CN102946902B

CN102946902B - 双特异性抗体

Info

Publication number: CN102946902B
Application number: CN201180016218.0A
Authority: CN
Inventors: U·布林克曼; R·克罗斯代尔; H·杜尔; C·克莱因; E·科佩茨基; W·劳; J·T·雷古拉; J·M·尚策; P·乌马纳; K·瓦萨
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2031-03-24
Also published as: CA2789074A1; US10106600B2; AR080793A1; BR112012024312A2; RU2573588C2; US20110293613A1; KR101498346B1; TW201138821A; MX2012010559A; WO2011117330A1; HK1182625A1; MX340124B; JP2013523104A; RU2012143798A; EP2552481A1; JP5726287B2; EP2552481B1; KR20120130276A; CN102946902A

Abstract

本发明涉及双特异性抗体、其生产方法、含有所述抗体的药物组合物及其用途。

Description

双特异性抗体

发明背景

最近开发了多种多特异性重组抗体形式，例如，通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，M.J.等人，Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342和Morrison，S.L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。

也开发了若干种其他新形式其中抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)不再被保留，例如双抗体、三抗体或四抗体、微抗体(minibodies)、若干种单链形式(scFv、Bis-scFv)，它们能结合两个或更多抗原(Holliger，P.等人，Nature Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer，N.，Léger O.，Pathobiology 74(2007)3-14；Shen，J.等人，Journal of ImmunologicalMethods 318(2007)65-74；Wu，C.等人，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

全部此类形式都使用接头，或用于将抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至其他结合蛋白质(例如scFv)，或融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer N.，Léger O.，Pathobiology 74(2007)3-14)。应当注意，可通过维持与天然存在的抗体的高度相似，来保留效应子功能，例如通过Fc受体结合介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

在WO 2007/024715中报道了作为改造的多价和多特异性结合蛋白质的双可变结构域免疫球蛋白。在US 6,897,044中报道了生物活性抗体二聚体的制备方法。在US 7,129,330中报道了具有至少四个通过多肽接头彼此连接的可变结构域的多价Fv抗体构建体。在US 2005/0079170中报道了二聚或多聚抗原结合结构。在US 6,511,663中报道了包含三个或四个通过连接结构彼此共价结合的Fab片段的三价或四价单特异性抗原结合蛋白质，该蛋白质不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了可在原核和真核细胞中有效率地表达，并且在治疗和诊断方法中有用的四价双特异性抗体。在US 2005/0163782中报道了从包含通过至少一个链间二硫键连接的二聚体和没有通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的混合物中分离上述两种类型的多肽二聚体，或优选地合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5,959,083中报道了双特异性四价受体。在WO2001/077342中报道了具有三个或更多功能性抗原结合位点的改造的抗体。

在WO 1997/001580中报道了多特异性和多价的抗原结合多肽。WO1992/004053报道了通常用结合相同的抗原决定簇的IgG类的单克隆抗体制备的同种缀合物(homoconjugate)是通过合成交联共价连接的。在WO 1991/06305中报道了对抗原具有高亲和性的寡聚单克隆抗体，其中分泌的寡聚体，通常属于IgG类的寡聚体，具有两个或更多缔合到一起形成四价或六价IgG分子的免疫球蛋白单体。在US 6,350,860中报道了源自羊的抗体和改造的抗体构建体，它们可用于治疗其中干扰素γ活性是病原的疾病。在US 2005/0100543中报道了可靶向的构建体，它们是双特异性抗体的多价载体，即可靶向的构建体的每个分子可以作为两个或更多双特异性抗体的载体。

在WO 1995/009917中报道了遗传改造的双特异性四价抗体。在WO2007/109254中报道了由稳定化的scFv组成或包含稳定化的scFv的稳定化的结合分子。

从Lu，D.等人，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 318(2004)507-513；Lu，D.等人，J.Biol.Chem.，279(2004)2856-2865和Lu，D.等人，J.Biol Chem.280(2005)19665-72中知晓了针对EGFR和IGF-1R的双特异性抗体。

US 2007/0274985涉及包含单链Fab(scFab)蛋白质的合成抗体分子，其也可与二聚体包括异数抗体缔合，其中至少两个单链抗体分子是缔合的。

WO 2009/080253涉及双特异性二价抗体。

然而，考虑到多特异性抗体的不同的问题和方面(例如药物动力学和生物学性质、稳定性、聚集、表达产量、副产品)，存在对更多备选的多特异性抗体形式的需求。

发明概述

在一方面，本发明涉及双特异性抗体，包含：

a)特异性结合第一个抗原的第一个全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合第二个抗原的第二个全长抗体的重链和轻链，其中重链的N端通过肽接头连接到轻链的C端。

在本发明的另一方面，根据本发明的双特异性抗体还具有以下特征：

a)的全长抗体的重链的CH3结构域和b)的全长抗体的重链的CH3结构域各自在包含抗体CH3结构域之间的原界面中的改变的界面处交汇；

其中，i)在一条重链的CH3结构域中

用具有较大侧链体积的氨基酸残基取代氨基酸残基，从而在一条重链的CH3结构域的界面内生成凸起，该凸起可位于另一条重链的CH3域的界面内的腔内

并且其中

ii)在另一条重链的CH3结构域中

用具有较小侧链体积的氨基酸残基取代氨基酸残基，从而在第二个CH3结构域的界面内生成腔，其中第一个CH3结构域的界面内的凸起可置于该腔内。

在另一方面，根据本发明的双特异性抗体具有以下特征：

通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域对应位置的氨基酸，两个CH3结构域都被进一步改变，如此使得两个CH3结构域之间能形成二硫桥。

在本发明的另一方面，根据本发明的双特异性抗体具有以下特征：

b)所述的第二个全长抗体的重链和轻链的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)是通过在以下位点之间引入二硫键，通过二硫化物稳定的：

i)重链可变结构域第44位至轻链可变结构域第100位，

ii)重链可变结构域第105位至轻链可变结构域第43位，或

iii)重链可变结构域第101位至轻链可变结构域第100位。

a)第一个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链，并且

b)第二个全长抗体特异性地结合EGFR并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述肽连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

b)第二个全长抗体特异性地结合EGFR并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述肽连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

a)第一个全长抗体特异性地结合EGFR并包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链，并且

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述肽连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述肽连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，根据本发明的双特异性抗体的特征在于抗体包含IgG1的恒定区。

在本发明的另一方面，根据本发明的双特异性抗体的特征在于在Asn297用糖链糖基化抗体，其中糖链中的岩藻糖量是65％或更低。

本发明的其他方面是包含所述双特异性抗体的药物组合物、所述组合物用于治疗癌症、所述双特异性抗体用于生产制造治疗癌症的药物的用途、通过向需要此类治疗的患者施用所述双特异性抗体治疗罹患癌症患者的方法。

本发明的其他方面是编码根据本发明的双特异性抗体的链的核酸分子。

本发明还提供能在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的含有所述根据本发明的核酸的表达载体，以及含有用于重组生产根据本发明的双特异性抗体的此类载体的宿主细胞。

本发明还包含原核或真核宿主细胞，其包含根据本发明的载体。

本发明还包含生产根据本发明的双特异性抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明的核酸并从所述细胞或细胞培养物上清液中回收所述双特异性抗体。本发明还包含通过用于生产双特异性抗体的此类方法获得的抗体。

本发明的另一个方面是制备根据本发明的双特异性抗体的方法，包括以下步骤：

a)用包含核酸分子的载体转化宿主细胞，所述核酸分子编码：

aa)特异性结合第一个抗原的第一个全长抗体的重链和轻链；；和

ab)特异性结合第二个抗原的第二个全长抗体的重链和轻链，其中重链的N端通过肽接头与轻链的C端连接；和

b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养宿主细胞；和

c)从所述培养物回收所述抗体分子。

现已发现根据本发明的双特异性抗体具有有价值的特征，例如在哺乳动物细胞(例如HEK293细胞和CHO细胞)中良好的表达产量、稳定性、生物或药理学活性、药物动力学性质。它们可用于例如治疗诸如癌症的疾病。包含3条多肽链的根据本发明的这些双特异性抗体在哺乳动物细胞中表达时尤其具有有价值的副产品谱。

附图描述

图1具有包含典型顺序的可变结构域和恒定结构域的两对重链和轻链的、特异性地结合第一个抗原1而没有CH4结构域的全长抗体的示意结构。

图2根据本发明的双特异性抗体的示意结构。

图3a和3b根据本发明的双特异性抗体的示意结构，包括knobs-intohole修饰的CH3结构域。

图4a和4b根据本发明的双特异性抗体的示意结构，包括knobs-intohole修饰的CH3结构域和第二个抗体重链和轻链的VH和VL结构域的二硫化物稳定。

图5根据本发明的双特异性抗体Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06对HUVEC增殖的抑制。

图6根据本发明的双特异性抗体Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06对Tie2磷酸化的抑制。

图7OA-Ak18-scFab-GA201(图7a)和OA-GA201-scFab-Ak18(图7b)的蛋白质印迹(还原的)。

图8较之亲本单特异性抗体<IGF-1R>HUMAB Clone 18或<EGFR>ICR62，双特异性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT对H322M癌细胞生长的抑制(剂量依赖性的)。

图9Biacore(表面等离子体共振)传感图：双特异性抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT显示了同时结合胺偶联的人EGFR和人IGF1R(x轴：应答，y轴：时间)。

图10较之亲本单特异性抗体<IGF-1R>HUMAB Clone 18和<EGFR>ICR62的组合，OA-GA201-scFab-Ak18_WT在BxPC3异种移植物模型中对肿瘤生长的抑制

发明详述

在一方面，本发明涉及双特异性抗体，包含：

a)特异性结合第一个抗原的第一个全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合第二个抗原的第二个全长抗体的重链和轻链，其中重链的N端通过肽接头与轻链的C端连接。

术语“全长抗体”指由两个“全长抗体重链”和两个“全长抗体轻链”组成的抗体(见图1)。“全长抗体重链”是由以N端至C端方向的抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成的多肽，简写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；在属于IgE亚类的抗体的情况下任选地有重链恒定结构域4(CH4)。优选地“全长抗体重链”是由以N端到C端方向的VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”由以N端至C端方向的抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，简写为VL-CL。抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两个全长抗体链通过CL结构域和CH1结构域之间和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接到一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如IgG1和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。根据本发明的全长抗体可来自单个物种例如人类，或它们可以是嵌合的或人源化的抗体。根据本发明的全长抗体包含两个抗原结合位点，每个位点由特异性地结合相同的抗原的VH和VL对形成。所述全长抗体的重链或轻链的C端表示位于所述重链或轻链的C端的最后一个氨基酸。所述全长抗体的重链或轻链的N端表示位于所述重链或轻链的N端的最后一个氨基酸。

如本发明中所用的术语“肽接头”表示具有氨基酸序列的肽，其优选地源自人工合成。根据本发明的肽用于通过肽接头连结第二个全长抗体(特异性地结合第二个抗原)轻链的C端和重链的N端。在第二个全长抗体重链和轻链中的肽接头是具有至少30个氨基酸长度，优选地32至50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个中肽接头是具有32至40个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方式中所述接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8、9或10，m＝0、1、2或3)或(x＝4，和n＝6、7或8，和m＝0、1、2或3)，优选地x＝4，n＝6或7，和m＝0、1、2或3，更优选地x＝4，n＝7，m＝2。在一个实施方式中，所述接头是(G₄S)₆G₂。优选地根据本发明的双特异性抗体的CH3结构域可以用“knob-into-holes”技术改变，该技术在例如WO 96/027011、Ridgway J.B.等人，Protein Eng 9(1996)617-621和Merchant，A.M.等人，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中详细说明并有一些实例。在该方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变以增加含有这两个CH3结构域的重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域中每个都可作为“knob”，而另一个作为“hole”。二硫桥的引入稳定异二聚体(Merchant，A.M等人，Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell，S.等人J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产量。

在本发明的一方面，根据本发明的双特异性抗体还具有以下特征：

一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域在包含抗体CH3结构域之间的原界面的界面处交汇；

其中所述界面被改变以促进双特异性抗体的形成，其中所述改变具有以下特征：

a)一条重链的CH3结构域被改变，

使得在双特异性抗体内的在与另一条重链CH3结构域的原界面交汇的一条重链CH3结构域的原界面内，

氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在一条重链的CH3结构域的界面内生成凸起，该凸起可置于另一条重链的CH3结构域的界面内的腔内

并且

b)另一条重链的CH3结构域被改变，

使得在双特异性抗体内的在与第一条重链CH3结构域的原界面交汇的第二条重链CH3结构域的原界面内，

氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二个CH3结构域的界面内生成腔，第一个CH3结构域的界面内的凸起可置于该腔内。

因此根据本发明的抗体优选地具有以下特征：

a)的全长抗体的重链的CH3结构域和b)的全长抗体的重链的CH3结构域各自在包含抗体CH3结构域之间的原界面中交替的界面处交汇；

其中，i)在一条重链的CH3结构域中

并且其中

ii)在另一条重链的CH3结构域中

优选地所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

优选地所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。

在本发明的一个方面，通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域对应位置的氨基酸来进一步改变两个CH3结构域，使得两个CH3结构域之间能形成二硫桥。

在一个实施方式中，双特异性抗体包含“Knobs链”的CH3结构域中的T366W突变和“hole链”的CH3结构域中的T336S、L368A、Y407V突变。也可使用CH3结构域之间额外的链间二硫桥(Merchant，A.M等人，Nature Biotech 16(1998)677-681)，例如通过向“knobs链”的CH3结构域中引入Y349C突变，向“hole链”的CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。

在另一个实施方式中，根据本发明的双特异性抗体包含两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和两个CH3结构域中的另一个中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在另一个优选的实施方式中双特异性抗体包含两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(一个CH3结构域中额外的Y349C突变和另一个CH3结构域中额外的E356C或S354C突变形成链间二硫桥)(编号均根据Kabat EU索引)。也可以备选地或额外地使用由如EP 1870459A1所述的其他knobs-in-holes技术。因此双特异性抗体的另一个实例是“knobs链”的CH3结构域中的R409D；K370E突变和“hole链”CH3结构域中的D399K；E357K突变(编号均根据Kabat EU索引)。

在另一个实施方式中双特异性抗体包含“knobs链”CH3结构域中的T366W突变和“hole链”CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变，以及额外地“knobs链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和“hole链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。

在另一个实施方式中双特异性抗体包含两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述三价双特异性抗体包含两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，以及额外地“knobs链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和‘hole链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。

在一个实施方式中，第二个全长抗体(特异性结合第二个抗原)的重链和轻链的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)是通过在以下位点引入二硫键，用二硫化物稳定的：

i)重链可变结构域第44位至轻链可变结构域第100位，

ii)重链可变结构域第105位至轻链可变结构域第43位，或

iii)重链可变结构域第101位至轻链可变结构域第100位(编号均根据Kabat EU索引)。

在一个实施方式中，第二个全长抗体(特异性结合第二个抗原)的重链和轻链的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)是通过在以下位点引入二硫键，用二硫化物稳定的：重链可变结构域第44位至轻链可变结构域第100位。

此类进一步的二硫化物稳定是通过在第二个全长抗体重链和轻链的可变结构域VH和VL之间引入二硫键实现的。引入非天然二硫桥以稳定单链Fv的技术在例如WO 94/029350、Rajagopal，V.等人，Prot.Engin.10(1997)1453-59、Kobayashi，H.等人，Nuclear Medicine&Biology，第25卷，(1998)387-393或Schmidt，M.等人，Oncogene(1999)18，1711-1721中说明。在一个实施方式中第二个全长抗体重链和轻链可变结构域之间任选的二硫键位于重链可变结构域第44位和轻链可变结构域第100位之间。在一个实施方式中可变结构域之间任选的二硫键位于重链可变结构域第105位和轻链可变结构域第43位之间(编号总是根据Kabat EU索引)。

在一个实施方式中，优选在第二个全长抗体重链和轻链的可变结构域VH和VL之间有所述任选的二硫化物稳定的根据本发明的双特异性抗体。

在一个实施方式中，优选在第二个全长抗体重链和轻链的可变结构域VH和VL之间没有所述任选的二硫化物稳定的根据本发明的双特异性抗体。

根据本发明的双特异性抗体的两部分都包含抗原结合位点(第一个全长抗体重链和轻链包含一个抗原结合位点，第二个全长抗体重链和轻链包含一个抗原结合位点)。如本文所用的术语“结合位点”或“抗原结合位点”指各自的抗原实际结合的根据本发明的所述双特异性抗体的区域。第一个全长抗体重链和轻链或第二个全长抗体重链和轻链中的每个抗原结合位点是通过由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的对形成的。

结合所需抗原(例如EGFR)的抗原结合位点可源自：a)抗原的已知抗体(例如抗EGFR抗体)或b)使用尤其是抗原蛋白质或核酸或其片段通过从头(de novo)免疫方法，或者通过噬菌体展示获得的新抗体或抗体片段。

本发明的抗体的抗原结合位点含有六个互补决定区(CDR)，它们对结合位点对抗原的亲和性有不同程度的贡献。有三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR和框架区(FR)的范围是通过与氨基酸序列的编制的数据库比较确定的，其中根据序列中的变异性定义了这些区域。

抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如天然抗体是单特异性的。如本文所用的术语“双特异性”抗体指具有两个或更多抗原结合位点，并且与两个不同抗原或与相同抗原的两个不同表位结合的抗体。根据本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体是对两个不同抗原双特异性的，即VEGF作为第一个抗原，ANG-2作为第二个抗原，或者例如EGFR作为第一个抗原，IGF-1R作为第二个抗原，或者反之亦然。

如本文所用的术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点，每个结合位点结合相同抗原的相同表位的抗体。

如本申请中所用的术语“价”指抗体分子中存在的结合位点的指定的数目。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别指抗体分子中存在三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。例如天然抗体或根据本发明的双特异性抗体有两个结合位点，是二价的。

如本文所用的术语“EGFR”指人表皮生长因子受体(又称为HER-1或Erb-B1，SEQ ID NO：13)，是c-erbB原癌基因编码的170kDa跨膜受体，表现内在的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi，H.等人，Br.J.Cancer 73(1996)228-235；Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，Cancer 94(2002)1593-1611)。SwissProt数据库条目P00533提供EGFR的序列。也存在EGFR的同工型和变体(例如可变RNA转录物、截断型、多态性等)，包括但不限于由Swissprot数据库条目P00533-1、P00533-2、P00533-3和P00533-4鉴定的那些。已知EGFR结合配体，包括α)，表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGf-双调蛋白、肝素结合EGF(hb-EGF)、β动物纤维素和表皮调节素(epiregulin)(Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，Cancer 94(2002)1593-1611；Mendelsohn，J.，和Baselga，J.，Oncogene 19(2000)6550-6565)。EGFR通过酪氨酸激酶介导的信号转导途径调控多个细胞过程，包括但不限于活化控制细胞增殖、分化、细胞存活、细胞凋亡、血管生成、有丝分裂发生，和转移的信号转导途径(Atalay，G.等人，Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Tsao，A.S.，和Herbst，R.S.，Signal 4(2003)4-9；Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，Cancer 94(2002)1593-1611；Modjtahedi，H.等人，Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。

如本文所用的术语“IGF-1R”指人类胰岛素生长因子1受体(IGF-IR，CD 221抗原；SEQ ID NO：14)，属于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族(LeRoith，D.等人，Endocrin.Rev.16(1995)143-163和Adams，T.E.等人，Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063)。SwissProt数据库条目P08069提供IGF-1R的序列。IGF-IR以高亲和性结合IGF-I并起始对此配体的体内生理应答。IGF-IR也结合IGF-II，然而亲和性略低。IGF-IR过表达促进细胞的肿瘤性转化，并且有证据表明IGF-IR参与细胞的恶性转化并因此是开发治疗癌症的治疗剂的有用的靶(Adams，T.E.等人，Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063)。

在本发明的优选的方面，根据本发明的双特异性抗体特异性地结合人IGF-1R和人EGFR(即根据本发明的双特异性抗体是双特异性抗IGF-1R/抗EGFR抗体)。双特异性抗体基于人<IGF-1R>HUMAB Clone 18(DSMACC 2587；WO 2005/005635，简称为<IGF-1R>Clone18或<IGF-1R>AK18)和人源化的<EGFR>ICR62(WO 2006/082515，简称为<EGFR>ICR62)的抗原结合位点。这些双特异性二价抗体的相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3(对于OA-Ak18-scFab-GA201)中；在SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7(对于OA-GA201-scFab-Ak18)中；在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4(对于OA-Ak18-scFab-GA201_WT)和在SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8(OA-GA201-scFab-Ak18_WT)中给出。

根据本发明的双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体表现出对需要EGFR和IGF-1R靶向治疗的人类患者的益处。根据本发明的抗体具有极有价值的性质，导致对罹患此类疾病，特别是罹患癌症的患者的益处。与单特异性亲本<IGF-1R>抗体相比，根据本发明的双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体表现出例如IGF-1R受体的内在化降低。此外，它们表现出对两个抗原EGFR和IGF-1R都表达的肿瘤细胞的良好靶向，这表明对罹患两个抗原EGFR和IGF-1R都表达的癌症的患者在效力/毒性比方面的益处。

因此在本发明的一方面，根据本发明的双特异性抗体具有以下特征：

b)第二个全长抗体特异性地结合EGFR并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

b)第二个全长抗体特异性地结合EGFR并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

因此在本发明的一个实施方式中双特异性抗体是抗IGF-1R/抗EGFR抗体，并且其特征在于包含SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3.22的氨基酸序列。因此本发明的一个方面是特异性结合人IGF-1R和人EGFR的双特异性抗体，其特征在于包含SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3的氨基酸序列。

因此在本发明的一个实施方式中双特异性抗体是抗IGF-1R/抗EGFR抗体，并且其特征在于包含SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：4的氨基酸序列。因此本发明的一个方面是特异性结合人IGF-1R和人EGFR的双特异性抗体，其特征在于包含SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ IDNo：4的氨基酸序列。

因此在本发明的一个实施方式中双特异性抗体是抗IGF-1R/抗EGFR抗体，并且其特征在于包含SEQ ID No：5、SEQ ID No：6和SEQ ID No：7的氨基酸序列。因此本发明的一个方面是特异性结合人IGF-1R和人EGFR的双特异性抗体，其特征在于包含SEQ ID No：5、SEQ ID No：6和SEQ IDNo：7的氨基酸序列。

因此在本发明的一个实施方式中双特异性抗体是抗IGF-1R/抗EGFR抗体，并且其特征在于包含SEQ ID No：5、SEQ ID No：6和SEQ ID No：8的氨基酸序列。因此本发明的一个方面是特异性结合人IGF-1R和人EGFR的双特异性抗体，其特征在于包含SEQ ID No：5、SEQ ID No：6和SEQ IDNo：8的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方式中，双特异性抗体是抗IGF-1R/抗EGFR抗体，并且其特征在于：

a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

b)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

c)包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列，或者

d)包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方式中所述双特异性抗体抗IGF-1R/抗EGFR抗体的特征在于具有以下一项或多项性质(用如实施例4和实施例5所述的测定确定的)：

-在H322M肿瘤细胞上，抗IGF-1R/抗EGFR抗体抑制IGF-1R的磷酸化，IC50为5nM或更少(优选地2nM或更少)；

-在H322M肿瘤细胞上，双特异性抗IGF-1R/抗EGFR抗体抑制EGFR的磷酸化，IC50为5nM或更少(优选地2nM或更少)；

-与抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB Clone 18(DSM ACC2587)相比，双特异性抗IGF-1R/抗EGFR抗体减少IGF-1R的下调50％或更多。

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，且CDR内不多于1个氨基酸残基替换，并且其中较之SEQ ID No：7的未突变的氨基酸序列的结合亲和性的KD值，结合亲和性的KD值相等或减小少于4倍。

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列，且CDR内不多于1个氨基酸残基替换，并且其中较之SEQ ID No：8的未突变的氨基酸序列的结合亲和性的KD值，结合亲和性的KD值相等或减小少于4倍。

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，且CDR3H内不多于1个氨基酸残基替换，并且其中较之SEQ ID No：7的未突变的氨基酸序列的结合亲和性的KD值，结合亲和性的KD值相等或减小少于4倍。

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列，且CDR3H内不多于1个氨基酸残基替换，并且其中较之SEQ ID No：8的未突变的氨基酸序列的结合亲和性的KD值，结合亲和性的KD值相等或减小少于4倍。

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，且CDR内不多于1个氨基酸残基替换，并且其中较之SEQ ID No：7的未突变的氨基酸序列的结合亲和性的KD值，结合亲和性的KD值相等或减小少于4倍；

并具有一项或多项以下性质(用如实施例4和实施例5所述的测定确定)：

-在H322M肿瘤细胞上抗IGF-1R/抗EGFR抗体抑制IGF-1R的磷酸化，IC50为5nM或更少(优选地2nM或更少)

-在H322M肿瘤细胞上抗IGF-1R/抗EGFR抗体抑制EGFR的磷酸化，IC50为5nM或更少(优选地2nM或更少)

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列，且CDR内不多于1个氨基酸残基替换，并且其中较之SEQ ID No：8的未突变的氨基酸序列的结合亲和性的KD值，结合亲和性的KD值相等或减小少于4倍；

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，且CDR3H内不多于1个氨基酸残基替换，并且其中较之SEQ ID No：7的未突变的氨基酸序列的结合亲和性的KD值，结合亲和性的KD值相等或减小少于4倍；

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列，且CDR3H内不多于1个氨基酸残基替换，并且其中较之SEQ ID No：8的未突变的氨基酸序列的结合亲和性的KD值，结合亲和性的KD值相等或减小少于4倍；

例如在EP10166860.6中描述了SEQ ID No：7或SEQ ID No：8的CDR3H中的氨基酸残基替换的实例，其中较之未突变的氨基酸序列的结合亲和性KD值，结合亲和性KD值相等或降低少于4倍。

如本文所用的术语“VEGF”指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)(SEQ ID No：15)，在例如Leung，D.W.等人，Science 246(1989)1306-9；Keck，P.J.等人，Science 246(1989)1309-12和Connolly，D.T.等人，J.Biol.Chem.264(1989)20017-24中描述。VEGF参与正常或异常血管生成以及与肿瘤和眼内疾病相关新血管化(Ferrara，N.等人，Endocr.Rev.18(1997)4-25；Berkman，R.A.等人，J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown，L.F.等人，Human Pathol.26(1995)86-91；Brown，L.F.等人，Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern，J.等人，Brit.J.Cancer.73(1996)931-934和Dvorak，H.等人，Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是同源二聚体糖蛋白，已从多种来源分离出。VEGF显示对内皮细胞的高度特异性有丝分裂活性。

如本文所用的术语“ANG-2”指人血管生成素-2(ANG-2)(备选地简写为ANGPT2或ANG2)(SEQ ID No：16)，在Maisonpierre，P.C.等人，Science 277(1997)55-60和Cheung，A.H.，等人，Genomics 48(1998)389-91中说明。发现血管生成素-1和血管生成素-2和ANG-2是Ties的配体，Ties是选择性表达于血管内皮内的酪氨酸激酶家族。Yancopoulos，G.D.等人，Nature 407(2000)242-48。血管生成素家族目前有四个确定的成员。血管生成素-3和血管生成素-4(Ang-3和Ang-4)可代表小鼠和人中相同基因座位的有巨大差异的对应物。Kim，I.，等人，FEBS Let，443(1999)353-56；Kim，I.，等人，J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别被鉴定为激动剂和拮抗剂(关于ANG-1参见：Davis，S.等人，Cell 87(1996)1161-69；关于ANG-2参见：Maisonpierre，P.C.等人，Science 277(1997)55-60)。全部已知的血管生成素主要结合Tie2，并且Ang-1和Ang-2都以3nM(Kd)的亲和性结合Tie2。Maisonpierre，P.C.等人，Science 277(1997)55-60。

在优选的实施方式中根据本发明的双特异性抗体特异性地结合人VEGF和人ASNG-2(即根据本发明的双特异性抗体是双特异性抗VEGF/抗ANG-2抗体)。双特异性抗体优选地基于抗VEGF抗体贝伐珠单抗(bevacizumab)和ANG2i-LC06(在WO2010/040508(PCT申请号PCT/EP2009/007182)中说明，是通过噬菌体展示获得的)的抗原结合位点。这些双特异性二价抗体的相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11(对于Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SS)中、并且在SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12(对于Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06)中给出。

a)第一个全长抗体特异性地结合VEGF并包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链，并且

b)第二个全长抗体特异性地结合ANG-2并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

b)第二个全长抗体特异性地结合ANG-2并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

因此在本发明的一个实施方式中双特异性抗体是抗VEGF/抗ANG-2抗体，其特征在于包含SEQ ID No：9、SEQ ID No：10和SEQ ID No：11的氨基酸序列。

因此在本发明的一个实施方式中双特异性抗体是抗VEGF/抗ANG-2抗体，其特征在于包含SEQ ID No：9、SEQ ID No：10和SEQ ID No：12的氨基酸序列。

本发明的全长序列抗体包含一种或多种免疫球蛋白类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，以及在IgG和IgA的情况下，其亚型。在优选的实施方式中，本发明的全长抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。

如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单种氨基酸组分的抗体分子制剂。

术语“嵌合抗体”指包含来自一个来源或物种的可变区(即结合区)，以及源自不同来源或物种的至少部分恒定区，通常用重组DNA技术制备。优选包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其他优选形式是其中从原抗体的恒定区修饰或改变恒定区以生成根据本发明的性质，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质的形式。此类嵌合抗体也称为“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段的免疫球蛋白基因的表达的产物。生产嵌合抗体的方法涉及本领域熟知的常规重组DNA和基因转染技术。参见例如Morrison，S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。

术语“人源化抗体”指其中框架或“互补决定区”(CDR)被修饰，以包含较之亲本免疫球蛋白具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在优选的实施方式中，鼠CDR被移植到人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann，L.等人，Nature 332(1988)323-327和Neuberger，M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。特别优选的CDR对应于代表用于嵌合抗体识别上述抗原的序列的那些CDR。本发明涵盖的“人源化抗体”的其他形式是其中从原抗体的恒定区额外地修饰或改变恒定区，以生成根据本发明的性质，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质的形式。

如本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。现有技术中熟知人抗体(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体也可以在能在免疫时生产人抗体的全部组成成分或所选择的人抗体，而不生产内源免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中产生。将人生殖系免疫球蛋白基因阵列转移到此类生殖系突变的小鼠中会导致在抗原攻击时产生人抗体(参见例如Jakobovits，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.等人，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann，M.等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗体也可在噬菌体展示文库中生产(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；和Boerner，P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。如在根据本发明的嵌合抗体和人源化抗体中所提到的，如本文所用的“人抗体”也包含在恒定区内被修饰以生成根据本发明的性质，特别是关于C1q结合和/或FcR结合的性质的此类抗体，例如通过“类转换”即改变或突变Fc部分(例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。

如本文所用的术语“重组人抗体”旨在包括用重组手段制备、表达、创造或分离的全部人抗体，例如从宿主细胞(例如NS0或CHO细胞)或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体，或者用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经接受体内体细胞超突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列源自并与人生殖系VH和VL序列相关，可能不天然存在于体内人抗体生殖系所有组成成分内。

如本文所用的“可变结构域”(轻链可变结构域(VL)、重链可变区(VH))指每对直接参与抗体与抗原结合的轻链和重链对。人轻链和重链可变结构域具有相同的一般形式，每个结构域包含四个序列广泛保守的框架(FR)区，由三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接。框架区采取β折叠构象，并且CDR可形成连接β折叠结构的环。每条链中的CDR被框架区维持其三维结构并与来自其他链的CDR共同形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和性中起到特别重要的作用，因此提供本发明的另一个对象。

术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”用于本文时指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除了此处限定的高变区残基之外的那些可变结构域区。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每条链上的CDR被此类框架氨基酸分隔开。特别地，重链的CDR3是对抗原结合最重要的区域。根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义确定CDR和FR区。

如本文所用，术语“结合”或“其特异性地结合”或“特异性地结合”指在用纯化的野生型抗原进行的体外测定中，优选地在表面等离子体共振测定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中，抗体结合抗原的表位。结合的亲和性用术语ka(抗体从抗体/抗原复合物缔合的速率常数)、k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。在一个实施方式中结合或特异性结合指10^-8mol/l或更低，优选地10^-9M至10^-13mol/l的结合亲和性(K_D)。因此，根据本发明的双特异性抗体优选地以10^-8mol/l或更低，优选地10^-9至10^-13mol/l的结合亲和性(KD)特异性结合对其特异的每个抗原。

抗体与FcγRIII的结合可以用BIAcore测定(GE-healthcare Uppsala，瑞典)研究。结合的亲和性用术语ka(抗体从抗体/抗原复合物缔合的速率常数)、k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。

术语“表位”包括任何能特异性结合抗体的多肽决定簇。在一些实施方式中，表位决定簇包括分子的化学活性表面的定组(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，在一些实施方式中，可具有特异性三维结构特征，和/或特异性电荷特征。表位是被抗体结合的抗原的区域。

在一些实施方式中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，抗体被称为特异性结合抗原。

如本申请中所用的术语“恒定区”指除了可变区外的抗体的结构域的总和。恒定区不直接涉及抗原结合，但表现出多种效应子功能。取决于其重链恒定区的氨基酸序列，抗体被分为以下类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些类被进一步分为亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。全部5种抗体类中都存在的轻链恒定区(CL)称为κ(kappa)和λ(lambda)。

如本申请所用的术语“源自人的恒定区”指亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。现有技术熟知此类恒定区，并被例如Kabat，E.A.说明(参见例如Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。

术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分的结合起始的过程。C1q与抗体的结合是由在所谓结合位点的限定的蛋白质-蛋白质相互作用引起的。现有技术熟知此类Fc部分结合位点(见上文)。此类Fc部分结合位点由例如氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329表征(编号根据Kabat EU索引)。IgG1、IgG2和IgG3亚类的抗体通常表现补体活化，包括C1q和C3结合，而IgG4不活化补体系统，并且不结合C1q和/或C3。

IgG4亚类的抗体表现减弱的Fc受体(FcγRIIIa)结合，其他IgG亚类的抗体表现强结合。然而如果Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc糖缺失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435残基被改变，也提供减弱的Fc受体结合(Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund，J.等人，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.等人，Immunology 86(1995)319-324；EP 0307434)。

在一个实施方式中，根据本发明的抗体与IgG1抗体相比，具有减弱的FcR结合，并且关于FcR结合，全长亲本抗体属于IgG4亚类，或属于IgG1或IgG2亚类，在S228、L234、L235和/或D265具有突变，和/或含有PVA236突变。在一个实施方式中，全长亲本抗体中的突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一个实施方式中全长亲本抗体中的突变是IgG4中S228P和L235E，IgG1中L234A和L235A。

在其他实施方式中根据本发明的双特异性抗体的特征在于所述全长抗体属于人IgG1亚类。

术语“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”指在效应子细胞存在下，根据本发明的抗体裂解人靶细胞。优选地通过在效应子细胞(例如新鲜分离的PBMC或从血沉棕黄层纯化的效应子细胞例如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞，或者永久生长的NK细胞系)存在下，用根据本发明的抗体处理表达EGFR和IGF-1R的细胞的制备物来测量ADCC。

术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分的结合起始的过程。C1q与抗体的结合是由在所谓结合位点的限定的蛋白质-蛋白质相互作用引起的。现有技术熟知此类Fc部分结合位点(见上文)。此类Fc部分结合位点由例如氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329表征(编号根据Kabat EU索引)。IgG1、IgG2和IgG3亚类的抗体通常显示补体活化，包括C1q和C3结合，而IgG4不活化补体系统，不结合C1q和/或C3。

抗体的恒定区直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。补体活化(CDC)是由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的恒定区的结合起始的。C1q与抗体的结合是由在所谓结合位点的限定的蛋白质-蛋白质相互作用引起的。现有技术熟知此类恒定区结合位点，被例如Lukas，T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton，D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen，J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh，M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.等人，Immunology 86(1995)319-324和EP 0307434说明。此类恒定区结合位点由例如氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329表征(编号根据Kabat EU索引)。

在一个实施方式中根据本发明的双特异性抗体包含IgG1或IgG3亚类(优选地IgG1亚类的)的恒定区，该恒定区优选地源自人。在一个实施方式中根据本发明的双特异性抗体包含IgG1或IgG3亚类(优选地IgG1亚类的)的Fc部分，该恒定区优选地源自人。

可以通过改造抗体的寡糖成分来增强单克隆抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，如Umana，P.等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180和US 6,602,684中说明。最常用的治疗抗体，IgG1类抗体是在每个CH2结构域的Asn297处具有保守N-连接的糖基化位点的糖蛋白。联结于Asn297的两个复杂双触角寡糖被包埋于CH2结构域之间，与多肽骨架形成广泛的接触，并且其存在对抗体介导效应子功能(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))是必要的(Lifely，M.R.等人，Glycobiology 5(1995)813-822；Jefferis，R.等人，Immunol.Rev.163(1998)59-76；Wright，A.，和Morrison，S.L.，Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana，P.等人.Nature Biotechnol.17(1999)176-180和WO 99/154342显示在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中过表达β(1，4)-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶III(“GnT III”)(催化二等分(bisected)的寡糖形成的糖基转移酶)显著地增加抗体的体外ADCC活性。Asn297糖组分的变化或其消除也影响与FcγR和C1q的结合(Umana，P.等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180；Davies，J.等人，Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294；Mimura，Y.等人，J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547；Radaev，S.等人，J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483；Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740；Simmons，L.C.等人，J.Immunol.Methods 263(2002)133-147)。

在例如WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739、Niwa，R.等人，J.Immunol.Methods 306(2005)151-160；Shinkawa，T.等人，J Biol Chem，278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722中说明了通过减少岩藻糖的量来增强单克隆抗体的细胞介导的效应子功能的方法。

人IgG1或IgG3的糖基化发生在Asn297，因为核心岩藻糖化的双触角复杂寡糖糖基化以最多2个Gal残基终止。Kabat，E.A.等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)和Brüggemann，M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love，T.W.等人，Methods Enzymol.178(1989)515-527详细报道了IgG1或IgG3亚类的人恒定重链区。取决于末端Gal残基的量，这些结构被称为G0、G1(α-1，6-或α-1，3-)或G2聚糖残基(Raju，T.S.，Bioprocess Int.1(2003)44-53)。例如Routier，F.H.，Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述了抗体Fc部分的CHO型糖基化。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常以至少85％的量在Asn297被岩藻糖化。全长亲本抗体的经修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。优选地二等分的，还原的/未岩藻糖化的寡糖是杂合的。在另一个实施方式中，双分叉的，还原的/未岩藻糖化的寡糖是复合的。

根据本发明，“岩藻糖的量”指相对于联结到Ash297的全部糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总量的在糖链内Asn297位的所述糖的量，其用MALDI-TOF质谱法测量并计算平均值。岩藻糖的相对量是含有岩藻糖的结构相对于通过MALDI-TOF在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的全部糖结构(例如分别是复合、杂合以及寡甘露糖和高甘露糖结构)的百分比(见实施例10)。

与其亲本<EGFR>和/或<IGF-1R>抗体相比，根据本发明的双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体表现出EGFR和IGF-1R受体的内在化降低。因此，在本发明的一个优选的实施方式中，双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体是用糖链在Asn297糖基化的(IgG1或IgG3亚类，优选地IgG1亚类)，其中所述糖链中岩藻糖的量是65％或更低(根据Kabat编号)。在另一个实施方式中所述糖链中的岩藻糖量在5％至65％之间，优选地在20％至40％之间。根据本发明，“Asn297”指位于Fc区中约第297位的氨基酸天冬酰胺。基于抗体较小的序列变异，Asn297也可位于第297位的上游或下游若干氨基酸处(通常不多于±3个氨基酸)，即在第294位和第300位之间。此类糖改造的抗体在本文中也称为afocusylated抗体。

根据本发明的afocusylated双特异性抗体可在糖修饰的宿主细胞中表达，该宿主细胞被改造使得以足以部分地岩藻糖化Fc区中的寡糖的量表达至少一个编码具有GnTIII活性的多肽的核酸。在一个实施方式中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。备选地，可以根据US 6,946,292降低或消除宿主细胞的α1，6-岩藻糖基转移酶活性以生成糖修饰的宿主细胞。抗体岩藻糖化的量可以预先确定，例如通过发酵条件(例如发酵时间)或通过至少两个具有不同岩藻糖化量的抗体的组合。此类afocusylated抗体和相应的糖改造方法在WO 2005/044859、WO 2004/065540、WO2007/031875、Umana，P.等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180、WO 99/154342、WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 97/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739中说明。这些糖改造的抗体具有增加的ADCC。产生根据本发明的afocusylated抗体的其他糖改造方法在例如Niwa，R.等人，J.Immunol.Methods 306(2005)151-160；Shinkawa，T.等人，J Biol Chem，278(2003)3466-3473；WO03/055993或US 2005/0249722中说明。

一个实施方式是使用WO 2005/044859、WO 2004/065540、WO 2007/031875、Umana，P.等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180、WO 99/154342、WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 97/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835或WO 2000/061739中所述的方法制备IgG1或IgG3亚类的双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体在Asn297被糖链糖基化，从而所述糖链中岩藻糖的量是65％或更低。

一个实施方式是使用Niwa，R.等人，J.Immunol.Methods 306(2005)151-160；Shinkawa，T.等人，J Biol Chem，278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722所述的方法制备IgG1或IgG3亚类的双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体在Asn297被糖链糖基化，从而所述糖链中岩藻糖的量是65％或更低。

根据本发明的抗体是用重组方法生产的。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明的抗体的核酸，而另一个方面是包含编码根据本发明的抗体的所述核酸的细胞。现有技术熟知重组生产的方法，包括在原核和真核细胞中表达蛋白质，然后分离抗体并且通常纯化到可药用的纯度。为在宿主细胞中表达上述抗体，通过标准方法将编码各个经修饰的轻链和重链的核酸插入表达载体。在适当的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞(上清液或裂解后的细胞)回收抗体。现有技术熟知用于重组生产抗体的通用方法，并在例如综述文献Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880中描述。

通过常规免疫球蛋白纯化方法，如，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基适当地分离根据本发明的双特异性抗体。用常规方法，容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA和RNA。杂交瘤细胞可作为此类DNA和RNA的来源。一旦分离，就可以把DNA插入表达载体，然后将其转染到否则不生产免疫球蛋白的宿主细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞或杂交瘤细胞)中，以获得在宿主细胞中合成重组单克隆细胞。

通过向抗体DNA中引入适当的核苷酸改变，或通过核苷酸合成来制备双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)。然而，此类修饰只能在非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述抗体的特征，例如IgG同种型和抗原结合，但可改善重组生产的产量、蛋白质稳定性或便于纯化。

如本申请所用的术语“宿主细胞”指能被改造以生成根据本发明的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方式中HEK293细胞和CHO细胞被用作宿主细胞。

如本文所用，表达法“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”被可互换地使用，全部此类命名包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代目标细胞和源自其的培养物，无论转移次数。也应当理解，由于故意或偶然的突变，后代的DNA内容可能不全部地精确地相同。包括这样的变体后代，所述变体后代具有与在初始转化的细胞中所筛选的相同的功能或生物活性。当意指不同的命名时，可从上下文弄清楚。

在NS0细胞中的表达在例如Barnes，L.M.等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes，L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270中描述。瞬时表达由例如Durocher，Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289和Norderhaug，L.等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述了可变结构域的克隆。Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，Cytotechnology 30(1999)71-83和Schlaeger，E.-J.，J.Immunol.Methods 194(1996)191-199描述了优选的瞬时表达系统(HEK293)。

适于例如原核细胞的控制序列包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动予、增强子和聚腺苷酸化信号。

当以功能性关系地放置核酸与另一核酸序列时，核酸是“有效连接”的。例如，如果前序列或分泌性引导物的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白被表达，则它是与多肽的DNA有效连接的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它是与编码序列有效连接的；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则它是与编码序列有效连接的。通常，“有效连接”指被连接的DNA序列是邻近的，在分泌性引导物的情况下，邻近并在阅读框内。然而，增强子不必是邻近的。连接是通过在方便的限制性位点连接完成的。如果不存在此类位点，根据常规实践，使用合成的寡核苷酸接头或连接头。

实施抗体纯化以除去细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质，通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域熟知的技术。参见Ausubel，F.等人编著.CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。建立了不同的方法并普遍用于蛋白质纯化，如用微生物蛋白质进行亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析(例如用苯基-琼脂糖凝胶、aza-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(例如用Ni(II)和Cu(II)亲和材料)、大小排阻层析和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

如本文所用的术语“转化”指将载体/核酸转移到宿主细胞内的过程。如果使用没有坚硬的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞，用例如Graham，F.L.，和van der Eb，A.J.，Virology 52(1973)456ff所述的磷酸钙沉淀方法进行转染。然而，也可以使用将DNA引入细胞的其他方法，例如核注射或原生质体融合。如果使用原核细胞或含有实质的细胞壁结构的细胞，例如，一个转染方法是用氯化钙进行钙处理，如Cohen，F.N等人，PNAS.69(1972)7110ff所述。

如本文所用，“表达”指核酸被转录为mRNA的过程和/或转录的mRNA(也称为转录物)随后被翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽被共同地称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，真核细胞中的表达可包括mRNA的剪切。

“载体”是核酸分子，特别地是自我复制的核酸分子，它将插入的核酸分子转移到宿主细胞内和/或在宿主细胞之间转移。术语包括主要起到将DNA或RNA插入到细胞内(例如染色体整合)的功能的载体、主要起到复制DNA和RNA的功能的载体的复制，和起到转录和/或翻译DNA或RNA的功能的表达载体。也包括提供多于一种上述功能的载体。

“表达载体”是这样的多核苷酸，当它被引入适当的宿主细胞时，能被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指由能起到产生所需表达产品的功能的表达载体组成的适当的宿主细胞，。

现已发现根据本发明的双特异性抗体具有有价值的特征如在哺乳动物细胞中良好的表达产量、稳定性、生物或药理学活性、药物动力学性质或毒性。例如，它们可用于治疗如癌症的疾病。根据本发明的抗体，特别是双特异性<IGF-1R-EGFR>抗体表现出有高度价值的性质例如对表达IGF-1R和EGFR受体的癌细胞的生长抑制，以及抗肿瘤效力，为罹患癌症的患者带来益处。与其亲本单特异性<IGF-1R>和<EGFR>抗体相比，根据本发明的双特异性<IGF-1R-EGFR>抗体表现出降低的IGF-1R和EGFR受体的内在化。

本发明的一个方面是包含根据本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是根据本发明的抗体用于制造药物组合物的用途。本发明的其他方面是制造包含根据本发明的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，所述组合物含有根据本发明的抗体，与药用载体共同制剂。

本发明的一个实施方式是用于治疗癌症的根据本发明的双特异性抗体。

本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。

本发明的另一个方面是根据本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药物的用途。

本发明的另一个方面是通过对需要此类治疗的患者施用根据本发明的抗体，来治疗罹患癌症的患者的方法。

如本文所用，“药用载体”包括任何和全部生理学上相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸附延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施药(例如通过注射或灌注)。

本发明的组合物可以用多种本领域已知的方法给药。本领域技术人员将认识到，施药的途径和/或模式将根据所需的结果变化。为通过某些施药途径施用本发明的化合物，用防止其失活的材料涂覆化合物或与化合物共同施用可能是必需的。例如，化合物可以在适当的载体，例如脂质体或稀释剂中对受试者施药。可药用的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药用载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。本领域熟知此类介质和活性剂用于药用活性物质的用途。

如本文所用的用语“肠胃外施药”和“肠胃外地施药”指除了肠和局部施药外的施药模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮肤内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜上和胸骨内注射和灌注。

如本文所用的术语癌症指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴细胞白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈部癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊柱轴(spinal axis)肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括任何上述癌的难治性形式或一个或多个上述癌症的组合。

这些组合物也可含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过如上所述的灭菌程序和通过包括多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等确保防止微生物存在。组合物中也可以理想地包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可以通过包括延迟吸收的活性剂例如单硬脂酸铝和明胶，导致可注射的药用形式的延长的吸收。

无论选择何种施药途径，通过本领域技术人员所知的常规方法，将可以适当的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物制剂为可药用的剂型。

本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以获得能有效地实现特定患者、组合物和施药模式所需的治疗应答，而不对患者有毒性的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多个药物动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物的活性、施药途径、施药时间、使用的特定组合物的排泄速率、治疗的持续时间、与使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、受治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、总体健康状况和既往病史，以及医疗领域熟知的类似因素。

组合物必须是无菌的并且是流体，使得能够用注射器递送。除了水，载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。

例如通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散剂的情况下维持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂，能够维持适当的流动性。在许多情况下，优选地在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇以及氯化钠。

氨基酸序列描述

SEQ ID NO：1<IGF-1R>重链，OA-Ak18-scFab-GA201(+WT)

SEQ ID NO：2<IGF-1R>轻链，OA-Ak18-scFab-GA201(+WT)

SEQ ID NO：3OA-Ak18-scFab-GA201的<EGFR>肽连接的重链和轻链，二硫化物稳定VH 44/VL100

SEQ ID NO：4OA-Ak18-scFab-GA201_WT的<EGFR>肽连接的重链和轻链

SEQ ID NO：5<EGFR>重链，OA-GA201-scFab-Ak18(+WT)

SEQ ID NO：6<EGFR>轻链，OA-GA201-scFab-Ak18(+WT)

SEQ ID NO：7<IGF-1R>肽连接的重链和轻链，二硫化物稳定VH44/VL100-OA-GA201-scFab-Ak18

SEQ ID NO：8OA-GA201-scFab-Ak18_WT的<IGF-1R>肽连接的重链和轻链

SEQ ID NO：9<VEGF>重链，Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06(+SS)

SEQ ID NO：10<VEGF>轻链，Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06(+SS)

SEQ ID NO：11 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS的<ANG-2>肽连接的重链和轻链，二硫化物稳定VH 44/VL100

SEQ ID NO：12<ANG-2>Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06的<ANG-2>肽连接的重链和轻链

SEQ ID NO：13人EGFR

SEQ ID NO：14人IGF-1R

SEQ ID NO：15人VEGF

SEQ ID NO：16人ANG-2

提供以下实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，本发明的实际范围在权利要求书中说明。应当理解，可以在不离开本发明的精神的情况下对所述方法进行修改。

实验方法

实施例

材料和方法

重组DNA技术

用标准方法操作DNA，如Sambrook，J.等人，Molecular cloning：Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，1989所述。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。

DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIHPublication No 91-3242中给出。抗体链的氨基酸是根据EU编码(Edelman，G.M.等人，PNAS 63(1969)78-85；Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.，NIH Publication No 91-3242)来编码的。用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)的软件包版本10.2和Infomax的Vector NTI高级套装版本8.0进行序列产生、作图、分析、注释和图解。

DNA测序

DNA序列是通过在SequiServe(Vaterstetten，德国)和Geneart AG(Regensburg，德国)实施的双链测序测序确定的。

基因合成

所需的基因片段是由Geneart AG(Regensburg，德国)通过自动基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物制备的。编码携带S354C和T366W突变的“knobs-in-hole”抗体重链以及在CH3结构域与未修饰的VH结构域或scFab抗体片段的组合中携带Y349C、T366S、L368A和Y407V突变的“knobs-in-hole”抗体重链，以及抗体轻链的基因片段的侧翼有单数个限制性内切酶切割位点(BamHI-XbaI或BamHI-KpnI)并被克隆到pGA18(ampR)质粒中。从经转化的细菌纯化质粒DNA并用UV光谱学确定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。所有构建体都被设计为具有编码前导肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’端DNA序列，该前导肽在真核细胞中靶向分泌的蛋白质。

构建表达质粒

使用Roche表达载体用于构建全部编码“knobs-in-hole”重链和抗体轻链的表达质粒。载体由以下元件组成：

-潮霉素抗性基因，作为选择标志物，

-EB病毒(EBV)的复制起点oriP，

-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制

-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌氨苄霉素抗性，

-来自人巨细胞病毒(HCMV)的早早期增强子和启动子，

-人1-免疫球蛋白聚腺苷酸(“polyA”)信号序列，和

-独特的BamHI和XbaI限制性位点。

包含具有未修饰的VH结构域或scFab片段的“knobs-in-hole”重链，和未修饰的轻链的免疫球蛋白基因是用基因合成制备的，并按说明克隆进入pGA18(ampR)质粒中。用BamHI和XbaI或BamHI和KpnI限制性酶(Roche Molecular Biochemicals)消化携带合成的DNA片段的pG18(ampR)质粒和Roche表达载体，并进行琼脂糖凝胶电泳。然后将经纯化的、编码“knobs-into-hole”重链和未修饰的轻链的DNA片段与分离的Roche表达载体BamHI/XbaI或BamHI/KpnI片段连接，得到最终表达载体。将最终表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离表达质粒DNA(Miniprep)并对其进行限制性酶分析和DNA测序。在150ml LB-Amp培养基中培养正确的克隆，然后再次分离质粒DNA(Maxiprep)并通过DNA测序确定序列完整性。

在HEK293细胞中瞬时表达双特异性抗体

重组双特异性抗体是通过根据制造商的说明用FreeStyle^TM 293表达系统(Invitrogen，美国)瞬时转染人胚胎肾293-F细胞表达的。简而言之，在FreeStyle^TM 293表达培养基中，37℃/8％CO₂下培养FreeStyle^TM 293-F细胞的悬液，并且在转染当天将细胞以1-2x10⁶活细胞/ml的密度接种到新鲜培养基中。在Opti-I培养基(Invitrogen，美国)中，用325μl的293fectin^TM(Invitrogen，德国)和250μg的‘Knobs-into-hole”重链1和2和轻链质粒DNA以1∶1∶1或1∶2∶1的摩尔比制备‘Knobs-into-hole”DNA-293fectin复合物，终转染体积为250ml。在转染7天后通过在14000g离心30分钟收集合有抗体的细胞培养物上清液，并通过无菌过滤器(0.22μm)过滤。将上清液储存在-20℃直到纯化。

纯化双特异性抗体

通过用蛋白A-琼脂糖凝胶^TM(GE Healthcare，瑞典)亲和层析和Superdex200大小排阻层析从细胞培养物上清液纯化双特异性抗体。简而言之，将无菌过滤的细胞培养物上清施用到用PBS缓冲液(10mMNa₂HPO₄、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的HiTrap ProteinA HP(5ml)柱上。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋白质。用0.1M pH2.8的柠檬酸缓冲液洗脱抗体和抗体变体，并用0.1ml 1M TrispH8.5中和含有蛋白质的部分。然后混合洗脱的蛋白质部分，用AmiconUltra离心过滤装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩到体积为3ml并上样到用20mM组氨酸、140mM NaCl，pH6.0平衡的Superdex200 HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，瑞典)。混合含有具有少于5％高分子量聚集物的纯化的双特异性抗体的部分并作为1.0mg/ml的等分试样储存在-80℃。

分析纯化的蛋白质

使用基于氨基酸序列计算出的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来测定纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。双特异性和对照抗体的纯度和分子量是通过在存在或不存在还原剂(5mM 1，4-二硫苏糖醇)的条件下的SDS-PAGE和用考马斯亮蓝染色分析的。根据制造商的说明使用预制凝胶系统(Invitrogen，USA)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。用Superdex 200分析性大小排阻柱(GE Healthcare，瑞典)，通过高效SEC，在25℃的200mM KH₂PO₄、250mM KCl，pH 7.0的运行缓冲液中分析双特异性和对照抗体样品的聚集物成分。以0.5ml/min的流速将25μg蛋白质注入柱中并等度洗脱50分钟。为进行稳定性分析，在4℃和40℃孵育1mg/ml浓度的纯化的蛋白质7天，然后用高效SEC评估。在通过用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶促处理来移除N-多糖后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱仪验证还原的双特异性抗体轻链和重链的氨基酸骨架的完整性。

表面等离子体共振

结合亲和性是用标准结合测定(例如表面等离子体共振技术(GE-Healthcare Uppsala，瑞典))在25℃确定的。为进行亲和性测量，用标准胺偶联和封闭化学作用在SPR设备(Biacore T100)上将30μg/ml的抗Fcγ抗体(来自山羊，Jackson Immuno Research)偶联到CM-5传感器芯片的表面。缀合后，在25℃以5μL/min的流速注射单或双特异性Her3/cMet抗体，然后以30μL/min进行人HER3或c-Met ECD的系列稀释(0nM至1000nM)。用PBS/0.1％BSA作为结合实验的运行缓冲液。然后用10mM甘氨酸-HCl，pH 2.0溶液的60s脉冲再生芯片。

EGFR/IGF-1R表面等离子体共振

使用Biacore T100装置(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala，瑞典)进行SPR实验。使用标准胺的偶联化学，将IGF-1R或EGFR固定在CM5生物传感器芯片比表面。用固定化引导程序将IGF-1R或EGFR以1μg/ml注射到醋酸钠，pH5.0中，目标是200RU(IGF-1R)或100RU(EGFR)。以相同方法处理参考对照流动池，但只使用载体缓冲液。在1xPBS pH7.4，0.05％Tween20(Roche Diagnostics GmbH)中稀释抗体并以30μl/min的流速，在3.125和50nM之间增加的浓度注射抗体。接触时间(缔合阶段)是3min(EGFR结合)和5min(IGF-1R结合)，解离时间是10min(EGFR)和3min(IGF-1R)。用以5μl/min的流速注射0.85％的磷酸达30s来再生EGFR结合。用以5μl/min的流速注射氯化镁1min再生IGF-1R结合。通过使用Biaevaluation软件中的1∶1Langmuir结合模型来计算动力学速率常数和平衡解离常数。

为证明同时结合，将双特异性抗体以25nM，5μl/min流速注射到EGFR表面达1min。在将抗体捕获到EGFR表面后，以30μl/min的流速，在2.5和80nM之间增加的浓度注射IGF-1R。用以5μl/min的流速注射0.85％的磷酸达30s来再生表面。通过使用Biaevaluation软件中的1∶1Langmuir结合模型来计算动力学速率常数和平衡解离常数。

ANG-2结合表面等离子体共振(Biacore)

使用BIACORE T100装置(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala，瑞典)，通过表面等离子体共振研究抗体与抗原(例如人ANG-2)的结合。简而言之，为进行亲和性测量，将山羊<hIgG-Fcγ>多克隆抗体通过胺偶联固定在CM5芯片上，用于呈递针对人ANG-2的抗体(图6B)。在HBS缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％Tween 20，ph 7.4)，25℃下测量结合。将纯化的ANG-2-His(或内部纯化的)以6.25nM和200nM之间的多种浓度加入溶液中。通过注射ANG-2达3分钟测量缔合；通过用HBS缓冲液洗涤芯片表明达3分钟进行测量解离，并用1∶1 Langmuir结合模型估计KD值。由于ANG-2制剂的异质性，不能观察到1∶1结合；因此KD值只是相对估计值。从样品曲线减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，用于修正系统内在基线位移和降低噪音信号。使用Biacore T100评估软件版本1.1.1进行传感图分析和用于亲和性数据计算。备选地，经由五组氨酸抗体，以2000-1700RU的捕获水平捕获Ang-2，所述五组氨酸抗体是经由胺偶联(无BSA)固定在CM5芯片上的(PentaHis-Ab无BSA，Qiagen No.34660)(见下文)。

VEGF结合表面等离子体共振(Biacore)

在Biacore T100仪器上根据以下方法用表面等离子体共振技术分析双特异性<VEGF-Ang-2>抗体的VEGF结合并使用T100软件包分析：简而言之，经由与山羊抗人IgG(JIR 109-005-098)，在CM5芯片上捕获<VEGF>抗体。使用如下的标准氨基偶联通过氨基偶联固定捕获抗体：HBS-N缓冲液作为运行缓冲液，活化是EDC/NHS的混合物完成的，其目标是700RU的配体浓度。在偶联缓冲液NaAc，pH 5.0，c＝2μg/mL中稀释捕获抗体，最后通过注射1M乙醇胺封闭仍然活化的羧基。Mabs<VEGF>抗体的捕获是在5μL/min的流动和c(Mabs<VEGF>)＝10nM，用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释的条件下完成的；应当达到约30RU的捕获水平。使用rhVEGF((rhVEGF，R&D-Systems货号293-VE)作为分析物。VEGF结合<VEGF>抗体的动力学表征是在37℃下，在作为运行缓冲液的PBS+0.005％(v/v)Tween20中完成的。以50L/min的流动和80sec的缔合时间以及1200sec的解离时间，和从300-0.29nM的rhVEGF的浓度系列注射样品。在每个分析物循环后，用10mM甘氨酸pH 1.5，以及60秒的接触时间，进行自由捕获抗体表面的再生。用通常的双参考方法(对照参考：rhVEGF结合以捕获山羊抗人IgG分子，测量流动池空白，rhVEGF浓度“0”，模型1：Langmui结合1∶1)(由于捕获分子结合，Rmax被设定为局部)来计算动力学常数。

生成HEK293-Tie2细胞系

为确定血管生成素-2抗体与ANG2刺激的Tie2磷酸化和ANG2与Tie2结合对细胞的干扰，生成了重组HEK293-Tie细胞系。简而言之，使用Fugene(Roche Applied Science)作为转染剂，将编码在CMV启动子控制下的全长人Tie2(SEQ ID 108)和新霉素抗性标志物的、基于pcDNA3的质粒(RB22-pcDNA3 Topo hTie2)转染到HEK293细胞(ATCC)中并在DMEM 10％FCS，500μg/ml G418中选择抗性细胞。通过克隆柱分离单个克隆，然后通过FACS分析Tie2表达。鉴定出克隆22具有高和稳定的Tie2表达，即使缺少G418(HEK293-Tie2克隆22)。然后用HEK293-Tie2克隆22进行细胞测定：ANG2诱导的Tie2磷酸化和ANG2细胞配体结合测定。

VEGF诱导的HUVEC增殖测定

选择VEGF诱导的HUVEC(人脐静脉内皮细胞，Promocell#C-12200)增殖以测量VEGF抗体的细胞功能。简而言之，在用胶原蛋白I涂覆的BDBiocoat Collagen I微量滴定板(BD#354407/35640)中的100μl饥饿培养基(EBM-2内皮基本培养基2，Promocell#C-22211，0.5％FCS，青霉素/链霉素)中孵育每96孔5000个HUVEC细胞(低传代数值，≤5次传代)过夜。将不同浓度的抗体与rhVEGF混合(30ng1/ml终浓度，BD#354107)并在室温预孵育15分钟。然后将混合物添加到HUVEC细胞，并且在37℃，5％CO₂孵育它们72h。在分析当天将板平衡至室温达30min，然后根据手册用CellTiter-GloTM发光细胞活力测定试剂盒(Promega，#G7571/2/3)确定细胞活力/增殖。在分光光度计中测定发光。

ANG2诱导的Tie2磷酸化测定

根据以下测定原理测量双特异性<ANG2-VEGF>抗体对ANG2诱导的Tie2磷酸化的抑制。在不存在或存在<ANG2-VEGF>抗体的情况下，用ANG2刺激HEK293-Tie2克隆22达5分钟并用夹心ELISA对P-Tie2进行定量。简而言之，在聚D-赖氨酸涂覆的96孔微量滴定板上，在100μlDMEM，10％FCS，500μg/ml Geneticin中培养每孔2x105个HEK293-Tie2克隆22细胞过夜。第二天在微量滴定板中制备<ANG2-VEGF>抗体的滴定行(4倍浓缩，75μl终体积/孔，两份)并与75μl的ANGPT2(R&D systems#623-AN)稀释液(3.2μg/ml作为4倍浓缩溶液)混合。将抗体和ANG2在室温预孵育15min。将100μl混合物添加至HEK293-Tie2克隆22细胞(用1mM NaV₃O₄，Sigma#S6508预孵育5min)并在37℃孵育5min。然后，每孔用200μl的冰冷的PBS+1mM NaV₃O₄洗涤细胞并通过每孔添加120μl的裂解缓冲液(20mM Tris，pH 8.0、137mMNaCl、1％NP-40、10％甘油、2mM EDTA、1mM NaV3O4、1mM PMSF和10μg/ml抑酶肽)在冰上裂解细胞。在4℃在微量滴定板摇床上裂解细胞30min，然后将100μl裂解液直接转移到p-Tie2 ELISA微量滴定板(R&DSystems，R&D#DY990)而不用预先离心，也不用进行测定总蛋白质。根据制造商的说明定量P-Tie2并使用Excel的XLfit4分析插件测定抑制的IC50值(剂量应答单址(one site)，模型205)。

细胞滴度发光测定

用细胞滴度发光测定(Promega)定量细胞活力和增殖。根据制造商的说明进行测定。简而言之，将细胞以100μL的总体积在96孔板内培养所需的时间。为进行增殖测定，将细胞从培养箱中移出并在室温放置30min。加入100μL细胞滴度发光试剂并将多孔板放在定轨摇床上达2min。15min后在微板阅读仪(Tecan)上对发光定量。

实施例1a

表达&纯化双特异性二价<VEGF-ANG-2>抗体分子

根据上文材料和方法所述的过程，表达和纯化双特异性二价<VEGF-ANG-2>抗体分子Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS和Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06。<VEGF>部分的VH和VL基于贝伐珠单抗。<ANG2>部分的VH和VL基于ANG2i-LC06的VH和VL(在PCT申请号PCT/EP2009/007182中说明，是通过噬菌体展示获得的)。这些双特异性二价抗体的相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS)，和SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12(Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06)中给出。通过蛋白质印迹确认Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SS和Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06的表达。Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS和Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06的纯化导致以下产量。

＊质谱：没有检测到同数重链二聚体。

按描述测定结合和其他性质。

实施例1b

表达&纯化双特异性二价<IGF-1R-EGFR>抗体分子

表：双特异性二价<IGF-1R-EGFR>抗体分子概览

根据上文材料和方法所述的过程，以1∶1∶1的质粒比例表达并纯化了双特异性二价<IGF-1R-EGFR>抗体分子OA-Ak18-scFab-GA201和OA-GA201-scFab-Ak18。双特异性抗体基于<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587；WO 2005/005635，简称为<IGF-1R>克隆18或<IGF-1R>AK18)和人源化的<EGFR>ICR62(WO 2006/082515，简称为<EGFR>ICR62)的抗原结合位点。这些双特异性二价抗体的相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3(OA-Ak18-scFab-GA201)，和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7(OA-GA201-scFab-Ak18)中给出。用蛋白质印迹确认了OA-Ak18-scFab-GA201和OA-GA201-scFab-Ak18的表达。在用蛋白A纯化细胞培养物上清液后，两个构建体都表现出50和58％之间的、具有如分析性SEC检测的预期的约148kDa的分子量的双特异性抗体和分子量为100kDa的大量的半抗体。在SEC纯化后，两个构建体都表现出86和90％之间的分子量为148kDa的同质单体和100kDa的残留副产品。也以1∶2∶1的质粒比例表达了OA-GA201-scFab-Ak18并进行Prot A和SEC纯化。如Bioanalyzer(Caliper analysis)所检测的，与1∶1∶1的表达比例相比，在蛋白A后，1∶2∶1表达水平的半抗体的量从30％减少至6％。SEC纯化的蛋白质的质谱分析确认了通过改变转染时的质粒比例有效地移除了半重链1人源化的<EGFR>ICR62抗体。在HEK293细胞中表达时，1∶2∶1质粒比例的OA-GA201-scFab-Ak18纯化产量增加了40％。

以1∶1∶1和1∶2∶1的质粒比例表达并类似地纯化双特异性二价<IGF-1R-EGFR>抗体分子OA-GA201-scFab-Ak18_WT(相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8中给出)。

1∶2∶1质粒比例的结果：

只有3个质粒的OA-scFab构建体与使用knobs-into-hole技术生成具有4个表达载体的双特异性分子异二聚体(参见例如WO 2009/080253)的方法相比，具有有价值的副产品谱的优势。根据本发明的抗体表现出完全没有错误配对的轻链或者缺少轻链的抗体(数据未给出)。

所述1∶2∶1方法表现出产生具有高纯度的双特异性分子和清楚减少的半抗体以及完全没有错误配对的轻链或者缺少轻链的抗体(数据未给出)。

按说明测定结合和其他性质。

可以类似地表达和纯化双特异性二价<IGF-1R-EGFR>抗体分子OA-Ak18-scFab-GA201_WT(相关轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4(OA-Ak18-scFab-GA201_WT)中给出)。

实施例2

双特异性抗体与两个抗原(同时)的结合

对比了不同的双特异性抗体形式的结合和从其中衍生出结合模块和双特异性抗体的“野生型”IgG的结合。这些分析是通过应用如上所述的表面等离子体共振(Biacore)完成的。可以检测到双特异性抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT与IGF-1R和EGFR的同时结合。

仪器：Biacore T100(GE Healthcare)，T200灵敏度增强

软件：T200 Control，版本1.0

软件：T200 Evaluation，版本1.0

芯片：CM5芯片

测定

根据制造商的说明在流动池1至4上进行标准胺偶联：运行缓冲液：HBS-N缓冲液，由EDC/NHS混合物活化，针对配体密度。在偶联缓冲液NaAc，pH 4.5中稀释EGFR，c＝15μg/mL；最后通过注射1M乙醇胺封闭剩余的活化的羧基。

流动池1上胺偶联的EGFR被用作参考对照表面，用于修正可能的缓冲液效应或非特异性结合。

以30μL/min的流速在25℃测量同时结合。以c＝10nM的浓度注射双特异性抗体2分钟，然后立即连续注射人或犬IGF1R(缔合时间：2分钟，解离时间：3分钟，c＝150nM)。

所有样品都用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释。

在每个循环后用15mM NaOH进行再生，接触时间1分钟，流速30μL/min。阴性对照：注射稀释缓冲液而非IGF1R作为阴性对照。

结果

双特异性抗体：OA-GA201-scFab-Ak18_WT表现出对胺偶联的人EGFR和人IGF1R的同时结合(见传感图图9)。

实施例3a

ANG2-VEGF-Mab Tie2磷酸化抑制

根据如上所述的测定原理测量双特异性<ANG2-VEGF>抗体对VEGF诱导的HUVEC增殖的抑制，结果在图5中显示。

实施例3b

ANG2-VEGF-Mab Tie2磷酸化抑制

根据如上所述的测定原理测量双特异性<ANG2-VEGF>抗体对ANG2诱导的Tie2磷酸化的抑制。结果在图6中显示。

实施例4

双特异性<EGFR-IGF1R>对IGF-1R的内在化/下调

人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)抑制IGF-1R信号传递并诱导IGF-1R的内在化和随后的下调。为评估双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的潜在抑制活性，分析了IGF-1R的下调程度。

为检测本发明的抗体对肿瘤细胞中IGF-1受体(IGF-1R)的量的作用，用IGF-1R和EGFR特异性抗体进行了时程实验和随后的ELISA分析。

在96孔板中在37℃和5％CO₂下，在用10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％PenStrep补充的RPMI培养基中过夜培养人H322M肿瘤细胞(从NCI获得)(1x10⁴细胞/孔)。

小心地移除培养基并用在RPMI培养基中稀释的总体积为100μl的双特异性<EGFR-IGF1R>抗体溶液代替培养基。将细胞在37℃和5％CO₂下培养至少3小时，但不超过24小时。

通过吸气小心地移除培养基并用120μl/孔的冷MES裂解缓冲液(25mM MES pH 6.5、2％Triton X-100、60nM辛基葡糖苷、150mMNaCl、10mM Na₃VO₄和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。将平板储存在-20℃直到进一步分析。

IGF-1R检测

将在PBS、3％BSA和0.2％20中以1∶200稀释的、终浓度为2.4μg/ml的生物素化的抗体AK1a(<IGF-1R>HUMAB克隆1a(DSMACC 2586)在WO2004/087756中说明，Roche，德国)添加到链霉亲和素涂覆的MTP(Roche ID号：11965891001)的每个孔中。将链霉亲和素-MTP在室温搅拌1小时，然后每孔用200μl含有0.1％20的PBS洗涤3次。

在移除PBS/Tween溶液后，向抗体涂覆的链霉亲和素-MTP的每个孔添加100μl细胞裂解液。

然后将MTP在室温下再搅拌孵育1小时并随后用含有0.1％20的PBS洗涤3次。

在PBS、3％BSA和0.2％20中1∶750稀释的IGF-1Rβ兔抗体(200μg/ml，Santa Cruz Biotechnology，货号sc-713)被用于检测由捕获抗体AK1a结合的IGF-1R。每孔加入100μl，并在恒定搅拌下在室温下孵育1小时。然后移除溶液，并用200μl含有0.1％20的PBS洗涤孔3次。在PBS、3％BSA和0.2％20中1∶4000稀释的过氧化物酶标记的抗兔IgG-HRP(Cell signaling货号7074)被用作第二检测抗体。每孔加入100μl，并在室温下搅拌孵育1小时。然后用含0.1％20溶液的PBS洗板6次。每孔加入100μl的过氧化物酶底物3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(Roche，BM-Blue ID号11484581)并在室温下搅拌孵育20分钟。通过每孔加入25μl的1M H₂SO₄终止生色反应并在室温下再孵育5分钟。在450nm处测量吸光度。

较之人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18，双特异性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT诱导较少的下调。与<IGF-1R>HUMAB克隆18相比，由OA-GA201-scFab-Ak18_WT的下调减少了＞50％。

实施例5

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体对EGFR和IGF-1R信号传递路径的抑制

人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)抑制IGF-1R信号传递，并且人源化的大鼠抗EGFR抗体ICR62抑制EGFR的信号传递。为评估双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的潜在抑制性活性，分析了对两条途径的信号传递的抑制程度。

将在用10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％PenStrep补充的RPMI培养基中的人肿瘤细胞(H322M，1x10⁴细胞/孔)接种到96孔微量滴定板中并在37℃和5％CO₂下培养过夜。

小心移除培养基并用100μl无血清DMEM培养基(用1mg/ml RSA、10mM Hepes、1％PenStrep补充)代替并在37℃和5％CO₂下孵育至少2.5小时。

再次小心移除培养基并用总体积为50μl的在无血清DMEM培养基中的双特异性和对照抗体(<IGF-1R>HUMAB克隆18和<EGFR>ICR62，终浓度0.01mg/ml)的稀释液代替，然后在37℃和5％CO₂下孵育30min。通过添加50μl IGF-1(10nM)或EGF(20ng/ml)(在无血清DMEM培养基中稀释)刺激细胞，并在37℃和5％CO₂下孵育10min。

小心移除培养基并用100μl/孔的冰冷PBS洗涤细胞1次。通过添加100μl/孔的BioRad细胞裂解缓冲液(BioRad细胞裂解试剂盒(BioRad Cat#171-304012)裂解细胞。将平板储存在-20℃直到进一步分析。

通过在500g离心5min，经过MultiScreen HTS过滤板过滤细胞裂解液来移除细胞碎片。使用P-EGFR(Tyr)珠试剂盒(Millipore Cat.#46-603)分析EGFR磷酸化，并且使用P-IGF-1R(Tyr1131)珠试剂盒(BioRad Cat.#171V27343)分析IGF-1R磷酸化，用Luminex系统分析过滤的细胞裂解液中EGFR和IGF-1R磷酸化。使用磷蛋白检测试剂试剂盒(BioRad Cat.#171-304004)，如BioPlex磷蛋白检测手册(BioRad Bulletin#2903)中所述进行Luminex测定。

在H322M肿瘤细胞上，双特异性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT有效地抑制IGF-1R的磷酸化(IC50：1nM，最大抑制：＞70％)和EGFR的磷酸化(IC50：1nM，最大抑制：＞70％)。

实施例6

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体对在3D培养物中的NCI-H322M肿瘤细胞的生长抑制

人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)抑制表达IGF-1R的肿瘤细胞系的生长(WO 2005/005635)。以类似的方式，人源化的大鼠抗EGFR抗体<EGFR>ICR62表现出对表达EGFR的肿瘤细胞系生长的抑制(WO 2006/082515)。为评估双特异性<EGFR-IGF1R>抗体在肿瘤细胞系生长测定中的潜在抑制性活性，分析了表达EGFR和IGF-1R的H322M中的抑制程度。

在用10％FBS(PAA)、1mM丙酮酸钠(Gibco，Darmstadt，德国)、非必需氨基酸(Gibco)和2mM L-谷氨酰胺(Sigma，Steinheim，德国)补充的RPMI 1640培养基(PAA，Pasching，奥地利)中培养H322M肺癌细胞。将25000细胞/孔接种到含有培养基的聚HEMA(聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)(Polysciences，Warrington，PA，美国)涂覆的96孔板中。同时加入不同浓度的双特异性抗体并孵育7天。使用(Promega，Madison，WI，美国)测定，根据制造商的说明通过测量细胞的ATP含量检测细胞活力。

在图8中显示了结果。双特异性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT以剂量依赖性的方式抑制H322M细胞的增殖。当与亲本单特异性抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18或<EGFR>ICR62相比较时，1000nM剂量的双特异性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT表现出改善的增殖抑制。

实施例7

在具有EGFR和IGF-1R表达的皮下异种移植物模型中双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的体内效力

人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)抑制表达IGF-1R的肿瘤细胞系的生长(WO 2005/005635)。以类似的方式，人源化的大鼠抗EGFR抗体<EGFR>ICR62表现出对表达EGFR的肿瘤细胞系生长的抑制(WO 2006/082515)。为评估双特异性<EGFR-IGF1R>抗体对体内肿瘤生长的潜在的抑制性活性，使用特征为表达EGFR和IGF-1R的皮下异种移植物模型BxPC-3。

在用10％胎牛血清(Sera Plus；PAN^TM Biotech GmbH)和2mM L-谷氨酰胺(PAN^TM Biotech GmbH)补充的RPMI 1640培养基((PAN^TMBiotech GmbH)中，在37℃，水饱和的空气，5％CO₂下培养人胰腺癌细胞系BxPC-3的细胞(从ATCC获得)。在接种当天，从培养瓶收获BxPC-3肿瘤细胞(1x胰蛋白酶-EDTA，Roche Diagnostics)并转移到培养基，离心，洗涤1次并在PBS中重悬。为进行细胞注射，将最终滴度调整到1x10⁸细胞/ml。然后将100μl该悬液(对应于1x10⁷个细胞)皮下注射到雌性SCID浅褐色小鼠的右胁腹。用载体、<EGFR-IGF1R>抗体和对照抗体(<IGF-1R>HUMAB Clone 18和<EGFR>ICR62))的治疗开始于肿瘤建立并达到150-250mm³的平均大小后。每周测量2次肿瘤体积，并且平行监测动物重量。比较单种治疗和单个抗体的组合和用双特异性抗体的疗法。

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT(20mg/kg；腹膜内，每周1次(q7d))在皮下BxPC3异种移植物模型中表现出强抗肿瘤效力(见图10和下表)，并且比单特异性抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(10mg/kg；腹膜内，每周一次(q7d))和<EGFR>ICR62(10mg/kg；腹膜内，每周1次(q7d))的组合稍微更好地抑制肿瘤生长。

实施例8

制备双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的糖改造的(glycoengineered)衍生物

通过使用磷酸钙转染方法用哺乳动物抗体重链和轻链表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，来生产双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的糖改造的衍生物。通过磷酸钙方法转染对数生长的HEK293-EBNA细胞。为生产未修饰的抗体，只用1∶1比例的抗体重链和轻链表达载体转染细胞。为生产糖改造的抗体，用4个质粒共转染细胞，2个用于抗体表达，1个用于融合GntIII多肽表达，1个用于甘露糖苷酶II表达，比例分别为4∶4∶1∶1。使用以10％FCS补充的DMEM培养基，在T-瓶中以贴壁单层培养物的形式培养细胞，并且当它们在50和80％铺满之间时进行转染。为在T75瓶中进行转染，将750万(至8百万)个细胞在转染前24小时接种到用FCS补充(最终达到10％V/V)的约14ml DMEM培养基中，(最后250μg/ml新霉素)，并将细胞置于37℃，5％CO₂空气的培养箱中过夜。对与每个待转染的T75瓶，通过混合在轻链和重链表达载体之间平均分配的47μg总质粒载体DNA、235μl 1M CaCl₂溶液，并加水到终体积为469μL，制备DNA、CaCl₂和水的溶液。向该溶液中添加469μl 50mM HEPES、280mMNaCl、1.5mM pH 7.05的Na₂HPO₄溶液，立即混合10秒并在室温下静置20秒。用以2％FCS补充的约12ml DMEM稀释悬液并添加到T75中代替现存的培养基。在37℃，5％CO₂培养细胞约17至20小时，然后用约12mlDMEM，10％FCS替换培养基。在转染后5-7天收获条件培养基，在210-300＊g离心5min，通过0.22μm过滤器无菌过滤(或备选地在1200rpm离心5min，然后在4000rpm第二次离心10min)并保存在4℃。

通过蛋白A亲和层析纯化分泌的抗体，最后在Superdex 200柱(Amersham Pharmacia)上进行大小排阻层析，将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液盐水并收集纯的单体IgG1抗体。用分光光度计从280nm处的吸光度估计抗体浓度。将抗体在pH6.7的25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸溶液中制剂。

双特异性抗体的糖改造的变体是通过共转染抗体表达载体和GnT-III糖基转移酶表达载体，或和GnT-III表达载体以及高尔基体甘露糖苷酶II表达载体生产的。按如上所述的用于纯化和制剂非糖改造抗体的方法来纯化和制剂糖改造的抗体。通过如下所述的MALDI/TOF-MS分析联结到抗体Fc区的寡糖，以测定岩藻糖的量。

通过PNGaseF消化将寡糖从抗体上酶促释放，抗体固定在PVDF膜上或在溶液中。

获得的含有释放的寡糖的消化溶液直接准备用于MALDI/TOF-MS分析，或在MALDI/TOF-MS分析的样品准备前用EndoH糖苷酶进一步消化获得的消化液。对所有根据本发明的双特异性抗体，GE指糖改造的。

实施例9

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体结合FcgIIIa和ADCC的能力

给定的抗体介导的ADCC的程度不仅取决于结合的抗原，也取决于恒定区与FcgRIIIa的亲和性，已知所述FcgRIIIa是引发ADCC反应的Fc受体。为分析双特异性<EGFR-IGF1R>抗体与FcgRIIIa的结合，应用了Biacore技术。通过此技术评价双特异性<EGFR-IGF1R>抗体与重组生产的FcgRIIIa结构域的结合。

所有表面等离子体共振测量是在BIAcore 3000仪器(GE HealthcareBiosciences AB，瑞典)上在25℃进行的。运行和稀释缓冲液是PBS(1mMKH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄、137mM NaCl、2.7mM KCl)，pH6.0、0.005％(v/v)Tween20。将可溶性人FcgRIIIa在pH5.0的10mM醋酸钠中稀释并使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare Biosciences AB，瑞典)将其固定在CM5生物传感器芯片上，以获得约1000RU的FcgRIIIa表面密度。在固定化过程中使用HBS-P(10mM HEPES，pH 7.4、150mM NaCl、0.005％表面活性剂P20；GE Healthcare Biosciences AB，瑞典)作为运行缓冲液。用PBS、0.005％(v/v)Tween20，pH6.0将XGFR双特异性抗体稀释到450nM的浓度并以30l/分钟的流速在3分钟期间注射。然后用PBS，pH8.0，0.005％(v/v)Tween20将传感器芯片再生1分钟。用BIAevaluation软件(BIAcore，瑞典)进行数据分析。

为分析双特异性<EGFR-IGF1R>抗体与FcgRIIIa的结合能力在何种程度上也转变为对肿瘤细胞的体外ADCC活性，在细胞测定中确定了ADCC能力。对于这些测定，制备了糖修饰的衍生物双特异性<EGFR-IGF1R>抗体(见上文)并在BiAcore ADCC能力测定形式和如上所述的体外ADCC测定中对其加以测试。

使用人外周血单核细胞(PBMC)作为效应子细胞，并且基本根据制造商的说明用Histopaque-1077(Greiner Leucosep#227288)制备所述人外周血单核细胞。简而言之，用肝素化的注射器从健康志愿者取静脉血。用PBS(不含有Ca⁺⁺或Mg⁺⁺)1∶0.75-1.3稀释血并铺在Histopaque-1077上。将梯度在800xg在室温下(RT)不间断离心30min。收集含有PBMC的界面并用PBS洗涤(每来自两个梯度的细胞50ml)并通过在400xg室温离心10分钟收获。在用PBS重悬沉淀后，对PBMC计数并通过在400xg室温下离心10min第二次洗涤。然后将细胞在适当的培养基中重悬，用于随后的步骤。

对于PBMC，用于ADCC测定的效应子对靶比例是25∶1。效应子细胞是在AIM-V培养基中以适当浓度制备的，为了在圆底96孔板中每孔加入50μl。靶细胞是在含有10％FCS的DMEM中培养的表达人EGFR/IGFR的细胞(例如H322M、A549或MCF-7)。

在PBS中洗涤靶细胞，计数并调整到1x10E6细胞/ml。用Calcein AM(10μM)在37℃/5％CO₂标记细胞30min。标记后，在PBS中洗涤细胞2次并以5000细胞/孔，将在50μl(AIM-V培养基)中的细胞接种到96孔圆底板中。在AIM-V中稀释抗体，对预铺的靶细胞添加50μl。然后加入效应子细胞并将板在37℃，含有5％CO₂的潮湿化的空气中孵育4小时。在孵育时间后将板在200g离心10min并将80μl上清液转移到黑色荧光板/透明底中，并用Tecan Infinite阅读仪测量荧光(Ex 485nm/Em 535nm)。

在测定中包括以下对照：

-背景：标记细胞后的50μl上清液等分试样+100μl培养基

-自发裂解：50μl靶细胞悬液+100μl培养基

-最大裂解：50μl靶细胞悬液+100μl培养基/1，5％Triton X-100

-没有抗体的裂解对照：50μl靶细胞悬液+50μl培养基+50μl PBL′s

抗体依赖性细胞毒性百分比是如下计算的：

％ADCC＝x-自发释放/最大裂解-自发裂解x100

实施例10

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的糖结构分析

为确定含有岩藻糖和不含有岩藻糖(a-fucose)的寡糖结构的相对比例，通过MALDI-Tof质谱分析法分析了纯化的抗体材料释放的聚糖。为此，将抗体样品(约50μg)与5mU N-糖苷酶F(Prozyme#GKE-5010B)在0.1MpH6.0的磷酸钠缓冲液中在37℃孵育过夜，以从蛋白质骨架释放寡糖。然后，分离释放的多肽结构并用NuTip-Carbon移液头(从Glygen获得：NuTip1-10μl，货号#NT1CAR)脱盐。第一步，通过用3μL 1M NaOH、20μL纯水(例如来自Baker的HPLC梯度级，#4218)、3μL 30％v/v醋酸、和再用20μL纯水洗涤，制备NuTip-Carbon移液头，用于结合寡糖。为此，将各溶液上样到NuTip-Carbon移液头中的色谱材料顶部并挤压通过。然后，通过将如上所述的N-糖苷酶F消化物吹吸约4至5次，将对应于10μg抗体的聚糖结构结合到NuTip-Carbon移液头中的材料上。用如上所述的方法用20μL纯水洗涤结合到NuTip-Carbon移液头中的材料上的聚糖，然后分别用0.5μL 10％和2.0μL 20％的乙腈分步洗脱。为此步骤，将洗脱溶液装入0.5mL反应管中并各吹吸4至5次。为用MALDI-Tof质谱分析法，组合两次的洗脱液。为进行此测量，将0.4μL组合的洗脱液在MALDI靶上与1.6μL SDHB基质溶液(2.5-二羟基苯甲酸/2-羟基-5-甲氧基苯甲酸[Bruker Daltonics#209813]以5mg/ml溶解于20％乙醇/5mM NaCl中)混合并用适当调谐的Bruker Ultraflex TOF/TOF仪器分析。通常，记录50-300个结果并概括成单次实验。用flex分析软件(Bruker Daltonics)评估获得的光谱，并确定每个检测到的峰的质量。然后，通过比较计算的质量和各自的结构(例如分别有或没有岩藻糖的复合、杂合和寡或高甘露糖)的理论预期的质量，将峰排布为含有或不含有岩藻糖的甘醇结构。

为确定杂合结构的比例，用N-糖苷酶F和内切糖苷酶H共同消化抗体样品。N-糖苷酶F从蛋白质骨架释放所有N连接的聚糖结构(复合、杂合以及寡和高甘露糖结构)，而内切糖苷酶H额外地在位于聚糖的还原性末端的两个GlcNAc残基之间切割所有杂合型聚糖。然后处理此消化物并以如上所述的用于N-糖苷酶F消化的样品的相同方法通过MALDI-Tof质谱分析法来分析消化物。通过比较来自N-糖苷酶F消化物和组合的N-糖苷酶F/内切H消化物的图式，使用特定的糖结构的信号的降低程度来估计杂合结构的相对含量。

从单个的甘醇结构的峰高度和所有检测到的糖结构的峰高度之和的比例计算每种糖结构的相对量。岩藻糖的量是含有岩藻糖的结构相对于在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定出的全部糖结构(例如分别是复合、杂合以及寡和高甘露糖结构)的百分比。afucosylation的量是缺少岩藻糖的结构相对于在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定出的全部糖结构(例如分别是复合、杂合以及寡和高甘露糖结构)的百分比。

测定的OA-GA201-scFab-Ak18_WT的岩藻糖的量在25％和40％之间。

实施例11

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体与具有不同的EGFR和IGF-1R表达的细胞的结合

人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)结合表达IGF-1R的细胞，而人源化大鼠抗EGFR抗体ICR62结合其表面表达EGFR的细胞。为评估与针对EGFR和IGF-1R的单特异性二价抗体相比，双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的结合性质，在具有不同的IGF-1R/EGFR表达比例的细胞上进行了竞争性结合测定。

将在冰冷缓冲液(PBS+2％FCS，Gibco)中稀释的人肿瘤细胞(例如A549、TC-71、MDA-MB-231，2x105细胞/孔)加入到在96孔微量滴定板中标记的单特异性抗体(HUMAB克隆18或人源化的大鼠抗EGFR抗体ICR62)(终浓度为1μg/ml)和不同浓度的未标记的<EGFR-IGF1R>抗体，或者未标记的单特异性抗体或者Fab片段的混合物作为对照(终滴定范围为100至0.002μg/ml)。将混合物在冰上孵育45分钟。通过加入150-200μl缓冲液(PBS+2％FCS)并随后离心(300g；5min，4℃)将细胞洗涤2次。然后在含有6.25μl/ml 7-AAD(BD#559925)的200μl固定缓冲液(1x CellFix，BD#340181)中重悬细胞并在冰上孵育10-20min以允许固定和7-AAD渗入死细胞。用FACS分析样品的荧光信号并计算IC50值。

与<IGF-1R>HUMAB克隆18相比的竞争性结合分析结果(IC50值)如表X所示。在表达IGF-1R和EGFR的A549肿瘤细胞上，双特异性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT的结合优于<IGF-1R>HUMAB克隆18(～3x)，并优于<IGF-1R>HUMAB克隆18Fab片段(～30x)，可能由于双特异性抗体同时结合IGF-1R和EGFR的能力(亲和力效应)。在表达IGF-1R但不表达EGRF的TC-71肿瘤细胞上，<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT的结合与<IGF-1R>HUMAB克隆18 Fab片段类似。在此情况下，只有IGF-1R被表达，而EGFR未被表达，OA-GA201-scFab-Ak18_WT只能用一条结合臂与IGF-1R结合。

与单特异性IGF-1R和EGFR靶向抗体相比较，双特异性<EGFR-IGF1R>抗体更强地结合表达IGF-1R和EGFR的细胞的能力可被用于实现对肿瘤组织更好的靶向，并且可能导致有利的安全特性(safetyprofile)和PK性质。

Claims

1.双特异性抗体，包含：

a)特异性结合第一个抗原的第一个全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合第二个抗原的第二个全长抗体的重链和轻链，其中重链的N端通过肽接头连接到轻链的C端，

其中a)的全长抗体的重链的CH3结构域和b)的全长抗体的重链的CH3结构域各自在包含抗体CH3结构域之间的原界面中的改变的界面处交汇；

其中，i)在一条重链的CH3结构域中

氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在一条重链的CH3结构域的界面内生成凸起，该凸起可置于另一条重链的CH3结构域的界面内的腔中

并且其中

ii)在另一条重链的CH3结构域中

氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二个CH3结构域的界面内生成腔，第一个CH3结构域的界面内的凸起可置于该腔中。

2.根据权利要求1的抗体，其特征在于：

所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)和

所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。

3.根据权利要求1或2的抗体，其特征在于：

通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域对应位置的氨基酸，两个CH3结构域都被进一步改变，使得两个CH3结构域之间能形成二硫桥。

4.根据权利要求1至3的任一项的抗体，其特征在于：

b)的第二个全长抗体的重链和轻链的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)是通过在以下位置之间引入二硫键，由二硫化物稳定的：

i)重链可变结构域第44位至轻链可变结构域第100位，

ii)重链可变结构域第105位至轻链可变结构域第43位，或

iii)重链可变结构域第101位至轻链可变结构域第100位。

5.根据权利要求1至4的任一项的双特异性抗体，其中抗体包含IgG1的恒定区。

6.根据权利要求1的双特异性抗体，其特征在于：

a)第一个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的轻链，并且

b)第二个全长抗体特异性地结合EGFR并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述肽连接的重链和轻链由SEQ IDNO:3的氨基酸序列组成。

7.根据权利要求1的双特异性抗体，其特征在于：

b)第二个全长抗体特异性地结合EGFR并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述肽连接的重链和轻链由SEQ IDNO:4的氨基酸序列组成。

8.根据权利要求1的双特异性抗体，其特征在于：

a)第一个全长抗体特异性地结合EGFR并包含由SEQID NO:5的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的轻链，并且

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述肽连接的重链和轻链由SEQID NO:7的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求1的双特异性抗体，其特征在于：

b)第二个全长抗体特异性地结合IGF-1R并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述肽连接的重链和轻链由SEQID NO:8的氨基酸序列组成。

10.根据权利要求1的双特异性抗体，其特征在于：

a)第一个全长抗体特异性地结合VEGF并包含由SEQID NO:9的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的轻链，并且

b)第二个全长抗体特异性地结合ANG-2并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链由SEQ IDNO:11的氨基酸序列组成。

11.根据权利要求1的双特异性抗体，其特征在于：

b)第二个全长抗体特异性地结合ANG-2并包含通过肽接头与轻链连接的重链，其中所述连接的重链和轻链由SEQ IDNO:12的氨基酸序列组成。

12.根据权利要求5至9的任一项的双特异性抗体，其中用糖链在Asn297糖基化抗体，其中糖链中岩藻糖的量是65％或更低。

13.包含根据权利要求1至12任一项的抗体的药物组合物。

14.编码根据权利要求1至12任一项的双特异性抗体的链的核酸分子。

15.含有根据权利要求14所述的核酸的表达载体，所述表达载体能在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。

16.包含根据权利要求15的载体的原核或真核宿主细胞。

17.制备根据权利要求1至12任一项的双特异性抗体的方法，

包括以下步骤：

a)用包含核酸分子的载体转化宿主细胞，核酸分子编码：

aa)特异性结合第一个抗原的第一个全长抗体的重链和轻链；和

ab)特异性结合第二个抗原的第二个全长抗体的重链和轻链，其中重链的N端通过肽接头连接到轻链的C端；和

b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养宿主细胞；和

c)从所述培养物回收所述抗体分子。

18.制备双特异性抗体的方法，包括以下步骤：

a)用包含核酸分子的载体转化宿主细胞，核酸分子编码：

b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养宿主细胞；和

c)从所述培养物回收所述抗体分子；

其中所述双特异性抗体包含：

a)特异性结合第一个抗原的第一个全长抗体的重链和轻链；

19.特异性结合人IGF-1R和人EGFR的双特异性抗体，其特征在于包含由SEQ ID No:1的氨基酸序列组成的重链、由SEQ ID No:2的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID No:3的氨基酸序列组成的连接的重链和轻链。

20.特异性结合人IGF-1R和人EGFR的双特异性抗体，其特征在于包含由SEQ ID No:1的氨基酸序列组成的重链、由SEQ ID No:2的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID No:4的氨基酸序列组成的连接的重链和轻链。

21.特异性结合人IGF-1R和人EGFR的双特异性抗体，其特征在于包含由SEQ ID No:5的氨基酸序列组成的重链、由SEQ ID No:6的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID No:7的氨基酸序列组成的连接的重链和轻链。

22.特异性结合人IGF-1R和人EGFR的双特异性抗体，其特征在于包含由SEQ ID No:5的氨基酸序列组成的重链、由SEQ ID No:6的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID No:8的氨基酸序列组成的连接的重链和轻链。

23.根据权利要求19至22任一项的双特异性抗体，其中用糖链在Asn297糖基化抗体，其中糖链中岩藻糖的量是65％或更低。

24.特异性结合人VEGF和人ANG-2的双特异性抗体，其特征在于包含由SEQ ID No:9的氨基酸序列组成的重链、由SEQ ID No:10的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID No:11的氨基酸序列组成的连接的重链和轻链。

25.特异性结合人VEGF和人ANG-2的双特异性抗体，其特征在于包含由SEQ ID No:9的氨基酸序列组成的重链、由SEQ ID No:10的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID No:12的氨基酸序列组成的连接的重链和轻链。