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CN102170891A - 有效成分包含来自野山参或人参等人参类形成层的植物干细胞株且用于进行获得性免疫缺陷综合症的预防或治疗的组合物 - Google Patents

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CN102170891A CN2009801386891A CN200980138689A CN102170891A CN 102170891 A CN102170891 A CN 102170891A CN 2009801386891 A CN2009801386891 A CN 2009801386891A CN 200980138689 A CN200980138689 A CN 200980138689A CN 102170891 A CN102170891 A CN 102170891A
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李银庆
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Abstract

本发明涉及用于进行获得性免疫缺陷综合症的预防或治疗的组合物，该组合物的有效成分包含来自野山参或人参等人参形成层的植物干细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中任意一种或一种以上。本发明中的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物为来自天然物的组合物，将现有药物治疗剂的副作用降至最低，对人体安全，通过有效增加CD4+T细胞等的T细胞数并减少HIV(human immunodeficiency virus)数，可以防止由于免疫障碍所引起的机率性感染、神经机能障碍、新生物生长甚至面临死亡的危险，从而可以用于获得性免疫缺陷综合症的预防、治疗及症状缓解。

Description

有效成分包含来自野山参或人参等人参类形成层的植物干细胞株且用于进行获得性免疫缺陷综合症的预防或治疗的组合物
技术领域
本发明涉及用于进行获得性免疫缺陷综合症的预防或治疗的组合物，该组合物的有效成分包含来自野山参或人参等人参形成层的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中任意一种或一种以上。
背景技术
自从1982年在美国的洛杉矶第一次发现获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)患者以来，AIDS患者数在全世界范围内增长。在韩国，自从1985年发现的美国人AIDS患者病例以来，患者数持续增加，AIDS治疗剂等研发已刻不容缓。
人类免疫缺陷病毒(以下称为HIV)是一种主要攻击人体淋巴球的病毒，围有包膜(envelope)，具有使遗传物质RNA染色体组(genome)逆转录为DNA后插入到宿主细胞的DNA中的特性，又名逆转录病毒。HIV结构的最内部存在有遗传信息RNA和逆转录酶(reverse transcriptase)，RNA和逆转录酶外层包有包膜蛋白，在其外层形成包含被称为gp120和gp41的糖蛋白脂肪膜保护膜。人们已经知道gp120在病毒识别T-细胞后入侵时起决定性的作用。
由于CD4细胞膜蛋白(CD4)是HIV-1病毒的细胞受体，因此HIV将CD4+T细胞作为目标。病毒细胞入侵取决于与细胞内CD4受体分子结合的gp120，由于HIV感染诱导这类细胞的枯竭，导致免疫功能耗竭、机率性感染、神经功能障碍、新生物生长、甚至死亡。
随着HIV感染者和AIDS患者的增加，美国、法国、加拿大、日本等世界许多国家加紧了治疗剂的开发。目前已知的抗HIV物质有美国FDA批准的2，3-叠氮胸苷(AZT)、双脱氧基苷(ddI)、双脱氧胞苷(ddC)等。但上述药物有严重的副作用并且难以获得有效治疗，基于这样的现实，新药品的开发已成为重要的课题。
还有一种治疗剂是HIV的蛋白酶抑制剂。HIV转变为如融合有外膜蛋白和酶等的gag蛋白和gag-pol蛋白的前体蛋白质后，根据自身的蛋白酶进行分解制造外膜蛋白、蛋白酶、逆转录酶和整合酶(integrase)等，在该过程中如果能抑制蛋白酶，则病毒的复制被中断，蛋白酶抑制剂就是以此原理为基础开发的。已开发的用作AIDS患者治治疗剂的蛋白分解酶抑制剂有沙奎那韦(saquinavir)，利托那韦(ritonavir)，茚地那韦(indinavir)等。但上述药物易引发糖尿病，溶血，出血，高血压，脂肪代谢障碍等副作用，而且由于需要长期服用治疗剂，导致出现灵杆菌，引发严重的问题。
本发明人致力于开发预防、治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的效果优异的来自天然物的组合物，发现野山参或人参等人参形成层的植物干细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物，对预防、治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的效果优异，并完成了本发明。
发明内容
本发明目的在于提供一种来自天然物的组合物，其使现有获得性免疫缺陷综合症(AIDS)治疗剂的副作用降至最低，并具有增强预防、治疗获得性免疫缺陷综合症的功效。
为实现上述目的，本发明提供一种用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的组合物，该组合物从人参类(Panax ginseng)形成层中诱导出来，包含具有如下特征的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中任意一种或一种以上，其中，所述细胞株具体特征如下：
(a)天然未分化状态(innately undifferentiated)；
(b)同质性细胞株(homogeneous cell line)；以及
(c)具有多个液泡(vacuole)的形态学特征。
本发明还提供一种预防或改善获得性免疫缺陷综合症的功能性食品，该功能性食品含有上述细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中任意一种或一种以上。
本发明还提供一种增加T细胞的免疫促进剂，其包含上述细胞株、其裂解液、其提取物、及其培养物中任意一种或一种以上。
本发明还提供一种预防或治疗获得性免疫缺陷综合症的组合物的用途，该组合物包含上述细胞株、其裂解液、其提取物与其培养物中的任意一种或一种以上。
本发明还提供一种预防或治疗获得性免疫缺陷综合症的方法，上述方法包括适用于包含上述细胞株、其裂解液、其提取物与其培养物中任意一种或一种以上的步骤。
本发明的其他特征和实施方式通过以下的详细说明和权利要求书进一步清楚。
附图说明
图1是表示本发明中的细胞株诱导过程(a)、来自野山参形成层的细胞株(b)A)和来自人参子叶的愈伤组织细胞株(生物资源中心，KCTC PC10224)的照片。
图2是表示本发明中的对来自野生人参形成层的细胞株进行给药之前的第77天开始到给药后第9天为止的CD4+T细胞数以及CD4+T细胞数/CD8+T细胞数的比例曲线图。
图3是在临床例中对14位患者进行HIV-1 RNA检测结果的示意图。
具体实施方式
在没有作其他形式的定义时，本说明书中所使用的所有技术与科技用语与本领域技术人员通常理解的含义相同。一般来讲，本说明书中所使用的命名方法是本领域所熟知的通用方法。
在本发明的实施例中主要使用的用语定义参考如下。
本申请中的“形成层(cambium)”是指：使植物的茎及根变粗，能够材积生长的组织。由于形成层是细胞分裂最活跃的分裂组织，当被用作植物组织培养的分离块时，能够高速并大量产生细胞(大韩民国授权专利第0533120号)。
本申请中的“裂解液”是指：利用清洁剂等化学方法或物理方法等将细胞裂解后获得的细胞溶解物；细胞株“提取物”可以通过对细胞溶解于溶剂中后分离出的物质利用蒸馏或蒸发的方法进行浓缩后获得。另外，本申请中的“培养物”概念包括培养的细胞株和培养液。此时培养的细胞株包括根据培养条件被分化的，或者有用物质的生产能力和/或分解能力得到提高的所有细胞株。
本申请中的“天然未分化状态(innately undifferentiated)”是指从最初开始维持分化之前的状态，而不是经过脱分化过程后具有的未分化的状态。
本申请中的“T细胞是指来自胸腺的、发挥主要免疫作用的淋巴球，在细胞表面表现CD4抗原的CD4+T细胞被称作辅助T细胞(helper T cell)，细胞表面发现有CD8抗原的CD8+T细胞被称为细胞毒性T细胞(cytotoxic Tcell)。其中，辅助T细胞用于辅助B细胞抗体的生产或细胞毒性T细胞的活性。
本发明的一个观点是：本发明涉及一种用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症的组合物，其有效成分为来自人参类(Panax ginseng)形成层的同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中的一种或一种以上。在本发明中，人参类(Panax ginseng)包括野山参或人参(Lian M.L.et al.，J.Plant Biology，45：201，2002；Han J.Y.et al.，J.Plant Biology，49：26，2006；Teng W.L.et al.，Tissue and Organ Culture，68：233，2002)。此时，本发明中的上述野山参或人参包括露天人参或组织培养的人参类(不定根和来自不定根的细胞株)。
本发明中的来自人参类形成层的细胞株具有如下特征：(a)天然未分化状态(innately undifferentiated)；(b)同质细胞株(homogeneous cell line)；以及(c)具有多个液泡(vacuole)的形态学特征。另外，还具有如下特征：(a)在进行悬浮培养时，以单细胞水平存在；(b)与来自人参类形成层以外的组织细胞株相比，在生物反应器中的剪应力(shear stress)敏灵敏度低；(c)与来自人参类形成层之外的组织细胞株相比，生长速度快，能够稳定培养。
在本发明中，上述同质细胞株的特征在于：根据包括如下步骤的分离方法获得：
步骤(a)，获得含有人参类形成层的组织；
步骤(b)，在包括3-吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)或3-吲丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)的培养基中培养上述获得的含有形成层的组织，诱导来自形成层的细胞株；
此时，具有如下特征：在上述培养过程中或培养前期步骤或后期步骤中，向上述含有形成层的组织进行渗透胁迫；和
步骤(c)，回收上述被诱导的来自形成层的细胞株。
此时，在上述步骤(b)中，上述渗透胁迫工序是为了根据形成层的特异性诱导细胞株而进行的，优选在包括上述IAA或IBA的培养基中进行培养之前进行，这样，在形成层之外的一般组织，即，一般组织在皮层(cortex)、韧皮部(phloem)、木质部(xylem)、髓心(pith)处丧失分裂能力之后，与IAA或IBA相同，实施形成层分裂特异激素处理后进行培养时会坏死。此时将渗透剂的含量处理为0.5～2M，优选为在冷藏或常温条件下施加16至24小时的渗透胁迫处理后撤销渗透胁迫。渗透剂的浓度、处理时间和温度按照不同植物、不同组织的状态而不同，对此没有特别限制。还有，在上述阶段(b)中，优选为所包含的上述IAA或IBA的含量为0.1～52mg/L。
另外，在上述步骤(c)中，其特征在于：优选为将被诱导的来自形成层的细胞株在包含2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid)、毒莠定(picloram)和IBA中一种或一种以上的培养基内进行增殖，然后回收来自形成层细胞株。此时，上述2，4-D、毒莠定或IBA中任一种含量优选为1～5mg/L，更优选地为2mg/L。
本发明中所使用的培养基为通常进行植物组织培养时使用的培养基，可例举N6培养基、SH培养基、MS培养基、AA培养基、LS培养基、B5培养基、WPM培养基、LP培养基、White培养基，GD培养基、DKW培养基、DCR培养基，但不限于此。
在本发明中，上述提取物，其特征在于：其是利用蒸馏水、低级醇、丙酮、二甲亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)以及他们的混合溶剂所形成的组中选出的溶剂进行提取的。此时，低级醇是指甲醇、乙醇等碳原子数为1-5的醇。
另外，CD4+T细胞在其体内与并存的抗原进行反应，并进行特异识别，然后增殖，同时释放人类已经知道的控制其他免疫体系细胞的淋巴因子(lymphokine)蛋白。并且，B淋巴球细胞根据CD4+T细胞产生的信号(signaling)，识别抗原，分泌特定抗体，其用于中和或去除伴随细胞间的体液运动的抗原性细菌和病毒。与此相似，CD8+T细胞(cytotoxicT cell)被由CD4+T细胞发出的信号激活，杀死被细胞内病原体感染的细胞。此外，CD4+T细胞还对感染和初期恶性肿瘤反应时伴随产生的自然杀伤细胞(natural killer cell)和巨噬细胞等已知免疫体系细胞的活性进行调节。
AIDS免疫缺陷综合症清楚地说明了这类CD4+T细胞的重要性。正是由于这些细胞的缺损，AIDS患者残留的CD4+T细胞的抗原反应减少或消失，必须的免疫-调节因子异常生成。CD4+T细胞由于数量及功能容量的减少，在B细胞和细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)的成熟方面无法充分发挥应有的作用。因此，为了监控感染HIV(human immunodeficiency virus)的患者，需要测定CD4+T细胞数或百分含量(Giorgi J.V.et al.，Clin.Immunol.Newslett.，10：55，1990)。
有鉴于此，在本发明实施例中，将来自野山参的形成层的同质细胞株向被诊断为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的患者给药后的结果，确认辅助T细胞CD4+T细胞的数量增加。因此，本发明中的来自人参类形成层的同质细胞株能够增强因HIV病毒减少的免疫性能，具有预防和治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的效果。
此外，在本发明的另一实施例中，将来自野山参形成层的同质细胞株向被诊断为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的患者给药后，测量了患者血浆中HIV的RNA数值。从测量结果可确认，通过本发明中的同质细胞株的给药，HIV的RNA数值发生有意义的减少，另外，通过给药，还可以确认未被检测出HIV病毒的患者。像这样的HIV减少或未检出，不仅意味着本发明中的同质细胞株具有抑制或消灭HIV增殖的作用，而且还可以作为治疗AIDS的证据。尤其是，给AIDS患者使用本发明中的同质细胞株后没有检出HIV，这样的结果表明，作为AIDS治疗剂它引人注目，而且提示有可能治愈AIDS。
综上所述，在本发明中虽然没有具体的实施例来揭示含有上述同质细胞株裂解液和提取物的组合物能够发挥预防与治疗获得性免疫缺陷综合症的功能，但具有通常知识的本领域技术人员应该能够知道，同上所述，由于确认上述细胞株具有预防与治疗获得性免疫缺陷综合症的活性，本发明中的含有同质细胞株裂解液或提取物的组合物也能够具有预防与治疗获得性免疫缺陷综合症的效果。
在本发明中，含有同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中一种或一种以上的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症的组合物，增加CD4+T细胞的免疫促进剂不仅可以单独包括上述同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中的任一种或一种以上，还可以为包括一种或一种以上的允许药用的载体、赋形剂或稀释剂的医药组合物。医药组合物中的上述同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物的有效药理含量可以根据疾病及其病重程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、给药途径和治疗期限等适当确定。
上述“允许药用”是指，从生理学角度允许给人类使用时，通常不会引起胃肠障碍、眩晕等类似过敏反应或与之相似反应的组合物。上述载体、赋形剂与稀释剂可例举：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及其矿物类等。
上述医药组合物还可以包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂和防腐剂等。另外，可利用本领域的公知方法将本发明中的组合物制成制剂，从而对哺乳动物给药后活性成分能够迅速、持续或延缓释放。剂型可为粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软质或硬质明胶胶囊、灭菌注射液、灭菌粉末等。
从另一角度，本发明涉及预防或改善获得性免疫缺陷综合症的功能性食品，其包括来自上述人参类形成层的同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中一种或一种以上。
本发明中的“功能性食品”意味着通过向普通食品添加本发明中的同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物，来提供食品功能。
实施例
以下，通过实施例对本发明进一步详细说明。具有通常知识的本领域技术人员应当知道，这些实施方式仅用于对本发明进行举例说明，并不限制本发明的保护范围。
尤其是在下述的实施方式中，具有通常知识的本领域技术人员应当知道，虽然来自野山参形成层的同质细胞株对获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的预防与抑制效果已经得到确认，使用含有其裂解液或其提取物及其细胞株的培养物也能够获得相同结果。
实施例1.制备来自人参类形成层的同质细胞株
1-1：准备植物材料
(1)图1(a)中的A体现了本发明中所使用的野山参的典型外观。准备好野山参后，为了使用野山参的主根部分，用流水去除附在外表面的土或其他污染物，再用液体洗剂洗涤主根表面，之后放到流水中。将清洗干净的组织放入到净化工作台内的已经灭菌的烧瓶中，用70％的乙醇灭菌30秒至1分钟的程度。之后用灭菌水漂洗，用1％至1.5％次氯酸钠(sodium hypochlorite，Junsei，Japan)进行5分钟至15分钟程度的消毒处理。此时，为了使消毒液能够有效地渗透到组织内，滴入几滴TWEEN 20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，Junsei，Japan)。该处理过程结束后，使用灭菌水漂洗3至5回的程度。然后，为了防止经杀菌处理后的组织纤维化，将杀菌后的主根放入包含抗氧化剂的BIM(browning inhibition medium)中进行30分钟至1小时程度的震荡培养，然后放到灭菌滤纸上去除水分。
使用的BIM的组成与使用浓度参见表1。
表1.BIM的组成与使用浓度
Figure BPA00001337687100091
此处盐浓度定容为整体的1/4。
然后，为了防止纤维化将上述材料放到盛有包含抗氧化剂的CS solution(cutting sloution，表2)灭菌容器中。薄薄地剥掉外表皮分成两半，再将各部分以横×竖×高＝0.5～0.7cm×0.5～0.7cm×0.2～0.5mm的大小切块，并使切块包含分裂能力旺盛的形成层部分。图1(a)中的B表示在野山参的主根部分，按照上述大小切断后制造的包含形成层的分离块的形状。
表2.CS(切削液)
  组成成分   使用浓度
  PVP(聚乙烯吡咯酮)   0.5％(w/v)
  抗坏血酸   100mg/L
  柠檬酸   150mg/L
(2)准备好在生物反应器(bioreactor)中维持着的100年的野山参不定根，仍然放入表2中的盛有CS solution的灭菌容器中，并且仍然采用与上述相同的方法获得包含形成层的分离块。
1-2：对包含野山参主根部分形成层的分离块进行渗透剂处理
为了使实施例1-1制得的分离块中被分化的组织即韧皮部、木质部、髓心等坏死，而仅使作为分裂组织的形成层能够生存，进行渗透胁迫处理。将包含上述形成层的分离块压印(blotting)到铺有滤纸的全治疗培养基(培养基1，表3)上，然后放置到装有1M蔗糖(Duchefa，Netherland)溶液的烧瓶内，在冷藏状态进行16-24小时的渗透胁迫后，依次在0.05M蔗糖溶液(sucrose solution)和0.1M蔗糖溶液中进行5分钟处理，根据高浓度蔗糖来消除胁迫。之后，将消除上述渗透胁迫的包含形成层的分离块放到铺有滤纸的全治疗培养基(培养基1)内，去除水分。
表3.全治疗培养基(培养基1)
Figure BPA00001337687100101
Figure BPA00001337687100111
1-3：从包含野山参形成层的分离块中诱导源自形成层的同质细胞株
为了诱导源自形成层并具有分裂能力的同质细胞株，将在上述实施例1-2中经渗透胁迫处理的分离块放到细胞株诱导培养基(培养基2，表4)中进行了治疗。用药治疗的培养基与下述<表4>中的记载相同。经治疗的分离块在22±1℃的黑暗条件下进行培养。
表4用于诱导源自形成层的细胞株的培养基组成
  组成与条件   使用浓度与条件
  盐   正常浓度WPM
  蔗糖   3％(w/v)
  IAA(3-吲哚乙酸)   2mg/L
  pH   5.8
  水晶洋菜   0.3％(w/v)
  抗坏血酸   100mg/L
  柠檬酸   150mg/L
此时，如<表5>中的记录，没有进行渗透处理直接在同质细胞株诱导培养基中进行治疗的分离块，虽然在治疗早期(2～3天内)，形成层中心很快能看到变黄的反应，但随着时间的流逝分离块整体变黄。将能看到形成层中心变黄反应的分离块，放入到最适合源自形成层并具有分裂能力的同质细胞株分离与增殖的培养基(培养基3)中，进行继代培养，试图继续诱导并增殖同质细胞株。但是纤维化现象严重，经过一段时间后仍然是除了纤维化反应之外看不到其他反应。
另外，如<表5>所示，针对进行渗透处理并撤销后在同质细胞株诱导培养基中进行了治疗的分离块，可观察到在其他组织中无法诱导细胞，只能在形成层中进行特异同质细胞的诱导。即，进行渗透处理然后撤销得到治疗的分离块，在培养的3-7天内，分离块形成层部分开始变得淡黄。之后大约7-14天，在变得淡黄的部分可以观察到诱导出圆圆的细胞株。此时，野地包含野山参形成层的分离块和包含野山参不定根形成层的分离块均观察到相同结果。图1(a)中的C表示了在包含野山参形成层的分离块中，具有形成层特异分裂能力的同质细胞株被诱导的状态。
另外，进行了渗透处理的分离块不是在具有形成层特异分裂能力的同质细胞株诱导培养基中，而是在包含进行普通人参、野山参等人参类培养中使用的包含2，4-D的培养基中进行培养时，在7-10天之间分离块整体开始变黄，之后再过7-14，能够观察到在切断面整体上细胞被诱导出来。
表5进行渗透处理后的分离块和没有进行渗透处理的分离块的反应比较
Figure BPA00001337687100121
1-4：被分离的源自野山参形成层的同质细胞株的增殖
在上述实施例1-3中使用被诱导的源自形成层的、具有分裂能力的同质细胞株进行增殖。使用最适合源自形成层并具有分裂能力的同质细胞株进行增殖的培养基，该培养基以下面<表6>中所记载的基本盐(salt)组成为基础，按照<表7>的记载所配制。此时，<表7>中的2，4-D用于从野地野山参形成层诱导出的同质细胞株的增殖，IBA用于从野山参不定根诱导出的同质细胞株的增殖。
表6.最适合源自形成层且具有分裂能力的同质细胞株进行分离及增殖的培养基的基本盐组成
Figure BPA00001337687100131
表7.最适合源自形成层且具有分裂能力的同质细胞株进行分离及增殖的培养基的组成(培养基3)
Figure BPA00001337687100141
与图1(a)中的C所表示的情况相同，进行渗透胁迫处理并使用培养基2，仅在形成层诱导出特异同质细胞后，使用<表8>所示的培养基3进行继代培养。其结果，源自形成层且具有分裂能力的同质细胞继续分裂、增殖，大约培养10～20天后，能够分离源自形成层且具有分裂能力的同质细胞株。这样，将被分离的来自野山参形成层的同质细胞株放到同一培养基内进行培养，再次增殖具有分裂能力的同质细胞株。图1(a)中的D表示将被分离的形成层特异同质细胞株在<表7>所示的培养基3中进行增殖的状态。
1-5：观察被分离的细胞株的特性
将上述来自野山参形成层的同质细胞株放到含有下面<表8>所示的液相培养基的烧瓶内，在黑暗的并且温度为25±1℃的条件下，在100rpm的旋转搅拌机(shaker)中进行培养。继代培养周期固定为两周，并使培养细胞始终维持以代数成长级的高活性。此时，<表8>中的2，4-D用于从野地野山参形成层诱导出的同质细胞株的培养，IBA用于从野山参不定根诱导出的同质细胞株的培养。
另外，来自人参子叶的愈伤组织(callus)也在<表8>的培养基4中进行培养，并与本发明中的来自野山参形成层的同质细胞株进行比较。
表8人参悬浮介质(培养基4)
Figure BPA00001337687100151
首先在观察细胞凝聚程度(biological microscope CX31，Olympus，Japan)时，如<表9>所示，本发明中的进行了2，4-D处理的、来自野地野山参形成层的细胞株在进行悬浮培养时，观察到95％以上是以单细胞水平存在，而本发明中的进行了IBA处理的、来自不定根形成层的细胞株也存在60％以上单细胞水平。本发明中的细胞株在进行悬浮培养时，能确认其特征在于以单细胞水平存在。另外，如图1(b)的A所示，进行了2，4-D处理的、来自野地野山参形成层的细胞株和进行了IBA处理的、来自不定根形成层的细胞株均能观察到具有多个小液泡(vacuole)的形态特征，并能够确定为未分化状态。与此相反，观察来自人参子叶的愈伤组织(callus，生物资源中心，KCTC PC10224)的结果，如图1(b)中的B所示，观察不到多个小液泡，只能看到一个大液泡。
表9人参的长期培养中细胞团类型
Figure BPA00001337687100161
另外，为了观察进行大量培养的可能性，在容积为3L的气升式生物反应器(airlift bioreactor，CYTEC Korea INC，Korea)中对来自人参子叶(cotyledon)的愈伤组织以及本发明中的来自野山参形成层的同质细胞进行培养。培养基使用<表8>中的液体培养基，并维持一定的条件：黑暗条件，25±1℃。
其结果，如<表10>所示，来自人参子叶(cotyledon)的培养物倍增时间(doubling time)在烧瓶中为21天，但在反应器(reactor)中延长为28天。究其原因，分析为：由于在反应器内生成生长环、在培养过程中植物培养体具有凝聚性、细胞壁过硬导致的前端敏感性，使细胞存活率(cell viability)急剧减少。
另外，本发明中的进行了2，4-D处理的、来自野地野山参形成层的细胞培养的倍增时间为3～4天，进行了IBA处理的、来自野山参不定根形成层的细胞培养物的倍增时间为5～6天，均与是否在烧瓶或反应器中进行没有什么差异，不仅如此，时间反而缩短。来自形成层的同质细胞培养物在生物反应器内形成的成长环面积非常小，对培养器进行简单的刺激并移动培养基，就可以简单去除内壁上的环。另外，如果凝聚团小，则由于体积小并且有很多液泡(vacuole)，所以不会因为前端敏感性变弱，而使得细胞存活率(cell viability)减少。即，本发明中的来自形成层的同质细胞株为了能够进行大量培养，其在生物反应器内，对随搅拌作用而产生的剪应力的敏感性低，从而明确了其可在生物反应器内进行快速、大量的成长。由此可知，本发明中的来自形成层的同质细胞株同来自形成层以外组织的细胞株相比，对剪应力的敏感性低5-9倍。
表10在液体悬浮培养与生物反应器中培养的来自野山参形成层的同质细胞株和来自人参子叶的细胞的倍增时间
Figure BPA00001337687100171
另外，对异质细胞株，即来自人参子叶(cotyledon)的愈伤组织(生物资源中心，KCTC PC10224)和来自形成层的同质细胞株实施了冷冻保存。使用培养了6～8天的悬浮培养物，冷冻保存剂为包含0.5M甘油(DUCHEFA，The Netherlands)和0.5M DMSO(DUCHEFA，The Netherlands)以及1M蔗糖(DUCHEFA，The Netherlands)的培养基，将悬浮培养物移入到5ml冷冻管(Duran，USA)内。经冷冻保存剂处理的细胞接种量为200mg/ml。冷冻保存剂处理了的悬浮细胞在冷冻室保存30分钟后，再在深冷柜中保管3小时，然后浸渍到液氮中。
之后，为了解冻，取出放置在液氮中20分钟以上的培养细胞，放入到40℃恒温水槽中进行1～2分钟的解冻。为了细胞的再生，对细胞悬浮液使用了无菌状态的漏斗与滤纸。将过滤细胞适当放置到包含滤纸的固形生长培养基上，在室温条件下稳定30分钟后，再次移送到新鲜的固形生长培养基。
其结果，来自人参子叶的异质细胞株不进行再生，而来自形成层的同质细胞株在四周后开始再次生长并进行增殖，看不出增殖率在冷冻保存前后有什么差别。
实施例2：来自野山参形成层的同质细胞株的干燥以及提取物的制备
对实施例1中的来自野山参不定根形成层的同质细胞株进行如下的干燥和提取：
(1)制备干燥的细胞株
(i)将去除培养液的细胞株进行冷冻干燥或热风干燥。
(ii)利用粉碎机粉碎上述干燥的细胞株。
(2)制备蒸馏水提取物
(i)：取去除培养液的细胞株并进行热风干燥、冷冻干燥的细胞株500g，向其加入5000ml蒸馏水，在50℃条件下搅拌6小时后进行提取。
(ii)：在进行上述溶解后，将3000g的溶液进行10分钟的离心分离，通过收集上层液体获取蒸馏水可溶物。
(iii)：利用真空旋转浓缩机对上述获得的蒸馏水可溶物进行减压浓缩。
(3)乙醇提取物的制备
(i)：取去除培养液的细胞株和进行热风干燥、冷冻干燥的细胞株500g，向其加入5000ml乙醇，在50℃时，搅拌6小时后提取。
(ii)：对上述溶解后的3000g溶液进行10分钟离心分离，通过收集上层液体获取乙醇可溶物。
(iii)：利用真空旋转浓缩机对上述获得的乙醇可溶物进行减压浓缩。
实验例1：确定来自人参类形成层的同质细胞株对获得性免疫缺陷综合症的预防与治疗效果，并测定(1)-CD4+T细胞数/CD8+T细胞数的比例
为了确定本发明中的来自人参类形成层的同质细胞株对获得性免疫缺陷综合症的预防与治疗的效果，对HIV(human immunodeficiency virus)阳性反应的AIDS患者(76年生，男，2006年8月诊断为AIDS感染者)给药，将上述实施例2的(1)中制备的干燥细胞株粉碎物以粉末状让患者服用，每日三次(早、中、晚)，每次1g溶于水中后服用。口服9天(给药开始时间：2008年8月19日)。给药过程中，不服用其他AIDS治疗剂，结果显示该给药没有副作用。
给药9天后，采集患者血液，利用各样品进行()CD4抗原的藻红蛋白-结合抗体(phycoerythrin-conjugated antibodies)以及CD8抗原的荧光氰酸盐-结合抗体(fluoresein isothiocyanate-conjugated antibodis)的培养(Simultest reagent；Becton dichknson，San Jose，CA)。即，利用上述方法将CD4+和CD8+T细胞进行染色后，利用FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson)并按照厂商提供的说明书中的测定方法进行测定。以上述获得的细胞数为基础，计算CD4+T细胞数/CD8+T细胞数的比例。
表11临床例一 给药开始时间：2008年8月19日
Figure BPA00001337687100191
其结果，如上述表11与图2所示，给药后CD4+T细胞数测定为每μl 616个细胞，以参考值为基准时，可确定达到正常值水准。即，由于将本发明中的来自野山参形成层的同质细胞株进行给药，CD4+T细胞数显示为增加。
另外，关于CD8+T细胞的情况，给药前测定结果为非常少的每μl 384个细胞，给药后观察为在正常范围内。由此可确定，由于将本发明中的来自形成层的同质细胞株进行给药，CD8+T细胞数显示为增加。
另外，与给药之前相比，CD4+T细胞数/CD8+T细胞数的比例在给药后观察为接近1。一般情况，正常人的CD4+T细胞数/CD8+T细胞数的比例为1左右，而AIDS患者的CD4+T细胞数绝对减少，CD8+T细胞在AIDS早期时由于被过度免疫活性化，CD8+T细胞数增加，但随后显现为逐级减少的状态。由此，在AIDS早期，CD4+T细胞数/CD8+T细胞数的比例为减少的倾向，但逐渐开始发生变化。
在上述实验结果中，给药前CD4+T细胞数/CD8+T细胞数的比例在给药后反倒减少，这是由于给药前的CD8+细胞数也剧减，但在给药后CD4+T细胞数和CD8+T细胞数增加为正常范围内，因而可以确定给药后对HIV的免疫性整体增强。
综上所述能够确定，本发明中的来自野山参形成层的同质细胞株能够增强因HIV而被降低的免疫性，具有对获得性免疫缺陷综合症(AIDS)进行预防与治疗的作用。
实验例2：确定来自人参类形成层的同质细胞株对获得性免疫缺陷综合症进行预防与治疗的效果并测定(2)-CD4+T细胞数值
为了确定本发明中的来自人参类形成层的同质细胞株对获得性免疫缺陷综合症的预防与治疗的效果，又对HIV阳性反应的AIDS患者追加给药，将上述实施例2的(1)中制备的冷冻干燥细胞株粉碎物以粉末形态让患者服用。每天(早、午、晚)三次，每次1g，溶于水中口服。在给药过程中不服用其他AIDS治疗剂，显示没有给药副作用。
给药期限因患者而异，给药后对患者采血2-3mL，向各血样中加入BD Multi TESTTM试剂(CD3荧光氰酸盐抗体(FITC)、CD8红枣素抗体(PE)、CD45多甲藻素、叶绿素蛋白抗体(PerCP)、CD4别藻蓝蛋白抗体(APC)、Becton-Dickinson、Britain)，当各荧光标记抗体结合到血球表面的抗原上后，使用Facs cd4 machine(BD，Britain)并按照厂商提供的说明书中的测定方法测定CD4数值。
测定结果及各患者的给药时间具体如下。
表12.临床例2(性别：女，年龄：49，国籍：加纳，给药开始日2009-07-29)
  时间   日期   CD4数目(×105/L)
  给药前   2009-07-28   180
  第一次   2009-08-5   500
临床例2中的患者，在给药前虽然没有由于AIDS而引发的极度严重的症状，但在给药前的三个月期间确定有咳嗽、头痛、腹泻、高血压、红斑症状，给药后这样的症状减少，给药前CD4+T细胞的数值为非常少的180，给药后确定提高至500的正常范围内。
AIDS免疫缺陷综合症的病因是由于CD4+T细胞的缺损，AIDS患者的残留的CD4+T细胞的抗原反应减少或消失，因此必需的免疫调节因子发生异常生成，经过测定CD4+T细胞数或百分比并确认治疗结果，可知，本发明中的同质细胞株能够增加CD4+T细胞，具有治疗AIDS的效果。
表13.临床例3(性别：男，年龄：32，国籍：加纳，给药开始日2009-09-10)
  时间   日期   CD4数目(×105/L)
  给药前   2009-09-09   260
  第一次   2009-09-16   316
临床例3中的患者经诊断为AIDS后，没有服用ARV(anti-retro virus)治疗剂的经历，服用本发明的同质细胞株后，确定在短时间内数值从260增加为316。这种CD4+T细胞的增加表明本发明中的同质细胞株具有AIDS治疗效果。
表14.临床例4(性别：女，年龄：31，国籍：加纳，给药开始日2009-06-20)
  时间   日期   CD4数目(×105/L)
  给药前   2009-06-19   282
  第一次   2009-07-17   320
临床例4的患者的CD4+T细胞数值确定从给药前的282增加为320。这种CD4+T细胞的增加表明本发明中的同质细胞株具有治疗AIDS的效果。
表15.临床例5(性别：男，年龄：38，国籍：加纳，给药开始日2009-06-20)
  时间   日期   CD4数目(×105/L)
  给药前   2009-06-19   443
  第一次   2009-07-17   485
  第二次   2009-09-08   559
临床例5的患者的CD4+T细胞数值确定从给药前的443持续增加为559。这种CD4+T细胞的增加表明本发明中的同质细胞株具有治疗AIDS的效果。
表16.临床例6(性别：男，年龄：45，国籍：加纳，给药开始日2009-08-12)
  时间   日期   CD4数目(×105/L)
  给药前   2009-08-11   484
  第一次   2009-08-19   527
  第二次   2009-09-09   613
临床例6的患者的CD4+T细胞数值确定从给药前的484持续增加为613。这种CD4+T细胞的增加表明本发明中的同质细胞株具有治疗AIDS的效果。
表17.临床例7(性别：女，年龄：45，国籍：加纳，给药开始日2009-06-24)
  时间   日期   CD4数目(×105/L)
  给药前   2009-06-23   690
  第一次   2009-07-8   1073
能够确定：由于给药，临床例7的患者的慢性咳嗽、贫血等通常的AIDS并发症状消失，CD4数值从690显著增加到1073。
综合上述测定结果可确定，本发明中的来自人参类形成层的同质细胞株能够增加CD4+T细胞数。AIDS免疫缺陷综合症是由于CD4+T细胞的缺损，AIDS患者的残留CD4+T细胞的抗原反应或减少或消失，导致必需的免疫-调节因子异常生成而引发的。考虑到这一点时可以确定，本发明中的来自野山参形成层的细胞株具有针对获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的预防与治疗效果。
实验例3：确定来自人参类形成层的同质细胞株对获得性免疫缺陷综合症的预防与治疗效果并测定(3)HIV中的RNA数值
为了确定本发明中的来自人参类形成层的同质细胞株对获得性免疫缺陷综合症的预防与治疗效果，对能够实施用于测定HIV中的RNA值的RT-PCR测试的HIV阳性反应的AIDS患者追加测定HIV病毒的RNA数值。
与实验例3相同，给各AIDS患者服用上述实施例2的(1)中制备的冷冻干燥细胞株粉碎物，以粉末状态。服用为一日三次(早、中、晚)每次1g，溶于水中口服。给药过程中不服用其他AIDS治疗剂，没有给药副作用。
给药期限因患者而异，给药后对患者采血后获取血浆(plasma)，使用罗氏公司(瑞士)的COBASAmpliPrep/COBAS
Figure BPA00001337687100242
TaqMan
Figure BPA00001337687100243
HIV-1 Test，version 2.0[v2.0]，按照厂商指导进行定量RT-PCR实验。此时，HIV-1RNA的定量，利用同一公司的COBAS
Figure BPA00001337687100244
TaqManAnalyzer或OBAS
Figure BPA00001337687100246
TaqMan
Figure BPA00001337687100247
48Analyzer进行测定。并且，采用了与实验例2相同的方法，针对部分患者同时也测定了CD4+T细胞数，测定了CD4+T细胞数。
测定结果及各患者的给药期限如下。
表18.临床例8(性别：男，年龄：51，国籍：肯尼亚，给药开始日2009-06-20)
Figure BPA00001337687100248
临床例8的患者，在诊断为AIDS后没有服用过ARV治疗剂，在第一次实验中，其血浆中的HIV-1 RNA数值测定结果可确定为：同给药前的数据6,252相比，剧减为3,574。
这样，HIV病毒的显著减少不仅意味着本发明中的同质细胞株具有增殖、抑制甚至杀灭HIV病毒的作用，而且还证明能够作为AIDS的治疗或预防用的组合物有效使用。
表19.临床例9(性别：女，年龄：38，国籍：加纳，给药开始日2009-09-10)
Figure BPA00001337687100251
临床例9的患者，其第一次实验只显示了小幅增加，而在之后的第二次测定结果可以确定，与给药前相比，血浆中的HIV-1 RNA数值锐减为751。
这样，HIV病毒的显著减少不仅意味着本发明中的同质细胞株具有增殖、抑制甚至杀灭HIV病毒的作用，而且还证明能够作为AIDS的治疗或预防用的组合物有效使用。
表20.临床例10(性别：男，年龄：34，国籍：肯尼亚，给药开始日2009-06-20)
Figure BPA00001337687100252
临床例10的患者的情况可确认，在给药之前其血浆中的HIV-1RNA数值为18,232，非常高，在持续给药之后，逐渐降低，剧减为1，875。
这样，HIV病毒的显著减少不仅意味着本发明中的同质细胞株具有增殖、抑制甚至杀灭HIV病毒的作用，而且还证明能够作为AIDS的治疗或预防用的组合物有效使用。
表21.临床例11(性别：女，年龄：26，国籍：泰国，给药开始日2009-07-19)
Figure BPA00001337687100261
临床例11的患者，其CD4数值的增加和HIV-1 RNA的减少都能够得到确定，由此可知使用本发明中的细胞株作为AIDS治疗或预防用的组合物是有效的。
表22.临床例12(性别：女，年龄：35，国籍：加纳，给药开始日2009-08-12)
Figure BPA00001337687100262
临床例12的患者，其CD4数值的增加和HIV-1RNA的减少都能够得到确定，由此可知使用本发明中的细胞株作为AIDS治疗或预防用的组合物是有效果的。
表23.临床例13(性别：女，年龄：35，国籍：加纳，给药开始日2009-06-24)
Figure BPA00001337687100263
临床例13的患者，在给药早期只测定CD4数值，确定该数值为逐渐增加，之后又进行了两次HIV-1 RNA数值测定，从测定结果可确定随着给药而数值减少。这样的实验结果表明，使用本发明中的细胞株作为AIDS的治疗或预防用的组合物是有效的。
表24.临床例14(性别：男，年龄：46，国籍：缅甸，给药开始日2009-05)
Figure BPA00001337687100272
临床例14的患者，如图3所示，给药大约两个月后确认没有检测出HIV-1RNA。(临床例14患者的情况下，使用QIAGEN公司(德国)的artus
Figure BPA00001337687100273
HIV-1 RG RT-PCR试剂盒并按照厂商的指导进行Rotor-Gene Real-Time分析)。给AIDS患者服用本发明中的同质细胞株，没有检测出HIV，这作为AIDS治疗剂是非常引人注目的结果，表明有可能完全治愈AIDS。
综合上述测定结果可确定，虽然因患者个体差别减少幅度不同，但给药本发明中的细胞株都能使HIV的RNA数值减少。像这样HIV病毒的减少或未检出不仅表明本发明中的细胞株具有抑制甚至杀死HIV病毒增殖的功能，还证明了能够治疗与预防AIDS。
制作例1：药学制剂的制作例
制剂例1.片剂的制作
将在实施例2中制作的细胞株提取物100mg与玉米淀粉100mg，乳糖100mg以及硬脂酸镁2mg混合，利用一般的片剂制作方法制作。
制剂例2.胶囊剂的制作
将实施例2中制作的细胞株提取物500mg填入软质明胶胶囊中，制作胶囊。
制剂例3.糖浆剂的制作
将实施例1中制作的细胞株1g，被异构化的葡萄糖糖浆10g，甘露醇5g和适量的净化水混合，利用通常的液体制剂的制作方法制作100ml糖浆剂。
制剂例4.注射剂的制作
将在实施例2中制作的细胞株提取物200mg放入到含有聚氧乙烯氢化蓖麻油的生理盐水200mg中进行加热溶解，制作含有0.1％浓度的混合提取物的注射剂。
制作例2：功能性食品的制作-功能性饮料的制作
制作例1：
将在实施例1中制作的细胞株200mg溶解到96ml的水中，再加入助剂维生素C500mg，矫味剂柠檬酸、寡糖各1g，保存剂苯甲酸钠0.05g，然后加入净化水使溶液总量为100ml，从而制作功能性饮料。
制作例2.
将在实施例2中制作的细胞株提取物200mg溶解到96ml的水中，再加入助剂维生素C500mg，矫味剂柠檬酸、寡糖各1g，保存剂苯甲酸钠0.05g，然后加入净化水使溶液总量为100ml，从而制作功能性饮料。
工业上的利用可能性
综上所述，本发明中的同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物为来自天然物的组合物，将现有药物治疗剂的副作用降至最低，对人体安全通过的同时有效增加CD4+T细胞等T细胞数量并减少HIV(human immunodeficiency virus)数，可以防止由于免疫障碍所引起的机率性感染、神经机能障碍、新生物生长、甚至面临死亡的危险，具有对获得性免疫缺陷综合症进行预防、治疗以及症状缓和的功能。
综上所述，对本发明的特定内容部分进行了详细的说明，具有通常知识的本领域技术人员应当知道，这样的具体记载仅为优选实施形态，并不对本发明的发明进行限制。因此，本发明的实际范围可根据权力要求及其等同物进行定义。

Claims (12)

1.用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的组合物，其特征在于，包含从人参类(panax ginseng)形成层诱导出来的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中一种或一种以上，所述细胞株具有如下特征：
a为天然未分化状态(innately undifferentiated)；
b为同质细胞株(homogeneous cell line)；以及
c具有多个液泡(vacuole)的形态学特征。
2.如权利要求1所述的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的组合物，其特征在于，所述细胞株还具有如下特征：
a在进行悬浮培养时，以单细胞水平存在；
b同来自人参类形成层以外的组织的细胞株相比，在生物反应器中对剪应力(shear stress)的敏感性低；以及
c与来自人参类形成层之外的组织的细胞株相比，生长速度快，能够稳定培养。
3.如权利要求1所述的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的组合物，其特征在于，所述细胞株按照包括如下步骤的分离方法制得：
步骤a，获得含有人参类形成层的组织；
步骤b，将所述获得的含有形成层的组织放到含有IAA(Indole-3-acetic acid)或IBA(Indole-3-butyric acid)的培养基中进行培养，诱导来自形成层的细胞株，其中，在所述实施培养的过程中，或在培养前阶段或后阶段向所述含有形成层的组织施加渗透胁迫；
步骤c，回收上述被诱导的来自形成层的细胞株。
4.如权利要求3所述的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的组合物，其特征在于，将所述步骤c中的被诱导的来自形成层的细胞株放到包含2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)、毒莠定(picloram)和IBA中一种或一种以上的培养基中进行增殖后，回收来自形成层的细胞株。
5.如权利要求1所述的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的组合物，其特征在于，所述提取物是使用由蒸馏水、低级醇、丙酮、DMSO(Dimethyl Sufoxide)及它们的混合溶剂构成的组中选择出的溶剂进行提取。
6.用于预防或改善获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的功能性食品，其特征在于，包含从人参类形成层诱导出的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中的一种或一种以上，所述细胞株具有如下特征：
a为天然未分化状态(innately undifferentiated)；
b为同质细胞株(homogeneous cell line)；以及
c具有多个的液泡(vacuole)的形态学特征。
7.如权利要求6所述的用于预防或改善获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的功能性食品，其特征在于，所述细胞株还具有如下特征：
a在进行悬浮培养时，以单细胞水平存在；
b与来自人参类形成层以外的组织的细胞株相比，在生物反应器中，对剪应力(shear stress)的敏感性低；以及
c与来自人参类形成层之外的组织的细胞株相比生长速度快，能够稳定培养。
8.如权利要求6所述的用于预防或改善获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的功能性食品，其特征在于，所述细胞株根据包含如下步骤的分离方法制得：
步骤a，获得含有人参类形成层的组织；
步骤b，将所述获得的含有形成层的组织放到含有IAA(Indole-3-acetic acid)或IBA(Indole-3-butyric acid)的培养基中进行培养，诱导来自形成层的细胞株，其中，在所述实施培养的过程中，或在培养前阶段或后阶段向所述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及
步骤c，回收上述被诱导的来自形成层的细胞株。
9.如权利要求8所述的用于预防或改善获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)的功能性食品，其特征在于，将所述步骤c中的被诱导的来自形成层的细胞株放到包含2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)、毒莠定(picloram)和IBA中一种或一种以上的培养基中进行增殖后，回收来自形成层的细胞株。
10.增加T细胞的免疫促进剂，其特征在于，含有从人参类形成层诱导出的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中的一种或一种以上，所述细胞株具有如下特征，
a为天然未分化状态(innately undifferentiated)；
b为同质细胞株(homogeneous cell line)；以及
c具有多个液泡(vacuole)的形态学特征。
11.如权利要求10所述的增加T细胞的免疫促进剂，其特征在于，所述细胞株根据包含如下步骤的分离方法制得：
步骤a，获得含有人参类形成层的组织；
步骤b，将所述获得的含有形成层的组织放到含有IAA(Indole-3-acetic acid)或IBA(Indole-3-butyric acid)的培养基中进行培养，诱导来自形成层的细胞株，其中，在所述实施培养的过程中，或在培养前阶段或后阶段向所述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及
步骤c，回收上述被诱导的来自形成层的细胞株。
12.如权利要求11所述的增加T细胞的免疫促进剂，其特征在于，将所述步骤c中的被诱导的来自形成层的细胞株放到包含2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)、毒莠定(picloram)和IBA中一种或一种以上的培养基中进行增殖后，回收来自形成层的细胞株。
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