CN111454849A - 一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其预先制备稀释到10‑2倍,10‑3倍,10‑4倍的土壤提取液，并利用大麦粒培养小麦穗腐致病菌，而后利用染有小麦穗腐致病菌的大麦粒与土壤提取液内微生物的抑制效果进行有效筛选，由于染菌大麦粒上的穗腐致病菌非常多，而喷雾稀释的土壤提取液微生物菌数量极少，两者数量上存在绝对悬殊，故能够在穗腐致病菌夹缝中生存的微生物菌落应是繁殖力和抑菌效果很强的菌落，由此有效排除无效微生物菌，其目的性明确，可以大大减少盲目分离土壤微生物菌的工作量，节工节本，且不易漏掉有效微生物菌，从而提升了抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离效率，实用性强。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法。
背景技术
为害小麦、大麦、玉米、水稻等禾本科植物的常见的穗腐致病菌包括玉米赤霉菌、无性阶段禾本科镰孢、麦根腐长蠕孢菌、小麦棒杆菌等。病菌以菌丝体在病残体如稻桩或种子内越冬或越夏，下一生长季形成子囊壳放射出子囊孢子，靠气流传播进行初侵染，分生孢子靠雨水传播再侵染。高温、多雨、多雾和潮湿天气利于本病的发生。
小麦穗腐致病菌的防治方法包括物理防治、化学杀菌剂防治、抗病性小麦品种选育以及生物防治。其中生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治的新方法。例如赤霉病菌虽然能在土壤中繁殖生长，但土壤表面很少观察到赤霉病菌孢子或孢子囊的原因在于土壤中含有大量抑制赤霉病镰刀菌大量繁殖的拮抗菌。故，用于生物防治的微生物包括了从土壤中筛选到的拮抗菌，包括细菌、真菌、少量的放线菌等。
如何从土壤中分离出能有抑制小麦穗腐致病菌生长的拮抗菌是生物防治的重要环节。通常从土壤中分离拮抗菌的方法是先分离出土壤中的所有菌群，然后用牛津杯法做抑制效果实验从而筛选出有拮抗作用的有益菌。但是土壤是微生物生活的大本营，1g土壤中就存在着多达106～109个微生物个体，如果先进行土壤微生物分离再进行抑菌试验，容易造成土壤分离工作量的庞大，而且还易漏掉有抑制作用的有效微生物菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制小麦穗腐病致病菌的土壤微生物菌的分离方法。
实现本发明目的的技术方案是：一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其包括以下步骤：
1）土壤提取液的制备：土壤样品采自表层下5～20cm深度土样，从田间采回的土样风干后放入已盛有灭菌水的塑料喷雾器中，充分振荡后的土样溶解液分别稀释到10-2倍,10-3倍,10-4倍，并分别转入喷雾瓶中；
2）大麦粒培养小麦穗腐致病菌：将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种小麦穗腐致病菌，并在25～26℃条件下培养若干天，使大麦粒充分长满小麦穗腐致病菌；
3）平板培养基接种携带小麦穗腐致病菌的大麦粒：在数个平板培养基内分别接种若干粒携带小麦穗腐致病菌的大麦粒，并使接种后的携带小麦穗腐致病菌的大麦粒于每个平板培养基上均匀分布；
4）有拮抗作用的微生物菌的初筛：
4.1） 将步骤1）中已经制备好的三种浓度的土壤提取液一一分别均匀喷布到不同的步骤3）所制备的已接种大麦粒的平板培养基表面；喷布后使用封口膜对接种有携带小麦穗腐致病菌的大麦粒的平板培养基边缘进行封口，并在25～26℃条件培养若干天后观察平板培养基中的小麦穗腐致病菌扩张的情况：
4.2）将步骤4.1）培养的平板培养基中能抑制小麦穗腐致病菌生长的菌落挑取出来，分别涂布于新的平板培养基内，同时勾取部分小麦穗腐致病菌菌丝“之”字型涂布于各初筛的培养基上，而后用封口膜对平板培养基边缘继续进行封口，并在25～26℃条件培养若干天；观察平板培养基内的微生物抑菌情况，从中筛选平板培养基内能够明显抑制小麦穗腐致病菌生长的菌落作为对所选用的小麦穗腐致病菌抑制作用好的菌落。
进一步地，其还包括步骤5）有拮抗作用的微生物菌的二次筛选：
5.1）挑取步骤4.2）中筛选出的对所选用的小麦穗腐致病菌抑制作用好的菌落，重复4.2）的步骤，纯化挑选出单菌落；单菌落较步骤4.2）筛选出的菌落具有稳定、不易变异的优点；
5.2）将经步骤5.1）中纯化后的单菌落分别接种于装有经灭菌处理的大麦粒培养瓶中，并同时将至少两粒步骤2）所培养的接种有小麦穗腐致病菌的大麦粒放入大麦粒培养瓶中，将大麦粒培养瓶封口后在25～26℃培养若干天，培养期内每天摇动玻璃瓶，最后静置1～2d观察菌丝是否得到抑制；该步骤用于验证当有益微生物菌和有害的小麦穗腐致病菌同时侵染大麦粒生物体时，分离出的有益微生物菌是否能够有效抑制小麦穗腐致病菌的生长；
5.3）观察步骤5.2）中的有抑菌作用的微生物菌的抑菌效果，挑选出小麦穗腐致病菌没有明显扩张的对应培养瓶内的微生物菌作为目的拮抗菌。
进一步地，其还包括步骤6）：对步骤5.3）得到的有拮抗作用的微生物菌的再次筛选：
6.1）将步骤5.3）中挑选出的微生物菌接种于装有经灭菌处理的大麦粒培养瓶中培养得到携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒；
6.2）在若干个新的平板培养皿的中心分别放置一粒携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒，而后在每个平板培养皿内于携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒外围均匀放置二至四粒步骤6.1）中携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒，观察抑菌效果，从中选出小麦穗腐致病菌没有明显扩张、拮抗作用较好的对应培养皿内的微生物菌作为目的拮抗菌。步骤6）的筛选方法操作方便，且不易造成污染，并与步骤5）的有拮抗作用的微生物菌的二次筛选形成双重验证，提高筛选的准确性。
进一步地，步骤6.2）中平板培养皿上放置四粒步骤6.1）培养的有抑菌效果的微生物菌的大麦粒时，放置方法为：制作若干个白底黑字的塑料圆形十字刻度板，每个十字刻度板的直径与平板培养皿的外径相等，接菌前，先将一个十字刻度板对齐放置于一个新的平板培养皿的正下方，平板培养皿为透明结构，平板培养基呈半透明状，将一粒携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒放于十字刻度板的正中心，并将四粒步骤6.1）培养到的携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒分别放置在由十字刻度板映射在平板培养基上的十字影像上。
进一步地，所述小麦穗腐致病菌为赤霉病镰刀菌、灰霉病菌、黑穗病菌、青霉和黄曲霉中任意一种可以在大麦粒上繁殖的有害菌。
进一步地，将经步骤5.1）得到的有抑菌效果的单菌落重复步骤5.2）的方案进行二次至三次筛选，以筛分出抑菌效果和繁殖效果更好的微生物菌。
进一步地，将步骤6.1）得到的有抑菌效果的微生物菌重复步骤6.2）的方案进行二次至三次筛选，以筛分出抑菌效果和繁殖效果更好的微生物菌。
进一步地，所述步骤1）中土壤为连续种植大麦或小麦的土壤。例如赤霉病镰刀菌，其具有腐生兼寄生的特性，可以在土壤中生存和繁殖，因此如果从赤霉病鉴定圃中采集土壤样本更容易从自然中分离到制约赤霉病镰刀菌的微生物菌；
进一步地，步骤2）中高温灭菌工序为：将蒸过或煮过的大麦粒装瓶后于120～125℃下灭菌20～25min。
进一步地，所述步骤3）和步骤6.2）中接种大麦粒时，先将无菌镊子的镊子头烧热，通过烧热的镊子头在平板培养基的待接菌位置处点出小洞，后将携带小麦穗腐致病菌或者微生物菌的大麦粒放置于小洞内，以防止后续因移动平板培养基而造成大麦粒移动。
本发明预先制备土壤提取液，并利用大麦粒培养小麦穗腐致病菌，而后利用小麦穗腐致病菌与土壤微生物的抑制效果进行有效筛选，此为本发明的关键步骤，由于染菌大麦粒上的穗腐致病菌非常多，而喷雾稀释的土壤微生物菌数量极少，两者数量上的绝对悬殊，故能够在穗腐致病菌夹缝中生存的微生物菌落应是繁殖力和抑菌效果很强的菌落，由此有效排除无效微生物菌，其目的性明确，可以大大减少盲目分离土壤微生物菌的工作量，节工节本，且不易漏掉有效微生物菌，提升了抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离效率，实用性强。
附图说明
图1为步骤4.1）平板培养基中的土壤微生物菌对携带有赤霉病菌的大麦粒菌丝扩展产生抑制作用的效果图；
图2为步骤5.1）中平板培养基内的微生物抑菌情况图；
图3为步骤5.3）其中两个培养瓶内赤霉病镰刀菌菌丝生长情况图；
图4为步骤6.2）中每个带十字刻度板的培养皿上大麦粒分布结构图；
图5为步骤6.2）抑菌效果好的微生物菌在培养皿内拮抗效果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明较佳实施例做详细说明。
一种抑制小麦穗腐致病菌-赤霉病菌的土壤微生物菌的分离方法，其包括以下步骤：
1）土壤提取液的制备：土壤样品来源于福建省南平市建阳区童游镇南平市农科所试验基地的小麦赤霉病抗性鉴定试验圃土壤表层下5～20cm深度土样，从田间采回的土样风干后，称取3g干燥的土样，放入已盛有27ml灭菌水的塑料喷雾器（喷雾器用酒精灭菌消毒后用灭菌水清洗）中，采用振荡器振荡30min～1h将土壤内的微生物震出，然后将土样溶解液分别稀释到10-2,10-3,10-4倍，并分别转入塑料喷雾瓶中；
2）大麦粒培养赤霉病镰刀菌：将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种赤霉病镰刀菌，并在25～26℃条件下培养5～6d，使大麦粒充分长满赤霉病镰刀菌；
3）平板培养基接种携带赤霉病镰刀菌的大麦粒：在数个平板培养基上分别接种9粒携带赤霉病镰刀菌的大麦粒，接种后的携带赤霉病镰刀菌的大麦粒均匀分布于各平板培养基上；
4）有拮抗作用的微生物菌的初筛：
4.1）将步骤1）中已经制备好的三种浓度的土壤提取液一一分别均匀喷布到不同的步骤3）所制备的已接种大麦粒的平板培养基表面，同时设置灭菌水空白对照；喷布后使用封口膜对接种有携带赤霉病镰刀菌的大麦粒的平板培养基边缘进行封口，并在25～26℃条件培养4～5d后观察平板培养基中的赤霉病镰刀菌菌丝扩张情况；如图1所示，赤霉病镰刀菌的菌丝具有很强的气生能力，在平板培养基表面受到抑制以后会产生大量的气生菌丝覆盖在平板培养基的盖子上，可以从培养皿背面观察菌丝扩张情况。
4.2）将步骤4.1）中对小麦赤霉病菌有抑制作用的菌落挑取出来，分别涂布于用于初筛的平板培养基内，同时勾取部分赤霉病镰刀菌菌丝“之”字型涂布于各初筛的平板培养基上，并另外单独勾取赤霉病镰刀菌菌丝“之”字型涂布于平板培养基上作为空白对照，而后用封口膜对平板培养基边缘进行封口，并在25～26℃培条件培养7～8d；观察平板培养基内的微生物抑菌情况，从中筛选平板培养基内能够明显抑制小麦赤霉病菌生长的菌落作为对所选用的小麦赤霉病菌抑制作用好的菌落；
5）有拮抗作用的微生物菌的二次筛选：
5.1）挑取步骤4.2）中筛选出的对所选用的小麦赤霉病菌抑制作用好的菌落，重复4.2）的步骤，纯化出抑制作用较好的单菌落；如图2所示，抑菌效果不好的培养皿表现为整个培养皿生长出红色（图中深色部分）赤霉病镰刀菌；抑菌效果好的培养皿中很少或者没有赤霉病镰刀菌菌丝生长；
5.2）将经步骤5.1）中纯化后的单菌落分别接种于装有经灭菌处理的大麦粒培养瓶中，并同时将至少两粒步骤2）所培养的接种有赤霉病镰刀菌的大麦粒放入大麦粒培养瓶中，大麦粒培养瓶中的大麦粒与瓶口间距为2cm以供菌丝向上生长，将大麦粒培养瓶封口后在25～26℃培养5～7d，培养期内前3～5天每天摇动玻璃瓶，最后静置2d观察菌丝是否得到抑制；同时，等量选取步骤2）所培养的赤霉病镰刀菌的大麦粒于另一装有经灭菌处理的大麦粒的培养瓶中，作为空白对照，空白对照封口后在25～26℃培养5～7d；该步骤用于验证当有益微生物菌和有害的赤霉病镰刀菌同时侵染生物体时，分离出的有益微生物菌是否能够有效抑制赤霉病镰刀菌菌丝的生长；
5.3）观察步骤5.2）中有抑菌作用的的微生物菌的抑菌效果，并挑选出小麦穗腐致病菌没有明显扩张的对应培养瓶内的微生物菌；如图3所示，可以观察到空白对照组的培养瓶内长满赤霉病镰刀菌菌丝，接种了抑菌效果好的微生物菌的培养瓶内几乎没有赤霉病镰刀菌菌丝；
6）对步骤5.3）得到的有拮抗作用的微生物菌的再次筛选：
6.1）将步骤5.3）中挑选出的微生物菌接种于装有经灭菌处理的大麦粒培养瓶中培养得到携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒；
6.2）制作若干个白底黑字的塑料圆形十字刻度板，每个十字刻度板的直径与平板培养皿的外径相等，接菌前，先将一个十字刻度板对齐放置于一个9cm平板培养皿的正下方，平板培养皿为透明结构，平板培养基呈半透明状，将四粒6.1）步骤培养的携带有抑菌效果微生物菌的大麦粒分别放置在由十字刻度板映射在平板培养基上的十字影像上，此时，每个平板培养基中心放置一粒携带有赤霉病镰刀菌的大麦粒（如图4所示），观察抑菌效果。抑制效果较好的实施例如图5所示：图5中位于中心的赤霉病菌菌落与其周围的携带有抑菌效果微生物的大麦粒之间出现透明的抑菌带，表明该微生物菌对中心的赤霉病菌菌落扩张形成有效抑制，而后选择该抑菌效果最好的微生物菌。
发明人从步骤6.2）中抽取22个实施例，每个实施例重复3次，同时设置对照例通过测量22个实施例以及对照例中各培养皿的赤霉病菌净生长量、赤霉病菌平均菌落直径，得到抑菌情况如表1所示：
表1
表1中的菌丝生长抑菌率（%）=【（CK组的菌丝生长直径-实施例组的菌落直径）/CK组的菌丝生长直径】*100%
由表1可知，编号为5、10、11、15、18、20的抑菌效果较好，抑菌率分别为达到66.4%、60.87% 、61.63%、60.87%、 69.15%、68.40%。
步骤5.3）中各培养瓶内拮抗菌的抑菌情况如表2所示：
表2：
表2中菌丝生长抑菌率（%）=【（CK组菌丝生长高度-菌丝生长高度）/对照菌丝生长高度】*100%。
从表2可知序号为5、18、20的抑菌效果较好，抑菌率都达到100%，即赤霉病菌在5、18、20这几个选出的微生物菌大麦粒瓶中受到抑制，完全不能生长，其对应图3中左边培养瓶内携带赤霉病菌的大麦粒未见到菌丝发展。
本发明的步骤4.1）将步骤1）中已经制备好的三种浓度的土壤提取液一一分别均匀喷布到不同的步骤3）所制备的已接种大麦粒的平板培养基表面的操作目的：大麦粒是已经长满了小麦穗腐致病菌菌丝，土壤提取液却是稀释了的微生物菌，病原菌的基数远远高于土壤提取液，这就要求土壤提取液中有抑菌效果的微生物菌不论在抑菌效果和生长速度上都要有绝对优势，才能够在培养基上看到抑菌效果。这种方法的优点在于筛选出的拮抗菌在生长速度和抑菌效果上都拥有绝对优势，抑菌效果会更好；带小麦致病穗腐菌的大麦粒和微生物菌一起在大麦粒上培养可以证明目标微生物菌是可以仅仅依靠生物营养体进行繁殖的，在繁殖速度上同小麦致病穗腐菌对比也可以验证，相对于只在培养基上验证抑菌效果会更加贴近于自然情况，同时这种操作比在温棚中进行的接菌试验要方便的多，条件也好控制，为后续的大田实验奠定了有力的基础，保证其用于在活体麦穗的生物防治的效率。步骤5.1）选取微生物菌落纯化挑选出单菌落，其目的在于单菌落稳定，不易变异，实验结果误差小。
本发明所述小麦穗腐致病菌不限于实施例采用的赤霉病镰刀菌，还可以为灰霉病菌，黑穗病菌、青霉，黄曲霉等任意一种可以在大麦粒上繁殖的有害菌；各步骤培养时间根据具体病原菌的生长速率而定；本专利实施例中的筛选赤霉病镰刀菌的抑制菌所用的培养基为PDA培养基，PDA培养基的成分为马铃薯180-250g，葡萄糖15-25g，琼脂15-20g，水1000mL。制作时将180～250g马铃薯去皮切碎,煮烂后取得马铃薯汁,加入15～25g葡萄糖或者蔗糖,加入琼脂15～20g,加水至1000mL,122℃灭菌即可；所述步骤1）中土壤为连续种植大、小麦的田块，菌源来源地采集的土壤样本更容易从自然中分离到制约小麦穗腐病菌的微生物菌；步骤5.1）实现了对步骤4）筛选出的菌落的纯化，其中单菌落的挑选方法为平板划线法等微生物领域常规技术手段；步骤5.2）用于验证当有益微生物菌和有害的小麦穗腐致病菌同时侵染大麦粒生物体时，分离出的有益微生物菌是否能够有效抑制小麦穗腐致病菌的生长；步骤6）的抑菌实验操作方便，且不易造成污染，并与步骤5）形成双重验证，提高筛选的准确性；所述步骤3）和步骤6.2）中接种大麦粒时，先将无菌镊子的镊子头烧热，通过烧热的镊子头在平板培养基的待接菌位置处点出小洞，后将携带小麦穗腐致病菌或者微生物菌的大麦粒放置于小洞内，以防止后续因移动平板培养基而造成大麦粒移动；步骤6.2）中每个平板培养皿内于携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒外围均匀放置二至四粒接种有步骤6.1）中携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒，其中四粒最易制作，且利于小麦穗腐致病菌的均衡发展；大麦粒的灭菌消毒方式为将大麦粒装瓶后放置于高压锅内高温灭菌等常规灭菌方式。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）土壤提取液的制备：土壤样品采自表层下5～20cm深度土样，从田间采回的土样风干后放入已盛有灭菌水的塑料喷雾器中，充分振荡后的土样溶解液分别稀释到10-2倍,10-3倍,10-4倍，并分别转入喷雾瓶中；
2）大麦粒培养小麦穗腐致病菌：将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种小麦穗腐致病菌，并在25～26℃条件下培养若干天，使大麦粒充分长满小麦穗腐致病菌；
3）平板培养基接种携带小麦穗腐致病菌的大麦粒：在数个平板培养基内分别接种若干粒携带小麦穗腐致病菌的大麦粒，并使接种后的携带小麦穗腐致病菌的大麦粒于每个平板培养基上均匀分布；
4）有拮抗作用的微生物菌的初筛：
4.1） 将步骤1）中已经制备好的三种浓度的土壤提取液一一分别均匀喷布到不同的步骤3）所制备的已接种大麦粒的平板培养基表面；喷布后使用封口膜对接种有携带小麦穗腐致病菌的大麦粒的平板培养基边缘进行封口，并在25～26℃条件培养若干天后观察平板培养基中的小麦穗腐致病菌扩张的情况；
4.2）将步骤4.1）培养的平板培养基中能抑制小麦穗腐致病菌生长的菌落挑取出来，分别涂布于新的平板培养基内，同时勾取部分小麦穗腐致病菌菌丝“之”字型涂布于各初筛的培养基上，而后用封口膜对平板培养基边缘继续进行封口，并在25～26℃条件培养若干天；观察平板培养基内的微生物抑菌情况，从中筛选平板培养基内能够明显抑制小麦穗腐致病菌生长的菌落作为对所选用的小麦穗腐致病菌抑制作用好的菌落。
2.根据权利要求1所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：其还包括步骤5）有拮抗作用的微生物菌的二次筛选：
5.1）挑取步骤4.2）中筛选出的对所选用的小麦穗腐致病菌抑制作用好的菌落，重复4.2）的步骤，纯化挑选出单菌落；
5.2）将经步骤5.1）中纯化后的单菌落分别接种于装有经灭菌处理的大麦粒培养瓶中，并同时将至少两粒步骤2）所培养的接种有小麦穗腐致病菌的大麦粒放入大麦粒培养瓶中，将大麦粒培养瓶封口后在25～26℃培养若干天，培养期内每天摇动玻璃瓶，最后静置1～2d观察菌丝是否得到抑制；
5.3）观察步骤5.2）中的有抑菌作用的微生物菌的抑菌效果，挑选出小麦穗腐致病菌没有明显扩张的对应培养瓶内的微生物菌作为目的拮抗菌。
3.根据权利要求2所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：其还包括步骤6）：对步骤5.3）得到的有拮抗作用的微生物菌的再次筛选：
6.1）将步骤5.3）中挑选出的微生物菌接种于装有经灭菌处理的大麦粒培养瓶中培养得到携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒；
6.2）在若干个新的平板培养皿的中心分别放置一粒携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒，而后在每个平板培养皿内于携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒外围均匀放置二至四粒步骤6.1）中培养的携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒，观察抑菌效果，从中选出小麦穗腐致病菌没有明显扩张、拮抗作用较好的对应培养皿内的微生物菌作为目的拮抗菌。
4.根据权利要求3所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：步骤6.2）中平板培养皿上放置四粒步骤6.1）培养的有抑菌效果的微生物菌的大麦粒时，放置方法为：制作若干个白底黑字的塑料圆形十字刻度板，每个十字刻度板的直径与平板培养皿的外径相等，接菌前，先将一个十字刻度板对齐放置于一个新的平板培养皿的正下方，平板培养皿为透明结构，平板培养基呈半透明状，将一粒携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒放于十字刻度板的正中心，并将四粒步骤6.1）中携带有抑菌效果的抑菌效果的微生物菌的大麦粒分别放置在由十字刻度板映射在平板培养基上的十字影像上。
5.根据权利要求1所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：所述小麦穗腐致病菌为赤霉病镰刀菌、灰霉病菌、黑穗病菌、青霉和黄曲霉中任意一种可以在大麦粒上繁殖的有害菌。
6.根据权利要求3所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：将经步骤5.1）得到的有抑菌效果的单菌落重复步骤5.2）的方案进行二次至三次重复筛选，将经步骤6.1）得到的有抑菌效果的微生物菌重复步骤6.2）的方案进行二次至三次重复筛选。
7.根据权利要求1所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：所述步骤1）中土壤为连续种植连续种植大麦或小麦的田块。
8.根据权利要求1所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：所述步骤2）中高温灭菌工序为：将蒸过或煮过的大麦粒装瓶后于120～125℃下灭菌20～25min。
9.根据权利要求1所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：所述步骤3）和步骤6.2）中接种大麦粒时，先将无菌镊子的镊子头烧热，通过烧热的镊子头在平板培养基的待接菌位置处点出小洞，后将携带小麦穗腐致病菌或者微生物菌的大麦粒放置于小洞内，可以有效防止大麦粒移位。
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