CN102911264A - 血小板聚集抑制剂组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血小板聚集抑制剂组合物。具体地，本发明提供药物组合物，包含至少一种下列(a)-(d)的多肽作为活性组分：(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；(b)包含在上述(a)的氨基酸序列中含一个或多个氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽；(c)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；以及(d)包含在上述(c)的氨基酸序列中含一个或多个氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽。
Description
本申请是2006年11月2日提交的申请号为200680035297.9，发明名称为“血小板聚集抑制剂组合物”申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽，或药物组合物，例如，包含表达产物(重组多肽)作为活性组分的血小板聚集抑制组合物，所述表达产物由编码该多肽的多核苷酸表达。
本发明进一步涉及对胶原蛋白具有结合能力的多肽，或包含该多肽作为活性组分的药物组合物。
本发明还涉及筛选在药物化合物中作为活性组分的化合物(例如，激动剂)的方法，所述化合物促进血小板聚集抑制活性。进而，本发明涉及具有血小板聚集抑制活性的新型多肽以及编码该多肽的多核苷酸。
背景技术
血小板聚集是由血管内皮细胞的损伤和其他多种因素造成的。当冠状导管、脑导管、或外周导管被血小板血栓堵塞时，分别导致心肌梗塞，脑梗塞或慢性动脉阻塞。这种血小板活化(刺激聚集)之后血栓病的例子包括动脉硬化，缺血性脑梗塞，包括心肌梗塞和心绞痛的缺血性心脏病，慢性动脉阻塞和静脉血栓。
具有抑制血小板聚集作用的药物用作带有上述各种疾病作为并发症的缺血性疾病的预防药，以及继高血压、肺高压、脑梗塞、肺梗塞和蛛网膜下腔出血之后的病理状况的预防药。此外，上述药物用于预防经皮腔内冠状动脉成型术(PTCA)和支架放置后的血栓形成，并还在通过将具有抑制血小板聚集作用的这样一种药物施加至支架上或包埋在支架本身中，以封装所述药物，从而用作支架放置后再狭窄的预防剂。
同时，蚊子用其尖锐的口针刺进皮肤，所述口针在吸血时抵达外周血管，并频繁重复被称作探查的刺入和拔出行为，以找到外周血管。据信，蚊子同时分泌唾液，其中含有促进血管舒张使得容易探测到血管的物质。由于上述探查，外周血管通常受损，变成充血。一般而言，血管受损时，暴露出血管内皮下方组织中的胶原，二磷酸腺苷(ADP)从破损细胞释放，凝血因子活化形成凝血酶。凝血酶强烈活化血小板，诱导血小板附着、血小板聚集和颗粒释放，最终通过形成纤维蛋白使血液凝结，形成坚实的血栓(止血机制)。已经知道蚊子的唾液含有抑制这种止血机制的物质(参见非专利文献1)。
蚊子的唾液腺蛋白，经最详细的研究是腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)。该酶为血小板聚集抑制物质，第一次是在埃及斑蚊(Aedesaegypti)的唾液里得到鉴定。腺苷三磷酸双磷酸酶抑制血小板聚集，导致从受损血管内皮细胞、红血球和附着的血小板释放的ADP降解成AMP(一磷酸腺苷)，并显示抗止血作用。为了阐明除蚊子之外各种吸血性昆虫的吸血行为，似乎有必要分析它们唾液物质的功能。
据预测众多唾液物质参与抑制血小板聚集，例如，已报道来自骚扰锥蝽(Triatoma infestans)的蛋白具有血小板聚集抑制活性(参见专利文献1和2)。
在来自斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的唾液腺的蛋白中，已鉴定出具有血液凝结抑制活性的蛋白，但还没有鉴定出具有血小板聚集抑制活性的蛋白(参见专利文献3)。
此外，已经报道了来自斯氏按蚊唾液腺的cDNA文库克隆的33种新型蛋白，但该报道并未描述具有血小板聚集抑制活性的蛋白，并且它们中很多的功能尚未知晓(参见非专利文献2)。
本发明人先前报道了从斯氏按蚊唾液腺克隆的、具有富含GE(GlyGlu)序列的蛋白(AAPP)(参见非专利文献3)。该蛋白具有810个碱基的可读框(ORF)，并且是28.5kDa的蛋白，据推导由269个氨基酸残基组成。其后发现该蛋白类似于非专利文献2公开的30kDa的抗原(GenBank检索号AY226454)，但在非专利文献2和3中对蛋白的作用和功能(活性)没有描述。
[专利文献1]JP 2004-121091-A公布
[专利文献2]JP 2004-121086-A公布
[专利文献3]JP 2003-116573-A公布
[非专利文献1]Riberio,J.M.,J.Exp.Biol.,108,1-7(1984))
[非专利文献2]Valenzuela,J.G.等,“开发斯氏按蚊的唾液腺转录体和蛋白体(Exploring the salivary gland transcriptome and proteome ofthe Anopheles stephensi mosquito)”,Insect Biochemistry
[非专利文献3]Hiroyuki Watanabe等,Medical Entomology andZoology 55 Suppl.,pp41,19(2004)
发明内容
本发明提供新型药物组合物，尤其是血小板聚集抑制剂和/或血小板粘附抑制剂。
本发明进一步提供包含对胶原具有结合能力的蛋白作为活性组分的新型药物组合物。
本发明还提供筛选物质诸如激动剂的方法，所述筛选方法确定该物质的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性。
与本发明人早先报道的对蛋白(AAPP)的研究分开的进一步广泛研究的结果是，本发明人在斯氏按蚊唾液腺中发现了具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的新型蛋白，成功地分离并鉴定出编码该蛋白的DNA，并且最新发现该蛋白具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性。
本发明提供特征为下列1-14项的发明。
第1项.药物组合物，包含至少一种下列(a)-(d)的多肽作为活性组分：
(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；
(b)包含氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽，所述氨基酸序列在上述(a)的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸缺失、插入、取代或添加；
(c)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；以及
(d)包含氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽，所述氨基酸序列在上述(c)的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸缺失、插入、取代或添加。
第2项.包含表达产物作为活性组分的药物组合物，所述表达产物由至少一种下列(e)-(j)的多核苷酸表达：
(e)包含SEQ ID NO:2的DNA序列或其互补序列的多核苷酸；
(f)在严格条件下与上述(e)的多核苷酸杂交并能够表达具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；
(g)包含与上述(e)的多核苷酸具有80%或更高的同源性的DNA序列并能够表达具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；
(h)包含SEQ ID NO:4的DNA序列或其互补序列的多核苷酸；
(i)在严格条件下与上述(h)的多核苷酸杂交并能够表达具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；和
(j)包含与上述(h)的多核苷酸具有80%或更高的同源性的DNA序列并能够表达具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸。
第3项.根据第1或2项的药物组合物，其中所述血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性是对由胶原诱导的血小板聚集的抑制活性和/或对血小板粘附至胶原的抑制活性。
第4项.根据第1或2项的药物组合物，其中所述药物组合物对胶原具有结合能力。
第5项.血小板聚集抑制剂和/或血小板粘附抑制剂，其包含第1项所述的多肽，或第2项所述的由多核苷酸表达的表达产物。
第6项.为血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性筛选激动剂的方法，其中第1项所述的多肽的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的水平在对象物质存在或缺乏下测量，并将对象物质存在下的测量值与对象物质缺乏下的测量值比较，以选出增强抑制作用的对象物质作为激动剂。
第7项.为血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性筛选激动剂的方法，其中第2项所述的由多核苷酸表达的表达产物的抑制活性的水平在对象物质的存在或缺乏下测量，并将对象物质存在下的测量值与对象物质缺乏下的测量值比较，以选出增强血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的对象物质作为激动剂。
第8项.筛选候选物质的方法，所述候选物质激动(agonist)第1项所述的多肽或第2项所述的表达产物的血小板抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，所述方法包括下列步骤(1)-(4)：
(1)制备培养基的步骤，所述培养基包含用表达第1项所述的多肽的表达载体转化的细胞，或包含第2项所述的表达产物的细胞，和富血小板的血浆；
(2)向上述(1)的培养基添加血小板聚集剂，以在对象物质存在或缺乏下诱导血小板聚集的步骤；
(3)在上述(2)的对象物质存在或缺乏下，测量血小板聚集水平的步骤；和
(4)当对象物质存在下的测量值大于对象物质缺乏下的测量值时，选择该对象物质作为候选物质的步骤。
第9项.为第1项所述的多肽或第2项所述的由多核苷酸表达的表达产物筛选激动剂的试剂盒，特征在于含有富血小板的血浆、第1项所述的多肽和第2项所述的表达产物中的任一种、以及血小板聚集剂作为组分。
第10项.分离的多肽，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
第11项.分离的多肽，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
第12项.分离的多肽，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
第13项.多核苷酸，包含SEQ ID NO:2的DNA序列或其互补序列。
第14项.多核苷酸，包含SEQ ID NO:4的DNA序列或其互补序列。
第15项.多核苷酸，包含SEQ ID NO:6的DNA序列或其互补序列。
上述(a)-(d)的至少一种多肽(蛋白)下文有时称作“SY-001”。上述(e)-(j)的至少一种多核苷酸的表达产物有时称作“本发明的表达产物”。
附图简述
图1显示用胶原刺激诱导实施例1，3(1)生产的SY-001的血小板聚集抑制活性；
图2显示用胶原刺激诱导实施例1，3(2)生产的SY-001的血小板聚集抑制活性；
图3显示实施例1和3生产的SY-001的血小板粘附抑制活性，其在实施例5中抑制血小板粘附至胶原；和
图4显示实施例1和3生产的SY-001在实施例6中对胶原具有结合能力。
最佳实施方式
氨基酸、肽、碱基序列和核酸在此的缩写表示法加入IUPAC-IUB定义的“对生物命名法的IUPAC-IUB通讯”（IUPAC-IUBCommunication on Biological Nomenclature），Eur.J.Biochem.,138:9(1984)，“含碱基序列和氨基酸序列的说明书准备指南(Guideline forpreparing specifications comprising base sequences and amino acidsequences)”(专利局)和本领域常用注释。
本文的多核苷酸(DNA分子)不仅包括双链DNA，而且包括单链DNA，含组成它们的有义链和反义链，并且不限制其长度。因此，编码SY-001的多核苷酸包括含基因组DNA的双链DNA，以及含cDNA的单链DNA(有义链)和具有与有义链互补的序列的单链DNA(反义链)，及合成的其DNA片段，除非另有说明。
本文的多核苷酸(DNA分子)不由功能区限定，并可包括表达抑制区、编码区、前导区、外显子和内含子中的至少之一。
多核苷酸也包括RNA和DNA。含某种氨基酸序列的多肽和含某种DNA序列的多核苷酸包括其片段、同源物、衍生物和突变体。
多核苷酸的突变体(突变DNA)包括天然发生的等位基因突变体，非天然发生的突变体，以及具有缺失、取代、添加和插入的突变体。但是，这些突变体编码的多肽具有与由突变前的多核苷酸编码的多肽基本相同的功能。
多肽的突变(氨基酸序列修饰)不一定通过天然发生的突变发生，例如，突变或翻译后修饰，并可以是通过利用天然存在的蛋白(例如，SY-001)人工进行的突变。多肽的上述突变包括与突变前的多肽具有至少80%，优选95%和更优选99%同源性的等位基因变体、同源物和天然突变体。
多肽或多核苷酸的同源性可以通过利用FASTA程序(Clustal,V.,Methods Mol.Biol.,25,307-318(1994))测量而得以分析。作为同源性分析最优选和简单的方法，可能例举这样的方法：其中序列储存在能够被计算机读取的介质上(例如，软盘，CD-ROM，硬盘驱动，外盘驱动，DVD等)，然后根据公知的检索步骤，利用存储的序列检索已知的序列数据库。已知的序列数据库的具体例子包括下列：
-日本DNA数据库(DNA Database of Japan,DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)；
-Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genebank/Index.htlm)；和
-欧洲分子生物学实验室核酸序列数据库(the European MolecularBiology Laboratory Nucleic Acid Seqence Database,EMBL)(http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html)。
同源性分析的众多检索算法对本领域技术人员而言是可用的。其一个例子包括称作BLAST程序的程序。在该程序中有5个BLAST过程。其中三个(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)是设计用于检查核苷酸序列。剩余两个设计用来检查蛋白序列(Coulson,Trends inBiotechnology,12:76-80(1994)；Birren等,Genome Analysis,1:543-559(1997))。
此外，其他程序，例如，序列比对程序和鉴定分开更远的序列的程序在本领域中对分析经鉴定的序列是可用的。
突变DNA对由此编码的氨基酸是沉默的(由突变的核酸序列编码的氨基酸残基没有变化)或保守的。保守氨基酸取代的例子如下所示。
一般而言，编码Cys残基的一个或多个密码子影响具体多肽的二硫键。
通常认为影响蛋白特征的氨基酸残基的取代包括下列：
a)用亲水残基取代疏水残基，例如，用Ser或Thr取代Leu,Ile,Phe，Val或Ala；
b)用Cys或Pro取代除Cys和Pro之外的氨基酸残基；
c)用负电残基，例如，Glu或Asp，取代具有正电侧链的残基，例如，Lys，Arg或His；和
d)用没有侧链的氨基酸残基，例如，Gly，取代具有极大侧链的氨基酸残基，例如，Phe。
(1)SY-001
SY-001包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列，并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，其抑制血小板对胶原的粘附和/或对胶原的结合能力。
SY-001可以是通过基因重组技术，利用大肠杆菌(Escherichia coli)的蛋白表达系统或利用下文所述实施例所示的杆状病毒(AcNPV)的蛋白表达系统表达的多肽，或通过化学合成获得的多肽。
作为SY-001的氨基酸序列的一个具体例子，可以列举SEQ IDNO:1或3中的一个。SY-001的氨基酸序列不限于SEQ ID NO:1或3之一，而且可以是那些与其具有一定同源性的氨基酸序列(同源氨基酸序列)。同源氨基酸序列可以包括这样的多肽：其含有在SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列，并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，该多肽抑制血小板对胶原的粘附和/或对胶原的结合能力。
SY-001具有的血小板聚集抑制活性包括抑制或阻断其中诱导血小板聚集的物质在人类血管(尤其在冠状动脉，主动脉和脑动脉)中增加或在血管中血小板的聚集能力被易化的病症的作用，或者抑制或阻断血管中已发生损伤和血小板在受损部位过分聚集的病症的作用。
在体外试验中，向富血小板的血浆(PRP)添加SY-001，通过抑制所述血浆中的血小板聚集剂所诱导的血小板聚集，可检测血小板聚集抑制活性。
更具体而言，SY-001的血小板聚集抑制活性可经下列方法确定。即，首先，通过离心从人类全血制备PRP。随后，该制备的PRP与溶液，例如含有SY-001的PBS溶液预温育，并向该溶液进一步加入血小板聚集剂以聚集血小板。血小板聚集剂的例子包括ADP(二磷酸腺苷)，胶原，CRP(胶原相关肽)，convulxin，TRAP(凝血酶受体活化肽)，肾上腺素，花生四烯酸，U-46619(血栓烷A2类似物，TXA2类似物)和A23187(钙离子载体)。所得溶液的血小板聚集率利用浊度透光率血小板聚集仪(aggregoter)(MCM HEMA TRACER 313M：由MC Medical提供)测量，而且SY-001的血小板聚集抑制率基于不含SY-001的对照值，从得到的测量值计算。因此，能够检测SY-001的血小板聚集抑制活性。
SY-001的血小板粘附抑制活性也可由下列方法确定。
将含有给定浓度的SY-001的PBS溶液添加到包被有胶原溶液的96孔板中，并在室温下温育30分钟。温育后，孔中加入血小板悬浮液，并在室温下温育45分钟。温育后，用吸液管从孔中取出温育溶液，用PBS洗孔。
孔中加入含有1%SDS的PBS溶液，摇动和搅动后孔被风干。然后，孔中加入蒸馏水，利用DC蛋白分析试剂盒(BIO-RAD Laboratories)测量各孔中的蛋白量。SY-001的血小板粘附抑制活性率基于不含SY-001的对照值，从得到的测量值计算，并从血小板粘附曲线计算SY-001的血小板粘附抑制活性。因此，可检测SY-001抑制血小板对胶原的粘附的血小板粘附抑制活性。
SY-001的胶原结合能力也可通过下述方法确定。
300μl封闭溶液添加至涂布胶原或未涂布胶原的各96孔板，并温育1小时。从各孔除去温育溶液，100μl含有给定浓度的SY-001的溶液加到各孔中，并在室温下温育1小时。从各孔除去温育溶液之后，则向各孔加入200μl的2%蔗糖，并在室温下温育5分钟。从各孔除去温育溶液之后，干燥孔，向各孔加入100μl重构的Ni-HRP溶液(KPP:Kirkegaard&Perry Laborator,Ltd.)，并在室温下温育30分钟。以洗涤缓冲液洗涤后，向各孔加入100μlABTS过氧化物酶底物(KPL Ltd.)，并轻轻摇动96孔板。
反应完成之后，向各孔添加100μl的1%SDS，然后用微量培养板读数仪，以405-410nm处的吸光度变化，对孔进行测量。
给定浓度的SY-001的胶原结合能力基于不含SY-001的对照载体的值，从所得的OD值计算，并从其胶原结合曲线计算SY-001的胶原结合能力。因此，可检测SY-001的胶原结合能力。
SY-001的抗血小板活性也可通过下述方法确定。即，从全血制备PRP，所述全血是用带有抗凝剂的注射器从健康供体采集血样后通过离心获得的。接着，制备的PRP以合适的缓冲液稀释，例如，Tyrode-Hepes(134mM NaCl,0.34mM Na2HPO4,2.9mM KCl,12mM NaHCO3,20mM Hepes,5mM glucose,1mM MgCl2,pH 7.3)，向该系列稀释液加入给定浓度的SY-001，并预温育。
向该溶液加入荧光标记的抗P选凝素(selectin)抗体、识别PAC-1(GPIIb/GPIIIa复合体)的抗体(由Becton Dickinson提供)、纤维蛋白原和膜联蛋白(annexin)V，随后加入血小板聚集剂，例如，ADP、胶原或TRAP，以活化血小板。因此，活化的血小板的荧光强度通过流式细胞仪测量，以评价SY-001对血小板活化的活性(对活化的抑制活性)。这种对血小板活化的抑制活性是血小板活化抑制活性。
在上述方法中，如果利用识别血小板和白细胞的荧光标记抗体，则还有可能评价化合物对血小板和白细胞的相互作用(血小板－白细胞粘附)的影响。
利用浊度透光率血小板聚集仪，测量SY-001对血小板聚集的抑制活性，对该方法的细节，本发明参照，例如，Born,G.V.R.,“Aggregationof blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal(通过二磷酸腺苷的血小板聚集及其逆转)”,Nature,1962,194,927-9和Sudo,T.等,“Potent effects of novel anti-platelet aggregatory cilostamide analogueson recombinant cyclic nucleotide phosphodiesterase isozyme activity(新型抗血小板聚集西洛酰胺类似物对重组环核苷酸磷酸二酯酶同工酶活性的有效影响)”,Biochem.Pharmacol.,2000,59,347-56。对血小板活化的测量而言，本发明还参照，例如，Ito,H.等,“Cilostazol inhibitsplatelet-leukocyte interaction by suppression of platelet activation(西洛他唑通过抑制血小板活化而抑制血小板－白细胞相互作用)”,Platelets,2004,15,293-301。
所以，对血小板聚集具有抑制活性和/或对血小板粘附具有抑制活性的SY-001，通过作用于哺乳动物的血液和血管以抑制或预防血栓或栓子形成，具有作为治疗剂的可能性，用于血液相关疾病及其并发症的出现或预防。
因而，对血小板聚集具有抑制活性和/或对血小板粘附具有抑制活性的SY-001，具有被认为可用作治疗剂或预防剂的可能性，用于继发于血栓或栓子形成引起的疾病及其并发症的病理状况，所述疾病及其并发症例如，心肌梗塞，脑栓塞，慢性动脉阻塞，动脉硬化，缺血性脑梗塞，心绞痛，静脉血栓症，高血压，肺高压，脑梗塞，肺梗塞，心衰，肾炎，肾衰，和蛛网膜下腔出血。
对血小板聚集具有抑制活性和/或对血小板粘附具有抑制活性的SY-001，还被被认为有一种可能性，用于预防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通过在支架上施加或在支架本身内包埋而包入含有SY-001的药物，用作支架放置后再狭窄的预防剂。
修饰的程度和位置，即上述(b)和(d)所示的SY-001中氨基酸残基的“缺失，插入，取代或添加”不受特别限制，只要包含修饰的氨基酸序列的多肽(等同物)与包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的多肽基本上具有相同的活性。优选的是，上述修饰通常在约1至几个氨基酸残基处进行。
在本发明中，“多个氨基酸的缺失，插入，取代或添加”是指2个以上和20个以下的氨基酸已被缺失、插入、取代或添加。多个氨基酸优选2个以上和10个以下，更优选2个以上和7个以下，还更优选2个以上和5个以下。该修饰的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或3的任一氨基酸序列具有，例如，约70%以上，优选约80%以上，更优选约95%以上，还更优选约98%以上的同源性。
本发明药物组合物中活性组分的多肽(SY-001)的具体例子如下文所述的实施例所示。
SY-001具有固有的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性。
SY-001还具有固有的胶原结合能力。
所以，含有SY-001作为活性组分的本发明药物组合物可用作治疗剂或预防剂，用于由血栓或栓子形成引起的疾病及其并发症之后的病理状态，所述疾病及其并发症例如，急性冠脉综合征，心肌梗塞，脑栓塞，慢性动脉阻塞，动脉硬化，缺血性脑梗塞，心绞痛，静脉血栓症，高血压，肺高压，脑梗塞，肺梗塞，心衰，肾炎，肾衰，和蛛网膜下腔出血。本发明的药物组合物还可用于预防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通过在支架本身上施加该药物组合物，用作支架放置后再狭窄的预防剂。
(2)编码SY-001的多核苷酸(DNA分子)
编码SY-001的多核苷酸(有时称作“SY-001的DNA分子”)的一个具体例子包括的多核苷酸(DNA分子)含有SEQ ID NO:2或4的DNA序列或其互补序列。
SY-001的DNA分子的另一个例子包括的多核苷酸，其在严格条件下与包含SEQ ID NO:2或4的DNA序列的互补序列的多核苷酸杂交，并能够表达具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽。
这里的“严格条件”可包括的条件，其中杂交发生在50°C下含有0.1%SDS的2×SSC中，并通过60°C下在含有0.1%SDS的1×SSC中洗涤而不分离。
此外，SY-001的DNA分子(多核苷酸)的另一个例子包括的多核苷酸包含这样的DNA序列，该DNA序列与包含SEQ ID NO:2或4的DNA序列或其互补序列的多核苷酸中最密切相关的一个具有80%以上，优选95%以上，更优选约98%以上的同源性，并能够表达具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽。
对于能够表达具有期望作用的其他实施例所示的多肽的DNA分子(有时称作修饰的DNA分子)而言，基本的要求是，由DNA分子编码的氨基酸序列多肽能表达血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性(尤其是，由胶原诱导的对血小板聚集的抑制活性和/或对血小板粘附至胶原的抑制活性)。换言之，条件是，用已插入多核苷酸(修饰的DNA分子)的重组表达载体转化的转化体能够表达具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的蛋白作为其表达产物。
上述修饰的DNA分子包括这样的DNA分子，该DNA分子包括编码SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列、尤其是具有一个或多个氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列(修饰的氨基酸序列)的DNA序列，以及编码其互补序列的DNA序列。该修饰的DNA可以是利用它检测修饰前本发明DNA分子的那些。
与SY-001的DNA分子中所含的多核苷酸(SY-001的DNA或其片段)同源并包含SEQ ID NO:2或4的DNA序列的DNA分子，意味着一系列相关的DNA分子，其与SEQ ID NO:2或4的DNA序列具有序列同源性，并通过它们的结构特征被认作一个DNA分子家族，且它们的表达模式具有共性，以及它们的生物功能具有相似性。
这种同源DNA分子可以是那些基于天然存在的DNA分子人工制备的(例如，SY-001的DNA片段)。该人工步骤的例子包括基因工程技术，诸如位点特异性突变[Methods in Enzymology,154,350,367-382(1987)；同上，100,468(1983)；Nucleic Acids Res.,12,9441(1984))；“Zoku Seikagaku Jikken Kouza 1”，由日本生化协会编辑(the Japanese Biochemical Society)的“Idenshi Kenkyuho II”，p105(1986)]，化学合成步骤，诸如磷酸三酯法和亚磷酰胺法[J.Am.Chem.Soc.,89,4801(1967);同上，91,3350(1969);Science,150,178(1968);Tetrahedron Lett.,22,1859(1981)；同上，24,245(1983)]及其组合。更具体而言，DNA分子也可通过亚磷酰胺法或磷酸三酯法合成，并且也可利用市售的全自动寡核苷酸合成仪合成。通过合成互补链并用化学合成的单链在合适条件下使该互补链退火，或利用DNA聚合酶以合适的引物将互补链加至化学合成的单链，可获得双链片段。
SEQ ID NO:2或4的DNA序列作为SY-001的DNA分子的一个具体实施方式，是编码多肽的氨基酸残基的密码子的一个组合例子，所述多肽包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列。SY-001的DNA分子不限于带有这种特殊DNA序列的DNA分子，并能够具有任选密码子的组合和为各氨基酸残基选定的DNA序列。密码子可根据标准方法选择。此时，可考虑密码子在所用宿主中的使用频率[Nucleic Acids Res.,9,43(1981)]。
(3)SY-001的DNA分子的生产
基于在此公开的编码SY-001的多核苷酸的核酸序列信息进行合成，或在SY-001的氨基酸序列信息的基础上直接合成对应编码氨基酸序列的核酸序列的DNA分子(化学DNA合成)，可容易地生产和获得SY-001的DNA分子。通用基因工程技术可适用于该生产[例如，参见分子克隆第2版(Molecular Cloning 2d Ed)，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；日本生化协会编辑的“Zoku Seikagaku Jikken Kouza 1”，“Idenshi Kenkyuho II”(1986)]。
作为直接合成SY-001的DNA分子的化学DNA合成方法，可举例说明的是通过亚磷酰胺法的固相合成方法。全自动合成仪可用于该合成法。
通过基因工程技术生产SY-001的DNA分子可以更特定地实施，方法是根据标准方法，通过从已表达SY-001的DNA分子的合适来源制备cDNA文库，并利用对SY-001的DNA分子特异的合适探针或抗体，从该文库选择所需的克隆[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,78,6613(1981)；Science,222,778(1983)]。
在上文中，作为cDNA来源，可举例说明的是表达SY-001的DNA分子的各种细胞和组织以及从中衍生的培养细胞。具体而言，希望的是使刺客虫斯氏按蚊的唾液腺成为来源。从来源提取和分离总RNA，分离和纯化mRNA，以及获得和克隆cDNA全部可根据标准方法实施。
利用通过提取、分离和纯化唾液腺mRNA获得的斯氏按蚊的唾液腺cDNA文库，可生产SY-001的DNA分子。除此之外，利用通过提取上述唾液腺mRNA，向RNA添加poly A，然后收集带poly A的RNA，用反转录酶生产cDNA，并且随后在cDNA两端添加限制性酶位点，所述cDNA掺入噬菌体中制备噬菌体文库，利用该噬菌体文库也可生产SY-001的DNA分子。
从cDNA文库筛选SY-001的DNA分子的方法不受特别限制，并可根据标准方法进行。作为具体方法，可举例说明的是其中利用对cDNA生产的蛋白特异的抗体(例如，抗－斯氏按蚊唾液抗体)，经免疫筛选选择对应的cDNA克隆的方法；利用选择性结合至目的DNA序列的探针的噬斑杂交方法；集落杂交方法；及其组合。
上述各杂交方法中所用的探针通常是基于SY-001的DNA分子的DNA序列信息而化学合成的DNA片段。已经获得的SY-001的DNA分子及其片段可有利地用作上述探针。而且，基于SY-001的DNA分子的DNA序列信息所获得的有义引物和反义引物也可用作上述筛选的探针。
用作探针的DNA(核苷酸)是对应SY-001的DNA序列的部分DNA(核苷酸)，并包括至少15个连续DNA，优选至少20个连续DNA，和更优选至少30个连续DNA。用于上述生产本发明DNA分子的阳性克隆自身可用作探针。
当获得SY-001的DNA分子时，可适当利用通过PCR的DNA/RNA的扩增方法[Science,230,1350(1985)]。具体而言，当难以从文库中获得全长cDNA时，可合适地采用RACE法[快速扩增cDNA末端(Rapidamplification of cDNA ends)；Jikken Igaku,12(6),35(1994)]，尤其是5’-RACE法[M.A.Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,8,8998(1988)]。
用于PCR方法的引物可任选基于后文实施例所述的SY-001的DNA分子的序列信息而设计，并根据标准方法合成。作为该引物，还可能利用在载体质粒的cDNA两端添加的DNA部分(SP6启动子引物和T7终止子引物)，所述载体质粒中已如后文实施例所述掺入了SY-001的cDNA。
经PCR方法扩增的DNA/RNA片段可根据标准方法，例如凝胶电泳方法，而分离和纯化。
如上所述获得的SY-001的DNA分子及其各种DNA片段可根据标准方法，例如二脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463(1977)]或Maxam-Gilbert法[Methods in Enzymology,65,499(1980)]，或简单利用可商购的测序试剂盒而进行测序。
(4)基因工程生产本发明的表达产物
根据普通的基因工程技术[例如，Science,224,1431(1984);Biochem.Biophys.Res.Comm.,130,692(1985);Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,80,5990(1983)]，利用SY-001的DNA分子的序列信息，本发明的表达产物(重组SY-001)作为该DNA分子的表达产物或含该表达产物的蛋白，可容易和稳定地大量生产。更具体而言，通过制备能够在宿主细胞中表达编码所需蛋白的重组DNA(表达载体)，用该载体转化宿主细胞以获得转化体，培养转化体并从所得培养物中收集目的蛋白，能够获得本发明的表达产物。
在本发明表达产物的生产中，任何原核生物和真核生物可用作宿主细胞。例如，作为宿主的原核生物可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等常用生物中任一种，适当的是大肠杆菌，尤其可用大肠杆菌K12菌株。真核生物的宿主细胞包括来自脊椎动物和酵母的细胞。前者的合适例子包括猴子COS细胞[Cell,23:175(1981)]、中国仓鼠卵巢细胞及其二氢叶酸还原酶缺失系[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,77:4216(1980)]，而后者的合适例子包括属于酵母菌（Saccharomyces）属的酵母细胞。当然，宿主细胞并不限于此。
当原核细胞用作宿主时，利用能够在宿主细胞中复制的载体，可能的是合适利用下述表达质粒，该质粒的获得是在本发明的基因上游处掺入起始蛋白合成所需的启动子、SD(Shain和Dalgarano)和起始密码子(例如，ATG)，从而能在该载体中表达所述基因。作为上述载体，通常利用的质粒是例如衍生自大肠杆菌pET-16b,pET-32,pBR322,pBR325,pUC12和pUC13。不受限于此，可利用公知的多种载体。利用大肠杆菌用于表达系统的可商购载体的例子包括pGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech),pMAL-C2,pMAL-P2(NewEngland Biolabs),pET-16,pET-32,pET-21,pET-21/lacq(Invitrogen)和pBAD/His(Invitrogen)。
当脊椎动物细胞用作宿主时，表达载体包括位于待表达的本发明基因上游具有启动子、RNA的剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列的那些。如果需要，这些载体可进一步具有复制起点。具体而言，表达载体的例子包括具有SV40早期启动子的pSV2dhfr[Mol.Cell.Biol.,1:854(1981)]。除上述之外，可利用可商购的多种公知载体。利用动物细胞用作表达系统的可商购载体的例子包括用于动物细胞的载体，诸如pEGFP-N,pEGFP-C(Clontrech),pIND(Invitrogen)和pcDNA3.1/His(Invitrogen)，以及用于昆虫细胞的载体，诸如pFastBacHT(GibciBRL),pAcGHLT(PharMingen),pAc5/V5-His,pMT/V5-His和pMT/Bip/V5-His(Invitrogen)。
作为昆虫细胞载体，可能的是举例说明其中已掺入SY-001的cDNA的杆状病毒载体(Takara)。具体而言，本发明的表达产物可通过将其中已掺入SY-001的cDNA的杆状病毒表达载体导入培养的细胞BmN4或蚕(Bombyx mori)的幼虫中，利用蚕的核型多角体病毒(BmNPV)表达，并经色谱从培养基或蚕的体液分离而获得。本发明的表达产物也可通过将SY-001的cDNA掺入到苜蓿丫纹夜蛾(Autographacalifornica)的核型多角体病毒(AcNPV)中，在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Sf9细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn5细胞中表达，并且同样经色谱从培养物的上清液纯化而获得。
当酵母细胞用作宿主时，表达载体的具体例子包括带有酸性磷酸酶基因启动子的pAM82[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,80:1(1983)]载体。用于酵母细胞的可商购表达载体的例子包括pPICZ(Invitrogen)和pPICZα(Invitrogen)。
启动子不特别受限。当属于埃希氏菌属(Escherichia genus)的细菌用作宿主时，可优选利用色氨酸(trp)启动子，lpp启动子，lac启动子，recA启动子和PL/PR启动子。当宿主属于芽孢杆菌时，优选SP01启动子，SP02启动子，penP启动子等。当酵母用作宿主时，利用pH05启动子，PGK启动子，GAP启动子，ADH启动子等可能是合适的。当动物细胞用作宿主时，优选的启动子是衍生自SV40的启动子，逆转录酶病毒启动子，金属硫蛋白启动子,热休克启动子，巨细胞病毒启动子，SRα启动子等。当昆虫细胞用作宿主时，可例举p10杆状病毒启动子，多角体蛋白启动子等。
作为SY-001的DNA分子的表达载体，优选可利用融合蛋白的表达载体。载体的具体例子包括pGEX(Promega)，用于表达成与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)一起的融合蛋白。
作为对应成熟多肽的编码序列的多核苷酸序列，其帮助多肽从宿主细胞的表达和分泌，可举例说明的是分泌序列和前导序列。这些序列包括标记序列(六组氨酸标记，组氨酸标记)，例如动物细胞情形下的血凝素标记，用于纯化细菌宿主中的融合成熟多肽。
将所需的重组DNA(表达载体)导入宿主细胞的方法，以及以此转化的方法不受特别限制，并可利用多种通用方法。
所得的转化体可根据标准方法培养，并且通过培养，在胞内或胞外或在转化体的细胞膜上表达和生产(累积和分泌)按需设计的由SY-001的DNA分子编码的目的蛋白(表达产物)。
作为用于培养的培养基，可任选不同的常用培养基。在适合宿主细胞生长的条件下，也可进行培养。
以此方式获得的本发明的表达产物(重组蛋白)，可通过多种分离操作[参见，Biochemistry Data Book II,第1175-1259页,第1版，第1次印刷，Tokyo Kagaku Dojin于1980年6月23日出版；Biochemistry,25(25),8274(1986)；Eur.J.Biochem.,163,313(1987)]，利用其所需的物理和化学性质，而分离和纯化。
这类方法具体包括通常的重排处理，蛋白沉淀剂处理(盐析),离心，渗压震扰，超声处理，超滤，多种液体层析，诸如分子筛层析(凝胶过滤)、吸收层析、离子交换层析、亲和层析和高效液相色谱(HPLC)，透析及其组合。特别优选的方法包括利用已结合了SY-001特异性抗体的柱的亲和层析。
当设计编码SY-001的多核苷酸时，可利用SEQ ID NO:2的SY-001的DNA分子的DNA序列。在该序列中，还可按需任意选择、改变和利用各氨基酸残基的密码子。
在SY-001的氨基酸序列中，当部分氨基酸残基或氨基酸序列通过取代、插入、缺失或添加而修饰时，可采用多种方法，诸如上述位点特异性突变。
(5)本发明药物组合物活性组分的本发明表达产物
本发明的表达产物(以及用于本发明筛选方法的相同表达产物)，是本发明药物组合物的活性组分，可通过上述(4)所示的基因工程技术获得。
本发明表达产物对血小板聚集的抑制活性与上文(1)所述的对SY-001的血小板聚集抑制活性的定义相同。该抑制活性可根据公知的血小板聚集测试法而确定，例如利用浊度透光率血小板聚集仪，通过富血小板血浆(PRP)的聚集测定法。
更具体而言，利用浊度透光率血小板聚集仪，在存在或缺乏SY-001下，向人血制备的PRP中加入血小板聚集剂，测量血小板聚集水平，并从其血小板聚集曲线计算SY-001的血小板聚集抑制率，从而确定和评价本发明表达产物对血小板聚集的血小板聚集抑制活性。
本发明的表达产物对血小板粘附的抑制活性与上文(1)所述的对SY-001的血小板粘附抑制活性(即，抑制血小板对胶原的粘附)的定义相同。根据公知的血小板粘附至胶原的测试法，例如利用Dc蛋白分析试剂盒(BIO-RAD Laboratories)，通过血小板粘附至胶原的测定法，能够确定该抑制活性。
更具体而言，利用Dc蛋白分析试剂盒，在存在或缺乏SY-001下，通过加入人血制备的血小板悬浮液，测量血小板与胶原的粘附水平，并从其血小板粘附曲线计算SY-001的血小板粘附抑制活性，能够确定和评价本发明的表达产物对血小板粘附至胶原的血小板粘附抑制活性。
本发明的表达产物对胶原结合的胶原结合能力与上文(1)所述的对SY-001的胶原结合能力(即，SY-001与胶原结合)的定义相同。根据公知的胶原结合的测试法，例如利用微量培养板读数仪在405-410nm处的吸光度变化，通过胶原结合能力的测定方法，能够确定该胶原结合能力。
更具体而言，利用微量培养板读数仪在405-410nm处的吸光度变化，在存在或缺乏胶原下，通过加入给定浓度的SY-001，测量SY-001的胶原结合能力的水平，并从其胶原结合曲线计算SY-001的胶原结合能力，能够确定和评价本发明的表达产物对胶原结合的胶原结合能力。
本发明的组合物基于包含本发明表达产物作为活性组分，通过本发明表达产物对血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性，可用作由血栓或栓子形成引起的疾病及其并发症之后的病理状况，所述疾病及其并发症例如，急性冠脉综合征，心肌梗塞，脑栓塞，慢性动脉阻塞，动脉硬化，缺血性脑梗塞，心绞痛，静脉血栓症，高血压，肺高压，脑梗塞，肺梗塞，心衰，肾炎，肾衰，和蛛网膜下腔出血的治疗剂或预防剂。本发明的组合物用于预防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通过在支架上施加该药物组合物或在支架自身中包埋该药物组合物从而包入该药物组合物，用作支架放置后再狭窄的预防剂。
（6）作为本发明药物组合物活性组分的SY-001的化学合成
作为本发明药物组合物的活性组分，多肽(SY-001)也可根据SEQID NO:1或3的氨基酸序列信息，通过通用的化学方法生产。所述方法包括通过常用液相方法或固相方法的肽合成方法。肽合成方法包括所谓的逐步延长方法，其中各氨基酸顺序合成，并一个接一个结合以延长链，还有片段缩合方法，其中合成包含几个氨基酸的片段，然后连接各个片段。SY-001可由任两者之一合成。
肽合成采用的缩合方法也可根据标准方法进行。标准方法的例子包括叠氮化物方法，混合酸脱水方法，DCC方法，活性酯方法，氧化和还原方法，DPPA(二苯基磷酰基叠氮化物)方法，DDC+加成(1-羟基苯并三唑，N-羟基琥珀酰胺，N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧基亚酰胺)方法和Woodward方法。
在上述肽合成反应之后，未参与反应的氨基酸或肽的羧基通常可通过酯化作用作为低级烷基酯，诸如甲酯、乙酯和叔丁酯，以及芳烷基酯，诸如苄酯、对甲氧基苄酯和对硝基苄酯被保护。
氨基酸，诸如在侧链带有官能团的酪氨酸残基，其羟基可以用乙酰基、苄基、苄氧基羰基或叔丁基保护，但并不一定总是要保护。此外，例如，精氨酸残基的胍基可以用合适的保护基保护，诸如硝基，甲苯磺酰基，对甲氧基苯磺酰基，亚甲基-2-磺酰基，苄氧基羰基，异冰片基氧基羰基，或金刚烷基氧基羰基。
作为最终获得的本发明药物组合物的活性组分，带有保护基的氨基酸、肽和多肽中的这些保护基的脱保护反应可根据常用方法进行，诸如接触还原法，以及利用液氨/钠，氟化氢，溴化氢，氯化氢，三氟乙酸，乙酸，甲酸，甲磺酸等的方法。
以此方式获得的SY-001，作为本发明药物组合物的活性组分，可任选根据多种方法纯化，诸如利用离子交换树脂、分配层析和凝胶层析的方法，以及肽化学领域中常用的逆流分布法。
(7)本发明的药物组合物
对本发明的药物组合物而言，重要的是含有SY-001或本发明的表达产物作为活性组分。所述药物组合物可用作药物组合物，尤其是用作血小板聚集抑制剂，用于抑制或阻断诱导血小板聚集的物质在人血管(尤其在冠状动脉，大动脉和脑动脉)中增加或者血小板的聚集能力在血管中得以促进的状况，或者血管中已发生损伤并且血小板在受损部位过分聚集的状况。
所述药物组合物还尤其可用作血小板粘附抑制剂，用于抑制或阻断血小板与作为聚集剂的物质的粘附，所述作为聚集剂的物质诸如胶原，其中诱导与人血管(尤其是冠状动脉，大动脉和脑动脉)中的血小板粘附的物质或血小板的粘附能力在血管中得以促进，或者用于抑制或阻断其中血管中已发生损伤并且血小板在受损部位过分聚集的状况。
本发明的药物组合物可用作治疗剂或预防剂，通过利用其对血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性，用于继血栓或栓子形成引起的疾病及其并发症之后的病理状态，所述疾病及其并发症例如，急性冠脉综合征，心肌梗塞，脑栓塞，慢性动脉阻塞，动脉硬化，缺血性脑梗塞，心绞痛，静脉血栓症，高血压，肺高压，脑梗塞，肺梗塞，心衰，肾炎，肾衰，和蛛网膜下腔出血。
鉴于SY-001预计对血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性，该药物组合物可用于预防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通过在支架上施加或包埋于支架自身从而包入该药物组合物，用于预防支架放置后的再狭窄。
SY-001或本发明的表达产物，作为本发明药物组合物中的活性组分，对血小板聚集和/或血小板粘附具有抑制活性，并通过利用该作用或活性，可用于与靶细胞或组织中的血小板聚集和/或血小板粘附有关的疾病的程序。受这种血小板聚集和/或血小板粘附影响的靶细胞的例子可包括血细胞和血小板。含这些细胞的组织的例子可包括冠状动脉血管，脑动脉血管，颈动脉血管，动脉血管，静脉血管，外周动脉血管，外周静脉血管，肾动脉血管和肝动脉血管。
根据本发明药物组合物具有的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性或抑制靶细胞中血小板聚集的作用和/或抑制血小板粘附的作用，可治疗或预防继血栓或栓子形成引起的疾病及其并发症之后的病理状态，所述疾病及其并发症例如，心肌梗塞，脑栓塞，慢性动脉阻塞，动脉硬化，缺血性脑梗塞，心绞痛，静脉血栓症，高血压，肺高压，脑梗塞，肺梗塞，心衰，肾炎，肾衰，和蛛网膜下腔出血。
根据SY-001对血小板聚集和/或血小板粘附的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，可预防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通过在支架上施加或包埋于支架自身从而包入它，预防支架放置后的再狭窄。
用于预防支架放置后的再狭窄的本发明药物组合物可用作环糊精包合物（clathrate）。也可通过在作为支架材料的生物可降解树脂上施加(厚涂或喷雾)或在包埋在支架自身中，利用本发明的药物组合物。
作为本发明药物组合物活性组分的SY-001或表达产物，也包括其可药用的盐。这种盐的例子包括无毒的碱金属盐诸如钠、钾、锂、钙、镁、钡和铵，碱土金属盐和铵盐。这些盐可依据标准方法生产。上述盐还包括通过SY-001或本发明的表达产物与合适的有机酸或无机酸反应获得的无毒的酸加成盐。代表性的无毒酸加成盐的例子包括盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，乙酸盐，草酸盐，戊酸盐，油酸盐，月硅酸盐，硼酸盐，苯甲酸盐，乳酸盐，苹果酸盐，对-甲苯磺酸盐（甲苯磺酸盐），柠檬酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，磺酸盐，乙醇酸盐，抗坏血酸盐，苯磺酸盐和萘磺酸盐。
本发明的药物组合物通过使SY-001、本发明的表达产物或其盐为活性组分，并含有药物有效量，与合适的药物载体或稀释剂一起，制成药物制剂形式。
作为用于制备药物制剂的药物载体，可举例说明的有赋形剂和稀释剂，诸如，填料，增稠剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，表面活性剂，和滑润剂。这些载体根据所得制剂的单位剂型任意选择和利用。尤其优选的药物制剂是任选利用用于通常蛋白制剂的各种成分制备的，例如，稳定剂，杀菌剂，缓冲剂，等渗剂，螯合剂，pH调节剂，表面活性剂等。
上述稳定剂的例子包括人血清白蛋白，常见L-氨基酸，糖类，和纤维素衍生物。这些可单独使用，或与表面活性剂组合使用。尤其是，通过该组合，活性组分的稳定性在某些情况下进一步提高。
L-氨基酸不特别受限，可利用甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等中的任一种。
糖类不特别受限。例如，可利用单糖，诸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖；糖醇，诸如甘露醇、肌醇和木糖醇；二糖，诸如，蔗糖、麦芽糖和乳糖；多糖，诸如，右旋糖苷、羟丙基淀粉、硫酸软骨素和透明质酸，及其衍生物。
表面活性剂不特别受限，可利用任一离子表面活性剂和非离子表面活性剂。其具体例子包括基于聚氧乙二醇山梨聚糖烷基酯、基于聚氧乙烯烷基酯、基于山梨聚糖单酰基酯、和基于脂肪酸甘油酯的表面活性剂。
纤维素衍生物不受特别限制。可利用甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，和羧甲基纤维素钠等。
上述糖类的添加量相对1μg活性组分为约0.0001mg以上，和优选约0.01-10mg。表面活性剂的添加量相对1μg活性组分为约0.00001mg以上和优选约0.0001-0.01mg。人血清白蛋白的添加量相对1μg活性组分为约0.0001mg以上和优选约0.001-0.1mg。L-氨基酸的添加量相对1μg活性组分合适的是约0.001-10mg。纤维素衍生物的添加量相对1μg活性组分为约0.0001mg以上和优选约0.001-0.1mg。
本发明药物组合物中所含的活性组分的量宽范围任意选择。适当的是制剂中活性组分的量通常约0.00001-70重量%和优选约0.0001-5重量%。
多种添加剂，诸如缓冲剂、等渗剂、和螯合剂，可添加至药物制剂中。缓冲剂的例子包括硼酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，ε-氨基己酸，谷氨酸和/或其盐(例如，碱金属盐，诸如钠、钾、钙和镁盐，以及碱土金属盐)。等渗剂的例子包括氯化钠，氯化钾，糖类和甘油。螯合剂的例子包括依地酸钠和柠檬酸。
药物制剂可制备成溶液制剂，并另可制备成通过冻干药物制剂获得的冻干剂型，该剂型通过溶解于含盐的缓冲剂以用时合适的浓度制备。
药物制剂的单位剂型可根据治疗意图任意选择。其代表性例子包括固体剂型，诸如片剂、丸药、粉末药物、粉剂、颗粒和胶囊，以及液体剂型，诸如溶液、悬浮液、乳液、糖浆和酏剂。这些根据给药途径进一步分类成口服剂、肠胃外剂、鼻用剂、阴道剂、栓剂、舌下剂、和膏剂，并可根据常用方法组合、模制和制备。如果需要，着色剂、防腐剂、香料、调味剂和甜味剂和其他药物也可包含于本发明的药物制剂中。
所述药物制剂的给药方法不受特别限制，并根据不同的剂型、患者的年龄、性别、其他病症和疾病的严重性而确定。例如，片剂，药丸，液体，悬浮液，乳液，颗粒和胶囊经口服给药。可注射剂单独或在与常见流体置换剂诸如葡萄糖和氨基酸的混合物中经静脉给药，如果需要，则经肌内、皮内、皮下或腹膜内单独给药。栓剂由直肠内给药。阴道剂经阴道给药，鼻用剂鼻内给药，舌下剂在口腔中给药，以及膏剂经皮下局部给药。
药物制剂的剂量不受特别限制，并根据所需的治疗效果、给药方法、治疗周期、患者的年龄、性别和其他病症，任意选自宽的范围。一般而言，优选的是确定剂量，使得活性组分的量通常约每kg体重每天0.01μg-10mg，优选约0.1μg-1mg。制剂可以分成每天1次至几次给药，或间歇给药。
(8)筛选促进对血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性的物质(激动剂)
本发明还提供用于筛选促进对血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性的候选化合物的方法。
所述方法的特征在于，在存在或缺乏对象物质下，对于包含SEQID NO:1或3的氨基酸序列的多肽，或包含在SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽，测量它们的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的水平；并通过比较对象物质存在下的测量值与对象物质缺乏下的测量值，选择影响血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的对象物质作为激动剂。
血小板聚集抑制作用的水平可通过血小板聚集抑制率而获得，所述血小板聚集率是从利用浊度透光率血小板聚合仪获得的测量值计算出的。更具体而言，利用带有抗凝剂的注射器，采集人血样品，并从收集的全血通过离心制备富血小板的人血浆(PRP)。将早先溶解于PBS的纯化SY-001溶液添加至PRP，然后在37°C预温育。随后，向其中加入作为血小板聚集剂的胶原溶液(由NYCOMED提供)，以聚集血小板，持续温育给定的时间段。其后，利用浊度透光率血小板聚集仪(MCMHEMA TRACER 313M：由MC Medical提供)，测量溶液的透光率，以制得血小板聚集曲线。在SY-001或SY-001＋对象物质的每种情形下，血小板聚集抑制率可从该曲线计算得到。作为上述聚集剂，除胶原之外，还可利用ADP，CRP，convulxin，TRAP，肾上腺素，花生四烯酸，U-46619，A23187等。
血小板粘附抑制活性的水平也可通过血小板粘附抑制率获得，所述抑制率从利用Dc蛋白分析试剂盒(Lowry方法Lowry,O.等，J.Biol.Chem.,193,265(1951)］BIO-RAD Laboratories)获得的测量值计算得到。更具体而言，利用带有抗凝剂的注射器，采集人血样品，并从离心全血获得的PRP制备血血小板悬浮液。将早先溶解于PBS的纯化SY-001溶液添加至涂布有胶原的96孔板，并在室温下温育30分钟。温育之后，孔中加入血小板悬浮液，并在室温下温育45分钟。温育之后，温育液用吸液管从孔中取出，并以PBS洗涤。
将含1%SDS的PBS溶液加到孔中，该孔在摇动和搅动之后风干。其后，孔中加入蒸馏水，并利用Dc蛋白分析试剂盒(BIO-RADLaboratories)测量各孔的蛋白量，SY-001的血小板粘附抑制率基于不含SY-001的对照值从获得的测量值计算，并从其血小板粘附曲线计算SY-001的血小板粘附抑制活性。在SY-001或SY-001＋对象物质的每种情形下，血小板粘附抑制率从该曲线计算得到。作为上述血小板粘附诱导剂，可利用胶原。
本发明还提供筛选增加SY-001的血小板聚集抑制活性的候选物质的方法，包括下列步骤(1)-(4)：
(1)制备培养基的步骤，所述培养基包括用SY-001的表达载体转化的细胞，以及富血小板的血浆(PRP)；
(2)在对象物质的存在或缺乏下，向上述(1)的培养基中添加血小板聚集物质，诱导血小板聚集的步骤；
(3)在上述(2)中对象物质存在下或对象物质缺乏下，测量血小板聚集抑制水平的步骤；和
(4)当对象物质存在下的测量值大于对象物质缺乏下的测量值时，筛选该对象物质作为候选物质的步骤。
本发明还提供筛选增加本发明表达产物的血小板聚集抑制作用的候选物质的方法，包括下列步骤(1)-(4)：
(1)制备培养基的步骤，所述培养基包括含本发明表达产物的细胞，以及富血小板的血浆(PRP)；
(2)在对象物质的存在或缺乏下，向上述(1)的培养基添加血小板聚集物质，诱导血小板聚集的步骤；
(3)在上述(2)的对象物质存在下或对象物质缺乏下，测量血小板聚集抑制的水平的步骤；和
(4)当对象物质存在下的测量值大于对象物质缺乏下的测量值时，选择该对象物质作为候选物质的步骤。
本发明还提供筛选测定SY-001的血小板粘附抑制活性的候选物质的方法，包括下列步骤(1)-(4)：
(1)(在孔上)制备培养基的步骤，所述培养基包括用SY-001的表达载体转化的细胞，以及涂布有血小板粘附物质(即，胶原)的孔板；
(2)在对象物质的存在或缺乏下，向上述(1)的培养基添加血小板悬浮液，诱导血小板粘附的步骤；
(3)在上述(2)的对象物质存在下或对象物质缺乏下，测量血小板粘附抑制的水平的步骤；和
(4)当对象物质存在下的测量值大于对象物质缺乏下的测量值时，选择该对象物质作为候选物质的步骤。
本发明进一步提供筛选测定本发明表达产物的血小板粘附抑制作用的候选物质的方法，包括下列步骤(1)-(4)：
(1)(在孔上)制备培养基的步骤，所述培养基包括含本发明表达产物的细胞，以及涂布有血小板粘附物质(即，胶原)的孔板；
(2)在对象物质的存在或缺乏下，向上述(1)的培养基添加血小板悬浮液，诱导血小板粘附的步骤；
(3)在上述(2)的对象物质存在下或对象物质缺乏下，测量血小板粘附抑制的水平的步骤；和
(4)当对象物质存在下的测量值大于对象物质缺乏下的测量值时，选择该对象物质作为候选物质的步骤。
本发明的筛选方法可通过实际应用高通量筛选技术而实施。根据该技术在例如，筛选血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的加速剂中的实际应用，在存在或缺乏待筛选的对象物质下，将带有合成反应混合物、细胞级分、和血液级分例如富血小板的血浆或血小板悬浮液中任一种的制剂(包括SY-001和该多肽的标记配体)温育。通过结合的标记配体的降低而检测对象物质是激动SY-001的作用还是拮抗SY-001的作用。SY-001的活性水平可通过比色标记的报道系统(不限于此)、掺入对多核苷酸或多肽的活性变化负责的报道基因、或本领域公知的结合分析而检测。
下述竞争性分析可用于筛选候选化合物作为血小板聚集抑制活性的加速剂，在所述竞争性分析中，SY-001或其他变体[例如，SY-001(151-269),SY-001(21-269)]以及其他血小板聚集抑制剂(例如，乙酰水杨酸，西洛他唑(cilostazol))同与它们结合的化合物相组合。
下述竞争性分析可用于筛选候选化合物作为血小板粘附抑制活性的加速剂，在所述竞争性分析中，SY-001或其他变体[例如，SY-001(151-269),SY-001(21-269)]以及其他血小板粘附抑制剂(例如，噻氯匹定(Ticlopidine))同与它们结合的化合物相组合。
通过本发明筛选方法筛选的对象物质(候选化合物)极可能是SY-001的激动剂，作为血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的加速剂。
激动剂可以是在本发明的筛选系统中，其存在下测量的增强血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的物质。
这些对象物质的具体例子包括寡肽，蛋白，抗体，RNA分子，siRNA，非肽化合物(合成化合物)，发酵产物，细胞提取物(植物提取物，动物提取物)和血浆。这些物质可以是那些新开发的或已知的物质。
血小板聚集抑制物质和/或血小板粘附抑制物质的例子包括无机或有机低分子化合物，天然发生或合成的肽和多肽，或通过基因重组技术制备的肽和多肽，这些物质通过与SY-001的结合增强SY-001的活性。用于编码SY-001的DNA分子、直接体内给药、或以插入重组载体的形式给药的有义DNA分子，也包括在上述血小板聚集抑制物质和/或血小板粘附抑制物质中。
根据本发明筛选方法筛选的具有活性来增强血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的候选物质评价如下。即，与对照(缺乏对象物质)比较，增加或促进血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性约20%以上，优选约30%以上，和更优选约50%以上的候选物质可被评价为促进血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的化合物。
促进血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的化合物被认为可用作继血栓或栓子形成引起的病症及其并发症之后的病理状态的治疗剂或预防剂，所述病症及其并发症例如，心肌梗塞，脑栓塞，慢性动脉阻塞，动脉硬化，缺血性脑梗塞，心绞痛，静脉血栓症，高血压，肺高压，脑梗塞，肺梗塞，心衰，肾炎，肾衰，和蛛网膜下腔出血。
在通过本发明筛选方法获得的促进血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的物质中，据推想还有自身就具有抑制由血小板聚集物质体内诱导的血小板聚集、和/或抑制由血小板粘附物质体内诱导的血小板粘附的活性的物质，此种物质被认为可用作多种领域、包括药物领域中的血小板聚集抑制剂和/或血小板粘附抑制剂。
(9)筛选试剂盒
本发明能提供用于筛选SY-001的激动剂的试剂盒，其特征在于，包含富血小板的血浆、SY-001(包括本发明表达产物)、以及血小板聚集剂作为组成成分。
本发明的筛选试剂盒包含(1)SY-001(例如，具有SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的多肽)或本发明的表达产物(例如，编码SY-001的DNA分子的、SEQ ID NO:2或4的DNA序列的表达产物)，(2)包含富血小板血浆的细胞培养基，以及(3)血小板聚集剂作为必要成分。与此种类型的筛选试剂盒类似，试剂盒可包含多种试剂，诸如细胞培养基，反应稀释剂，染色剂，缓冲剂，固定液和洗涤液，作为其他任选成分。
本发明试剂盒的具体例子包括那些含下列组分1-3的试剂盒：
组分1：细胞(表达SY-001的细胞，培养细胞，包括用编码SY-001的多核苷酸(DNA分子)转化的大肠杆菌细胞或昆虫细胞)，利用含EGTA-Na的MOPS缓冲液，在5%CO2和37°C下以0.5-1×105细胞/孔在60mm培养皿中培养；
组分2：诱导血小板聚集的物质(例如，胶原，ADP)；和
组分3：富血小板的血浆。
在利用本发明筛选试剂盒的筛选方法中，血小板聚集抑制率在富血小板的血浆中以孔的每孔单位视野检测，在所述孔中已加入测试物质(对象物质，药物候选物质)。接着，血小板聚集抑制率在未加入测试物质的孔中检测。随后，测试前者抑制率和后者抑制率之间的显著差异。这些测量和评价可根据标准方法实施。
本发明也可提供筛选SY-001激动剂的试剂盒，其特征在于，含有血小板粘附剂(即，胶原)、SY-001(包括本发明的表达产物)以及血小板悬浮液作为组分。
本发明的筛选试剂盒包含(1)SY-001(例如，具有SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的多肽)或本发明的表达产物(例如，编码SY-001的DNA分子SEQ ID NO:2或4的DNA序列的表达产物)，(2)血小板粘附物质(即，胶原)，以及(3)血小板悬浮液作为必要成分。与此种类型的筛选试剂盒类似，该试剂盒可包含多种试剂，诸如细胞培养基，反应稀释剂，染色剂，缓冲剂，固定液和洗涤液，作为其他任选成分。
本发明试剂盒的具体例子包括那些含下列组分1-3的试剂盒：
组分1：细胞(表达SY-001的细胞，培养细胞，包括用编码SY-001的多核苷酸(DNA分子)转化的大肠杆菌细胞或昆虫细胞)，利用PBS缓冲液，在5%CO2和37°C下以0.5-1×105细胞/孔在60mm培养皿中培养；
组分2：诱导血小板粘附的血小板粘附物质(例如，胶原，ADP)；和
组分3：血小板悬浮液。
在利用本发明筛选试剂盒的筛选方法中，血小板粘附抑制率以孔的每孔单位视野的血小板对胶原的粘附水平检测，在所述孔中已加入测试物质(对象物质，药物候选物质)。接着，血小板粘附抑制率在未加入测试物质的孔中检测。随后，测试前者抑制率和后者抑制率之间的显著差异。这些测量和评价可根据标准方法实施。
实施例
本发明将参照下列实施例更详细描述。这些实施例仅用于举例说明，并不限制本发明。
<实施例1>
1.从斯氏按蚊唾液腺制备cDNA文库
使羽化后3-7天的雌性斯氏按蚊(SDA500品系)吮吸小鼠(购自CLEA Japan Inc.的BALB/c品系)的血。从吮吸血液后6小时的蚊子取下翅、足、头部和腹部，仅将包括唾液腺的胸部存储在液氮中。在收集了300个蚊子的胸部时，利用RNeasy Midi试剂盒(QIAGEN)抽提RNA。通过收集添加Poly A的RNA，利用反转录酶制备cDNA，在两端处添加限制性酶切位点(EcoRI和HindIII位点)，并掺入λSCREEN-1克隆试剂盒(Novagen)而制备文库。
2.免疫筛选唾液腺的cDNA文库
大肠杆菌(ER-1647,Takara)用上述文库的各个噬菌体感染，并利用抗-斯氏按蚊唾液腺抗体作为探针进行筛选。抗斯氏按蚊唾液腺抗体通过用斯氏按蚊唾液腺与弗氏佐剂的匀浆一起免疫兔子而制备。
通过筛选获得的阳性克隆感染至大肠杆菌ER-1647并扩增。然后，取出噬菌体，利用CreMediated质粒切除(CreMediated Plasmid Excision,Novagen)，将插入部分克隆至质粒pSCREEN-1b(+)(Novagen)。插入部分的碱基序列利用在pSCREEN的两端添加的DNA部分(SP6启动子引物：SEQ ID NO:10，产品编号TKR3867,Takara Bio,和T7终止子引物：SEQ ID NO:11，产品编码NV432,Novagen)，用ABI提供的310基因分析仪(Genetic Analyzer)进行测序。
碱基序列分析的结果，发现克隆的基因片段含有终止密码子，但是缺失起始密码子。为了获得SY-001cDNA缺失的5’区，利用抽提自唾液腺cDNA文库的λ筛选噬菌体DNA作为模板，并且利用引物、SP6启动子引物(SEQ ID NO:10)和SEQ ID NO:12的pAnS-1引物，进行5'-RACE方法[Frohman,M.A.等，PNASC,8,8998-9002(1988)]，克隆约470bp的DNA片段。该DNA片段与上述筛选所得的DNA片段重叠，并进一步含有起始密码子。两个DNA片段连接，以确定编码SY-001的DNA分子的整个碱基序列。
cDNA中发现的ORF编码28.5kDa推导蛋白的269个氨基酸残基，并含有807bp。该蛋白预测是作为唾液分泌的蛋白，因为从推导的氨基酸序列预测出该蛋白是pI=3.8的酸性蛋白，N端的21个氨基酸残基是疏水性的，并显示信号肽样序列，并且C端没有膜锚定区。
该推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO:5中。编码氨基酸序列的DNA分子的碱基序列示于SEQ ID NO:6。
3.通过重组DNA表达SY-001及其纯化
(1)生产SY-001(22-269)
编码SY-00122-269位氨基酸残基(SEQ ID NO:5)的DNA片段通过PCR扩增。上述1所示的唾液腺cDNA用作模板。所用的引物pAnSG-F7(SEQ ID NO:13)在从5’端的第3至第8位具有NcoI位点(CCATGG)，并且所用的引物pAnSG-R1(SEQ ID NO:14)在从5’端的第2至第9位具有NotI位点(GCGGCCGC)。然后，将该DNA片段克隆至pENTR/D-TOPO(Invitrogen)，以构建质粒pENTR-SY-001-外显子1-4。
随后，用NcoI和NotI切割pENTR-SY-001-外显子1-4所得的SY-001DNA片段(约760bp)插入pET32-b(+)(Novagen)的NcoI/NotI位点，以构建质粒pET32-SY-001-外显子1-4。
用该pET32-SY-001-外显子1-4转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)，所得的转化体37°C下振荡培养在6mL含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基(LBA)中15小时。然后，将培养基加到600mL LBA中，之后在37°C下振荡培养4小时。随后，向培养基中加入6mL 100mM IPTG，37°C下进一步振荡培养4小时。所得培养基以6,000×g离心15分钟，除去上清液。所得沉淀通过向其加入40mL6M盐酸胍而裂解。所得细菌溶液以30,000×g离心25分钟，收集上清液。向其中加入1.8mL Ni-NTA(QIAGEN)，然后4°C下搅拌15小时。混合物以3,000×g离心3分钟，除去上清液，并收集Ni-NTA。向收集的Ni-NTA加入含有10mM咪唑的6M尿素-TBS溶液(6M尿素，150mM NaCl，50mM Tris-HCl[pH7.5])。所得混合物以3,000×g离心3分钟，除去上清液。所得Ni-NTA装填至柱子中。
SY-001外显子1-4蛋白从柱子上如下洗脱。即，2mL含有20mM、50mM、100mM和200mM咪唑的6M尿素-TBS溶液分别按序流过柱子，并收集相应级分。各级分的部分在12%SDS-PAGE上电泳，然后用考马斯染色来确定含有SY-001外显子1-4蛋白的级分。该级分对PBS透析48小时。蛋白量利用BCA蛋白分析试剂盒(PIERCE)定量，产量为5.0mg。
以此方式获得的重组蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:7。1-162位的氨基酸序列和410-420位的氨基酸序列分别是衍生自硫氧还蛋白和含有His标记序列的pET32-b(+)的氨基酸序列。本发明的SY-001的氨基酸序列(22-269)位于162-409位。
(2)生产SY-001(148-269)
利用引物pAnSG-F8(SEQ ID NO:15)和pAnSG-R1(SEQ IDNO:14)，以上述(1)制备的pET32-SY-001外显子1-4作为模板进行PCR。所得DNA片段(382bp)克隆至pENTR/D-TOPO(Invitrogen)中，以构建质粒pENTR-SY-001外显子3-4。质粒pENTR-SY-001外显子3-4用NcoI/NotI切割，从而获得372bp的DNA片段。该片段插入pET32(b)+(Novagen)的NcoI/NotI位点，以构建质粒pET32-SY-001外显子3-4。
用上述获得的pET32-SY-001-外显子3-4转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)，所得转化体37°C下振荡培养在6mL含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基(LBA)中15小时。然后，将培养基加到600mL LBA中，之后37°C下振荡培养4小时。随后，向培养基中加入6mL 100mM IPTG，37°C下进一步振荡培养4小时。所得培养基以6,000×g离心15分钟，除去上清液。所得沉淀通过加入40mL 6M盐酸胍而裂解。所得细菌溶液以30,000×g离心25分钟，收集上清液。向其中加入1.8mL Ni-NTA(QIAGEN)，然后4°C下搅拌15小时。混合物以3,000×g离心3分钟，除去上清液，并收集Ni-NTA。向收集的Ni-NTA加入含有10mM咪唑的6M尿素-TBS溶液(6M尿素，150mM NaCl，50mM Tris-HCl[pH7.5])。所得混合物以3,000×g离心3分钟，除去上清液。所得Ni-NTA装填至柱子中。
SY-001外显子3-4蛋白从柱子上如下洗脱。即，2mL分别含有20mM、50mM、100mM和200mM咪唑的6M尿素-TBS溶液按序流过柱子，并收集相应级分。各级分的部分在12%SDS-PAGE上电泳，然后用考马斯染色来确定含有SY-001外显子3-4蛋白的级分。该级分对PBS透析48小时。蛋白量利用BCA蛋白分析试剂盒(PIERCE)定量，产量为1.8mg。
以此方式获得的重组蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:8，并具有含293个氨基酸残基的氨基酸序列。在此氨基酸序列中，1-160位的氨基酸序列和283-293位的氨基酸序列分别是衍生自硫氧还蛋白和含有His标记序列的pET32-b(+)的氨基酸序列。SY-001的氨基酸序列(148-269)位于161-282位。
实施例2
利用杆状病毒表达系统生产重组SY-001(21-269)
(1)生产杆状病毒SY-001(21-269)
编码SY-00121-269位的多肽(SEQ ID NO:1)的DNA片段利用实施例1.1所示的唾液腺cDNA作为模板通过PCR扩增。所用引物pAnSG-F10(SEQ ID NO:16)在5’端的第5至第10位点具有BamHI位点(GGATCC)和在第12位G至第41位A具有FLAG序列。所用引物pAnSG-R1(SEQ ID NO:14)在5’端第2至第9位点具有NotI位点(GCGGCCGC)。将DNA片段克隆至pENTR/D-TOPO(Invitrogen)，以构建质粒pENTR-SY-001-外显子1-4。
随后，用BamHI/NotI切割pENTR-SY-001-外显子1-4获得的SY-001片段(780bp)插入pBACgus-1(Novagen)的BamHI/NotI位点，以构建杆状病毒转移载体质粒pBACgus-SY-001-外显子1-4。
利用重组杆状病毒制备试剂盒(BacVector-2000转染试剂盒，Novagen)，用上述杆状病毒转移载体质粒pBACgus-SY-001-外显子1-4和BacVector-2000DNA共转染Sf9细胞，制备重组杆状病毒。制备的重组杆状病毒命名为AcNPV-SY-001-外显子1-4。
即，Sf9细胞以1×107个细胞/150mm陪替氏培养皿培养，在感染复数约5时用AcNPV-SY-001-外显子1-4感染。3-4天后，从10个150mm陪替氏培养皿收集约250mL培养上清液，向其中加入1.5mLNi-NTA(QIAGEN)，然后4°C下搅拌15小时。混合物以3,000×g离心3分钟，弃去上清液。收集Ni-NTA，向其中加入50mL含10mM咪唑的TBS溶液(150mM NaCl,50mM Tris-HCl[pH7.5])。所得混合物进一步以3,000×g离心3分钟，弃去上清液。所得Ni-NTA装填在柱子中。
SY-001外显子1-4蛋白从柱子如下洗脱。即，2mL分别含有20mM、50mM、100mM和200mM咪唑的TBS溶液按序流过柱子，并收集相应级分。各级分的部分在12%SDS-PAGE上电泳，然后用考马斯染色来确定含有SY-001外显子1-4蛋白的级分。该级分对PBS透析48小时。蛋白量利用BCA蛋白分析试剂盒(PIERCE)定量，产量为0.8mg。
以此方式获得的重组蛋白SY-001的氨基酸序列(21-269)示于SEQID NO:9。在此氨基酸序列中，1-10位的序列为FLAG序列，11-259位的氨基酸序列为SY-001的序列(21-269)，以及260-270位的序列为衍生自pBACgus-1、含有His标记序列的序列。
实施例3
利用浊度透光率血小板聚集仪，通过测量富血小板的血浆(PRP)中的血小板聚集，评价SY-001对血小板聚集的抑制作用。
方法概要如下。即，首先，利用带有抗凝剂的注射器，从健康供体采集血样，通过离心采集的全血，制备富血小板的血浆(PRP)。制备的PRP与SY-001溶液[PBS溶液，其中已溶解实施例1.3-(1)制备的具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的SY-001]或作为对照的PBS混合并预温育，随后加入血小板聚集剂使血小板聚集。作为血小板聚集剂，分别采用ADP(Sigma提供)，胶原(NYCOMED提供)，CRP(Peptide InstituteInc.提供)，convulxin(Alexis提供)，TRAP(Sawaday Technology Co.提供)，肾上腺素(Daiichi Pharmaceutical Co.,Ltd.提供)，花生四烯酸(Sigma提供)，U-46619(Cayman提供)或A23187(Sigma提供)。
接着，血小板聚集率利用浊度透光率血小板聚集仪(MCM HEMATRACER 313M：MC Medical提供)测量5分钟，并在5分钟测量中获得最大聚集率。SY-001的血小板聚集抑制率(%)根据下式计算。
血小板聚集抑制率(%)=(1-As/Ac)×100
As：带有SY-001的PRP中最大血小板聚集率
Ac：仅PRP作为对照中最大血小板聚集率
上述操作的细节如下列(a)-(c)所示。
(a)首先，利用带有6mL 3.8%柠檬酸钠作为凝血剂（coagulant）的注射器，从健康供体采集60mL血液。随后，该血液以1,100rpm离心10分钟，将上层富含人血小板的血浆(PRP)层转移至另一个试管。剩余的下层部分以3,000rpm离心10分钟，所得上层清亮黄色层(贫血小板的血浆，PPP)转移至另一个试管。混合上述得到的PRP和PPP，制备血小板数已经调节到3×108/mL的混合物，并用于随后的测量中。该混合物在下列测量中称作“PRP测量样品”。
设定血小板聚集仪的血小板聚集率，使得PPP的透光率为100%的血小板聚集率，而PRP的透光率为0%的血小板聚集率。
(b)确定胶原浓度和测量血小板聚集抑制活性
首先，已加入200μL不含SY-001的PRP测量样品的聚集管放置在血小板聚集仪中，并在37°C下温育2分钟。随后，向其中加入22.2μL胶原溶液(NYCOMED GmBH,Moriya Sangyo提供)，血小板聚集率在37°C下持续测量5分钟。5分钟内最高的血小板聚集率为最大血小板聚集率。在胶原溶液中，采用5-20μg/mL浓度(PRP测量样品中的终浓度为0.5-2μg/mL)作为次最大浓度，此时诱导了最大血小板聚集率的70%。
(c)接着，(i)分别制备30nM、100nM和300nM的SY-001(22-269)[具有实施例1，3-(1)制备的SEQ ID NO:7的氨基酸序列]，(ii)分别制备100nM、300nM和1000nM的SY-001(148-269)[具有实施例1，3-(2)制备的SEQ DI NO:8的氨基酸序列]或(iii)PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,8.1mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4)作为对照，加入到已加入200μL PRP测量样品的各管中。各混合物放置在血小板聚集仪中，37°C下温育2分钟。随后，向其中加入22.2μL上述确定的给定浓度的胶原溶液，血小板聚集率自加入起测量5分钟。
通过胶原刺激诱导的SY-001(22-269)的血小板聚集抑制活性的结果示于图1。通过胶原刺激诱导的SY-001(148-269)的血小板聚集抑制活性的结果示于图2。
在各图中，水平轴代表自加入胶原前30秒的时程(-0.5至5分钟)，而纵轴代表血小板聚集率(%)。
在图1中，曲线(1)显示加入300nM浓度SY-001(22-269)的情形下的结果，曲线(2)显示SY-001(22-269)100nM时的结果，曲线(3)显示SY-001(22-269)30nM浓度时的结果，以及曲线(4)显示对照的结果。
在图2中，曲线(1)显示以1000nM浓度加入SY-001(148-269)情形下的结果，曲线(2)显示SY-001(148-269)300nM时的结果，曲线(3)显示SY-001(148-269)100nM时的结果，以及曲线(4)显示对照的结果。
从这些图所示结果显而易见的是，已经显示随着添加量增加，本发明的SY-001减少通过胶原刺激诱导的血小板聚集，即，SY-001具有血小板聚集抑制活性。
利用实施例2的杆状病毒表达系统生产的重组蛋白SY-001(21-269)，进行与上述相同的试验。结果得到与图1所示基本相同的结果。因此，显然，本发明的SY-001显然具有血小板聚集抑制活性。
在利用上述SY-001(21-269)的试验中，通过将SY-001(21-269)的浓度从3nM改变到1000nM，获得血小板聚集率。然后，利用SAS软件(SAS Institute,Japan,Release 8.1)，对SY-001(21-269)的血小板聚集抑制活性(IC50)进行log-logit分析。结果，SY-001(21-269)的IC50计算为25nM。
从上述结果，已推测出，在SEQ ID NO:5的SY-001的氨基酸序列148和269位之间，存在于C端侧的抗原表位部分可能有助于本发明SY-001的血小板聚集抑制活性。
实施例4
合成SY-001变体
通过固相合成方法，利用Fmoc(9-芴甲氧羰基)法，SY-001合成如下。
具有从SEQ ID NO:5的氨基酸序列的N端至C端的所需数目氨基酸残基的合成多肽，可利用TBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯]和HOBt[1-羟基苯并三唑水合物]作为活性剂，通过连续流模式反应而获得。
如果需要，可将所得的合成多肽溶解于二甲基亚砜，并进一步以乙腈稀释。
制剂实施例1
(1)制备本发明药物组合物的可注射制剂是在0.01M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中加入并混合100μg/mL SY-001(具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列)、0.01mg/mL Tween 80(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯；聚山梨醇酯80)、15mg/mL右旋糖苷40、0.1mg/mL半胱氨酸和1.0mg/mL HSA(人血清白蛋白)，(利用0.22μm过滤膜)过滤混合物，然后无菌分配过滤液，每小瓶1mL，并冷冻干燥。该制剂使用时可通过溶解于1mL盐水中使用。
(2)制备本发明药物组合物的可注射制剂是在每瓶注射用蒸馏水中加入10μg/0.1mL SY-001(具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列)，5mg半胱磺酸和1mg人血清白蛋白(HSA)，每瓶过滤所得溶液1mL，并冷冻干燥。
SY-001对血小板粘附至胶原的作用
将3,10,30,100,300,1000 or 3000nM的SY-001溶液(50μL)添加至涂布有40μg/mL胶原(NYCOMED GmBH)的96-孔板，并在室温下温育30分钟。温育之后，向各孔加入50μL血小板悬浮液(6×108/mL细胞)，并在室温下温育45分钟。温育之后，用吸液管取出各孔中的溶液，并以200μL PBS洗孔。随后，向各孔加入20μL含有1%SDS的PBS，接着振荡搅动并在45°C下风干。其后，向各孔加入5μL蒸馏水，利用Dc蛋白分析试剂盒(BIO-RAD)测量孔中的蛋白浓度。
结果示于图3。
如图3所示，经鉴定，本发明的SY-001以剂量依赖方式抑制血小板对胶原的粘附，尤其在剂量300μg/mL以上时，SY-001显示对血小板粘附的有效抑制作用。
SY-001与胶原的结合能力
向涂布有胶原的96-孔板(NUNC，152038)或未涂布的96-孔板(NUNC，260895)的各孔中加入封闭溶液(300μL)，室温下温育1小时。取出各孔中的溶液，并向各孔加入100μL的3,10,30,100or 300nMSY-001蛋白溶液，室温下温育1小时。取出各孔溶液，向孔中加入200μL 2%蔗糖，室温下温育5分钟。取出各孔溶液，干燥孔。随后，向各孔加入100μL重构的Ni-HRP溶液(ExpressDetector Nickel-HRP，KPL)，室温下温育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤之后，向各孔加入100μL ABTS过氧化物酶底物，轻轻振荡混合。反应终止后，加入100μL 1%SDS，利用微量培养板读数仪测量波长405-410nm处的吸光度。
结果示于图4。三角形代表作为对照的空载体的反应曲线。如图4所示，经鉴定，SY-001对胶原具有结合能力。
如上所述，可以鉴定，本发明的SY-001不仅对血小板聚集具有抑制作用，而且对血小板与胶原的粘附具有抑制作用。还能鉴定，本发明的SY-001对胶原具有结合能力。
从这些结果可以看出，包含本发明的SY-001作为活性组分的药物组合物可以是有用的药物组合物，作为心肌梗塞，肺栓塞，脑梗等的治疗剂和预防剂。
重组SY-001的血小板粘附抑制作用和胶原结合能力
图3：SY-001抑制血小板与胶原的粘附。
图4：SY-001具有对胶原的结合能力。
序列表自由内容
SEQ ID NO:10代表SP6启动子引物序列，SEQ ID NO:11代表T7终止子引物序列，SEQ ID NO:12代表pAnS-1引物序列，SEQ ID NO:13代表pAnSG-F7引物序列，SEQ ID NO:14代表pAnSG-R1引物序列，SEQ ID NO:15代表pAnSG-F8引物序列，以及SEQ ID NO:16代表pAnSG-F10引物序列。
工业实用性
根据本发明，可提供含有SY-001或本发明表达产物作为活性组分的药物组合物。本发明的组合物据认为可用作治疗剂或预防剂，用于继各种疾病之后的病理状况，所述疾病例如由血栓或栓子引起的疾病和并发症，例如急性冠脉综合征，心肌梗塞，脑栓塞，慢性动脉阻塞，动脉硬化，缺血性脑梗塞，心绞痛，静脉血栓症，高血压，肺高压，脑梗塞，肺梗塞，心衰，肾炎，肾衰，和蛛网膜下腔出血，其中涉及SY-001和编码SY-001多肽的多核苷酸(DNA分子)。
此外，本发明的组合物据认为可用于预防PTCA和支架放置后的血栓形成，并且通过在支架上施加SY-001或在支架本身中包埋SY-001而包入SY-001，用于预防支架放置后的再狭窄。
通过利用由本发明提供的SY-001和编码SY-001的DNA分子，可筛选用于多肽或DNA分子的表达产物(本发明的表达产物)的激动剂，即，筛选具有下列活性的物质作为候选化合物：促进这些蛋白对血小板聚集和/或血小板粘附的固有抑制活性。
Claims (5)
1.分离的多肽，其由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
2.分离的多核苷酸，其由SEQ ID NO:4的DNA序列或其互补序列组成。
3.药物组合物，其包含作为活性组分的权利要求1的多肽，以及药物载体。
4.药物组合物，其包含作为活性组分的重组多肽，以及药物载体，所述重组多肽由SEQ ID NO:4的DNA序列组成的多核苷酸表达。
5.权利要求3或4的药物组合物，其中药物组合物用作血小板聚集抑制剂。
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