[go: up one dir, main page]

CN102812017A - 吡嗪衍生物 - Google Patents

吡嗪衍生物 Download PDF

Info

Publication number
CN102812017A
CN102812017A CN2011800145753A CN201180014575A CN102812017A CN 102812017 A CN102812017 A CN 102812017A CN 2011800145753 A CN2011800145753 A CN 2011800145753A CN 201180014575 A CN201180014575 A CN 201180014575A CN 102812017 A CN102812017 A CN 102812017A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino
compound
propyl
pyrazine
methoxy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800145753A
Other languages
English (en)
Inventor
T.冯
H.J.桑加尼
H.瓦达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AstraZeneca AB
Original Assignee
AstraZeneca AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AstraZeneca AB filed Critical AstraZeneca AB
Publication of CN102812017A publication Critical patent/CN102812017A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及式(I)的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐；其中n、m及R各自具有说明书的上文中所定义的任一含义；其制备方法、含它们的药物组合物及它们在制备用于治疗骨相关性疾病或病症的药物中的用途。

Description

吡嗪衍生物
本发明涉及某些新颖吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其具有骨形成活性且因此可用于治疗人或动物体的方法中。本发明还涉及制备所述吡嗪衍生物的方法、包含所述吡嗪衍生物的药物组合物以及所述吡嗪衍生物在治疗方法，例如在制备用于预防或治疗温血动物(例如人)中的骨相关性疾病或病症的药物中的用途。
本发明尤其涉及为糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂的吡嗪衍生物。
GSK3是由两种同工型(α和β)构成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，所述同工型由不同基因编码，但在催化域内是高度同源的。GSK3在中枢及周围神经系统中高度表达。GSK3为多功能激酶，其调节在重要细胞功能、结构、基因表达、迁移及存活中所涉及的多种不同信号传导途径(Jope等，Neurochem Res.2007，32，577-595)。GSK3使若干底物磷酸化，包括tau、β-连环蛋白(cetenin)、糖原合酶、丙酮酸脱氢酶及延长起始因子2b(eIF2b)。胰岛素及生长因子活化蛋白激酶B，蛋白激酶B可在第9位丝氨酸残基上磷酸化GSK3并使其灭活(Kannoji等，ExpertOpin.Ther.Targets 2008，12，1443-1455)。
GSK3为组成性活性激酶，现已认识到其可调节包括Wnt/β-连环蛋白、Notch及PI3K及hedgehog信号传导途径在内的途径且在调节包括骨生成、软骨发生及脂肪生成在内的过程中起作用(Kulkarni等，J CellBiochem，2007，102，1504-1518)。已在体外和体内证实GSK3β(GSK3的一种同工型)调节骨形成。抑制GSK3防止β-连环蛋白磷酸化，从而导致β-连环蛋白稳定、积聚以及从细胞质易位至核。认为此过程导致转录因子活化并使骨形成中涉及的特定基因转录，例如诱导碱性磷酸酶mRNA及蛋白质(早期成骨细胞分化标志物)表达(Bain等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2003，301：84-91)。鼠类间充质干细胞中的GSK3抑制在体外诱导成骨细胞分化及骨形成的标志物(Kulkarni等，JBMR，2006，6，910-920)。GSK3β的抑制在体外保护成骨细胞培养物的存活及分化免受糖皮质激素诱导性抑制(MC3T3-E1细胞，Wang等，Life Sciences，2009，85，685-692)。杂合GSK3β-缺陷型小鼠表现出增加的骨形成(Kugimiya F等，PLoS One，2007，2(9)，e837，1-9)。另外，已证实GSK3的特定抑制剂在骨丢失的卵巢切除动物模型中增加骨质量并改善骨强度(Kulkarni等，JBMR，2006，21，910-920)并且减少动物的糖皮质激素诱导性骨丢失(Wang等，Life Sciences，2009，85，685-692)。另外，GSK3的抑制在骨髓瘤的5T2MM模型中防止骨形成的骨髓瘤诱导性抑制及溶骨性疾病的进展(Abdul等，Bone，2009，44(增刊1)，S53摘要103)。
遗传研究已确定人类的骨质量与Wnt信号传导之间的关联(Gong等，Am.J.Hum.Genet 1996，59，146-51：Little等，N.Engl.J.Med.，2002，347，943-4)。然后，小鼠中Wnt信号传导的遗传及药理学操作已证实此途径在调节骨形成中的关键作用。由Wnt活化的途径是通过经典(即Wnt//β-连环蛋白)途径来进行信号传导，所述经典途径通过多种机制来增加骨质量，包括干细胞的更新、前成骨细胞复制的刺激、成骨细胞发生的诱导及成骨细胞的抑制及骨细胞凋亡。因此，利用GSK3抑制剂来增强Wnt途径信号传导可用于治疗骨相关性疾病、或涉及需要新的且增多的骨形成的其它病症，例如骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)、由于损伤或手术的骨折修复、导致骨丢失的慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、导致骨病变的癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病(Paget′s disease)。
这些发现表明GSK3酶的药理学抑制剂应具有治疗各种形式的骨相关性疾病或病症的治疗价值，所述疾病或病症为例如骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)、由于损伤或手术的骨折修复、导致骨丢失的慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、导致骨病变的癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
除骨相关性疾病或病症以外，有证据表明GSK3酶还在其它疾病中起作用。GSK3抑制可在阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、痴呆症及taupathies、急性神经退化性疾病、双相性精神障碍(dipolar disorder)、精神分裂症、糖尿病、脱发、炎性疾病、癌症、青光眼及再生性医学中具有有益效果。因此，预期GSK3酶抑制剂在预防及治疗众多种除骨相关性疾病或病症外的疾病方面具有价值。
现已令人惊奇地发现，本发明化合物(即吡嗪衍生物)具有强效骨形成活性，可用于预防或治疗骨相关性疾病或病症。不希望暗示本发明中所公开化合物仅借助于对单一生物过程的效应而具有药理学活性，而是认为所述化合物通过对GSK3酶的抑制来产生骨形成效应。
众所周知，如果一种药物的血浆浓度会因另一药物的联合给药而改变，则可出现诸如毒性或功效减低的严重问题。如果存在通过具有肝酶抑制或诱导性质的另一物质的联合给药所造成一种药物的代谢变化，则可出现通常称为药物-药物相互作用的此种现象。细胞色素P450是主要的肝生物异源物质代谢酶且通常CYP(细胞色素P450)3A4同工型被视为人类肝中最重要的酶之一，这是因为大多数氧化药物已通过此酶进行生物转化。因此，不期望采用具有显著程度的此类肝酶抑制或诱导性质的药物。这在诸如那些可使用本发明化合物治疗的疾病方面尤为重要。例如，导致骨病变的癌症所用的抗癌药物通常将需要与用于预防或治疗骨相关性疾病或病症的化合物联合给药。许多抗癌药物具有窄治疗窗(即介于有效剂量与毒性剂量之间的小窗宽)，因此小心控制此类药物的血浆浓度以避免毒性或功效减低是至关重要的。用作多发性骨髓瘤的初步治疗的这种抗癌药物的一个实例为蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)(称作万珂(Velcade))，其具有极窄的治疗窗宽。此药物被CYP3A4充分代谢，使得接收可诱导或抑制此酶的任一化合物的联合给药的患者需要进行密切监视(参见Highlights of Prescribing Informationfor Velcade：http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/021602s 015lbl.pdf)。因此，需要对肝酶(例如CYP3A4)表现出低活性的用于预防或治疗骨相关性疾病或病症的新化合物。现已惊奇地发现本发明的特定化合物，即3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐，对CYP3A4具有此低活性。3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐的另一有利性质在于其对心脏Na+通道hNav1.5不表现出强效抑制活性。
此外，当与其它特定激酶比较时，本发明的某些化合物还对GSK3表现出有用选择性。
根据本发明的一个方面，提供式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA00002154850800041
其中：
n为2或3；
m为2或3；
R为甲基或乙基。
根据本发明的另一方面，提供式I的吡嗪衍生物，其为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺或其药学上可接受的盐：
Figure BDA00002154850800042
应理解，上文所定义的式I化合物可展示互变异构现象。应理解，本发明在其定义中包括任一这种互变异构体形式或具有GSK3酶抑制活性的不同互变异构体形式的混合物，且并不仅限于式图中所用或实施例中所命名的任一种互变异构体形式。通常，仅任何此类互变异构体形式之一在下文实施例中命名或在下文任一相关式图中提供。
式I化合物的合适的药学上可接受的盐为(例如)式I化合物的酸加成盐，例如与无机酸或有机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸或柠檬酸)的酸加成盐。式I化合物的另一合适的药学上可接受的盐为(例如)在给予式I化合物后在人类或动物体内所形成的盐。
式I化合物的特定的药学上可接受的盐为式I化合物与选自以下的酸的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、乙磺酸、DL-扁桃酸或苯甲酸。
根据本发明的一个方面，式I化合物的特定的药学上可接受的盐为式I化合物与盐酸的酸加成盐。
根据本发明的另一方面，式I化合物的特定的药学上可接受的盐为式I化合物与苯磺酸或对甲苯磺酸的酸加成盐。
根据本发明的另一方面，式I化合物的特定的药学上可接受的盐为式I化合物与苯磺酸的酸加成盐。
根据本发明的另一方面，式I化合物的特定的药学上可接受的盐为式I化合物与对甲苯磺酸的酸加成盐。
根据本发明的另一方面，式I化合物的特定的药学上可接受的盐为式I化合物与选自乙磺酸、DL-扁桃酸或苯甲酸的酸的酸加成盐。
应进一步理解，式I化合物的合适的药学上可接受的溶剂合物也形成本发明的一方面。合适的药学上可接受的溶剂合物为(例如)水合物，例如半水合物、单水合物、二水合物或三水合物或其替代量。
一些式I化合物可表现出多晶型现象。应理解，本发明涵盖任一多晶形式或其混合物，所述形式具有用于抑制糖原合酶激酶-3活性的性质，本领域中已熟知如何通过下文所述标准试验来测定多晶形式的抑制糖原合酶激酶-3活性的功效。
众所周知，结晶材料可使用诸如以下的常规技术来分析：X-射线粉末衍射(下文为XRPD)分析、示差扫描量热法(下文为DSC)、热重分析(下文为TGA)、漫反射红外傅里叶变换(Diffuse ReflectanceInfrared Fourier Transform)(DRIFT)光谱法、近红外(NIR)光谱法、溶液态和/或固态核磁共振光谱法。可通过Karl Fischer分析来测定此等结晶材料的水含量。
例如，已确定实施例2的化合物的特定结晶形式。
因此，本发明的另一方面为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的形式B。
所有以下XRPD数据均如实施例部分的介绍中段落(viii)中所述来测定。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有在2θ＝3.5°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有在2θ＝17.6°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有在2θ＝3.5°和17.6°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有在2θ＝3.5°、7.0°、9.5°、10.4°、12.4°、13.8°、14.1°、15.9°、17.6°、21.0°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有与图4中所示X射线粉末衍射图谱基本上相同的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有在2θ＝3.5°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有在2θ＝17.6°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有在2θ＝3.5°和17.6°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有在2θ＝3.5°、7.0°、9.5°、10.4°、12.4°、13.8°、14.1°、15.9°、17.6°、21.0°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式(形式B)，其具有如图4中所示的X射线粉末衍射图谱。
作为另一个实例，实施例3的化合物表现出多晶型现象且已鉴定出两种结晶形式。
因此，本发明的另一方面为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的形式A。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在约2θ＝8.4°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在约2θ＝14.5°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在约2θ＝8.4°和14.5°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在约2θ＝7.5°、8.4°、11.0°、14.5°、15.7°、18.5°、20.2°、22.0°、22.2°、23.0°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有与图6a中所示X射线粉末衍射图谱基本上相同的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.4°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝14.5°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.4°和14.5°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝7.5°、8.4°、11.0°、14.5°、15.7°、18.5°、20.2°、22.0°、22.2°、23.0°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.4°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝14.5°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.4°和14.5°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝7.5°、8.4°、11.0°、14.5°、15.7°、18.5°、20.2°、22.0°、22.2°、23.0°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有如图6a中所示的X射线粉末衍射图谱。
因此，本发明的另一方面为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的形式C。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有在约2θ＝11.2°、14.7°和15.8°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有在约2θ＝11.2°、12.6°、14.7°、15.5°、15.8°、16.8°、20.4°、21.1°、22.5°、26.5°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有与图6b中所示X射线粉末衍射图谱基本上相同的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有在2θ＝11.2°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有在2θ＝14.7°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有在2θ＝15.8°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有在2θ＝11.2°、14.7°和15.8°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有在2θ＝11.2°、12.6°、14.7°、15.5°、15.8°、16.8°、20.4°、21.1°、22.5°、26.5°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的结晶形式(形式C)，其具有如图6b中所示的X射线粉末衍射图谱。
作为另一个实施例，已鉴定实施例4.1的化合物的特定结晶形式。
因此，本发明的另一方面为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的形式A。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在约2θ＝8.0°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在约2θ＝23.0°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在约2θ＝8.0°和23.0°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在约2θ＝8.0°、11.7°、14.8°、20.0°、20.9°、21.5°、22.2°、23.0°、27.5°、28.0°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有与图8中所示X射线粉末衍射图谱基本上相同的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.0°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝23.0°±0.1°2θ处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.0°和23.0°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.0°、10.5°、11.7°、12.4°、14.8°、16.0°、17.0°、18.1°、20.0°、20.9°、21.5°、22.2°、23.0°、27.5°、28.0°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.0°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝23.0°处具有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.0°和23.0°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝8.0°、10.5°、11.7°、12.4°、14.8°、16.0°、17.0°、18.1°、20.0°、20.9°、21.5°、22.2°、23.0°、27.5°、28.0°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有如图8中所示的X射线粉末衍射图谱。
已鉴定特定结晶形式的化合物的其它实例为实施例4.2至4.4的化合物。
因此，本发明的另一方面为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺二乙磺酸盐的形式A。
因此，本发明的另一方面为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单DL-扁桃酸盐的形式A。
因此，本发明的另一方面为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯甲酸盐的形式A。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺二乙磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝5.2°和12.7°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺二乙磺酸盐(diesylate)的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝5.2、10.4、12.7、15.0、16.9、17.3、19.1、19.6、20.0、23.5°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺二乙磺酸盐的结晶形式(形式A)，其具有如图10中所示的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单DL-扁桃酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝2.7°和7.8°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单-DL-扁桃酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝2.7°、5.2°、7.8°、9.6°、10.5°、12.3°、13.1°、15.7°、18.4°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单DL-扁桃酸盐的结晶形式(形式A)，其具有如图12中所示的X射线粉末衍射图谱。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯甲酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝5.3°与9.2°处具有至少两个特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯甲酸盐的结晶形式(形式A)，其具有在2θ＝5.3°、6.2°、9.2°、9.8°、11.9°、16.6°、17.8°、18.1°、19.5°、24.6°处具有特征峰的X射线粉末衍射图谱，其中所述值可±0.1°2θ。
根据本发明的另一方面，提供3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯甲酸盐的结晶形式(形式A)，其具有如图14中所示的X射线粉末衍射图谱。
应理解，X射线粉末衍射图谱的2θ值可在机器之间或样品之间稍有变化，且因此所引述值不应理解为绝对值。
还已知可获得根据测量条件(例如所用设备或机器)而具有一个或多个测量误差的X射线粉末衍射图谱。具体而言，众所周知，X射线粉末衍射图谱中的强度可根据测量条件而波动。因此，应理解，除非另有说明，否则上文所述本发明结晶形式并不限于提供与图4、图6a、图6b、图8、图10、图12及图14中所示X射线粉末衍射图谱相同的X射线粉末衍射图谱的晶体，且任何提供与这些图中所示的那些基本上相同的X射线粉末衍射图谱的晶体均属于本发明范围内。X射线粉末衍射领域的技术人员能够判定X射线粉末衍射图谱的基本上相同。
X射线粉末衍射领域的技术人员还将意识到，峰的相对强度可受(例如)尺寸在30微米以上且不均一纵横比的晶粒的影响，所述晶粒可能影响样品分析。技术人员还将意识到，反射位置可受样品在衍射仪中所处的精确高度及衍射仪的零校准的影响。样品的表面平整度也可具有小的影响。因此，所提供衍射图谱数据不应理解为绝对值(参见Jenkins，R & Snyder，R.L.‘Introduction to X-Ray Powder Diffractometry’John Wiley & Sons 1996；Bunn，C.W.(1948)，Chemical Crystallography，Clarendon Press，London；Klug，H.P.& Alexander，L.E.(1974)，X-RayDiffraction Procedures)。
通常，X射线粉末衍射图中衍射角的测量误差为大约±0.1°2θ，且当考虑X射线粉末衍射数据时，应考虑此测量误差。此外，应理解，强度可根据实验条件及样品制备(较佳取向)而波动。
应进一步理解，式I化合物的合适的药学上可接受的前药也形成本发明的一方面。因此，本发明化合物可以前药形式给予，该前药为在人类或动物体内分解以释放本发明化合物的化合物。可使用前药改变本发明化合物的物理性质和/或药物动力学性质。当本发明化合物包含可连接性质改良基团的合适基团或取代基时，可形成前药。前药的实施例包括可在式I化合物中的氨基处形成的体内可裂解酰胺衍生物。
因此，在以下情况下，本发明包括如上文所定义式I化合物：当其通过有机合成而变得可用时和当在人类或动物体内通过其前药裂解而变得可用时。因此，本发明包括通过有机合成方式产生的那些式I化合物以及在人类或动物体内通过前体化合物的代谢产生的此类化合物，即式I化合物可为合成产生的化合物或代谢产生的化合物。
式I化合物的合适的药学上可接受的前药为基于合理的医学判断适于给予人类或动物体而无不利的药理活性且无不适当的毒性的前药。
应理解，尽管上文所定义式I化合物的药学上可接受的前药可由于一个或多个不对称碳原子以光学活性或外消旋形式存在，但在其定义中，本发明还包括任一此类光学活性或外消旋形式。可通过本领域中熟知的有机化学的标准技术进行光学活性形式的合成，例如通过自光学活性起始材料合成或通过外消旋形式的拆分。
以下文献中阐述了前药的不同形式，例如：-
a)Methods in Enzymology，第42卷，第309-396页，由Widder等编辑(Academic Press，1985)；
b)Design of Pro-drugs，由H.Bundgaard编辑(Elsevier，1985)；
c)A Textbook of Drug Design and Development，由Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard编辑，第5章“Design and Application of Pro-drugs”，H.Bundgaard，第113-191页(1991)；
d)H.Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，8，1-38(1992)；
e)H.Bundgaard等，Journal of Pharmaceutical Sciences，77，285(1988)；
f)N.Kakeya等，Chem.Pharm.Bull.，32，692(1984)；
g)T.Higuchi和V.Stella，“Pro-Drugs as Novel Delivery Systems”，A.C.S.Symposium Series，第14卷；和
h)E.Roche(编者)，“Bioreversible Carriers in Drug Design”，Pergamon Press，1987。
具有氨基的式I化合物的合适的药学上可接受的前药为(例如)其体内可裂解的酰胺衍生物。来自氨基的合适的药学上可接受的酰胺包括(例如)与(1-10C)烷酰基(例如乙酰基、苯甲酰基、苯基乙酰基及经取代的苯甲酰基及苯基乙酰基)形成的酰胺。苯基乙酰基和苯甲酰基上的环取代基的实施例包括氨基甲基、N-烷基氨甲基、N，N-二烷基氨甲基、吗啉代甲基、哌嗪-1-基甲基和4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基甲基。
在给予式I化合物后，式I化合物的体内效应可部分由在人类或动物体内形成的一种或多种代谢产物来施加。如上文所述，式I化合物的体内效应还可通过前体化合物(前药)的代谢来施加。
本发明的特定化合物为实施例中的每一个及其药学上可接受的盐，其中每一个提供本发明的另一独立方面。
根据本发明的另一方面，提供式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其可通过依照如本文所公开的实施例中的任一个来获得。
本发明的另一特征为本文所定义的任一范围，前提是个别地放弃特定实施例(例如实施例1、2、3a、3b、4.1等)。
本发明的再一特征为本文所定义的任一范围，前提是个别地放弃一个特定实施例(例如实施例1、2、3a、3b、4.1等)。
本发明的特定新颖化合物包括(例如)式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其中n、m和R各自具有上文或在下文段落(a)至(h)中所定义的任一含义：-
(a)n为2；
(b)n为3；
(c)m为2；
(d)m为3；
(e)n为3且m为3；
(f)n为3且m为2；
(g)n为2且m为3；或
(h)R为甲基。
本发明化合物的特定组为上文式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其中：-
n为2或3；
m为3；
R为甲基或乙基，合宜地为甲基。
本发明化合物的特定组为上文式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其中：-
n为3；
m为2或3；
R为甲基或乙基，合宜地为甲基。
本发明特定的化合物为选自以下中任一种的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐：-
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺；
3-氨基-6-(4-{2-[(2-甲氧基乙基)氨基]乙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺；
3-氨基-6-(4-{2-[(3-甲氧基丙基)氨基]乙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺；和
3-氨基-6-(4-{3-[(2-甲氧基乙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺。
根据本发明再一方面，本发明的特定化合物为选自以下中任一种的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐：-
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺；
3-氨基-6-(4-{2-[(3-甲氧基丙基)氨基]乙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺；和
3-氨基-6-(4-{3-[(2-甲氧基乙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺。
本发明的另一方面提供用于制备式I化合物或其药学上可接受的盐的方法。合适的方法通过以下代表性方法变型来阐释，其中除非另有说明，否则n、m和R均具有上文所定义的任一含义。必要起始材料可通过标准有机化学工序获得。结合以下代表性方法变型来阐述此类起始材料的制备且在所附实施例内。或者，必要起始材料可通过与所阐释的那些类似的工序来获得，所述工序为在有机化学家的普通技术范围之内。
合适的方法变型包括(例如)以下：-
(a)式II化合物：
或其反应性衍生物，其中m为2或3且X代表合适的离去基团，例如卤素(如溴、氟、氯或碘)或磺酸根基团(例如甲磺酸根或三氟甲磺酸根)，其中在需要时可保护所存在的任一官能团，与式III的胺化合物的胺置换反应：
Figure BDA00002154850800191
其中n为2或3且R为甲基或乙基，以形成式I化合物，此后去除所存在的任一保护基团。
在有机溶剂(例如二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙腈)存在下在合适碱(例如碱金属碳酸盐(例如碳酸钠或碳酸钾)或碱土金属碳酸盐(例如碳酸钙)、金属氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾))存在下在(例如)0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于80℃与90℃之间的温度范围下方便地进行反应。
包括反应性衍生物在内的式II化合物可通过(例如)式IV化合物：
Figure BDA00002154850800192
(其中m为2或3)与合适活化试剂(例如甲磺酰氯、甲苯磺酰氯、亚硫酰氯或草酰氯)的反应来制备。可在有机溶剂(例如四氢呋喃或二氯甲烷)中使用无机碱(例如碳酸钠或碳酸钾)或有机碱(例如三乙胺或二异丙基乙胺)在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在环境温度下方便地进行所述反应。
式IV化合物可通过(例如)式V化合物：
Figure BDA00002154850800193
(其中m为2或3且PG代表保护基团，例如叔丁基二甲基甲硅烷基或四氢吡喃)与合适的酸(例如硫酸)的反应来制备。
可在有机溶剂(例如甲醇、四氢呋喃或二噁烷)中使用无机酸(例如盐酸或氢溴酸)或有机酸(例如三氟乙酸)在(例如)0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于20℃与80℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
式V化合物可通过(例如)式VI化合物：
Figure BDA00002154850800201
(其中Y代表合适的离去基团，例如卤素(如氯、氟、溴或碘)或三氟甲磺酸根)与式VII化合物的金属催化偶合反应来制备：
Figure BDA00002154850800202
其中m为2或3，Z代表合适的离去基团，例如卤素(如氯、氟、溴或碘)或三氟甲磺酸根且PG代表保护基团，例如叔丁基二甲基甲硅烷基或四氢吡喃。
可在有机溶剂(例如四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺或二噁烷)中在具有合适配体(例如Pd(dppf)Cl2或Pd(PPh3)3)的Pd催化剂存在下且具有合适配体的二硼烷(例如双联频哪醇硼酸酯或双联邻苯二酚硼酸酯)存在下以及在盐(例如乙酸钾或乙酸钠)存在下在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于80℃与90℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
或者，式IV化合物可通过(例如)式VI化合物与式VIII化合物的反应来制备：
Figure BDA00002154850800211
其中m为2或3且W代表硼酸或硼酸酯，例如频哪醇硼酸酯或邻苯二酚硼酸酯。
可在有机溶剂(例如四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺或二噁烷)中在具有合适配体(例如Pd(dppf)Cl2或Pd(PPh3)3)的Pd催化剂存在下且在盐(例如乙酸钾或乙酸钠)存在下在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于70℃与90℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
式IV化合物还可使用与上文所述者相反的偶合方法来制备，其中式VI化合物将以W基团(其为硼酸或硼酸酯，例如频哪醇硼酸酯或邻苯二酚硼酸酯，如上文所定义)代替Y基团且式VIII化合物将以所存在Y基团(为合适的离去基团，例如卤素(例如氯、氟、溴或碘)或三氟甲磺酸根，如上文所定义)代替W基团。用于该反应的合适条件将为上文所述的那些。
式VIII化合物可通过(例如)用合适的二硼烷复合物(例如双联频哪醇硼酸酯或双联邻苯二酚硼酸酯)处理式IX化合物来制备：
Figure BDA00002154850800212
其中m为2或3且Z代表合适的离去基团，例如卤素或三氟甲磺酸根。可在有机溶剂(例如四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈或二噁烷)中在具有配体(例如PCy3或PPh3)的Pd催化剂(例如Pd-Cl2或Pd(OAc)2)的存在下且在盐(例如乙酸钾或乙酸钠)存在下在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于70℃与90℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
式VII化合物可通过(例如)用合适的保护剂(例如叔丁基二甲基氯硅烷)处理式IX化合物来制备：
其中m为2或3且Z代表合适的离去基团，例如卤素或三氟甲磺酸根。在有机溶剂(例如四氢呋喃或二氯甲烷)存在下使用无机碱(例如碳酸钠或碳酸钾)或有机碱(例如三乙胺或二异丙基乙胺)且在合适催化剂(例如4-二甲基氨基吡啶)存在下在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在环境温度下方便地进行所述反应。
或者，可利用二氢吡喃在有机溶剂(例如THF)中或如果不存在溶剂，则利用催化剂(例如硫酸或HCl)在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在回流条件下进行上述反应。
式III、VI及IX的化合物可通过常规工序获得或可商购获得，如文献中已知，或者其可通过使用或调节本领域中已知的标准方法来制备；
(b)式X化合物：
Figure BDA00002154850800222
(其中，n为2或3，m为2或3，R为甲基或乙基且PG2代表合适的保护基团例如烷氧基羰基，如叔丁氧基羰基或异丙氧基羰基)与合适的酸(例如HCl或三氟乙酸)的反应。
可在有机溶剂(例如EtOAc、甲醇、2-甲基四氢呋喃或四氢呋喃)中或在无机溶剂(例如水)中使用无机酸(例如盐酸或氢溴酸)或有机酸(例如三氟乙酸)在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于20℃与80℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
式X化合物可通过(例如)式XI化合物：
(其中，n为2或3，m为2或3，R为甲基或乙基，PG2代表合适的保护基团，如烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基或异丙氧基羰基)，且W代表硼酸或硼酸酯(例如频哪醇硼酸酯或邻苯二酚硼酸酯))与式VI化合物的金属催化偶合反应来制备。
可在有机溶剂(例如四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二噁烷或1-丁醇)中在具有合适配体(例如Pd(dppf)Cl2或Pd(PPh3)3的Pd催化剂或与四氯钯酸钠及3-(二叔丁基磷鎓)丙烷硫酸盐的混合物存在下且在盐(例如乙酸钾、乙酸钠或磷酸三钾N-水合物)存在下在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于70℃与90℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
式XI化合物可通过(例如)式XII化合物：
Figure BDA00002154850800232
(其中，n为2或3，m为2或3，R为甲基或乙基，PG2代表合适的保护基团例如烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基或异丙氧基羰基)且Z代表合适的离去基团例如卤素或三氟甲磺酸根)与合适的二硼烷复合物(例如双联频哪醇硼酸酯(bis(pinacolato)diboron)或双联邻苯二酚硼酸酯(bis(catecholato)diboron))的反应来制备。可在有机溶剂(例如四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈或二噁烷)中在具有配体(例如PCy3或PPh3)的Pd催化剂(例如Pd-Cl2或Pd(OAc)2存在下且在盐(例如乙酸钾或乙酸钠)存在下在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于70℃与90℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
式XII化合物可通过(例如)式XIII化合物：
Figure BDA00002154850800241
(其中，n为2或3，m为2或3，R为甲基或乙基，且Z代表合适的离去基团，如卤素或三氟甲磺酸根)与合适的保护剂(例如二碳酸二叔丁基酯)的反应来制备。可在有机溶剂(例如甲醇、四氢呋喃或二噁烷)中使用无机酸(例如盐酸或氢溴酸)或有机酸(例如三氟乙酸)在例如0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于20℃与80℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
式XIII化合物可通过(例如)式XIV化合物：
Figure BDA00002154850800242
或其反应性衍生物(其中m为2或3，X代表合适的离去基团，例如卤素(例如溴、氟、氯或碘)或磺酸根基团(例如甲磺酸根或三氟甲磺酸根)且Z代表合适的离去基团(例如卤素或三氟甲磺酸根))与合适的保护剂(例如二碳酸二叔丁基酯)以及与式III的胺化合物的反应来制备。
可在有机溶剂(例如二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙腈)存在下在合适碱(例如碱金属碳酸盐(例如碳酸钠或碳酸钾)或碱土金属碳酸盐(例如碳酸钙)、金属氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾))存在下在例如0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在介于80℃与90℃之间的温度范围下方便地进行所述反应。
式XIV化合物可通过式IX化合物与合适的活化试剂(例如甲磺酰氯、甲苯磺酰氯、亚硫酰氯或草酰氯)的反应来制备。可在有机溶剂(例如四氢呋喃或二氯甲烷)中使用无机碱(例如碳酸钠或碳酸钾)或有机碱(例如三乙胺或二异丙基乙胺)在0℃至150℃的范围内的温度下，适宜地在环境温度下方便地进行所述反应。
当需要式I的吡嗪衍生物的药学上可接受的盐(例如酸加成盐)时，其可通过例如所述吡嗪衍生物与合适的酸的反应获得。
当需要式I的吡嗪衍生物的药学上可接受的前药时，其可使用常规工序获得。例如，式I的吡嗪衍生物的体内可裂解酰胺可通过例如包含氨基的式I化合物与药学上可接受的羧酸的反应获得。
有机合成领域的技术人员还应理解，本发明化合物中的某些环取代基可通过标准芳香族取代反应引入或通过常规官能团改性在上述方法之前或之后立即生成，且同样纳入本发明的方法方面中。此类反应及改性包括(例如)通过芳香族取代反应引入取代基、取代基还原、取代基烷基化、取代基酰化、取代基酰胺化及取代基氧化。此类工序的试剂及反应条件为化学领域所熟知。芳香族取代反应的特定实例包括使用(例如)酰基卤及路易斯酸(Lewis acid)(例如三氯化铝)在弗里德尔-克拉夫茨(Friedel Crafts)条件下引入酰基；使用烷基卤及路易斯酸(例如三氯化铝)在傅-克条件下引入烷基；及引入卤代基。
还应理解，在上文所提及的一些反应中，可能需要或期望保护化合物中的任何敏感基团。需要或期望保护的情况及合适的保护方法是本领域的技术人员已知的。可根据标准操作使用常规保护基团(关于说明，参见T.W.Green，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley andSons，1991)。因此，如果反应物包括诸如氨基、羧基或羟基的基团，则可能希望保护本文所提及的一些反应中的基团。
氨基或烷基氨基的合适保护基团为(例如)酰基(例如烷酰基，例如乙酰基)、烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基)、芳基甲氧基羰基(例如苄氧基羰基)、或芳酰基(例如苯甲酰基)。以上保护基团的脱保护条件必然随所选保护基团而变化。因此，例如，可通过(例如)用合适的碱(例如碱金属氢氧化物，例如氢氧化锂或氢氧化钠)水解来去除酰基(例如烷酰基)或烷氧基羰基或芳酰基。或者，可通过(例如)用合适的酸(例如盐酸、硫酸、磷酸或三氟乙酸)处理来去除酰基(例如叔丁氧基羰基)且可通过(例如)在催化剂(例如碳载钯)上进行氢化或通过用路易斯酸(例如，三(三氟乙酸)硼)处理来去除芳基甲氧基羰基(例如苯甲氧基羰基)。伯氨基的合适替代保护基团为(例如)邻苯二甲酰基，其可通过用烷基胺(例如二甲基氨基丙胺)或用肼处理来去除。
可使用化学领域中熟知的常规技术在合成的任一适宜阶段去除保护基团。
某些本文所定义中间体为新颖的且其作为本发明另一特征提供。例如，式II及V的化合物(如上文所定义)可用作制备本发明化合物的中间体。
此外，以下化合物可用作制备本发明化合物的中间体：
3-氨基-6-(4-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丙基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-吡嗪-2-甲酰胺；和
甲磺酸3-(4-(5-氨基-6-(吡啶-3-基氨基甲酰基)吡嗪-2-基)苯基)丙酯。
生物测定
可使用以下测定来测量本发明化合物的效应：
(a)体外GSKβ激酶测定
此生物化学测定使用基于荧光共振能量转移(FRET)的偶联酶模式来测定测试化合物抑制重组GSK3β丝氨酸/苏氨酸激酶将底物磷酸化的能力(Kleman-Leyer，K.等，Drug Disc.Devel.2003，6：81-2)。此测定中所用底物为Z′-LYTETM ser/Thr 9肽且FKET测定试剂盒从Invitrogen(Paisley，UK，目录号PV3324)获得。具有H350L突变的N-末端His6-标签重组人类GSK3β在Sf21昆虫细胞的杆状病毒中表达，所述病毒经纯化并且得自Millipore(Billerica，Massachusetts，USA，目录号14-306Human)。
将测试化合物制备成在二甲基亚砜(DMSO)中的10mM储液并视需要稀释于DMSO中。将化合物稀释液的等分试样(2.5μl)添加至Optiplate-F PerkinElmer 384孔板(Massachusetts，USA，目录号6007270)的各孔中。通过使用从Invitrogen(Paisley，UK，目录号PV3326)获得的100％磷酸化肽生成产生对应于最大酶活性的最大信号的对照孔。将100％磷酸化肽的5μl等分试样(100μM，在1.33x激酶缓冲液中)添加至所有最大对照孔中。将2.5μl在1.33x激酶缓冲液中的4％DMSO溶液(v/v)添加至最大对照孔中。通过添加2.5μl在包含4％DMSO(v/v)的1.33x激酶缓冲液中的40μM星形孢菌素来生成产生对应于100％抑制酶的最低信号的对照孔。将GSK3β(100ng/μl)酶与未磷酸化底物(Z-LYTETM ser/Thr9肽，100μM)在1.33x激酶缓冲溶液中的5μl混合物添加至除最大对照孔以外的各孔中并将测定板以270g离心1分钟。所用1.33x激酶缓冲液得自Invitrogen(Paisley，UK，目录号PV3189)且包含67mM HEPES(pH 7.5)、13mM MgCl2、1.3mM EGTA，0.01％BRIJ-35。然后向每孔中添加在激酶缓冲液中的2.5μl三磷酸腺苷(28μM)，以270g离心1分钟且随后在室温下将测定板振荡1小时。专有显色溶液通过将58μl显色试剂A(Invitrogen，Paisley，UK，目录号PV3297)添加至2142μl显色试剂B(Invitrogen，Paisley，UK，目录号P3127)中来制备。然后向每孔中添加5μl Invitrogen专有显色溶液，以270g离心1分钟且随后在室温下振荡1小时。通过每孔添加5μl终止试剂(Invitrogen，Paisley，UK目录号P3094)终止反应，以270g离心1分钟且随后在室温下振荡5分钟。
使用Perkin Elmer Envision分光光度计(Perkin Elmer，Massachusetts，USA)读取源自400nM下的激光激发的所得信号。Z’-LYTETM生物化学测定采用基于FRET的偶联酶模式且基于磷酸化肽与未磷酸化肽进行蛋白水解裂解的差示灵敏度。参比方法，其计算在400nm下激发供体荧光团后供体发射与受体发射的比率(发射率)，量化反应进展，如以下等式中所示。
发射率＝香豆素发射(445nm)÷荧光素发射(520nm)(520nm)
使用每一测试化合物浓度、100％DMSO对照孔及100％抑制对照孔的平均数据值来生成浓度反应曲线，由其计算化合物处理对激酶活性的抑制百分比并计算效能(IC50)值。IC50值为抑制人类GSK3β激酶活性的50％的测试化合物的浓度。此测定中的最终ATP浓度为7μM。
(b)细胞β-连环蛋白稳定化测定
此测定使用基于成像的方法来测量测试化合物促进C3H10T1/2细胞核中β-连环蛋白稳定化的能力。β-连环蛋白稳定化为GSK3β抑制作用的指标。
将C3H10T1/2小鼠克隆8成纤维细胞细胞系(美国模式培养物保藏所(ATCC，USA；目录号CRL 226)在37℃和5％CO2下以常规方式保持在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Invitrogen，Paisley；UK；目录号10270)和2mM左旋谷氨酰胺(Invitrogen，Paisley，UK；目录号25030024)的Eagle基础培养基(BME，Invitrogen；Paisley，UK；目录号41010)中。对于测定而言，使用标准组织培养方法，利用′Accutase′(Innovative Cell Technologies公司，San Diego，USA；目录号AT104)使细胞自培养烧瓶剥离，并且重悬于由含有5％(v/v)FBS和2mM左旋谷氨酰胺的BME构成的测定培养基中，以获得55,555个细胞/毫升。然后，使用Multidrop Combi分配器(Thermo Fisher Scientific，Loughborough，UK)将90μl此溶液接种至底部透明的96孔组织培养板(Perkin Elmer Viewplate；目录号6005182)的各孔中，以获得5.000个细胞/孔。将各板在37℃和5％CO2下培育过夜，使细胞附着到各孔。将测试化合物制备成在二甲基亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich；Poole，UK，目录号49442-9)的10mM储液，并在DMSO中连续稀释。使用MultidropCombi将245μl预热分析培养基分配至96孔板(Thermo Fisher Scientific，Loughborough，UK；目录号50823925)中，然后将5μl连续稀释的化合物添加至此中间板中。在混合后，将各化合物浓度的10μl添加至细胞板中。DMSO储液的总稀释因子为500倍。对照细胞接收DMSO(0.2％v/v最终浓度)或10μM阳性对照化合物。在37℃和5％CO2下将细胞培育24小时。
在化合物处理后，通过将100μl 8％w/v低聚甲醛(Sigma-Aldrich，Poole，UK；目录号P6148)直接添加至测定板孔中来固定细胞。将细胞在环境温度下与固定剂一起培育30分钟，随后用100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS，Sigma-Aldrich；目录号D8537)洗涤3次。然后，将细胞洗涤1次并在室温下，在阻断溶液(PBS，其包含1.1％w/v牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，Poole，UK；目录号A7906)和0.2％v/v Triton X-100(Sigma-Aldrich，Poole，UK；目录号X100))中培育1小时。在去除阻断溶液后，将30μl在阻断溶液中稀释成1.25μg/ml浓度的抗β-连环蛋白抗体(BD Biosciences；目录号610154)添加至细胞中并在4℃下培育16小时。然后将细胞在100μl阻断溶液中洗涤两次并在环境温度下培育1小时。随后将细胞置于包含AF647驴抗小鼠抗体(Invitrogen，Paisley，UK；目录号A31571)和Hoechst 33342(Invitrogen，Paisley，UK；目录号H1399)核复染剂(两者分别在阻断溶液中稀释成4μg/ml及1μM的浓度)的40μl二次抗体溶液中。在室温下，与二级染色溶液一起培育2小时。然后将细胞在100μl PBS中洗涤3次，然后将板密封以备图像捕捉使用。捕捉荧光图像并使用Incell分析仪3000(GE Healthcare，USA)量化。使用365nm的激发波长以及设定为1的中性密度滤波器及450-65发射滤波器来观察Hoechst核染色。使用633nm激光波长、设定为1的中性密度滤波器和695-55nm的发射滤波器来捕捉β-连环蛋白定位。为能进行足够的细胞计数，每孔获取4个图像。使用核转位分析模块(Nuclear Trafficking Analysis Module)(TRF2)来分析图像数据。将测定板上各孔的数据归一化为相同测定板的阴性对照与阳性对照的中值以及以阳性对照的比例表示的效应百分比。分析不包括总细胞数低于实验批次中值的50％的孔的数据。将浓度反应曲线拟合至希尔方程(Hillequation)的以下形式(Neubig等，2003，Pharmacol Rev.2003；55：597-606)
y＝A+((B-A)÷(1+((C÷x)^D)))
其中x＝化合物浓度(M)且y＝效应％。此外，其中A＝浓度效应曲线的基底(basal)，B＝渐近线曲线，C＝曲线中点，D＝斜率
以产生最大效应的一半(EC50)的化合物浓度及以最大效应百分比报告每一测试化合物的数据。
式I化合物的药理学性质可在上述测试(a)和(b)中的一个或多个中以下列浓度或剂量来证实：
测试(a)：-相对于人类GSK3β酶的IC50在(例如)10nM至1μM的范围内
测试(b)：-相对于鼠类C3H/10T1/2细胞中的细胞β-连环蛋白积聚的EC50在(例如)50nM至5μM的范围内。
例如，实施例1所公开的吡嗪化合物在测试(a)中具有活性，其中相对于人类GSK3β酶的IC50为大约35nM；且在测试(b)中具有活性，其中相对于鼠类C3H/10T1/2细胞核中的细胞β-连环蛋白积聚的EC50为大约242nM。
实施例5所公开的吡嗪化合物在测试(a)中具有活性，其中相对于人类GSK3β酶的IC50为大约21nM；且在测试(b)中具有活性，其中相对于鼠类C3H/10T1/2细胞核中的细胞β-连环蛋白积聚的EC50为大约902nM。
实施例6所公开的吡嗪化合物在测试(a)中具有活性，其中相对于人类GSK3β酶的IC50为大约48nM；且在测试(b)中具有活性，其中相对于鼠类C3H/10T1/2细胞核中的细胞β-连环蛋白积聚的EC50为大约902nM。
实施例7所公开的吡嗪化合物在测试(a)中具有活性，其中相对于人类GSK3β酶的IC50为大约80nM；且在测试(b)中具有活性，其中相对于鼠类C3H/10T1/2细胞核中的细胞β-连环蛋白积聚的EC50为大约3890nM。
适宜地，本发明的特定化合物在上述测试(a)和(b)中在以下浓度或剂量下具有活性：-
测试(a)：-相对于人类GSK3β酶的平均IC50在(例如)5nM至40nM的范围内
测试(b)：-相对于鼠类C3H/10T1/2细胞中的细胞β-连环蛋白积聚的平均EC50在(例如)50nM至300nM的范围内。
例如，实施例1所公开的吡嗪化合物在测试(a)中具有活性，其中相对于人类GSK3β酶的IC50为大约35nM；且在测试(b)中具有活性，其中相对于鼠类C3H/10T1/2细胞核中的细胞β-连环蛋白积聚的EC50为大约242nM。
c)成骨性分化和体外矿化的评估
材料和方法
对于体外骨生成，以5000个细胞/cm2的密度将自人类脂肪获得的干细胞(hADSC)(Invitrogen，UK；目录号R7788-115)接种至12孔板中且在补充有5％胎牛血清(FBS，Gibco，UK；目录号10270)和2mM
Figure BDA00002154850800311
(Gibco；目录号35050)的无酚红达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)(DMEM；Sigma-Aldrich，UK；目录号D1145)的基础培养基中培养。在过夜培育后，替换基础培养基并添加3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐(溶于100％DMSO中且在细胞培养基中稀释至0.2％DMSO的最终浓度)。在成骨性阳性对照孔中，用分化培养基替换基础培养基；所述分化培养基为补充有5％FBS、2mM
Figure BDA00002154850800312
50μg/ml L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich；目录号A8960)、5mM β-甘油磷酸盐(Calbiochem，UK；目录号35675)和10nM地塞米松(dexamethasone)(Sigma-Aldrich；目录号D4902)的无酚红DMEM。在37℃下于5％CO2中利用培养基培育培养物且经24天的时程，其中每3至4天替换化合物。
使用茜素红S(Alizarin Red S)染色评估在该时程期间矿化骨小结的形成。在整个时程中，多次将细胞用4％低聚甲醛(Sigma-Aldrich；目录号P6148)固定20分钟，随后用不含氯化钙和氯化镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma-Aldrich；目录号D8537)洗涤3次，然后在室温下用40mM茜素红S(Sigma-Aldrich；目录号A5533)(pH 4.2)染色20分钟。在染色期间将各板置于振动台(50rpm)上。在染色后，用PBS将细胞洗涤3次，并用水洗涤3次。使用Leica M165FC立体显微镜和相关Leica应用套件成像软件(Leica Microsystems，UK)使细胞成像。
通过使用先前所述氯化十六烷基吡啶提取法自骨小结提取茜素红S染色剂来量化矿化量(Gregory等，Analytical Biochemistry，2004，329：77-84；Hwang等，Stem Cells and Development 17：963-970，2008)。简言之，经由向各孔中添加1ml氯化十六烷基吡啶鎓缓冲液(由在10mMNa3PO4(Sigma-Aldrich；目录号342483)(pH 7.0)中的10％氯化十六烷基吡啶鎓(Sigma-Aldrich；目录号C0732)组成)并在37℃下培育1小时而自骨小结提取茜素红S染色剂。在培育后，将200μl等分试样转移至96孔板中并使用微量板分光光度计(SpectraMax Plus，MolecularDevices，USA)测定550nM下的吸光度。以550nM下的平均吸光度±均值标准误差(SEM)表示数据。依次使用单向方差分析(ANOVA)和Tukey氏多重比较事后检验来检验组间差异的统计显著性。将P＜0.05视为显著。
图1A：示出在24天细胞培养后与载体相比响应300nM 3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐的矿化骨小结的茜素红S染色的图片。实验以一式三份进行。
图1B：300nM 3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐对骨矿化的效应，使用氯化十六烷基吡啶提取来量化茜素红S染色。数据显示为550nM下的平均吸光度并依次使用单向ANOVA及Tukey氏多重比较事后检验来分析：n＝9；***，P＜0.001。
图1A和1B示出在24天细胞培养后，3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐显著诱导祖细胞定型及成骨细胞分化，如通过相对于载体对照增加的茜素红S染色所指示。
d)大鼠中增加的骨形成
化合物给予、采血样及尸检
在包含0.5％HPMC((羟丙基)甲基纤维素；目录号H7509，Sigma，Poole，UK)和0.1％Tween 80(v/v)(目录号P8074，Sigma，Poole UK)的水中配制3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐。在每天上午7点与10点之间使用直钢(75mM，16号(gauge))经口灌喂针(Vet-Tech Solutions Ltd，Congleton，UK)向12周龄与16周龄之间的雌性斯普拉-道来氏大鼠(Sprague Dawley rat)(Charles River CRL：CD大鼠，Deal，Margate，UK)(230-340g)给予化合物或载体，其中经口灌喂给药的体积为5mL/kg。每天1次以不同剂量(包括等效于3mg/kg、6mg/kg、18mg/kg及59mg/kg三盐酸盐的2.5mg/kg/天、5mg/kg/天、15mg/kg/天或50mg/kg/天游离碱剂量)给予化合物或载体并保持7至14天。在一些研究中，在过夜禁食后，在处理前获取血清样品以测量基线血清骨生物标志物。自尾静脉对血液取样并通过将血液添加至血清凝胶血液收集管(Microvette 500Z-gel，目录号20.1344，Sarstedt，Leicester，UK)中且在4℃下将所述管以13000rpm离心5分钟来制备血清。将血清样品储存在-80℃下，随后进行生物标志物分析。在最后一次处理剂量24小时后，在通过腹膜内注射过剂量戊巴比妥(pentobarbitone)麻醉剂(3mL/kg 200mg/mL戊巴比妥钠(Euthatal)，Merial Animal Health Ltd，Harlow，UK)将已禁食过夜动物处死后，对其进行尸检。在化合物或载体处理后，在尸检期间自降主动脉获取血液以获得供血清骨生物标志物分析用最终血清样品。通过25号×5/8TW针将血液吸入无菌2.5mL注射器中并倾析至2×0.5mL血清凝胶血液收集管(Monovette 500Z-gel，目录号20.1344，Sarstedt，Leicester，UK)中，离心并储在-80℃下，随后进行分析。移出股骨及腰椎以供组织病理学处理和骨形成评估。对左股骨和第4或第5腰椎进行处理以供组织病理学分析。为将骨快速脱钙(用于制备苏木精及曙红染色切片)，将股骨在10％中性缓冲福尔马林(目录号PRC/R/4，Pioneer Chemicals，Colchester，UK)中固定10天，之后在10％甲酸水溶液(目录号F/1850/PB17，Fisher Scientific，Loughborough，UK)中脱钙5天，每天更换脱钙溶液。如果需要进行免疫组织化学分析，则将骨在10％中性缓冲福尔马林中固定10天，之后在50℃下用12％EDTA(乙二胺四乙酸)和4％中性缓冲福尔马林(目录号PRC/R/132，Pioneer Chemicals，Colchester，UK)中脱钙7周，且每周更换流体。在脱钙后，将股骨在流动自来水中洗涤2小时并通过标准过夜自动化处理方案使用连续的醇、乙醇及二甲苯溶液进行处理，之后进行最终蜡包埋。用切片机切割4μm厚切片，用苏木精和曙红染色并进行组织病理学评估。
骨形成的评价
可使用以下技术来评价化合物对GSK3抑制及骨合成代谢的效应。
a)组织病理学
通过光学显微术评价大鼠股骨切片中的组织病理学变化并通过骨小梁和骨皮质的变化评估骨形成。
在7天或14天后，当以5mg/kg计量口服给药3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐时，与相关载体对照组相比，在股骨中的形态方面没有显示任何差异。
在口服给药3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐7天后，使15mg/kg及50mg/kg的口服剂量与软骨下区域及骨干中的骨皮质二者中的增加的类骨质及骨的剂量有关变化相关联。另外，这两种剂量均与成骨细胞肥大(暗示成骨细胞活化)的迹象相关。另外，在50mg/kg剂量下，松质骨区室内的骨有增加的迹象。此剂量还与骨髓细胞动员及分化的组织学证据相关，尤其通过松骨区室内未成熟(胚细胞)成骨细胞数量的增加和髓细胞构成的增加。
在口服给药3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐14天后，3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐的组织学效应在性质上与那些在给予7天后所发现的相似，但通常更为明显且显示骨髓对化合物具有更大反应。具体而言，15mg/kg剂量的3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐显示软骨下区域及皮质区域二者中有骨形成的迹象。这两个发现均与成骨细胞肥大相关。通过在10只动物中的2只中观察软骨下区域中的局部骨质量来进一步加强对骨形成的确定。在50mg/kg组中，除上文所述的那些外，存在更广泛的暗示骨形成的骨变化：软骨下区域中类骨质的增加及潮标分区(tide mark zonation)；松骨区室中类骨质的增加及骨髓细胞构成的显著变化，具体而言，胚细胞群扩增，其与成骨细胞扩增在形态学上一致。
总地来说，这些数据在形态学上支持3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐在体内诱发骨形成的观念。
b)骨密度测定
使用具有Stratec软件6.0版的Norland Stratec XCT Research SA+设备(Norland Stratec Medizintechnik，Birkenfeld，Germany)并使用周围定量式计算机断层摄影术(pQCT)测量骨矿物质密度(
Figure BDA00002154850800351
等，Bone，1998，23，155-61，Tuukkanen等，J Bone Mineral.Res.2000，15，1905-11)。对体素大小为0.07×0.07×0.5mm3的每一右股骨进行体外pQCT测量。就干骺端测量而言，CT扫描位点在股骨远端距远端关节表面为总骨长度的25％处。全部骨的体积矿物质密度(干骺端总骨矿物质密度-BMD)测定为mg/cm3。
与载体处理的大鼠相比，以15mg/kg连续14天每天1次口服给予雌性CRL：CD大鼠口服给予的3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐使右股骨干骺端总BMD增加6.6％。用3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺盐酸盐处理的大鼠的股骨中的总BMD为814.41±15mg/cm3或载体为764.23±16mg/cm3(平均值±SEM)。这些结果显示口服给予3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐刺激骨形成。
骨生物标志物评价
通过用于I型前胶原的N-末端前肽(P1NP)的酶免疫测定(EIA)测定试剂盒和用于源自破骨细胞的耐酒石酸盐酸性磷酸酶形式5b(TRAcP-5b)的免疫固定酶活性测定试剂盒测定骨生物标志物，所述免疫固定酶活性测定试剂盒专门用于大鼠血清生物标志物的量化。测定试剂盒购自Immunodiagnostic Systems Ltd(IDS Ltd，Boldon，UK)且依照厂商说明书使用，以测定血清中I型前胶原的N-末端前肽(P1NP-产品代码AC-33F1)和源自破骨细胞的耐酒石酸盐酸性磷酸酶形式5b(TRAcP-5b-产品代码SB-TR102)水平。
PINP测定
所用P1NP测定为竞争性免疫测定，其中大鼠血清中的P1NP与经生物素标记的PINP蛋白质竞争板固定的抗体结合。在室温下在板振荡器上使用以下物质将用多株兔抗P1NP预涂覆的供应的96孔测定板以700rpm振荡培育1小时：50μl厂商供应的标准物或5μl血清及45μl供应的分析样品稀释液及50μl供应的P1NP生物素溶液，该溶液包含经生物素标记的P1NP蛋白质。用300μl供应的洗涤缓冲液将测定板的各孔手动洗涤3次，完全去除洗涤缓冲液，且在室温下将150μl供应的酶偶联物(包含连接至辣根过氧化物酶的抗生物素蛋白)培育30分钟。用洗涤缓冲液将测定板洗涤3次并在室温下将包含四甲基联苯胺和过氧化氢的水性制剂的150μl供应的TMB溶液培育30分钟，随后添加50μl供应的0.5M HCl来终止反应。使用Molecular Devices Spectromax-Plus分光光度计在450nM下测定所有孔的吸光度，其中参考吸光度为650nM。通过使用针对标准曲线的标准回归分析测定血清样品中P1NP的浓度(以ng/mL为单位)。
TRAcP-5b测定
在用多株抗小鼠IgG预涂覆的供应的96孔测定板中进行TRAcP-5b测定。在室温下在板振荡器上将各孔与100μl抗大鼠TRAcP-5b抗体一起以950rpm振荡培育60分钟。利用自动化1200μl多通道移液管用300μl供应的洗涤缓冲液将测定板的各孔手动洗涤4次。排出洗涤缓冲液并在室温下将100μl供应的标准物或具有75μl 0.9％NaCl溶液(Fresenius Kabi Ltd，Runcorn，UK，产品代码-2295121E)的25μl血清样品与50μl供应的释放试剂一起振荡培育1小时。用300μl供应的洗涤缓冲液将测定板的各孔手动洗涤5次。完全去除洗涤缓冲液并在37℃下将100μl供应的且新制备的pNPP(对硝基苯基磷酸盐)底物溶液培育1小时，随后添加25μl 0.32M NaOH以终止反应。使用Molecular DevicesSpectromax-Plus分光光度计在405nM下测定所有孔的吸光度。通过使用针对标准曲线的标准回归分析测定血清样品中TRAcP-5b的浓度(以U/L为单位)。
图2示出在口服给予3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐7天后大鼠中的血清P1NP水平
图3示出在口服给予3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐7天后大鼠中的血清TRAcP-5b水平
图2和图3中所示数据表明，连续7天每天1次口服给予雌性CRL：CD大鼠3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐产生血清P1NP水平(骨形成的标志物)的增加及血清TRAcP-5b水平(骨再吸收的标志物)的降低。这些结果显示口服给予3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐刺激骨形成。
使用以下测定来测量3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐抑制重组人类酶中CYP3A4的能力。
测定
根据咪达唑仑(midazolam)氧化对1′-羟基咪达唑仑的抑制来测定某些化合物抑制膜中CYP3A4的能力。CYP3A4使用咪达唑仑来催化1′-羟基咪达唑仑形成，其通过LC MS/MS来测量。相对于对照，抑制CYP3A4导致1′-羟基咪达唑仑产生速率下降。采用自动测定(完全IC50)使用自动化平台，每板运行至多13种化合物以及作为CYP3A4的标准抑制剂的酮康唑(ketoconazole)。
培育
在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4，在37℃下)中进行培育，所述缓冲液包含DMSO(1％)、咪达唑仑(2.5μM)、非那西丁(phenacetin)(25.7μM)、双氯芬酸(diclofenac)(1.8μM)、S-美芬妥英(S-mephenytoin)(30.5μM)、丁呋洛尔(bufuralol)(8.8μM)、NADPH(1mM)、大肠杆菌(E.coli)表达的3A4膜(5pmol/ml)、1A2膜(25pmol/ml)、2C9膜(5pmol/ml)、2C19膜(2.5pmol/ml)、2D6膜(5pmol/ml)及测试抑制剂酮康唑、α-萘黄酮(α-napthoflavone)、磺胺苯吡唑、反苯环丙胺及奎尼丁(quinidine)。非那西丁及双氯芬酸购自Sigma-Aldrich(Poole，dorset，UK)。S-美芬妥英、丁呋洛尔(盐酸盐)及咪达唑仑(盐酸盐)购自Ultrafine Chemicals(Manchester，UK)。重组表达的CYP酶购自Cypex(Dundee，UK)。
在自动样品处理器上进行测定。在微量滴定板中进行培育。通过添加NADPH(还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐)开始测定，将试剂混合并对板进行预培育。然后在hotel培育器中将板培育10分钟。添加MeOH(1∶1vol/vol)以终止反应。将样品离心，转移至清洁板中并通过LCMS/MS来分析，该分析使用带有Agilent HP1100二元溶剂输送泵和CTC HTS-PAL自动进样器的Applied Biosystems-Sciex API4000质谱仪来进行。流动相由甲醇和水组成，其中以甲酸(0.1％)作为改性剂。所用柱为Phenomenex Max RP 50×2mM(4μm粒径)。使用梯度系统，以3％有机流动相开始并保持0.25分钟，在1.75分钟升至100％有机。总运行时间为2.5分钟，其中流动速率为0.6mL/min。将10μl注射到柱上。监测产物(1′-羟基咪达唑仑)的形成。
抑制剂浓度
测试化合物的推荐浓度为50μM、15μM、5μM、1.5μM、0.5μM、0.15μM。需要测试抑制剂在DMSO中的5mM储液以获得这些浓度。使用酮康唑作为标准抑制剂且在0.09-0.0003μM下进行培育。
数据分析
通过测量MS/MS面积单位计算每一反应的反应速率。通过使用假希尔曲线(pseudo Hill plot)并利用自动电子表格将数据线性化来进行数据分析。
计算CYP3A4的抑制程度并以IC50值表示。IC50值为抑制CYP 3A4活性的50％的测试化合物的浓度。在上述分析中，3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐的估计IC50值＞50μM，表明所述化合物对CYP3A4具有可忽略的活性。
使用以下分析来测量3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐对心脏Na+通道hNav1.5的活性。
细胞培养物及制备
所用表达hNav1.5的中国仓鼠卵巢K1(CHO)细胞先前已有描述(Persson，F.等，(2005)，Journal of Cardiovascular Electrophysiology，16，329-341)。在37℃下在包含GlutamaxTM、10％胎牛血清及1mg/mlG418(均来自Invitrogen)的F-12Ham培养基中使所述细胞在加湿环境(5％CO2)中生长至半汇合状态。在使用前，使用预热(37℃)的维尔烯(Versene)1∶5000(Invitrogen)的3mL等分试样洗涤单层。在对此溶液进行抽吸后，在37℃下将烧瓶与另一3mL维尔烯1∶5000一起培养6分钟时段。然后通过轻轻敲击使细胞与烧瓶底部分离并随后将10mL包含钙(0.9mM)及镁(0.5mM)的达尔伯克磷酸盐缓冲液盐水(PBS；Invitrogen)添加至烧瓶中并且抽吸到15mL离心管中，之后进行离心(50g，达4分钟)。丢弃所得上清液并将团块轻轻地重悬于3mL PBS中。移出细胞悬浮液的0.5mL等分试样并在自动细胞计数器(Cedex；Innovatis)中测定活细胞数(基于台盼蓝排除)，使得可用PBS调节细胞重悬体积以获得期望的最终细胞浓度。就IonWorks Quattro实验而言，所用最终细胞浓度为1,000,000个细胞/毫升。
IonWorks的电生理学
IonWorks HT器件的原理和操作已由Schroeder等阐述(Schroeder等，(2003)，Ionworks HT：a new high-throughput electrophysiologymeasurement platform。Journal of Biomolecular Screening，8，50-64.2003)。简言之，该技术基于384孔板(PatchPlate)，其中在各孔中通过利用吸力将细胞定位并保持于分隔两个隔离流体室的小孔上来尝试记录。一旦完成密封，就将PatchPlate下侧上的溶液换成包含两性霉素B的溶液。这使得覆盖各孔中的孔洞的细胞膜片具有渗透性且实际上允许自单一细胞进行穿孔全细胞膜片箝记录。Ion Works Quattro器件使用相同技术，不同的是从至多64个细胞/孔进行记录。使用PBS(Invitrogen)作为具有以下组成(以mM计)的细胞外溶液：138NaCl、2.7KCl、0.9CaCl2、0.5MgCl2，1.5KH2PO4和8.1Na2HPO4。“内部”溶液(在密封形成过程期间使用)组成(以mM计)为：Kgluconate100、KCl 40、MgCl23.2、EGTA 3和HEPES 5(均得自Sigma-Aldrich；pH 7.25-7.30，使用10M KOH)。包含抗生素的溶液组成(以mM计)为：KCl 140、EGTA 1、MgCl21和HEPES 20(pH 7.25-7.30，使用10M KOH)及100μg/ml两性霉素B(Sigma-Aldrich)。将各化合物布置于板上12列中以便能够构建10个8点浓度-效应曲线；板上剩余两列加入载体(最终浓度为0.33％DMSO)以界定测定基线，及超大阻断浓度的氟卡胺(flecainide)(最终浓度为316μM)以界定100％抑制浓度。在用各测试化合物培育大约3.5分钟之前和之后测量hNav1.5电流。以此方式，可产生非积聚浓度-效应曲线，其中前提是在足够百分比的孔中达到验收标准(参见下文)。所有记录均在室温下进行。
混合之前及之后hNav1.5电流通过由下组成的单电压组来引发：在-90mV下保持15s时段、160ms跃变至-100mV(以获得泄漏电流的估计值)，100ms跃变回至-90mV，之后连续8个脉冲经50ms自以3Hz施加的-90mV保持电位至0mV。(选择3Hz的刺激频率，因其刺激在人类中所发现心率的正常上限范围-即180次跳动/分钟)。在混合之前及之后电压脉冲之间不存在对膜电位的箝位。根据在电压脉冲方案开始到-100mV跃变期间所引发电流的估计值对电流进行漏减(leak-subtracted)。在2.5kHz下对电流信号取样。
Ion Works TM软件通过以下操作而自经漏减的迹线测量扫描之前及之后hNav1.5电流幅值：获得在去极化脉冲至0mV的末期的平均电流(基线电流)并自峰内电流减去该值。各孔中所引发电流的验收标准为：扫描之前密封电阻＞30MΩ(Quattro)，扫描之前Na+电流幅值更小于-150pA；扫描之后密封电阻＞30MΩ(Quattro)。通过各孔及8个测试脉冲中每一者的扫描之前hNav1.5电流除以扫描之后hNav1.5电流来估计hNav1.5电流的抑制程度。
IC50值为抑制hNav1.5活性的50％的测试化合物的浓度。3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐的IC50为21.2μM，表明其对心脏Na+通道hNav1.5不会表现出强效抑制活性。
还在体内大鼠基因毒性微核研究中测试3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐。此研究的目的为研究两次口服剂量的3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐是否增加大鼠骨髓中微核未成熟红细胞(MIE)的频率。
将3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐给予7只在给予时大约10周龄的雄性WistarHan大鼠的群组。间隔24小时向各组给予两次剂量的0mg/kg、25mg/kg、125mg/kg及250mg/kg游离碱等效物(0μmol/kg、59.5μmol/kg、297μmol/kg及595μmol/kg)且在第二次剂量24小时后取样进行骨髓分析。向对照大鼠给予在磷酸盐缓冲液盐水中的载体、0.5％w/v羟丙基甲基纤维素及0.1％w/v聚山梨醇酯80。最高剂量为耐受最大值。
在第二次剂量24小时后处死动物并制备骨髓涂片，固定并用吖啶橙(acridine orange)染色。对于每一动物而言，对2000个未成熟红细胞(IE)的微核细胞(MIE)的出现率进行评分并在1000个细胞中测定IE与成熟红细胞(E)的比率。为充当质量控制工序，包括来自在先前研究中用环磷酰胺以20mg/kg(72μmol/kg)处理大鼠的骨髓的6个载玻片以及来自在染色及编号前处理过的动物的载玻片。
在两次剂量的3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐后，MIE超出载体对照的出现率不存在生物上或统计上的显著增加。处理组与载体对照组的IE∶E比率相似。如所预计的，与载体对照值相比，来自预先给予环磷酰胺的大鼠的载玻片中的MIE的出现率显著增加。
总之，当以两次高达250mg/kg游离碱等效物(595μmol/kg)的口服剂量给予时，3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐不会增加雄性Wistar Han大鼠的骨髓中微核未成熟红细胞的出现率。
还发现3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐表现出其它期望性质，例如药物动力学特性及高水溶解性(在磷酸钠缓冲液(pH 7.4，n＝4)中的平均测量溶解度为大约1128mg/ml)。
根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。
本发明组合物可呈适于口服使用的形式(例如作为片剂、锭剂、硬或软胶囊、水性或油性悬浮液、乳液、可分散粉剂或颗粒、糖浆或酏剂)、呈适于局部使用的形式(例如作为霜剂、膏剂、凝胶、或水性或油性溶液或悬浮液)、呈适于通过吸入给药的形式(例如作为细微粉末或液态气溶胶)、呈适于通过吹入给药的形式(例如作为细碎粉末)或呈适于肠胃外给药的形式(例如作为无菌水性或油性溶液用于静脉内、皮下、腹膜内或肌内给予或作为栓剂用于直肠给予)。
本发明组合物也可结合用于治疗骨组织的合适器件或植入物使用。
本发明组合物可通过常规工序使用本领域中熟知的常规药物赋形剂来获得。因此，意欲口服使用的组合物可包含(例如)一种或多种着色剂、甜味剂、调味剂和/或防腐剂。
与一种或多种赋形剂组合以产生单一剂型的活性成分的量将必然随所治疗主体和特定给药途径而变化。例如，意欲口服给予人类的制剂通常将包含(例如)1mg至1g活性剂(更合适地为1mg至250mg，例如1mg至100mg)，其与以总组合物的重量计可在约5％至约98％之间变化的适当且方便量的赋形剂混合。
出于治疗性或预防性目的，式I化合物的剂量大小自然应根据病状的性质和严重程度、动物或患者的年龄和性别以及给药途径，根据熟知的药学原理而改变。
在出于治疗性或预防性目的使用式I化合物时，通常所施用方式应使得接收在(例如)1mg/kg至100mg/kg体重范围内的日剂量，如果需要的话以分剂量给予。通常，在采用肠胃外途径时应给予较低剂量。因此，例如，就静脉内给药而言，通常应使用在(例如)1mg/kg至25mg/kg体重范围内的剂量。同样，就通过吸入给药而言，应使用在(例如)1mg/kg至25mg/kg体重范围内的剂量。然而，口服给药是优选的，特别是呈片剂形式。通常，单位剂型将包含约10mg至0.5g的本发明化合物。
如上所述，已发现本发明中定义的式I化合物非常适于抑制糖原合酶激酶-3(GSK3)。因此，预期本发明的所述化合物可用于预防和/或治疗与糖原合酶激酶-3活性相关的病症，即所述化合物可用于在需要此预防和/或治疗的哺乳动物(包括人类)中产生GSK3的抑制效应。
如上文所述，GSK3酶的抑制剂具有预防和/或治疗各种形式的骨相关性疾病或病症的治疗价值，所述疾病或病症为(例如)骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)、由于损伤或手术的骨折修复、导致骨丢失的慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、导致骨病变的癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明的一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用作温血动物(例如人)的药物。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的与GSK3相关的病症。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的与GSK3相关的病症的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的与GSK3相关的病症的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供预防和/或治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的与GSK3相关的病症的方法，其包括给予所述动物有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于预防温血动物(例如人)中的骨丢失。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在预防温血动物(例如人)中的骨丢失中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防温血动物(例如人)中的骨丢失效应的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供预防需要此治疗的温血动物(例如人)中的骨丢失的方法，其包括给予所述动物有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的那些对GSK-3酶的抑制敏感的骨相关性疾病或病症。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的那些对GSK-3酶的抑制敏感的骨相关性疾病或病症的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供预防和/或治疗那些对GSK-3酶的抑制敏感的骨相关性疾病或病症的方法，其包括给予温血动物(例如人)有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)、由于损伤或手术的骨折修复、导致骨丢失的慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、导致骨病变的癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)中的此类骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的以下病症的药物中的用途：骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)、由于损伤或手术的骨折修复、导致骨丢失的慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、导致骨病变的癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)中的此类骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的以下病症的药物中的用途：骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)、由于损伤或手术的骨折修复、导致骨丢失的慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、导致骨病变的癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)中的此类骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明此方面的另一特征，提供预防和/或治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的以下病症的方法：骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)、由于损伤或手术的骨折修复、导致骨丢失的慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、导致骨病变的癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)中的此类骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病，所述方法包括给予有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
如上文所定义的式I的吡嗪化合物可用于原发性及继发性骨质疏松，其中原发性骨质疏松包括绝经后骨质疏松以及男性和及女性二者中的老年性骨质疏松，并且继发性骨质疏松包括可的松(cortisone)诱导性骨质疏松，术语骨质疏松还包括任一其它类型的诱导性继发性骨质疏松。式I的吡嗪化合物可以不同配制方案进行局部或全身性给药以治疗这些病症。
因此，在本发明的另一特征中，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于治疗温血动物(例如人)中的骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗温血动物(例如人)中的骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗温血动物(例如人)中的骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供用于治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的骨质疏松(遗传性、医源性或因衰老/激素失衡而产生)的方法，其包括给予有效量的如上文所定义式I的色烯酮(chromenone)衍生物或其药学上可接受的盐。
促进及增加骨形成和/或骨矿物质密度使如上文所定义的式I化合物适于在哺乳动物中降低骨折(fracture)发生率，降低骨折速率和/或增加骨折愈合速率，增加松质骨形成和/或新骨形成。促进及增加新骨形成的用途可与手术结合。可在手术期间使用本发明，其中治疗外科医生将以适当制剂形式局部地将本发明放置靠近有缺陷的骨和/或放置在体腔中。骨可能(例如)已断裂，且在开放性骨折修复期间，利用本文所述及要求保护的本发明并随后应将其放置于骨折中或靠近该骨折处。在一些情况下，可能缺失骨片(例如在肿瘤切除或严重事故后)，且利用本文所述及要求保护的本发明，并随后应将其放置于靠近建设性骨手术部位处。
因此，在本发明的另一特征中，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于促进温血动物(例如人)中的骨形成。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于促进温血动物(例如人)中的骨形成的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于促进温血动物(例如人)中的骨形成的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供促进需要此治疗的温血动物(例如人)中的骨形成的方法，其包括给予有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于增加温血动物(例如人)中的骨矿物质密度。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于增加温血动物(例如人)中的骨矿物质密度的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于增加温血动物(例如人)中的骨矿物质密度的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供增加需要此治疗的温血动物(例如人)中的骨矿物质密度的方法，其包括给予有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于在温血动物(例如人)中降低骨折发生率和/或增加骨折愈合速率和/或增加愈合骨折强度。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于在温血动物(例如人)中降低骨折发生率和/或增加骨折愈合速率和/或增加愈合骨折强度的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于在温血动物(例如人)中降低骨折发生率和/或增加骨折愈合速率和/或增加愈合骨折强度的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供在需要此治疗的温血动物(例如人)中降低骨折发生率和/或增加骨折愈合速率和/或增加愈合骨折强度的方法，其包括给予有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)中的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的以下病症的药物中的用途：癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)中的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的以下病症的药物中的用途：癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)中的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明此方面的另一特征，提供预防和/或治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的以下病症的方法：癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)中的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病，所述方法包括给予有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的多发性骨髓瘤中的骨病变。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗温血动物(例如人)中的多发性骨髓瘤中的骨病变的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供预防和/或治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的多发性骨髓瘤中的骨病变的方法，其包括给予有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于预防患有以下病症的温血动物(例如人)中的骨骼相关事件：因癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)所致的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明此方面的另一特征，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于预防患有以下病症的温血动物(例如人)中的骨骼相关事件的药物中的用途：因癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)所致的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
根据本发明此方面的另一特征，提供预防需要此治疗的患有以下病症的温血动物(例如人)中的骨骼相关事件的方法：因癌症(例如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤)所致的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病，所述方法包括给予有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
除骨相关性疾病或病症以外，有证据表明GSK3酶还在其它疾病中起作用。因此，预期GSK3酶抑制剂在预防及治疗众多种除骨相关性疾病或病症外的疾病中具有价值。例如，预期GSK3酶抑制剂在癌症治疗中具有价值。实际上，还已发现式I的特定吡嗪衍生物，即3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐对其它激酶(例如PIM3、CHK2(限制点激酶2)和DYRK1a(经双特异性酪氨酸磷酸化且调节的激酶1a)表现出抑制活性，所述激酶还被认为在癌症中起作用。
因此，式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐应具有治疗各种形式的癌症疾病的治疗价值，所述癌症包括实体瘤(例如癌及肉瘤)和白血病以及恶性淋巴瘤。具体而言，式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐应具有治疗(例如)以下癌症的治疗价值：乳癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌及细支气管肺泡癌)和前列腺癌，以及及胆管癌、骨癌、膀胱癌、头颈癌、肾癌、肝癌、胃肠组织癌、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、宫颈癌及外阴癌和白血病(包括ALL和CML)、多发性骨髓瘤及淋巴瘤。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于治疗温血动物(例如人)中的癌症。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗温血动物(例如人)中的癌症的药物中的用途。
根据本发明此方面的另一特征，提供治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的癌症的方法，其包括给予所述动物有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于治疗选自以下的癌症：乳癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌和细支气管肺泡癌)及前列腺癌。
根据本发明的另一方面，提供如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗温血动物(例如人)中的选自以下的癌症的药物中的用途：乳癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌和细支气管肺泡癌)及前列腺癌。
根据本发明此方面的另一特征，提供治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的选自以下的癌症的方法：乳癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌和细支气管肺泡癌)及前列腺癌，所述方法包括给予所述动物有效量的如上文所定义的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
除非有相反的明确规定，否则在本说明书的上下文中，术语“疗法”或“治疗”还包括“预防”。术语“治疗”和“治疗性”应作相应理解。
除非有相反的明确规定，否则在本说明书上下文中，术语“疾病”还包括“病症”。
如上文所述，在给予式I化合物之后，式(I)化合物的体内效应可部分由在人类或动物体内形成的一种或多种代谢产物施加。
上文所定义抗骨丢失治疗可作为唯一疗法应用或除本发明化合物外还可包括常规手术或放射疗法或化学疗法。此化学疗法可包括以下类别的抗肿瘤剂中的一种或多种：-
(i)其它抗增殖药/抗肿瘤药及其组合，如医学肿瘤学中所用的，例如烷化剂(如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺、氮芥(nitrogen mustard)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、替莫唑胺(temozolamide)和亚硝基脲类)；抗代谢物(例如吉西他滨(gemcitabine)和抗叶酸剂，例如氟嘧啶类，如5-氟尿嘧啶及替加氟(tegafur)、雷替曲塞(raltitrexed)、氨甲蝶呤(methotrexate)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类抗生素，如阿霉素(adriamycin)、博来霉素(bleomycin)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunomycin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素C(mitomycin-C)、放线菌素(dactinomycin)及光辉霉素(mithramycin))；抗有丝分裂剂(例如，长春花生物碱类，如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)以及紫杉烷，如紫杉醇(taxol)和多西他赛(taxotere)及polo激酶抑制剂)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如，表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)，如依托泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、托泊替康(topotecan)和喜树碱(camptothecin))；
(ii)细胞生长抑制剂，例如，抗雌激素类(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、氟维司群(fulvestrant)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)和艾多昔芬(iodoxyfene))、抗雄激素类(例如，比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate))、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprorelin)和布舍瑞林(buserelin))、孕激素类(如乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))、芳香酶抑制剂(如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、伏氯唑(vorazole)和依西美坦(exemestane))以及5α-还原酶的抑制剂(例如非那雄胺(finasteride))；
(iii)抗侵袭剂[例如，c-Src激酶家族抑制剂，如4-(6-氯-2，3-亚甲基二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基羟喹唑啉(AZD0530；国际专利申请WO 01/94341)、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼(dasatinib)，BMS-354825；J.Med.Chem.，2004，47，6658-6661)和伯舒替尼(bosutinib)(SKI-606)，及金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他(marimastat)，尿激酶型纤溶酶原激活剂受体功能的抑制剂或乙酰肝素酶(Heparanase)的抗体]；
(iv)生长因子功能抑制剂：例如，此类抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体(例如，抗erbB2抗体曲妥单抗(trastuzumab)[HerceptinTM]、抗EGFR抗体帕尼单抗(panitumumab)、抗erbB1抗体西妥昔单抗(cetuximab)[Erbitux，C225]以及由Stern等，Critical reviews inoncology/haematology，2005年第54卷第11-29页公开的任一生长因子或生长因子受体抗体)；此类抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如，EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼(gefitinib)，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼(erlotinib)，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI 1033)、erbB2酪氨酸激酶抑制剂(例如拉帕替尼(lapatinib))；肝细胞生长因子家族的抑制剂；胰岛素生长因子家族的抑制剂；血小板衍生生长因子家族的抑制剂，例如伊马替尼(imatinib)和/或尼洛替尼(nilotinib)(AMN107)；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂，例如法尼基(farnesyl)转移酶抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006)、替吡法尼(tipifarnib)(R115777)和洛那法尼(lonafarnib)(SCH66336))、通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传导抑制剂、c-kit抑制剂、abl激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、Plt3激酶抑制剂、CSF-1R激酶抑制剂、IGF受体(胰岛素样生长因子)激酶抑制剂；aurora激酶抑制剂(aurora kinase inhibitor)(例如AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)以及周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如CDK2和/或CDK4抑制剂；
(v)抗血管生成剂，例如，可抑制血管内皮生长因子的效应的那些[例如，抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(bevacizumab)(AvastinTM)以及(例如)VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，例如凡德他尼(vandetanib)(ZD6474)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)、舒尼替尼(sunitinib)(SU11248)、阿西替尼(axitinib)(AG-013736)、帕唑帕尼(pazopanib)(GW 786034)以及4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO 00/47212中的实施例240)，例如公开于国际专利申请WO 97/22596、WO 97/30035、WO97/32856及WO 98/13354中的那些的化合物及通过其它机制起作用的化合物(例如，利诺胺(linomide)、整联蛋白αvβ3功能抑制剂及血管生成抑制素(angiostatin)]；
(vi)血管损伤剂，例如考布他汀(Combretastatin)A4及公开于国际专利申请WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434及WO 02/08213中的化合物；
(vii)内皮素受体拮抗剂，例如齐泊腾坦(zibotentan)(ZD4054)或阿曲生坦(atrasentan)；
(viii)反义治疗剂，例如，针对以上所列靶的那些，例如，ISIS2503(抗-ras反义剂)；
(ix)蛋白体抑制剂，例如万珂(硼替佐米)
(x)基因疗法方法，包括(例如)替代诸如异常p53或异常BRCA1或BRCA2的异常基因的方法、诸如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些的GDEPT(基因导向的酶前药疗法)方法以及可提高患者对化学疗法或放射疗法的耐受性的方法(例如多重耐药性基因疗法)；和
(xi)免疫疗法方法，包括(例如)提高患者肿瘤细胞的免疫原性的体外或体内方法，例如用诸如白介素2、白介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的细胞因子转染；降低T-细胞无反应性的方法；使用经转染的免疫细胞(例如经细胞因子转染的树突细胞)的方法；使用经细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法；以及使用抗个体基因型抗体的方法。
根据本发明的此方面，提供适用于治疗骨相关性疾病或病症的组合，其包含如上文所定义的式I化合物或其药学上可接受的盐及上文(i)-(xi)下所列举的抗肿瘤剂中的任一种。
因此，在本发明的另一方面中，提供式I化合物或其药学上可接受的盐与选自上文(i)-(xi)下所列举者的抗肿瘤剂的组合。
在本文中，当使用术语“组合”时，应理解为这是指同时、分开或依序给予。在本发明的一个方面中，“组合”是指同时给予。在本发明的另一方面中，“组合”是指分开给予。在本发明的另一方面中，“组合”是指依序施用。在依序或分开施用时，不应给予第二组分的延迟不应使得丧失该组合的有益效果。
根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含式I化合物或其药学上可接受的盐与选自上文(i)-(xi)下所列举者的抗肿瘤剂的组合、以及药学上可接受的稀释剂或载体。
根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含式I化合物或其药学上可接受的盐与选自上文(i)-(xi)下所列举者的抗肿瘤剂的组合、以及药学上可接受的稀释剂或载体，所述组合物用于治疗骨相关性疾病或病症。
根据本发明的另一特征，提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐与选自上文(i)-(ix)下所列举者的抗肿瘤剂的组合在制备用于温血动物(例如人)中的骨相关性疾病或病症的药物中的用途。
因此，在本发明的额外特征中，提供治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的骨相关性疾病或病症的方法，其包括给予所述动物有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐与选自上文(i)-(xi)下所列举者的抗肿瘤剂的组合。
根据本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其包含式I化合物或其药学上可接受的盐与选自上文(i)-(xi)下所列举者的抗肿瘤剂的组合。
根据本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其包含
a)式I化合物或其药学上可接受的盐，其呈第一单位剂型；
b)选自上文(i)-(xi)下所列举者的抗肿瘤剂，其呈第二单位剂型；和
c)容器构件，其用于容纳所述第一和第二剂型。
上文所定义的抗骨丢失治疗可作为唯一疗法应用或除本发明化合物方法外还可包括与其它药理活性剂(例如双膦酸盐、雌激素、SERMS(选择性雌激素受体调节剂)、RANKL(核因子kB配体的受体活化剂)拮抗剂、降钙素以及雌激素促进剂(例如甲状旁腺激素或重组或合成甲状旁腺激素))的组合。双膦酸盐的实例包括阿伦膦酸盐(alendronate)、氯膦酸盐(clodronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、依替膦酸盐(etidronate)、利塞膦酸盐(risedronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)和唑来膦酸(zoledronic acid)。SERMS的实例包括雷洛昔芬(raloxifene)和二氢雷洛昔芬。RANKL拮抗剂的一个实例为地诺单抗(denosumab)。降钙素包括人类降钙素和鲑降钙素。
根据本发明的此方面，提供适用于治疗骨相关性疾病或病症的组合，其包含如上文所定义的式I化合物或其药学上可接受的盐及选自以下的药理活性剂：双膦酸盐、雌激素、SERM、RANKL拮抗剂、降钙素及雌激素(oestogenic)促进剂。
根据本发明的另一方面，提供药物组合物，其包含式I化合物或其药学上可接受的盐与选自以下的药理活性剂的组合以及药学上可接受的稀释液或载体：双膦酸盐、雌激素、SERM、RANKL拮抗剂、降钙素及雌激素促进剂。
根据本发明的另一方面，提供药物组合物，其包含式I化合物或其药学上可接受的盐与选自以下的药理活性剂的组合以及药学上可接受的稀释液或载体：双膦酸盐、雌激素、SERM、RANKL拮抗剂、降钙素及雌激素促进剂，所述药物组合物用于治疗骨相关性疾病或病症。
根据本发明的另一特征，提供式I化合物或其药学上可接受的盐与选自以下的药理活性剂的组合在温血动物(人)中治疗骨相关性疾病或病症中的用途：双膦酸盐、雌激素、SERM、RANKL拮抗剂、降钙素及雌激素促进剂。
因此，在本发明的额外特征中，提供治疗需要此治疗的温血动物(例如人)中的骨相关性疾病或病症的方法，其包括给予所述动物有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐与选自以下的药理活性剂的组合：双膦酸盐、雌激素、SERM、RANKL拮抗剂、降钙素及雌激素促进剂。
尽管式I化合物主要具有作为用于温血动物(包括人)中的治疗剂的价值，但其在需要抑制GSK-3的效应的任何时候也是有用的。因此，其可作为药理学标准物用于开发新的生物试验和研究新的药理剂。
现在将在以下实施例中阐释本发明，其中，通常：
(i)除非另有说明，否则在环境温度下(即在17℃至25℃的范围内)且在惰性气体(例如氮气)的气氛下进行操作；
(ii)通过旋转蒸发进行蒸发且在通过过滤去除残余固体后进行后处理工序；
(iii)使用得自Agela technologies的预填充Agela正相Si60二氧化硅滤筒在自动combiflash companion(TELEDYNE，ISCO，USA)上进行快速色谱纯化；
(iv)使用水(包含0.1％TFA)与乙腈的极性渐减混合物作为洗脱液在配备有ZMD或ZQ ESCi质谱仪和Luna反相柱(C-18，5微米二氧化硅，50mm直径，250mm长度，流速为80毫升/分钟)的SHIMADZU仪器(LC-8A)上进行制备色谱法，或在适当的情况下，使用WatersSymmetry C8，Xterra或Phenomenex Gemini柱，使用乙腈和乙酸铵水溶液、氨、甲酸或三氟乙酸作为缓冲液进行RPHPLC(反相制备型高效液相色谱法)；
(v)产率(如果存在)未必为可获得的最大值；
(vi)通常，通过核磁共振(NMR)光谱法来确认式I终产物的结构；以δ标度测量NMR化学位移值[使用Varian或Bruker Avance 400(400MHz)仪器测定质子磁共振谱]；除非另有说明，否则在环境温度下进行测量；已使用以下缩写：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；dd，双重双峰；ddd，双组双重双峰；dt，双重三峰；bs，宽信号；
(vii)通常，式I终产物也可在液相色谱法接着质谱法(LCMS)来表征；使用配备有SHIMADZU 2010EV质谱仪和Xtimate 3μm C-18柱(2.1×30mM)或Shim-pack XR-ODS C-18柱(3.0×30mM)的SHIMADZU 20AB，在以下任一种条件下进行LC MS：(a)流速为1.2mL/min，使用10％A+90％B至80％A+20％B的溶剂体系，历经3分钟，其中A＝在乙腈中的0.01875％TFA，B＝在H2O中的0.0375％TFA，或(b)流速为1.0mL/min，使用90％A+10％B至10％A+80％B的溶剂体系，历经2分钟，其中A＝在水中的0.05％甲酸，B＝在ACN中的0.05％甲酸；
(viii)X射线粉末衍射谱是(使用P′Analytical Cubix分析仪器)通过将结晶材料的样品安装在单晶硅(SSC)晶片样品夹持器上且将样品展开成薄层来测定。使样品以30转/分钟(以改良计数统计)旋转，并用由在45kV及40mA下运行的长细聚焦铜管所产生的波长为1.5418埃的X射线辐照。使准直X射线源穿过设定在V20的自动可变发散狭缝，且反射的辐射对准穿过5.89mm防散射狭缝及9.55mm探测器狭缝。以θ-θ模式，在2度至40度2θ范围内，将样品暴露100秒/0.02°2θ增量(连续扫描模式)。该仪器配备有位置灵敏探测器(Lynxeye)。通过利用X′Pert行业软件操作的Dell Optiplex 686Windows XP Workstation进行控制和数据捕捉。X射线粉末衍射领域的技术人员将意识到峰的相对强度可受(例如)尺寸在30微米以上且纵横比不均一的晶粒的影响，峰的相对强度可影响样品分析。技术人员还将意识到，反射位置可受样品在衍射仪中所处的精确高度及衍射仪的零校准的影响。样品的表面平整度也可具有小的影响。因此，所呈现的衍射图谱数据不应视为绝对值。
(ix)使用TA Instruments Q2000DSC仪器进行差式扫描量热法。通常将配备有封盖的TZero铝盘内包含的小于5mg材料以10℃/分钟的恒定加热速率在0℃至300℃的范围内加热。使用吹扫气体(氮气)，流速为50毫升/分钟。通常，由于粒子及样品尺寸引入热滞，因此可发现转变温度值的测量误差为大约±1℃；并且
(x)已使用以下缩写：-
Boc2O    二碳酸二叔丁基酯
Br2      溴
CDCl3    氘代氯仿
DCM      二氯甲烷
DMAP     4-二甲基氨基吡啶
DMF          N，N-二甲基甲酰胺
DMSO         二甲基亚砜
EtOAc        乙酸乙酯
HATU         O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲
             六氟磷酸盐
HCl          氯化氢
HF           氟化氢
IPA          异丙醇
KOAc         乙酸钾
K2CO3        碳酸钾
LiAlH4       氢化铝锂
MeCN         乙腈
MeOD         氘代甲醇
MgSO4        硫酸镁
MsCl         甲磺酰氯
MTBE         甲基叔丁基醚
Na2CO3       碳酸钠
NaOH         氢氧化钠
Na2SO4       硫酸钠
NMP          1-甲基-2-吡咯烷酮
N2           氮气
PCy3         三环己基膦
Pd(dppf)Cl2  [1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)
Pd-Cl2       二氯化钯(II)
PE           石油醚
TBSCl        叔丁基二甲基氯硅烷
THF          四氢呋喃
TEA          三乙胺
TLC          薄层色谱法
实施例1
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐
根据以下方案制备标题化合物：
Figure BDA00002154850800602
(i)3-(4-溴苯基)丙-1-醇：
在0℃下向3-(4-溴苯基)-丙酸(9.16g，40mmol)在THF(150mL)中的溶液中分批添加LiAlH4(1.4g，36mmol)。当完成添加时，将反应混合物加热并在回流下搅拌另外5小时。将反应混合物冷却至0℃并逐滴添加2N-HCl(50mL)。用EtOAc萃取反应混合物并用水(x3)洗涤。将合并的有机萃取物经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，获得呈油状物的副标题化合物(i)(8g)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.40(d，2H)，7.08(d，2H)，3.66(t，2H)，2.66(t，2H)，1.89-1.82(m，2H)。
(ii)(3-(4-溴苯基)丙氧基)(叔丁基)二甲基硅烷：
向步骤(i)的产物(32.25g，0.15mol)在无水二氯甲烷(400mL)中的溶液中依序添加三乙胺(45g，0.45mol)、DMAP(915mg，7.5mmol)及TBSCl(33g，0.215mol)。将所得溶液搅拌过夜。用二氯甲烷萃取反应混合物并用水(x3)洗涤。将合并的有机层经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过柱色谱法利用PE对粗制产物进行纯化，获得呈浅褐色油状物的副标题化合物(ii)(40g)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.34(d，2H)，7.02(d，2H)，3.56(t，2H)，2.58(t，2H)，1.77-1.73(m，2H)，0.86(s，9H)，0.00(s，6H)；
HPLC保留时间＝1.017min。
(iii)3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸甲酯：
3-氨基吡嗪-2-甲酸甲酯(200g，1.3mol，3B Scientific Corporation)溶于AcOH(1L)中。将该溶液升温至50℃并逐滴添加Br2(312g，1.9mol)。当完成添加时，在50℃下将混合物搅拌另外3小时。将反应混合物缓慢倾倒至冰水(4L)中。将沉淀过滤，用水洗涤并在减压下干燥，获得呈红褐色固体的副标题化合物(iii)(300g)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.28(s，1H)，3.97(s，3H)；
HPLC保留时间＝1.016min。
(iv)3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸：
向步骤(iii)的产物(200g，0.86mol)在MeOH(500mL)中的溶液中缓慢添加5N-NaOH(500mL)。在50℃下将所得混合物搅拌3小时。在减压下去除MeOH并将水(300mL)加至反应混合物中。利用6N-HCl将溶液酸化至pH 3。用EtOAc萃取溶液并用水洗涤。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干，获得呈褐黄色固体的副标题化合物(iv)(180g)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.30(s，1H)；
HPLC保留时间＝0.850min。
(v)3-氨基-6-溴-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺
向步骤(iv)的产物(100g，0.45mol)在DMF(350mL)中的溶液中添加TEA(129mL，0.91mol)和3-氨基吡啶(42.3g，0.45mol)。将HATU(174g，0.45mol)分批添加至溶液中。将悬浮液过滤，用水洗涤并在减压下干燥，获得呈黄色固体的副标题化合物(v)(105g)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ9.50(s，1H)，8.81(d，1H)，8.40(dd，1H)，8.32(s，1H)，8.23-8.20(m，1H)，7.33(dd，1H)。LCMS(ESI)m/z[M+H]+＝294&296(计算值＝294&296)(多模式+)，HPLC保留时间＝0.478min。
(vi)3-氨基-6-(4-(3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丙基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-吡嗪-2-甲酰胺：
搅拌步骤(ii)的产物(9.84g，30mmol)、双联频哪醇硼酸酯(11.4g，45mmol)、KOAc(9g，90mmol)和Pd(dppf)Cl2(1g，1.5mmol)在二噁烷(200mL)中的混合物并将其用N2(x3)脱气。在80℃下将该混合物在N2气氛下搅拌3小时。将反应混合物冷却至室温。将水(25mL)和Na2CO3(10g，90mmol)添加至混合物中。将混合物搅拌10分钟，随后添加步骤(v)的产物(7.9g，27mmol)和Pd(dppf)Cl2(0.5g，0.7mmol)。将所得溶液再用N2(x3)脱气。在90℃下将反应混合物在N2气氛下搅拌另外10小时。添加Na2SO4，过滤并真空浓缩滤液。通过柱色谱法利用PE∶EtOAc＝5∶1至3∶1作为洗脱液对粗制产物进行纯化，获得呈黄色固体的副标题化合物(vi)(7.8g)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ9.90(s，1H)，8.73(d，1H)，8.62(s，1H)，8.34(d，1H)，8.21(d，1H)，7.74(d，2H)，7.28(d，2H)，7.28(m，1H)，3.6(t，2H)，2.68(t，2H)，1.83-1.79(m，2H)，0.86(s，9H)，0.00(s，6H)；LCMS(ESI)m/z[M+H]+＝464(计算值＝464)(多模式+)，HPLC保留时间＝1.233min。
(vii)3-氨基-6-(4-(3-羟丙基)苯基)-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺：
将步骤(vi)的产物(14.5g，31.3mmol)添加至塑料容器中并添加THF(150mL)。将HF(30mL)小心添加至溶液中并在室温下将溶液搅拌3小时。将混合物倾倒至600mL水中并添加5N-NaOH以将溶液碱化至pH＝10-11。用EtOAc萃取溶液并用水(x3)洗涤。将合并的EtOAc萃取物经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，获得呈黄色固体的副标题化合物(vii)(10g)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.94(d，1H)，8.87(s，1H)，8.31(dd，1H)，8.18-8.16(m，1H)，8.10(d，2H)，7.60(brs，2H)，7.38(dd，1H)，7.28(d，2H)，3.39(q，2H)，2.61(t，2H)，1.75-1.65(m，2H)；LCMS(ESI)m/z[M+H]+＝350(计算值＝350)(多模式+)，HPLC保留时间＝0.858min。
(viii)甲磺酸3-(4-(5-氨基-6-(吡啶-3-基氨基甲酰基)吡嗪-2-基)苯基)丙酯：
将二氯甲烷(200mL)和二异丙基乙胺(2g，17.16mmol)添加至步骤(vii)的产物(4g，11.46mmol)中。将所得溶液冷却至0℃并逐滴添加MsCl(2g，17.16mmol)。当完成添加时，在0℃下将所得溶液搅拌10分钟且在室温下搅拌2小时。用二氯甲烷萃取反应混合物并用水(x3)洗涤。将合并的有机萃取物经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，获得呈黄褐色固体的副标题化合物(viii)(4.5g)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ9.94(s，1H)，8.81(d，1H)，8.70(s，1H)，8.41(d，1H)，8.30(d，1H)，7.84(d，2H)，7.34(d，2H)，7.34(m，1H)，4.27(t，2H)，3.03(s，3H)，2.84(t，2H)，2.17-2.10(m，2H)；
LCMS(ESI)m/z[M+H]+＝428(计算值＝428)(多模式+)，HPLC保留时间＝0.933min。
(ix)3-氨基-6-(4-(3-(3-甲氧基丙基氨基)丙基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐：
在90℃下将步骤(viii)的产物(4.25g，10mmol)、K2CO3(2.76g，20mmol)和3-甲氧基丙胺(1.78g，20mmol)在MeCN(100mL)中的混合物在N2气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温并过滤。真空浓缩滤液并通过制备型HPLC进行纯化。蒸发包含所需化合物的馏分以将溶剂(乙腈和水)体积自1L减至50mL并添加0.5M HCl水溶液(20mL)。然后将所得黄色溶液冻干，获得为三盐酸盐的标题化合物(黄色固体，2.7g)。
1H-NMR(400MHz，MeOD)δ9.63(d，1H)，8.95(d，1H)，8.81(s，1H)，8.64(d，1H)，8.12-8.09(m，1H)，8.10(d，2H)，7.42(d，2H)，3.51(t，2H)，3.34(s，3H)，3.13(t，2H)，3.05(t，2H)，2.78(t，2H)，2.10-2.00(m，2H)，1.98-1.90(m，2H)；
LCMS(ESI)m/z[M+H]+＝421(计算值＝421)(多模式+)，HPLC保留时间＝0.815min。
实施例2
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-甲酰胺
Figure BDA00002154850800641
根据以下方案制备标题化合物：
Figure BDA00002154850800642
(i)甲磺酸3-(4-溴苯基)丙酯：
在0-5℃下向3-(4-溴苯基)丙-1-醇(500g，2.30mol)和二异丙基乙胺(312g，2.40mol)在无水二氯甲烷(4L)中的搅拌溶液中逐滴缓慢添加甲磺酰氯(280g，2.40mol)。添加后，在0-5℃下将反应混合物搅拌1小时。用盐水(1L)将反应混合物洗涤两次。真空浓缩有机相，获得副标题化合物(i)(667g)。HPLC保留时间＝1.353min。
(ii)3-(4-溴苯基)-N-(3-甲氧基丙基)丙-1-胺：
在80-90℃下将步骤(i)的产物(272g，0.93mol)、K2CO3(256g，1.86mol)、甲氧基丙胺(199g，2.22mol)在MeCN(1.5L)中的混合物在N2气氛下搅拌16小时。将反应混合物冷却至室温并过滤。浓缩滤液以去除MeCN。将MTBE(1L)和H2O(1L)加入所得混合物中并用1N-HCl水溶液(1L)洗涤。收集水相并通过2.5N-NaOH水溶液将其碱化至pH＝9-10，获得在溶液中的副标题化合物(ii)，其直接用于下一步骤。
LCMS(ESI)m/z[M+H]+＝286&288(计算值＝286&288)(多模式+)，HPLC保留时间＝0.935min。
(iii)N-[3-(4-溴苯基)丙基]-N-(3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯：
向步骤(ii)的产物(0.93mol)在来自最后步骤的NaOH水溶液中的搅拌反应混合物中加入THF(1L)并在10℃下将Boc2O(222g，1.01mol)逐滴添加至混合物中。添加后，在10℃下将混合物搅拌1小时并用MTBE(1L×2)萃取。浓缩有机相并通过柱色谱法(PE∶EtOAc＝10∶1-5∶1)进行纯化，获得300g副标题化合物(iii)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.38(d，J＝8.4Hz，2H)，7.05(d，J＝8.4Hz，2H)3.35(t，J＝6.0Hz，2H)，3.30(s，3H)，3.22(s，4H)，2.54(t，J＝7.6Hz，2H)，1.76-1.84(m，4H)，1.43(s，9H)。LCMS(ESI)m/z[M+H]+＝386&388(计算值＝386&388)(多模式+)。
(iv)N-(3-甲氧基丙基)-N-{3-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基]丙基}氨基甲酸叔丁基酯：
搅拌步骤(iii)的产物(230g，0.60mol)、双联频哪醇硼酸酯(227g，0.89mol)、KOAc(175g，1.79mol)、Pd-Cl2(3.20g，18mmol)、PCy3(10g，38mmol)在MeCN(4L)中的混合物并用N2脱气3次。在80℃下将反应混合物在N2下搅拌16小时。将混合物过滤并真空浓缩滤液以去除MeCN。加入MTBE(3L)且用H2O(800mL×3)洗涤有机相并浓缩，获得呈油状物的副标题化合物(iv)(250g)，其直接用于下一步骤。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.71(d，J＝8.0Hz，2H)，7.18(d，J＝8.0Hz，2H)，3.35(t，J＝6.0Hz，2H)，3.29(s，3H)，3.22(s，4H)，2.60(t，J＝7.6Hz，2H)，1.75-1.88(m，4H)，1.43(s，9H)，1.32
HPLC保留时间＝1.793min。
(v)N-[3-{4-[5-氨基-6-(3-吡啶基氨基甲酰基)吡嗪-2-基]苯基}丙基]-N-(3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯：
搅拌步骤(iv)的产物(250g，0.58mol)、3-氨基-6-溴-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺(220g，0.75mol)、Na2CO3(183g，1.73mol)和Pd(dppf)Cl2(25.30g，35mmol)在DMF(3L)中的混合物并用N2脱气3次。在70-80℃下将混合物在N2下搅拌24小时。将混合物过滤并真空浓缩滤液以去除DMF。加入EtOAc(1.5L)和H2O(800mL)并在10-25℃下将其搅拌1小时。将悬浮液过滤，真空浓缩有机相并通过柱色谱法(PE∶EtOAc＝3∶1-1∶3)进行纯化。将粗制产物自EtOAc-MeOH重结晶并过滤，通过EtOA洗涤黄色固体并在减压下干燥。获得副标题化合物(v)(浅黄色固体，160g)。
LCMS(ESI)m/z[M+H]+＝521(计算值＝521)(多模式+)，HPLC保留时间＝1.366min。
(vi)3-氨基-6-(4-(3-(3-甲氧基丙基氨基)丙基)苯基)-N-(吡啶-3-基)-吡嗪-2-甲酰胺：
将步骤(v)的产物(300g，0.58mol)(在4N-HCl中)在EtOAc(3L)中的混合物搅拌3小时。将悬浮液过滤并获得黄色固体。将固体溶于H2O(1.2L)中。将2N-NaOH逐滴添加至溶液中以碱化至pH＝11。将该混合物用THF与EtOAc(5L×2，1∶1)的混合物萃取并用10％-NaCl水溶液洗涤有机相并且真空浓缩。获得副标题化合物(vi)(浅黄色固体，210g)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.57(s，1H)，8.99(d，J＝2.4Hz，1H)，8.89(s，1H)，8.35(dd，J＝1.2Hz，J＝4.8Hz，1H)，8.23-8.20(m，1H)，8.12(d，J＝8.4Hz，2H)，7.67(s，2H)，7.40(dd，J＝4.8Hz，J＝4.8Hz，1H)，7.28(d，J＝8.4Hz，2H)，3.33(t，J＝6.8Hz，2H)，3.18(s，3H)，2.62(t，J＝7.2Hz，2H)，2.47(dd，J＝7.2Hz，J＝14Hz，4H)，1.73-1.65(m，2H)，.1.62-1.56(m，2H)。
通过XRPD(参见图4)确定如上文所述制备的3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺形式B为晶体且具有以下X射线粉末衍射峰：
角度2θ(2θ)   强度％
3.5   100
7.0   4
9.5   2
10.4   15
12.4   3
13.8   2
14.1   8
15.9   7
17.6   9
21.0   5
还用10℃/min的加热速率进行3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺形式B的DSC分析(图5)，并且分析显示起始点为47℃且峰值为60℃的初始吸热事件，随后为起始点为113℃且峰值为116℃的后续相变。因此，DSC分析显示，3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺形式B为熔融起始点为约113℃且峰值为约116℃的高熔融固体。
实施例3a
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的形式A
将500.6mg 3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺(如实施例2中所制备)和189.09mg苯磺酸准确称重至玻璃小瓶中并添加15mL IPA以形成悬浮液。在室温下将悬浮液保持振荡2天，且随后过滤并在室温下干燥，获得黄色粉末。
通过XRPD(参见图6a)确定如上文所述所制备的3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的形式A为晶体且其具有以下X射线粉末衍射峰：
角度2θ(2θ)   强度％
7.5   16
8.4   100
11.0   13
14.5   9
15.7   12
18.5   8
20.2   6
22.0   11
22.2   10
23.0   3
还用10℃/min的加热速率进行3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐形式A的DSC分析，且分析显示起始点为89℃且峰值为99℃的初始吸热事件，随后为起始点为164℃且峰值为167.0℃的熔体(图7a)。因此，DSC分析显示，3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐形式A为熔融起始点为约164℃且峰值为约167℃的高熔融固体。
实施例3b
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的形式C
Figure BDA00002154850800681
3-氨基-6-溴-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺的合成
阶段1：3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸甲酯
Figure BDA00002154850800682
将3-氨基吡嗪-2-甲酸甲酯(1kg)、N-溴代琥珀酰亚胺(1.162kg)和乙腈(8L)加入反应器中。在室温下将混合物搅拌10分钟，加热至75-80℃并在轻缓回流条件下保持2至3小时。
将混合物冷却至25℃并在旋转蒸发仪上蒸发至干。将所得黑色固体再溶于二氯甲烷(20L)中并加入活性碳(100g)。在25℃下将所得悬浮液搅拌30至60分钟，随后过滤以去除不溶物。随后用饱和Na2SO3(3×5L)水溶液及水(5L)洗涤滤液。在相分离后收集有机层。在旋转蒸发仪上去除二氯甲烷并获得呈褐色固体的3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸甲酯，其不进一步纯化即用于下一步骤(1090g湿产物)。
阶段2：3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸
Figure BDA00002154850800691
将3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸甲酯(1.4kg)、5N NaOH溶液(5.6L)和甲醇(8.4L)加入反应器中。在剧烈搅拌的同时使所得悬浮液在50℃下加热3小时。分析混合物的反应是否完成。
将混合物冷却至25℃并通过过滤收集固体。用水(1L)洗涤滤饼。将所得固体悬浮于水(5L)中并通过添加6N HCl溶液将此悬浮液的pH值调节至3。在25℃下将酸性溶液剧烈搅拌48h。在此期间，检查pH值，若pH值＞3，则加入额外酸。将悬浮液过滤，收集黄褐色固体，在N2流下在烘箱中将其在40℃下干燥。将粗制副标题材料用于下一步骤。
阶段3：3-氨基-6-溴-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺
Figure BDA00002154850800692
将3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸(1.07kg)、3-氨基吡啶(460g)、三乙胺(680mL)和DMF(6.4L)加入反应器中。将混合物冷却至-5至0℃并搅拌15分钟。在氮气流下，分多份缓慢添加HATU(1.8kg)，同时将温度维持在10℃以下。添加时，形成稠的黄色沉淀。添加后，在20-25℃下将混合物搅拌1h。分析反应是否完成(3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酸＝0％)。在剧烈搅拌下添加水(13L)。在25℃下将黄色悬浮液搅拌30分钟。将悬浮液过滤并将滤饼再加入反应器中。加入水(13L)。将黄色悬浮液升温至50℃并在此温度下搅拌2h。将悬浮液过滤并用水洗涤滤饼。在氮气流下将湿产物(3-氨基-6-溴-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺)在烘箱中于55℃下干燥。(1.14Kg)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)7.39(dd，1H)；7.74(br.s.，2H)；8.18(ddd，1H)；8.33(dd，1H)；8.43(s，1H)；8.96(d，1H)；10.51(s，1H)。
(3-甲氧基丙基){3-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯 基]丙基}氨基甲酸叔丁基酯的合成
阶段1：3-(4-溴苯基)丙-1-醇
Figure BDA00002154850800701
将硼氢化钠(119.12g)和THF(5L)加入反应器1中并将温度调节至-20℃。将3-(溴苯基)丙酸(1kg)与THF(3L)加入反应器2中并在25℃下搅拌直至所有固体溶解。将反应器2中的此溶液转移至反应器1中，使反应器1容纳物维持在＜0℃。将BF3·Et2O(991.4g)缓慢添加至反应器1中，使反应器1容纳物维持在-20至-10℃。添加后，在-20至-10℃下将混合物搅拌1h。分析反应是否完成(3-(溴苯基)丙酸＜2.5％)。将水(2L)缓慢添加至反应器1中以淬灭反应。(气体逸出)。将MTBE(5L)加入反应器1中并进行相分离。收集上层并用MTBE(5L)洗涤下层。收集上层并将其与前一步骤的层合并。通过添加1N NaOH溶液将有机层的pH值调节为8至9。用饱和NaCl溶液(2L)洗涤有机层并收集上层。将有机层蒸发至无色油状物。
阶段2：甲磺酸3-(4-溴苯基)丙酯
Figure BDA00002154850800702
将3-(4-溴苯基)丙-1-醇(335g)和二氯甲烷(2.5L)加入反应器1中。将反应器1调节至-10至0℃。将三乙胺(205g)加入反应器1中。将甲磺酰氯(272.7g)逐滴添加至反应器1中，使容钠物维持在＜0℃。在-5至5℃下将反应器1搅拌1h，随后分析反应是否完成。用水(1L)和饱和NaCl溶液(1L)洗涤有机层。将有机层蒸发至干，获得甲磺酸3-(4-溴苯基)丙酯(418g)。
阶段3：3-(4-溴苯基)-N-(3-甲氧基丙基)丙-1-胺
Figure BDA00002154850800711
将甲磺酸3-(4-溴苯基)丙酯(418g)和乙腈(2L)加入反应器1中。将3-甲氧基丙胺(305g)和碳酸钾(394g)添加至反应器1中并将混合物升温至80-90℃并且保持4-16h。分析混合物是否完成(甲磺酸3-(4-溴苯基)丙酯＜0.5％)。将反应物冷却至25℃并将悬浮液过滤以去除白色固体。在旋转蒸发仪上将滤液浓缩至干。将来自旋转蒸发仪的粗制产物、MTBE(2L)和水(1.5L)加入反应器2中。在相分离后，收集有机层并用1N HCl(2L)洗涤直至pH＝4-5。在相分离后，通过2.5N NaOH溶液将水相碱化至pH＝9-10且将所得水溶液不进一步处理即用于下一步骤。
阶段4：[3-(4-溴苯基)丙基](3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯
Figure BDA00002154850800712
将在水(1.5L)和THF(500mL)中的3-(4-溴苯基)-N-(3-甲氧基丙基)丙-1-胺(500g)加入反应器中。在10℃下将三乙胺(176.8g)加入反应器中。在10℃下将Boc2O(475.5g)逐滴添加至反应器1中的混合物中并在10℃下将混合物搅拌1h。分析混合物是否完成反应。用MTBE(3×1L)萃取混合物。将合并的有机层蒸发至获得呈油状物的粗制产物。通过硅胶柱色谱法进一步纯化粗制产物。(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0-20∶1-10∶1)。获得呈微黄色油状物的[3-(4-溴苯基)丙基](3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯(327.0g)。
阶段5：(3-甲氧基丙基){3-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基]丙基}氨基甲酸叔丁基酯
Figure BDA00002154850800721
将[3-(4-溴苯基)丙基](3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯(500g)和乙腈(4.3L)连同双联频哪醇硼酸酯(394.4g)、乙酸钾(190.5g)、PCy3(23.2g)和Pd(OAc)2(8.7g)一起加入反应器1中。用氮气将容器变压吹扫3次。将混合物升温至85-90℃并保持16h，随后分析反应是否完成([3-(4-溴苯基)丙基](3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯＜0.5％)。将混合物冷却至25℃，过滤并将滤液浓缩以去除MeCN。加入MTBE(3L)并用水(3×1.5L)洗涤MTBE层。浓缩MTBE层，获得粗制产物。通过硅胶柱色谱法进一步纯化粗制产物。(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0-40∶1-10∶1)。获得呈微黄色油状物的(3-甲氧基丙基){3-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基]丙基}氨基甲酸叔丁基酯(490.0g)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.27(s，12H)；1.35(m，9H)；1.65(m，2H)；1.74(m，2H)；2.54(t，2H)；3.10(m，1H)；3.15(m，1H)；3.18(s，3H)；3.26(t，2H)；7.19(d，2H)；7.58(d，2H)。
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2- 甲酰胺单苯磺酸盐的合成
阶段1：((3-{4-[5-氨基-6-(吡啶-3-基氨基甲酰基)吡嗪-2-基]苯基}丙基)(3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯
Figure BDA00002154850800731
向反应器中加入3-氨基-6-溴-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺(1580g)、(3-甲氧基丙基){3-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基]丙基}氨基甲酸叔丁基酯(2778g)、1-丁醇(23.7L)、磷酸三钾N-水合物(2740g)和水(1.58L)。在氮气下在环境温度(21℃)下搅拌容纳物。向第二反应器中补充3-(二叔丁基磷鎓)丙烷磺酸盐(DTBPPS)(83.04g)、四氯钯酸钠(45.52g)和水(1.58L)的溶液。将催化剂/配体溶液倾倒至反应物中；将反应物钝化并加热至80℃。在80℃下将反应物搅拌2小时。将该批料冷却至60℃并添加水(22.1L)。在60℃下用水洗涤容纳物。通过补充有1-丁醇(3.95L)的珍珠岩(500g)过滤有机层和界面。将有机液体再加入容器中并在60℃下用水(11.1L)洗涤。在60℃下用10％w/v氯化钠水溶液(11.2L)洗涤有机液体。将有机液体加热至60℃并在真空下蒸馏至约10相对体积。将批料冷却至20℃并在氮气下搅拌16小时。将容纳物过滤并用1-丁醇(4L×2)洗涤。排出黄色自由流动固体并在40℃下在真空烘箱中干燥过夜((3-{4-[5-氨基-6-(吡啶-3-基氨基甲酰基)吡嗪-2-基]苯基}丙基)(3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯(2428g))。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.37(s，9H)1.62-1.72(m，2H)1.73-1.87(m，2H)2.59(t，J＝7.65Hz，2H)3.12-3.21(m，4H)3.19(s，3H)3.28(t，J＝6.25Hz，2H)7.31(d，J＝8.10Hz，2H)7.42(dd，J＝8.41，4.74Hz，1H)7.62(br.s.，2H)8.13(d，J＝8.10Hz，2H)8.21(ddd，J＝8.40，2.60，1.40Hz，1H)8.35(dd，J＝4.70，1.40Hz，1H)8.90(s，1H)8.98(d，J＝2.59Hz，1H)10.54(s，1H)
阶段2：3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺
Figure BDA00002154850800741
将(3-{4-[5-氨基-6-(吡啶-3-基氨基甲酰基)吡嗪-2-基]苯基}丙基)(3-甲氧基丙基)氨基甲酸叔丁基酯(1kg)和水(8L)添加至反应器中，搅拌并加热至70℃。缓慢添加36％盐酸(606mL)以控制气体逸出速率。在70℃下将容纳物搅拌45分钟。通过添加氢氧化钠(325mL)将pH调节至3-4。将容纳物冷却至50℃并添加2-甲基四氢呋喃(5L)。随后通过添加48％氢氧化钠液体(170mL)将pH调节至pH 11-12。然后将容纳物冷却至40℃。使批料沉淀并使两个层分离。用2-甲基四氢呋喃(2.5L)洗涤水层。用10％w/v氯化钠水溶液洗涤合并的有机层。蒸馏有机层以去除3.75L馏出物。将剩余液体加热至50℃并添加甲基叔丁基醚(4L)。经4小时将液体冷却至10℃，随后通过过滤分离。用甲基叔丁基醚(2L×2)洗涤固体并在真空烘箱中在50℃下干燥。3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺(721g)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.77-1.87(m，2H)1.88-2.01(m，2H)2.72(t，J＝7.65Hz，2H)2.89-3.03(m，4H)3.23(s，3H)3.39(t，J＝5.98Hz，2H)7.35(d，J＝8.30Hz，2H)7.68(br.s.，2H)7.68(dd，J＝8.62，5.17Hz，1H)8.18(d，J＝8.30Hz，2H)8.41-8.52(m，2H)8.57(br.s.，2H)8.94(s，1H)9.16(d，J＝2.15Hz，1H)10.77(s，1H)
阶段3：3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐
Figure BDA00002154850800742
向反应器中加入3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺(700g)和乙醇(4.9L)。将容纳物加热至60℃以获得溶液。将苯磺酸(258g)加入反应器中，随后加入乙醇(2.1L)和水(70mL)。将容纳物加热至60℃。随后将完成溶液冷却至51℃并接种3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的形式A(0.35g，如根据实施例3a制备)。一旦形成结晶，就使容纳物在51℃下保持2小时，然后经4小时斜坡(ramp)冷却至40℃，在40℃下保持4小时，随后经4小时进一步冷却至10℃。使容纳物在10℃下保持12小时，然后过滤并用乙醇(700mL×2)洗涤。在真空烘箱中将固体3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐形式C在40℃下干燥(810g)。
1H-NMR(700MHz，DMSO-d6)δppm 1.78-1.86(m，2H)1.92(五重峰，J＝7.70Hz，2H)2.70(t，J＝7.70Hz，2H)2.89-2.99(m，4H)3.22(s，3H)3.37(t，J＝6.05Hz，2H)7.28-7.35(m，5H)7.47(dd，J＝8.25，4.73Hz，1H)7.62(br.s.，2H)7.62(dd，J＝7.92，1.54Hz，2H)8.16(d，J＝8.36Hz，2H)8.27(ddd，J＝8.30，2.40，1.30Hz，1H)8.34(br.s.，2H)8.38(dd，J＝4.70，1.32Hz，1H)8.91(s，1H)9.01(d，J＝2.42Hz，1H)10.57(s，1H)
通过XRPD(参见图6b)确定如就在上文所述所制备的3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐的形式C为晶体且其具有以下X射线粉末衍射峰：
角度2θ(2θ)   强度％
11.2   0.9
12.6   0.3
14.7   0.6
15.5   0.7
15.8   0.7
16.8   0.8
20.4   0.7
21.1   4.3
22.5   1.8
26.5   0.3
还用10℃/min的加热速率进行3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐形式C的DSC分析，且分析显示起始点为98℃且峰值为99℃的固-固转变，随后为起始点为165℃且峰值为170℃的后续相变(图7b)。因此，DSC分析显示，3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐形式C为熔融起始点为约165℃且峰值为约170℃的高熔融固体。
实施例4.1-4.4
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺的特定盐
实施例4.1
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐
实施例4.2
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺二乙磺酸盐
实施例4.3
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单DL-扁桃酸盐
实施例4.4
3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯甲酸盐
单苯甲酸盐形式A、单DL-扁桃酸盐形式A及单甲苯磺酸盐形式A盐通过使大约500mg 3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺形式B与在10mL IPA中的1摩尔当量适当抗衡离子反应来制备。在室温下进行所述反应并将混合物搅拌5天，随后通过过滤分离。
二乙磺酸盐形式A通过使大约500mg 3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺形式B与在10mL IPA中的2摩尔当量抗衡离子反应来制备。在室温下进行所述反应并将混合物搅拌5天，随后通过过滤分离。
通过XRPD(参见图8)确定3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐形式A为晶体且具有以下X射线粉末衍射峰：
角度2θ(2θ)   强度％
8.0   100
11.7   19
14.8   24
20.0   10
20.9   10
21.5   12
22.2   27
23.0   53
27.5   13
28.0   11
还用10℃/min的加热速率进行3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐形式A的DSC分析(图9)，且分析显示起始点为168℃且峰值为171℃的熔体。因此，DSC分析显示3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐形式A为熔融起始点为约168℃且峰值为约171℃的高熔融固体。
通过XRPD(参见图10)确定3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺二乙磺酸盐形式A为晶体且具有以下X射线粉末衍射峰：
角度2θ(2θ)   强度％
5.2   100
10.4   9
127   32
15.0   7
16.9   15
17.3   13
19.1   21
19.6   11
200   5
23.5   15
还用10℃/min的加热速率进行3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺二乙磺酸盐形式A的DSC分析(图11)，且分析显示起始点为179℃且峰值为181℃的熔体。因此，DSC分析显示3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺二乙磺酸盐形式A为熔融起始点为约179℃且峰值为约181℃的高熔融固体。
通过XRPD(参见图12)确定3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单DL-扁桃酸盐形式A为晶体且具有以下X射线粉末衍射峰：
角度2θ(2θ)   强度％
2.7   84
5.2   39
7.8   74
9.6   50
10.5   100
12.3   13
13.1   41
15.7   20
18.4   51
2.7   84
还用10℃/min的加热速率进行3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单DL-扁桃酸盐形式A的DSC分析(图13)，且分析显示认为与起始点为约140℃且峰值为约144℃的熔体对应的初始吸热事件。此后为起始点为约146℃且峰值为约149℃的放热(重结晶)事件，随后为起始点为约153℃且峰值约156℃的最终熔融事件。因此，DSC分析显示，3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单DL-扁桃酸盐形式A经历熔融-重结晶-熔融转变顺序，其中初始熔融起始点为约140℃且峰值为约144℃。
通过XRPD(参见图14)确定3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯甲酸盐形式A为晶体且具有以下X射线粉末衍射峰：
角度2θ(2θ)   强度％
5.3   100
6.2   18
9.2   57
9.8   19
11.9   14
16.6   25
17.8   38
18.1   56
19.5   20
24.6   39
还用10℃/min的加热速率进行3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯甲酸盐形式A的DSC分析(图15)，且分析显示起始点为141℃且峰值为143℃的熔体。因此，DSC分析显示3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯甲酸盐形式A为熔融起始点为约141℃且峰值为约143℃的高熔融固体。
实施例5
3-氨基-6-(4-{3-[(2-甲氧基乙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2- 甲酰胺三盐酸盐
Figure BDA00002154850800791
使用与那些在实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，不同的是使用2-甲氧基乙胺替代步骤(ix)中的3-甲氧基丙胺。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ9.65(s，1H)，8.96(d，J＝8.0Hz，1H)，8.83(s，1H)，8.64(d，J＝5.6Hz，1H)，8.12(m，3H)，7.42(d，J＝7.6Hz，2H)，3.66(m，2H)，3.48(s，3H)，3.23(m，2H)，3.10(m，2H)，2.82(m，2H)，2.11(m，2H)。
LCMS：保留时间＝0.761min。
实施例6
3-氨基-6-(4-{2-[(3-甲氧基丙基)氨基]乙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2- 甲酰胺
Figure BDA00002154850800801
根据以下工序制备标题化合物：
(i)(4-溴苯基乙氧基)(叔丁基)二甲基硅烷
向2-(4-溴苯基)乙醇(5g，25mmol)在无水二氯甲烷(150mL)中的溶液中依序添加三乙胺(7.5g，75mmol)、DMAP(300mg，2.5mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(7.5g，50mmol)。将所得浅褐色溶液在室温下搅拌过夜。用二氯甲烷和水将反应混合物萃取3次。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。利用PE作为洗脱液对粗制产物进行柱色谱法，获得呈褐色油状物的副标题化合物(7.1g)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.41(dd，J＝6.4，2.0Hz，2H)，7.10(dd，J＝6.4，2.0Hz，2H)，3.80(t，J＝6.8Hz，2H)，2.79(t，J＝6.8Hz，2H)，0.88(s，9H)，0.00(s，6H)。
(ii)3-氨基-6-(4-(2-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)乙基)苯基)-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺
将步骤(i)的产物(6.9g，27.1mmol)、KOAc(6.6g，67.8mmol)、Pd(dppf)Cl2(0.82g，1.13mmol)在二噁烷(150mL)中的混合物用N2脱气并再充气3次。在90℃下将混合物在N2下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温并将实施例1中步骤(v)的产物(6.6g，22.6mmol)、Pd(dppf)Cl2(0.5g，0.7mmol)、水(50mL)和Na2CO3(7.2g，67.8mmol)添加至该混合物中。将所得溶液用N2脱气3次且在90℃下在N2下搅拌另外7小时。用二氯甲烷将反应混合物萃取3次且将合并的有机层经无硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过柱利用PE∶EtOAc＝5∶1→3∶1作为洗脱液纯化残余物，获得呈黄色固体的副标题化合物(4.1g)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.95(s，1H)，8.79(d，J＝2.4Hz，1H)，8.68(s，1H)，8.41(d，J＝2.4Hz，1H)，8.25(d，J＝8.2Hz，1H)，7.80(d，J＝8.0Hz，2H)，7.39-7.30(m，3H)，3.84(t，J＝6.8Hz，2H)，2.88(t，J＝6.8Hz，2H)，0.87(s，9H)，0.00(s，6H)。
(iii)3-氨基-6-(4-(2-羟乙基)苯基)-N-(吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺
在室温下将步骤(ii)的产物(4.1g，9.13mmol)和四丁基氟化铵(4.8g，18.3mmol)在THF(150mL)中的溶液搅拌过夜。真空浓缩混合物且用二氯甲烷萃取残余物并用水洗涤。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，获得副标题化合物(2.5g)。
LCMS保留时间＝0.801min
(iv)甲磺酸4-(5-氨基-6-(吡啶-3-基氨基甲酰基)吡嗪-2-基)苯乙基酯
向步骤(iii)的产物(2.5g，7.5mmol，1.0当量)和TEA(2.3g，22.5mmol)在无水二氯甲烷中的溶液中添加MsCl(1.7g，15mmol)。在室温下将反应混合物搅拌4小时。在减压下去除溶剂并通过柱纯化残余物，获得副标题化合物(1.9g)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.87(s，1H)，8.76(s，1H)，8.64(s，1H)，8.36(d，J＝4.0Hz，1H)，8.24(d，J＝8.4Hz，1H)，7.80(d，J＝8.0Hz，2H)，7.38-7.24(m，3H)，4.42(t，J＝6.8Hz，2H)，3.08(t，J＝6.8Hz，2H)，2.87(s，3H)。
(v)3-氨基-6-(4-{2-[(3-甲氧基丙基)氨基]乙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺
在90℃下将步骤(iv)的产物(250mg，0.61mmol)、K2CO3(250mg，1.8mmol)、3-甲氧基丙胺(82mg，0.92mmol)在MeCN(20mL，Aldrich，HPLC级)中的混合物在N2气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温并过滤。真空浓缩滤液并对残余物进行制备型HPLC以进行纯化，浓缩洗脱液并将1N NaOH溶液添加至残余物中以控制pH＝8-9。用DCM将混合物萃取3次。将合并的萃取物经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，获得标题化合物(黄色固体，158mg)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.89(s，1H)，8.74(d，J＝2.4Hz，1H)，8.63(s，1H)，8.35(d，J＝4.4Hz，1H)，8.23(d，J＝8.4Hz，1H)，7.76(d，J＝8.4Hz，2H)，7.40-7.27(m，3H)，3.37(t，J＝6.2Hz，2H)，3.23(s，3H)，2.90-2.77(m，4H)，2.69(t，J＝7.0Hz，2H)，1.76-1.62(m，2H)。
LCMS：保留时间＝0.741min。
实施例7
3-氨基-6-(4-{2-[(2-甲氧基乙基)氨基]乙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐
Figure BDA00002154850800821
3-氨基-6-(4-{2-[(2-甲氧基乙基)氨基]乙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺使用与在实施例6所述的那些类似的工序来制备，不同的是在步骤(v)中使用2-甲氧基乙胺替代3-甲氧基丙胺。将MeCN添加至3-氨基-6-(4-{2-[(2-甲氧基乙基)氨基]乙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺中并且还添加0.5M HCl水溶液(20mL)。随后将所得黄色溶液冻干，获得为三盐酸盐的标题化合物。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ9.66(s，1H)，8.98(d，J＝8.8Hz，1H)，8.85(s，1H)，8.65(d，J＝5.6Hz，1H)，8.17-8.12(m，3H)，7.48(d，J＝8.4Hz，2H)，3.70(t，J＝4.8Hz，2H)，3.44(s，3H)，3.35-3.28(m，4H)，3.13-3.08(m，2H)。
LCMS：保留时间＝0.720min。

Claims (18)

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐：
Figure 2011800145753100001DEST_PATH_IMAGE002
；
其中：
n为2或3；
m为2或3；
R为甲基或乙基。
2. 根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺。
3. 根据权利要求1所述的式I化合物，其为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺三盐酸盐。
4. 据权利要求1所述的式I化合物，其为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单苯磺酸盐。
5. 根据权利要求1所述的式I化合物，其为3-氨基-6-(4-{3-[(3-甲氧基丙基)氨基]丙基}苯基)-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺单甲苯磺酸盐。
6. 一种药物组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。
7. 根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗。
8. 根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防诸如人的温血动物中的对GSK-3酶的抑制敏感的骨相关性疾病或病症的药物中的用途。
9. 根据权利要求1至5中任一项所述的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗诸如人的温血动物中的对GSK-3酶的抑制敏感的骨相关性疾病或病症。
10. 一种用于治疗或预防患有对GSK-3酶的抑制敏感的骨相关性疾病或病症的诸如人的温血动物的方法，所述方法包括给予所述动物有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐。
11. 根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于促进诸如人的温血动物中的骨形成的药物中的用途。
12. 根据权利要求1至5中任一项所述的式I的吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，其用于促进诸如人的温血动物中的骨形成。
13. 一种用于促进诸如人的温血动物中的骨形成的方法，所述方法包括给予所述动物有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐。
14. 根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗诸如人等温血动物中的以下病症的药物中的用途：诸如乳癌、前列腺癌和肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤等癌症中的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
15. 根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗诸如人的温血动物中的以下病症：诸如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤等癌症中的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病。
16. 一种用于治疗诸如人等温血动物中的以下病症的方法：诸如乳癌、前列腺癌及肺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨纤维肉瘤等癌症中的骨病变、癌症诱导的骨疾病、医源性骨疾病、良性骨疾病以及佩吉特氏病，所述方法包括给予所述动物有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐。
17. 根据权利要求14或权利要求15所述的用途，其中所述癌症为多发性骨髓瘤。
18. 根据权利要求16的所述方法，其中所述癌症为多发性骨髓瘤。
CN2011800145753A 2010-01-19 2011-01-18 吡嗪衍生物 Pending CN102812017A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29619610P 2010-01-19 2010-01-19
US61/296196 2010-01-19
PCT/GB2011/050065 WO2011089416A1 (en) 2010-01-19 2011-01-18 Pyrazine derivatives

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102812017A true CN102812017A (zh) 2012-12-05

Family

ID=43743548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800145753A Pending CN102812017A (zh) 2010-01-19 2011-01-18 吡嗪衍生物

Country Status (14)

Country Link
US (2) US8198285B2 (zh)
EP (1) EP2526097A1 (zh)
JP (1) JP2013517321A (zh)
KR (1) KR20120120307A (zh)
CN (1) CN102812017A (zh)
AR (1) AR079945A1 (zh)
AU (1) AU2011208530A1 (zh)
BR (1) BR112012017884A2 (zh)
CA (1) CA2786520A1 (zh)
MX (1) MX2012008328A (zh)
RU (1) RU2012135093A (zh)
TW (1) TW201130814A (zh)
UY (1) UY33191A (zh)
WO (1) WO2011089416A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103748086A (zh) * 2011-05-23 2014-04-23 默克专利有限公司 吡啶和吡嗪衍生物

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2970890T3 (da) 2013-03-14 2020-05-04 Brigham & Womens Hospital Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til opformering og dyrkning af epitelstamceller
AU2015311816B2 (en) 2014-09-03 2019-04-04 Massachusetts Institute Of Technology Compositions, systems, and methods for generating inner ear hair cells for treatment of hearing loss
AU2017205194A1 (en) 2016-01-08 2018-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Production of differentiated enteroendocrine cells and insulin producing cells
US10213511B2 (en) 2016-03-02 2019-02-26 Frequency Therapeutics, Inc. Thermoreversible compositions for administration of therapeutic agents
US10201540B2 (en) 2016-03-02 2019-02-12 Frequency Therapeutics, Inc. Solubilized compositions for controlled proliferation of stem cells / generating inner ear hair cells using GSK3 inhibitors: I
US11260130B2 (en) 2016-03-02 2022-03-01 Frequency Therapeutics, Inc. Solubilized compositions for controlled proliferation of stem cells / generating inner ear hair cells using a GSK3 inhibitor: IV
MX390321B (es) 2016-12-30 2025-03-20 Frequency Therapeutics Inc Compuestos de 1h-pirrol-2,5-diona y metodos de uso de los mismos para inducir la auto-renovacion de celulas madre/progenitoras de soporte.
CA3109647A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Frequency Therapeutics, Inc. Compositions and methods for generating hair cells by upregulating jag-1
EP3837351A1 (en) 2018-08-17 2021-06-23 Frequency Therapeutics, Inc. Compositions and methods for generating hair cells by downregulating foxo
WO2020163812A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Frequency Therapeutics, Inc. Valproic acid compounds and wnt agonists for treating ear disorders

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003004475A1 (en) * 2001-07-05 2003-01-16 Astrazeneca Ab Heterocyclic amines for the treatment of conditions associated with gsk-3
WO2004055006A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Astrazeneca Ab Novel compounds having selective inhibiting effect at gsk3
WO2004055005A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Astrazeneca Ab Novel compounds having selective inhibiting effect at gsk3
US20070213322A1 (en) * 2006-03-08 2007-09-13 Astrazeneca Ab Use
WO2008106692A1 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Pim kinase inhibitors and methods of their use

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
AU719434B2 (en) 1996-02-13 2000-05-11 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives as VEGF inhibitors
ES2169355T3 (es) 1996-03-05 2002-07-01 Astrazeneca Ab Derivados de 4-anilinoquinazolina.
GB9718972D0 (en) 1996-09-25 1997-11-12 Zeneca Ltd Chemical compounds
GB9714249D0 (en) 1997-07-08 1997-09-10 Angiogene Pharm Ltd Vascular damaging agents
GB9900334D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Angiogene Pharm Ltd Tricylic vascular damaging agents
GB9900752D0 (en) 1999-01-15 1999-03-03 Angiogene Pharm Ltd Benzimidazole vascular damaging agents
MXPA01008182A (es) 1999-02-10 2003-08-20 Astrazeneca Ab Derivados de quinazolina como inhibidores de angiotensina.
HK1046276A1 (zh) 2000-02-05 2003-01-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated 有益的用作erk抑制剂的吡唑组合物
EP1289952A1 (en) 2000-05-31 2003-03-12 AstraZeneca AB Indole derivatives with vascular damaging activity
UA73993C2 (uk) 2000-06-06 2005-10-17 Астразенека Аб Хіназолінові похідні для лікування пухлин та фармацевтична композиція
MXPA02012903A (es) 2000-07-07 2004-07-30 Angiogene Pharm Ltd Derivados de colquinol como inhibidores de angiogenesis.
CA2411160A1 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Angiogene Pharmaceuticals Limited Colchinol derivatives as vascular damaging agents
SE0102439D0 (sv) 2001-07-05 2001-07-05 Astrazeneca Ab New compounds
CN100409840C (zh) 2002-01-10 2008-08-13 霍夫曼-拉罗奇有限公司 GSK-3β抑制剂在制备增加骨生成的药物中的应用
JP4414232B2 (ja) 2002-03-05 2010-02-10 イーライ リリー アンド カンパニー キナーゼ阻害物質
AU2003234464B2 (en) 2002-05-03 2009-06-04 Exelixis, Inc. Protein kinase modulators and methods of use
SE0203753D0 (sv) 2002-12-17 2002-12-17 Astrazeneca Ab New compounds
BRPI0408251A (pt) 2003-03-11 2006-03-01 Pfizer Prod Inc compostos de pirazina como inibidores do fator de crescimento transformante (tgf)
AU2004274861A1 (en) 2003-06-06 2005-03-31 Wyeth Methods and materials for identifying agents which modulate bone remodeling and agents identified thereby
EP1653970A4 (en) 2003-08-13 2008-10-15 Novartis Vaccines & Diagnostic GSK-3 HEMMER AND ITS USES
AU2004268621C1 (en) 2003-08-29 2011-08-18 Exelixis, Inc. c-Kit modulators and methods of use
US20050064044A1 (en) 2003-09-19 2005-03-24 Georges Rawadi GSK-3beta inhibitors in the treatment of bone-related diseases
JP2007524682A (ja) 2004-02-12 2007-08-30 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 代謝調節型グルタミン酸受容体−５の調節物質としてのビピリジルアミド
WO2010054398A1 (en) 2008-11-10 2010-05-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compounds useful as inhibitors of atr kinase

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003004475A1 (en) * 2001-07-05 2003-01-16 Astrazeneca Ab Heterocyclic amines for the treatment of conditions associated with gsk-3
WO2004055006A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Astrazeneca Ab Novel compounds having selective inhibiting effect at gsk3
WO2004055005A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Astrazeneca Ab Novel compounds having selective inhibiting effect at gsk3
US20070213322A1 (en) * 2006-03-08 2007-09-13 Astrazeneca Ab Use
WO2008106692A1 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Pim kinase inhibitors and methods of their use

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103748086A (zh) * 2011-05-23 2014-04-23 默克专利有限公司 吡啶和吡嗪衍生物
CN103748086B (zh) * 2011-05-23 2016-05-25 默克专利有限公司 吡啶和吡嗪衍生物

Also Published As

Publication number Publication date
CA2786520A1 (en) 2011-07-28
UY33191A (es) 2011-08-31
BR112012017884A2 (pt) 2019-09-24
AU2011208530A1 (en) 2012-08-09
WO2011089416A1 (en) 2011-07-28
MX2012008328A (es) 2012-08-08
AR079945A1 (es) 2012-02-29
US8198285B2 (en) 2012-06-12
RU2012135093A (ru) 2014-03-10
US20130123275A1 (en) 2013-05-16
EP2526097A1 (en) 2012-11-28
US20120022082A1 (en) 2012-01-26
TW201130814A (en) 2011-09-16
JP2013517321A (ja) 2013-05-16
KR20120120307A (ko) 2012-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102812017A (zh) 吡嗪衍生物
AU2016323399B2 (en) 8-(6-(3-(amino)propoxy)-3-pyridyl)-1 -isopropyl-imidazo(4,5-c)quinolin-2-one derivatives as selective modulators of ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase for the treatment of cancer
US20200361908A1 (en) Crystals of aniline pyrimidine compound serving as egfr inhibitor
DK3218366T3 (en) AURORA A-KINASE INHIBITORS
CN101921236B (zh) 可用于治疗赘生性疾病、炎性和免疫系统病症的2,4-二(苯氨基)嘧啶
AU2013261267B2 (en) Carboxylic acid compounds
JP5415403B2 (ja) ９−（ピラゾール−３−イル）−９ｈ−プリン−２−アミンおよび３−（ピラゾール−３−イル）−３ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミン誘導体および癌の処置のためのそれらの使用
JP6306035B2 (ja) 医薬組成物のためのスルホキシミン置換キナゾリン
JP2020526543A (ja) ロイシンリッチリピートキナーゼ２の阻害剤
JP6139792B2 (ja) タンキラーゼ阻害剤としてのピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン化合物
WO2008104754A1 (en) Novel pyrimidine derivatives 698
US20180179189A1 (en) Adipate forms and compositions of biaryl inhibitors of bruton's tyrosine kinase
TW201105673A (en) Novel 1,2,3,4-tetrahydropyrimido{1,2-a}pyrimidin-6-one derivatives, preparation thereof and pharmaceutical use thereof
MX2014009944A (es) Inhibidores de pirazolopirimidinilo en enzima activadora de ubiquitina.
RS52252B (sr) Derivati 2-oksoalkil-1-piperazin-2-ona, njihovo dobijanje i terapeutska primena
CN114644654A (zh) 芳基磷氧化衍生物、酸式盐或其晶型及其制备方法和应用
JP6479854B2 (ja) 医薬組成物のためのスルホキシイミン置換キナゾリン
WO2024254534A1 (en) Methods of treating inflammatory diseases
WO2022127807A1 (zh) 一种芳基磷氧化物类衍生物自由碱的晶型及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121205