CN106568757A - 一种检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒。该试剂盒包括a)TCP‑1‑H6多肽、b)TP‑1‑H6多肽、c)水溶性量子点、d)FITC、e)DAPI。水溶性量子点与靶向TCP‑1‑H6多肽通过His‑tag偶联作为荧光探针(TCP‑1‑H6‑QD)。TCP‑1‑H6‑QD能特异性的标记colon26细胞的受体和结肠癌肿瘤组织切片，而不会识别正常的结肠组织和脑组织。本发明提供的这种试剂盒，对结肠癌肿瘤的诊断和治疗具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物技术领域，涉及一种结肠癌肿瘤检测试剂盒，具体涉及一种检测结肠癌肿瘤细胞和肿瘤组织的量子点靶向探针试剂盒。
背景技术
结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，由于早期症状不明显和缺乏特异性，发生肿瘤时症状隐蔽而不易察觉。结肠癌的检查方法有多种，其中结肠镜和钡灌肠检查是常用的检查方法，但这些检查只能显示结肠腔内的病变情况，无法显示腔外的病变，且检测有一定的痛苦。
检测肿瘤细胞需要一个能特异性识别肿瘤标志物的探针，传统的有机荧光染料是生物标记与细胞成像常用的探针，但也存在一些固有的缺陷，如光稳定性差、易光漂白、发射谱峰拖尾等，这些都使其应用受到限制。与传统有机染料相比，量子点具有更优异的光谱性质，如激发谱峰宽且连续分布，而发射光谱成对称分布且宽度窄，颜色可调，并且光化学稳定性高，不易光解(Marcel BJ,Mario M,Peter G,et al.Science 1998,281,2013-2016)。这些优越的性能使量子点在体内细胞成像和生物特定标记等方面都得到了广泛应用，并日益成为分子细胞成像研究中非常重要的一种探针工具。
目前，在生物标记中应用最广泛的是金属有机溶剂法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子点。脂溶性的量子点通常需要聚合物或者巯基小分子修饰从而转化为水溶性才能生物应用。量子点与生物分子的偶联方法有很多种，包括共价偶联和静电吸附。另一种方法是在生物分子上引入一个His-tag。量子点表面的Zn原子和多组氨酸残基的金属亲和协调作用，含有组氨酸残基的蛋白质和多肽能够直接接到量子点表面的Zn原子，这种方法具有很好的稳定性，已逐渐成为生物标记中一种常用的方法。
TCP-1(环状多肽cyclo(1,9)-CTPSPFSHC)是通过体内噬菌体展示技术和原位结肠癌动物模型相结合筛选出一种新型的肿瘤靶向多肽。这个多肽在体内可以特异性地结合结肠肿瘤新生的血管细胞(CD31+阳性细胞)而不会结合到正常组织(Li Z J,Wu W K K,Ng SS M,et al.JControl Release,2010,148:292–302)。
最近，多肽修饰的量子点已广泛应用于生物成像领域。本发明克服了之前结肠癌肿瘤检测的不足，运用TCP-1-H6-QD靶向探针的试剂盒，检测结肠癌肿瘤细胞和肿瘤组织。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒。
本发明所要解决的再一技术问题在于提供上述量子点试剂盒的用途。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种用于检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒，其特征是：该试剂盒包括a)TCP-1-H6多肽、b)TP-1-H6多肽、c)水溶性量子点、d)FITC、e)DAPI。
本发明选用的量子点为含有Zn的量子点，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。该量子点是由谷胱甘肽作为修饰剂将脂溶性量子点转换为水溶性量子点。
本发明中选用的TCP-1-H6多肽为cyclo(1,9)-CTPSPFSHCGP9G2H6，TP-1-H6多肽为TPSPFSHGP9G2H6，两种多肽均由Fmoc固相合成法合成。
在本发明中TCP-1-H6多肽与量子点按18:1混合，震荡10min后，用超滤去除多余的多肽分子，得到量子点-多肽复合物，即为量子点靶向探针。
针对上述的量子点试剂盒的用途，用于检测结肠癌肿瘤细胞和肿瘤组织。
本发明的有益效果是：本发明将TCP-1肿瘤靶向多肽与水溶性量子点通过His-tag相结合，可准确、快速、灵敏地特异性标记结肠癌肿瘤细胞与肿瘤组织，而不会识别正常的结肠组织和脑组织，该试剂盒在临床上具有实用价值。
附图说明
下面结合附图和实施案例对本发明进一步说明。
图1是Colon 26细胞分别与TCP-1-H6-QD(A),QDs(B)和TP-1-H6-QD(C)混合孵育4h后的共聚焦成像图，标尺20μm。
图2是TCP-1-H6-QD识别结肠癌肿瘤组织。A，TCP-1-H6-QD结肠肿瘤组织成像；B，TCP-1-H6-QD肿瘤组织成像，同时加入150μM TCP-1-H6；C，TCP-1-H6-QD正常结肠组织成像；D，TCP-1-H6-QD脑组织成像；E，量子点肿瘤组织成像。放大倍数：400×
具体实施方式
实施例
本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
实施例1一种用于检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒组成与配置：
该试剂盒包括a)TCP-1-H6多肽、b)TP-1-H6多肽、c)水溶性量子点、d)FITC、e)DAPI。
A).TCP-1-H6多肽序列为cyclo(1,9)-CTPSPFSHCGP9G2H6。
B).TP-1-H6多肽序列为TPSPFSHGP9G2H6。两种多肽均由固相合成法合成。
C).水溶性量子点为含有Zn的量子点，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。该量子点是由谷胱甘肽作为修饰剂将脂溶性量子点转换为水溶性量子点。
D).异硫氰酸荧光素(FITC)
E).4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)
实施例2用检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒检测Colon26细胞，其过程如下：
1.将多肽与量子点按照18:1的比例混合，震荡10分钟后，用超滤去除多余的多肽分子，即得到量子点—多肽荧光探针。
2.细胞核用DAPI染色后的Colon 26细胞在RPMI-1640(Invitrogen)培养基中培养,并在二氧化碳培养箱中培育过夜(5％CO2,37℃)。
3.TCP-1-H6-QD与混合后,37℃培育4h，并用没标记多肽的量子点和TP-1-H6-QD与孵育作对照。
4.培育后的细胞用PBS缓冲液(pH 7.4)洗三次。
5.在Nikon C1si激光共聚焦荧光显微镜(Nikon,Japan)下观察荧光成像(激发波长为488nm)。
实验结果证实，TCP-1-H6-QD中量子点的荧光与DAPI的荧光有很大重合(图1A)，这表明TCP-1-H6-QD主要存在于细胞核内。量子点荧光成像清晰地表明TCP-1-H6-QD能特异性进入colon 26细胞内，TCP-1-H6的靶向作用引导量子点进入细胞内。而单独的量子点(图1B)和TP-1-H6-QD(图1C)与colon26细胞孵育后，均未观察到明显的量子点荧光。进一步证实了TCP-1-H6-QD特异性标记colon 26细胞的受体。
实施例3用检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒检测小鼠结肠癌肿瘤组织切片，其过程如下：
1.将多肽与量子点按照18:1的比例混合，震荡10分钟后，用超滤去除多余的多肽分子，即得到量子点—多肽荧光探针。
2.选取含有结肠癌肿瘤小鼠的结肠癌肿瘤组织切片，并选取正常的结肠组织与脑组织作对照。
3.对选取的组织中的血管用FITC标记的二抗染色，细胞核用DAPI染色。
4.肿瘤组织或其他组织与TCP-1-H6-QD(100nM)混合后,37℃培育1h。
5.培育后的组织用PBS缓冲液(pH 7.4)洗三次。
6.在Nikon C1si激光共聚焦荧光显微镜(Nikon,Japan)下观察荧光成像(激发波长为488nm)。
实验结果还证实，TCP-1-H6-QD可以特异性识别结肠癌肿瘤组织切片(图2A)，但是不会识别正常的组织比如结肠组织和脑组织(图2C和图2D)。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
1.一种检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括a)TCP-1-H6多肽、b)TP-1-H6多肽、c)水溶性量子点、d)FITC、e)DAPI，TCP-1-H6多肽与水溶性量子点通过His-tag偶联作为荧光探针TCP-1-H6-QD。
2.一种检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒的制备方法，其特征在于，TCP-1-H6多肽与水溶性量子点混合后震荡，用超滤去除多余的多肽分子，得到所述的荧光探针TCP-1-H6-QD。
3.根据权利要求1所述的检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒，其特征在于，水溶性量子点是由谷胱甘肽为修饰剂将脂溶性量子点转换而成。
4.根据权利要求1所述的检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒，其特征在于，所述的水溶性量子点为含有Zn的量子点CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
5.根据权利要求1所述的检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒，其特征在于，TCP-1-H6多肽为cyclo(1,9)-CTPSPFSHCGP9G2H6。
6.根据权利要求1所述的检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒，其特征在于，TP-1-H6多肽为TPSPFSHGP9G2H6。
7.根据权利要求1所述的检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒，其特征在于，TCP-1-H6多肽配体包括用于结合量子点的组氨酸序列、提供多肽刚性结构的序列和靶向序列，各序列之间以肽键相结合。
8.根据权利要求2所述的检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒的制备方法，其特征在于，TCP-1-H6多肽与水溶性量子点混合摩尔比为18:1。
9.根据权利要求2所述的检测结肠癌肿瘤的量子点靶向探针试剂盒的制备方法，其特征在于，TCP-1-H6多肽与水溶性量子点混合后震荡10min。
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