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CN102918150A - α-淀粉酶 - Google Patents

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CN102918150A
CN102918150A CN2011800122319A CN201180012231A CN102918150A CN 102918150 A CN102918150 A CN 102918150A CN 2011800122319 A CN2011800122319 A CN 2011800122319A CN 201180012231 A CN201180012231 A CN 201180012231A CN 102918150 A CN102918150 A CN 102918150A
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alpha
amino acid
leu
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C.安德森
T.A.波尔森
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Novozymes North America Inc
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Novozymes AS
Novozymes North America Inc
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Abstract

本发明涉及α-淀粉酶变体，编码所述变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用所述变体酶的方法。

Description

α-淀粉酶
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有改进性质，例如，改进的稳定性的α-淀粉酶变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法，和使用所述变体的方法。
相关领域描述
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)由一组酶组成，其催化淀粉和其它直链和支链1,4-糖苷寡糖和多肽的水解。
α-淀粉酶商业上用于多种目的如在淀粉加工的初始阶段(例如，液化)；在湿磨过程中；和在由糖源产生醇的过程中。它们也用作洗涤剂或洗涤剂基质中的助剂；在纺织业中用于淀粉脱浆；用于烘焙应用中；用于饮料产业；在油田中用于钻探过程中；用于循环过程，例如纸张脱墨；和用于动物饲料。
首先使用的一种细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，也称作TermamylTM，其已经得到广泛表征并已经确定了该酶的晶体结构。碱性淀粉酶，如源自芽孢杆菌属菌种菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513和DSM9375(披露于WO 95/26397中)的α-淀粉酶，形成了用于洗涤剂的特定的α-淀粉酶组。已经对很多这些已知的细菌淀粉酶进行了修饰，以改进它们在具体应用中的功能性。
TermamylTM和很多高效α-淀粉酶的活性都需要钙。TermamylTM的晶体结构显示三个钙原子通过带负电荷的氨基酸残基配位结合于α-淀粉酶结构。对于钙的需要在存在强螯合化合物的应用，如在洗涤剂或从全谷物产生乙醇的过程中是缺点，在这些过程中植物材料包含大量天然螯合剂如肌醇六磷酸。
已知钙不敏感淀粉酶，例如，EP 1022334和WO 03/083054中披露的α-淀粉酶，和具有UNIPROT:Q03657中所披露序列的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)α-淀粉酶。
因此提供钙敏感性降低的α-淀粉酶是有益的。
发明内容
本发明提供包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性。
本发明提供包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的C-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性。
本发明还涉及编码α-淀粉酶变体的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，和产生亲本α-淀粉酶的变体的方法。
本发明还涉及所述变体在淀粉加工(例如，液化)；湿磨过程；由糖源产生醇；洗涤剂；餐具洗涤组合物；纺织业中的淀粉脱浆；烘焙应用；饮料工业；油田钻探过程；循环过程，例如，用于纸张脱墨，和动物饲料中的用途。
附图简述
图1显示SEQ ID NO:1-16、29和30的比对。
发明详述
本发明提供包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域的α-淀粉酶变体，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性。
本发明还提供包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域的α-淀粉酶变体，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的C-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性。
定义
A、B和C-结构域：α-淀粉酶的结构包含三个不同的结构域A、B和C，参见，例如，Machius等,1995,J.Mol.Biol.246:545-559。术语“结构域”指多肽的区域，其自身形成整个分子的独特而独立的亚结构。α-淀粉酶由携带活性位点的β/α-8桶状结构，其记为A-结构域；β-片层3和α-螺旋3之间相当长的环状结构，其记为B-结构域；和C-结构域组成，并且在某些情况下还包含糖结合域(例如，WO2005/001064；Machius等，见上文)。
α-淀粉酶的结构域可以通过结构分析，如使用结晶技术确定。用于确定α-淀粉酶的结构域的一种可选方法是将α-淀粉酶的氨基酸序列与结构域已确定的另一种α-淀粉酶进行序列比对。与例如已经确定了B-结构域的α-淀粉酶中的B-结构域序列对齐的序列可以视为给定α-淀粉酶的B-结构域。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)由一组酶组成，其催化淀粉和其它直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
钙不敏感淀粉酶指对于最佳活性和/或保持活性构型/结构不需要钙的存在的α-淀粉酶。
钙敏感淀粉酶指需要钙的存在而保持其结构和/或具有完全酶活性的α-淀粉酶。对于一些钙敏感淀粉酶而言，已经显示它们在活性构型中包含与酸性氨基酸残基配位的钙原子。已知大量钙敏感α-淀粉酶，并且由于其有益的性质已经在工业上使用。钙敏感α-淀粉酶通常对于导致在其结构中配位的钙原子丢失的条件(如洗涤剂组合物和燃料物质)敏感。
钙敏感性可通过如下确定：在存在强螯合剂的情况下温育α-淀粉酶，并分析这种温育对α-淀粉酶的活性或稳定性的影响。在存在螯合剂的情况下钙敏感α-淀粉酶较不稳定或者在温育过程中丢失大部分或全部活性，而钙不敏感α-淀粉酶在温育过程中不丢失其全部活性或仅丢失少部分活性。可以使用本领域已知的方法评价螯合剂强度，如Nielsen等,2003,Anal.Biochem.314:227-234；和Nagarajan和Paine,1984,J.Am.Oil Chem.Soc.61(9):1475-1478中所披露的方法。可用于这种测定法的强螯合剂的实例是EGTA(乙二醇四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、DTMPA(二亚乙基三胺-五-亚甲基膦酸)和HEDP(1-羟基乙-1,1-二基双膦酸)。可以使用其它强螯合剂确定α-淀粉酶的钙敏感性。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明变体的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸编码区的连接。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。
改进的性质：术语“改进的性质”指与变体相关的特性，所述特性与其它α-淀粉酶相比得到改进。这种改进的性质包括，但不限于，改变的温度依赖性活性概貌，热稳定性，pH活性，pH稳定性，底物特异性，产物特异性，和化学稳定性。
分离的变体：术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然相关的至少一种组分移出的多肽或多核苷酸。举例而言，变体如通过SDS-PAGE测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本领域中已知宿主细胞可产生两种或更多种由相同多核苷酸表达的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。
亲本：术语“亲本”α-淀粉酶指对其进行改变而产生本发明的变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽，或者其变体，通过任何适当的手段制备。例如，亲本多肽可以是天然存在的多肽的变体，其具有修饰或改变的氨基酸序列。亲本还可以是等位变体。
多肽片段：术语“多肽片段”指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面，片段包含至少481个氨基酸残基，例如，至少483，至少486，和至少493个氨基酸残基。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOS S:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段。
变体：术语“变体”意指具有α-淀粉酶活性的多肽，其包含改变，即在一个或多个(几个)位置的取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基。取代意指用不同的氨基酸取代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指邻接于占据某位置的氨基酸添加一个或多个(几个)氨基酸，例如1-5个氨基酸。
野生型：术语“野生型”意指由天然存在的微生物，如自然界中的细菌、酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。
变体的命名规则
就本发明而言，除非另外指出，否则使用SEQ ID NO:27中披露的杂合多肽(其具有嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:4)的氨基酸1-104，之后是环状芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:13)的氨基酸103-208，之后是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:4)的氨基酸211-515的序列)确定在另一个α-淀粉酶中对应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:27中披露的成熟多肽比对，并且根据比对结果，可以使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序，优选3.0.0版本或更新版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定与SEQ ID NO:27中披露的成熟多肽中任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。
可使用“ClustalW”(Larkin等,2007,Bioinformatics 23:2947-2948)通过多个多肽序列的比对来确认另一种α-淀粉酶中相应氨基酸残基的鉴定。
当其它酶与SEQ ID NO:27的成熟多肽差异较大从而传统的基于序列的比较不能检测它们之间的关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可以使用其它逐对序列比较算法。使用利用多肽家族(谱)的概率代表搜索数据库的搜索程序，可在基于序列的搜索中获得更高的灵敏度。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程产生谱，并且能检测关系较远的同源物(Atschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。如果多肽家族或超家族在蛋白质结构数据库中有一个或多个(几个)代表，则可以实现甚至更高的灵敏度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)利用来自多种来源的信息(PSI-BLAST，二级结构预测，结构比对谱，和溶解势)作为神经网络的输入，所述网络可预测所查询序列的结构折叠。类似地，可以使用Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法比对未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型。然后可以使用这些比对结果产生多肽的同源性模型，并且可以使用专门开发的多种工具评价这类模型的精确度。
对于已知结构的蛋白质，几种工具和资源可用于获取和产生结构比对。例如，已经比对了蛋白质的SCOP超家族的结构，并且这些比对结果可以获取和下载。可以使用多种算法，如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Eng.11:739-747)比对两个或更多个蛋白质的结构，并且执行这些算法还能用于查询具有目的结构的结构数据库以发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics 16:566-567)。可以使用这些结构比对在相同的结构超家族内的蛋白质中预测结构和功能上相应的氨基酸残基。这种信息，连同来自同源性建模和谱搜索的信息，可以用于预测在将感兴趣的突变从一个蛋白质移动至关系接近或遥远的同源物时要突变哪些残基。
在描述本发明的各种α-淀粉酶变体时，为便于提述，采用下述命名法。在所有情况下，应用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸取代苏氨酸表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变用加号(“+”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411的突变，分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，和用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。
缺失。对于氨基酸缺失，使用下述命名法：原始氨基酸、位置*。因此，在位置195的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失用加号(“+”)分隔，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用下述命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入氨基酸。因此在位置195的甘氨酸后面插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入氨基酸#1、新插入氨基酸#2等]。例如，在位置195的甘氨酸后面插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这种情况下，通过在插入氨基酸残基前面的氨基酸残基位置编号后加小写字母为插入的氨基酸残基编号。因此在上述实例中序列为：
  亲本：   变体：
  195   195195a 195b
  G   G-K-A
多个改变。包含多个改变的变体用加号(“+”)分隔，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位置170和195用酪氨酸和谷氨酸取代精氨酸和甘氨酸。
不同改变。在一个位置引入不同改变时，不同的改变用逗号分隔，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示下述变体：Tyr167Gly+Arg170Gly，Tyr167Gly+Arg170Ala，Tyr167Ala+Arg170Gly和Tyr167Ala+Arg 170Ala。
结构域
钙敏感α-淀粉酶
钙敏感α-淀粉酶的实例包括下述α-淀粉酶：
1.具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶；
2.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的黄热芽孢杆菌(Bacillusflavothermus)淀粉酶，WO 2005/001064中所述的AMY1048；
3.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶；
4.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)α-淀粉酶；
5.具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列、源自WO 00/60060中所述芽孢杆菌属菌种DSM 12649的α-淀粉酶AA560；
6.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列、源自WO 95/26397中所述芽孢杆菌属菌种NCIB 12512的α-淀粉酶；
7.具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列、源自WO 95/26397中所述芽孢杆菌属菌种NCIB 12513的α-淀粉酶；
8.具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列、由Tsukamoto等,1988,Biochem.Biophys.Res.Comm.151:25-31所述的α-淀粉酶SP707；
9.具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的α-淀粉酶TS-22；
10.具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列、J.Appl.Microbiology,1997,82:325-334(SWALL:q59222)中所述的α-淀粉酶TS-23；
11.具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列、源自WO 97/00324中所述芽孢杆菌属菌种KSM-AP1378(FERM BP-3048)的α-淀粉酶；
12.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列、源自WO 02/10356中所述芽孢杆菌属菌种A7-7的α-淀粉酶；
13.具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列、源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶(Spezyme Xtra)。
14.具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列、Jeang等,2002,Appl.Environ.Microbiol.68:3651-3654中所述的噬纤维菌属(Cytophaga)α-淀粉酶。
以及这些钙敏感α-淀粉酶中任一种的杂合体和变体。
其它钙敏感α-淀粉酶包括由EP 0252666中所述地衣芽孢杆菌菌株(ATCC27811)产生的α-淀粉酶，和WO 91/00353和WO 94/18314中披露的α-淀粉酶。
钙敏感α-淀粉酶可以是两个或更多个钙敏感α-淀粉酶的杂合体，如解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶之间的杂合体。
商业上可得到的钙敏感α-淀粉酶是以下述商品名销售的产物：OptithermTM和TakathermTM(可由Danisco获得)；MaxamylTM(可由Danisco获得)，Spezym AATM，Spezyme Delta AATM，Spezyme Fred和Spezyme Xtra(可由Danisco获得)，和KeistaseTM(可由Daiwa获得)，PURASTARTM ST 5000E和PURASTRATM HPAM L(来自Genencor Int.)。
下表提供了这些钙敏感α-淀粉酶的A-、B-、C-和糖结合结构域：
Figure BDA00002094918100091
Figure BDA00002094918100101
钙不敏感α-淀粉酶
钙不敏感α-淀粉酶的实例包括下述：
1.具有SEQ ID NO:13的序列的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)α-淀粉酶；
2.具有SEQ ID NO:14的序列的KSM K-36α-淀粉酶；
3.具有SEQ ID NO:15的序列的KSM K-38α-淀粉酶；
4.具有SEQ ID NO:16的序列的沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)α-淀粉酶；
5.具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列、WO 03/083054中所述的火球菌属(Pyrococcus)杂合α-淀粉酶；
以及这些α-淀粉酶中任一种的杂合体和变体。
下表提供了这些钙不敏感α-淀粉酶的A-、B-、C-和糖结合结构域：
Figure BDA00002094918100102
Figure BDA00002094918100111
通过用钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域或其部分取代钙敏感α-淀粉酶的B-结构域或其部分可以产生α-淀粉酶。还可以通过用钙敏感α-淀粉酶的A-和C-结构域或其部分取代钙不敏感α-淀粉酶的A-和C-结构域或其部分而产生α-淀粉酶。在产生杂合α-淀粉酶时，不应在两个剪接位点缺失或插入氨基酸，所述剪接位点即将钙敏感α-淀粉酶的序列与钙不敏感α-淀粉酶的序列组合的两个位点。
上文的表中提供的钙敏感和钙不敏感α-淀粉酶的A-、B-和C-结构域的边界是灵活的，并且允许关于序列的一些自由度。因此，通常可能偏离结构域的确切边界多至20个氨基酸，例如，少于20个氨基酸，少于10个氨基酸，少于6个氨基酸，和少于3个氨基酸。换言之，要用钙不敏感α-淀粉酶的序列替代的钙敏感α-淀粉酶的序列可以在B-结构域边界的20个氨基酸之内，例如，少于10个氨基酸，6个氨基酸之内，和3个氨基酸之内。例如，边界相差一个氨基酸，两个氨基酸，三个氨基酸，四个氨基酸，五个氨基酸，六个氨基酸，七个氨基酸，八个氨基酸，九个氨基酸，或十个氨基酸。
例如，对于解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基102-207，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置92-112范围内的位置并且结束于位置197-217范围内的位置，例如，开始于位置96-108范围内的位置并结束于位置198-213范围内的位置，或开始于位置99-105范围内的位置并结束于位置204-210范围内的位置。解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-101(A1)+208-396(A2)和397-483。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置91-111范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置96-101范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置101-106范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置198-218范围内的位置并结束于位置478-483范围内的位置，例如，开始于位置203-208范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，或者开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置的A2和C-结构域。
对于黄热芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-211，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置198-218范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置202-214范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置205-212范围内的位置。黄热芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+212-398(A2)和399-484。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置202-222范围内的位置并结束于位置479-484范围内的位置，例如，开始于位置207-212范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置，或者开始于位置212-217范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置的A2和C-结构域。黄热芽孢杆菌α-淀粉酶进一步具有氨基酸残基485-586的糖结合结构域。糖结合结构域不是淀粉酶活性所需的，并且可以完全或部分缺失。
对于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:3)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基104-207，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的序列开始于位置94-114范围内的位置并且结束于位置194-214范围内的位置，例如，开始于位置98-110范围内的位置并结束于位置198-210范围内的位置，或开始于位置101-107范围内的位置并结束于位置201-207范围内的位置。地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-103(A1)+208-396(A2)和397-483。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置93-113范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置98-103范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置103-108范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置198-218范围内的位置并结束于位置478-483范围内的位置，例如，开始于位置203-208范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，或者开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置的A2和C-结构域。
对于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:4)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基105-210，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置95-115范围内的位置并且结束于位置197-213范围内的位置，例如，开始于位置99-111范围内的位置并结束于位置201-213范围内的位置，或开始于位置102-108范围内的位置并结束于位置204-210范围内的位置。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-104(A1)+211-396(A2)和397-483。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置94-114范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置99-104范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置104-109范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置201-221范围内的位置并结束于位置478-483范围内的位置，例如，开始于位置206-211范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，或者开始于位置211-216范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置的A2和C-结构域。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶进一步具有氨基酸残基484-586的C-末端延伸。糖结合结构域不是淀粉酶活性所需的，并且可以完全或部分缺失。
对于芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:5)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-212，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置199-219范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置203-215范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置206-212范围内的位置。芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-396(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置的A2和C-结构域。
对于芽孢杆菌属α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-212，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置199-219范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置203-215范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置206-212范围内的位置。芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-396(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置的A2和C-结构域。
对于芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:7)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-212，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置199-219范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置203-215范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置206-212范围内的位置。芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置的A2和C-结构域。
对于SP707α-淀粉酶(SEQ ID NO:8)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-212，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置199-219范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置203-215范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置206-212范围内的位置。SP707α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置的A2和C-结构域。
对于TS-22α-淀粉酶(SEQ ID NO:9)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-212，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置199-219范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置203-215范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置206-212范围内的位置。TS-22α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-484。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置的A2和C-结构域。TS-22α-淀粉酶进一步具有氨基酸残基485-586的糖结合结构域。淀粉酶活性不需要糖结合结构域，并且可以完全或部分缺失。
对于TS-23α-淀粉酶(SEQ ID NO:10)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-212，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置199-219范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置203-215范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置206-212范围内的位置。TS-22α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-484。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置的A2和C-结构域。TS-23α-淀粉酶进一步具有氨基酸残基485-583的糖结合结构域。淀粉酶活性不需要糖结合结构域，并且可以完全或部分缺失。
对于KSM-AP1378α-淀粉酶(SEQ ID NO:11)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-212，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置199-219范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置203-215范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置206-212范围内的位置。KSM-AP1378α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置的A2和C-结构域。
对于芽孢杆菌属SP7-7α-淀粉酶(SEQ ID NO:12)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基106-212，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置96-116范围内的位置并且结束于位置199-219范围内的位置，例如，开始于位置100-112范围内的位置并结束于位置203-215范围内的位置，或开始于位置103-109范围内的位置并结束于位置206-212范围内的位置。芽孢杆菌属SP7-7α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-105(A1)+213-398(A2)和399-485。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置的A2和C-结构域。
对于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:29)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基105-210，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置95-115范围内的位置并且结束于位置197-213范围内的位置，例如，开始于位置99-111范围内的位置并结束于位置201-213范围内的位置，或开始于位置102-108范围内的位置并结束于位置204-210范围内的位置。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-104(A1)+211-396(A2)和397-483。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置94-114范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置99-104范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置104-109范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置201-221范围内的位置并结束于位置478-483范围内的位置，例如，开始于位置206-211范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，或者开始于位置211-216范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置的A2和C-结构域。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶进一步具有氨基酸残基484-486的C-末端延伸。糖结合结构域不是淀粉酶活性所需的，并且可以完全或部分缺失。
对于噬纤维菌属α-淀粉酶(SEQ ID NO:30)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基103-208，由钙不敏感α-淀粉酶的相应序列替代的序列开始于位置93-113范围内的位置，并且结束于位置195-215范围内的位置，例如，开始于位置97-109范围内的位置并结束于位置199-211范围内的位置，或开始于位置100-106范围内的位置并结束于位置202-208范围内的位置。噬纤维菌属α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-102(A1)+209-397(A2)和398-484。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置92-112范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置97-102范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置102-107范围内的位置的A1-结构域。本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置199-219范围内的位置并结束于位置479-484范围内的位置，例如，开始于位置204-209范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置，或者开始于位置209-214范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置的A2和C-结构域。
对于环状芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:13)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基103-208。本发明的α-淀粉酶可包含开始于位置93-113范围内的位置并且结束于位置195-215范围内的位置，例如，开始于位置97-109范围内的位置并结束于位置199-211范围内的位置，或开始于位置100-106范围内的位置并结束于位置202-208范围内的位置的B-结构域。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-102(A1)+209-395(A2)和396-482。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置92-112范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置97-102范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置102-107范围内的位置。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域开始于位置199-219范围内的位置并结束于位置385-405范围内的位置，例如，开始于位置204-209范围内的位置并结束于位置390-395范围内的位置，或者开始于位置209-214范围内的位置并结束于位置395-400范围内的位置。A1和A2结构域优选同时由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域开始于位置386-406范围内的位置并结束于位置477-482范围内的位置，例如，开始于位置391-396范围内的位置并结束于位置479-482范围内的位置，或开始于位置396-401范围内的位置并结束于位置479-482范围内的位置。环状芽孢杆菌α-淀粉酶进一步具有氨基酸残基483-492的C-末端延伸。延伸不是淀粉酶活性所需的，并且可以完全或部分缺失。
对于KSM-K36α-淀粉酶(SEQ ID NO:14)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基104-207，本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置93-113范围内的位置，并且结束于位置195-215范围内的位置，例如，开始于位置97-109范围内的位置并结束于位置199-211范围内的位置，或开始于位置100-106范围内的位置并结束于位置202-208范围内的位置的B-结构域。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-103(A1)+208-393(A2)和394-480。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置93-113范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置98-103范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置103-108范围内的位置。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域开始于位置198-218范围内的位置并结束于位置383-403范围内的位置，例如，开始于位置203-208范围内的位置并结束于位置388-393范围内的位置，或者开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置393-398范围内的位置。A1和A2结构域优选同时由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域开始于位置384-404范围内的位置并结束于位置475-480范围内的位置，例如，开始于位置389-394范围内的位置并结束于位置477-480范围内的位置，或开始于位置394-399范围内的位置并结束于位置477-480范围内的位置。
对于KSM-K38α-淀粉酶(SEQ ID NO:15)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基104-207，本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置93-113范围内的位置并且结束于位置195-215范围内的位置，例如，开始于位置97-109范围内的位置并结束于位置199-211范围内的位置，或开始于位置100-106范围内的位置并结束于位置202-208范围内的位置的B-结构域。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-103(A1)+208-393(A2)和394-480。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置93-113范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置98-103范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置103-108范围内的位置。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域开始于位置198-218范围内的位置并结束于位置383-403范围内的位置，例如，开始于位置203-208范围内的位置并结束于位置388-393范围内的位置，或者开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置393-398范围内的位置。A1和A2结构域优选同时由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域开始于位置384-404范围内的位置并结束于位置475-480范围内的位置，例如，开始于位置389-394范围内的位置并结束于位置477-480范围内的位置，或开始于位置394-399范围内的位置并结束于位置477-480范围内的位置。
对于沃氏火球菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:16)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基110-171，本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置100-120范围内的位置并且结束于位置161-181范围内的位置，例如，开始于位置105-115范围内的位置并结束于位置166-171范围内的位置，或开始于位置107-113范围内的位置并结束于位置171-176范围内的位置的B-结构域。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-109(A1)+172-338(A2)和339-435。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置99-119范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置104-109范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置109-114范围内的位置。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域开始于位置161-181范围内的位置并结束于位置328-348范围内的位置，例如，开始于位置167-172范围内的位置并结束于位置333-338范围内的位置，或者开始于位置172-177范围内的位置并结束于位置338-343范围内的位置。A1和A2结构域优选同时由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域开始于位置329-349范围内的位置并结束于位置430-435范围内的位置，例如，开始于位置324-329范围内的位置并结束于位置432-435范围内的位置，或开始于位置329-344范围内的位置并结束于位置432-435范围内的位置。
对于火球菌属杂合α-淀粉酶(SEQ ID NO:31)，其中已经确定B-结构域为氨基酸残基110-171，本发明的α-淀粉酶可以包含开始于位置100-120范围内的位置并且结束于位置161-181范围内的位置，例如，开始于位置105-115范围内的位置并结束于位置166-171范围内的位置，或开始于位置107-113范围内的位置并结束于位置171-176范围内的位置的B-结构域。环状芽孢杆菌α-淀粉酶的A和C-结构域分别确定为氨基酸残基1-109(A1)+172-338(A2)和339-435。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A1-结构域开始于位置1-5范围内的位置并结束于位置99-119范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置104-109范围内的位置，或者开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置109-114范围内的位置。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的A2-结构域开始于位置161-181范围内的位置并结束于位置328-348范围内的位置，例如，开始于位置167-172范围内的位置并结束于位置333-338范围内的位置，或者开始于位置172-177范围内的位置并结束于位置338-343范围内的位置。A1和A2结构域优选同时由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代。可以由钙敏感α-淀粉酶的相应序列替代的C-结构域开始于位置329-349范围内的位置并结束于位置430-435范围内的位置，例如，开始于位置334-339范围内的位置并结束于位置432-435范围内的位置，或开始于位置339-344范围内的位置并结束于位置432-435范围内的位置。
变体
本发明的变体具有α-淀粉酶活性并且包含A-、B-和C-结构域和，可选地，糖-结合模块。
变体的A-结构域
在一个实施方案中，本发明的变体包含A-结构域，所述结构域与SEQ IDNO:1-12的A-结构域中的任何一个具有至少70%并低于100%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:1的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:2的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:3的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:4的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:5的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:6的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:7的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:8的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:9的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:10的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:11的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:12的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:29的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:30的A-结构域具有至少70%的序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
所述A-结构域的氨基酸序列在对应于位置8、52、53、59、91、220、224、242、244、245、282、284、301、303、304、307、348、386或388的位置具有至少一个差异，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个差异。
在一个实施方案中，所述A-结构域与SEQ ID NO:1-12的A-结构域之中的任何一个相比具有1-15个差异，即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个差异。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置8的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置27的位置，即，所述氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gln。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置34的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Lys。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置52的位置，即，所述氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gly。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置53的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置59的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr，例如，Ala。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置80的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置86的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ser。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置90的位置，即，所述氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ser。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置91的位置，即，所述氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置100的位置，即，所述氨基酸是Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Ser、Trp、Tyr或Val，例如，Glu或Leu。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置204的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置206的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、M et、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，例如，Met。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置220的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Pro。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置224的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、M et、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置235的位置，即，所述氨基酸是Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Thr或Trp。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置242的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gln或Glu。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置244的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置245的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、M et、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ala或Lys。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置270的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置282的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、M et、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Trp。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置284的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、M et、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gln、Thr或Val。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置301的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Lys。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置303的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Arg。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置304的位置，即，所述氨基酸是Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置307的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置348的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Thr。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置386的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gln、Glu、Thr，或Val。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置388的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ile或Val。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置52和53的位置不同。例如，在对应于位置52和53的位置的氨基酸分别是Gly和Tyr。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置59、242和307的位置不同。例如，在对应于位置59、242和307的位置的氨基酸分别是Ala；Gln或Glu；和Leu。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置220和224的位置不同。例如，在对应于位置220和224的位置的氨基酸分别是Pro和Leu。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置242和282的位置不同。例如，在对应于位置242和282的位置的氨基酸分别是Gln或Glu；和Trp。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置242和284的位置不同。例如，在对应于位置242和284的位置的氨基酸分别是Gln或Glu；和Gln、Thr或Val。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置242、284和307的位置不同。例如，在对应于位置242、284和307的位置的氨基酸分别是Gln或Glu；Gln，Thr或Val；和Leu。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置242和307的位置不同。例如，在对应于位置242和307的位置的氨基酸分别是Gln或Glu；和Leu。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置244和284的位置不同。例如，在对应于位置244和284的位置的氨基酸分别是Tyr；和Gln，Thr或Val。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置244、284和307的位置不同。例如，在对应于位置244、284和307的位置的氨基酸分别是Tyr；Gln，Thr或Val；和Leu。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置244和307的位置不同。例如，在对应于位置244和307的位置的氨基酸分别是Tyr和Leu。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置284和307的位置不同。例如，在对应于位置284和307的位置的氨基酸分别是Gln，Thr或Val；和Leu。
在一个实施方案中，变体的A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29或30在对应于位置301、303和304的位置不同。例如，在对应于位置301、303和304的位置的氨基酸分别是Lys，Arg和Asp。
变体的B-结构域
本发明的变体包含钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域。
在一个实施方案中，所述B-结构域与SEQ ID NO:13的B-结构域具有至少60%的序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个实施方案中，所述B-结构域与SEQ ID NO:14的B-结构域具有至少60%的序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个实施方案中，所述B-结构域与SEQ ID NO:15的B-结构域具有至少60%的序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个实施方案中，所述B-结构域与SEQ ID NO:16的B-结构域具有至少60%的序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
在一个实施方案中，所述B-结构域与SEQ ID NO:13的B-结构域具有至少55%并且低于100%的序列同一性，例如，所述B-结构域与SEQ ID NO:13的B-结构域具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。
在一个实施方案中，所述B-结构域与SEQ ID NO:13的B-结构域具有至少55%并且低于100%的序列同一性，例如，所述B-结构域与SEQ ID NO:31的B-结构域具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。
B-结构域的氨基酸序列在对应于位置105、115、117、129、132、134、135、150、157、159、160、164、166、168、169、170、171、172、174、176、177、179、180、181、182、184、187、188、191、206、208或210的位置具有至少一个差异，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个差异。
在一个实施方案中，B结构域与SEQ ID NO:13的B-结构域相比具有1-15个差异，即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个差异。
在一个实施方案中，B结构域的氨基酸序列在对应于位置105、115、117、129、132、134、135、150、157、159、160、164、166、168、169、170、171、172、174、176、177、184、187、188、191、206、208或210的位置具有至少一个差异，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个差异，和/或在对应于位置179-182的至少两个位置的氨基酸缺失。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置105的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置115的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、M et、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr，例如，Trp。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置117的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置129的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Val。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置132的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置134的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Glu或Tyr。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置135的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asn或Gln。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置150的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Thr。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置157的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置159的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置160的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置164的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val，例如，Val。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置166的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Trp。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置168的位置，即，所述氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Glu。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置169的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ser。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置170的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Arg。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置171的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Lys。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置172的位置，即，所述氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置174的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Arg。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置176的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置177的位置，即，所述氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置179的位置，即，所述氨基酸是Ag、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asn、Asp、Gln或Glu，或者缺失。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置180的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ala、Pro或Ser，或者缺失。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置181的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ala、Asp、Cys、Leu或Pro，或者缺失。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置182的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ala、Pro或Ser，或者缺失。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置184的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ala。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置187的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Trp。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置188的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Glu。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置191的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Thr。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置202的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、A sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置204的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，例如，Lys或Met。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置206的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，例如，Lys或Met。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置208的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置210的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr或Val。
在一个实施方案中，所述差异可以位于对应于位置222的位置，即，所述氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，例如，Val。
在一个实施方案中，对应于位置179和180的氨基酸缺失。
在一个实施方案中，对应于位置179和181的氨基酸缺失。
在一个实施方案中，对应于位置179和182的氨基酸缺失。
在一个实施方案中，对应于位置180和181的氨基酸缺失。
在一个实施方案中，对应于位置180和182的氨基酸缺失。
在一个实施方案中，对应于位置181和182的氨基酸缺失。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、117、150和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、117、150和184的位置的氨基酸分别为Asp、Asp、Thr和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、129、177和179的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、129、177和179的位置的氨基酸分别为Asp；Val；Leu；和Asn，Asp，Gln或Glu，或者缺失；和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、132和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、132和184的位置的氨基酸分别为Asp、Asp和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、134和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、134和184的位置的氨基酸分别为Asp、Glu和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、135、179和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、135、179和184的位置的氨基酸分别为Asp；Asn；Asn，Asp，Gln或Glu，或者缺失；和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105和150的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105和150的位置的氨基酸分别为Asp和Thr。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、150、164、166、168、171和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、150、164、166、168、171和184的位置的氨基酸分别为Asp、Thr、Val、Trp、Glu、Lys和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、150、164和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、150、164和184的位置的氨基酸分别为Asp、Thr、Val和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、150、166、168、和171的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、150、166、168、和171的位置的氨基酸分别为Asp、Thr、Trp、Glu和Lys。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、150、166、168、171和180的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、150、166、168、171和180的位置的氨基酸分别为Asp、Thr、Trp、Glu、Lys和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、150和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、150和184的位置的氨基酸分别为Asp、Thr和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、150、184和206的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、150、184和206的位置的氨基酸分别为Asp、Thr、Ala和Met。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、157、159、160、184、208和210的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、157、159、160、184、208和210的位置的氨基酸分别为Asp；Tyr；Tyr；Tyr；Ala；Tyr；和Tyr或Val。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、160和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、160和184的位置的氨基酸分别为Asp、Tyr和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、164和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、164和184的位置的氨基酸分别为Asp、Val和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、166、168和171的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、166、168和171的位置的氨基酸分别为Asp、Trp、Glu和Lys。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、179和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、179和184的位置的氨基酸分别为Asp；Asn、Asp、Gln，或Glu，或者缺失；和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105和184的位置的氨基酸分别为Asp和Ala。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105、184和210的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105、184和210的位置的氨基酸分别为Asp；Ala；和Tyr或Val。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置105和206的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置105和206的位置的氨基酸分别为Asp和Met。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置166、168和171的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置166、168和171的位置的氨基酸分别为Trp、Glu和Lys。
在一个实施方案中，变体的B-结构域在对应于位置187、188和191的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同。例如，在对应于位置187、188和191的位置的氨基酸分别为Trp、Glu和Thr。
本发明的α-淀粉酶可以在源自钙不敏感的α-淀粉酶的B-结构域中进一步包含其它取代、插入或缺失。在钙不敏感的α-淀粉酶的B-结构域中合适的取代、插入或缺失的实例是对应于环状芽孢杆菌α-淀粉酶中下述改变的改变：E179*，N180*，E185W，N186E和D189T(SEQ ID NO:13编号)，其对应于SEQ ID NO:27编号中的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T。
在另一个实施方案中，本发明的α-淀粉酶包含取代Q150T。
在另一个实施方案中，本发明的α-淀粉酶包含取代T164V。
在另一个实施方案中，本发明的α-淀粉酶包含取代K184A。
变体的C-结构域
在一个实施方案中，本发明的变体包含与SEQ ID NO:1-12的C-结构域中的任何一个具有至少70%并且低于100%序列同一性的C-结构域。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:1的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:2的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:3的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:4的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:5的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:6的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:7的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:8的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:9的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:10的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:11的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:12的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:29的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:30的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
在一个实施方案中，所述C-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的C-结构域中的任一个相比具有1-15个差异，即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个差异。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置407的位置，即，所述氨基酸是Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Asp。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置430的位置，即，所述氨基酸是Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Asp。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置432的位置，即，所述氨基酸是Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Pro。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置459的位置，即，所述氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr或Val，例如，Pro。
在一个实施方案中，差异可以位于对应于位置475的位置，即，所述氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr或Val，例如，Gln或Lys。
在一个实施方案中，所述变体的C-结构域与SEQ ID NO:1-12的C-结构域中的任一个在对应于位置407和430的位置不同。例如，在对应于位置407和430的位置的氨基酸是Asp。
在一个实施方案中，所述变体的C-结构域与SEQ ID NO:1-12的C-结构域中的任何一个在对应于位置407、430和432的位置不同。例如，在对应于位置407、430和432的位置的氨基酸分别是Asp，Asp和Pro。
在一个实施方案中，所述变体的C-结构域与SEQ ID NO:1-12的C-结构域中的任何一个在对应于位置407和432的位置不同。例如，在对应于位置407和432的位置的氨基酸分别是Asp和Pro。
在一个实施方案中，所述变体的C-结构域与SEQ ID NO:1-12的C-结构域中的任何一个在对应于位置430和432的位置不同。例如，在对应于位置30和432的位置的氨基酸分别是Asp和Pro。
在一个实施方案中，α-淀粉酶变体通过Phadebas活性测量的活性与通过G7-pNG测定法测量的活性的比例大于0.1，优选大于0.25，甚至更优选大于0.5和最优选大于1。
Phadebas测定法是使用交联不可溶蓝色淀粉聚合物确定α-淀粉酶活性的测定法(
Figure BDA00002094918100371
淀粉酶测试，由Magle Life Sciences,Lund,Sweden提供)。
G7-pNG测定法是使用可溶的色原化合物对-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷确定α-淀粉酶活性的测定法。包含PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim生产(目录号1054635)。
为了使用Phadebas和G7-pNG测定法确定淀粉酶活性，测定法中必须包括活性已知的参照淀粉酶，并且相对于已知参照确定活性。就本发明而言，认为参照α-淀粉酶在用Phadebas和G7-pNG测定法测量时具有相同的活性，参照α-淀粉酶是由Novozymes A/S以商品名
Figure BDA00002094918100372
销售的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有SEQ ID NO:3的序列。因此，相对于由G7-pNP测定法测量的活性，用Phadebas测定法测量活性时参照α-淀粉酶具有1的比例。
通过测量两种特别选择的底物上的活性并计算比例来确定在不可溶底物上的活性与在可溶底物上的活性的比例。优选地，比例为钙不敏感α-淀粉酶的至少1.5倍高，例如，至少2倍高，至少2.5倍高和至少3倍高。
使用下面披露的用于确定由Phadebas测定法测量的活性与G7pNG测定法的活性的比例的方法，发现具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的环状芽孢杆菌α-淀粉酶具有约0.014的比例。
其它突变
本发明的α-淀粉酶可以包含本领域已知的一个或多个取代、插入和/或缺失，以改善α-淀粉酶的性质。
例如，根据WO94/02597和WO 94/18314的教导，可以用不可氧化氨基酸残基取代可氧化氨基酸残基从而提高酶在氧化条件下，例如，在存在漂白剂时的稳定性，所述文献通过提述并入本文。
WO 99/23211、WO 01/66712和WO 2006/002643中披露了可以引入的其它有益的取代，所述文献通过提述并入本文。
本发明的变体优选由481-515，481-493或481-486个氨基酸组成。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，其包括：(a)向亲本α-淀粉酶在对应于位置8、52、53、59、91、220、224、242、244、245、282、284、301、303、304、307、348、386、388、407、430、432和459的一个或多个(几个)位置引入取代，其中所述变体具有α-淀粉酶活性；和(b)回收所述变体。
可以根据本领域已知的任何诱变方法制备变体，如定位诱变，合成基因构建，半合成基因构建，随机诱变，改组，等。
定位诱变是一种在编码亲本α-淀粉酶的多核苷酸分子的确定位点产生一个或多个(几个)突变的技术。所述技术可以在体外或体内进行。
合成基因构建可以体外合成设计的多核苷酸分子以编码目的多肽分子。可以使用多种技术进行基因合成，如由Tian等,2004,Nature 432:1050-1054所述的基于多重微芯片的技术，和类似的技术，其中合成并在光-可编程微流体芯片上组装寡核苷酸。
可以通过PCR在体外完成定位诱变，所述PCR涉及包含理想突变的寡核苷酸引物的使用。还可以通过盒诱变在体外进行定位诱变，所述盒诱变涉及由限制酶在包含编码亲本α-淀粉酶的多核苷酸的质粒中的位点切割，和之后包含突变的寡核苷酸在多核苷酸中的连接。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等,1990,Nucleic Acids Research 18:7349-4966。
可以通过本领域已知的方法在体内完成定位诱变。参见，例如，美国专利申请公开号No.2004/0171154；Storici等,2001,Nature Biotechnology 19:773-776；Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290；和Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。
任何定位诱变方法可用于本发明中。有很多可以用来制备亲本α-淀粉酶的变体的可用的商业试剂盒。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建，和/或定位诱变，和/或随机诱变，和/或改组等方面来实现半合成基因构建。半合成构建的特点是使用合成的多核苷酸片段的方法，与PCR技术组合。因此基因的确定区域可以从头合成，而另外的区域可以使用位点-特异性诱变引物扩增，其它区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可改组多核苷酸片段。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明任何变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作所述多核苷酸以提供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子序列，其是由用于表达编码多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导变体的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其包括在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列已由在曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包括在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列已由在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述变体的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的氨基端相连的信号肽，并且指导编码的多肽进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码所述变体的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码区。外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强变体的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于变体N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码区。
当信号肽区和前肽区二者均出现在多肽的氨基端时，将前肽区置于紧接着(next to)多肽氨基端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的变体、启动子和转录和翻译终止信号。上述多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码变体的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS 1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加α-淀粉酶变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)以获得基本纯的α-淀粉酶变体。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含编码变体的多核苷酸，所述多核苷酸有利地用于变体的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，使所述载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的变体的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个方面，宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。
在另一个方面，真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
在另一个方面，酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。
在另一个方面，酵母宿主细胞可为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一个方面，真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
在另一个方面，丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
在另一个方面，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Si.USA 75:1920。
产生方法
本发明还涉及用于产生变体的方法，其包括：(a)在适合表达所述变体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)从培养基回收所述变体。
使用本领域熟知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
在一个可选的方面，不回收变体，而将表达所述变体的本发明的宿主细胞作为变体的来源。
可以使用本领域已知的对于所述变体是特异性的方法来检测变体。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，如实施例中所述，酶测定法(enzyme assay)可用于测定多肽的活性。
变体可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的变体可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的变体，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
植物
本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含编码本发明的变体的分离的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述变体。变体可从植物或植物部分回收。或者，可以将含有所述重组变体的植物或植物部分按原样用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
表达本发明的变体的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiology 86:506所述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.of Plant Physiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant Cell Physiol.39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,PlantPhysiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现本发明的多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明的多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Mol.Biol.19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant J.2:275-281；Shimamoto,1994,Current Opin.Biotech.5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Mol.Biol.21:415-428所描述的。其他用于依照本公开使用的转化方法包括那些描述于美国专利6,395,966和7,151,204的那些(两者均通过提述以其整体并入本文)。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除了用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有所述构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码变体或其部分的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。
植物可通过回交转化方法生成。举例而言，植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。
可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当具有所需性状但除此之外(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有该目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。
本发明还涉及产生本发明变体的方法，包括：(a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述变体。
组合物
本发明还涉及包含α-淀粉酶变体和至少一种其它酶的组合物。其它酶选自下组：β-淀粉酶，纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶，支链淀粉酶，和/或其它可在商业过程中与α-淀粉酶联合使用的酶。其它酶还可以是另一种α-淀粉酶。这类酶在淀粉加工、糖转化、醇和其它有用的终产物的发酵、商业洗涤剂和清洁辅助用品、去污、纤维处理或脱浆等中为本领域所知。
使用α-淀粉酶变体的方法-工业应用
本发明的变体具有可用于多种工业应用中的宝贵性质。具体地，所述变体可以用于洗涤剂中，特别是洗衣洗涤剂组合物和餐具洗涤洗涤剂组合物，硬表面清洁组合物，和用于对织物、纤维或衣物脱浆，纸浆和纸的生产，啤酒制造，乙醇生产，和淀粉转化过程。
α-淀粉酶变体可用于淀粉过程，具体为淀粉转化，特别是淀粉的液化(参见，例如，美国专利No.3,912,590，EP 252730和EP 063909，WO 99/19467，和WO 96/28567，其通过提述全部并入本文)。还涵盖用于淀粉转化目的的组合物，其可以除本发明的变体之外还包含AMG、支链淀粉酶和其它α-淀粉酶。
此外，所述变体特别用于由淀粉或全谷物产生甜味剂和乙醇(参见，例如，美国专利No.5,231,017，其通过提述并入本文)，如燃料、饮用和工业乙醇。
所述变体还可以用于织物、纤维和衣物的脱浆(参见，例如，WO 95/21247，美国专利4,643,736，和EP 119920，其通过提述并入本文)，啤酒制造或酿造，和在纸浆和纸生产或相关过程中。
淀粉加工
天然淀粉由微观颗粒组成，其在室温时不溶于水。当加热含水的淀粉浆时，颗粒膨胀并最终爆裂，使淀粉颗粒分布于溶液中。在这个“糊化”过程中，粘度急剧增加。因为典型工业过程中的固体水平为30-40%，所以淀粉必须稀化或“液化”，使其能进行适当加工。在当前的商业实践中，这种粘度下降主要通过酶降解而获得。
常用的淀粉-转化过程，如液化和糖化过程，如美国专利No.3,912,590、EP 252730和EP 063909所述，其通过提述并入本文。
在一个实施方案中，将淀粉降解至较低分子量碳水化合物组分如糖或脂肪替代物的转化过程包括脱支(debranching)步骤。
将淀粉转化成糖时，将淀粉解聚。这种解聚过程由例如，预处理步骤和两个或三个连续加工步骤组成，即液化过程、糖化过程，并且依赖于理想的终产物，任选地包括异构化过程。
当理想的最终糖产物是，例如，高果糖糖浆时，可以将右旋糖糖浆转化成果糖。在糖化过程之后，pH增加至6-8，优选pH 7.5的值，并且通过离子交换去除钙。然后使用，例如，固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。
发酵产物的生产
通常地，由全谷物生产醇(乙醇)可以分成4个主要步骤：磨制、液化、糖化和发酵。
磨制谷物以打开结构以便于进一步加工。使用的两个过程是湿磨或干磨。在干磨中，磨制完整的谷粒，并用于过程的其余部分中。湿磨能够非常好地分离胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)，并且大都在平行生产糖浆的场合使用。
在液化过程中，通过水解将淀粉颗粒溶解成大部分DP大于4的麦芽糊精。可以通过酸处理或α-淀粉酶的酶处理进行水解。酸水解用途有限。原材料可以是磨制的全谷物或淀粉加工的侧流。
在典型的酶解液化过程中，通过α-淀粉酶将长链淀粉降解成更短的支链和直链单元(麦芽糊精)。酶解液化通常以三步热浆过程进行。将浆料加热至60-95℃ (例如，77-86℃，80-85℃，或83-85℃)，并且加入酶。在85℃进行1-2小时的液化过程。pH通常为5.5-6.2。为了确保在这些条件下最佳的酶稳定性，加入1mM钙(提供约40ppm游离钙离子)。在这种处理后，液化淀粉具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。
然后将浆料蒸汽加热(jet-cook)至95-140℃，例如，105-125℃，冷却至60-95℃，并加入更多的酶以实现最终水解。液化过程在pH 4.5-6.5，通常在pH 5-6进行。磨制并液化的谷粒也称作醪。
在存在糖化酶如葡糖淀粉酶的情况下将含液化淀粉的材料糖化。糖化过程可以持续12-120小时(例如，12-90小时，12-60小时和12-48小时)。
然而，通常在30-65℃，通常约60℃的温度进行约30分钟至2小时(例如，30-90分钟)的预糖化步骤，然后在发酵过程中完全糖化，其称作同时糖化和发酵(SSF)。pH通常为4.2-4.8，例如，4.5。在同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而是酵母和酶一起加入。
在典型的糖化过程中，通过加入葡糖淀粉酶和脱支链酶，如异淀粉酶(美国专利No.4,335,208)或支链淀粉酶，将液化过程中产生的麦芽糊精转化成右旋糖。在加入葡糖淀粉酶和脱支链酶之前，温度降至60℃。糖化过程进行24-72小时。
在加入糖化酶之前，pH降至4.5以下，并保持高温(高于95℃)，使液化α-淀粉酶失活。这个过程减少短寡糖(称作“潘糖前体”)的形成，其不能由脱支链酶正确水解。通常，约0.2-0.5%的糖化产物是支链三糖潘糖(Glc pα1-6Glcpα1-4Glc)，其不能由支链淀粉酶降解。如果来自液化的活性淀粉酶在糖化过程中仍然存在(即，未变性)，潘糖的量可以高达1-2%，其极为不理想，因为会显著降低糖化产率。
由酶促糖化产生可发酵的糖(例如，糊精、单糖，具体为葡萄糖)。这些可发酵的糖进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。此外，糖可以用作微生物发酵过程中用于产生终产物的发酵原料，所述终产物如醇(例如，乙醇和丁醇)，有机酸(例如，琥珀酸和乳酸)，糖醇(例如，甘油)，抗坏血酸中间产物(例如，葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸，和2-酮-L-古洛糖酸)，氨基酸(例如，赖氨酸)，蛋白质(例如，抗体及其片段)。
在一个实施方案中，在液化过程步骤中获得的可发酵的糖用于产生醇，并且具体为乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶和发酵生物体(例如，酵母)一起加入，然后在30-40℃的温度进行所述过程。
发酵中使用的生物体依赖于理想的终产物。典型地，如果乙醇是理想的终产物，则使用酵母作为发酵生物体。在一些优选的实施方案中，产生乙醇的微生物是酵母，并且特别是酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株(美国专利No.4,316,956)。多种酿酒酵母是商业上可得到的，并且其包括但不限于FALI(Fleischmann′s Yeast)，SUPERSTART(Alltech)，FERMIOL(DSMSpecialties)，RED STAR(Lesaffre)和Angel醇酵母(Angel Yeast Company，China)。方法中使用的起子酵母的量是在适当时间有效产生商业上显著量的乙醇的量(例如，在少于72小时内从具有25-40%DS的底物产生至少10%乙醇)。通常以约104-约1012，优选约107-约1010个活酵母计数每mL发酵液的量提供酵母细胞。在向醪加入酵母后，通常发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度为约26-34℃，通常在约32℃，并且pH为pH 3-6，例如，约pH 4-5。
发酵可以包括，除发酵微生物(例如，酵母)之外，营养成分，和其它酶，包括肌醇六磷酸酶。酵母在发酵中的用途在本领域中公知。
在其它实施方案中，如本领域已知的，适当的发酵微生物的使用能产生发酵终产物，包括，例如，甘油，1,3-丙二醇，葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2,5-二酮-D-葡糖酸，2-酮-L-古洛糖酸，琥珀酸，乳酸，氨基酸，及其衍生物。更特定地，当乳酸是理想的终产物时，可以使用乳杆菌属(Lactobacillus)菌种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是理想的终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸是理想的终产物时，可以使用Pantoea citrea作为发酵微生物。上述列举的长串仅作为实例，并且本领域技术人员了解很多可用于获取理想终产物的发酵微生物。
用于从未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法
本发明涉及用于从含淀粉材料不进行含淀粉材料的糊化(即，未烹制)而产生发酵产物的方法。可以在不液化含有含淀粉材料和水的含水浆料的情况下产生发酵产物，如乙醇。在一个实施方案中，本发明的方法包括在初始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖源生成酶存在下糖化(例如，磨制的)含淀粉材料，例如，粒状淀粉，从而产生能由合适的发酵生物体发酵成为发酵产物的糖。在这个实施方案中，理想的发酵产物，例如，乙醇，产生自未糊化(即，未烹制)，优选磨制的谷物谷粒，如玉米。因此，在第一个方面本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，所述方法包括使用糖源生成酶和发酵生物体，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度同时糖化和发酵含淀粉材料。在一个实施方案中，还存在蛋白酶。蛋白酶可以是任何酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。可在发酵后，例如，通过蒸馏，任选地回收发酵产物，例如，乙醇。在发酵过程中通常存在淀粉酶，如葡糖淀粉酶和/或其它糖源生成酶，和/或α-淀粉酶。葡糖淀粉酶和其它糖源生成酶的实例包括水解原料淀粉的葡糖淀粉酶。α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物体的实例包括酵母，例如酿酒酵母的菌株。术语“初始糊化温度”指淀粉糊化开始的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在50-75℃开始糊化；糊化的确切温度依赖于特定的淀粉并且可以由技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以随着植物种类，植物种类的特定品种以及生长条件而改变。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的初始糊化温度可以使用Gorinstein和Lii,1992, 44(12):461-466所述的方法确定为淀粉颗粒的双折射损失5%的温度。在开始进行所述方法之前，可以制备具有含淀粉材料的10-55，例如，25-45和30-40w/w%干固体(DS)的含淀粉材料(如粒状淀粉)的浆料。浆料可以包括水和/或工艺水，如釜馏物(回流)，洗涤水，蒸发浓缩物或馏分，来自蒸馏的侧线气提器水，或来自其它发酵产物装置的工艺水。因为本发明的过程在初始糊化温度以下进行，并且因此粘度没有显著增加，如果需要可使用高水平的蒸馏。在一个实施方案中，含水浆料包含约1-约70vol.%，优选15-60vol.%，特别是约30-50vol.%水和/或工艺水，如釜馏物(回流)，洗涤水，蒸发浓缩物或馏分，蒸馏的侧线气提器水，或来自其它发酵产物装置的工艺水，或它们的组合，等等。可通过将颗粒大小，优选通过干磨或湿磨，降低至0.05-3.0mm，优选0.1-0.5mm制备含淀粉材料。在进行本发明的方法后，含淀粉材料中至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者优选至少99%干固体转化成可溶淀粉水解物。本发明这个方面的方法在初始糊化温度以下的温度进行，意味着温度通常为30-75℃，优选45-60℃。在一个优选的实施方案中，方法在25-40℃，如28-35℃，如30-34℃，优选约32℃的温度进行。在一个实施方案中，进行所述方法使糖水平，如葡萄糖水平，保持在低水平，如6w/w%以下，如约3w/w%以下，如约2w/w%以下，如约1w/w%以下，如约0.5w/w%以下，或约0.25w/w%以下，如约0.1w/w%以下。通过简单地使用调整量的酶和发酵生物体可实现糖的这种低水平。本领域的技术人员能容易地确定使用的酶和发酵生物体的剂量/量。还可以选择酶和发酵生物体的用量，以保持发酵液中麦芽糖的低浓度。例如，麦芽糖水平保持在约0.5w/w%以下，如约0.2w/w%以下。本发明的方法可以在pH约3-约7，优选pH 3.5-6，或者更优选pH 4-5进行。在一个实施方案中，发酵进行6-120小时，具体为24-96小时。
用于从糊化含淀粉材料产生发酵产物的方法
在这个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物，特别是乙醇的方法，所述方法包括液化步骤和顺序或同时进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉酶材料产生发酵产物的方法，所述方法包括步骤：
(a)在存在α-淀粉酶变体的情况下液化含淀粉材料，或；
(b)使用糖源生成酶糖化步骤(a)中获得的液化材料；
(c)使用发酵生物体发酵。
在一个方面，在液化步骤中还使用支链淀粉酶如家族GH57支链淀粉酶。在一个实施方案中，在液化之前、过程中和/或之后加入蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施方案中，金属蛋白酶源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，例如，桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCC No.0670。在一个实施方案中，糖源生成酶是源自如下的葡糖淀粉酶：曲霉属，例如，黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株，，踝节菌属(Talaromyces)，特别是埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)的菌株；或者阿太菌属(Athelia)，特别是罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)的菌株；栓菌属(Trametes)，例如，瓣环栓菌(Trametes cingulata)的菌株；大纹饰孢属(Pachykytospora)的菌株，例如，纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)的菌株；或白桩菇属(Leucopaxillus)，例如，大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)的菌株；或隔孢伏革菌属(Peniophora)的菌株，例如，菌种红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的菌株；或它们的混合物。糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可以顺序或同时进行。当所述方法以顺序糖化和发酵过程进行时，可以在糖化和/或发酵的过程中加入支链淀粉酶和/或金属蛋白酶，当步骤(b)和步骤(c)同时进行(SSF过程)时，可以在发酵之前或过程中加入所述酶。也可以在液化之前(预液化处理)即，在步骤(a)之前或过程中，和/或液化后(液化后处理)，即，步骤(a)之后，有利地加入支链淀粉酶和/或金属蛋白酶。在液化之前或过程中，即，步骤(a)之前或过程中，加入支链淀粉酶最有利。在发酵后可任选地，例如，通过蒸馏，回收发酵产物，如特别是乙醇。发酵生物体优选为酵母，优选酿酒酵母的菌株。在一个具体的实施方案中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包含下述步骤：
x)优选通过磨制(例如，使用锤式粉碎机)，降低含淀粉材料的颗粒大小；
y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
在一个实施方案中，颗粒大小小于#7筛，例如，#6筛。#7筛通常用于常规的现有技术方法中。含水浆料可包含10-55w/w%干固体(DS)，例如，25-45和30-40w/w%干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至糊化温度以上，并且可以加入α-淀粉酶变体启动液化(稀化)。在一个实施方案中，浆料可以蒸汽加热以在用步骤(a)中的α-淀粉酶处理之前进一步将浆料糊化。在一个实施方案中，液化可以以三步热浆法进行。在pH 4-6，优选4.5-5.5，将浆料加热至60-95℃，优选70-90℃，如优选80-85℃，并且任选地将α-淀粉酶变体与支链淀粉酶和/或蛋白酶(优选金属蛋白酶)一起加入以启动液化(稀化)。在一个实施方案中，然后在95-140℃，优选100-135℃，如105-125℃的温度将浆料蒸汽加热约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟。将浆料冷却至60-95℃，并且加入更多的α-淀粉酶变体和任选地支链淀粉酶变体和/或蛋白酶(优选金属蛋白酶)以结束水解(二次液化)。液化过程通常在pH 4.0-6，具体在pH 4.5-5.5进行。糖化步骤(b)可以使用本领域公知的条件进行。例如，完整的糖化过程可以持续约24-约72小时，然而，一般在30-65℃，通常约60℃的温度仅进行通常40-90分钟的预糖化，然后在同时糖化和发酵工艺(SSF工艺)中在发酵过程中进行完全糖化。糖化通常在20-75℃，优选40-70℃，通常约60℃的温度，和在pH 4-5，通常在约pH 4.5进行。用于产生发酵产物特别是乙醇的最广泛使用的工艺是同时糖化和发酵(SSF)工艺，其中没有糖化的保持阶段，意味着发酵生物体(如酵母)和酶可一起加入。SSF通常可以在25-40℃，如28-35℃，如30-34℃，优选约32℃的温度进行。在一个实施方案中，发酵进行6-120小时，具体为24-96小时。
啤酒制造
α-淀粉酶变体还可以用于啤酒制造过程和类似的发酵中；α-淀粉酶通常在淀粉糖化(mashing)过程中加入。所述过程与上文所述的磨制、液化、糖化和发酵过程基本类似。
用釜馏物处理淀粉浆料
将经磨制的含淀粉材料与水和回收的稀釜馏物合并得到含水浆料。浆料可包含15-55%ds w/w (例如20-50%，25-50%，25-45%，25-40%，20-35%和30-36%ds)。在一些实施方案中，回收的稀釜馏物(回流)为约10-70%v/v(例如，10-60%，10-50%，10-40%，10-30%，10-20%，20-60%，20-50%，20-40%以及20-30%)。
一旦将经磨制的含淀粉材料与水和回流合并，则不调整浆料的pH。此外，在向浆料加入肌醇六磷酸酶和任选地α-淀粉酶之后也不调整pH。在一个实施方案中，浆料的pH为约pH 4.5至低于约6.0(例如，pH 4.5-5.8，pH 4.5-5.6，pH 4.8-5.8，pH 5.0-5.8，pH 5.0-5.4，pH 5.2-5.5和pH 5.2-5.9)。依赖于向浆料中加入的稀釜馏物的量和包含稀釜馏物的材料的类型，浆料的pH可为约pH4.5-5.2。例如，稀釜馏物的pH可为pH 3.8-pH 4.5。
在乙醇生产过程中，可以加入酸降低啤酒池(beer well)中的pH，从而降低蒸馏前微生物污染的风险。
在一些实施方案中，向浆料加入肌醇六磷酸酶。在其它实施方案中，除了肌醇六磷酸酶，还向浆料加入α-淀粉酶。在一些实施方案中，向浆料顺序加入肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶。在其它实施方案中，同时加入肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶。在一些实施方案中，将包含肌醇六磷酸酶和任选地包含α-淀粉酶的浆料温育(预处理)约5分钟至约8小时(例如，5分钟至6小时，5分钟至4小时，5分钟至2小时，和15分钟至4小时)。在其它实施方案中，在约40-115℃(例如，45-80℃，50-70℃，50-75℃，60-110℃，60-95℃，70-110℃，70-85℃和77-86℃)的温度温育浆料。
在其它实施方案中，在含淀粉材料的淀粉糊化温度以下约0-约30℃(例如，0-25℃，0-20℃，0-15℃，0-10℃和0-5℃)的温度温育浆料。在一些实施方案中，温度为约68℃以下，约65℃以下，约62℃以下，约60℃以下和约55℃以下。在一些实施方案中，温度为约45℃以上，约50℃以上，约55℃以上和约60℃以上。在一些实施方案中，将在淀粉糊化温度以下的温度温育包含肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶的浆料称作一级(1°)液化。
在一个实施方案中，磨制的含淀粉材料是谷物/玉米(corn)或买罗高粱(milo)。浆料包含25-40%DS，pH为4.8-5.2，并将浆料与肌醇六磷酸酶和任选地α-淀粉酶在60-75℃的温度温育5分钟至2小时。
目前，人们相信商业上可得到的用于液化过程的α-淀粉酶通常对于使用整粒磨制谷物在约80℃以上的温度在低于pH 5.6的pH水平通过干磨工艺产生液化的淀粉底物而言不够稳定。很多商业上可得到的α-淀粉酶的稳定性在低于约4.0的pH下降。
在进一步液化的步骤中，使温育或预处理的含淀粉材料暴露于温度增加，如含淀粉材料的淀粉糊化温度以上约0-约45℃ (例如，70-120℃，70-110℃和70-90℃)，在约pH 4.0-5.5约2分钟至约6小时(例如，2分钟至4小时、90分钟、140分钟和90-140分钟)，更优选1-2小时。可以通过常规的高温蒸汽加热系统在短时间内，例如1-15分钟，增加温度。然后在约75-95℃(例如，80-90℃和80-85℃)的温度将淀粉进一步水解约15-150分钟(例如，30-120分钟)。在一个优选的实施方案中，在这些工艺步骤过程中不调整pH，并且液化醪的pH为约pH 4.0-pH 5.8(例如，pH4.5-5.8，pH 4.8-5.4和pH 5.0-5.2)。在一些实施方案中，向二级液化步骤加入第二剂量的热稳定α-淀粉酶，但是在其它实施方案中，无额外剂量的α-淀粉酶。
温育和液化步骤之后可为本领域公知的糖化和发酵步骤。
蒸馏
任选地，发酵之后，可以通过，例如，蒸馏和之后任选地进行一个或多个处理步骤，提取醇(例如，乙醇)。
在一些实施方案中，由本文提供的方法产生的乙醇的产率/得率(yield)为至少8%，至少10%，至少12%，至少14%，至少15%，至少16%，至少17%和至少18%(v/v)和至少23%v/v。根据本文提供的方法获得的乙醇可以用作，例如，燃料乙醇，饮用乙醇，即，可饮用的中性酒精，或工业乙醇。
副产物
发酵后留下谷粒，其通常以液体或干燥形式用于动物饲料。在进一步的实施方案中，终产物可以包括发酵共产物如蒸馏干酒糟(DDG)和蒸馏干酒糟加可溶物(DDGS)，其可以用于，例如，动物饲料。
关于如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的进一步细节为技术人员所公知。
根据本文提供的方法，糖化和发酵可以同时或分开进行。
纸浆和纸的生产
α-淀粉酶变体也可以用于由淀粉增强废纸和纸板生产木质纤维素材料，如纸浆、纸和纸板，特别地其中再制浆发生在pH 7以上并且其中淀粉酶通过对强化淀粉的降解而促进废材料的崩解。α-淀粉酶变体特别适用于从涂布淀粉的印刷纸张产生造纸纸浆的过程。所述过程可如WO 95/14807中所述进行，其包括下述步骤：
a)崩解纸张以产生纸浆，
b)在步骤a)之前、过程中或之后用淀粉降解酶处理，和
c)在步骤a)和b)之后从纸浆分离墨水颗粒。
α-淀粉酶变体也可以用于改性淀粉，其中在造纸过程中将酶改性的淀粉与碱性填料如碳酸钙、高岭土和粘土一起使用。使用α-淀粉酶变体，可以在存在填料的情况下改性淀粉，从而使整合的工艺更简单。
织物、纤维和衣物的脱浆
α-淀粉酶变体在织物、纤维或衣物脱浆方面非常有用。在织物加工业中，α-淀粉酶常规上用作脱浆过程中的辅助物以促进含淀粉浆料的去除，所述浆料在纺织过程中作为纬纱(weft yarn)上的保护层。纺织后完全去除浆料覆层很重要，可以确保后续过程中获得最优结果，所述后续过程中将纤维洗涤、漂白和染色。酶法分解淀粉是优选的，因为其不涉及对纤维材料的任何有害作用。为了降低加工成本并增加工厂产量，脱浆过程有时与煮炼和漂白步骤组合。在这种情况下，通常使用非酶辅助物如碱或氧化剂来分解淀粉，因为常规的α-淀粉酶不能与高pH水平和漂白剂良好地相容。因为使用的具有相当侵略性的化学品，所以淀粉浆料非酶法分解导致一些纤维受损。因此，理想的是使用α-淀粉酶变体，因为它们在碱溶液中具有改进的性能。在将含纤维素的纤维或织物退浆时，α-淀粉酶变体可以单独使用，或者与纤维素酶组合使用。
退浆和漂白过程在本领域中公知。例如，在例如WO 95/21247、美国专利No.4,643,736、EP 119920中描述了这类过程，所述文献通过提述并入本文。
清洁过程和洗涤剂组合物
可以将α-淀粉酶变体作为洗涤剂组合物的成分加入并用于各种清洁或洗涤过程，包括洗衣和餐具洗涤。例如，所述变体可以用于WO 96/23874和WO 97/07202中所述的洗涤剂组合物中。
所述α-淀粉酶变体以常规使用的浓度并入洗涤剂中。例如，本发明的变体可以以对应于0.00001-10mg(根据纯的活性酶蛋白计算)的α-淀粉酶每升洗涤/餐具洗涤液(使用洗涤剂的常规剂量水平)的量并入。
洗涤剂组合物可以例如配制为手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适合于污染的纤维的预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的纤维软化剂组合物，或者配制为用于常用家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制用于手洗或机洗的餐具洗涤操作。
所述洗涤剂组合物可以进一步包含一种或多种其它酶，如脂肪酶、过氧化物酶、蛋白酶、另一种淀粉分解酶，例如，另一种α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶，CGT酶，纤维素酶，甘露聚糖酶(如来自Novozymes,Denmark的MannawayTM)，果胶酶，果胶裂合酶，角质酶，和/或漆酶。
通常，选择的酶的性质应该与选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其它酶和非酶成分的相容性，等)，并且酶应该以有效量存在。
可以通过加入包含一种或多种酶的多种添加剂，或者通过加入包含所有这些酶的组合的添加剂，将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，例如，分开的添加剂或组合的添加剂，可以配制为，例如，颗粒，液体，浆料等。优选的清洁添加剂配制物是颗粒，具体为无粉尘颗粒，液体，具体为稳定化液体，或浆料。
无粉尘颗粒可以如，例如，美国专利No 4,106,991和4,661,452中所披露的产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法涂覆。蜡质涂层材料的实例是平均摩尔重量1000-20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；其中醇包含12-20个碳原子并且其中有15-80个环氧乙烷单元的乙氧基化的脂肪醇；脂肪醇，脂肪酸；和脂肪酸的单甘油酯、双甘油酯和三甘油酯。在GB 1483591中给出通过流体床技术适合于本申请的成膜涂层材料的实例。可以根据已建立的方法，例如，通过加入多元醇如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸来稳定液体酶制备物。根据EP 238216中披露的方法可以制备受到保护的酶。
洗涤剂组合物可以为任何方便的形式，例如，条、片、粉末、颗粒、膏或液体。液体洗涤剂可含水，通常包含多至约70%水和0-约30%有机溶剂，或不含水。
洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂通常以按重量计约0.1%-60%的水平存在。
在包括于其中时，洗涤剂通常包含约1%-约40%的阴离子表面活性剂如直链烷基苯磺酸盐，α-烯烃磺酸盐，烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)，醇乙氧基硫酸酯，仲烷基磺酸盐，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基-或烯基琥珀酸或肥皂。
在包括于其中时，洗涤剂通常包含约0.2%-约40%的非离子表面活性剂如醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基多糖苷，氧化烷基二甲基胺，乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗涤剂可包含0-约65%的洗涤剂助剂或络合剂如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)，聚羧酸酯如聚丙烯酸酯，马来酸丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以包含漂白系统，其可包含H2O2源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与可形成过酸的漂白活化剂如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸盐组合。或者，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。
可以使用常规稳定剂，例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸，或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸使洗涤剂组合物的酶稳定化，并且可以如，例如，WO 92/19708和WO92/19709中所述配制组合物。
洗涤剂还可以包含其它常用洗涤剂成分如，例如，纤维调理剂，包括粘土、泡沫增强剂、抑泡剂、抗蚀剂，悬污剂、防污物再沉积剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂、助水溶物、晦暗抑制剂，或香料。
洗涤剂组合物可以对应于0.01-100mg酶蛋白每升洗涤液，优选0.055mg酶蛋白每升洗涤液，具体为0.1-1mg酶蛋白每升洗涤液的量包含任何酶。
本文所述的一种或多种变体酶可以另外并入WO 97/07202中披露的洗涤剂配制物中，所述文献通过提述并入本文。
本文披露的内容在下述实施例中包括更详细的细节，其不以任何方式意欲限制所要求保护的范围。因此下述实施例用于阐述，但不限制所要求保护的范围。
实施例
材料和方法
α-淀粉酶和变体的发酵
可以通过本领域公知的方法或如下进行发酵。
将携带相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株在含相关抗生素的LB-琼脂平板上划线，并在37℃过夜生长。
将菌落转移至500ml摇瓶中补加相关抗生素(例如10mg/l氯霉素)的100mlBPX培养基中。
BPX培养基的组成：
Figure BDA00002094918100631
BAN是Novozymes销售的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶产物。
培养物在37℃C，270rpm振荡4-5天。
通过在4500rpm离心20-25分钟从发酵液去除细胞和细胞碎片。之后过滤上清以获得完全澄清的溶液。浓缩滤液并在UF-滤膜(10000截留膜)上洗涤，并将缓冲液改变为20mM乙酸(盐)pH 5.5。将UF-滤液施于S-琼脂糖F.F.上并以相同缓冲液中的0.2M NaCl分步洗脱而进行洗脱。将洗脱液针对10mM Tris,pH 9.0透析并施于Q-琼脂糖F.F.上并在6个柱体积中以0-0.3M NaCl的线性梯度洗脱。汇集包含活性(通过Phadebas测定法测量)的级分，将pH调至7.5，并通过用0.5%w/vol.的活性炭处理5分钟而去除残余颜色。
Phadebas测定法
也可通过使用
Figure BDA00002094918100632
片为底物的方法确定α-淀粉酶活性。Phadebas片(
Figure BDA00002094918100633
淀粉酶测试，由Magle Life Sciences,Lund,Sweden提供)包含交联的不可溶蓝色淀粉聚合物，其已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并制成片状。
对于每个单次测量，将一片悬浮于含5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，0.01%
Figure BDA00002094918100634
X100，用NaOH将pH调至目的值)的管中。此为底物溶液。将待测试的α-淀粉酶稀释于50mM Britton-Robinson缓冲液。此为淀粉酶溶液。测试在恒温，例如，在室温，37℃或50℃进行。不溶的蓝色淀粉聚合物通过α-淀粉酶水解得到可溶的蓝色片段。所得的蓝色溶液的吸光度，其在620nm处用分光光度法测量，是α-淀粉酶活性的函数。
在选择的温度将575微升底物溶液平衡5分钟。通过向底物溶液加入25微升淀粉酶溶液并在选择的温度在轻柔混合下将样品温育15分钟而开始水解。通过加入100微升1M NaOH而停止反应，并在混合后立即在冰浴上冷却。在500gav离心3分钟后，将200微升上清液转移至微量滴定板中，并读出在620nm处的吸光度数值(Aamyl)。如所述制备盲样(blind)，只是其中用25微升50mM Britton-Robison缓冲液代替25微升淀粉酶溶液。盲样在620nm处的吸光度为Ab。类似地，通过制成具有已知活性的一系列Termamyl稀释溶液并如上所述测量向溶液释放的蓝色而产生标准曲线。标准品在620nm的吸光度为As。标准曲线为As-Ab针对样品中的Termamyl活性的图线。可以通过比较Aamyl–Ab与Termamyl标准曲线而确定目的淀粉酶的活性。
重要的是在温育15分钟(测试时间)后测量的620nm吸光度为620nm处0.2-2.0吸光度单位。在这个吸光度范围内，活性和吸光度呈线性关系(Lambert-Beer定律)。因此必须调整酶(目的淀粉酶和标准物两者)的稀释度以符合这个标准。在特定的一组条件下(温度，pH，反应时间，缓冲液条件)，1mg给定的α-淀粉酶将水解定量的底物并产生蓝色。
G7-pNP淀粉酶测定法
还通过使用PNP-G7底物的方法确定α-淀粉酶活性。PNP-G7，其为对硝基苯基-α,D-麦芽七糖苷的缩写，是可以由内切淀粉酶切割的块状(blocked)寡糖。切割后，试剂盒中包括的α-葡糖苷酶消化底物以释放具有黄色因此能够通过可见光分光光度法在λ=405nm (400-420nm)测量的游离PNP分子。包含PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Roche/Hitachi制造(目录号11876473)。来自这个试剂盒的G7-PNP底物包含22mmol/L 4,6-亚乙基-G7-PNP和52.4mmol/L HEPES(2-[4-2(-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0)，并且α-葡糖苷酶包含52.4mmol/L HEPES，87mmol/L NaCl，12.6mmol/L MgCl2，0.075mmol/L CaCl2，>4kU/L α-葡糖苷酶)。
将待分析的淀粉酶样品在50mM EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(Sigma,E9502))，0.01%
Figure BDA00002094918100641
X100，1mM CaCl2，pH 7.0中稀释。在使用前，通过将来自试剂盒的1mL含α-葡糖苷酶的试剂与0.2mL含4,6-亚乙基-G7-PNP的试剂混合而制成底物工作溶液。在PCR仪中温育样品后立即将样品在残余活性缓冲液(50mM EPPS，0.01%
Figure BDA00002094918100651
X100，1mM CaCl2，pH 7.0)中稀释10倍。通过将20微升稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板并加入80微升底物工作溶液而进行测定。混合溶液并在室温预温育1分钟，每20秒测量OD 405nm处的吸收值，共历时5分钟。
时间依赖性吸收曲线的斜率(吸光度每分钟)与在给定条件下目的α-淀粉酶的比活性(活性每mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至斜率低于0.4吸光度单位每分钟的水平。
Figure BDA00002094918100652
淀粉酶活性测定法
还可以通过使用
Figure BDA00002094918100653
底物的方法确定α-淀粉酶活性。
Figure BDA00002094918100654
Ultra淀粉酶测定试剂盒(E33651,Invitrogen,La Jolla,CA,USA)中的底物是玉米淀粉衍生物，DQTM淀粉，其是用
Figure BDA00002094918100655
FL染料标记达到淬灭荧光的程度的玉米淀粉。
将一个含有约1mg冻干底物的小瓶溶于100微升50mM乙酸钠(pH 4.0)中。将小瓶漩涡振荡20秒并在室温置于暗处，间歇混合直至溶解。然后加入900微升100mM乙酸(盐)，0.01%(w/v)
Figure BDA00002094918100656
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5，彻底漩涡振荡并在室温保存于暗处直至使用。通过在残余活性缓冲液(100mM乙酸(盐)，0.01%(w/v)
Figure BDA00002094918100657
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5)中稀释10倍得到浓度为100微克/ml的底物而制备底物工作溶液。温育后立即将酶在100mM乙酸(盐)，0.01%(W/v)
Figure BDA00002094918100658
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5中稀释至浓度为20ng酶蛋白/mL。
对于测定，将25微升底物工作溶液与25微升稀释酶在黑色384孔微量滴定板中混合10秒。在15分钟之内每分钟于25℃测量一次每孔中的荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)，并计算荧光强度针对时间的图线的斜率作为Vmax。图线应该是线性的，并且已经调整了残余活性测定法使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。
实施例1：杂合体的制备
制备具有SEQ ID NO:7中所示序列的钙敏感α-淀粉酶和具有SEQ ID NO:13中所示序列的钙不敏感α-淀粉酶的下述杂合体。
杂合体1：去除SEQ ID NO:7的氨基酸残基106-215，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-211代替，得到SEQ ID NO:17，并引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:17编号)，其与使用SEQID NO:27编号的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合体的序列示于SEQ ID NO:18中。
杂合体2：去除SEQ ID NO:7的氨基酸残基106-214，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-210代替，得到SEQ ID NO:19，并引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:19编号)，其与使用SEQID NO:27编号的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合体的序列示于SEQ ID NO:20中。
杂合体3：去除SEQ ID NO:7的氨基酸残基106-213，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-209代替，得到SEQ ID NO:21，并引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:21编号)，其与使用SEQID NO:27编号的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合体的序列示于SEQ ID NO:22中。
实施例2：存在螯合剂时的稳定性
将酶样品在49℃C在DTPA终浓度为1.5%的缓冲液pH 8.0(50mM EPPS，0.01%
Figure BDA00002094918100661
X100，pH 8.0)中温育1小时，并将参照样品在4℃温育1小时。此外，将酶样品在42℃在DTPA终浓度为1.5%的缓冲液pH 10.0(50mM EPPS，0.01%
Figure BDA00002094918100662
X100，pH 10.0)中温育1小时，并将参照样品在4℃温育1小时。为了确定在含DTPA的缓冲液pH 8和pH 10中的淀粉酶稳定性，通过在5mM EPPS，0.01%X100，pH 8.0中稀释而将待测试的酶调整至0.25和0.5mg酶蛋白/mL。
将160微升稳定性缓冲液(50mM EPPS，0.01%
Figure BDA00002094918100664
X100，1.875%DTPA，pH 8.0或pH 10.0)和40微升淀粉酶溶液一式两份转移至96孔PCR微量滴定板中并将其内容物混合1分钟。每孔中DTPA的终浓度为1.5％。将来自每孔的20微升转移至置于4℃的新PCR微量滴定板中(参照样品)。在PCR仪中温育PCR MTP，当缓冲液具有pH 8.0时在49℃温育1小时(pH 8，49℃样品)，当缓冲液具有pH 10.0时在42℃温育1小时(pH 10，42℃样品)。
温育后立即如G7-pNP淀粉酶测定法中所述分析PCR板上样品的淀粉酶活性。应注意的是，为了降低测定中来自DTPA的干扰，在分析残余活性前将参照和pH 8，49℃样品/pH 10，42℃样品稀释至相同浓度。在相同的96孔板上确定参照样品和pH 8，49℃样品或pH 10，42℃样品的活性。残余活性计算为：100*Vmax(pH 8，42℃或pH 10，49℃样品)/Vmax(参照样品)。
Figure BDA00002094918100671
杂合体1、2和3非常稳定，在pH 8，49℃和pH 10，42℃温育1小时后具有100%残余活性。相比之下，具有缺失D183*+T184*的SEQ ID NO:7在这些条件下具有少于20%的残余活性，而SEQ ID NO:7和SP707具有甚至更低的残余活性。
实施例3：其它α-淀粉酶
制备下述α-淀粉酶：
杂合体4：去除SEQ ID NO:5的氨基酸残基106-212并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-208替代，得到SEQ ID NO:23，并且引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:23编号)，其与SEQ ID NO:27编号中的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合体的序列示于SEQ ID NO:24中。
杂合体5：去除SEQ ID NO:8的氨基酸残基106-212并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-208替代，得到SEQ ID NO:25，并且引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T(使用SEQ ID NO:25编号)，其与SEQ ID NO:27编号中的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合体的序列示于SEQ ID NO:26中。
如实施例2中所述，将杂合体4和5(SEQ ID NO:24和26)，具有改变E182*，N183*，E188W，N189E和D192T (使用SEQ ID NO:5编号，其与SEQ ID NO:27编号中的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应)的SEQ ID NO:5的变体，和SEQ ID NO:8的α-淀粉酶与DTPA温育。结果显示温育后杂合体4和5具有几乎为100%的残余活性，而其它α-淀粉酶在温育过程中损失了大部分活性。
实施例4：α-淀粉酶变体的稳定性
通过在pH 4.5和5.5及75℃和85℃的温度将参照α-淀粉酶及其α-淀粉酶变体与0.12mM CaCl2温育，然后施用
Figure BDA00002094918100681
底物(E
Figure BDA00002094918100682
Ultra淀粉酶测定法试剂盒,E33651,Molecular Probes,Invitrogen,La Jolla,CA,USA)确定残余活性，来确定具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的参照α-淀粉酶(嗜热脂肪芽孢杆菌和环状芽孢杆菌α-淀粉酶的杂合体(SEQ ID NO:27)，具有改变E181*+G182*+E187W+N188E+D191T+D407N+D430N+P432D)及其α-淀粉酶变体的稳定性。
将纯化的酶样品在酶稀释缓冲液(10mM乙酸(盐)，0.01%
Figure BDA00002094918100683
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.0)中稀释至0.5和1或5和10ppm(微克/ml)的工作浓度。将二十微升酶样品转移至48孔PCR MTP中，并向每孔加入180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸(盐)，150mM MES，0.01%
Figure BDA00002094918100684
X100，0.12mM CaCl2，pH 4.5或5.5)并混合。使用两个酶浓度一式两份进行测定。在75℃或85℃温育前，取出40微升并保存在冰上作为参照样品。在PCR仪中温育30/45分钟(pH 4.5和75℃)，45/60分钟(pH 5.5和75℃)，5/10分钟(pH 4.5和85℃)和10分钟(pH 5.5和85℃)。
温育后将参照样品和PCR仪中的样品在残余活性缓冲液(100mM乙酸(盐)，0.01%
Figure BDA00002094918100685
X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5)中稀释至20ng/ml，并将25微升稀释酶转移至黑色384-MTP中。如
Figure BDA00002094918100686
淀粉酶活性测定法部分所述使用
Figure BDA00002094918100687
底物确定残余活性。简言之，向包含稀释酶的每个孔加入25微升底物工作溶液(100微克/ml)。使用485-P nm的激发滤片和555nm的发射滤片在15分钟内每分钟确定荧光(荧光读数器是Polarstar，BMG)。对于每个设置将残余活性标准化至对照样品。
假设为对数衰减，使用下述公式计算半衰期(T1/2(min))：T1/2(min)=T(min)*LN(0.5)/LN(%RA/100)，其中T是用分钟表示的测定温育时间，而%RA是测定中确定的%残余活性。
使用这个测定设置，如表1中所示，确定参照α-淀粉酶及其变体的半衰期。
表1
Figure BDA00002094918100691
Figure BDA00002094918100701
Figure BDA00002094918100711
Figure BDA00002094918100721
Figure BDA00002094918100731
Figure BDA00002094918100741
Figure BDA00002094918100751
结果证明α-淀粉酶变体具有比参照α-淀粉酶显著更长的半衰期和更高的稳定性。
实施例5：使用α-淀粉酶变体产生乙醇
如下制备以名称LIQUOZYME
Figure BDA00002094918100752
由Novozymes销售的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体和实施例4中所述两种α-淀粉酶变体的三种小规模醪：将约54g玉米粉，约51g自来水，和约45g回流在250mL塑料瓶中混合至总浆料重量为150g。将玉米浆料的pH调至4.5。以2微克淀粉酶每克干固体向醪加入酶。对于液化，向瓶中加入α-淀粉酶并将瓶彻底混合，置于预热的85℃水浴中。将样品在pH 4.5在水浴中保持2小时，前30分钟每10分钟振荡一次，之后在2小时液化的其余时间，每30分钟振荡一次。然后在冰浴中冷却样品；将pH调至5.0，并加入0.75mL脲和0.45mL青霉素，使它们在醪中分别达到1000和3ppm的终浓度。然后用Spirizyme(由Novozymes销售的葡糖淀粉酶产物)使样品进行同时糖化和发酵(SSF)。
将五克醪的等分试样转移至预称重的锥形离心管中，每种醪使用5个重复实验。然后在32℃水浴中使用Spirizyme
Figure BDA00002094918100762
对于这些醪进行54小时的SSF。对于所有发酵，葡糖淀粉酶剂量为0.50AGU/g DS。测量SSF过程中的CO2重量损失，并在54小时的SSF后使用HPLC定量乙醇。下面的表2中提供了平均54小时HPLC SSF数据。
表2
54小时发酵后的乙醇产率/得率(yield)
Figure BDA00002094918100763
结果证明α-淀粉酶变体的使用使得乙醇相对于LIQUOZYME
Figure BDA00002094918100764
的得率显著提高。
实施例6：洗涤剂中的洗涤性能
为了评价α-淀粉酶在洗涤剂中的洗涤性能，进行了洗涤实验。使用MiniWash测定法测试实施例1的杂合体1、2和3的性能，并与具有含缺失D183*+T184*(SEQ ID NO:7编号)的SEQ ID NO:7的氨基酸序列的α-淀粉酶相比较。在此测试中，可以同时在几个酶剂量检查酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。
Mini Wash测定法的说明
Mini Wash有多个烧杯，每个烧杯能容纳多至80ml酶-洗涤剂溶液。通过向测试系统加入CaCl2，MgCl2和NaHCO3而将水硬度调至10°dH。将织物样品，在本实施例中为CS-28，附接于设计的框以将织物浸入酶-洗涤剂溶液中，频率为每分钟浸入40次。在洗涤过程中控制酶-洗涤剂溶液的温度。洗涤后，用流动的自来水漂洗植物随后在暗处干燥。通过用ZEISS MCS 521VIS分光光度计测量460nm处的减少(remission)而评价酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。
织物：
CS-28是技术上以大米淀粉污染的棉织物，可从Center For Test MaterialsBV，P.O.Box 120,3133KT Vlaardingen,the Netherlands获得。
在下面详明的实验条件下进行实验：
Figure BDA00002094918100771
结果与讨论：
将α-淀粉酶的洗涤性能标准化至具有含缺失D183*+T184*的SEQ ID NO:7的氨基酸序列的α-淀粉酶的洗涤性能。
Figure BDA00002094918100772
实施例7：杂合体的制备
制备下述杂合体。
杂合体6：去除具有取代M9L+R118K+G149A+G182T+G186A+D183*+G184*+N195F+M202L+V214V+T257I+Y295F+N299Y+R320K+M323T+A339S+E345R+R458K(使用SEQ ID NO:5编号)的SEQ ID NO:5的变体中的氨基酸残基106-213，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-209代替，并引入下述改变：E182*，N183*，E188W，N189E和D192T，其与使用SEQ ID NO:27编号的E181*，N182*，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合体的序列示于SEQ ID NO:32中。
杂合体7：去除SEQ ID NO:8的变体中的氨基酸残基106-213(使用SEQID NO:8编号)，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-209代替。该杂合体的序列示于SEQ ID NO:33中。
杂合体8：去除SEQ ID NO:3的变体中的氨基酸残基104-208(所述变体为SEQ ID NO:3的氨基酸1-35由SEQ ID NO:1的氨基酸1-33替代，并且具有取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (使用SEQID NO:3编号))，并用SEQ ID NO:13的氨基酸残基103-209代替，并引入下述改变：N102D，Q147T，E178*，N179*，K181A，E184W，N185E和D188T，其与使用SEQ ID NO:27编号的N105D，Q150T，E181*，N182*，K184A，E187W，N188E和D191T相对应。该杂合体的序列示于SEQ ID NO:34中。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述那些的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。
通过下述段落进一步限定本发明：
段1.一种分离的α-淀粉酶，其包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域、钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，所述A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性，其中所述α-淀粉酶具有α-淀粉酶活性。
段2.一种分离的α-淀粉酶，其包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，所述C-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的C-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性，其中所述α-淀粉酶具有α-淀粉酶活性。
段3.段2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:1的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或者至少100%序列同一性。
段4.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:1的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段5.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:2的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75％，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段6.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:3的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75％，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段7.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:4的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段8.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:5的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段9.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:6的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段10.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:7的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段11.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:8的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段12.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:9的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段13.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:10的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段14.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:11的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段15.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:12的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段16.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:29的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段17.段1或2的α-淀粉酶，其中所述A-结构域与SEQ ID NO:30的A-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性。
段18.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:1的位置1-5范围内的位置并结束于位置91-111范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置96-101范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置101-106范围内的位置，具体为位置1-101的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段19.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:2的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段20.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:3的位置1-5范围内的位置并结束于位置93-113范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置98-103范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置103-108范围内的位置，具体为位置1-103的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段21.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:4的位置1-5范围内的位置并结束于位置94-114范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置99-104范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置104-109范围内的位置，具体为位置1-104的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段22.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:5的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段23.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:6的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段24.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:7的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段25.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:8的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段26.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:9的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段27.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:10的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段28.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:11的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段29.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:12的位置1-5范围内的位置并结束于位置95-115范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置100-105范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置105-110范围内的位置，具体为位置1-105的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段30.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:29的位置1-5范围内的位置并结束于位置94-114范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置99-104范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置104-109范围内的位置，具体为位置1-104的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段31.段1-17中任一个α-淀粉酶，其中所述A1-结构域与开始于SEQ ID NO:30的位置1-5范围内的位置并结束于位置92-112范围内的位置，例如，开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置97-102范围内的位置或开始于位置1-3范围内的位置并结束于位置102-107范围内的位置，具体为位置1-102的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段32.段1-31中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置8的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Leu。
段33.段1-32中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置27的位置的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Gln。
段34.段1-33中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置34的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Lys。
段35.段1-34中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置52的位置的氨基酸是Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Gly。
段36.段1-35中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置53的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Tyr。
段37.段1-36中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置59的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Tyr，例如，Ala。
段38.段1-37中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置80的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Trp，Tyr或Val，例如，Asp。
段39.段1-38中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置86的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Ser。
段40.段1-39中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置90的位置的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Ser。
段41.段1-40中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置91的位置的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Leu。
段42.段1-41中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置100的位置的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Gly或Leu。
段43.段1-42中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置204的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Leu。
段44.段1-43中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置206的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val，例如，Met。
段45.段1-44中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置220的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Pro。
段46.段1-45中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置222的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val，例如，Val。
段47.段1-46中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置224的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Leu。
段48.段1-47中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置235的位置的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Thr或Trp。
段49.段1-48中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置242的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Gln或Glu。
段50.段1-49中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置244的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Tyr。
段51.段1-50中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置245的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Ala或Lys。
段52.段1-51中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置270的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Leu。
段53.段1-52中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置282的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Trp。
段54.段1-53中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置284的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Gln，Thr或Val。
段55.段1-54中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置301的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Lys。
段56.段1-55中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置303的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Arg。
段57.段1-56中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置304的位置的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Asp。
段58.段1-57中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置307的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Leu。
段59.段1-58中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置348的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Thr。
段60.段1-59中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置386的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Gln，Glu，Thr或Val。
段61.段1-60中的任一个α-淀粉酶，其中对应于位置388的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，例如，Ile或Val。
段62.段1-61中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置52和53的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置52和53的位置的氨基酸分别是Gly和Tyr。
段63.段1-62中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置59、242和307的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置59、242和307的位置的氨基酸分别是Ala；Gln或Glu；和Leu。
段64.段1-63中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置220和224的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置220和224的位置的氨基酸分别是Pro和Leu。
段65.段1-64中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置242和282的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置242和282的位置的氨基酸分别是Gln或Glu；和Trp。
段66.段1-65中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置242和284的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置242和284的位置的氨基酸分别是Gln或Glu；和Gln，Thr或Val。
段67.段1-66中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置242、284和307的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置242、284和307的位置的氨基酸分别是Gln或Glu；Gln，Thr或Val；和Leu。
段68.段1-67中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置242和307的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置242和307的位置的氨基酸分别是Gln或Glu；和Leu。
段69.段1-68中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置244和284的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置244和284的位置的氨基酸分别是Tyr；和Gln，Thr或Val。
段70.段1-69中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置244、284和307的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置244、284和307的位置的氨基酸分别是Tyr；Gln，Thr或Val；和Leu。
段71.段1-70中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置244和307的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置244和307的位置的氨基酸分别是Tyr和Leu。
段72.段1-71中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置284和307的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置284和307的位置的氨基酸分别是Gln，Thr或Val；和Leu。
段73.段1-72中的任一个α-淀粉酶，其中所述变体的A-结构域在对应于位置301、303和304的位置与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中的任一个不同，例如在对应于位置301、303和304的位置的氨基酸分别是Lys，Arg，和Asp。
段74.段1-73中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:13的B-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段75.段1-74中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:14的B-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段76.段1-75中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:15的B-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段77.段1-76中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:16的B-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段78.段1-77中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:31的B-结构域具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段79.段1-78中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与开始于SEQ ID NO:13的位置93-113范围内的位置并结束于位置195-215范围内的位置，例如，开始于位置97-109范围内的位置并结束于位置199-211范围内的位置，或开始于位置100-106范围内的位置并结束于位置202-208范围内的位置，具体为位置103-208的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段80.段1-79中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与开始于SEQ ID NO:14的位置93-113范围内的位置并结束于位置195-215范围内的位置，例如，开始于位置97-109范围内的位置并结束于位置199-211范围内的位置，或开始于位置100-106范围内的位置并结束于位置202-208范围内的位置，具体为位置104-207的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段81.段1-80中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与开始于SEQ ID NO:15的位置93-113范围内的位置并结束于位置195-215范围内的位置，例如，开始于位置97-109范围内的位置并结束于位置199-211范围内的位置，或开始于位置100-106范围内的位置并结束于位置202-208范围内的位置，具体为位置104-207的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段82.段1-81中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与开始于SEQ ID NO:16的位置100-120范围内的位置并结束于位置161-181范围内的位置，例如，开始于位置105-115范围内的位置并结束于位置166-171范围内的位置，或开始于位置107-113范围内的位置并结束于位置171-176范围内的位置，具体为位置110-171的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段83.段1-82中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与开始于SEQ ID NO:31的位置100-120范围内的位置并结束于位置161-181范围内的位置，例如，开始于位置105-115范围内的位置并结束于位置166-171范围内的位置，或开始于位置107-113范围内的位置并结束于位置171-176范围内的位置，具体为位置110-171的序列具，有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段84.段1-83中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域与SEQ ID NO:13的B-结构域具有至少55%并且小于100%序列同一性。
段85.段1-84中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置105的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Asp。
段86.段1-85中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置115的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，或Tyr，例如，Trp。
段87.段1-86中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置117的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Asp。
段88.段1-87中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置129的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Val。
段89.段1-88中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置132的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Asp。
段90.段1-89中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置134的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Glu或Tyr。
段91.段1-90中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置135的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Asn或Gln。
段92.段1-91中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置150的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Thr。
段93.段1-92中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置157的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Tyr。
段94.段1-93中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置159的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Tyr。
段95.段1-94中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置160的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Tyr。
段96.段1-95中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置164的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr，或Val，例如，Val。
段97.段1-96中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置166的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Trp。
段98.段1-97中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置168的位置的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Glu。
段99.段1-98中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置169的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Ser。
段100.段1-99中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置170的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Arg。
段101.段1-100中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置171的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Lys。
段102.段1-101中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置172的位置的氨基酸是Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Leu。
段103.段1-102中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置174的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Arg。
段104.段1-103中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置176的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Tyr。
段105.段1-104中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置177的位置的氨基酸是Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Leu。
段106.段1-105中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置179的位置的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Asn，Asp，Gln，或Glu，或者缺失。
段107.段1-106中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置180的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Ala，Pro，或Ser，或者缺失。
段108.段1-107中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置181的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Ala，Asp，Cys，Leu，或Pro，或者缺失。
段109.段1-108中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置182的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Ala，Pro，或Ser，或者缺失。
段110.段1-109中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置184的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Ala。
段111.段1-110中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置187的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Trp。
段112.段1-111中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置188的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Glu。
段113.段1-112中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置191的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Thr。
段114.段1-113中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置206的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，或Val，例如，Lys或Met。
段115.段1-114中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置208的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Tyr。
段116.段1-115中的任一个α-淀粉酶，其中在对应于位置210的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Tyr或Val。
段117.段1-116中的任一个α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、115、117、129、132、134、135、150、157、159、160、164、166、168、169、170、171、172、174、176、177、179、184、187、188、191、202、204、206、208或210的位置具有至少一个不同，并且在对应于位置179-182的至少两个位置的氨基酸缺失。
段118.段1-117中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、117、150和184的位置与SEQ ID NO:13的B-结构域不同，例如，对应于位置105、117、150和184的位置的氨基酸分别是Asp、Asp、Thr和Ala。
段119.段1-118中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、129、177和179的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、129、177和179的位置的氨基酸分别是Asp；Val；Leu；和Asn，Asp，Gln或Glu，或者缺失；和Ala。
段120.段1-119中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、132和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、132和184的位置的氨基酸分别是Asp，Asp，和Ala。
段121.段1-120中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、134和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、134和184的位置的氨基酸分别是Asp，Glu，和Ala。
段122.段1-121中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、135、179和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、135、179和184的位置的氨基酸分别是Asp；Asn；Asn，Asp，Gln，或Glu，或者缺失；和Ala。
段123.段1-122中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105和150的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105和150的位置的氨基酸分别是Asp和Thr。
段124.段1-123中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、150、164、166、168、171和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、150、164、166、168、171和184的位置的氨基酸分别是Asp，Thr，Val，Trp，Glu，Lys，和Ala。
段125.段1-124中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、150、164和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、150、164和184的位置的氨基酸分别是Asp，Thr，Val和Ala。
段126.段1-125中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、150、166、168和171的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、150、166、168和171的位置的氨基酸分别是Asp，Thr，Trp，Glu，和Lys。
段127.段1-126中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、150、166、168、171和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、150、166、168、171和184的位置的氨基酸分别是Asp，Thr，Trp，Glu，Lys，和Ala。
段128.段1-127中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、150和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、150和184的位置的氨基酸分别是Asp，Thr，和Ala。
段129.段1-128中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、150、184和206的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、150、184和206的位置的氨基酸分别是Asp，Thr，Ala，和Met。
段130.段1-129中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、157、159、160、184、208和210的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、157、159、160、184、208和210的位置的氨基酸分别是Asp；Tyr；Tyr；Tyr；Ala；Tyr；和Tyr或Val。
段131.段1-130中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、160和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、160和184的位置的氨基酸分别是Asp，Tyr，和Ala。
段132.段1-131中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、164和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、164和184的位置的氨基酸分别是Asp，Val，和Ala。
段133.段1-132中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、166、168和171的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、166、168和171的位置的氨基酸分别是Asp，Trp，Glu，和Lys。
段134.段1-133中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、179和184的位置与SEQ IDNO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、179和184的位置的氨基酸分别是Asp；Asn，Asp，Gln，或Glu，或者缺失；和Ala。
段135.段1-134中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105和184的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105和184的位置的氨基酸分别是Asp和Ala。
段136.段1-135中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105、184和210的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105、184和210的位置的氨基酸分别是Asp；Ala；和Tyr或Val。
段137.段1-136中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置105和206的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置105和206的位置的氨基酸分别是Asp和Met。
段138.段1-137中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置166、168和171的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置166、168和171的位置的氨基酸分别是Trp，Glu，和Lys。
段139.段1-138中任一个的α-淀粉酶，其中所述B-结构域在对应于位置187、188和191的位置与SEQ ID NO:3的B-结构域不同，例如，对应于位置187、188和191的位置的氨基酸分别是Trp，Glu，和Thr。
段140.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:1的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段141.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:1的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段142.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:2的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段143.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:3的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段144.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:4的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段145.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:5的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段146.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:6的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段147.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:7的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段148.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:8的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段149.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:9的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段150.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:10的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段151.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:11的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段152.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:12的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段153.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:29的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段154.段1-139中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域与SEQ ID NO:30的C-结构域具有至少70%序列同一性，例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。
段155.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:1的开始于位置198-218范围内的位置并结束于位置478-483范围内的位置，例如，开始于位置203-208范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，或者开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，具体为位置208-483的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段156.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:2的开始于位置202-222范围内的位置并结束于位置479-484范围内的位置，例如，开始于位置207-212范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置，或者开始于位置212-217范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置，具体为位置212-484的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段157.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:3的开始于位置198-218范围内的位置并结束于位置478-483范围内的位置，例如，开始于位置203-208范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，或者开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，具体为位置208-483的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段158.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:4的开始于位置201-221范围内的位置并结束于位置478-483范围内的位置，例如，开始于位置206-211范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，或者开始于位置211-216范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，具体为位置211-483的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段159.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:5的开始于位置193-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，具体为位置213-485的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段160.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:6的开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，具体为位置213-485的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段161.段1-160中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:7的开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，具体为位置213-485的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段162.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:8的开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，具体为位置213-485的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段163.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:9的开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置，具体为位置213-484的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段164.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:10的开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-484范围内的位置，具体为位置213-484的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段165.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:11的开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，具体为位置213-485的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段166.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:12的开始于位置203-223范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，例如，开始于位置208-213范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，或者开始于位置213-218范围内的位置并结束于位置482-485范围内的位置，具体为位置213-485的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段167.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:29的开始于位置201-221范围内的位置并结束于位置478-483范围内的位置，例如，开始于位置206-211范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，或者开始于位置211-216范围内的位置并结束于位置480-483范围内的位置，具体为位置211-483的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段168.段1-155中的任一个α-淀粉酶，其中所述A2和C-结构域与SEQID NO:30的开始于位置199-219范围内的位置并结束于位置479-484范围内的位置，例如，开始于位置204-209范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置，或者开始于位置209-214范围内的位置并结束于位置481-484范围内的位置，具体为位置209-484的序列，具有至少60%序列同一性，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。
段169.段1-168中的任一个α-淀粉酶，其中位于对应于位置407的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Asp。
段170.段1-169中的任一个α-淀粉酶，其中位于对应于位置430的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Asp。
段171.段1-170中的任一个α-淀粉酶，其中位于对应于位置432的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，例如，Pro。
段172.段1-171中的任一个α-淀粉酶，其中位于对应于位置459的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr，或Val，例如，Pro。
段173.段1-172中的任一个α-淀粉酶，其中位于对应于位置475的位置的氨基酸是Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr，或Val，例如，Gln或Lys。
段174.段1-173中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域在对应于位置407和430的位置与SEQ ID NO:1-12，29和30的C-结构域中任一个不同，例如，在对应于位置407和430的位置的氨基酸为Asp。
段175.段1-174中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域在对应于位置407、430和432的位置与SEQ ID NO:1-12，29和30的C-结构域中任一个不同，例如，在对应于位置407、430和432的位置的氨基酸分别为Asp，Asp，和Pro。
段176.段1-175中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域在对应于位置407和432的位置与SEQ ID NO:1-12，29和30的C-结构域中任一个不同，例如，在对应于位置407和432的位置的氨基酸分别为Asp和Pro。
段177.段1-176中的任一个α-淀粉酶，其中所述C-结构域在对应于位置430和432的位置与SEQ ID NO:1-12，29和30的C-结构域中任一个不同，例如，在对应于位置430和432的位置的氨基酸分别为Asp和Pro。
段178.段1-177中的任一个α-淀粉酶，其中所述α-淀粉酶由481至515，481至493，或481至486个氨基酸组成。
段179.段1-178中的任一个α-淀粉酶，其热稳定性强于SEQ ID NO:1-12、29和30中的任一个α-淀粉酶。
段180.段1-179中的任一个α-淀粉酶，其钙敏感性低于SEQ ID NO:1-12、29和30中的任一个α-淀粉酶。
Figure IDA00002094918700011
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Claims (18)

1.一种分离的α-淀粉酶，其包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，所述A-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的A-结构域中任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性，其中所述α-淀粉酶具有α-淀粉酶活性。
2.一种分离的α-淀粉酶，其包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，所述C-结构域与SEQ ID NO:1-12、29和30的C-结构域中任一个具有至少70%和低于100%的序列同一性，其中所述α-淀粉酶具有α-淀粉酶活性。
3.权利要求1-31中任一项的α-淀粉酶，其中
在对应于位置8的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在对应于位置27的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gln。
在对应于位置34的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Lys。
在对应于位置52的位置的氨基酸是除下述氨基酸之外的任何氨基酸：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gly。
在对应于位置53的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在对应于位置59的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr，例如Ala。
在对应于位置80的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在对应于位置86的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ser。
在对应于位置90的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ser。
在对应于位置91的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在对应于位置100的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gly或Leu。
在对应于位置204的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在对应于位置206的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，例如，Met。
在对应于位置220的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Pro。
在对应于位置222的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，例如，Val。
在对应于位置224的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在对应于位置235的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Thr或Trp。
在对应于位置242的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gln或Glu。
在对应于位置244的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Tyr。
在对应于位置245的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ala或Lys。
在对应于位置270的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在对应于位置282的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Trp。
在对应于位置284的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gln、Thr或Val。
在对应于位置301的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Lys。
在对应于位置303的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Arg。
在对应于位置304的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在对应于位置307的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Leu。
在对应于位置348的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Thr。
在对应于位置386的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Gln、Glu、Thr或Val。
在对应于位置388的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Ile或Val。
4.权利要求1-165中的任一项α-淀粉酶，其中
在对应于位置407的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在对应于位置430的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Asp。
在对应于位置432的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，例如，Pro。
在对应于位置459的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val，例如，Pro。
在对应于位置475的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val，例如，Gln或Lys。
5.一种洗涤剂组合物，其包含权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶和表面活性剂。
6.一种组合物，其包含权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶和选自下组的一种或多种酶：β-淀粉酶，纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如，木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶和支链淀粉酶。
7.权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。
8.权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶用于将纺织品脱浆的用途。
9.权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶用于产生烘焙产物的用途。
10.权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶用于将含淀粉材料液化的用途。
11.一种产生液化淀粉的方法，所述方法包括用权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶液化含淀粉材料。
12.一种产生发酵产物的方法，包括：
a.用权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶液化含淀粉材料以产生液化醪；
b.将液化醪糖化以产生可发酵糖；和
c.在存在发酵生物的情况下发酵可发酵糖。
13.一种产生发酵产物的方法，所述方法包括将淀粉底物与权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和发酵生物接触。
14.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶。
15.包含权利要求14的多核苷酸的核酸构建体。
16.一种表达载体，其包含权利要求15的核酸构建体。
17.一种宿主细胞，其包含权利要求15的核酸构建体。
18.一种用于产生α-淀粉酶的方法，其包含：
a.在适合表达α-淀粉酶的条件下培养权利要求17的宿主细胞；和
b.从培养基回收α-淀粉酶。
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