CN111269838A - 利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其通过将长满赤霉病菌的大麦粒掩埋于土壤内，诱导土壤中的拮抗菌附着在染菌大麦粒上，再通过抑菌拮抗实验挑选出可定植于大麦粒上的拮抗菌。其相对直接从土壤中筛选拮抗菌的传统方法，具有针对性和实用性强，方法简单有效，工作量小，筛选效率高，准确度高、且筛选出的拮抗菌更易在大麦粒上生长的优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及一种利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法。
背景技术
小麦赤霉病别名麦穗枯、烂麦头、红麦头，是小麦的主要病害之一。小麦赤霉病在全世界普遍发生，主要分布于潮湿和半潮湿区域，尤其气候湿润多雨的温带地区受害严重。从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中为害最严重的是穗腐。赤霉病由多种镰刀菌引起，其可以寄生在土壤中待适宜的气候条件飞散到空气中感染大、小麦，引起赤霉病的发生。例如冬小麦的生长季当中，如遇到多雨的冬季，冬季的雨水为土壤中赤霉病的生长提供了适宜的条件，将为次年春季的赤霉病发生提供大量的初始菌源量，导致次年的春季小麦赤霉病严重发生。
目前小麦赤霉病的防治方法包括物理防治、化学杀菌剂防治、抗病性小麦品种选育以及生物防治。其中生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治的新方法，微生物防治能够解决化学防治的抗药性以及药害等问题。赤霉菌虽然能在土壤中繁殖生长，但是由于土壤中含有大量抑制赤霉病菌大量繁殖的拮抗菌，故土壤表面很少观察到赤霉病菌孢子或孢子囊。用于生物防治的微生物即为从土壤中筛选到的拮抗菌，包括细菌、真菌、少量的放线菌等。如何从土壤中分离出能有抑制赤霉病生长的拮抗菌是生物防治的重要环节。通常从土壤中分离拮抗菌的方法是先分离出土壤中的所有菌群，然后用牛津杯法做抑制效果实验从而筛选出有拮抗作用的有益菌。但是土壤是微生物生活的大本营，1g土壤中就存在着多达106～109个微生物个体，如果先进行土壤微生物分离再进行抑菌试验，容易造成土壤分离工作量的庞大，而且还易漏掉有抑制作用的有效微生物菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法。
实现本发明目的的技术方案是：一种利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其包括以下步骤：
1）携带赤霉病菌的大麦粒的制备：将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶于高温灭菌后冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种赤霉病菌，并在25～26℃条件下培养5～6d，期间摇动培养瓶2～3次，使大麦粒充分长满赤霉病菌；
2）纱布包裹含有赤霉菌的大麦粒:使用若干块无菌纱布分别包裹数颗已长满赤霉病菌的大麦粒，并逐份扎口系好标签；
3）大麦粒的掩埋：将每份无菌纱布包好的大麦粒掩埋在土壤下10～20cm的深度，25～30d后取出；
4）装瓶：将从土壤中取出的每个无菌纱布内包裹的大麦粒分别装入一个灭菌后的玻璃瓶内，做好标记待用；
5）培养皿制备：将每个玻璃瓶内的大麦粒取出洗净消毒后在无菌滤纸上切开大麦粒后分装于若干培养皿内的平板培养基上培养；
6）观察经步骤5）培养3～5d后的培养皿上的染菌大麦粒菌丝发展情况，挑取红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养皿内的能够抑制大麦粒菌丝生长的微生物菌落进行分离培养；
7）拮抗菌的筛选：将经步骤6）挑选进行分离培养的微生物菌落挑取出来按“之”字型分别涂布于数个新的培养皿的平板培养基上，并在每个培养皿正中间放置一粒步骤1）中制取的携带有赤霉病菌的大麦粒，而后用封口膜对平板培养基边缘进行封口，于25～26℃下培养7～8d，从中选出红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养皿内的微生物菌落。
进一步地，挑取步骤7）中筛选出的微生物菌落，按步骤7）的操作重复筛选数次，纯化得到单菌落。单菌落较微生物菌落具有稳定性高，不易变异的优点。
进一步地，其还包括步骤8）拮抗菌的二次筛选：具体地，
8.1）挑取由步骤7）筛选出的有抑菌作用的单菌落接种于灭菌的大麦粒培养瓶中，并同时接种两粒步骤1所培养的携带赤霉病菌的大麦粒，大麦粒培养瓶内的大麦粒与瓶口之间存在供菌丝向上生长的空隙，而后在大麦粒培养瓶中注入1mL的无菌水，封口后在25～26℃下培养5～7d，培养期内每天摇动玻璃瓶，最后静置1～2d观察菌丝是否得到抑制；
8.2）观察步骤8.1）中大麦粒培养瓶内的菌丝抑菌效果，挑选出红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养瓶内的微生物菌作为目的拮抗菌。
步骤8）为对步骤7）得到的有抑菌作用的单菌落进行的二次筛选，以得到当对赤霉病菌具有拮抗作用的微生物菌和有害的赤霉病菌同时侵染生物体时，抑制赤霉菌效果更好的拮抗菌。
进一步地，步骤3）中大麦粒所埋的土壤选择种植过大、小麦的田块，尤其是年年发生赤霉病的田块，更容易有拮抗菌的产生。
进一步地，步骤1）中高温灭菌工序为：将蒸过或煮过的大麦粒装瓶后于120～125℃下灭菌20～25min；
发明人研究发现，拮抗菌存在于土壤中，而大麦赤霉病主要在穗部发病，故本发明通过将长满赤霉病菌的大麦粒掩埋于土壤内，诱导土壤中的拮抗菌附着在大麦粒上，并分离定植于大麦粒上的拮抗菌，由此筛选出在能在大麦粒植物体上具有一定定植能力的拮抗菌。其相对直接从土壤中筛选拮抗菌的传统方法，具有针对性和实用性强，方法简单有效，工作量小，筛选效率高，准确度高的优点。
附图说明
图1为步骤6）中抑制效果较好的实施例的培养皿内染菌大麦粒赤霉病菌的菌丝发展情况图；
图2为步骤7）中抑菌拮抗实验中培养皿内染菌大麦粒赤霉病菌的菌丝发展情况图，其中左边两个培养皿为空白对照；
图3为步骤8.1）中接种有步骤7）得到的拮抗菌的培养瓶内携带赤霉病菌的大麦粒的菌丝发展情况图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明较佳实施例做详细说明。
一种利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其包括以下步骤：
1）携带赤霉病菌的大麦粒的制备：将蒸过或煮过的大麦粒装瓶培养瓶于120～125℃下灭菌20～25min，并冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种赤霉病菌，并在25～26℃条件下培养5～6d，期间摇动培养瓶2～3次，使大麦粒充分长满赤霉病菌；
2）纱布包裹含有赤霉菌的大麦粒:使用若干块无菌纱布分别包裹数颗已长满赤霉病的镰刀菌的大麦粒，并逐份扎口系好标签；每块纱布可包裹100粒大麦；
3）大麦粒的掩埋：将每份无菌纱布包好的大麦粒掩埋在土壤下10～20cm处，25～30d后取出；大麦粒所埋的土壤选择种植过大、小麦的田块；
4）装瓶：将从每个土壤中取出的无菌纱布内包裹的大麦粒装入一个灭菌后的玻璃瓶内，做好标记待用；
5）培养皿制备：将每个玻璃瓶内的大麦粒取出用自来水洗净，再分别用75%乙醇处理10s后再用2%NaClO消毒15min，然后用无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上切开大麦粒后置于PDA培养基上培养3～5d； 每个培养皿放置4～5粒大麦粒，每个小瓶做三个重复的培养皿，同时将没有掩埋的长有赤霉菌的大麦粒放置在一个培养皿中设置对照；
6）观察经步骤5）培养3～5d后的培养皿上的染菌大麦粒菌丝发展情况，挑取能够抑制大麦粒菌丝生长的微生物菌落进行分离培养；其中，图1即为抑制效果较好的培养皿，该培养皿内红色赤霉病菌生长受到抑制，而抑菌效果不好的培养皿表现为整个培养皿生长出红色赤霉病菌；
7）拮抗菌的一次筛选：将步骤6）中具有拮抗作用的微生物菌落挑取出来“之”字型分别涂布于二十四个新的培养皿的平板培养基上，并在每个培养皿正中间放置一粒步骤1）中制取的携带有赤霉病菌的大麦粒做抑菌拮抗实验，同时设置没有拮抗菌仅有染菌大麦粒的培养皿作为空白对照，而后用封口膜对平板培养基边缘进行封口，于25～26℃下培养7～8d，从中筛选出对赤霉病菌抑制作用好的微生物菌落，并将挑取出的微生物菌落，按7）的步骤重复操作四次，纯化挑选出繁殖后不容易变异的单菌落；如图2所示，其中，左边两个培养皿为空白对照，其余24个培养皿为挑选出来的具有抑菌作用的拮抗菌抑菌效果。通过培养基背面观察抑菌情况，可以观察到空白对照组整个培养皿长满赤霉病菌菌丝，其余培养皿中间染菌的大麦粒的菌丝受到显著抑制不能扩展；
8）拮抗菌的二次筛选：
8.1）挑取步骤7）中有抑菌作用的单菌落接种于灭菌的大麦粒培养瓶中，并同时接种两粒步骤1所培养的携带赤霉病菌的大麦粒，大麦粒培养瓶中的大麦粒与瓶口间距为2cm以供菌丝向上生长，并在大麦粒培养瓶中注入1mL的无菌水，封口后在25～26℃下培养7d，前5d每天摇动玻璃瓶，5d后停止摇动静置2d观察菌丝是否得到抑制；
8.2）观察步骤8.1）中大麦粒培养瓶内的菌丝抑菌效果， 如图3所示，左边4个培养瓶中的拮抗菌能在大麦粒中快速繁殖并有效抑制赤霉病菌的生长，使赤霉病菌不能生长，对应培养瓶内的微生物菌即为本发明的目的拮抗菌。
其中，步骤7）中各培养皿的抑菌情况如表1所示：
表1
表1中的菌丝生长抑菌率（%）=【（CK组的菌丝生长直径-实施例组的菌落直径）/CK组的菌丝生长直径】*100%
从表1可知编号为5、10、15、18、20、21、22的抑菌效果较好，抑菌率分别达到84.83%、92.42% 、83.89%、86.26%、70.14%、 84.36%、84.36%。
步骤8）中各培养瓶内拮抗菌的抑菌情况如表2所示：
表2：
表2中菌丝生长抑菌率（%）=【（对照菌丝生长高度-菌丝生长高度）/对照菌丝生长高度】*100%
从表2可知序号为5、10、18、22的抑菌效果较好，抑菌率都达到100%，即赤霉病菌在5、10、18、22这几个选出的微生物菌大麦粒瓶中受到抑制，完全不能生长。
由实验数据可知，本发明将长满赤霉病菌的大麦粒掩埋于土壤内，可以诱导土壤中的拮抗菌附着在大麦粒上。本发明实现了目标拮抗菌的快速筛选，并且由于拮抗菌为大麦粒上分离出，因此筛选出的拮抗菌在大麦粒植物体上有一定的附着能力，保证其用于在活体麦穗的生物防治的效率。筛选出的拮抗菌涂布在平板培养基上，而后用封口膜对平板培养基边缘进行封口，于25～26℃下培养后可用于大田试验。
本发明所述蒸过或煮过的大麦粒可以为采用经泡水后煮或蒸至半生不熟的大麦粒，也可以为经煮或蒸至熟而不烂的大麦粒；步骤2）纱布包裹的赤霉菌的大麦粒数量优选在100粒左右，足量的大麦粒埋入土壤才能充分与土壤接触，又能保证实验的需要，太多不易全面接触土壤，也不易保存占空间，太少实验用的不够，并且100粒刚好装一个30ML小瓶子；所述单胞菌的挑选方法为平板划线法等微生物领域常规技术手段；步骤5）中大麦粒的消毒方式为实验室常规的消毒手段，具体地可用自来水洗净，再分别用75%乙醇处理10s后再用2%NaClO消毒15min，然后用无菌水冲洗3次；步骤5）中每个培养皿放置的大麦粒数量以及每个小瓶可做的重复的培养皿数量根据实验设计选择；所述培养基可以为PDA培养基等常规的适宜培养赤霉病菌的培养基。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）携带赤霉病菌的大麦粒的制备：将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种赤霉病菌，并在25～26℃条件下培养5～6d，期间摇动培养瓶2～3次，使大麦粒充分长满赤霉病菌；
2）纱布包裹含有赤霉菌的大麦粒:使用若干块无菌纱布分别包裹数颗已长满赤霉病菌的大麦粒，并逐份扎口系好标签；
3）大麦粒的掩埋：将每份无菌纱布包好的大麦粒掩埋在土壤下10～20cm的深度，25～30d后取出；
4）装瓶：将从土壤中取出的每个无菌纱布内包裹的大麦粒分别装入一个灭菌后的玻璃瓶内，做好标记待用；
5）培养皿制备：将每个玻璃瓶内的大麦粒取出洗净消毒后，在无菌滤纸上切开大麦粒后分装于若干培养皿内的平板培养基上培养；
6）观察经步骤5）培养3～5d后的培养皿上的染菌大麦粒菌丝发展情况，挑取红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养皿内的能够抑制大麦粒菌丝生长的微生物菌落进行分离培养；
7）拮抗菌的筛选：将经步骤6）挑选进行分离培养的微生物菌落挑取出来按“之”字型分别涂布于数个新的培养皿的平板培养基上，并在每个培养皿正中间放置一粒步骤1）中制取的携带有赤霉病菌的大麦粒，而后用封口膜对平板培养基边缘进行封口，于25～26℃下培养7～8d，从中选出红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养皿内的微生物菌落。
2.根据权利要求1所述的利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：挑取步骤7）中筛选出的微生物菌落，按步骤7）的操作重复筛选数次，纯化得到单菌落。
3.根据权利要求2所述的利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：其还包括步骤8）拮抗菌的二次筛选：具体地，
8.1）挑取由步骤7）筛选出的有抑菌作用的单菌落接种于灭菌的大麦粒培养瓶中，并同时接种两粒步骤1所培养的携带赤霉病菌的大麦粒，大麦粒培养瓶内的大麦粒与瓶口之间存在供菌丝向上生长的空隙，而后在大麦粒培养瓶中注入1mL的无菌水，封口后在25～26℃下培养5～7d，培养期内每天摇动玻璃瓶，最后静置1～2d观察菌丝是否得到抑制；
8.2）观察步骤8.1）中大麦粒培养瓶内的菌丝抑菌效果，挑选出红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养瓶内的微生物菌作为目的拮抗菌。
4.根据权利要求1所述的利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：步骤3）中大麦粒所埋的土壤选择种植过大、小麦的田块。
5.根据权利要求1所述的利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：步骤1）中高温灭菌工序为：将蒸过或煮过的大麦粒装瓶后于120～125℃下灭菌20～25min。
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