CN103497916A - 一株枯草芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用。本发明公开的一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其保藏编号为CGMCC No.7621。作为小麦赤霉病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用。

背景技术

禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）是禾本科作物的重要病原菌之一，可引起麦类赤霉病(Fusarium Head Blight，FHB)，禾谷镰刀菌为限制小麦产量的一个主要因素(Dubin,1997)。我国气候条件十分有利于麦类赤霉病的发生，长江中下游地区常年病害造成产量损失10%-15%，大流行年份减产近50%(黄昌等，2000)。由于全球气候变暖以及秸秆还田、免耕栽培等耕作制度改变的影响，我国麦类赤霉病的发生区域由长江流域迅速向西北、华北扩展（张昊，2011），特别是在2008、2010和2012年，全国麦类赤霉病发生十分严重，造成了严重的产粮损失和不良的社会影响，严重威胁我国粮食安全。

禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，3,7,15三羟基-12,13环氧单端孢霉-9烯-8酮）是存在于赤霉病菌感染麦粒中的主要天然毒素之一。DON已被认定为最危险的自然发生食品污染物之一，被列入国际研究的优先地位(Larsen et al.,2004)。DON可致人免疫力下降、贫血、头痛、腹痛、恶心；致动物拒食、生长延滞和流产(Rochaet al.,2005；Sobrova et al.,2010；Pestka,2010)。DON广泛存在并大量污染小麦及其制品，对人畜构成很大危害，严重威胁我国食品安全。

因此，加强禾谷镰刀菌防控研究已成为保障我国粮食安全和食品安全的迫切需求。

多年来对麦类赤霉病防治主要依靠化学农药,但随着化学农药带来的环境问题，加之多年用药已导致病原菌抗药性禾谷镰刀菌菌株的出现（Changjun Chen et al.，2007）,使防治难度加大。虽然在赤霉病抗性品质方面国内外投入大量的精力开展相关研究，但至今尚无理想的高抗小麦品种（李正辉等，2007）。

生物防治不仅可降低对环境的影响，还不易产生抗药性，相关理论和技术的研究日益为人们所关注。枯草芽孢杆菌营养简单，在自然界中广泛存在,对人畜无毒无害,不污染环境,能产生多种抗菌素和酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，较其他微生物更具有开发为生物防控菌剂的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用。

本发明提供的一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其保藏编号为CGMCCNo.7621。

上述菌株在生物防治镰刀菌引起的植物病害中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。

上述任一所述的应用中，所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。

上述任一所述的应用中，所述植物为谷物；所述谷物为麦类作物或玉米；所述麦类作物具体为小麦。

上述菌株在制备抑制镰刀菌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述的镰刀菌为禾谷镰刀菌。

一种防治镰刀菌引起的植物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为上述枯草芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产物。

上述方法中，所述生长过程为扬花期。

上述任一所述的方法中，所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。

上述任一所述的方法中，所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。

上述任一所述的方法中，所述植物为谷物；所述谷物为麦类作物或玉米；所述麦类作物具体为小麦。

本发明提供的枯草芽孢杆菌不仅在平板培养时可高效抑制禾谷镰刀菌，而且在田间小区实验中其防治效果高达77.4%，是多菌灵1000倍稀释液防治效果的2倍，即防治效果明显优于目前普遍施用的多菌灵。作为小麦赤霉病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。

附图说明

图1为对峙培养实验。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

NB液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋白胨在NB液体培养基中的浓度为1%，牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0.3%，NaCl在NB液体培养基中的浓度为0.5%，所述%均为质量体积百分比（g/100ml）。

NA固体培养基：在NB液体培养基中加入琼脂（琼脂与液体培养基的比例为1.5g：100ml），得到NA固体培养基。

PDA培养基：马铃薯200g,加入少量水煮20min，三层纱布过滤，取滤液用水定容至1L，加入20g葡萄糖，15g琼脂，121℃高压灭菌20min。

绿豆汤培养基：绿豆10g，加入少量水煮20min，三层纱布过滤，取滤液用水定容至1L，分装后121℃高压灭菌20min。

禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）FG1在文献“杨慧勇,李飞凤,陆琼娴,徐剑宏,史建荣.拮抗菌株AFR0406对小麦赤霉病菌和纹枯病菌的生物活性测定.江苏农业科学，2006(06),142-144.”中公开过，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。

小麦石新828品种在文献“孙志军，杨晓丽，张辉，张广辉.小麦新品种石新828选育过程及高产栽培技术.现代农业科技，2011（09），96-97.”中公开过，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。

实施例1、菌的分离与鉴定

一、菌的分离

（一）2011年10月，在超净工作台中，将京郊采集的丝瓜花药放在无菌蒸馏水中振荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为180rpm。

（二）将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于禾谷镰刀菌对峙培养实验。将得到的对禾谷镰刀菌拮抗能力最强的一株菌命名为SG6。

二、鉴定

（一）按照“伯杰细菌鉴定手册”（第八版）和“常见细菌系统鉴定手册”（东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2）中描述的方法，对菌株SG6进行形态特征、培养特性和生理生化特性鉴定，具体结果如下：

菌体的形态特征：

呈杆状，周生鞭毛，革兰氏阳性。

培养特性：

菌落呈污白色或微黄色，表面粗糙不透明，菌落软而湿润、质地均匀。

生理生化特性：

葡萄糖：+；木糖：+；L-阿拉伯糖：+；甘露醇：+；乳糖：-；发酵葡萄糖产气：+；利用柠檬酸盐：+；50℃生长：+；pH5.7生长：+；7%NaCl生长：+；淀粉水解：+；分解酪素：+；硝酸盐还原：+。

（二）16S rDNA试验

提取SG6的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列如SEQ IDNo.1所示。

根据Gen-Bank序列同源性比较，菌株SG6与Bacillus subtilis strain CICC10163(GenBank登录号DQ005496.1)同源性为100%，与Bacillus amyloliquefaciens M20J(GenBank登录号AB735995.1)同源性为100%，初步判定该菌为芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp.)。

基于以上特征，将菌株SG6鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌株已于2013年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7621。

实施例2、枯草芽孢杆菌SG6对禾谷镰刀菌的拮抗作用

采用对峙培养法检测枯草芽孢杆菌SG6对禾谷镰刀菌的拮抗。

一、用直径为5mm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）FG1菌落边缘打取菌盘，用灭菌的牙签将菌盘挑入PDA平板中心。

二、在距PDA平板中心25mm处四点划线接种相同体积和浓度的SG6，以仅接种禾谷镰刀菌菌盘的PDA平板为对照组，28℃培养4-5天，观察有无抑菌带形成。每个组做三个平行。结果如图1和表1所示。

图1中，1：对照组；2：SG6组

图1表明，SG6对禾谷镰刀菌有很强的抑制效果。

表1培养5天后SG6对禾谷镰刀菌的抑制作用

（抑菌带宽度是指病原菌边缘至拮抗菌株边缘的最短距离)

实施例3、SG6对禾谷镰刀菌的田间防治

一、将SG6在NB培养基中28℃振荡过夜培养，稀释至浓度为2.4×10⁸cfu/ml。在石新828品种的扬花期进行喷雾，喷雾体积为300ml，作为实验组。

同时以50%多菌灵1000倍稀释液和不接菌的NB稀释液在小麦石新828品种的扬花期分别进行喷雾，喷雾体积为300ml，其中以不接菌的NB稀释液组作为对照组。

二、将禾谷镰刀菌FG₁用绿豆汤培养基振荡培养（28℃，5天），得到菌悬液，菌液浓度为2×10⁵cfu/ml。

三、在完成上述三组喷雾处理后，立即进行禾谷镰刀菌菌悬液喷雾接种，喷雾体积为300ml，均匀喷在每组的小区上，每组的小区面积(即田间面积)为2m²。

每组设3个重复，结果取平均值。

禾谷镰刀菌菌悬液喷雾接种21天后，观察麦穗的发病，有麦穗干枯发白或发红，内部籽粒不饱满、重量减轻表现的麦穗为发病麦穗。

各组的病情指数按照公式1计算。

SG6组和多菌灵组的防治效果按照公式2计算。

式中，CK是指NB稀释液组，处理是指SG6组和多菌灵组。

表2SG6对禾谷镰刀菌的田间防治效果

防治效果如表2所示，结果表明，枯草芽孢杆菌SG6能很好防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其保藏编号为CGMCC No.7621。

2.权利要求1所述的菌株在生物防治镰刀菌引起的植物病害中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。

5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述植物为谷物；所述谷物为麦类作物或玉米；所述麦类作物具体为小麦。

6.权利要求1所述的菌株在制备抑制镰刀菌的产品中的应用。

7.一种防治镰刀菌引起的植物病害的方法，是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。

10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为谷物；所述谷物为麦类作物或玉米；所述麦类作物具体为小麦。