CN105176894B

CN105176894B - 一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂

Info

Publication number: CN105176894B
Application number: CN201510742976.0A
Authority: CN
Inventors: 李社增; 马平; 鹿秀云; 郭庆港; 张晓云; 商俊燕
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2035-11-03
Also published as: CN105176894A

Abstract

本发明属于农业生物防治领域，具体公开了一种用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB27688，其保藏编号为CGMCC No.11457。本发明还公开了利用该菌制备的微生物菌剂，以及它们在防治番茄灰霉病上的应用。本发明为防治番茄灰霉病提供了一个高效的微生物，平均防效在80.0％以上，且针对性强；其次，本发明微生物菌剂对人、畜安全，属于环境友好型；此外，利用本发明防治番茄灰霉病持效期长，不易产生抗药性；本发明制备方法简单、成本低、使用简单。

Description

一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂

技术领域

本发明属于农业生物防治领域，具体涉及一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌，以及含有该解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，还涉及它们在防治番茄灰霉病上的应用。

背景技术

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)引起的一种重要病害。该病害主要危害果实，造成果实腐烂，也危害叶、茎和花，番茄减产可达20％～50％，损失严重；该病发病后传播速度非常快，严重威胁保护地番茄生产。其病原菌寄主范围较广，除侵染茄科蔬菜外，还可侵染瓜类、甘蓝、菜豆、莴苣、洋葱、苹果等作物。

目前，对番茄灰霉病的主要防治方法有：一是化学防治。化学防治虽有见效快、效率高等优点，但是因长期使用会造成环境污染、危害害虫的天敌等缺点，因此逐步被淘汰；其次是生物防治，由于生物防治药效高、持效期长、不易产生抗药性、环境友好等优点日益受到人们的青睐。

芽孢杆菌(Bacillius sp)是一种受到广泛关注的生防细菌，以其分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、贮藏期长和使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物。因芽孢杆菌能产生内生芽孢，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是用于防治番茄灰霉病的芽孢杆菌之一，目前，用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌主要有CGMCC No.4777(专利号：ZL201210059785.0)、BA-KA3(专利申请号：201410618581.5)、SZ23(专利申请号：201410683826.2)、LH-1(专利申请号：201410735508.6)和NCPSJ17(专利申请号：201310112580.9)等。由于病原菌的多样性和同步进化特性，因此需要寻找不同的新菌株防治番茄灰霉病。

发明内容

本发明目的在于提供一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、广谱杀菌活性优点。

本发明第二目的在于提供一种利用上述解淀粉芽孢杆菌生产的微生物菌剂。

本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株在防治番茄灰霉病上的用途。

本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的用途。

本发明第六目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株的鉴定方法。

本发明第七目的在于提供上述微生物菌剂的鉴定方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB27688，己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11457。

利用上述解淀粉芽孢杆菌HMB27688生产的微生物菌剂，其活性成分为HMB27688菌体。

上述微生物菌剂可以为液体制剂。

上述微生物菌剂，其中HMB27688的活菌数大于18.0×10⁸cfu/mL。

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的HMB27688菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL LB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基中，在温度为25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养40～50h，得发酵液；

(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB27688菌株的液体制剂。

所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。

上述制备方法步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。

上述制备方法步骤(2)中所述的LB液体培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl 0.1～1.0％，MnSO₄·H₂O 0.5～1.0％，其余为水；pH值为7.2。

所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO₄·H₂O混合，再加水，调节pH搅拌均匀即可。

上述解淀粉芽孢杆菌HMB27688在防治番茄灰霉病上的应用。

上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的应用。

本发明微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为10⁷cfu/mL，于番茄灰霉病发病前进行叶面喷雾即可。

HMB27688菌株的筛选分离过程

HMB27688菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市的棉田土壤中分离得到。2013年4月河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市棉田中五点采集土样，混匀后称取1g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10^-4、10^-5、10^-6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200μL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d-3d，进行细菌的分离和纯化。并以番茄灰霉病为靶标，通过平板对峙法、离体叶片法、盆栽试验法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对番茄灰霉病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB27688。

HMB27688菌株的分类鉴定：

(1)形态特征鉴定

在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB27688属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(2)利用16S rDNA序列鉴定分类

以HMB27688的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16S rDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为：

F27：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’；(SEQ ID No:1)，

R1492：5’GGCTACCTTGTTACGACTT3’；(SEQ ID No:2)；

16S rDNA的扩增反应体系为50μL:10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL，F27(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL；HMB27688的基因组DNA 50ng；ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB27688的16S rDNA序列(见SEQ ID No:3)。将所得HMB27688的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB27688与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到99％；构建系统发育树(见图1)，HMB27688与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB27688属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(3)利用gyrB基因序列鉴定分类

以HMB27688基因组DNA为模板，利用芽孢杆菌gyrB基因简并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物的序列为：

gyrB-F：5’TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3’；(SEQ ID No:4)

gyrB-R：5’TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3’；(SEQ ID No:5)

gyrB的PCR扩增反应体系为50μL:10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL；HMB27688基因组DNA 50ng；ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB27688菌株的gyrB基因序列(见SEQ ID No:6)。将获得的HMB27688菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树。结果发现HMB27688与解淀粉芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高；构建系统发育树(见图2)，HMB27688菌株与解淀粉芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB27688为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并且是一个新菌株。

综合以上形态特征、16S rDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知HMB27688属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并且和现有的解淀粉芽孢杆菌菌株不同，是一个新菌株。

上述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27688的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，即为HMB27688菌株。

上述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27688的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID No:6所示的核苷酸序列，即为HMB27688菌株

上述微生物菌剂的鉴定方法，包括以待测菌剂中提取的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，即为HMB27688微生物菌剂；或以待测菌剂中提取的基因组DNA为模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID No:6所示的核苷酸序列，即为HMB27688微生物菌剂。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明为防治番茄灰霉病提供了一个高效的微生物，开辟了一个新的防治途径；(2)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病的药效高，平均防效在80.0％以上，且针对性强；(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，属于环境友好型；(4)利用本发明方法防治番茄灰霉病不易产生抗药性；(5)本发明制备方法简单、成本低、使用简单。

附图说明

图1.为根据16S rDNA序列获得的HMB27688菌株的系统发育树图。

图2.为根据gyrB基因序列获得的HMB27688菌株的系统发育树图。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1HMB27688微生物菌剂的制备

按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-80℃的菌株HMB27688(解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27688己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11457)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃进行活化，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培养12小时，得活化的菌株。

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB液体培养基100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)中活化的菌株，在30℃、摇床转速180rpm的条件下进行振荡培养12小时，得种子液。

(3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl 0.5％，MnSO₄·H₂O 0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用。

(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速180rpm条件下进行发酵培养36小时，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞数/(成熟芽胞数+菌体数)×100)；芽胞率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养48h，得解淀粉芽孢杆菌HMB27688的液体制剂。

实施例2解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉菌的拮抗作用试验

(一)试验时间和地点：2013年8月上旬在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。

(二)试验方法：

(1)供试番茄灰霉菌来源：番茄灰霉菌BC-1菌株采自河北省保定市容城县东牛东庄村番茄病果，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，致病力测定表现为强致病力。

(2)平板对峙实验：

首先将番茄灰霉菌BC-1在PDA平板上活化，培养4天后在菌落边缘区域，用打孔器()打孔制成菌片，将番茄灰霉菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例1步骤(1)中活化的解淀粉芽孢杆菌HMB27688点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB27688菌株的番茄灰霉菌生长情况)。25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量番茄灰霉菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HMB27688后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示。计算公式为：

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100

结果(见表1)解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉菌的抑制率达88.16％；透明的抑菌带宽11.5毫米；说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉菌抑菌性强，具有防治番茄灰霉病的生防潜力。

表1HMB27688菌株对番茄灰霉菌的拮抗作用试验结果

菌株名称	对照生长量(mm)	处理生长量(mm)	抑菌率(％)
				HMB27688	38.0	4.5	88.16

实施例3解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病防治效果的对比试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27688液体制剂；用水稀释50倍。

(2)化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)；用水稀释500倍。

(3)空白对照：清水

(二)试验方法：本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。在50孔育苗盘中培育番茄苗(番茄L-402，辽宁园艺种苗公司，辽宁省农业科学院园艺研究所生产)，长出2片复叶时移栽到直径20厘米的花盆中，每盆1棵苗。植株生长至7-8片复叶时，选用叶龄一致，大小一致的叶片，先用无菌水冲洗叶表，无菌滤纸吸干水分，再在实施例1所得的用水稀释后(悬浮液含菌体10⁷cfu/mL)的解淀粉芽孢杆菌HMB27688菌剂中蘸一下，使叶子表面充分着药，然后放在铺有双层灭菌滤纸的培养皿中，同时接入番茄灰霉菌BC-1菌盘(直径6mm)，保湿培养。以未用HMB27688菌剂处理的叶片为空白对照。待空白对照充分发病后调查病斑直径，计算防治效果。

表2解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病防效的对比试验结果

处理	病斑直径(mm)	防效(％)
			HMB27688液体制剂	4.0c	83.33
化学药剂	6.8b	71.67
			空白对照	24.0a	--

结果(见表2)离体叶片生测结果表明，本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病防效为83.33％，化学药剂的防效为71.67％，HMB27688对番茄灰霉病的防效明显高于化学药剂，说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27688及其微生物菌剂对番茄灰霉病具有很好的防治效果。

实施例4解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病防治效果的对比试验

(一)试验处理：

(3)空白对照：清水

(二)试验方法：2013年12月在河北省农林科学院植物保护研究所人工气候室内进行。在日光温室培育番茄苗(番茄L-402，辽宁园艺种苗公司，辽宁省农业科学院园艺研究所生产)，待番茄生长出8片复叶，移至控温控湿培养室，选取大小一致的番茄苗，将实施例1制备的HMB27688液体制剂的50倍水稀释液均匀喷洒在番茄苗上，在25℃培养24小时，然后在每片小叶上接入番茄灰霉菌菌盘(PDA平板上25℃下培养3-5d，直径6mm)，保湿培养。设清水和化学药剂对照，3d后调查发病结果，采用十字测量法测量每个病斑直径(A,B)，计算病斑面积和防治效果。

病斑面积(mm²)＝π×A×B/4

防治效果(％)＝(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100

结果(见表3)活体生测结果表明，解淀粉芽孢杆菌HMB27688显著抑制了番茄灰霉菌在番茄叶片上的扩展，其防治番茄灰霉病的效果为86.70％，而化学药剂的防效为73.02％；本发明HMB27688对番茄灰霉病的防效显著高于化学药剂的防效。说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27688及其微生物菌剂对番茄灰霉病有很好的防治效果。

表3解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病防效的对比试验结果

处理	病斑面积(mm²)	防效(％)
			HMB27688液体制剂	15.02c	86.70
化学药剂	30.42b	73.02
			空白对照	112.76a	--

实施例5解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病防治效果的对比试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27688液体制剂，用水稀释50倍。

(3)空白对照：清水

(二)试验方法：2014年2月-6月在河北省保定市满城县大赛村孙茂龙番茄大棚进行。开始试验时整个棚内番茄叶部灰霉病中度发生，施药前摘除病叶。每小区三行，四次重复，随机区组排列。采用背负式电动喷雾器接种实施例1所制备的解淀粉芽孢杆菌HMB27688菌剂(用水进行稀释，含菌体 10⁷cfu/mL)；另设对照药剂和空白对照。首次施药7天后再喷施1次，二次施药后的第7天调查各个处理小区的单株病叶数，并计算防效。

结果(见表4)解淀粉芽孢杆菌HMB27688菌剂处理后，其番茄灰霉病的单株病叶数显著低于空白对照和化学药剂对照，其防效达到85.72％，说明解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病有很好的防治效果。

表4解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病防效的对比试验结果

处理	单株病叶数(片)	防效(％)
			HMB27688液体制剂	0.67c	85.72
化学药剂	1.33b	71.52
			空白对照	4.67a	---

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB27688，己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11457。

2.利用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌HMB27688生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为HMB27688菌体。

3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂为液体制剂。

4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌HMB27688在防治番茄灰霉病上的应用。

5.权利要求2或3所述的微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的应用。