CD14高／CD16低至CD14高／CD16高、CD14低／CD16高、和CD14-／CD16高至CD14-／CD16低细胞。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述CTM子集步骤包括：

-对代表晚期CTM的CD64低相对于代表经典单核细胞和早期CTM的CD64高进行选通，随后

-通过以携带CD16+／CD14+表型的事件来选择所有其他早期CTM细胞(相对于经典单核细胞)以区分单核细胞和CTM细胞，以及定义整个CTM区室为CD64低和CD16+／CD14+／CD64高，随后

-基于CD64、CD14和CD16的表达水平，将所选的CTM进一步细分为不同的功能或成熟相关区室，优选地其中所述不同的区室为CD64高／CD14高／CD16低至CD64高／CD14高／CD16高、CD64高／CD14低／CD16高、CD64低／CD14-／CD16高和CD64低／CD14-／CD16低。

9.根据权利要求8所述的方法，其中进一步细分所选CTM的步骤是基于CD64、CD14、CD16和CD36，优选地包括鉴定以下CTM子集中至少一个：

从CD64高／CD36高／CD14高／CD16低至CD64高／CD36高／CD14高／CD16高、CD64高／CD36高／CD14低／CD16高、CD64低／CD36高／CD14-／CD16高和CD64低／CD14-／CD16低／CD36-至低的细胞。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括外周血、腹水、胸腔积液、脑脊液、骨髓、淋巴结、淋巴液、滑液、或从实体组织制备的单细胞悬液。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)包括细胞内染色：

a.蛋白酶诱导的单一蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自经细胞内加工的组织相关蛋白质；

b.蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自一种经细胞内加工的组织相关蛋白质；

c.蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自单个器官或组织的正常细胞的两种或更多种经细胞内加工蛋白质；

d.蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自单个器官或组织的不正常细胞的两种或更多种经细胞内加工蛋白质；

e.蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自单个器官或组织的正常和不正常细胞的两种或更多种经细胞内加工之蛋白质，包括至少一种针对正常蛋白质之肽表位的抗体和至少一种针对非正常蛋白质之肽表位的抗体的组合；

f.蛋白酶诱导的两种或更多种不同的蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自两个或更多个器官或组织的正常和不正常细胞的两种或更多种经细胞内加工之蛋白质。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种检测抗体允许检测一个或更多个源自异常蛋白的肽表位，优选地其中所述的异常蛋白选自：癌基因蛋白、突变蛋白、融合蛋白、源自过敏原的蛋白质和源自病原体(如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的蛋白质。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述差异标记的抗体组包括选自以下的相容性荧光染料的组合：异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)、别藻蓝蛋白(APC)、alexa fluor488、alexa647，alexa710、alexa fluor405、花青素5(Cy5)、花青素5.5(Cy5.5)、太平洋蓝(PacB)、地平线紫450(HV450)、太平洋橙(PacO)、亮紫(BV)、HV500、OC515、克罗梅橙、量子点及其与PE、APC或PerCP(例如PE／Cy5、PE／Cy5.5、PE／Cy7、PerCP／Cy5.5、APC／Cy7、PE-德州红、APCCy750)偶联的缀合物或者任何其他相容性荧光染料或荧光染料串联体。

14.诊断试剂盒，其包含：在第一容器中的针对一组核心标志物的差异标记的抗体，其中所述核心标志物为CD300e、CD14和CD16并且优选还有HLADR，和任选地使用所述试剂盒以鉴定和计数至少一个、优选至少两个、更优选至少三个CTM子集的说明书。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述第一容器包含针对标志物CD300e、CD14和CD16，优选CD300e、CD14、CD16和HLADR的抗体，更优选地还包括选自针对标志物CD36、CD64或CD45之抗体的至少一种抗体。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一容器包含针对CD300e、CD14、CD16、HLADR、CD45、CD64和CD36的抗体。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的试剂盒，其还包括第二容器，所述第二容器包含至少一种针对蛋白酶诱导的至少一种蛋白质片段上一个或更多个表位的检测抗体，所述蛋白质片段衍生自其来源组织中各CTM对非CTM蛋白质的细胞内降解。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第二容器包含至少一种针对衍生自上皮蛋白质细胞内降解的蛋白酶诱导的一种或更多种蛋白质片段的检测抗体，所述上皮蛋白质优选乳腺上皮蛋白、食道上皮蛋白、胃上皮蛋白、胰上皮蛋白、结肠上皮蛋白、直肠-乙状结肠上皮蛋白、甲状腺上皮蛋白、肺或支气管上皮蛋白、前列腺上皮蛋白、膀胱上皮蛋白、宫颈上皮蛋白、子宫上皮蛋白、黑素瘤蛋白(例如Melan-A)、肾-肾小球蛋白、或针对其他上皮细胞标志物，任选地还包括用于恶性肿瘤早期诊断和监测的说明。

19.根据权利要求17或18所述的诊断试剂盒，其中所述第二容器包含至少一种检测抗体，其允许检测衍生自脑或神经特异性蛋白质细胞内降解的一个或多个表位，优选地所述脑或神经特异性蛋白质选自Apoε4、淀粉样前体蛋白(APP)、GFAP和髓鞘质，任选地还包括用于阿尔茨海默氏病、神经胶质瘤或多发性硬化症的早期诊断和监测的说明。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的诊断试剂盒，其中第二容器包含至少一种检测抗体，其允许检测衍生自心肌特异性蛋白质(例如肌钙蛋白或CK-MB)、肾／肾小球特异性蛋白、肝特异性蛋白或肺特异性蛋白细胞内降解的一个或多个表位，任选地其还包括用于在分别经历了心、肾、肝或肺移植的患者中评估移植后器官存活和移植排斥过程的说明。

Claims (20)

1.一种使用循环中组织巨噬细胞(CTM)作为扰乱组织稳态和疾病的反映来确定对象的健康状况、早期检测组织损伤、早期诊断和监测疾病和／或在对象中评价治疗有效性的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述对象的生物测试样品，其包含循环中组织巨噬细胞(CTM)；

b)使用一组针对核心标志物CD14、CD16和CD300e以及优选还有HLADR的差异标记的不同抗体对所述CTM进行染色，以用于对不同CTM子集的鉴定和计数；

c)使用一种或更多种检测抗体对所述CTM进行固定、透化和染色，所述检测抗体针对蛋白酶诱导的至少一种蛋白质片段上一个或更多个表位，所述蛋白酶诱导的蛋白质片段衍生自其来源组织中的各CTM对非CTM蛋白质的细胞内降解，由此鉴定循环中组织特异性巨噬细胞(CTSM)的至少一个子集；

d)对所述染色的CTM和CTSM进行多参数流式细胞分析以确定与各个细胞相连的每种不同的带标记抗体的信号的量；

e)确定在每个CTM子集和表达每个所测细胞内表位的每个CTSM特定子集内的各细胞的相对和绝对数量；

f)计算(i)在每个源自不同的正常和已改变组织的每个CTM子集和每个CTSM特定子集内细胞的相对和绝对数量，所述CTM子集和所述CTSM特定子集根据所评价的蛋白酶诱导的各个蛋白质片段的集合所限定，以及ii)与所评价的各细胞内肽中每一个相关的抗体关联信号的量，以得到受试CTSM染色谱，和；

g)针对每种所评价的组织，将受试CTSM染色谱和正常CTSM染色谱进行比较，其中异常受试染色谱指示了组织损伤、改变的组织稳态、疾病的存在和/或治疗的有效性与耐受性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括使用针对标志物CD300e、CD14、CD16和HLADR的抗体进行染色。

3.根据权利要求1和2所述的方法，其中步骤b)还包括使用针对标志物CD45、CD64和CD36中一个或更多个的抗体进行染色。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤d)包括：基于以下实施选通策略：细胞表面表达CD300e、CD14和CD16，优选地CD300e、CD14、CD16和HLADR，并结合侧向散射(SSC)分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其中选通策略由以下构成：(i)纳入步骤，以纳入经典的单核细胞和CTM二者，其基于CD300e表达，优选CD300e和HLADR表达，结合侧向散射(SSC)分析，和(ii)随后的子集鉴定步骤，以区分经典的CD14高／CD16-单核细胞和CTM，并鉴定CTM群体内的子集。

6.根据权利要求5所述的方法，其包括下列任一：

(i)至少对CD300e、CD14和CD16染色并且对SSC加CD300e+细胞之组合进行选通以选择具有低至中等SSC的表达CD300e的细胞；

(ii)至少对CD300e、CD14、CD16和HLADR染色并且对侧向散射(SSC)加CD300e+和HLADR+细胞之组合进行选通以选择具有低至中等SSC的同时共表达CD300e和HLADR的细胞；或者

(iv)至少对CD300e、CD14、CD16、CD45和HLADR染色并且对SSC加CD300e+、CD45+和HLADR+细胞之组合进行选通，优选地对具有CD45以及低至中等SSC的同时共表达CD300e和HLADR的细胞进行选通。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述子集鉴定步骤包括：经典的(CD14高／CD16-)单核细胞和两个主要的CTM子集的鉴定，其鉴定为CD14高／CD16低至CD14高／CD16高、CD14低／CD16高、和CD14-／CD16高至CD14-／CD16低细胞。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述CTM子集步骤包括：

-对代表晚期CTM的CD64低相对于代表经典单核细胞和早期CTM的CD64高进行选通，随后

-通过以携带CD16+／CD14+表型的事件来选择所有其他早期CTM细胞(相对于经典单核细胞)以区分单核细胞和CTM细胞，以及定义整个CTM区室为CD64低和CD16+／CD14+／CD64高，随后

-基于CD64、CD14和CD16的表达水平，将所选的CTM进一步细分为不同的功能或成熟相关区室，优选地其中所述不同的区室为CD64高／CD14高／CD16低至CD64高／CD14高／CD16高、CD64高／CD14低／CD16高、CD64低／CD14-／CD16高和CD64低／CD14-／CD16低。

9.根据权利要求8所述的方法，其中进一步细分所选CTM的步骤是基于CD64、CD14、CD16和CD36，优选地包括鉴定以下CTM子集中至少一个：

从CD64高／CD36高／CD14高／CD16低至CD64高／CD36高／CD14高／CD16高、CD64高／CD36高／CD14低／CD16高、CD64低／CD36高／CD14-／CD16高和CD64低／CD14-／CD16低／CD36-至低的细胞。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括外周血、腹水、胸腔积液、脑脊液、骨髓、淋巴结、淋巴液、滑液、或从实体组织制备的单细胞悬液。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)包括细胞内染色：

a.蛋白酶诱导的单一蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自经细胞内加工的组织相关蛋白质；

b.蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自一种经细胞内加工的组织相关蛋白质；

c.蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自单个器官或组织的正常细胞的两种或更多种经细胞内加工蛋白质；

d.蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自单个器官或组织的不正常细胞的两种或更多种经细胞内加工蛋白质；

e.蛋白酶诱导的两种或更多种不同蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自单个器官或组织的正常和不正常细胞的两种或更多种经细胞内加工之蛋白质，包括至少一种针对正常蛋白质之肽表位的抗体和至少一种针对非正常蛋白质之肽表位的抗体的组合；

f.蛋白酶诱导的两种或更多种不同的蛋白质片段的一个或更多个表位，所述蛋白质片段衍生自来自两个或更多个器官或组织的正常和不正常细胞的两种或更多种经细胞内加工之蛋白质。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种检测抗体允许检测一个或更多个源自异常蛋白的肽表位，优选地其中所述的异常蛋白选自：癌基因蛋白、突变蛋白、融合蛋白、源自过敏原的蛋白质和源自病原体(如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的蛋白质。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述差异标记的抗体组包括选自以下的相容性荧光染料的组合：异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)、别藻蓝蛋白(APC)、alexa fluor488、alexa647，alexa710、alexa fluor405、花青素5(Cy5)、花青素5.5(Cy5.5)、太平洋蓝(PacB)、地平线紫450(HV450)、太平洋橙(PacO)、亮紫(BV)、HV500、OC515、克罗梅橙、量子点及其与PE、APC或PerCP(例如PE／Cy5、PE／Cy5.5、PE／Cy7、PerCP／Cy5.5、APC／Cy7、PE-德州红、APCCy750)偶联的缀合物或者任何其他相容性荧光染料或荧光染料串联体。

14.诊断试剂盒，其包含：在第一容器中的一组核心标志物，其包括差异标记的抗体，其中所述核心标志物为CD300e、CD14和CD16并且优选还有HLADR，和任选地使用所述试剂盒以鉴定和计数至少一个、优选至少两个、更优选至少三个CTM子集的说明书。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述第一容器包含针对标志物CD300e、CD14和CD16，优选CD300e、CD14、CD16和HLADR的抗体，更优选地还包括选自针对标志物CD36、CD64或CD45之抗体的至少一种抗体。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一容器包含针对CD300e、CD14、CD16、HLADR、CD45、CD64和CD36的抗体。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的试剂盒，其还包括第二容器，所述第二容器包含至少一种针对蛋白酶诱导的至少一种蛋白质片段上一个或更多个表位的检测抗体，所述蛋白质片段衍生自其来源组织中各CTM对非CTM蛋白质的细胞内降解。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第二容器包含至少一种针对衍生自上皮蛋白质细胞内降解的蛋白酶诱导的一种或更多种蛋白质片段的检测抗体，所述上皮蛋白质优选乳腺上皮蛋白、食道上皮蛋白、胃上皮蛋白、胰上皮蛋白、结肠上皮蛋白、直肠-乙状结肠上皮蛋白、甲状腺上皮蛋白、肺或支气管上皮蛋白、前列腺上皮蛋白、膀胱上皮蛋白、宫颈上皮蛋白、子宫上皮蛋白、黑素瘤蛋白(例如Melan-A)、肾-肾小球蛋白、或针对其他上皮细胞标志物，任选地还包括用于恶性肿瘤早期诊断和监测的说明。

19.根据权利要求17或18所述的诊断试剂盒，其中所述第二容器包含至少一种检测抗体，其允许检测衍生自脑或神经特异性蛋白质细胞内降解的一个或多个表位，优选地所述脑或神经特异性蛋白质选自Apoε4、淀粉样前体蛋白(APP)、GFAP和髓鞘质，任选地还包括用于阿尔茨海默氏病、神经胶质瘤或多发性硬化症的早期诊断和监测的说明。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的诊断试剂盒，其中第二容器包含至少一种检测抗体，其允许检测衍生自心肌特异性蛋白质(例如肌钙蛋白或CK-MB)、肾／肾小球特异性蛋白、肝特异性蛋白或肺特异性蛋白细胞内降解的一个或多个表位，任选地其还包括用于在分别经历了心、肾、肝或肺移植的患者中评估移植后器官存活和移植排斥过程的说明。

Images