CN110200014A

CN110200014A - 防治镰刀菌病害的微生物制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110200014A
Application number: CN201910413417.3A
Authority: CN
Inventors: 杨丽荣; 夏明聪; 张洁; 孙润红; 潘娅梅; 武超
Original assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2019-09-06

Abstract

本发明公开了一种防治镰刀菌病害的微生物制剂及其制备方法和应用，该制剂由以下质量百分比的原料组成：60～80%枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497菌液，8～10%粘着剂，1～2%稳定剂，填料补足100%。该微生物制剂的制备方法为：将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497菌液与填料混合，喷雾干燥制成母粉；在母粉中添加粘着剂和稳定剂，制得微生物制剂。将所述的防治镰刀菌病害的微生物制剂应用于在镰刀菌引起的植物病害生物防治中的。本发明的微生物制剂具有高效、绿色、安全的特点，且抗逆性好，生产成本低廉。

Description

防治镰刀菌病害的微生物制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及肥料制备技术领域，具体涉及一种防治镰刀菌病害的微生物制剂及其制备方法和应用。

背景技术

镰刀菌（Fusarium）是一类世界性分布的真菌，其可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，进而影响产量和品质，是农业生产上防治最为艰难的重要病害之一。

镰刀菌不仅在全球范围内引起小麦赤霉病（Fusarium head blight，FHB），还产生真菌毒素（Mycotoxin Deoxynivalenol），严重影响小麦的产量和品质，给农业生产造成巨大的损失；其中，脱氧雪腐镰孢菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）毒性最强，可导致人、畜中毒，还对小麦细胞、组织及种子的萌发有毒害作用，在病菌致病过程中也有重要作用，被认为是主要的致病因子。近年来该病还在我国小麦各大主产区频繁大面积发生，据不完全统计2012年我国麦区小麦赤霉病发生面积达达1.7亿亩，是近30年来发生最重的一年。由于暖冬频发、降水增加、秸秆还田等状况的叠加，赤霉病迅速向黄淮麦区蔓延，已成为黄淮麦区小麦的主要病害，多年来DON毒素污染范围非常广泛。因此，如何有效的控制其真菌毒素已成为国际公认的重点和难题。

当前，由于天然抗性资源匮乏，已鉴定和开发的抗病性种质资源有限，传统育种方法未能有效控制这些病原菌及其毒素的危害。长期以来，镰刀菌的防治以化学杀菌剂为主，导致了严重的环境污染和生态环境问题，同时诱发了病原菌的抗药性和产毒量的增强。

因此，亟需开发一种对生态和环境安全的镰刀菌病害防治制剂及方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种效果好且成本低廉的环境友好型防治镰刀菌病害的微生物制剂，同时提供了一种工艺流程简单、成本低的制备方法。

发明人在对枯草芽孢杆菌YB-04（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.6497，详见本发明人已授权专利文献CN103255077B，发明名称：枯草芽孢杆菌YB-04、其微生物制剂及其在秸秆降解中的应用）后续的进一步研究中发现，枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497除能有效降解秸秆外，还对镰刀菌具有强烈的抑制作用。

而且上述枯草芽孢杆菌，具有生长繁殖快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽孢，对人畜无害、环境兼容性好、能够抑制多种植物病害、不易使农作物产生抗药性；而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长等优点，因此，可作为一种理想的生防制剂。

基于上述研究及技术基础，本发明采用如下技术方案来解决本发明所提出的技术问题：

设计一种防治镰刀菌病害的微生物制剂，其由以下质量百分比的原料组成：60～80%枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497菌液，8～10%粘着剂，1～2%稳定剂，填料补足100%。

优选的，所述粘着剂为麦芽糊精、大豆粉、明胶中的至少一种；研究表明，这几类物质能更好的增加药剂对病菌的粘着性能，更好的发挥防治效果。

优选的，所述稳定剂为膨润土和/或羧甲基纤维素；在微生物制剂在贮存过程中，能防止有效成分分解或物理性能变坏。

优选的，所述填料为滑石粉、凹凸棒土、白土、粘土、白炭黑中的至少一种；除作为菌群依附的载体外，还可增加制剂的分散性。

进一步的，所述枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：

（1）培养皿培养：将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497接种固体培养基，28～32℃，培养32～48小时；

（2）一级种子培养：将步骤（1）培养的菌种接种一级种子培养基，初始pH值为7.0～7.2，在24～37℃，培养20～24小时，得一级种子；

（3）二级种子培养：按体积比为1～6％的接种量，将所述一级种子接种到二级种子培养基中，曝气，培养28～40小时，制得二级种子；

（4）发酵培养：按体积比为1～6％的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得该菌种的菌悬液；

（5）浓缩菌液。

优选的，所述一级种子培养基的配方为：玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉15g，鱼粉5g，CaCO₃5g，(NH₄)₂ SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，水1000ml。

优选的，所述二级种子培养基的配方为：玉米粉12.98g，葡萄糖5g，豆饼粉20.11g，鱼粉5g，CaCO₃6.90g，(NH₄)₂ SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.2g，水1000ml；

本发明还公开了上述防治镰刀菌病害的微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497菌液与填料混合，喷雾干燥制成母粉；在母粉中添加粘着剂和稳定剂，制得微生物制剂。

枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497在镰刀菌引起的植物病害生物防治中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明微生物制剂在防治镰刀菌引起的植物病害生物的同时能够改善土壤肥力，活化改良土壤微生物环境，环保无污染。

2.本发明的微生物制剂环境友好，能够实现作物病害绿色防控，能够提升农产品质量安全和保护农业生态安全，有利于农作物的无公害生产，有利于提升作物的品质。

3.本发明微生物制剂中的枯草芽孢杆菌产生芽孢能力强，抗逆性好，可以在一些极端的环境中长期存活，利于保存，非常适用于微生物制剂的保存、加工和应用。

4. 本发明微生物制剂施用于麦田，能使小麦叶功能期延长，推迟成熟期，对小麦后期灌浆和千粒重提高十分有利，对提高小麦产量和质量具有明显的促进作用。

5.本发明的微生物制剂生产工艺简单，能够利用现有成熟生产设备，其生产成本低廉，能够提升农产品国际竞争力，易推广普及。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：枯草芽孢杆菌YB-04的繁殖培养

（1）培养皿培养：将枯草芽孢杆菌YB-04在无菌条件下接种于固体培养基上，在28～32℃、优选30℃下，培养32～48小时；

（2）一级种子培养：将步骤（1）培养的菌种在无菌条件下接种于一级种子培养基中，初始pH值为7.0～7.2，在24～37℃，培养20～24小时，制得一级种子；

一级种子培养基的配方为：玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉15g，鱼粉5g，CaCO₃5g，(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，水1000ml；

（3）二级种子培养：按体积百分比为1～6％的接种量，将所述一级种子接种到发酵培养基中，曝气，培养28～40小时，制得二级种子；

二级种子培养基的配方为：玉米粉12.98g，葡萄糖5g，豆饼粉20.11g，鱼粉5g，CaCO₃6.90g，(NH₄)₂ SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.2g，水1000ml；该配方对枯草芽孢杆菌YB-04的扩繁效果好、速度快，且成本低；

（4）发酵培养：按体积百分比为1～6％的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得该菌种的菌悬液；

（5）浓缩至菌液的有效活菌数为500亿/克。

实施例二：微生物制剂的制备

（1）将实施例一制得的浓缩菌液与滑石粉、凹凸棒土混合，喷雾干燥制成母粉；

（2）在母粉中添加麦芽糊精，制得微生物制剂。

其中，菌液、麦芽糊精和膨润土的质量百分比为60%、8%和1%，滑石粉和凹凸棒土补足100%。

实施例三：微生物制剂的制备

（1）将实施例一制得的浓缩菌液与白土、粘土混合，喷雾干燥制成母粉；

（2）在母粉中添加大豆粉和膨润土，制得微生物制剂。

其中，菌液、大豆粉和膨润土的质量百分比为70%、9%和1.5%，白土和粘土补足100%。

实施例四：微生物制剂的制备

（1）将实施例一制得的浓缩菌液与白炭黑混合，喷雾干燥制成母粉；

（2）在母粉中添加明胶和羧甲基纤维素，制得微生物制剂。

其中，菌液、明胶和羧甲基纤维素的质量百分比为80%、10%和2%，白土和粘土补足100%。

实施例五：微生物制剂在茎基腐盆栽中的应用验证试验

本实验在河南省农业科学院的温室内进行，室内盆栽实验所用基质材料为草炭土，蛭石混合而成，供试小麦品种为郑麦366。处理的方法如下：

（1）菌饼接种：以小麦茎基腐假禾谷镰刀菌（为河南省农业科学院植物保护研究所分子生物学实验室保存）为供试病原菌，将其转接到PDA平板上，用打孔器打成直径1cm的菌饼待用，在营养钵中装入基质材料，表面压平，将菌饼置于基质上面，带菌面向上，将不同处理的种子播种，每个菌饼上放置一粒种子，播层上用基质覆盖；

（2）实施例二微生物制剂拌种处理：小麦种子经1%的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3次，催芽，露白后浸种，每公斤小麦种子用20ml终浓度为10⁶cfu/ml的微生物制剂浸种1h，种子表面晾干，播种待用；

（3）实施例二微生物制剂灌根：小麦种子经1%的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3次，催芽，露白然后播种。待小麦露芽每株小麦根部浇灌1ml 制剂，到播种第10天再次浇灌；

（4）药剂对照：用苯醚甲环锉对小麦进行拌种和浸种处理。

（5）对照：小麦种子经1%的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3次，催芽，露白然后播种。

每个处理重复5次，每钵15粒，在25 ℃下培养28 d后洗根调查。待对照完全发病后调查结果计算。

分级标准：

0：无症状；

1：胚盘节变褐；

2：胚盘节、地中茎或叶銷变褐；

3：胚盘节、地中茎或叶销均变褐；

4：地中茎、叶销及下部茎杆变褐；

5：茎杆出现干枯腐烂症状；

6：由茎杆腐烂导致植株死亡；

7：苗枯或种子腐烂。

通过盆栽防治实验结果（表1）表明该微生物制剂可防治小麦茎基腐病，伴土防治效果最好，高于苯醚甲环唑，达到77.5%以上，穴施效果低于伴土效果。

表1微生物制剂对小麦茎基腐病盆栽防治作用

。

注：各处理的平均值用不同的小写字母表示差异达5%显著水平；下同。

实施例六：微生物制剂在小麦赤霉病防治中的应用试验

实验地点：河南省农业科学院试验示范基地

小麦品种：郑麦366，播量25斤/亩，按常规施底肥及追肥。

播前处理：正常整地，浅耕

实验时间：2016年10月-2017年5月

实验处理：如表2所示。试验设4个药剂处理和1个空白对照处理，每处理重复3次，随机区组排列，每个处理小区面积20*30m²。

表2 实验处理

。

拌种方法：每公斤小麦种子用20ml终浓度为10⁶cfu/ml的微生物制剂拌种，，均匀拌种后，敞开晾干备用。

喷施方法：每种供试药剂选用常规质量浓度（见表2），于2016 年4 月20～25 日，小麦齐穗期进行第1 次施药；2016 年5月1～5 日，小麦扬花期进行第2 次施药，采用背负式电动喷雾器进行喷雾，药剂二次稀释法配制，每亩用水量30kg。

调查方法、时间和次数：于2016 年5 月24 日左右，小麦乳熟期，每小区对角线5点取样，每点调查100 穗，以枯穗面积占整个穗面积的百分率来分级，记录各级病穗数和调查总穗数。具体分级标准如下：

0级：全穗无病

1级：感病穗面积占全穗面积的四分之一以下。

3级：感病穗面积占全穗面积的四分之一至二分之一。

5级：感病穗面积占全穗面积的二分之一至四分之三。

7级：感病穗面积占全穗面积的四分之三以上。

药效计算方法：

表3 小麦赤霉病药效实验结果

。

田间试验结果如表3所示，可以看出，不同杀菌剂2 次施药后对小麦赤霉病的防治效果，以3%苯醚甲环唑水乳剂效果最好（72.4%），显著高于40%多菌灵悬浮剂，实施例三中微生物制剂效果次之，与3％苯醚甲环唑防治效果相当，显著高于市售生防制剂的54.3%，表明微生物制剂持效期较长，在田间表现很好的防治效果。具有进一步开发为生物农药的潜力。

实施例七：田间施用微生物制剂对小麦产量的影响试验

试验设于河南省农业科学院试验示范基地。实验处理同实施例六，其中试验例为实施例四的微生物制剂。

调查方法为收获前采取每小区五点取样、每点调查1米双行，测平均行距（本试验统一机播，平均行距21cm），调查小麦穗数折合亩穗数；选有代表性的不间断查20个穗计算平均穗粒数，烘干后称千粒重，打85折计算理论产量。

从对小麦增产效果分析如表4所示：

表4小麦产量试验结果

。

以实施例四的微生物制剂处理效果最好，增产率26.2%，显著高于其他处理。施用3％苯醚甲环唑次之，增产率为21.7%。从此数据可看出，实施例四微生物制剂不仅有防治效果还有增产效果，优于其他化学药剂。

试验研究表明，该微生物制剂使小麦叶功能期延长，成熟期推迟3天，对小麦后期灌浆和千粒重提高十分有利。另外该微生物菌制剂对环境友好，对提高小麦产量和质量具有明显的促进作用，推广前景巨大。

上面结合实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims

1.一种防治镰刀菌病害的微生物制剂，其由以下质量百分比的原料组成：60～80%枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497菌液、8～10%粘着剂、1～2%稳定剂，余量为填料。

2.根据权利要求1所述的防治镰刀菌病害的微生物制剂，其特征在于，所述粘着剂为麦芽糊精、大豆粉、明胶中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的防治镰刀菌病害的微生物制剂，其特征在于，所述稳定剂为膨润土或\和羧甲基纤维素。

4.根据权利要求1所述的防治镰刀菌病害的微生物制剂，其特征在于，所述填料为滑石粉、凹凸棒土、白土、粘土、白炭黑中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的防治镰刀菌病害的微生物制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：

（5）浓缩菌液。

6.根据权利要求5所述的防治镰刀菌病害的微生物制剂，其特征在于，所述一级种子培养基的配方为：玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉15g，鱼粉5g，CaCO₃5g，(NH₄)₂ SO₄ 1g，K₂HPO₄0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，水1000ml。

7.根据权利要求5所述的防治镰刀菌病害的微生物制剂，其特征在于，所述二级种子培养基的配方为：玉米粉12.98g，葡萄糖5g，豆饼粉20.11g，鱼粉5g，CaCO₃6.90g，(NH₄)₂ SO₄1g，K₂HPO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.2g，水1000ml。

8.权利要求1所述的防治镰刀菌病害的微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497菌液与填料混合，喷雾干燥制成母粉；在母粉中添加粘着剂和稳定剂，制得微生物制剂。

9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.6497在镰刀菌引起的植物病害生物防治中的应用。