CN103409494A - 镰刀菌拮抗菌的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种镰刀菌拮抗菌的快速高效筛选方法，采用平板两步培养法进行拮抗菌的筛选，首先在营养培养基上分离细菌，然后在长有细菌的平板上喷雾镰刀菌的孢子液，继续于28℃条件下培养，观察细菌周围的抑菌圈，如在周围出现抑菌圈，说明该细菌对镰刀菌具有拮抗能力。本发明采用同一平板两步培养法，对从样品中分离出来的细菌不需要在营养培养基上进行一一纯化后再转入另一培养基培养测定，大大节约实验过程中所需要的培养基，节省人力，物力和财力，提高了拮抗菌的筛选效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种生防菌的快速高效筛选方法，尤其是一种快速高效筛选镰刀菌拮抗菌的方法。
背景技术
植物真菌病害是影响植物生长发育的一种重要病害，其中很多的病害是由镰刀菌引起的。镰刀菌属是真菌中较大的属，广泛分布于自然界中，兼寄生或腐生生活。它可以侵染多种植物(经济作物、药用植物和观赏植物)的维管束系统，并在生长代谢过程中产生多种真菌毒素危害作物生长，引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等多种病害，严重影响作物的产量和品质。例如禾谷镰刀菌引起小麦赤霉病，不但可以导致粮食产量锐减，而且它产生的毒素对人畜健康危害严重，具有致癌，致畸的危害，DON污染谷物后会使动物产生包括嗜睡、食欲丧失、呕吐、肠道损伤、皮肤坏死、胃肠功能障碍、免疫功能障碍和繁殖功能障碍等症状，T-2毒素会使鸡雏患上关节软骨病等。
植物病害每年给农业生产造成巨大的经济损失，因此病害防治成为当务之急。而目前，植物病害的防治方法主要有两种，一种是化学防治，另一种是生物防治，化学防治虽然见效快，但是容易环境污染，对人畜的安全造成巨大的影响；由于微生物资源丰富，繁殖快，很多微生物能够产生抑制病原菌生长和繁殖的拮抗物质，因此通过生物防治来控制植物病害的效果也逐渐显露出来，并且随着人们生活水平的提高，环境安全和食品安全也越来越受到大家的重视，越来越多的人开始放弃使用化学药剂，而改用生物防治的方法来控制植物的真菌病害。
植物病原菌的生物防治，就是利用拮抗微生物或其代谢产物（抗生物质等）防治植物病原菌，以达到控制植物病害的目的。在生物防治过程中，不管是利用拮抗微生物本身还是其产生的代谢产物-抗生素等来控制植物病原菌，筛选到高效的拮抗菌是最为重要的前提条件。常规拮抗菌的筛选过程比较繁杂，如同大海捞针，需要耗费大量的人力和物力。一般来说，拮抗菌的筛选首先需要对采集来的样品系列稀释后在营养平板上涂布培养，然后把平板上生长出来的所有细菌一一挑取后在另一个营养平板上纯化，纯化后再把细菌一一接种到另一种营养平板上和病原菌进行对峙培养，通过对所有细菌进行拮抗能力的测定最终筛选到拮抗微生物，由于土壤和植株中微生物种类繁多，而拮抗菌所占的比例又非常少，而且平板上的好多细菌是同一个菌株，但是依靠菌株形态很难判断是不是同一个菌，所以在分离细菌、细菌纯化和对峙培养过程需要大量的培养基和大量的分离、纯化和拮抗能力测定的工作。正是由于这种筛选方法过程繁琐，效率低，造成没有更多的时间和精力进行广泛的样品采集，以增加拮抗菌筛选的范围，从而提高筛选到高效拮抗菌的可能性。
发明内容
本发明的目的在于：针对拮抗菌筛选过程繁琐，效率低的实际问题，提供一种快速、简便、高效的镰刀菌拮抗菌的筛选方法。
本发明的目的是这样实现的：一种镰刀菌拮抗菌的快速高效筛选方法，是采用平板两步培养法进行拮抗菌的筛选，首先在营养培养基上分离细菌，然后在长有细菌的平板上喷雾镰刀菌的孢子液，继续于28℃条件下培养，观察细菌周围的抑菌圈，如在周围出现抑菌圈，说明该细菌对镰刀菌具有拮抗能力；镰刀菌拮抗菌的快速高效筛选方法，其特征在于：筛选过程中所用的培养基可以包括所有能够同时满足细菌生长和镰刀菌孢子液萌发的培养基，其中LB和PDA培养基比较常用。具体筛选方法是：
a) 细菌的分离培养，不同来源的土壤样品或植株样品，放入无菌水中震荡混匀后，用无菌水配制成10-3,10-5,10-7,10-9的稀释液，把不同稀释度的稀释液分别涂布于LB培养基或PDA培养基平板上，每个稀释液重复两次，将涂布好的培养皿放置于28℃条件下培养48小时以上；
b) 镰刀菌孢子液的制备：将镰刀菌在PDA培养基上活化后，接入绿豆汤培养基中，25℃光照培养一周后，用无菌纱布过滤后即成镰刀菌孢子液；
c) 镰刀菌孢子液的喷雾，将镰刀菌孢子液放入无菌的喷壶内，对着经过涂布培养长有细菌的平板快速喷雾接种镰刀菌孢子液，正置1小时后，倒置放于28℃培养箱内培养48小时以上；
d) 镰刀菌拮抗菌的初筛，观察接种镰刀菌孢子液后培养48小时后的平板，如在细菌周围出现抑菌圈，说明该细菌对镰刀菌具有拮抗能力，因此初步判断该菌为拮抗菌；
e) 拮抗菌的纯化，把具有抑菌圈的细菌在LB等细菌培养基平板上进行划线纯化，28℃培养箱内培养48小时后，观察菌落的形态，颜色，和大小等性状，对具有性状不一样的菌落，分别按同样的方法再次进行划线纯化，直至每个平板上的菌落呈现相同的颜色，大小和形状，即为纯化好的细菌；
f) 拮抗菌的复筛，将纯化好的细菌接种于LB培养基或PDA培养基平板上，28℃培养箱内培养48小时后，喷雾镰刀菌孢子液后，于28℃培养48小时后测定抑菌圈的大小；
所述的抑菌圈是指镰刀菌被抑制生长区域的直径。
本发明中所述的培养基为能够同时满足细菌和镰刀菌生长的营养培养基，其中LB和PDA培养基较为常用，LB培养基的配方为：蛋白胨10.0 g/ L，酵母膏 5.0 g/L，NaCl 2.0 g/L pH 7.0～7.5，再加入琼脂 15~20 g/L；PDA培养基的配方为：马铃薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，再加入琼脂 15~20 g/L；b步骤中所述的绿豆汤培养基的配方为：30 g绿豆，用蒸馏水煮沸后，直至约50%的绿豆开花后，用无菌纱布进行过滤，取过滤后的上清液定容至1L。
本发明中，拮抗菌的保存，把具有抑菌圈的细菌在LB等细菌培养基中培养后，加入灭菌的甘油，使甘油的终浓度为20% 左右，-70℃保存，备用。
本发明的优点在于：从样品中分离出来的细菌不需要在新鲜的营养培养基上进行一一纯化，然后在另一个新鲜培养基上采用对峙培养法对所有的细菌进行抑菌能力的测定，而是采用同一平板两步培养法，即在平板上涂布分离出细菌后，直接在长有细菌的平板上喷上镰刀菌的孢子液，然后继续培养，2天后，通过观察细菌周围的抑菌圈就能初步筛选到抗镰刀菌的拮抗菌，大大节约实验过程中所需要的培养基，因此节省人力，物力和财力，提高了拮抗菌的筛选效率。
本发明的优点还在于：采用绿豆汤培养基培养镰刀菌的孢子液，使用无菌纱布过滤后就可以直接喷雾到涂布培养长有细菌的平板上，相对于采用镰刀菌菌悬液喷雾来说，孢子液均匀，在喷雾过程不容易堵塞喷壶，而且镰刀菌在平板上分散均匀，以确保实验的正确性；同时孢子液在4℃条件下可以保存很长的时间，所以在拮抗菌筛选过程不需要每天制备镰刀菌，节约了大量的时间。
附图说明
图1A为抗镰刀菌细菌在LB固体培养基平板上的初筛图片；图1B为抗镰刀菌细菌在PDA固体培养基平板上的初筛图片。
图2A为镰刀菌拮抗菌在LB固体培养基上的复筛图片；图2B为镰刀菌拮抗菌在PDA固体培养基上的复筛图片；
具体实施方式
以下仅以从采集的土壤样品和小麦样品中分离抗镰刀菌的拮抗细菌，说明快速、高效筛选镰刀菌拮抗菌的方法，具体实施时不受实施例限制。本方法中所使用技术术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
实施例1
本发明的培养基：
LB液体培养基：蛋白胨10.0 g/ L，酵母膏 5.0 g/L，NaCl 2.0 g/L (pH 7.0～7.5)，再加入琼脂 15~20 g/L；
PDA液体培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，再加入琼脂 15~20 g/L；
绿豆汤培养基：30 g绿豆，用蒸馏水煮沸后，直至约50%的绿豆开花后，用无菌纱布进行过滤，取过滤后的上清液定容至1L。
实施例2
采集玉米根系的土壤，放入无菌水中震荡混匀后，用无菌水配制成10-5,10-7,10-9的稀释液，把不同稀释度的稀释液分别涂布于LB和PDA平板上，每个稀释液重复两次，将涂布好的培养皿放置于28℃条件下培养48小时以上，挑涂布培养长细菌的平板备用。
将禾谷镰刀菌GZ3639（该菌株由美国农业部真菌毒素研究中心馈赠）在PDA培养基上活化后，接入绿豆汤培养基中，25℃培养一周后，用无菌纱布过滤后即成镰刀菌孢子液；将镰刀菌孢子液放入无菌的喷壶内，对着长有细菌的平板进行快速喷雾接种，正置1小时后倒置放于28℃培养箱内培养48小时后，观察平板上的抑菌圈，如在细菌的周围出现抑菌圈，说明该细菌对镰刀菌具有拮抗能力，因此初步判定该菌为拮抗菌。
把具有抑菌圈的细菌在LB等细菌培养基平板上进行划线纯化，28℃培养箱内培养48小时后，观察菌落的形态，颜色，和大小性状，对同一平板上具有性状不一样的菌落，分别按同样的方法再次进行划线纯化，直至每个平板上的菌落呈现相同的颜色，大小和形状；将纯化好的细菌用牙签接种于LB或PDA平板上，再次采用镰刀菌孢子液喷雾法检测对镰刀菌的拮抗能力；把具有抑菌圈的细菌在LB等细菌培养剂中培养后，加入灭菌的甘油，使甘油的终浓度为20%左右，-70℃保存，备用。所获得的拮抗菌筛选结果见表1所示。
具体实施时，所用营养培养基也可以为LB液体培养基或PDA液体培养基。
表1 拮抗菌筛选结果
| 编号 | 拮抗菌名称 | 抑菌圈直径（mm） | 抑菌带（mm） |
| 1 | JSS-1 | 32 | 14 |
| 2 | JSS-2 | 31 | 14 |
| 3 | JSS-3 | 28 | 12 |
| 4 | JSS-4 | 25 | 10 |
| 5 | JSS-5 | 25 | 8 |
| 6 | JSS-6 | 18 | 6 |
| 7 | JSS-7 | 18 | 5 |
| 8 | JSS-8 | 12 | 5 |
抑菌圈直径：整个镰刀菌被抑制生长区域的直径；
抑菌带：是拮抗菌边缘到镰刀菌生长区边缘的距离。
表中涉及拮抗剂名称JSS-1至JSS-8均为发明人自定义拮抗菌名称，涉及具体菌株名称待后续鉴定。
实施例3
采集小麦麦穗，放入研钵中磨碎后，放入无菌水中震荡混匀后，用无菌水配制成10-3,10-5,10-7的稀释液，把不同稀释度的稀释液分别涂布于LB和PDA平板上，每个稀释液重复两次，将涂布好的培养皿放置于28℃条件下培养48小时，挑涂布培养长细菌的平板备用；
将禾谷镰刀菌GZ3639（该菌株由美国农业部真菌毒素研究中心馈赠）在PDA培养基上活化后，接入绿豆汤培养基中，25℃培养一周后，用无菌纱布过滤后即成镰刀菌孢子液；将镰刀菌孢子液放入无菌的喷壶内，对着长有细菌的平板进行快速喷雾接种，正置1小时后倒置放于28℃培养箱内培养48小时后，观察平板上的抑菌圈，如在细菌的周围出现抑菌圈，说明该细菌对镰刀菌具有拮抗能力，因此初步判定该菌为拮抗菌。
把具有抑菌圈的细菌在LB等细菌培养基平板上进行划线纯化，28℃培养箱内培养48小时后，观察菌落的形态，颜色，和大小等性状，对具有性状不一样的菌落，分别按同样的方法再次进行划线纯化，直至每个平板上的菌落呈现相同的颜色，大小和形状，即为纯化好的细菌；将纯化好的细菌用牙签接种于LB或PDA平板上，再次采用镰刀菌孢子液喷雾法检测细菌对镰刀菌的拮抗能力；把具有抑菌圈的细菌在LB等细菌培养剂中培养后，加入灭菌的甘油，使甘油的终浓度为20%左右，-70℃保存，备用。所获得的拮抗菌筛选结果见表2所示。
具体实施时，所用营养培养基也可以为LB液体培养基或PDA液体培养基。
表2拮抗菌筛选结果
| 编号 | 拮抗菌名称 | 抑菌圈直径（mm） | 抑菌带（mm） |
| 10 | JSP-1 | 28 | 11 |
| 11 | JSP-2 | 26 | 10 |
| 12 | JSP-3 | 25 | 10 |
| 13 | JSP-4 | 17 | 7 |
| 14 | JSP-5 | 15 | 5 |
| 15 | JSP-6 | 11 | 4 |
| 16 | JSP-7 | 9 | 2 |
抑菌圈直径：整个镰刀菌被抑制生长区域的直径；
抑菌带：是拮抗菌边缘到镰刀菌生长区边缘的距离。
表中涉及拮抗剂名称JSS-1至JSS-8均为发明人自定义拮抗菌名称，涉及具体菌株名称待后续鉴定。
Claims (5)
1.一种镰刀菌拮抗菌的筛选方法，其特征在于：采用平板两步培养法，即首先在营养平板上分离细菌，然后喷雾镰刀菌的孢子液，继续于28℃条件下培养，周围出现抑菌圈的细菌即为镰刀菌拮抗菌；具体方法和步骤如下：
a) 把不同来源的土壤样品或植株样品，放入无菌水中震荡混匀后，配制成10-3,10-5,10-7,10-9的稀释液，把不同稀释度的稀释液分别涂布于含有营养培养基的平板上，每个稀释液重复两次，将涂布好的培养皿倒置放于28℃条件下培养48小时以上，挑涂布培养后长有细菌的平板备用；
b) 将镰刀菌在PDA培养基上活化后，接入绿豆汤培养基中，25℃光照培养一周后，用无菌纱布过滤后即成镰刀菌孢子液；
c) 将镰刀菌孢子液放入无菌的喷壶内，对着经过涂布培养长有细菌的平板快速喷雾接种镰刀菌孢子液，正置1小时后倒置放于28℃培养箱内培养48小时以上；
d) 观察接种镰刀菌孢子液后培养48小时后的平板，挑选出现抑菌圈的细菌；
e) 把具有抑菌圈的细菌在营养培养基平板上进行划线纯化，28℃培养箱内培养48小时后，观察菌落的形态，颜色和大小性状，对具有性状不一样的菌落，分别按同样的方法再次进行划线纯化，直至每个平板上的菌落呈现相同的颜色，大小和形状，即为纯化好的细菌；
f) 拮抗菌的复筛，将纯化好的细菌点种于营养培养基平板上，28℃培养箱内培养48小时后，喷雾镰刀菌孢子液后，于28℃培养48小时后观察，有抑菌圈的为镰刀菌拮抗菌。
2.根据权利要求1所述的镰刀菌拮抗菌的筛选方法，其特征在于：所述的营养培养基为LB液体培养基或LB固体培养基；LB液体培养基的配方为：蛋白胨10.0 g/ L，酵母膏 5.0 g/L，NaCl 2.0 g/L ，pH 7.0～7.5；在LB液体培养基中加入琼脂 15~20 g/L形成LB固体培养基。
3.根据权利要求1所述的镰刀菌拮抗菌的筛选方法，其特征在于：所述的营养培养基为PDA液体培养基或PDA固体培养基；PDA液体培养基的配方为：马铃薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，在PDA液体培养基中加入琼脂 15~20 g/L形成PDA固体培养基。
4.根据权利要求1-3之一所述的镰刀菌拮抗菌的筛选方法，其特征在于：把f步骤获得的镰刀菌拮抗菌在LB等细菌培养基中培养后，加入灭菌的甘油，使甘油的终浓度为20%左右，-70℃保存，备用。
5.根据权利要求4所述的镰刀菌拮抗菌的筛选方法，其特征在于：所述的绿豆汤培养基的配方为：30 g绿豆，用蒸馏水煮沸后，直至约50%的绿豆开花后，用纱布进行过滤，取过滤后的上清液定容至1L。
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