CN102843903A

CN102843903A - CRY1Da和CRY1Fa蛋白用于昆虫抗性管理的组合用途

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Publication number: CN102843903A
Application number: CN2010800640101A
Authority: CN
Inventors: T.米德; K.纳瓦; N.P.斯托尔; J.J.希茨; A.T.伍斯利; S.L.伯顿
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Kedihua Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2030-12-16
Also published as: JP5908409B2; CN102843903B; IL220333A; JP2013514768A; BR112012014575A2; CO6602146A2; RU2603257C2; MX2012007138A; KR20120096574A; AR079499A1; PH12012501436A1; AU2010330916B2; MX358710B; UA111710C2; WO2011075587A1; US20120331589A1; RU2012129906A; AU2010330916A1; ZA201204914B; EP2512221A1

Abstract

本发明包括用于控制鳞翅目昆虫的方法和植物，所述植物包含组合的含有Cry1Fa和Cry1Da核心毒素的蛋白质以延迟或预防昆虫抗性的形成。

Description

CRY1Da和CRY1Fa蛋白用于昆虫抗性管理的组合用途

发明背景

人类种植玉米(corn)以供食物和能量应用。人类还种植许多其它作物，包括大豆和棉花。昆虫食用并损害植物，并且由此削弱这些人类努力。每年花费数十亿美元来控制昆虫害虫(pest)，并且它们造成的损害损失额外的数十亿。合成的有机化学杀虫剂已经是用于控制昆虫害虫的主要工具，但是生物学杀虫剂，诸如自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)衍生的杀虫蛋白(insecticidal protein)已经在一些领域中发挥重要作用。经由用Bt杀虫蛋白基因转化生成昆虫抗性植物的能力已经使现代农业发生革命，而且提高杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。

已经使用几种Bt蛋白来创建至今已经成功登记并商业化的昆虫抗性转基因植物。这些包括玉米中的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry3Bb、棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab、和马铃薯中的Cry3A。

除了在2种蛋白质的组合杀虫谱是期望的(例如，玉米中的Cry1Ab和Cry3Bb组合以分别提供对鳞翅目害虫和根虫的抗性)或蛋白质的独立作用使它们可用作用于延迟易感昆虫群中抗性形成的工具(例如，棉花中的Cry1Ac和Cry2Ab组合以提供烟草蚜虫的抗性管理)的情况中外，表达这些蛋白质的商业产品表达单一蛋白质。

也就是说，已经导致此技术的快速且普遍采用的昆虫抗性转基因植物的一些质量(quality)还引起如下的忧虑，即害虫(pest)群体会形成对由这些植物生成的杀虫蛋白的抗性。已经提示了保留基于Bt的昆虫抗性性状的效用的几种策略，其包括与避难所(refuge)组合以及与不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高剂量的蛋白质(McGaughey等(1998),“B.t.ResistanceManagement,”Nature Biotechnol.16:144-146)。

为了在IRM叠加中使用而选定的蛋白质需要独立地施加其杀虫效果，使得对一种蛋白质形成的抗性未赋予对第二种蛋白质的抗性(即，没有对蛋白质的交叉抗性)。如果例如在对“蛋白质A”的抗性方面选定的害虫群对“蛋白质B”敏感，那么会推断没有交叉抗性，并且蛋白质A和蛋白质B的组合会有效延迟对单独的蛋白质A的抗性。

在没有抗性昆虫群的情况中，可以基于假设与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征做出评估。已经提示了受体介导的结合在鉴定有可能不展现出交叉抗性的杀虫蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。缺乏此方法中固有的交叉抗性的关键预测物(predictor)是杀虫蛋白在敏感的昆虫物种中不竞争受体。

在两种Bt毒素竞争相同受体的情况中，则若所述受体在所述昆虫中突变，使得毒素之一不再结合所述受体，并且如此针对昆虫不再是杀虫性的，则情况可能是昆虫也会对第二种毒素(其竞争性结合相同受体)有抗性。也就是说，昆虫被说成与这两种Bt毒素有交叉抗性。然而，若两种毒素结合两种不同受体，则这可以是如下的指示，即昆虫不会对那两种毒素同时有抗性。

Cry1Fa可用于控制许多鳞翅目害虫物种，包括欧洲玉米螟(European cornborer)(ECB；玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Hübner ))和秋粘虫(fall armyworm)(FAW；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))，并且针对甘蔗螟(sugarcane borer)(SCB；小蔗螟(Diatraea saccharalis))是有活性的。Cry1Fa蛋白(如在含有事件TC1507的玉米植物中生成的)负责供FAW控制用的行业领先的昆虫抗性性状。Cry1Fa在

SmartStax^TM、和WideStrike^TM产品中进一步部署。

因为可用于标记受体结合测定法中检测的蛋白质的最常见技术灭活Cry1Fa蛋白的杀虫活性，所以使用Cry1Fa蛋白进行(竞争性或同源性)受体结合研究的能力是有限的。

其它Cry毒素列于官方B.t.命名委员会的站点(Crickmore等;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。见所附的附录A。目前有几乎60个“Cry”毒素大类(Cry1-Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。许多数字组各自具有大写字母亚组，而大写字母亚组具有小写字母亚-亚组。(例如，Cry1具有A-L，而Cry1A具有a-i)。

发明概述

本发明部分涉及令人惊讶的发现，即在对Cry1Fa蛋白的杀虫活性的抗性方面选择的秋粘虫(草地夜蛾；FAW)群体对Cry1Da蛋白的杀虫活性没有抗性。凭借本公开内容的益处，如本领域技术人员会认可，表达这两种杀虫蛋白或其杀虫部分的植物会可用于延迟或阻止对单独的这些杀虫蛋白之任一种的抗性的形成。

本发明还得到如下的发现支持，即Cry1Fa和Cry1Da彼此不竞争结合来自FAW的肠受体。

本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔(pyramid)”，其中Cry1Fa和Cry1Da毒素是基础对(base pair)。一种优选的金字塔提供至少两种蛋白质，其提供针对两种害虫，即FAW和ECB (欧洲玉米螟；玉米螟)的非交叉抗性活性：Cry1Fa加Cry1Da加一种或多种抗ECB毒素诸如Cry1Ab。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对FAW的三种不同作用模式。这些优选的“三种作用模式”金字塔组合是Cry1Fa加Cry1D及选自下组的另一种毒素/基因：Vip3Ab、Cry1C、Cry1Be、和Cry1E。生成这三种毒素的植物(和种植有此类植物的土地面积(acreage))包括在本发明的范围内。也可以添加其它毒素/基因，但是依照本发明，这些特定的三重叠加会有利地且令人惊讶地提供针对FAW的三种作用模式。这可以帮助降低或消除避难土地面积的需要。一般地，本发明还涉及使用针对单一靶害虫彼此不竞争的三种杀虫蛋白(在一些优选的实施方案中为Cry蛋白)。

如此，Cry1Da可以在3基因组合中用于玉米和其它植物(例如，棉花和大豆)。cry1Da基因可以组合入例如Cry1Fa产品诸如

SmartStax^TM、和WidesStrike^TM中。因而，Cry1Da的使用可以显著降低对其它商业化蛋白质的选择压力。

附图简述

图1：对被FAW(蓝色棒)或rFAW(紫色棒)侵扰的玉米叶节(leaf segment)的损害(均值%叶损害+SEM)。前面有数字“5163”的所有处理是来自用含有Cry1Da的构建体转化的植物的叶节。在图的左边远侧分组未检出Cry1Da表达的植物。在图的中间分组检出Cry1Da表达的植物。非转基因(即，阴性)对照在图的右边远侧，并且标记为“B104”、“HiII”、和“Isoline”。含有Cry1Fa的商业近交物(inbred)是右侧的第一处理(标记为“Herculex I”)，并且是与标记为“Isoline”的非转基因对照相同的遗传背景。

图2：Cry1Fa核心毒素、Cry1Da核心毒素、和经¹²⁵I标记的Cry1Da核心毒素蛋白竞争对草地夜蛾BBMV的结合。

发明详述

如本文中报告的，转基因玉米(和其它植物；例如棉花和大豆)中生成的Cry1Da毒素在控制已经形成对Cry1Fa活性的抗性的秋粘虫(FAW；草地夜蛾)中是非常有效的。如此，本发明部分涉及令人惊讶的发现，即对Cry1Fa有抗性的秋粘虫对Cry1Da易感(即，没有交叉抗性)。

本发明还部分涉及令人惊讶的发现，即Cry1Da毒素有效保护植物(诸如玉米植物)免于Cry1Fa抗性秋粘虫的损害。关于此害虫的讨论，见例如Tabashnik,PNAS(2008),第105卷No.49,19029-19030。

本发明包括Cry1Da毒素保护玉米和其它经济上重要的植物物种免于由秋粘虫进食(feeding)引起的损害和产量损失或对于已经形成对Cry1Fa的抗性的秋粘虫群的用途。

如此，本发明教导了阻止或减轻秋粘虫对Cry1Fa和/或Cry1Da的抗性形成的IRM叠加。

本发明提供了用于控制鳞翅目害虫的组合物，其包含生成含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质和含有Cry1Da核心毒素的蛋白质的细胞。

本发明进一步包含转化为生成含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质和含有Cry1Da核心毒素的蛋白质两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。优选地，主题cry1Fa多核苷酸和主题cry1Da多核苷酸在遗传构建体中在(可操作连接/包含)非苏云金芽孢杆菌启动子的控制下。主题多核苷酸可以包含在植物中表达增强的密码子选择。

另外，意图本发明提供一种控制鳞翅目害虫的方法，包括使所述害虫或所述害虫的环境与有效量的组合物接触，所述组合物含有含Cry1Fa核心毒素的蛋白质，并且进一步含有含Cry1Da核心毒素的蛋白质。

本发明的一个实施方案包括玉米植物及此类植物的种子，所述玉米植物包含编码含有Cry1Da核心毒素的蛋白质的植物可表达基因和编码含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物可表达基因。

本发明的又一个实施方案包括玉米植物及此类植物的种子，其中已经将编码含有Cry1Da核心毒素的蛋白质的植物可表达基因和编码含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物可表达基因渐渗入所述玉米植物中。

昆虫受体。如实施例中所描述的，使用放射性标记的Cry1Da核心毒素蛋白的竞争受体结合研究显示了Cry1Fa核心毒素蛋白不竞争FAW昆虫组织中存在的Cry1Da结合的高亲和力结合位点。这些结果指示，Cry1Fa和Cry1Da蛋白的组合是一种减轻FAW群中对Cry1Fa的抗性形成(及同样地，对Cry1Da的抗性形成)的有效手段，并且会有可能提高表达这两种蛋白质的玉米植物中对此害虫的抗性的水平。

如此，部分基于上文及本文中别处描述的数据，认为可以使用Cry1Da和Cry1Fa蛋白的共生成(叠加)来生成针对FAW的高剂量IRM叠加。可以对此组合添加其它蛋白质以扩充昆虫控制谱。例如，在玉米中，Cry1Ab的添加会创建用于控制欧洲玉米螟的IRM金字塔。

另一个部署选项会是与另一种第三毒素/基因组合使用Cry1Fa和Cry1Da蛋白，以及使用此三重叠加来减轻FAW中对这些毒素之任一种的抗性的形成。如此，本发明的另一个部署选项会是在FAW可以形成抗性群体的作物生长区中使用这些蛋白质中的一种、两种、或三种(或更多种)。因而，本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔”，其中Cry1Fa和Cry1Da毒素是基础对。一种优选的金字塔提供至少两种蛋白质，其提供针对两种害虫，即FAW和ECB(欧洲玉米螟；玉米螟)的非交叉抗性活性：Cry1Fa及Cry1Da及一种或多种ECB毒素诸如Cry1Ab(见US 20080311096)，因为Cry1F针对这两种昆虫都有活性。其它ECB毒素包括Cry1Be(见USSN61/284,290；2009年12月16日提交)、Cry1I(见USSN 61/284,278；2009年12月16日提交),Cry2Aa(见USSN 61/284,278；2009年12月16日提交)和DIG-3(见US 201000269223)。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的毒素具有针对FAW的三种不同作用模式。这些优选的“三种作用模式”金字塔组合是Cry1Fa及Cry1D及选自下组的另一种毒素/基因：Vip3Ab、Cry1C(见USSN61/284,281；2009年12月16日提交)、Cry1Be、和Cry1E (见USSN 61/284,278；2009年12月16日提交)。生成这三种毒素的植物(和种植有此类植物的土地面积)包括在本发明的范围内。也可以添加其它毒素/基因，但是依照本发明，这些特定的三重叠加会有利地且令人惊讶地提供针对FAW的三种作用模式。这可以帮助降低或消除避难土地面积的需要。如此，超过10英亩如此种植的田地包括在本发明内。

如此，Cry1Da可以在3基因组合中用于目前处于新性状开发过程的开发I的玉米。Cry1Fa在

SmartStax^TM、和WidesStrike^TM产品中。因而，Cry1Da的使用可以显著降低对其它商业化蛋白质的选择压力。

例如，其它Vip3毒素列于所附附录A中。也可以使用那些GENBANK号来获得本文中公开的或提及的任何基因和蛋白质的序列。

美国专利No.5,188,960和美国专利No.5,827,514描述了适用于用于实施本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质。美国专利No.6,218,188描述了编码适合于用于本发明的含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质的经植物优化的DNA序列。

可以使用本发明中描述的毒素组合来控制鳞翅目害虫。成年鳞翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜为食，并且是传粉的重要实现物(effector)。几乎所有鳞翅目幼虫，即毛虫以植物为食，并且许多是严重的害虫。毛虫在叶上或内部进食或者以植物的根或茎为食，对植物剥夺营养物，而且经常破坏植物的物理支持结构。另外，毛虫以果实、织物、和贮存的谷物和面粉为食，毁坏出售的这些产品或者严重降低其价值。如本文中所使用的，提及鳞翅目害虫指害虫的各个生命阶段，包括幼虫阶段。

本发明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某个点处，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的过渡。Bt毒素的N端杀虫活性的毒素部分称为“核心”毒素。自核心毒素区段至异源原毒素区段的过渡可以大致在毒素/原毒素连接处发生或者，在备选中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游发生向异源原毒素部分的过渡。

举例而言，本发明的一个嵌合毒素是Cry1Fa的完整核心毒素部分(氨基酸1至601)和异源原毒素(C端的氨基酸602)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。作为第二个实施例，本发明的第二嵌合毒素具有Cry1Da的完整核心毒素部分(氨基酸1至619)和异源原毒素(C端的氨基酸620)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自Cry1Ab蛋白毒素。

本领域技术人员会领会，Bt毒素(即使在某个种类诸如Cry1F内)在长度和核心毒素部分向原毒素部分过渡的精确位置上会以一定程度有所变化。通常，Cry1Da和Cry1Fa毒素的长度是约1150至约1200个氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的过渡通常会在全长毒素的约50%-约60%发生。本发明的嵌合毒素会包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此，嵌合毒素会包含Cry1FaBt毒素蛋白的全长的至少约50%或Cry1DaBt毒素蛋白的全长的至少约50%。这通常会是至少约590个氨基酸。关于原毒素部分，整段的Cry1Ab原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端。

基因和毒素。依照本发明有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，而且还包括保留本文中明确例示的毒素的特征性杀虫(pesticidal)活性的这些序列、变体、突变体、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，术语基因的“变体”或“变异”指编码相同毒素或编码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“等同毒素”指与要求保护的毒素具有相同或基本上相同的针对靶害虫的生物学活性的毒素。

如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf，J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum和D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)第62卷:807-813，边界代表约95%(Cry1Fa和1Da)、78%(Cry1F和Cry1D)、和45%(Cry1)序列同一性。这些截留也可以仅仅应用于核心毒素(对于Cry1F和Cry1D毒素)。

对于本领域技术人员应当显而易见的是，可以经由几种手段鉴定并获得编码活性毒素的基因。可以自保藏于培养物保藏所的分离物获得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通过使用基因合成仪以合成方式构建这些基因或其部分或变体。可以使用用于生成点突变的标准技术来容易地构建基因的变异。还有，可以使用商品化的外切核酸酶或内切核酸酶依照标准的规程来生成这些基因的片段。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变自这些基因的末端系统性剪断核苷酸。也可以使用多种限制酶来获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶来直接获得这些蛋白质毒素的活性片段。

保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等同物会在本发明的范围内。还有，由于遗传密码的冗余，多种不同DNA序列可以编码本文中公开的氨基酸序列。完全在本领域技术人员的技术内的是创建编码相同的，或基本上相同的毒素的这些备选DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围内。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有没有实质性影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。编码保留杀虫活性的蛋白质的基因的片段也包括在此定义中。

用于鉴定依照本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的又一种方法是经由使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列凭借合适的标记物可以是可检出的或者可以以固有荧光生成，如记载于国际申请No.WO93/16094的。如本领域中公知的，若探针分子和核酸样品通过形成两种分子间强烈的键来杂交，则可以合理地假设探针和样品具有实质的同源性。优选地，通过本领域中公知的技术在严格条件下进行杂交，如记载于例如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,第169-170页的。盐浓度和温度组合的一些例子如下(以严格性升高的次序)：2X SSPE或SSC于室温；1X SSPE或SSC于42°C；0.1X SSPE或SSC于42°C；0.1X SSPE或SSC于65°C。探针的检测提供了一种用于以已知的方式测定杂交是否已经发生的手段。此类探针分析提供一种用于鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准的规程来合成依照本发明作为探针使用的核苷酸区段。也可以使用这些核苷酸序列作为PCR引物以扩增本发明的基因。

变体毒素。已经在本文中明确例示本发明的某些毒素。因为这些毒素仅是本发明的毒素例示性的，所以应当容易显而易见的是，本发明包括具有例示毒素的相同或相似杀虫活性的变体或等同毒素(和编码等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素与例示的毒素会具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常会大于75%，优选大于90%，且最优选大于95%。氨基酸同源性在毒素中负责生物学活性或者牵涉决定最终负责生物学活性的三维构型的至关重要的区域中会是最高的。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的，并且若这些取代在对于活性不是至关重要的区域中或者是不影响分子的三维构型的保守氨基酸取代，则可以是预期的。例如，氨基酸可以放入以下种类：非极性、不带电荷的极性、碱性、和酸性。其中的一类氨基酸用相同类型的另一种氨基酸替换的保守取代落入本发明的范围内，只要取代不实质性改变化合物的生物学活性。下文是属于每类的氨基酸的例子的列表。

氨基酸的种类	氨基酸的例子
		非极性	Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp
不带电荷的极性	Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln
		酸性	Asp,Glu
碱性	Lys,Arg,His

在一些情况中，也可以进行非保守取代。至关重要的因素是这些取代必须不显著降低毒素的生物学活性。

重组宿主。可以将编码本发明的毒素的基因导入极其多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫剂(pesticide)的胞内生成和维持。可以使用接合转移和重组转移来创建表达本发明的两种毒素的Bt菌株。也可以用一种或两种毒素基因转化其它宿主生物体，所述毒素基因然后用于实现协同效应。凭借合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可以将微生物应用于害虫的位置，在那里它们会增殖并被摄取。结果是对害虫的控制。或者，可以在延长毒素的活性并且稳定细胞的条件下处理为毒素基因做宿主的微生物。然后，可以将经处理的细胞(其保留毒性活性)应用于靶害虫的环境。

在经由合适的载体将Bt毒素基因导入微生物宿主中，且将所述宿主应用于生活状态的环境的情况中，使用某些宿主微生物是必要的。选择如下的微生物宿主，已知所述微生物宿主占据一种或多种感兴趣作物的“植物圈”(叶面(phylloplane)、叶圈、根际、和/或根面)。这些微生物选择为使得能够在特定环境(作物和其它昆虫生境)中与野生型微生物成功竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定维持和表达，且期望地，提供改善的保护杀虫剂免于环境降解和灭活。

已知大量微生物驻留于极其多种重要的作物的叶面(植物叶的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobactenum)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳酸菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，例如属酵母菌属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈细菌物种，诸如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobacteniumtumefaciens)、类球红细胞(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈真菌物种，诸如深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、胶红类酵母菌(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母菌(R.aurantiaca)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、液化隐球菌(C.diffluens)、劳伦梯氏隐球菌(C.laurentii)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpollulans)。特别感兴趣的是色素性微生物。

极其多种方法可用于在容许基因的稳定维持和表达的条件下将编码毒素的Bt基因导入微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员公知的，并且记载于例如美国专利No.5135867，通过提及而将其收入本文。

细胞的处理。可以处理表达Bt毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞以延长毒素活性并稳定细胞。形成的杀虫剂微囊体包含在已经稳定化的细胞结构内的一种或多种Bt毒素，并且在将微囊体应用于靶害虫的环境时会保护毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常不限于那些不生成对于高等生物体，诸如哺乳动物有毒性的物质的细胞。然而，可以使用生成对于高等生物体有毒性的物质的生物体，其中毒性物质是不稳定的或应用水平充分降低，从而避免对哺乳动物宿主的毒性的任何可能性。作为宿主，特别感兴趣的会是原核生物和低等真核生物，诸如真菌。

细胞通常会是完整的，并且在处理时基本上为增殖形式，而不是为孢子形式，尽管在一些情况中可以采用孢子。

可以通过化学或物理手段，或者通过化学和/或物理手段的组合来处理微生物细胞，例如含有一种或多种B.t.毒素基因的微生物，只要所述技术没有不利地影响毒素的特性，也不降低保护毒性的细胞性能。化学试剂的例子是卤化剂，特别是原子数17-80的卤素。更特别地，可以将碘在温和(mild)条件下且持续足够的时间使用，使得实现期望的结果。其它合适的技术包括用醛，诸如戊二醛；抗感染药，诸如氯化苄烷铵(zephiran chloride)和西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)；醇，诸如异丙基和乙醇；各种组织固定剂，诸如Lugol碘、Bouin氏固定剂、各种酸和Helly氏固定剂(见：Humason,Gretchen L.,Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或在对宿主环境施用细胞时保留并延长细胞中生成的毒素的活性的物理(热)和化学剂的组合处理。物理手段的例子是短波长辐射，诸如gamma-辐射和X-辐射、冷冻、UV照射、冻干等。用于处理微生物细胞的方法披露于美国专利No.4,695,455和4,695,462，通过提及而将其收入本文。

细胞一般会具有增强的结构稳定性，这会增强对环境条件的抗性。在杀虫剂为原型(proform)的情况中，细胞处理的方法应当选择为使得不抑制靶害虫病原体将原型加工成杀虫剂的成熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质，而且可以抑制对多肽杀虫剂的原型的加工。处理方法应当至少保留毒素的生物利用度或生物活性的实质性部分。

出于生成目的选择宿主细胞中特别感兴趣的特征包括容易将一种或多种B.t.基因导入宿主中、表达系统的利用度、表达效率、杀虫剂在宿主中的稳定性、和辅助遗传性能的存在。作为杀虫剂微囊体使用的感兴趣特征包括杀虫剂的保护质量，诸如厚的细胞壁、色素沉着、和包含体的胞内包装或形成；在水性环境中存活；缺乏哺乳动物毒性；对摄食的害虫的吸引力；在不损害毒素的情况中容易杀死和固定；等等。其它考虑因素包括容易配制和处理、经济、贮存稳定性，等等。

细胞生长。可以将含有一种或多种B.t.杀虫基因的细胞宿主在任何便利的营养培养基中培养，其中DNA构建体提供选择优势，提供选择培养基，使得基本上所有或所有细胞保留B.t.基因。然后，可以依照常规的方式收获这些细胞。或者，可以在收获前处理细胞。

可以使用标准技术培养基和发酵技术来培养生成本发明的毒素的B.t.细胞。在完成发酵周期后，可以如下收获细菌，即首先通过本领域中公知的手段自发酵培养基分离B.t.孢子和晶体。可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它组分将回收的B.t.孢子和晶体配制成可湿的粉末、液体浓缩物、颗粒剂或其它配制剂以便于针对特定的靶害虫的处理和应用。这些配制剂和应用规程是本领域中公知的。

配制剂(formulation)。可以将含有引诱剂和B.t.隔离群、或包含自本文中公开的B.t.隔离群可获得的基因的重组微生物的孢子、晶体、和毒素的配制的诱饵颗粒剂应用于土壤。也可以将配制的产物以种子涂层材料或根处理或总体植物处理在作物周期的后期阶段应用。B.t.细胞的植物和土壤处理可以以可湿的粉末、颗粒或粉尘采用，其通过混合各种惰性材料，诸如无机矿物质(叶硅酸盐(phyllosilicate)、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(粉状玉米穗轴、稻壳、胡桃壳等)来实现。配制剂可以包含展着剂-粘着剂(spreader-sticker)佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体配制剂可以是基于水性的或非水性的，并且以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等采用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。

如本领域技术人员会领会的，杀虫浓度会随特定配制剂的性质，特别是它是浓缩物还是要直接使用而广泛变化。杀虫剂会以至少1%(按重量计)存在，并且可以是100%(按重量计)。干配制剂会具有约1-95%(按重量计)的杀虫剂，而液体配制剂一般会是液相中约1-60%(按重量计)的固体。配制剂一般会具有约102至约104个细胞/mg。这些配制剂会以每公顷约50mg(液体或干的)至1kg或更多施用。

可以通过喷雾、喷粉、喷洒等将配制剂应用于鳞翅目害虫的环境，例如叶或土壤。

植物转化。一种用于生成本发明的杀虫蛋白的优选的重组宿主是经转化的植物。可以使用本领域中公知的多种技术来将如本文中所公开的编码Bt毒素蛋白的基因插入植物细胞中。例如，包含大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制系统和容许选择经转化的细胞的标志物的大量克隆载体可用于准备好将外来基因插入高等植物中。例如，载体包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184，等等。因而，可以将具有编码Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合适的限制性位点插入载体中。可以使用所得的质粒对大肠杆菌转化将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。将质粒回收。序列分析、限制性分析、电泳、和其它生物化学-分子生物学方法一般作为分析方法实施。在每次操作后，可以将使用的DNA序列切割，并与下一DNA序列连接。可以在同一或其它质粒中克隆每个质粒序列。根据将期望的基因插入植物中的方法，其它DNA序列可以是必要的。如果例如使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右侧边界，但是经常是右侧和左侧边界必须作为要插入的基因的侧翼区连接。T-DNA转化植物细胞的用途已经透彻研究，并且充分记载于EP 120516,Lee和Gelvin (2008),Hoekema(1985),Fraley等,(1986),及An等,(1985)，而且是本领域中完善建立的。

一旦将插入的DNA在植物基因组中整合，它便是相对稳定的。转化载体通常含有选择标志，其对经转化的植物细胞赋予对抗微生物剂或抗生素诸如Bialaphos、卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素等的抗性。因而，个别采用的标志物应当容许选择经转化的细胞，而不是不含插入的DNA的细胞。

大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA的转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、或电穿孔以及其它可能的方法。若使用土壤杆菌进行转化，则必须将要插入的DNA克隆入特殊的质粒中，即克隆入中间载体中或克隆入二元载体中。可以通过由于与T-DNA中的序列同源的序列所致的同源重组将中间载体整合入Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含转移T-DNA必需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中自身复制。可以依靠辅助质粒将中间载体转移入根癌土壤杆菌中(接合)。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌中都能自身复制。它们包含选择标志基因和接头或多接头，其以右侧和左侧T-DNA边界区为框。可以将它们直接转化入土壤杆菌中(Holsters等,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包含携带vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移入植物细胞中必需的。可以含有别的T-DNA。使用如此转化的细菌来转化植物细胞。有利地，可以将植物外植体与根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌一起培养以将DNA转移入植物细胞中。然后，可以在可含有供选择用的抗生素或抗微生物剂的选择培养基中自感染的植物材料(例如，叶块、柄(stalk)段、根，而且还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生全植物。然后，可以对如此获得的植物测试插入的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中质粒没有特殊需要。有可能使用普通的质粒，诸如例如pUC衍生物。

经转化的细胞以常见的方式在植物内部生长。它们可以形成生殖细胞，并且将转化的性状传递给后代植物。可以将此类植物以正常的方式培养，并且与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得的杂种个体具有相应的表型特性。

在本发明的一个优选的实施方案中，会用基因转化植物，其中已经对植物优化密码子选择。见例如美国专利No.5380831，在此通过提及而将其收录。虽然在本文中例示了一些截短的毒素，但是Bt领域中公知的是，130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N端半部分和作为原毒素“尾部”的C端半部分。如此，合适的“尾部”可以与本发明的截短的/核心毒素一起使用。见例如美国专利No.6218188和美国专利No.6673990。另外，用于创建用于植物的合成Bt基因的方法是本领域中已知的(Stewart和Burgin,2007)。优选的转化植物的一个非限制性例子是能育的玉米植物，其包含编码Cry1Fa蛋白的植物可表达基因，而且进一步包含编码Cry1Da蛋白的第二植物可表达基因。

可以通过轮回选择育种，例如通过回交来实现Cry1Fa-和Cry1Da-决定性状对近交玉米系的转移(或渐渗入。在此情况中，首先将期望的轮回亲本与携带适合于Cry1F-和Cry1D-决定性状的基因的供体近交物(非轮回亲本)杂交。然后，将此杂交的后代与轮回亲本回交(mate back)，接着在所得的后代中选择要自非轮回亲本转移的期望的性状。在与轮回亲本回交及选择期望的性状的3个，优选地4个，更优选地5个或更多个世代后，后代在控制所转移的性状的基因座方面会是杂合的，但是在大多数或几乎所有其它基因方面会与轮回亲本一样(见例如Poehlman和Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版,172-175;Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第1卷:Theoryand Technique,360-376)。

昆虫抗性管理(IRM)策略。例如，Roush等概述了2毒素策略，又称作“金字塔化(pyramiding)”或“叠加”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。

在其网站上，美国环境保护局(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了提供与生成针对靶害虫有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的非转基因(即，非B.t.)避难所(非Bt作物/玉米的部分)的下列要求。

“玉米螟防护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米产品的特定结构化需要如下：

结构化避难所：玉米带中20%非鳞翅目Bt玉米避难所；

棉花带中50%非鳞翅目Bt避难所

区组

内部(即，在Bt田内)

外部(即，在1/2英里(若可能的话，1/4英里)Bt田内的不同田地以使随机杂交最大化)

田间条(Strip)

条必须宽至少4行(优选地6行)以降低幼虫运动的效果”

另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)，在其网站上：

(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

还提供关于避难所需要的类似指导。例如：

“玉米螟IRM的要求：

-以避难杂种种植至少20%的玉米地

-在棉花生产区中，避难所必须是50%

-必须在1/2英里的避难杂种内种植

-避难所可以在Bt田内以条种植；避难条必须宽至少4行

-只有当对靶昆虫达到经济阈值时，可以用常规的杀虫剂处理避难所

-基于Bt的可喷射的杀虫剂不能对避难玉米使用

-必须在有Bt玉米的每个农场种植合适的避难所”

如由Roush等(例如第1780和1784右栏)所述，各自针对靶害虫有效的且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的叠加或金字塔化可以容许使用更小的避难所。Roush提示，对于成功的叠加，小于10%避难所的避难所大小可以提供与单一(非金字塔化)性状的约50%避难所相当的抗性管理。对于目前可用的金字塔化Bt玉米产品，美国环境保护局要求比对于单一性状产品(一般为20%)显著更少(一般为5%)的非Bt玉米的结构化避难所。

存在有提供避难所的IRM效果的多种方式，包括田间的各种几何种植样式(如上文所提及的)和袋中种子混合物，如由Roush等(见上文)及美国专利No.6,551,962进一步讨论的。

可以对主题双重或三重叠加或金字塔使用上述百分比、或类似的避难所比率。对于具有针对单一靶害虫的三种作用模式的三重叠加，目的会是0避难所(或例如小于5%避难所)。这特别适用于商业面积—例如超过10英亩的。

本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物通过提及以它们与本说明书的明确教导不矛盾的程度完整收录。

以下是例示用于实施本发明的规程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另有记录，所有百分比是按重量计，而所有溶剂混合物比例是按体积计。所有温度以摄氏度计。

如本文中所使用的，除非明确指示或暗示，术语“一个”、“一种”、和“该/所述”表示“至少一个/种”。

实施例1

生物测定数据

转基因玉米(pDAS5163)中表达的Cry1Da提供保护免于秋粘虫(FAW)草地夜蛾食用(J.E.Smith)。相同事件在控制已经形成对Cry1Fa的抗性的FAW中更有效，并且明显优于含有事件TC1507的玉米植物，所述事件TC1507可论证是用于FAW控制的行业领先的昆虫抗性性状。

我们还已经证明了Cry1Fa(来自重组荧光假单胞菌菌株DR1649的蛋白质；质粒pDAB1817)和Cry1Da(来自重组荧光假单胞菌菌株DC782的蛋白质)都有效控制人工饮食生物测定法中的FAW，而且组合的效力大于自其个别效力预期的。

基于上文所描述的数据，共表达Cry1Da和Cry1Fa可以针对FAW、其它重要的夜蛾(Spodoptera)物种、和可能其它鳞翅目害虫生成高剂量的IRM叠加。可以对此组合添加其它蛋白质以增加谱。例如在玉米中，Cry1Ab的添加会为欧洲玉米螟(ECB)，玉米螟(Hübner)创建IRM叠加。

如图1中所显示的，对被FAW(蓝色棒)或rFAW(紫色棒)侵扰的玉米叶节的损伤(均值%叶损伤+SEM)。前面有数字“5163”的所有处理是来自用含有Cry1Da的构建体转化的植物的叶节。在图的左远侧分组未检出Cry1Da表达的植物。在图的中间分组检出Cry1Da表达的植物。非转基因(即，阴性)对照在图的右远侧，并且标记为“B104”、“HiII”、和“Isoline”。含有Cry1Fa的商业近交物是右侧的第一处理(标记为“Herculex I”)，并且是与标记为“Isoline”的非转基因对照相同的遗传背景。

创建原毒素嵌合物，并将其工程化改造入能够指导玉米(pDAS5163)中的表达的表达盒中，所述原毒素嵌合物由Cry1Da的经胰蛋白酶切割的极限毒素(limit toxin)的编码序列和Cry1Ab的c端原毒素区的编码序列组成。使用根癌土壤杆菌转化玉米，并鉴定含有Cry1Da/1Ab嵌合物的事件。用野生型秋粘虫(FAW)或来自对Cry1Fa有抗性的秋粘虫群体(rFAW)的幼虫生物测定来自再生植物的叶部分。经Cry1Da/1Ab转化的植物确实降低FAW的食用，但是不如含有2个拷贝的Cry1Fa的近交物那样有效(图1)。(测试的Cry1Da事件在转基因方面是半合子的，而转化的近交物在事件TC1507方面是纯合的)。相反，一般地，含有Cry1Da/1Ab的相同事件在降低rFAW的食用方面比含有Cry1Fa的近交物有效得多(图1)。

在用于评估效力的标准的、人工的饮食生物测定法中测试Cry1Fa(来自重组荧光假单胞菌菌株DR1649的蛋白质；质粒pDAB1817)、Cry1Da(来自重组荧光假单胞菌菌株DC782的蛋白质)、和2种的1:1(w:w)组合的杀虫活性。使用LOGIT分析(

8.0,SAS Inc.2008)进行效力评估，所述LOGIT分析产生LC₅₀评估值和LC₅₀的上和下限(95%)。使用由Tabashnik(1992)描述的方法来进行协同测试，所述方法使用每个单独组分的效力来计算组合的效力的预期值。在组合的评估置信上限低于计算的预期效力时，认为组合是协同的。在秋粘虫(FAW)和对Cry1Fa有抗性的秋粘虫群体(rFAW)的情况中，组合的LC₅₀的置信上限低于评估的效力(表1和2)，由此得到如下的结论，即Cry1Fa和Cry1Da的组合对这2个群体是协同的。

表1。Cry1Fa、Cry1Da、和2种的1∶1(w;w)组合对野生型秋粘虫(FAW)草地夜蛾的效力评估值、95%置信区间的上和下限(分别为LCL和UCL)。最后一栏含有基于使用由Tabashnik(1992)Tabashnik BE.Evaluation of synergismamong Bacillus thuringiensis toxins.Applied and Environmental Microbiology58[10],3343-3346.1992描述的公式得到的每种单独的蛋白质的效力的预期LC₅₀值。在预期值高于组合的置信上限时，认为组合是协同的。

表2。Cry1Fa、Cry1Da、和2种的1∶1(w;w)组合对Cry1Fa抗性秋粘虫(rFAW)草地夜蛾的效力评估值、95%置信区间的上和下限(分别为LCL和UCL)。最后一栏含有基于使用由Tabashnik(1992)描述的公式得到的每种单独的蛋白质的效力的预期LC₅₀值。在预期值高于组合的置信上限时，认为组合是协同的。

实施例2

结合数据的汇总

下文描述了用经¹²⁵I标记的Cry1Da进行的竞争结合实验，其使用自FAW分离的刷状缘膜囊(BBMV)进行。来自这些实验的结果表明Cry1Da紧密结合其受体，而且Cry1Fa不与Cry1Da竞争结合位点。若对Cry1Da的抗性可以基于这些研究中观察到的受体的突变，则这些数据提示Cry1Fa会是一种用于管理此类抗性群体或减轻此类抗性形成的良好IRM工具。来自用Cry1Fa抗性FAW(rFAW)的生物测定法的结果表明Cry1Da对此群体有活性。这些数据共同提示Cry1Fa和Cry1Da可以是有效减轻对任一种杀虫蛋白的抗性形成的IRM叠加。

受体结合测定法显示了¹²⁵I Cry1Da紧密结合其受体，并且可以被未标记的Cry1Da有效竞争掉。Cry1Ab、Cry1Fa或Cry1Be都不能自FAW BBMV中其受体位点竞争掉¹²⁵I Cry1Da，指示Cry1Da具有FAW中肠中Cry1Ab、Cry1F和Cry1Be不竞争的独特结合位点。因为rFAW与野生型FAW一样对Cry1Da敏感，所以这指示rFAW昆虫中改变的假定的受体位点不是Cry1Da结合的受体位点。如此，Cry1Da是Cry1Fa的一种卓越的叠加配偶物，因为它在负责其生物学活性的不同靶位点相互作用。

在对FAW BBMV添加¹²⁵I Cry1Da时，仅非放射性标记的Cry1Da自身能够置换结合的¹²⁵I Cry1Da。Cry1Fa、Cry1Ab和Cry1Be不能自BBMV置换结合的¹²⁵I Cry1Da指示在FAW中肠中，Cry1Da结合Cry1Fa、Cry1Ab和Cry1Be不相互作用的独特受体位点，即使所有这四种不同Cry毒素针对FAW幼虫是有活性的。

实施例3

包含Cry1核心毒素和异源原毒素的嵌合毒素的设计

嵌合毒素。先前已经在例如美国专利No.5593881和美国专利No.5932209中报告了利用与另一种Cry毒素的原毒素区段融合的一种Cry毒素的核心毒素域的嵌合蛋白。

本发明的Cry1Da嵌合蛋白变体包括如下的嵌合毒素，其包含源自Cry1Da杀虫毒素的N端核心毒素区段和与其融合的超出核心毒素区段末端的某个点的异源delta内毒素原毒素区段。自核心毒素至异源原毒素区段的过渡可以大致在天然核心毒素/原毒素连接处发生或者，在备选中，天然原毒素(超出核心毒素区段延伸)的一部分可以得到保留，其中在下游发生向异源原毒素的过渡。在变体融合物中，核心毒素和原毒素区段可以正好包含衍生它们的天然毒素的氨基酸序列，或者可以包含在彼此融合时不降低，而且可以提高各区段的生物学功能的氨基酸添加、缺失、或取代。

例如，本发明的嵌合毒素包含源自Cry1Da的核心毒素区段和异源原毒素。在本发明的一个优选的实施方案中，源自Cry1Da2的核心毒素区段(594个氨基酸)与包含源自Cry1Ab delta-内毒素的原毒素区段(545个氨基酸)的异源区段融合。嵌合蛋白的1139个氨基酸的序列在本文中称为Cry1Da。应当理解，包含Cry1Da2核心毒素变体和源自Cry1Ab的原毒素的其它嵌合融合物在本发明的范围内。

本发明的第二嵌合蛋白包含源自Cry1Fa的核心毒素区段(603个氨基酸)和与其融合的异源区段，该异源区段包含源自Cry1Ab delta-内毒素的原毒素区段(545个氨基酸)。嵌合蛋白的1148个氨基酸的序列在本文中称作Cry1Fa。

实施例4

编码嵌合蛋白的表达质粒的构建和假单胞菌属中的表达

在工程化改造为生成全长Cry1Da嵌合蛋白的荧光假单胞菌(Pf)表达构建体pDOW2848的构建中使用标准的克隆方法[如记载于例如Sambrook等,(1989)和Ausubel等,(1995)及其更新]。在具有经修饰的lac操纵子插入的荧光假单胞菌菌株MB214(菌株MB101的衍生物；荧光假单胞菌生物变型I)中实施蛋白质生成，如美国专利No.5169760所披露的。基础克隆策略需要将编码Cry1Da蛋白的DNA片段亚克隆入质粒载体中，由此将其在来自质粒pKK223-3(PL Pharmacia,Milwaukee,WI)的Ptac启动子和rrnBT1T2终止子的表达控制下放置。一个此类质粒称作pDOW2848，而含有此质粒的MB214隔离群称作Dpf150。

在摇瓶中的生长和表达分析。通过摇瓶培养的荧光假单胞菌菌株Dpf150来实现供表征和昆虫生物测定法用的Cry1Da蛋白的生成。进行由Ptac启动子驱动的Cry1Da蛋白生成，如先前记载于美国专利No.5527883的。微生物学操作的详情在Squires等,(2004)、美国专利申请20060008877、美国专利申请20080193974、和美国专利申请20080058262(通过提及而将它们收入本文)中可获得。通过于30°在摇动的情况中24小时的初始温育后添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)来诱导表达。在诱导时和诱导后的多个时间对培养物取样。通过600nm的光密度(OD₆₀₀)测量细胞密度。

摇瓶样品的细胞分级和SDS-PAGE分析。在每个取样时间，将样品的细胞密度调节至OD₆₀₀=20，并将1mL等分试样以14000x g离心5分钟。将细胞团粒于-80°冷冻。使用EasyLyse^TM细菌蛋白提取溶液(

Biotechnologies,Madison,WI)生成来自冷冻烧瓶细胞团粒样品的可溶性和不溶性级分。将每个细胞团粒在1mL EasyLyse^TM溶液中重悬，并在裂解缓冲液中以1:4进一步稀释，并在摇动的情况中于室温温育30分钟。将裂解物于4°以14,000rpm离心20分钟，并将上清液以可溶性级分回收。然后，将团粒(不溶性级分)在等体积的磷酸盐缓冲液盐水(PBS；11.9mM Na₂HPO₄、137mMNaCl、2.7mM KCl，pH7.4)中重悬。

将样品与含有β-巯基乙醇的2X Laemmli样品缓冲液(Sambrook等,见上文)以1:1混合，并煮沸5分钟，之后上样到Criterion XT Bis-Tris 12%凝胶(Bio-Rad Inc.,Hercules,CA)上。在推荐的XT MOPS缓冲液中实施电泳。用Bio-Safe考马斯染料依照制造商的(Bio-Rad)方案对凝胶染色，并使用AlphaInnotech Imaging系统(San Leandro,CA)成像。

内含体制备。对来自荧光假单胞菌发酵的细胞实施Cry1Da蛋白内含体(IB)制备，所述细胞生成不溶性Bt杀虫蛋白，如通过SDS-PAGE和MALDI-MS(基质辅助激光解吸/离子化质谱术)表明的。将荧光假单胞菌发酵团粒在37°水浴中融合。将细胞以25%w/v在裂解缓冲液[50mM Tris,pH 7.5,200mMNaCl、20mM EDTA二钠盐(乙二胺四乙酸)、1%Triton X-100、和5mM二硫苏糖醇(DTT)；刚好在使用前添加5mL/L细菌蛋白酶抑制剂混合物(产品目录编号P8465;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)]中重悬。使用手持式匀浆器以最低设置(Tissue Tearor,BioSpec Products,Inc.,Bartlesville,OK)悬浮细胞。通过用金属刮铲混合将溶菌酶(25mg Sigma L7651，来自鸡蛋清)添加至细胞悬浮液，并将悬浮液于室温温育1小时。将悬浮液在冰上冷却15分钟，然后使用Branson超声波仪250(2个1-分钟时间，以50%工作循环，30%输出)超声处理。通过显微术检查细胞裂解。若必要的话，再添加25mg溶菌酶，并重复温育和超声处理。经由显微术确认细胞裂解后，将裂解物以11,500x g离心25分钟(4°)以形成IB团粒，并弃去上清液。如上文，将IB团粒用100mL裂解缓冲液重悬，用手持式混合仪均质化，并离心。通过重悬(在50mL裂解缓冲液中)、匀质化、超声处理和离心来重复清洗IB团粒，直至上清液变为无色，并且IB团粒变为坚固且灰白色颜色。对于最后一次清洗，将IB团粒在含有2mM EDTA的无菌过滤(0.22μm)蒸馏水中重悬，并离心。将最终的团粒在含有2mM EDTA的无菌过滤蒸馏水中重悬，并在1mL等分试样中于-80°贮存。

通过融化1mL IB团粒的等分试样，并用无菌过滤的蒸馏水以1:20稀释来完成对IB制备物中的蛋白质的SDS-PAGE分析和定量。然后，将稀释的样品在4X还原性样品缓冲液[250mM Tris,pH6.8、40%甘油(v/v)、0.4%溴酚蓝(w/v)、8%SDS(w/v)和8%β-巯基乙醇(v/v)]的情况中煮沸，并与1X Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(BioRad)一起上样到4-20%Tris-甘氨酸，12+2孔凝胶(Invitrogen)运行上。将凝胶以200伏特运行60分钟，然后用考马斯蓝(45%甲醇、10%乙酸中的50%G-250/50%R-250)染色，并用蒸馏水中的7%乙酸、5%甲醇脱色。通过针对在同一凝胶上运行以产生标准曲线的牛血清清蛋白(BSA)标准样品比较条带的密度计数值来完成靶条带的量化。

内含体的溶解。按Eppendorf 5415C型离心机的最高设置(约14,000xg)离心来自Pfd隆DPf150的6mL Cry1Da内含体悬浮液以沉淀内含物。将贮存缓冲上清液除去，并在50mL圆锥管中用25mL 100mM碳酸钠缓冲液pH11更换。使用移液管重悬内含体，并涡旋振荡，以彻底混合。将管在温和摇动的平台上于4°放置过夜以提取靶蛋白。将提取物于4°以30,000x g离心30分钟，并使用Amicon Ultra-15再生纤维素离心滤器装置(30,000分子量截留；Millipore)将所得的上清液浓缩5倍。然后，使用一次性PD-10柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)将样品缓冲液改变为10mM CAPS[3-(环己氨)1-丙磺酸]pH10。

内含体蛋白质的溶解和胰蛋白酶活化。在一些情况中，按Eppendorf5415C型离心机的最高设置(约14,000x g)离心来自Pf克隆DPf150的Cry1Da内含体悬浮液以沉淀内含物。将贮存缓冲上清液除去，并用100mM CAPS,pH11更换以提供约50mg/mL的蛋白质浓度。将管于室温摇动3小时，以完全溶解蛋白质。以与5%至10%(w:w，基于IB粉末的初始重量)相等的量添加胰蛋白酶，并通过在摇动的情况中于4°温育过夜或者通过于室温摇动90-120分钟实现消化。通过以10,000x g离心15分钟除去不溶性材料，并将上清液应用于MonoQ阴离子交换柱(10mm乘10cm)。通过0%至100%1M NaCl梯度在25个柱体积里洗脱活化的Cry1Da蛋白(如通过SDS-PAGE测定的，见下文)。将含有活化的蛋白质的级分合并，并在必要时，如上文使用Amicon Ultra-15再生纤维素离心过滤装置浓缩至小于10mL。然后，将材料在含有100mM NaCl、10%甘油、0.5%Tween-20和1mM EDTA的缓冲液中通过Superdex 200柱(16mm乘60cm)。通过SDS-PAGE分析测定的是，活化的(酶截短的)蛋白质以65至70mL洗脱。将含有激活的蛋白质的级分合并，并如上文使用离心浓缩器浓缩。

凝胶电泳。通过在含有5mM DTT作为还原剂的

LDS样品缓冲液(Invitrogen)中以1:50稀释制备浓缩的蛋白质制备物以供电泳用，并于95°加热4分钟。将样品在4-12%

凝胶的一式两份道中在范围为0.2μg至2μg/道的5个BSA标准品(对于标准曲线产生)旁边上样。使用MOPS SDS运行缓冲液(Invitrogen)以200V应用电压，直至示踪染料达到凝胶底部。将凝胶用45%甲醇、10%乙酸中的0.2%考马斯蓝G-250染色，并首先用45%甲醇、10%乙酸短暂，然后用7%乙酸、5%甲醇充分脱色，直至清除背景。在脱色后，用BioRad Fluor-S MultiImager扫描凝胶。使用仪器的Quantity One软件v.4.5.2获得染色蛋白质条带的扣除背景的体积，并且产生BSA标准曲线，其用于计算储备溶液中的嵌合Cry1Da蛋白的浓度。

实施例5

Cry1Fa和Cry1Da核心毒素蛋白的制备和草地夜蛾刷状缘膜囊的分离以供竞争结合实验用

以下实施例评估Cry1核心毒素蛋白对昆虫肠组织中的推定受体的竞争结合。显示了经¹²⁵I标记的Cry1Da核心毒素蛋白以高亲和力结合自草地夜蛾(秋粘虫)制备的刷状缘膜囊(BBMV)，而且Cry1Fa核心毒素蛋白不竞争此结合。

Cry蛋白的纯化。在荧光假单胞菌表达菌株中表达编码嵌合Cry1Da蛋白的基因，如实施例4中所描述的。在相似的方式中，在Pf系统中表达编码包含Cry1Fa核心毒素(603个氨基酸)和Cry1Ab蛋白(545个氨基酸)的嵌合蛋白的基因。在Cry1Fa情况中，表达质粒称作pDAB1817，而含有pDAB1817的荧光假单胞菌菌株称作DPf129。通过实施例4的方法纯化蛋白质，然后实施胰蛋白酶消化以自全长蛋白质生成活化的核心毒素，并通过实施例4中所描述的方法纯化产物。胰蛋白酶加工的(活化的核心毒素)蛋白质的制备物是大于95%纯的，并且具有约65kDa的分子量，如通过SDS-PAGE实验测定的。如本文中所使用的，自Cry1Da蛋白制备的活化的核心毒素称作Cry1Da核心毒素蛋白，而自Cry1Fa蛋白制备的活化的核心毒素称作Cry1Fa核心毒素蛋白。

溶解的BBMV的制备和分级。采用蛋白质量化和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准方法，如例如Sambrook等(1989)和Ausubel等(1995)及其更新中教导的。

将末龄草地夜蛾幼虫禁食过夜，然后在冰上冷冻15分钟后解剖。自体腔取出中肠组织，留下附着于体壁的后肠。将中肠在9X体积的冰冷均质化缓冲液(300mM甘露醇、5mM EGTA、17mM Tris碱，pH7.5)(其补充有如供应商推荐的那样稀释的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich P-2714))中放置。用玻璃组织匀浆器的15次撞击(stroke)将组织均质化。通过Wolfersberger(1993)的MgCl₂沉淀法制备BBMV。简言之，将300mM甘露醇中的等体积24mM MgCl₂溶液与中肠均浆混合，搅动5分钟，并容许在冰上竖立15分钟。将溶液于4°以2,500x g离心15分钟。将上清液保留，并将团粒悬浮到初始体积的0.5X稀释的均质化缓冲液中，并再次离心。将两种上清液组合，并于4°以27,000x g离心30分钟以形成BBMV级分。将团粒以约3mg/mL的蛋白质浓度悬浮到BBMV贮存缓冲液(10mM HEPES、130mM KCl、10%甘油，pH7.4)中。使用牛血清清蛋白(BSA)作为标准品测定蛋白质浓度。使用QuantiChrom^TMDALP-250碱性磷酸酶测定试剂盒(Gentaur Molecular Products,Kampenhout,BE)遵循制造商的用法说明书在冷冻样品前进行碱性磷酸酶测定(一种用于BBMV级分的标志物酶)。此酶的比活通常比存在于起始中肠均浆级分中的比活升高7倍。将BBMV等分取样到250μL样品中，在液氮中速冻，并于–80°贮存。

电泳。还原性(即在5%β-巯基乙醇中，BME)和变性(即，在存在2%SDS的情况中于90°加热5分钟)条件下进行通过SDS-PAGE对蛋白质的分析。将蛋白质上样到4%至20%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(BioRad;Hercules,CA)的孔中，并于200伏特分离60分钟。通过用考马斯亮蓝R-250(BioRad)染色1小时来检测蛋白质条带，并用7%乙酸中的5%甲醇溶液脱色。将凝胶成像，并使用BioRad Fluro-S Multi Imager^TM分析。通过与上样到凝胶的一个孔中的BenchMark^TM蛋白质梯(Life Technologies,Rockville,MD)样品中观察到的已知分子量蛋白质的迁移率比较来测定蛋白质条带的相对分子量。

Cry1Da核心毒素蛋白的碘化。使用Pierce碘化珠(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)来碘化纯化的Cry1Da核心毒素蛋白。简言之，将两个碘化珠用500μL PBS(20mM磷酸钠、0.15M NaCl,pH7.5)清洗两次，并放入具有100μLPBS的1.5mL离心管中。添加0.5mCi经¹²⁵I标记的碘化钠，容许组分于室温反应5分钟，然后将1μg Cry1Da核心毒素蛋白添加至溶液，并容许再反应3至5分钟。通过自碘化珠移出溶液来终止反应，并将其应用于在50mM CAPS,pH10.0、1mM DTT(二硫苏糖醇)、1mM EDTA、和5%甘油中平衡的Zeba^TM旋转柱(Invitrogen)。将碘化珠用10μL PBS清洗两次，并也将清洗缓冲液应用于Zeba^TM脱盐柱。通过以1,000x g离心2分钟将放射性溶液洗脱通过旋转柱。然后，将经¹²⁵I放射性标记的Cry1Da核心毒素蛋白针对50mM CAPS,pH10.0、1mM DTT、1mM EDTA、和5%甘油透析。

成像。通过SDS-PAGE和磷光成像(phosphorimaging)测定碘化的Cry1Da核心毒素蛋白的放射性纯度。简言之，使用BioRad凝胶干燥装置遵循制造商的用法说明书干燥SDS-PAGE凝胶。通过将干燥的凝胶在Mylar膜(厚12μm)中包裹，并将它们在Molecular Dynamics储存磷光体屏(storage phosphorscreen)(35cm x 43cm)下暴露1小时来对它们成像。使用Molecular DynamicsStorm 820磷光成像仪(phosphorimager)显现板，并使用ImageQuant^TM软件分析图像。

实施例6

经125I标记的Cry1核心毒素蛋白对来自草地夜蛾的BBMV的结合

测试饱和曲线来测定BBMV蛋白用于用Cry1Da和Cry1Fa核心毒素蛋白进行的结合测定法的最佳量。将0.5nM经¹²⁵I放射性标记的Cry1核心毒素蛋白于28°在具有范围为0μg/mL至500μg/mL的BBMV蛋白量的结合缓冲液(8mMNaHPO₄、2mM KH₂PO₄、150mM NaCl、0.1%BSA,pH7.4)(总体积0.5mL)中温育1小时。通过将150μL反应混合物一式三份取样到不同1.5mL离心管中，并将样品于室温以14,000x g离心8分钟分开结合BBMV蛋白的经¹²⁵I标记的Cry1核心毒素蛋白与未结合的级分。将上清液温和地除去，并将团粒用冰冷的结合缓冲液清洗三次。将含有团粒的离心管的底部剪出，放入13x 75mm玻璃培养管中，并在gamma计数器中对样品各计数5分钟。将减去背景CPM(在没有BBMV蛋白情况中的反应)获得的CPM(每分钟计数)相对于BBMV蛋白浓度绘图。依照由其他人(Luo等,1999)报告的结果，用于结合测定法的BBMV蛋白的最佳浓度测定为150μg/mL。

实施例7

用Cry1Da和Cry1Fa的核心毒素蛋白进行的针对来自草地夜蛾的BBMV 的竞争结合测定法

使用150μg/mL草地夜蛾BBMV蛋白和0.5nM经¹²⁵I放射性标记的Cry1Da核心毒素蛋白进行同源和异源竞争结合测定法。对反应混合物添加的竞争性非放射性标记的Cry1Fa核心毒素蛋白的浓度范围为0.045nM至1000nM，并且与放射性Cry1Da核心毒素蛋白同时添加，以确保实际的结合竞争。于28°实施温育1小时，并测量结合BBMV(特异性结合)的经¹²⁵I标记的Cry1Da核心毒素蛋白的量，如上文所描述的。通过在存在1,000nM非放射性标记的Cry1Da核心毒素蛋白的情况中获得的计数代表非特异性结合。认为100%总结合是在没有任何竞争物Cry1Fa核心毒素蛋白的情况中的结合量。

使用经¹²⁵I标记的Cry1Da核心毒素蛋白的受体结合测定法测定Cry1Fa核心毒素蛋白自其在来自草地夜蛾的BBMV上的结合位点置换此放射性标记的配体的能力。结果显示了Cry1Fa核心毒素蛋白在高达1000nM的浓度(放射性结合配体浓度的2000倍)没有自其受体蛋白置换结合的经¹²⁵I标记的Cry1Da核心毒素蛋白。如预期的，未标记的Cry1Da核心毒素蛋白能够自其结合蛋白置换放射性标记的Cry1Da核心毒素蛋白，展现出s形(sigmoidal)剂量响应曲线，其中在5nM时发生50%置换。

如此，指示Cry1Da核心毒素蛋白与草地夜蛾BBMV中不结合Cry1Fa核心毒素蛋白的结合位点相互作用。

参考文献

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附录A

delta-内毒素的列表–来自Crickmore等网站(申请中引用)

登录号是NCBI条目(若可获得的话)

Claims

1.一种转基因植物，其包含编码Cry1D杀虫蛋白的DNA和编码Cry1F杀虫蛋白的DNA。

2.权利要求1的植物的种子。

3.权利要求1的植物，其中编码Cry1D杀虫蛋白的DNA和编码Cry1F杀虫蛋白的DNA已经渐渗入所述植物中。

4.权利要求3的植物的种子。

5.包含非Bt避难所植物和权利要求1的多个植物的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于40%。

6.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于30%。

7.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于20%。

8.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于10%。

9.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于5%。

10.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物在区组或条中(in blocksor strips)。

11.种子混合物，其包含来自非Bt避难所植物的避难所种子和权利要求4的多个种子，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于40%。

12.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于30%。

13.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于20%。

14.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于10%。

15.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于5%。

16.一种管理昆虫形成对Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求5的植物田地。

17.权利要求1的转基因植物，所述植物进一步包含编码含有Cry1Ab核心毒素的蛋白质的DNA。

18.包含非Bt避难所植物和权利要求17的多个转基因植物的植物田地，其中所述避难所植物占(comprise)所述田地中的所有作物植物的小于约20%。

19.包含权利要求17的多个植物的植物田地，其中所述田地包含小于约10%避难所植物。

20.一种管理昆虫形成对Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求19的植物田地。

21.一种用于控制鳞翅目害虫的组合物，其包含表达有效量的含有Cry1F核心毒素的蛋白质和含有Cry1D核心毒素的蛋白质两者的细胞。

22.权利要求21的组合物，其包含经转化以表达含有Cry1F核心毒素的蛋白质和含有Cry1D核心毒素的蛋白质两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。

23.一种控制鳞翅目害虫的方法，包括对所述害虫或对所述害虫的环境给予有效量的权利要求21的组合物。

24.一种转基因植物，其生成对于相同靶昆虫而言杀虫性的三种杀虫性Cry蛋白，所述昆虫具有形成对任一种所述Cry蛋白的抗性的潜力，且其中每种所述Cry蛋白结合所述靶昆虫中的不同肠受体。

25.权利要求24的植物，其中所述昆虫是秋粘虫。

26.一种转基因植物，其生成Cry1Fa蛋白加Cry1Da蛋白加(plus)选自下组的第三种蛋白质：Vip3A、Cry1C、Cry1Be、和Cry1E蛋白。

27.一种管理昆虫形成对Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求26的植物田地。

28.包含非Bt避难所植物和权利要求26的多个植物的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于约10%。

29.权利要求28的田地，其中所述田地包含小于约5%避难所植物。

30.一种管理昆虫形成对Cry毒素的抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求28或29的植物田地。

31.种子混合物，其包含来自非Bt避难所植物的避难所种子和来自权利要求26的植物的多个种子，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于10%。

32.权利要求5、18和28中任一项的田地，其中所述植物占据超过10英亩。

33.权利要求1、2、17、24、和26中任一项的植物，其中所述植物选自下组：玉米、大豆、和棉花。

34.权利要求1、2、17、24、和26中任一项的植物，其中所述植物是玉米植物。

35.权利要求1、2、17、24、26、33、和34中任一项的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述Cry1D杀虫蛋白的所述DNA和编码所述Cry1F杀虫蛋白的所述DNA，其中所述Cry1F杀虫蛋白与SEQ ID NO:1是至少99%同一的，且所述Cry1D杀虫蛋白与SEQ ID NO:2是至少99%同一的。

36.权利要求1、2、17、24、26、33、和34中任一项的植物，其中所述Cry1F杀虫蛋白包含SEQ ID NO:1，且所述Cry1D杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2。