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CN102084000A - 微泡在医学疾病和病况的诊断、预后以及治疗中的用途 - Google Patents

微泡在医学疾病和病况的诊断、预后以及治疗中的用途 Download PDF

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CN102084000A CN2009801111070A CN200980111107A CN102084000A CN 102084000 A CN102084000 A CN 102084000A CN 2009801111070 A CN2009801111070 A CN 2009801111070A CN 200980111107 A CN200980111107 A CN 200980111107A CN 102084000 A CN102084000 A CN 102084000A
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Abstract

本发明公开的主题涉及通过检测分离自受试者生物样本的微泡中的生物标志物来辅助诊断、预后、监测和评价该受试者的疾病或其他医学病况的方法。此外，所公开的主题涉及通过确定生物样本内的微泡浓度来诊断、监测疾病的方法；涉及通过给予包含核酸或蛋白质的微泡而将所述核酸或蛋白质都递送到靶标的方法；涉及通过将不含微泡或富含微泡的流体部分引入患者而实施体液输注的方法。

Description

微泡在医学疾病和病况的诊断、预后以及治疗中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年2月1日提交的美国临时申请61/025,536和于2008年9月26日提交的美国临时申请61/100,293的优先权，其中每篇专利申请以其整体通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在由国家癌症研究所(National Cancer Institute)颁发的资助金NCI CA86355和NCI CA69246的政府支持下形成的。政府对本发明具有某些权利。
技术领域
本发明涉及医学诊断、患者监控、治疗效力评价、核酸和蛋白质递送以及输血等领域。
背景技术
成胶质细胞瘤是高度恶性的脑肿瘤，尽管进行了大量的研究和临床工作，但是该肿瘤的预后较差(Louis et al.，2007)。这种肿瘤的侵入本性使得不可能完全手术切除，并且平均存活时间仅为约15个月(Stupp et al.，2005)。成胶质细胞瘤细胞以及许多其他肿瘤细胞具有使间质环境转变为对其自身有利的显著能力。肿瘤细胞直接改变周围的正常细胞以有利于肿瘤细胞的生长、侵入、化学抗性、免疫逃避和转移(Mazzocca et al.，2005；Muerkoster et al.，2004；Singer et al.，2007)。肿瘤细胞还抢夺正常脉管系统并刺激迅速形成新的血管从而向肿瘤提供营养(Carmeliet and Jain，2000)。尽管免疫系统初始可以抑制肿瘤生长，但是经常通过免疫抑制途径的肿瘤激活而逐步钝化(Gabrilovich，2007)。
细胞脱落的小微泡称为外来体(Thery et al.，2002)。外来体据报道为具有约30-100nm的直径并且在正常和病理学状况下从许多不同细胞类型上脱落(Thery et al.，2002)。这些微泡最开始被描述为从成熟网织红细胞的细胞表面上弃去转铁蛋白-受体的机制(Pan and Johnstone，1983)。通过(胞)内体膜向内出芽而形成外来体，从而产生了随后与质膜融合的胞内多泡体(MVB)，并向外部释放外来体(Thery et al.，2002)。然而，现在有证据表明外来体更直接的释放。据称，某些细胞如Jurkat T细胞直接通过质膜向外出芽而脱落外来体(Booth et al.，2006)。由细胞脱落的所有膜囊在本文中统称为微泡。
据称，果蝇(Drosophila melanogaster)中的微泡(所谓的阿尔戈体(argosome))含有诸如无翅蛋白的形态发生素并且通过发育中的果蝇胚胎中的成虫盘上皮在较长的距离上移动(Greco et al.，2001)。据称，在精液中发现的微泡(称作前列腺小体)具有广泛的功能，包括促进精子运动、稳定顶体(acrosome)反应、辅助免疫抑制和抑制血管生成(Delves et al.，2007)。另一方面，据称由恶性前列腺细胞释放的前列腺小体促进血管生成。据称，微泡转移蛋白质(Mack et al.，2000)并且近期研究表明从不同细胞系分离的微泡也可以含有信使RNA(mRNA)和微小RNA(miRNA)，并且可以将mRNA转移到其他细胞类型(Baj-Krzyworzeka et al.，2006；Valadi et al.，2007)。
据称来源于B细胞和树突细胞的微泡具有有效的体内免疫-刺激和抗肿瘤作用并且已经用作抗肿瘤疫苗(Chaput et al.，2005)。据称树突细胞来源的微泡含有对于T细胞活化所必需的共刺激蛋白，而大多数肿瘤细胞来源的微泡不含有该蛋白(Wieckowski and Whiteside，2006)。从肿瘤细胞分离的微泡可以起到抑制免疫反应和加速肿瘤生长的作用(Clayton et al.，2007；Liu et al.，2006a)。乳腺癌微泡可以刺激血管生成，而血小板来源的微泡可以促进肿瘤发展和肺癌细胞转移(Janowska-Wieczorek et al.，2005；Millimaggi et al.，2007)。
通过积累促进无限制细胞生长的遗传改变而引发癌。已表明每个肿瘤平均具有约50-80个在非肿瘤细胞中不存在的突变(Jones et al.，2008；Parsons et al.，2008；Wood et al.，2007)。目前检测这些突变谱(曲线，profile)的技术包括活检样本分析和对在体液(如血液)中循环的突变肿瘤DNA片段的非侵入式分析(Diehl et al.，2008)。前一种方法是侵入性的、复杂的并且可能对受试者造成伤害。而后一种方法由于体液中突变癌DNA拷贝数极低，因而天生缺乏敏感性(Gormally et al.，2007)。因此，癌诊断所面临的一个挑战是开发可以通过非侵入性方式检测不同阶段肿瘤细胞的诊断方法，并且该方法具有高灵敏度和特异性。还已表明基因表达谱(编码mRNA或微小RNA)可以区别癌性和非癌性组织(Jones et al.，2008；Parsons et al.，2008；Schetter et al.，2008)。然而，目前检测基因表达谱的诊断技术需要组织的侵入性活检。一些活检程序导致高风险并且可能是有害的。此外，在活检程序中，从有限区域获取组织样本并且该组织样品可能产生假阳性或假阴性，特别是在异质肿瘤和/或分散在正常组织内的肿瘤中。因此，高度需要用于检测生物标志物的非侵入性并且灵敏的诊断方法。
发明内容
一般地，本发明是一种用于检测受试者中是否存在包含在微泡中的各种各样的生物标志物的新型方法，借此辅助诊断、监测和评价与微泡生物标志物有关的疾病、其他医学病况(病症，condition)和治疗效力。
本发明的一个方面是用于辅助诊断或监测受试者的疾病或其他医学病况的方法，其包括以下步骤：a)从来自受试者的生物样本中分离微泡部分；和b)检测该微泡部分内是否存在生物标志物，其中生物标志物与疾病或其他医学病况有关。这些方法可以进一步包括将检测步骤的结果与对照进行比较的步骤或多个步骤(例如，将样本中检测的一个或多个生物标志物的量与一个或多个对照水平进行比较)，其中如果检测步骤的结果与对照相比具有可测量的差异，则将该受试者诊断为患有所述疾病或其他医学病况(例如，癌)。
本发明的另一个方面是一种辅助评价在受试者中的治疗效力的方法，其包括以下步骤：a)从受试者的生物样本中分离微泡部分(组分，fraction)；和b)检测该微泡部分内是否存在生物标志物，其中所述生物标志物与疾病或其他医学病况的治疗效力有关。该方法可以进一步包括在一段时间内提供一系列来自受试者的生物样本的步骤。另外，该方法可以进一步包括确定来自所述一系列生物样本每一个中的检测步骤结果的任何可测量变化的步骤或多个步骤(例如，一个或多个检测的生物标志物的量)，从而评价所述疾病或其他医学病况的治疗效力。
在本发明上述方面的某些优选实施方式中，来自受试者的生物样本为体液样本。特别优选的体液为血液和尿液。
在本发明上述方面的某些优选实施方式中，所述方法进一步包括分离来源于特定类型细胞(例如，癌或肿瘤细胞)的选择性微泡部分。另外，选择性微泡部分可以基本由尿液微泡(泌尿微泡，urinary microvesicle)组成。
在本发明上述方面的某些实施方式中，与疾病或其他医学病况有关的生物标志物为i)核酸物质；ii)一种或多种核酸的表达水平；iii)核酸变体；或iv)任何前述标志物的组合。这样的生物标志物的优选实施方式包括信使RNA、微小RNA、DNA、单链DNA、互补DNA和非编码DNA。
在本发明上述方面的某些实施方式中，疾病或其他医学病况为肿瘤性疾病或病况(例如，成胶质细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤和结直肠癌)、代谢疾病或病况(例如，糖尿病、炎症、围产期病况或与铁代谢有关的疾病或病况)、移植后病况或胎儿病况。
本发明的另一个方面是一种辅助诊断或监测受试者的疾病或其他医学病况的方法，其包括以下步骤：a)从受试者获得生物样本；和b)确定该生物样本内的微泡的浓度。
本发明的另一个方面是一种用于将核酸或蛋白质递送到个体中的靶细胞的方法，其包括以下步骤：将含有核酸或蛋白质的微泡或将产生这样的微泡的一个或多个细胞给予该个体，以使这些微泡进入所述个体的靶细胞。在本发明这一方面的优选实施方式中，将微泡被递送到脑细胞。
本发明的另一个方面是一种用于实施体液(例如，血液、血清或血浆)输注的方法，其包括以下步骤：获得完全不含或基本完全不含微泡的供体体液的部分，或从特定细胞类型(例如，肿瘤细胞)获得完全不含或基本完全不含微泡的部分，并且将不含微泡的部分引入患者。本发明的一个相关方面是是物质的组合物，所述物质包括完全不含或基本完全不含微泡的供体体液样本(例如，血液、血清或血浆)，或来自特定细胞类型的完全不含或基本完全不含微泡的样本。
本发明的另一个方面是一种用于实施体液(例如，血液、血清或血浆)输注的方法，其包括以下步骤：获得供体体液的富含微泡的部分，和将富含微泡的部分引入患者。在优选的实施方式中，所述部分富含有来源于特定细胞类型的微泡。本发明的一个相关方面是物质的组合物，所述物质包括富含微泡的体液样本(例如，血液、血清或血浆)。
本发明的另一个方面是一种辅助鉴别与疾病或其他医学病况有关的新型生物标志物的方法，其包括以下步骤：从受试者获得生物样本；从该样本分离微泡部分；和检测该微泡部分内的核酸物质、它们各自的表达水平或浓度、核酸变体、或它们的组合。
现在将详细说明本发明的各个方面和实施方式。应理解在不背离本发明范围的前提下可以对细节进行改变。另外，除非本文另外要求，否则单数术语将包括复数而复数术语将包括单数。
出于描述和公开的目的，所有提到的专利、专利申请和出版物均明确地通过引用并入本文，例如，在可以结合本发明使用的出版物中描述的方法。提供这些出版物仅用于它们在本申请的申请日之前的公开内容。在这方面不应解释为承认本发明的发明人没有权利通过在先发明或出于任何其他原因使本发明提到这样的披露内容之前。所有有关日期的说明或有关这些文献内容的表示均基于申请人可获得的信息并且不构成对这些文献的有关日期或内容的正确性的任何承认。
附图说明
图1：成胶质细胞瘤细胞产生含有RNA的微泡。(a)原代成胶质细胞瘤细胞的扫描电子显微镜图像(图例＝10μm)。(b)高倍放大图显示了细胞表面上的微泡。囊泡的大小不同，其直径在约50nm至约500nm之间(图例＝1μm)。(c)显示了从用RNA酶A处理或未处理的微泡中提取的总RNA的量的曲线。该量用在260nm波长(x轴)的吸光度值(Abs，y轴)表示。实验重复5次，并且示出了代表性曲线。(d)显示了从原代成胶质细胞瘤细胞提取的总RNA的尺寸分布的生化分析仪数据和(e)显示了从分离自原代成胶质细胞瘤细胞的微泡提取的总RNA的尺寸分布的生化分析仪数据。25nt峰代表内标。(d)中的两个主峰(箭头)代表18S(左箭头)和28S(右箭头)核糖体RNA。从微泡提取的RNA中没有核糖体峰(e)。(f)由原代成胶质细胞瘤细胞分泌的微泡的透射电子显微镜图(图例＝100nm)。
图2：微泡RNA的分析。图2(a)和2(b)为在来自两个不同实验的微泡中的mRNA水平和供体成胶质细胞瘤细胞中断mRNA水平的散布图。线性回归显示供体细胞中的mRNA水平相对于微泡的相关性不好。图2(c)和2(d)为在两种不同供体细胞或两种不同微泡制备物中的mRNA水平。与图2(a)和2(b)相比，线性回归显示供体细胞之间(图2(c))或微泡(图2(d))之间的mRNA水平密切相关。
图3：微泡DNA的分析。
a)采用来自在核酸提取前用DNA酶处理的外来体的DNA模板进行GAPDH基因扩增。泳道鉴别如下：
1.100bp MW梯型(ladder)
2.阴性对照
3.来自GBM 20/3细胞的基因组DNA对照
4.来自正常血清外来体的DNA(不含肿瘤细胞的对照)
5.来自正常人成纤维细胞(NHF19)的外来体DNA
6.来自原代髓母细胞瘤细胞(D425)的外来体DNA
b)采用来自未用DNA酶预先处理的外来体的DNA模板进行GAPDH基因扩增。泳道鉴别如下：
1.100bp MW梯型
2.来自原代黑素瘤细胞0105的DNA
3.来自黑素瘤0105的外来体DNA
4.阴性对照
5.来自原代GBM 20/3的cDNA(阳性对照)
c)人内源性反转录病毒K基因的扩增。泳道鉴别如下：
1.100bp MW梯型
2.来自髓母细胞瘤(medulloblastoma)D425a的外来体DNA
3.来自髓母细胞瘤D425b的外来体DNA
4.来自正常人成纤维细胞(NHF19)的外来体DNA
5.来自正常人血清的外来体DNA
6.来自GBM 20/3的基因组DNA
7.阴性对照
d)腱糖蛋白(tenascin)C基因的扩增。所列泳道鉴别如下：
1.100bp MW梯型
2.来自正常人成纤维细胞(NHF19)的外来体
3.来自血清(不含肿瘤细胞的个体A)的外来体
4.来自血清(不含肿瘤细胞的个体B)的外来体
5.来自原代髓母细胞瘤细胞D425的外来体
e)转座细胞系1(transposable Line 1)元件的扩增。泳道鉴别如下：
1.100bp MW梯型
2.来自正常人血清的外来体DNA
3.来自正常人成纤维细胞的外来体DNA
4.来自髓母细胞瘤D425a的外来体DNA
5.来自髓母细胞瘤D425b的外来体DNA
f)DNA在来自D425髓母细胞瘤细胞的外来体中存在。泳道鉴别如下：
1.100bp标志物
2.未用DNA酶处理的D425
3.采用DNA酶处理的D425
4.1kb标志物
g)使用RNA皮可芯片(RNA pico chip)的单链核酸分析。上图：未用DNA酶处理的纯化的DNA；下图：采用DNA酶处理的纯化的DNA。上图中的箭头指示检测到的核酸。25nt处的峰为内标。
h)来自原代髓母细胞瘤D425的外来体中所包含的核酸的分析。上图：通过RNA皮级芯片检测的单链核酸。下图：通过DNA1000芯片检测的双链核酸。上图中的箭头指示检测到的核酸。两个峰(15和1500bp)为内标。
i)使用RNA皮可芯片对不同来源的外来体DNA的分析。上图：从来自成胶质细胞瘤细胞的外来体提取的DNA。下图：从来自正常人成纤维细胞的外来体提取的DNA。
图4：当包括血清外来体分离步骤时，来自血清的胞外RNA提取更有效。a)来自血清的外来体RNA。b)直接全血清提取。c)空孔。箭头指示样本中检测到的RNA。
图5：微泡和起源细胞之间的基因表达水平的比较。与微泡来源于的细胞相比，发现微泡中有3426个基因，差异分布超过了5倍(p值＜0.01)。
图6：微泡RNA的本体(ontological)分析。(a)饼形图显示了微泡中含量最丰富的500种mRNA物质的生物学过程本体。(b)显示了属于与肿瘤生长相关的本体的微泡RNA的密度的曲线图。x轴代表本体中存在的mRNA转录本的数目。阵列上的平均强度水平为182。
图7：mRNA水平的聚簇图(簇状图，clustering diagram)。分析了细胞系中以及从这些细胞系培养基中分离的外来体中mRNA表达谱的微阵列数据并且生成了表达谱的聚簇。RNA物质的标记如下：
20/3C-1：成胶质细胞瘤20/3细胞RNA，阵列重复(array replicate)1
20/3C-2：成胶质细胞瘤20/3细胞RNA，阵列重复2
11/5C：成胶质细胞瘤11/5细胞RNA
0105C：黑素瘤0105细胞RNA
0664C：黑素瘤0664细胞RNA
0664E-1：黑素瘤0664外来体RNA，阵列重复1
0664E-2：黑素瘤0664外来体RNA，阵列重复2
0105E：黑素瘤0105外来体RNA
20/3E：成胶质细胞瘤20/3外来体RNA
11/5E-1：成胶质细胞瘤11/5外来体，阵列重复1
11/5E-2：成胶质细胞瘤11/5外来体，阵列重复2
GBM：成胶质细胞瘤。刻度表示聚簇之间的距离。
图8：来自血清的微泡含有微小RNA。使用定量miRNA RT-PCR分析了从两位不同患者的微泡和成胶质细胞瘤细胞(GBM1和GBM2)中提取的成熟miRNA的水平。循环阈值(Ct)用平均值±SEM表示(n＝4)。
图9：微小RNA水平的聚簇图。分析了细胞系中以及从这些细胞系培养基中分离的外来体中微小RNA表达谱的微阵列数据并且生成了表达谱的聚簇。RNA种类的标记如下：
0664C-1：黑素瘤0664细胞RNA，阵列重复1
0664C-2：黑素瘤0664细胞RNA，阵列重复2
0105C-1：黑素瘤0105细胞RNA，阵列重复1
0105C-2：黑素瘤0105细胞RNA，阵列重复2
20/3C-1：成胶质细胞瘤20/3细胞RNA，阵列重复1
20/3C-2：成胶质细胞瘤20/3细胞RNA，阵列重复2
11/5C-1：成胶质细胞瘤11/5细胞RNA，阵列重复1
11/5C-2：成胶质细胞瘤11/5细胞RNA，阵列重复2
11/5E-1：成胶质细胞瘤11/5外来体，阵列重复1
11/5E-2：成胶质细胞瘤11/5外来体，阵列重复2
20/3E-1：成胶质细胞瘤20/3外来体RNA，阵列重复1
20/3E-2：成胶质细胞瘤20/3外来体RNA，阵列重复2
0664E：黑素瘤0664外来体RNA
0105E-1：黑素瘤0105外来体RNA，阵列重复1
0105E-2：黑素瘤0105外来体RNA，阵列重复2
GBM：成胶质细胞瘤。刻度表示聚簇之间的距离。
图10：血清微泡中微小RNA-21的表达水平与神经胶质瘤有关。示出了柱状图，其中左侧为正常对照血清，右侧为神经胶质瘤血清。使用定量RT-PCR测量来自成胶质细胞瘤患者血清和正常患者对照血清的外来体中的微小RNA-21(miR-21)的水平。成胶质细胞瘤血清显示Ct值减小了5.4，相当于miR21增加了约40倍(2ΔCt)。将每个样本的miR21水平归一化为GAPDH(n＝3)。
图11：使用巢式RT-PCR检测肿瘤样本和相应血清外来体中的EGFRvIII mRNA。野生型EGFR PCR产物在1153bp处显现为条带，而EGFRvIII PCR产物在352bp处显现为条带。包括GAPDH mRNA的RT-PCR作为阳性对照(226bp)。用星号表示认为是EGFRvIII阳性的样本。患者11、12和14在肿瘤样本中仅显示出EGFRvIII的弱扩增，但当加载更多样本时其变得明显。
图12：在来自52个正常对照血清的微泡上实施EGFRvIII的巢式RT-PCR。在正常对照血清中从未发现EGFRvIII(352bp)。包括GAPDH(226bp)的PCR作为对照。
图13：可以在来自人血清的外来体内检测海帕西啶(肝抗菌肽，hepcidin)mRNA。A)通过Agilent生化分析仪(Agilent Bioanalyzer)产生的假凝胶。B)Agilent生化分析仪对阳性对照(样本1)产生的原始图。C)Agilent生化分析仪对阴性对照(样本2)产生的原始图。D)Agilent生化分析仪对外来体(样本3)产生的原始图。
图14：尿液外来体的分离和尿液外来体内的核酸的鉴别。(a)肾小管细胞中含有许多小“外来体”的多泡体(MVB)的电子显微镜图像。(b)分离的尿液外来体的电子显微镜图像。(c)通过Agilent生化分析仪对尿液外来体中所含的RNA转录本的分析。鉴别出大量的RNA物质，但是没有18S和28S核糖体RNA。(d)通过PCR对尿液外来体中各种RNA转录本的鉴别。由此鉴别的转录本为：水通道蛋白1(Aquaporin 1)(AQP1)；水通道蛋白2(AQP2)；Cubulin(CUBN)；兆蛋白(Megalin)(LRP2)；精氨酸血管加压素受体2(arginine vasopressin receptor 2)(AVPR2)；钠/氢交换器3(SLC9A3)；V-腺苷三磷酸酶B1亚基(ATP6V1B1)；去氧肾上腺素(Nephrin)(NPHS1)；肾小球足细胞裂隙膜蛋白(Podocin)(NPHS2)；和氯离子通道3(CLCN3)。自上而下，分子量(MW)泳道中的五个条带对应于1000、850、650、500、400、300个碱基对片段。(e)来自尿液样本的外来体核酸的生化分析仪图。数字表示人个体的编号。(f)显示使用(e)中的核酸提取物，用不同引物对产生的PCR产物的假凝胶。House(框)表示肌动蛋白基因，而肌动蛋白引物来自Ambion(TX，USA)。+ve对照表示使用来自Ambion(TX，USA)的人肾cDNA作为模板的PCR，而-ve对照表示不使用核酸模板的PCR。(g)假凝胶照片，其显示了在核酸提取前经由使用和不使用DNA酶处理的外来体的PCR对肌动蛋白基因cDNA进行的阳性鉴别。(h)显示从人尿液外来体分离的核酸量的生化分析仪图。
图15：尿液外来体中前列腺癌生物标志物的分析。(a)凝胶照片，其显示了TMPRSS2-ERG基因的PCR产物以及该PCR产物的消化片段。P1和P2分别表示来自患者1和患者2的尿液样本。对于每个样品，未消化的产物在左侧泳道而消化的产物在右侧泳道。MWM表示具有MW标志物的泳道。在图的右侧指出了条带的大小(未消化和消化的)。(b)凝胶照片，其显示了PCA3基因的PCR产物和该PCR产物的消化片段。P1、P2、P3和P4分别表示来自患者1、患者2、患者3和患者4的尿液样品。对于每个样品，未消化的产物在左侧泳道而消化的产物在右侧泳道。MWM表示具有MW标志物的泳道。在图的右侧指出了条带的大小(未消化和消化的)。(c)在(a)和(b)中出现的患者信息和数据的总结。TMERG表示TMPRSS2-ERG融合基因。
图16：BRAF mRNA包含在由黑素瘤细胞脱落的微泡内。(a)电泳凝胶照片，其显示BRAF基因扩增的RT-PCR产物。(b)电泳凝胶照片，其显示GAPDH基因扩增的RT-PCR产物。泳道以及它们所对应的样本为如下：泳道#1-100bp分子量标志物；泳道#2-YUMEL-01-06 exo；泳道#3-YUMEL-01-06细胞；泳道#4-YUMEL-06-64 exo；泳道#5.YUMEL-06-64细胞；泳道#6.M34exo；泳道#7-M34细胞；泳道#8-成纤维细胞；泳道#9-阴性对照。参考术语“exo”意思是RNA是从培养基中的外来体提取的。参考术语“细胞”意思是RNA是从培养的细胞提取的。YUMEL后的数字表示特定批次YUMEL细胞系的鉴别。(c)来自YUMEL-01-06exo的PCR产物的测序结果。来自YUMEL-01-06细胞、YUMEL-06-64 exo和YUMEL-06-64细胞的结果与来自YUMEL-01-06 exo的结果相同。(d)来自M34 exo的PCR产物的测序结果。来自M34细胞的结果与来自M34 exo的结果相同。
图17：成胶质细胞瘤微泡可以将功能性RNA递送到HBMVEC。(a)纯化的微泡用膜染料PKH67(绿色)标记并将其加入HBMVEC。在1小时内，将微泡内化到内含体-样结构中。(b)从稳定表达Gluc的成胶质细胞瘤细胞分离微泡。RNA提取以及Gluc和GAPDH mRNA的RT-PCR表明两者均整合到微泡中。(c)然后，将微泡加入HBMVEC并培育24小时。在微泡加入后，在0、15和24小时测量培养基中的Gluc活力，并将其归一化为微泡中的Gluc活力。结果表示为平均值±SEM(n＝4)。
图18：成胶质细胞瘤微泡刺激体外血管生成并且含有血管生成蛋白。(a)在仅基础培养基(EBM)和添加了GBM微泡(EBM+MV)或血管生产因子(EGM)的基础培养基中的MatrigelTM上培养HBMVEC。16小时后测量小管生成，表示为以与EBM中生长的细胞相比较的平均小管长度±SEM(n＝6)。(b)在人血管生成抗体阵列上分析了来自原代成胶质细胞瘤细胞中的总蛋白以及来自这些细胞的微泡(MV)。(c)扫描该阵列并用图像J软件(Image Jsoftware)分析强度(n＝4)。
图19：从原代成胶质细胞瘤细胞中分离的微泡促进U87成胶质细胞瘤细胞系的增殖。将100,000个U87细胞接种到24孔板的孔中，并允许在(a)正常生长培养基(DMEM-5％FBS)或(b)添加了125μg微泡的正常生长培养基中，生长三天。(c)3天后，未添加微泡的细胞扩大到480,000个，而添加微泡的细胞扩大到810,000个。NC表示在正常对照培养基中生长的细胞，而MV表示在添加了微泡的培养基上生长的细胞。结果表示为平均值±SEM(n＝6)。
具体实施方式
微泡是由真核细胞脱落到或由质膜出芽到细胞外部的。这些膜囊的尺寸是不均匀的，其直径范围在约10nm至约5000nm。在本领域中，将通过胞内多泡体的胞吐作用释放的小微泡(直径为约10至1000nm，并且更经常为30至200nm)称为“外来体”。本文中所描述的方法和组合物同等地可适用于所有大小的微泡；优选30至800nm；并且更优选30至200nm。
在一些文献中，术语“外来体”还表示含有核糖核酸外切酶的蛋白质复合体，该核糖核酸外切酶参与mRNA降解以及小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)和核糖体RNA(rRNA)的加工处理(Liu et al.，2006b；van Dijk et al.，2007)。这样的蛋白质复合体不具有膜并且不是如本文所使用那些术语的“微泡”或“外来体”。
作为诊断和/或预后工具的外来体
本发明的某些方面是基于以下惊人的发现，即可以从成胶质细胞瘤患者的血清中分离成胶质细胞瘤来源的微泡。这来源于脑中细胞的微泡存在于受试者的体液中的首次发现。在该发现之前，还不知道成胶质细胞瘤细胞是否产生微泡或这样的微泡是否可以穿过血脑屏障而进入到身体的其他部分。发现这些微泡含有与肿瘤细胞有关的突变mRNA。这些微泡还含有微小RNA(miRNA)，其被发现在成胶质细胞瘤中含量丰富。还发现成胶质细胞瘤来源的微泡有效地促进了培养基中的原代人脑微血管内皮细胞(HBMVEC)的血管生成特征。这种血管生成作用至少部分是通过存在于微泡中的血管生成蛋白介导的。这些微泡中发现的核酸以及微泡的其他内含物如管生成蛋白，通过提供遗传谱而可以用作用于肿瘤诊断、表征和预后的有价值的生物标志物。通过分析在肿瘤发展期间是否获得其他突变以及某些突变的水平是否随时间或随治疗过程而提高或降低，这些微泡内的内含物还可以用于监测肿瘤随时间的发展。
本发明的某些方面基于微泡是由肿瘤细胞分泌并在体液中循环的发现。微泡的数目随肿瘤生长而增加。体液中微泡的浓度与相应肿瘤负荷成比例。肿瘤负荷越大，则体液中微泡的浓度越高。
本发明的某些方面基于另一惊人的发现，即受试者体液中的大多数胞外RNA包含在微泡中并且因此被保护而不受核糖核酸酶的降解。如实施例3中所证实的，可以从微泡中回收总血清中超过90％的胞外RNA。
本发明的一个方面涉及通过确定生物样本中的微泡浓度而用于检测、诊断、监测、治疗或评价受试者的疾病或其他医学病况的方法。可以使用未首先分离微泡的生物样本或通过首先分离微泡的生物样本来实施该确定。
本发明的另一个方面涉及用于检测、诊断、监测、治疗或评价受试者的疾病或其他医学病况的方法，其包括以下步骤：从受试者体液中分离外来体，和分析在该外来体中包含的一种或多种核酸。核酸定性和/或定量地进行分析，并将结果与从患有或未患有该疾病或其他医学病况的一位或多位其他受试者预期或获得的结果相比较。如与一位或多位其他个体相比，存在受试者的微泡核酸含量差异，可以指示该受试者中是否存在该疾病或其他医学病况，指示该疾病或其他医学病况的发展(例如，肿瘤尺寸和肿瘤恶性程度的变化)或指示对该疾病或其他医学病况的易患性。
事实上，本文所描述的分离方法和技术提供了以下至今未实现的优势：1)选择性分析疾病或肿瘤-特异性核酸的机会，这可以通过将疾病或肿瘤-特异性微泡与液体样本内其他微泡分离开得以实现；2)与通过直接从液体样本中提取核酸所获得的得率/完整性相比，核酸物质的得率显著较高，并且序列完整性也较高；3)可量测性，例如，检测表达水平低的核酸，可以通过从大量血清中使更多微泡成颗粒而提高灵敏度；4)更纯的核酸，因为在核酸提取步骤前从微泡颗粒中排除了蛋白质和脂质、死细胞碎片以及其他可能的污染物和PCR抑制剂；和5)由于微泡颗粒的体积比初始血清要小得多，因此核酸提取方法的选择更多，从而有可能使用小体积柱过滤器从这些微泡颗粒中提取核酸。
优选从采自受试者体液的样本分离微泡。如本文所使用的，“体液”表示从受试者身体的任何位置，优选地为外周位置分离的液体样本，其包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、尿液、痰液、脊髓液、胸膜液、乳头吸出物(nipple aspirate)、淋巴液、呼吸液、肠道液和泌尿生殖道液、泪液、唾液、乳汁、来自淋巴系统的液体、精液、脑脊髓液、器官内系统液、腹水液、肿瘤囊肿液、羊水和它们的组合。
术语“受试者”旨在包括表现或预计具有微泡的所有动物。在具体实施方式中，受试者为哺乳动物、人类或非人类的灵长类动物、狗、猫、马、牛、其他家畜或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠等)。术语“受试者”和“个体”在本文中可以互换使用。
在本领域中，从生物样本中分离微泡的方法是已知的。例如，在Raposo等人(Raposo et al.，1996)的论文中说明了差速离心的方法，并且在本文的实施例部分中详细说明了类似的方法。美国专利No.6899863和6812023中描述了阴离子交换色谱和/或凝胶渗透色谱的方法。美国专利No.7198923中描述了蔗糖密度梯度电泳或细胞器电泳的方法。在(Taylor and Gercel-Taylor，2008)中描述了磁力活化细胞分选(MACS)的方法。在(Cheruvanky et al.，2007)中描述了纳米膜超滤浓缩器的方法。优选地，可以通过新近开发的使用独特微流体平台的微芯片技术从受试者体液中鉴别和分离微泡，从而有效并且选择性地分离肿瘤来源的微泡。如在Nagrath等人(Nagrath et al.，2007)的论文中所描述的，可以使用该论文中所教导的捕获和分离的类似原理调整该技术以适于鉴别和分离微泡。以上每篇参考文献对其这些方法的教导通过引用并入本文。
在一种实施方式中，针对来源于特定细胞类型例如：肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结直肠、乳腺、前列腺、脑、食管、肝、胎盘、胎儿细胞的微泡富集从体液分离的微泡。由于微泡经常携带来自其供体细胞的表面分子，如抗原，因此可以使用表面分子来鉴别、分离和/或富集来自特定供体细胞类型的微泡(Al-Nedawi et al.，2008；Taylor and Gercel-Taylor，2008)。以这种方式，可以分析来源于不同细胞群体的微泡的核酸内含物。例如，肿瘤(恶性和非恶性)微泡携带肿瘤相关表面抗原并且可以经由这些特异性肿瘤相关表面抗原进行检测、分离和/或富集。在一个实施例中，所述表面抗原为上皮细胞粘附分子(EpCAM)，它对来自肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌以及肝起源癌的微泡具有特异性，但是对血液细胞起源的癌症不具有特异性。(Balzar et al.，1999；Went et al.，2004)。在另一个实施例中，表面抗原为CD24，它是对尿液微泡特异的糖蛋白(Keller et al.，2007)。在另一个实施例中，表面抗原选自CD70分子、癌胚抗原(CEA)、EGFR、EGFRvIII及其他变体、Fas配基、TRAIL、转铁蛋白受体、p38.5、p97和HSP72的组。另外，肿瘤特异性微泡可以以缺少表面标志物(如CD80和CD86)为特征。
可以通过例如，使用对所期望表面抗原特异的抗体、适体、适体类似物或分子印迹聚合物实现对来自特定细胞类型的微泡的分离。在一种实施方式中，所述表面抗原对癌类型特异。在另一种实施方式中，所述表面抗原对不必需是癌性的细胞类型特异。在美国专利No.7198923中提供了基于细胞表面抗原的微泡分离方法的一个实例。例如，如在美国专利No.5840867和5582981、WO/2003/050290以及Johnson等人的出版物(Johnson et al.，2008)中所描述的，适体以及它们的类似物特异地结合表面分子并且可以用作用于收集细胞类型特异性微泡的分离工具。例如，如在美国专利No.6525154、7332553和7384589以及Bossi等人的出版物(Bossi et al.，2007)中所描述的，分子印迹聚合物还特异地识别表面分子并且是用于回收和分离细胞类型特异性微泡的工具。以上每篇参考文献以对这些方法的教导通过引用并入本文。
在分析前，从外来体提取核酸可能是有益的或是另外所希望的。可以使用本领域中熟知的任何数量的程序从微泡中分离核酸分子，对特定生物样本选择适合的具体分离程序。在本文的实施例部分中提供了提取方法的实例。在一些情况下，使用一些技术也可能在不从微泡进行提取的情况下进行核酸分析。
在一种实施方式中，在不进行扩增步骤下直接分析提取的核酸，包括DNA和/或RNA。可以使用不同的方法进行直接分析，所述方法包括，但不限于，纳米弦技术(nanostring technology)。纳米弦技术通过将颜色编码的荧光报告子连接到各个靶分子上从而使得能够鉴别和定量生物样本中的单个靶分子。该方法与通过扫描条型码测量库存量的概念类似。可以用数百个或甚至数千个不同的代码制定报告子从而允许高度复杂的分析。在Geiss等人的出版物(Geiss et al.，2008)中描述了该技术，并且该教导的内容通过引用并入本文。
在另一种实施方式中，在分析前对微泡的核酸进行扩增可能是有益的或是另外所希望的。核酸扩增的方法是本领域是常用的并且一般是已知的，在本文中描述了核酸扩增方法的多个实例。如果期望，可以进行扩增从而使其为定量的。定量扩增将允许定量确定各种核酸的相对量以生成如下所描述的谱图。
在一种实施方式中，提取的核酸为RNA。然后，在进一步扩增前优选地将RNA反转录到互补DNA中。这样的反转录可以单独进行或结合扩增步骤进行。结合反转录和扩增步骤的方法的一个实例为反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，它可以进一步修改为定量的，例如，如美国专利No.5639606中所描述的定量RT-PCR，其所教导的内容通过引用并入本文。
核酸扩增方法包括，但不限于，聚合酶链反应(PCR)(美国专利No.5219727)和它的改变形式，如原位聚合酶链反应(美国专利No.5538871)、定量聚合酶链反应(美国专利No.5219727)、巢式聚合酶链反应(美国专利No.5556773)、自主序列复制和它的改变形式(Guatelli et al.，1990)、转录扩增系统和它的改变形式(Kwoh et al.，1989)、Qb复制酶法和它的改变形式(Miele et al.，1983)、冷-PCR(Li et al.，2008)或任何其他核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果诸如核酸的分子以极低的数目存在，则设计用于检测核酸分子的那些检测方案是特别有用的。以上参考文献以其对这些方法的教导通过引用并入本文。
微泡中存在的核酸的分析为定量的和/或定性的。对于定量分析，使用本领域已知的方法(如下所述)测量微泡内所关心的特异性核酸的相对或绝对量(表达水平)。对于定性分析，使用本领域已知的方法(如下所述)鉴别微泡内所关心的特异性核酸的种类(野生型或变体)。
在本文中，使用“遗传畸变”表示微泡内的核酸量以及核酸变体。具体地，遗传畸变包括但不限于基因(例如，致癌基因)或一组基因的过表达、基因(例如，肿瘤抑制基因如p53或RB)或一组基因的欠表达(under-expression)、基因或一组基因拼接变体的替代生产、基因拷贝数变体(CNV)(例如，DNA双微体(double minutes))(Hahn，1993)、核酸修饰(例如，甲基化、乙酰化和磷酸化)、单核苷酸多态性(SNP)、染色体重排(例如，倒转、缺失和重复)以及基因或一组基因的突变(插入、缺失、重复、错义、无义、同义或任何其他核苷酸变化)，在许多情况下，这些突变最终影响基因产物的活力和功能，导致产生替代性转录拼接变体和/或基因表达水平变化。
可以通过熟练技术人员已知的多种技术确定这些遗传畸变。例如，可以通过微阵列分析(美国专利No.6913879、7364848、7378245、6893837和6004755)和定量PCR确定核酸表达水平、替代性拼接变体、染色体重排和基因拷贝数。尤其是，可以使用Illumina Infinium II全基因组基因分型测定或Agilent人类基因组CGH微阵列检测拷贝数变化(Steemers et al.，2006)。可以通过，例如，美国专利No.7186512和专利公开WO/2003/023065中所描述的方法测定核酸修饰。具体地，可以通过Illumina DNA甲基化OMA003癌板(Illumina DNA Methylation OMA003 Cancer Panel)确定甲基化谱。可以通过使用等位基因特异探针的杂交、酶促突变检测、错配异源双链体(heteroduplex)的化学切割(Cotton et al.，1988)、错配碱基的核糖核酸酶切割(Myers et al.，1985)、质谱法(美国专利No.6994960、7074563和7198893)、核酸测序、单链构型多态性(SSCP)(Orita et al.，1989)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Fischer and Lerman，1979a；Fischer and Lerman，1979b)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)(Fischer and Lerman，1979a；Fischer and Lerman，1979b)、限制性片段长度多态性(RFLP)(Kan and Dozy，1978a；Kan and Dozy，1978b)、寡核苷酸连接测定(OLA)、等位基因特异性PCR(ASPCR)(美国专利No.5639611)、连接链反应(LCR)及其改变形式(Abravaya et al.，1995；Landegren et al.，1988；Nakazawa et al.，1994)、流式细胞异源双链分析(WO/2006/113590)以及它们的组合/改变形式来检测SNP和突变。显著地，可以通过基因表达系列分析(SAGE)技术确定基因表达水平(Velculescu et al.，1995)。一般地，在多个出版物中报道了分析遗传畸变的方法，它并不限于本文所引用的那些方法，并且这些方法对熟练专业人员来说是可用的。适当的分析方法将取决于具体的分析目标、患者的病况/病史以及要检测、监测或治疗的特定的癌、疾病或其他医学病况。以上参考文献以其对这些方法的教导通过引用并入本文。
已鉴别出导致和/或有助于癌初始产生或发展的各种各样的遗传畸变。在表4(不同类型的癌)和表6(胰腺癌)中提供了通常在癌中上调(即过表达)的基因的实例。表8中提供了在脑肿瘤中上调的微小RNA的实例。在本发明的一种实施方式中，表4和/或表6中所列的基因以及表8中所列的微小RNA的核酸表达水平提高。表5(不同类型的癌)和表7(胰腺癌)中提供了通常在癌中下调(例如，欠表达)的基因的实例。表9中提供了在脑肿瘤中下调的微小RNA的实例。在本发明的一种实施方式中，表5和/或表7中所列的基因以及表9中所列的微小RNA的核酸表达水平降低。在(Furnari et al.，2007)中综述了通常在脑肿瘤中欠表达或过表达的基因的实例，并且该主题内容作为参考并入本文。对于脑肿瘤的发展，RB和p53通常为下调以降低它们的肿瘤抑制活力。因此，在这些实施方式中，可以使用其失调表达水平对癌类型特异的基因和/或微小RNA的核酸表达水平是否提高或降低，来指示受试者中是否存在该类型的癌。
同样地，还可以在来自受试者体液的微泡内分析核酸变体，例如，DNA或RNA修饰、单核苷酸多态性(SNP)和突变(例如，错义、无义、插入、缺失、重复)，其中的受试者包括怀孕的雌性动物，其中来源于胎儿的微泡可以存在于血清以及羊水中。表3提供了非限制性实例。在另一实施方式中，核苷酸变体位于EGFR基因中。在另一实施方式中，核苷酸变体为EGFRvIII突变/变体。在本领域中，术语“EGFR”、“表皮生长因子受体”和“ErbB1”可互换使用，例如，如在Carpenter的论文(Carpenter，1987)中所描述的。对于脑肿瘤的发展，RB、PTEN、p16、p21和p53经常突变以降低它们的肿瘤抑制活力。在Furnari等人的论文(Furnari et al.，2007)中讨论了特定形式脑肿瘤中的特异性突变的实例，并且该主题内容作为参考并入本文。
另外，最近已在一些正在进行的研究项目中鉴别出与癌有关的更多的遗传畸变。例如，癌症基因组谱(Cancer Genome Atlas，TCGA)计划正在探索与人癌症有关的基因组变化的谱图。该项目以及其他类似研究工作的结果已经发表并且作为参考并入本文(Jones et al.，2008；McLendon et al.，2008；Parsons et al.，2008；Wood et al.，2007)。具体地，这些研究项目已鉴别了在人成胶质细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和/或结直肠癌中的遗传畸变，如突变(例如，错义、无义、插入、缺失和重复)、基因表达水平变化(mRNA或微小RNA)、拷贝数变化和核酸修饰(例如，甲基化)。表11和表12(成胶质细胞瘤)、表13(胰腺癌)、表14(乳腺癌)和表15(结直肠癌)中列出了在这些癌中最经常突变的基因。这些基因中的遗传畸变，以及事实上在癌中含有任何遗传畸变的任何基因，均为可以选择用于通过本文所述方法诊断和/或监测癌的靶标。
通过对微泡内的核酸实施核苷酸变体筛选可以实现对一种或多种核苷酸变体的检测。根据熟练专业人员所确定必需或期望的，该筛选可以是宽泛的或狭窄的。它可以是宽泛的筛选(建立该筛选以检测已知与一种或多种癌或疾病状况有关的基因中的所有可能的核苷酸变体)。在怀疑或已知存在一种特定癌或疾病的情况下，则可以将所述筛选特定于该癌或疾病。一个实例为脑肿瘤/脑癌筛选(例如，建立该筛选以检测与脑癌各种临床特定亚型或该癌的已知抗药性或药物敏感性突变有关的基因中的所有可能核苷酸变体)。
在一种实施方式中，分析是微泡中存在的特定核酸的量(水平)的谱图，本文中称为微泡的“定量核酸谱”。在另一实施方式中，该分析是微泡(野生型以及变体)中存在的特定核酸种类的谱，本文中称为“核酸种类谱图”。本文中用于提及这些谱图类型的组合的术语为“遗传谱”，其提及对核苷酸物质、变体是否存在以及核酸水平是否提高或降低的确定。
一旦产生后，将微泡的这些遗传谱与健康正常个体中预期的或来源健康正常个体其他方面的那些遗传谱进行比较。谱图可以是基因组范围的谱图(建立该谱图以检测所有可能的表达基因或DNA序列)。它也可以是较狭窄的，如癌范围的谱图(建立该谱图以检测所有可能的基因或来源于该基因的核酸，或已知与一种或多种癌有关的基因)。在怀疑或已知存在一种特定癌的情况下，可以将谱图特定于该癌(例如，建立该谱图以检测所有可能的基因或来源于该基因并且与该癌的各种临床特定亚型或该癌已知抗药性或敏感性突变有关的核酸)。
可以由熟练专业人员选择要扩增和/或分析的核酸。可以扩增和/或分析外来体的全部核酸内含物或仅扩增和分析特定核酸的亚组，其中的核酸可能或怀疑受到所存在的疾病或其他医学病况(如癌)的影响。对所分析微泡核酸中的核酸畸变的鉴别可以用于诊断受试者是否患有疾病，如与该畸变有关的癌、遗传病或病毒感染。例如，对癌特异性基因的一种或多种核酸变体(例如，EGFRvIII突变)是否存在的分析可以指示该个体中癌的存在性。可替换地或另外地，对核酸针对癌特异性核酸水平的提高或降低的分析可以指示该个体中癌的存在性(例如，EGFR核酸的相对提高，或肿瘤抑制基因如p53的相对降低)。
在一种实施方式中，通过对微泡中核酸的分析检测了与疾病(如癌)有关的基因突变(例如，经由核苷酸变体，过表达或欠表达)，其中的核酸来源于细胞起源中的基因组本身或来源于通过病毒引入的外源基因。由于预期能够产生在疾病诊断和预后中有用的信息，因此该核酸序列可以是完整的或部分的。该序列对实际基因或转录序列可以是正义的或反义的。熟练专业人员将能够根据微泡中可能存在的正义或反义核酸来设计核苷酸差异的检测方法。许多这样的方法包括对核苷酸序列特异性的探针的使用，其中的核苷酸序列为直接侧连或含有核苷酸差异。具有基因序列和该基因内核酸变体位置的知识的熟练专业人员可以设计这样的探针。如本领域和本文中所述的，这样的探针可以用于分离、扩增和/或实际杂交以检测该核酸变体。
可以采用各种各样的方式来确定来自受试者的微泡内的核酸中是否存在特定核苷酸变体或多个变体。各种各样的方法可用于该分析，其包括，但不限于，PCR、用等位基因特异性探针的杂交、酶促突变检测、错配的化学切割、质谱法或DNA测序(包括微测序)。在特定的实施方式中，可以两种形式实施用等位基因特异性探针的杂交：1)结合到固相(玻璃、硅、尼龙膜)的等位基因特异性寡核苷酸和在溶液中的标记样本，如在许多DNA芯片应用中，或2)在溶液中的结合样本(通常为克隆的DNA或PCR扩增的DNA)和标记的寡核苷酸(等位基因特异性或短的以允许通过杂交测序)。诊断性测试可以包括通常在固体载体上的一组差异，其使得能够同时确定多于一个的差异。在另一实施方式中，确定微泡核酸中存在至少一种核酸差异需要单体型分析试验(haplotyping test)。确定单体型的方法是本领域技术人员已知的，例如在WO00/04194中。
在一种实施方式中，确定是否存在核酸变体涉及通过一些方法确定变体位点或多个位点(序列内的核酸与标准出现差异的确切位置)的序列，其中的方法例如为聚合酶链反应(PCR)、链终止DNA测序(美国专利No.5547859)、微测序(Fiorentino et al.，2003)、寡核苷酸杂交、焦磷酸测序(pyrosequencing)、Illumina基因组分析仪、深度测序、质谱法或其他核酸序列检测方法。用于检测核酸变体的方法是本领域熟知的并且在WO 00/04194中公开，该专利作为参考并入本文。在示例性方法中，诊断测试包括对所期望基因序列中跨过一个或多个已知变体的DNA或RNA(通常在将RNA转换为互补DNA之后)的片段进行扩增。接着，为了鉴别扩增片段中的核苷酸变体，对该扩增片段进行测序和/或进行电泳。
在一种实施方式中，本发明提供了一种对在如本文所述的分离的微泡核酸筛选核苷酸变体的方法。这可以通过例如PCR实现，或可替换地，可以在连接链式反应(LCR)中实现(Abravaya et al.，1995；Landegren et al.，1988；Nakazawa et al.，1994)。对于所关心基因中的点突变的检测，LCR可以是特别有用的(Abravaya et al.，1995)。LCR方法包括以下步骤：设计用于扩增靶序列的简并引物，该引物对应于与所关心基因对应的核酸的一个或多个保守区，使用从微泡获得的核酸作为模板用所述引物扩增PCR产物并分析该PCR产物。微泡核酸的PCR产物与对照样本(具有或不具有核苷酸变体)的比较指示该微泡核酸中的变体。根据对照，改变可以是微泡核酸中存在或不存在核苷酸变体。
可以使用能够按照扩增产物尺寸对它们进行分离的任何方法实施扩增产物分析，包括自动和手动凝胶电泳、质谱法等。
可替换地，可以使用SSCP、DGGE、TGGE、化学切割、OLA、限制性片段长度多态性以及杂交(例如，核酸微阵列)，基于序列差异性对扩增产物进行分析。
核酸分离、扩增和分析的方法对本领域技术人员来说是常规的，并且可以在，例如Molecular Cloning：A laboratory Manual(3-Volume Set)Ed.Joseph Sambrook、David W.Russel and Joe Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory，3rd edition(January 15，2001)，ISBN：0879695773中查找到方案的实例。PCR扩增中所使用方法的特别有用的方案来源是PCR Basics：From Background to Bench by Springer Verlag；1st edition(October 15，200)，ISBN0387916008。
由于已知肿瘤细胞以及一些正常细胞将微泡脱落到体液中并且如本文所证明的，这些微泡内的遗传畸变反映了肿瘤细胞内的畸变，因此可以利用微泡来实施自肿瘤活检样本上进行的多种诊断方法。此外，使用微泡的诊断方法具有直接在肿瘤活检样本上实施的诊断方法所不具有的特征。例如，与肿瘤/癌核酸采样的其他形式不同，微泡核酸分析的一个具体优势是对来源于个体中肿瘤或遗传学非均匀肿瘤所有病灶的肿瘤/癌核酸进行分析的可利用性。活检样本是受限的，因为它们仅提供关于获得的活组织检查的肿瘤的特定病灶的信息。体内或甚至单个肿瘤内发现的不同肿瘤/癌性病灶经常具有不同的遗传谱并且在标准活组织检查中得不到分析。然而，对来自个体的微泡核酸的分析估计可能提供个体内所有病灶的采样。这提供了有关推荐治疗、治疗有效性、疾病预后和疾病复发分析的重要信息，而简单的活组织检查不能提供这些信息。
通过本文所描述的方法，对与特定疾病和/或医学病况有关的遗传畸变的鉴别也可以用于诊断患有疾病或其他医学病况(如癌)的个体的预后和治疗决定。疾病和/或医学病况的遗传基础的鉴别提供了指导治疗该疾病和/或医学病况的有用信息。例如，已证明化学疗法的多种形式对具有特定遗传异常/畸形的癌更有效。一个实例为使用如激酶抑制剂吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)的药物靶向治疗EGFR的有效性。已表明这样的治疗对EGFR基因在EGFR蛋白激酶结构域中具有特定核苷酸突变的癌细胞更有效(美国专利公开20060147959)。换言之，在EGFR核酸信息的激酶结构域中存在至少一个鉴别的核苷酸变体，表明患者可能受益于使用EGFR靶向化合物吉非替尼或厄洛替尼的治疗。由于已经证明从体液中的微泡分离出了肿瘤来源的EGFR转录本，因此可以通过本文所述的方法在微泡中存在的核酸中鉴别这样的核苷酸变体。
还发现其他基因中的遗传畸变影响治疗有效性。如在Furnari等人的出版物(Furnari et al.，2007)中所公开的，在各种各样的基因中的突变影响在治疗脑肿瘤的化学疗法中使用的特定药物的有效性。对微泡内核酸中的这些遗传畸变的鉴别将指导适当治疗计划的选择。
同样地，本发明的多个方面涉及用于监测受试者的疾病(例如，癌)发展的方法，还涉及用于监测个体的疾病复发的方法。这些方法包括以下步骤：如本文所讨论的从个体体液中分离微泡，并且如本文所讨论的分析微泡内的核酸(例如，形成该微泡的遗传谱)。使用某个遗传畸变/谱的存在性/不存在性来指示如本文所讨论的受试者中该疾病(例如，癌)的存在性/不存在性。随时间周期性地实施该过程并检查结果以监测该疾病的发展或消退，或确定该疾病的复发。换句话说，遗传谱的变化表明受试者的疾病状态的变化。从受试者中采集微泡样本以进行微泡分离和分析之间花费的时间段将取决于受试者的情况并且由熟练的专业人员决定。当分析来自与受试者所进行的疗法有关的基因的核酸时，这样的方法将证明是极其有利的。例如，可以监测该疗法所靶向的基因的突变发展，其中的突变使其对疗法产生耐受性，此时可以相应地改变疗法。所监测的基因还可以是指示对特定疗法产生特定反应的基因。
本发明的多个方面还涉及这样的事实，即各种各样的非癌性疾病和/或医学病况也具有遗传联系和/或原因，并且这样的疾病和/或医学病况同样可以通过本文所述的方法进行诊断和/或监测。许多这样的疾病在本质上为代谢性、传染性或退变性的。一种这样的疾病为糖尿病(例如，尿崩症)，其中加压素2型受体(V2R)发生改变。另一种这样的疾病为肾纤维化，其中胶原、纤连蛋白和TGF-β的基因的遗传谱发生改变。通过本文所述的方法同样可以检测由于药物滥用(例如，类固醇或药物使用)、病毒和/或细菌感染以及遗传病状态所造成的遗传谱的变化。
本文所描述的发明可应用的疾病或其他医学病况包括，但不限于，肾病、尿崩症、I型糖尿病、II型糖尿病、肾病性肾小球肾炎、细菌或病毒性肾小球肾炎、IgA肾病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein Purpura)、膜性增生性肾小球肾炎、膜性肾病、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、肾病综合征微小病变性疾病、局灶性肾小球硬化症及相关病症、急性肾衰竭、急性小管间质性肾炎、肾盂肾炎(pyelonephritis)、泌尿生殖道炎性疾病(GU tract inflammatory disease)、初期子巅(Pre-clampsia)、肾移植排斥、麻疯病、反流性肾病(reflux nephropathy)、肾石病、遗传性肾病、髓质囊性病(medullar cystic)、髓状海绵病(medullar sponge)、多囊性肾病、常染色体显性多囊性肾病、常染色体隐性多囊性肾病、结节性硬化、希林二氏病(von Hippel-Lindau disease)、家族性肾小球薄基底膜病、III型胶原肾小球病、纤连蛋白肾小球病、阿尔波特氏综合征(Alport′s syndrome)、法布里病(Fabry′s disease)、指甲膝盖综合征(Nail-Patella Syndrome)、先天性泌尿异常、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、淀粉样变性病和相关病症、热性疾病、家族性地中海热、HIV感染-AIDS、炎性疾病、系统性血管炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)、多动脉炎、坏死性和新月体肾小球肾炎、多肌炎-皮肤肌炎、胰腺炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、痛风、血液病症、镰刀细胞病、血栓性血小板减少性紫癜、范科尼综合征(Fanconi′s syndrome)、移植、急性肾损伤、过敏性肠道综合征、溶血尿毒症综合征、急性肾皮质坏死、肾血栓、创伤和手术、大面积损伤、燃烧、腹部和血管手术、麻醉诱发、药物使用或药物滥用的副作用、循环疾病性心肌梗塞、心力衰竭、周围性血管疾病、高血压、冠心病、非动脉粥样硬化性心血管疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病、皮肤病、牛皮癣、系统性硬化病、呼吸道疾病、COPD(慢性阻塞性肺病)、阻塞性睡眠呼吸暂停、高海拔缺氧症或内分泌病、肢端肥大症、糖尿病或尿崩症。
根据对多种因素中的一个或多个的分析，由熟练的专业人员对分离微泡的个体进行选择。所考虑的这些因素为受试者是否具有特定疾病(例如，癌)的家族史、是否对该疾病具有遗传易患性、是否由于家族史、遗传易患性、指示易患性的其他疾病或体征或环境原因而具有高患病风险。环境原因包括生活方式、对造成或有助于该疾病的试剂的暴露，如在空气、土地、水或饮食中暴露。另外，之前已患有该疾病、在治疗前或治疗后诊断为该疾病、目前正在治疗该疾病(正在进行疗法)以及正在从该疾病中缓解或恢复都是选择实施所述方法的个体的原因。
在分析步骤前，可选地利用选择基因或核酸以进行分析的其他额外步骤实施本文所描述的方法。这种选择可以基于受试者的任何易患性(趋向，predisposition)、或任何之前的暴露或诊断或受试者经历的或同时进行的治疗性治疗。
诊断、监测或其他方式测定谱图的癌可以是任何种类的癌。这包括但不限于上皮细胞癌，如肺、卵巢、子宫颈、子宫内膜、乳腺、脑、结肠和前列腺癌。还包括胃肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖泌尿癌和膀胱癌、黑素瘤和白血病。另外，本发明的方法和组合物同样可应用于个体中非恶性肿瘤的检测、诊断和预后(例如，神经纤维瘤、脑脊膜瘤和许旺氏细胞瘤)。
在一种实施方式中，所述癌为脑癌。在本领域中，脑肿瘤和脑癌的类型是熟知的。神经胶质瘤是由脑神经胶质(支持性的)组织引起的肿瘤的通称。神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤。星形细胞瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤以及两种或更多种细胞类型混合的肿瘤(称作混合性胶质细胞瘤)是最常见的神经胶质瘤。以下是脑肿瘤的其他常见类型：听神经瘤(神经鞘瘤、许旺氏细胞瘤、神经鞘瘤(Neurinoma))、腺瘤、星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、巨细胞星形细胞瘤、中级和高级星形细胞瘤、再发性肿瘤、脑干神经胶质瘤、脊索瘤、脉络丛乳头状瘤、CNS淋巴瘤(原发性恶性淋巴瘤)、囊肿、皮样囊肿、表皮样囊肿、颅咽管瘤、室管膜瘤、间变性室管膜瘤、神经节细胞瘤(节细胞神经瘤)、神经节神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM)、恶性星形细胞瘤、神经胶质瘤、成血管细胞瘤、不宜手术的脑肿瘤、淋巴瘤、髓母细胞瘤(MDL)、脑膜瘤、转移性脑肿瘤、混合性胶质细胞瘤、神经纤维瘤、少突神经胶质瘤、视神经胶质瘤、松果体区肿瘤、垂体腺瘤、PNET(原始神经外胚层瘤)、脊髓肿瘤、亚室管膜瘤和结节性硬化(布尔讷维氏病(Bourneville′s Disease))。
除鉴别先前已知的核酸畸变(由于与疾病有关)之外，本发明的方法可以用于鉴别先前未鉴别的核酸序列/修饰(例如，转录后修饰)，所述核酸序列/修饰的畸变与某种疾病和/或医学病况有关。这是通过以下步骤完成的，例如，分析来自患有指定疾病/医学病况(例如，癌的临床类型和亚型)的一位或多位受试者体液的微泡内的核酸并且与未患有给定疾病/医学病况的一位或多位受试者的微泡内的核酸进行比较以鉴别它们核酸内含物的差异。该差异可以是任何遗传畸变，其包括但不限于，核酸的表达水平、可替换的拼接变体、基因拷贝数变体(CNV)、核酸的修饰、单核苷酸多态性(SNP)和核酸突变(插入、缺失或单核苷酸改变)。一旦对某种疾病鉴别出了特定核酸遗传参数的差异，则可以进行涉及临床和统计显著数目的受试者的进一步研究以建立该特定核酸遗传畸变与该疾病之间的相关性。如熟练专业人员所确定为适当的，可以通过本文所描述的一种或多种方法进行遗传畸变分析。
作为递送载体的外来体
本发明的多个方面还涉及本文所述的实际微泡。在一种实施方式中，本发明是一种如本文所描述的分离的微泡，其分离自个体。在一种实施方式中，通过个体脑内的细胞(例如，肿瘤或非肿瘤细胞)产生了微泡。在另一实施方式中，如本文所述的，从个体体液分离了微泡。本文描述了分离方法。
本发明的另一个方面涉及以下发现，即从人成胶质细胞瘤细胞中分离的微泡含有mRNA、miRNA和血管生成蛋白。原代人脑内皮细胞经由内吞机制吸收这样的成胶质细胞瘤微泡，并且在那些细胞中翻译掺入到该微泡中的报告蛋白mRNA。这表明微泡所传递的信息可以改变靶细胞(吸收微泡的细胞)的遗传和/或翻译谱。所述微泡还含有已知在成胶质细胞瘤中含量富含的miRNA(Krichevskyet al，manuscript in preparation)。因此，来源于成胶质细胞瘤肿瘤的微泡可以作为mRNA、miRNA和蛋白质的递送载体起作用，其可以经由递送特定mRNA物质而改变其他细胞的翻译状态、促进内皮细胞的血管生成并且刺激肿瘤生长。
在一种实施方式中，在将供体受试者体液递送到受体受试者前，将微泡从所述体液中消除。供体受试者可以是具有不可检测的肿瘤的受试者，并且体液中的微泡来源于肿瘤。由于微泡中的遗传材料和蛋白质可以促使受体受试者中细胞无限制的生长，因此如果不除去供体体液中的肿瘤微泡，则它们将是有害的。
同样，本发明的另一个方面为本文所鉴别的微泡将核酸递送到细胞的应用。在一种实施方式中，细胞位于个体的体内。该方法包括将含有核酸的微泡或产生这样的微泡的细胞给予个体以使微泡接触和/或进入该个体的细胞。将核酸递送至其的细胞称为靶细胞。
可以遗传改造微泡以含有其天然不包含的核酸(即，对微泡正常内含物来说是外源的)。这可以通过将核酸物理插入到微泡中来完成。可替换地，可以遗传改造细胞(例如，在培养基中生长的细胞)以将一个或多个特定核酸靶向至外来体中，并且可以从该细胞分离外来体。可替换地，可以将遗传改造的细胞本身给予所述个体。
在一种实施方式中，产生用于给予的外来体的细胞与靶细胞在体内具有相同或类似的来源或位置。也就是说，对于将微泡递送到脑细胞来说，产生微泡的细胞将是脑细胞(例如，在培养基中生长的原代细胞)。在另一实施方式中，产生外来体的细胞与靶细胞相比为不同的细胞类型。在一种实施方式中，产生外来体的细胞为在体内位于靶细胞附近的类型。
可以经由外来体被递送至细胞的核酸序列可以是RNA或DNA，并且可以是单链或双链的，并且可以选自包括以下的组：编码所关心蛋白质的核酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如，肽-核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)等。这些核酸序列包括，例如，但是不局限于，编码蛋白质的核酸序列(例如，作为翻译抑制物的蛋白)、反义分子、核糖酶、小抑制性核酸序列、例如，但是不局限于RNAi、shRNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸和它们的组合。
将从细胞类型中分离的微泡递送到受体受试者。所述微泡可能使受体受试者医学上受益。例如，肿瘤外来体的血管生成和前增殖(pro-proliferation)作用可能有助于受体受试者中受损组织的再生。在一种实施方式中，递送方式为通过体液输注，其中在将来自供体受试者的体液递送到受体受试者前，将微泡加入到所述体液中。
在另一实施方式中，微泡是适合给予给受试者(例如，本文所述方法中的受试者)的成分(例如，药用制剂中的活性成分)。通常，这包括用于活性成分的药用载体。具体载体将取决于多种因素(例如，给药途径)。
“药用载体”是指混合靶向递送组合物和/或将其递送至受试者的任何药学上可接受的方式。这包括药用材料、组合物或载体，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，涉及将主题试剂从一个器官或身体部分携带或递送到另一个器官或身体部分。每种载体必须是在与制剂其他成分相容的意义上是“可接受的”并且与对受试者(例如，人)给药是兼容的。
对受试者的给药可以是系统的或局部的。这包括但不限于，通过将活性化合物递送至受试者中所期望位置的任何适合途径，将活性化合物(例如，药物制剂中的)分散、递送或施加至受试者，包括通过肠胃外或口服途径、肌肉注射、皮下/皮内注射、静脉注射、含服给药、透皮递送以及通过直肠、结肠、阴道、鼻内或者呼吸道途径施用等方式给药。
应理解，本发明不局限于本文中所描述的特定方法、方案和试剂，并且同样可以改变。本文中所使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不用于限制本发明的范围，该范围仅由本发明的权利要求限定。
在一个方面，本发明涉及本文中所描述的组合物、方法及其各自的成分，它们对本发明是必要的，但是对未指明元件(组分，element)的包括是开放的，必要或不必要的(“包括”)。在一些实施方式中，要包括在所述组合物、方法或它们各自成分的描述中的其他元件限于不实质性地影响本发明的基本和新颖特征的那些元件(“基本由...组成”)。这同样适用于所描述的方法的步骤以及其中的组合物和成分。在其他实施方式中，本文中所描述的发明、组合物、方法和它们各自的成分用来排除认为不是该成分、组合物或方法的必要要素的任何元件(“由...组成”)。
实施例
实施例1-7：肿瘤细胞脱落的微泡，其含有RNA，包括mRNA和微小RNA，并且这些微泡含有体液中超过90％的胞外RNA。
实施例1：从原代人成胶质细胞瘤细胞脱落的微泡。
通过手术切除术获得成胶质细胞瘤组织，解离肿瘤细胞并进行单层培养。具体地，直接从手术中取得来自由神经病理学家诊断为多形性成胶质细胞瘤的患者的脑肿瘤试样并将其置于冷的无菌神经基础培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。在手术后1小时内使用神经组织解离试剂盒(Miltenyi Biotech，Berisch Gladbach，Germany)将该试样解离成单细胞并在添加了青霉素-链霉素(分别为10IU mL-1和10μg mL-1，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)的DMEM 5％dFBS上铺板。由于在通常用于培养细胞的胎儿牛血清(FBS)中可以找到微泡并且这些微泡含有相当大量的mRNA和miRNA，因此使肿瘤细胞在含有除去了微泡的FBS(dFBS)的培养基中生长是重要的。发现培养的获自三种成胶质细胞瘤肿瘤的原代细胞在早期传代和晚期传代产生微泡(传代是根据细胞分裂所定义的细胞代，它是常见的细胞培养技术并且是保持细胞存活所必需的)。通过扫描电子显微镜(图1a和1b)以及透射电子显微镜(图1f)能够检测微泡。简要地说，将人成胶质细胞瘤细胞置于鸟氨酸涂敷的盖片上，并用0.5×Karnovskys固定剂固定，然后用PBS清洗2×5分钟(清洗两次，每次5分钟)。细胞在35％EtOH 2×10min、50％EtOH 2×10min、70％EtOH 2×10min、95％EtOH 2×10min、以及100％EtOH 4×10min中脱水。然后将这些细胞转移到Tousimis SAMDR1-795半自动临界点干燥器中进行临界点干燥(critical point drying)，接着在GATAN 618型高分辨离子束涂布器中用铬涂覆。如图1a和1b所示，用尺寸在约50-500nm变化的微泡覆盖肿瘤细胞。
实施例2：成胶质细胞瘤微泡含有RNA。
为了分离微泡，将第1-15代的成胶质细胞瘤细胞在不含微泡的培养基(含有5％dFBS的DMEM，其中dFBS是通过在110,000×g超离心16小时以除去牛微泡制备的)中培养。48小时后，收获了来自4000万细胞的条件培养基。通过差速离心纯化微泡。具体地，将成胶质细胞瘤条件培养基在300×g离心10分钟以消除任何细胞污染物。将上清液在16500×g进一步离心20分钟，并通过0.22μm过滤器(或滤膜)过滤。接着，以110,000×g超离心70分钟使微泡成颗粒(或沉淀)。将微泡颗粒在13ml的PBS中清洗，再次成粒并重新悬浮于PBS中。
使用DC蛋白质测定(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测量分离的微泡的总蛋白质含量。
对于RNA从微泡中的提取来说，将最终浓度为100μg/ml的RNA酶A(Fermentas，Glen Burnie，MD，USA)加入微泡悬液并在37℃培育15分钟以除去微泡外部的RNA，从而确保所提取的RNA来自微泡的内部。接着，根据生产商的规程使用MirVana RNA分离试剂盒(Ambion，Austin TX，USA)从微泡提取总RNA。根据生产商的规程用DNA酶处理后，使用纳滴(nanodrop)ND-1000仪(Thermo Fischer Scientific，Wilmington，DE，USA)对总RNA进行定量。
发现成胶质细胞瘤微泡含有RNA和蛋白质，其比值为约1∶80(μg RNA∶μg蛋白质)。在培养的48小时时间后，从微泡中分离的蛋白质和RNA的平均得率为约4μg蛋白质和50ngRNA/百万细胞。
为了证实RNA包含在微泡内部，将微泡暴露于RNA酶A或在RNA提取前进行模拟处理(图1c)。用RNA酶处理后，RNA含量的减少从未超过7％。因此，看起来几乎所有来自培养基的胞外RNA都包含在微泡内，并因而通过周围的液胞膜而保护所述RNA不受外部RNA酶的作用。
使用生化分析仪(Bioanalyzer)分析来自微泡及其供体细胞的总RNA，表明微泡包含与各种各样的mRNA和miRNA相一致的宽范围的RNA尺寸，但是缺乏18S和28S(细胞RNA的核糖体RNA特征峰)(图1d和1e)。
实施例3：微泡含有DNA。
为了测试微泡是否还含有DNA，如实施例2所提到的，分离外来体，然后在细胞溶解以释放内含物前用DNA酶进行处理。DNA酶处理步骤是为了除去外来体外部的DNA以使只提取存在于该外来体内部的DNA。具体地，使用购自Ambion的不含DNA的试剂盒按照生产商的建议(产品号#AM1906)进行DNA酶处理。对于DNA纯化步骤，将分离外来体的等分试样在作为MirVana RNA分离试剂盒(Ambion)一部分的300μl溶胞缓冲液中溶解，并且按照生产商的建议使用DNA纯化试剂盒(Qiagen)从细胞溶解混合物中纯化DNA。
为了检查所提取的DNA中是否含有常见的基因，使用对GAPDH、人内源性反转录病毒K、腱糖蛋白-c和系-1(Line-1)特异的引物对进行PCR。对于GAPDH基因，使用下列引物：正向3GAPDH新(Forw3GAPDHnew)(SEQ ID NO：1)和反向3GAPDH新(Rev3GAPDHnew)(SEQ ID NO：2)。如果模板为拼接GAPDHcDNA，则该引物对扩增112bp的扩增子，如果模板为未拼接基因组GAPDH DNA，则该引物对扩增216bp的扩增子。在一个实验中，在细胞溶解以进行DNA提取前，用DNA酶处理分离的外来体(图3a)。如所预期的，从来自肿瘤血清(参见图3a中的泳道4)和原代肿瘤细胞(参见图3a中的泳道6)的外来体扩增了所述112bp片段，但是未从来自正常人成纤维细胞的外来体(参见图3a中的泳道5)扩增。不能从所有三种来源的外来体扩增所述216bp片段。但是，当使用从成胶质细胞瘤细胞分离的基因组DNA作为模板时，112bp和216bp片段均得到扩增(参见图3a中的泳道3)。因此，拼接的GAPDH DNA存在于分离自肿瘤细胞的外来体内，但是不存在于分离自正常成纤维细胞的外来体内。
相反，在另一实验中，在细胞溶解以进行DNA提取前，分离的外来体没有用DNA酶处理(图3b)。从分离自原代黑素瘤细胞的外来体不但扩增了所述112bp片段，而且也扩增了所述216bp片段(参见图3b中的泳道3)，表明外来体外部存在已经被反转录的非拼接GAPDH DNA或部分拼接的cDNA。
对于人内源性反转录病毒K(HERV-K)基因，使用下列引物：HERVK_6正向(HERVK_6Forw)(SEQ ID NO：3)和HERVK_6反向(HERVK_6Rev)(SEQ ID NO：4)。引物对扩增172bp扩增子。从被分离并用DNA酶处理的外来体提取DNA，并将其用作用于PCR扩增的模板。如图3c所示，在所有肿瘤和正常人血清外来体中扩增了172bp片段，但是未在正常人成纤维细胞的外来体中扩增。这些数据表明与来自正常人成纤维细胞的外来体不同，肿瘤和正常人血清外来体含有内源性反转录病毒DNA序列。为了检查肿瘤外来体是否还含有转座元件，使用下列细胞系-1特异性引物进行PCR扩增：细胞系1正向(Line1_Forw)(SEQ ID NO：5)和细胞系1_反向(Line1_Rev)(SEQ ID NO：6)。由于每种引物含有等量的两种不同的寡核苷酸，因此这两种引物被设计用于检测所有物质中的细胞系-1。对于细胞系1_正向引物，在用“s”表示的位置处，一个寡核苷酸包含C而另一个寡核苷酸包含G。对于细胞系1_反向引物，在用“r”表示的位置处，一个寡核苷酸包含A而另一个寡核苷酸包含G。该引物对扩增290bp扩增子。模板为从用DNA酶(如上所述)处理的外来体中提取的DNA。如图3e所示，可以从来自肿瘤细胞和正常人血清的外来体扩增290bp的细胞系-1片段，但是不能从来自正常人成纤维细胞的外来体中扩增。
为了测试外来体是否还含有腱糖蛋白-C DNA，使用下列引物对进行PCR：腱糖蛋白C正向(Forw)(SEQ ID NO：7)和腱糖蛋白C反向(Rev)(SEQ ID NO：8)。该引物对扩增197bp扩增子。模板为从被分离并接着在细胞溶解前用DNA酶处理的外来体中提取的DNA。如图3d所示，在来自肿瘤细胞或正常人血清的外来体中扩增了197bp的腱糖蛋白C片段，但是没有在正常人成纤维细胞的外来体中扩增。因此，腱糖蛋白C DNA存在于肿瘤和正常人血清外来体中，而不存在于正常人成纤维细胞外来体中。
为了进一步证实外来体中DNA的存在，使用如上所述的方法从D425髓母细胞瘤细胞提取外来体DNA。具体地，分离外来体，并在细胞溶解前用DNA酶处理。在通过1％琼脂糖凝胶中用溴化乙锭染色进行可视化前，用DNA酶处理或不用DNA酶处理等体积的最终DNA提取物。溴化乙锭是对核酸特异性染色的染料并且可以在紫外光下可视化。如图3f所示，DNA酶处理后溴化乙锭染色消失(参见图3f中的泳道3)，而在未处理等分试样中可以可视化强染色(参见图3f中的泳道2)。还在RNA皮可芯片(Agilent Technologies)上分析用和未用DNA酶处理的提取物。如图3g所示，可以容易地在未用DNA酶处理的提取物中检测到单链DNA(参 见图3g的上图)，但是在使用DNA酶处理的提取物中几乎不能检测到(参见图3g的下图)。
为了测试所提取的DNA是否为单链，如上一段所述的，从处理的外来体提取核酸并进一步用RNA酶处理以去除任何RNA污染物。接着，在RNA皮可生化分析仪芯片(RNA pico Bioanalyzer cihp)和DNA 1000芯片上分析处理的核酸。RNA皮可芯片仅检测单链核酸。DNA 1000芯片检测双链核酸。如图3h所示，检测到单链核酸(参见上图)，但是未检测到双链核酸(参见下图)。因此，包含在肿瘤外来体内的DNA主要为单链DNA。
为了证明单链DNA存在于肿瘤细胞中但不存在于正常人成纤维细胞中，从来自成胶质细胞瘤患者血清或正常人成纤维细胞的外来体中提取核酸。细胞溶解前用DNA酶处理外来体，并在分析前用RNA酶处理纯化的核酸。如图3i所示，通过RNA皮可芯片可以检测从成胶质细胞瘤患者血清提取的外来体核酸。相反，从正常人成纤维细胞中仅提取了极少量的单链DNA。
因此，发现来自肿瘤细胞和正常人血清的外来体含有单链DNA。由于扩增产物不含有内含子，因此所述单链DNA是反转录产物(图3a和图3b)。已经知晓，肿瘤细胞以及正常祖细胞/干细胞具有活性反转录酶(RT)活力，尽管正常祖细胞/干细胞中反转录酶活力相对地低得多。这种RT活力使得以下结论似乎是合理的，即可以反转录细胞中的RNA转录本并将其作为cDNA包装到外来体中。令人感兴趣地，由于肿瘤细胞通常具有上调的反转录酶活力，因此来自肿瘤细胞的外来体含有更多的对应于肿瘤特异性基因转录本的cDNA。因此，外来体中的肿瘤特异cDNA可以用作不同肿瘤类型的诊断或预后的生物标志物。与使用mRNA作为肿瘤生物标志物相比，使用cDNA作为生物标志物将省去反转录步骤。另外，由于血清/血浆含有从要死亡的细胞释放的基因组DNA，因此相对于全血清/血浆DNA的使用，外来体cDNA的使用是有利的。当测试扩增的全血清/血浆DNA时，将有更多背景。
实施例4：人血清中的大多数胞外RNA包含在外来体内。
为了确定在血清中作为“游离RNA”/RNA蛋白复合体循环的RNA量相对于包含在外来体内的RNA量，我们从健康人受试者中分离了血清，并将该血清均匀分成体积相等的两个样本。对于样本1，对该血清超离心以除去大部分微泡。然后，收集血清上清液并使用Trizol LS提取该上清液中留下的RNA。对于样本2，不对该血清进行超速离心，而是使用Trizol LS从血清中提取总RNA。测量样本1上清液中和样本2血清中的RNA的量。作为结果，发现样本1上清液中游离RNA的量小于从血清样本2中分离的总RNA量的10％。因此，血清中大部分RNA与外来体有关。
实施例5：通过增加血清外来体分离步骤实现高效的血清胞外核酸提取。
全血清和血浆含有大量循环的DNA并且可能还含有在蛋白质复合体中受到保护的RNA，而血清中游离RNA的半衰期为几分钟。正常和患病哺乳动物血清中的胞外核酸谱不同，因此它们可以作为某些疾病的生物标志物。为了检查该谱，需要提取核酸。然而，从血清和血浆中直接提取核酸是不实际的，特别是对于从大体积的血清/血浆中提取。这种情况下，在提取外来体核酸前，使用大量的Trizol LS(一种RNA提取试剂)使所有血清核酸酶立即失活。随后，污染物沉淀到样本中并影响随后的分析。如实施例4所示，血清中大部分胞外RNA包含在血清外来体中。因此，我们测试了通过在核酸提取前分离血清外来体是否更有效地分离胞外核酸。
将来自患者的4毫升(mL)血清分成2个2ml的等分试样。在RNA提取前分离来自一个等分试样的血清外来体。外来体分离和RNA提取的方法与实施例2中所提到的相同。对于另一等分试样，根据生产商的建议直接使用Trizol LS提取RNA。在生化分析仪RNA芯片(Agilent Technologies)上分析了来自这两种提取的核酸。如图4所示，使用前一种方法提取的RNA的量显著高于后一种方法所获得的量。另外，后一种方法提取的RNA的质量比前一种方法的质量相对较差。因此，外来体分离步骤有助于有效地从血清提取胞外RNA。
实施例6：mRNA的微阵列分析。
使用Agilent全人类基因组微阵列(4×44k，双色阵列)，通过Miltenyi Biotech(Auburn，CA，USA)对成胶质细胞瘤细胞和来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡中的mRNA群体进行微阵列分析。对如实施例1和2中所述制备的来自原代成胶质细胞瘤细胞的两种不同RNA制备物以及它们相应的微泡RNA制备物进行微阵列分析。使用GeneSifter软件(Vizxlabs，Seattle，WA，USA)分析数据。使用Intersector软件(Vizxlabs)提取两种阵列上易于检测的基因。已将微阵列数据存放在NCBI基因表达汇编(Gene Expression Omnibus)中，并且通过GEO系列登记号GSE13470可访问。
我们发现在两种阵列上在细胞中有约22,000个基因转录本的检测水平大大高于背景水平，而在微泡中有约27,000个基因转录本的检测水平大大高于背景水平(99％置信区间)。在两种阵列上，有约4700个不同的mRNA是仅在微泡中检测到的，这表明了微泡内的选择性富集过程。与此一致的是，相比于来自两种肿瘤细胞制备物的起源细胞，微泡中的mRNA水平存在较差的整体相关性(图2a和2b)。相反，来自一个细胞培养物(A)的mRNA水平对第二细胞培养物(B)具有较好的相关性(图2c)，并且在来自相应微泡(A)和(B)的mRNA水平中也存在类似的相关性(图2d)。因此，肿瘤细胞和微泡内的mRNA分布具有一致性。通过比较微泡中转录本与它们的起源细胞的转录本的比值，我们发现有3426个转录本分布的差异超过了5倍(p值＜0.01)。这些之中，与细胞中的相比，有2238个转录本为富集的(高达380倍)而有1188个转录本的丰度较小(高达90倍)(图5)。记录了所有基因转录本的强度和比值。记录并检查了提高或降低超过10倍的mRNA转录本的本体。
在微泡中高度富集的mRNA转录本并非总是在微泡中最丰富的那些。一旦递送，含量最丰富的转录本更可能会在受体细胞中产生作用，因此，基于它们的本体描述，将微泡中存在的含量最丰富的500个mRNA转录本分成不同的生物学过程(图6a)。在各种本体中，由于代表了可以参与重建肿瘤间质和提高肿瘤生长的特定功能，因此选择血管生成、细胞增殖、免疫反应、细胞迁移和组蛋白修饰进行进一步研究。对属于这五种本体(存在论，ontology)的成胶质细胞瘤微泡mRNA作图以比较它们的水平以及对mRNA谱的贡献(图6b)。与阵列的中间信号强度水平相比，所有五种本体均包含具有极高表达水平的mRNA。
对与供体细胞相比在微泡中富含的mRNA的全面分析，表明可能存在将这些信息定位到微泡中的细胞机制，该机制可能是经由如对在特定细胞位置中翻译的mRNA(如对β肌动蛋白)所描述的3′UTR中的“区位编码(zip code)”进行的(Kislauskis et al.，1994)。微泡中mRNA的构象是未知的，但是它们可以作为核糖核酸颗粒(RNP)存在(Mallardo et al.，2003)，该颗粒然后在供体细胞中会防止降解和过早翻译。
使用全基因组cDNA介导的退火、选择、延伸和连接(DASL)测定，通过Illumina Inc.公司(San Diego，CA，USA)对成胶质细胞瘤细胞和来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡、黑素瘤细胞和来源于黑素瘤细胞的微泡进行了mRNA群体微阵列分析。全基因组DASL测定将Illumina DASL测定的PCR和标记步骤与基于基因的杂交和Illumina的HumanRef-8珠芯片(BeadChip)的全基因组探针组相结合。这种珠芯片覆盖了来源于RefSeq(工作版本36.2(Build 36.2，发行号22(Release 22))的超过24,000种注释基因。对从原代成胶质细胞瘤细胞、来自成胶质细胞瘤细胞的微泡(用实施例1和2中所述的方法获得)、黑素瘤细胞和来自黑素瘤细胞的微泡(用实施例1和2中所述的方法获得)获得的两种不同RNA制备物进行微阵列分析。
将每种RNA制备物的表达数据收集在一起并用于产生聚簇图(cluster diagram)。如图7所示，分别将成胶质细胞瘤细胞、来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡、黑素瘤细胞和来源于黑素瘤细胞的微泡的mRNA表达谱聚集。以约0.06的距离将两种原代成胶质细胞瘤细胞系20/3C和11/5C的表达谱聚簇。以约0.09的距离将两种原代黑素瘤细胞系0105C和0664C的表达谱聚簇。以约0.15的距离将来自两种原代黑素瘤细胞系0105C和0664C的外来体的表达谱一起聚簇。以约0.098的距离将来自两种原代成胶质细胞瘤细胞系20/3C和11/5C的外来体的表达谱一起聚簇。因此，来自成胶质细胞瘤和黑素瘤的外来体具有独特的mRNA表达标记图(expression signature)，并且外来体的基因表达标记图与它们的来源细胞的标记图不同。这些数据证明来自微泡的mRNA表达谱可以在本文所述的癌诊断和预后方法中使用。
实施例7：成胶质细胞瘤微泡含有miRNA
使用定量miRNA反转录PCR检测来自微泡和来自供体细胞的成熟miRNA。具体地，使用mirVana RNA分离试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)从微泡和供体细胞分离总RNA。使用
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微小RNA测定试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，使用特异性miR-引物将30ng总RNA转化为cDNA并根据生产商的规程进一步扩增。
在已知被上调并且在神经胶质瘤中含量丰富的那些miRNA中，在从两种不同原代成胶质细胞瘤(GBM 1和GBM 2)纯化的微泡中分析了11种miRNA的子集。该子集含有let-7a、miR-15b、miR-16、miR-19b、miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-92、miR-93、miR-320和miR-20。所有这些miRNA在供体细胞和微泡中易于检测(图8)。微泡中每μg总RNA的水平通常比亲本细胞中的低(10％，相当于约3Ct-值)，但是这些水平具有良好的相关性，表明这11种miRNA在微泡中的含量不高。
使用由DASL测定激励的微小RNA表达谱板(MicroRNAExpression Profiling Panel)，通过Illumina Inc.公司(San Diego，CA，USA)对成胶质细胞瘤细胞和来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡、黑素瘤细胞和来源于黑素瘤细胞的微泡中的微小RNA群组进行了微阵列分析。人微小RNA组包括1146种微小RNA。对来自原代成胶质细胞瘤细胞、来自成胶质细胞瘤细胞的微泡(使用实施例1和2中所述的方法获得)、黑素瘤细胞和来自黑素瘤细胞的微泡(使用实施例1和2中所述的方法获得)的两种不同RNA制备物进行微阵列分析。
将每种RNA制备物的表达数据收集在一起并用于产生聚簇图。如图9所示，分别将成胶质细胞瘤细胞、来源于成胶质细胞瘤细胞的微泡、黑素瘤细胞和来源于黑素瘤细胞的微泡的微小RNA表达谱一起聚簇。以约0.13的距离将两种原代黑素瘤细胞系0105C和0664C的表达谱聚簇。以约0.12的距离将两种原代成胶质细胞瘤细胞系20/3C和11/5C的表达谱聚簇。以约0.12的距离将来自两种原代成胶质细胞瘤细胞系20/3C和11/5C的外来体的表达谱一起聚簇。以约0.17的距离将来自两种原代黑素瘤细胞系0105C和0664C的外来体的表达谱一起聚簇。因此，来自成胶质细胞瘤和黑素瘤的外来体具有独特的微小RNA表达标记图，并且外来体的基因表达标记图与它们来源细胞的标记图不同。此外，如本文所证明的，来自微泡的微小RNA表达谱可以在本文所述的癌诊断和预后方法中使用。
微泡中微小RNA的发现表明来源于肿瘤的微泡可以通过改变它们的转录/翻译谱来更改周围的正常细胞。此外，如本文所证明的，来自微泡的miRNA表达谱可以在本文所描述的癌(包括，但不限于，成胶质细胞瘤)诊断和预后方法中使用。
实施例8-15：这些实施例表明来自体液的外来体内的核酸可以用作疾病或其他医学病况的生物标志物。
实施例8：微泡中miRNA的表达谱可以用作成胶质细胞瘤的敏感生物标志物。
为了确定外来体内的微小RNA是否可以用作疾病和/或医学病况的生物标志物，我们检查了微小RNA表达水平与疾病状态之间存在的相关性。由于在成胶质细胞瘤细胞中微小RNA-21以高水平表达并且在从成胶质细胞瘤患者血清中分离的外来体中易于检测，因此我们通过定量RT-PCR定量地测量了来自成胶质细胞瘤患者血清的外来体内微小RNA-21的拷贝数。具体地，从来自9位正常人受试者和9位成胶质细胞瘤患者的4ml血清样本中分离了外来体。RNA提取程序与实施例2中所描述的RNA提取程序类似。使用单重qPCR(Applied Biosystems)分析miR-21的水平并将其归一化为GAPDH表达水平。
如图10所示，成胶质细胞瘤血清样本中的平均Ct值低了5.98，表明成胶质细胞瘤患者中外来体miRNA-21的表达水平比正常人受试者中的高约63倍。该差异为统计学显著性的，其p值为0.01。因此，微小RNA-21表达水平和成胶质细胞瘤疾病状态之间具有相关性，这证明了本文公开的无创性诊断方法的有效性和适用性。例如，在一个方面，所述方法包括以下步骤：从受试者体液分离外来体，通过测量微小RNA-21的拷贝数分析外来体内的微小RNA-21表达水平，将所述拷贝数与来自正常受试者的外来体内的拷贝数或与通过分析来自一组正常受试者的外来体内的微小RNA-21的含量所产生的标准拷贝数相比较。拷贝数增加表明受试者中存在成胶质细胞瘤；而拷贝数未增加则表明受试者中不存在成胶质细胞瘤。可以将该基本方法推广到与其他种类的微小RNA有关的其他疾病和/或医学病况的诊断/监测。
实施例9：微泡中的mRNA可以用作诊断的敏感生物标志物
由于通过PCR方法能够高灵敏度地检测核酸，因此它们作为生物标志物具有较高的价值。因此，设计并实施了下列测试以确定微泡中的mRNA是否可以用作医学疾病或病况(在这种情况下是成胶质细胞瘤肿瘤)的生物标志物。由于EGFRvIII突变的表达对某些肿瘤是特异的并且限定了神经胶质瘤的不同临床亚型，因此选择了表皮生长因子受体(EGFR)mRNA(Pelloski et al.，2007)。另外，由于EGFRvIII突变为体细胞突变而不是种系突变，因此通常不能使用不同于病变组织以外的组织检测这些突变。因此，检测EGFRvIII突变通常需要对如神经胶质瘤肿瘤的损害组织进行活组织检查。如以下详细说明的，使用巢式RT-PCR鉴别神经胶质瘤肿瘤活检样本中的EGFRvIII mRNA，并将结果与从相同患者血清样本中纯化的微泡中所发现的mRNA种类进行比较。
从原代人成胶质细胞瘤细胞中纯化了微泡，然后从所述微泡和供体细胞(活组织检查)中提取RNA。对样本编码并以蒙眼方式(blind fashion)进行PCR。包括Gli-36EGFRvIII(稳定表达EGFRvIII的人神经胶质瘤细胞)作为阳性对照。如实施例2中所述，使来自0.5-2ml冷冻血清样本的微泡成颗粒，并使用MirVana微泡RNA分离试剂盒提取RNA。然后使用相同的引物组，通过巢式RT-PCR扩增来自微泡和供体细胞的野生型EGFR(1153bp)和EGFRvIII(352bp)转录本。具体地，按照生产商推荐的规程使用OmniscriptRT试剂盒(Qiagen Inc，Valencia，CA，USA)将RNA转化为cDNA。GAPDH引物为GAPDH正向引物(SEQ ID NO：9)和GAPDH反向引物(SEQ ID NO：10)。EGFR/EGFRvIII PCR1引物为SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12。EGFR/EGFRvIII PCR2引物为SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14。PCR循环方案为在94℃保持3分钟；在94℃保持45秒，60℃保持45秒，72℃保持2分钟，进行35个循环；以及最后一步为在72℃保持7分钟。
我们分析了活检样本以确定是否存在EGFRvIII mRNA并将结果与从相同患者冷冻血清样本中纯化的外来体中提取的RNA进行比较。30个肿瘤样本中有14个(47％)含有EGFRvIII转录本，这与在其他研究中所发现的包含该突变的成胶质细胞瘤的百分比一致(Nishikawa et al.，2004)。可以从大约在手术时间抽取血清的25位患者中的7位(28％)的外来体扩增EGFRvII(图11和表1)。当使用新引物对EGFR/EGFRvIII PCR3：SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16作为以上巢式PCR扩增的第二引物对时，发现了具有EGFRvIII突变的更多个体(表1)。可以从用旧引物对EGFRvIIIPCR2：SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14鉴别为阴性的6位患者的外来体中扩增EGFRvIII。值得注意地，活组织检查未显示EGFRvIII突变的个体13的外来体证实含有EGFRvIII突变，这表明使用外来体技术提高了EGFRvIII突变检测的灵敏度。不能从分离自52个正常对照血清样本的外来体扩增EGFRvIII(图12)。令人感兴趣地，具有EGFRvIII阴性肿瘤样本的两位患者在血清外来体中原来为EGFRvIII阳性，这支持神经胶质瘤肿瘤中的EGFRvIII表达是不均匀(不同种类，heterogeneous)的病灶。此外，我们的数据还显示，出乎意料地能够从成胶质细胞瘤患者的冷冻体血清中分离微泡中的完整RNA。来自证实为成胶质细胞瘤患者的这些蒙眼血清样本是从癌症研究中心(VU medical center，Amsterdam，the Netherlands)获得的，并且将它们保存在-80℃直至使用。血清微泡中的肿瘤特异性RNA的鉴别使得能够检测存在于肿瘤细胞中的体细胞突变。这样的技术应导致诊断和治疗决定的改善。
微泡中发现的RNA含有在给定时间的细胞基因表达谱的基本阵列的“快照(snapshot)”。在来源于成胶质细胞瘤的微泡中发现的mRNA中，由于EGFRvIII拼接变体特异地与成胶质细胞瘤相关，因此EGFR mRNA受到了特别的关注(Nishikawa et al.，2004)。这里证实了脑肿瘤将微泡释放到穿过血脑屏障(BBB)的血流中，这在之前是未被证实的。进一步证实了通过以下方法能够检测mRNA变体如脑肿瘤中EGFRvIII，所述方法包括从少量患者血清中分离外来体并分析所述微泡中的RNA。
在选择最佳治疗方案时，对肿瘤中EGFRvIII突变的认识是重要的。EGFRvIII-阳性神经胶质瘤对使用EGFR-抑制剂如厄洛替尼或吉非替尼进行治疗的响应可能性高了超过50倍(Mellinghoffet al.，2005)。
实施例10：铁代谢紊乱的诊断
如下列实施例所证实的，可以修整外来体诊断方法以适用于其他目的。
海帕西啶(一种抗菌肽)，是铁代谢的主要激素调节剂。这种肽主要在哺乳动物的肝脏中产生，并受骨髓促红细胞生成活性、循环和储存的体内铁含量以及炎症的控制。一旦受到刺激，海帕西啶将会被分泌到循环或尿中，在那里它可以作用于靶膜铁转运蛋白(ferropotin)表达细胞。膜铁转运蛋白是迄今为止鉴定出的唯一铁输出子(iron exporter)，并且当与海帕西啶结合时，它被内化并降解。所得到的膜铁转运蛋白的破坏导致铁保留在如巨噬细胞和肠上皮细胞的膜铁转运蛋白表达细胞中。这种病理生理机制在于慢性疾病的贫血。更具体地，贫血的特征在于海帕西啶不适当的高水平以及网状内皮组织系统内铁含量的升高。的确，贫血可能与多种疾病和/或医学病况有关，如感染(急性和慢性的)、癌、自体免疫、实体器官移植后的慢性排斥以及慢性肾病和炎症(Weiss and Goodnough，2005)。另一方面，在如遗传性血色素沉着病的遗传性铁过载疾病中，海帕西啶不适当的低表达水平促使铁从网状内皮组织系统内潜在致命的过量流出。因此，海帕西啶在与慢性病有关的贫血中被上调，而在血色素沉着病中被下调。
目前，除飞行时间质谱法(TOF MS)外，没有定量测量循环或尿中海帕西啶水平的适合测试(Kemna et al.，2008)，而飞行时间质谱法需要高度专业化的设备，并因此不易使用。最近，已提出使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法定量测量海帕西啶激素水平，但由于与海帕西啶(Kemna et al.，2005；Kemna et al.，2007)以及其他铁相关参数(Brookes et al.，2005；Roe et al.，2007)缺乏明确的相关性，因此该方法缺乏一致性。
如下所示，在来自人血清的外来体中检测了海帕西啶mRNA。首先从人血清中分离了外来体，并且在转化为cDNA并进行PCR扩增前提取它们的mRNA内含物。设计PCR引物以扩增人海帕西啶的129个核苷酸片段。引物序列为SEQID NO：57和SEQ IDNO：58。通过生化分析仪容易地检测了129个核苷酸的海帕西啶转录本(图13D的中间峰)。作为阳性对照(图13B)，提取了来自人肝细胞瘤细胞系Huh-7的RNA并将其转化为cDNA。阴性对照(图13C)没有mRNA。在图13A中的假凝胶中还显示了这些生化分析仪数据。
循环的微泡内的海帕西啶mRNA与肝细胞中的海帕西啶mRNA相关联。因此，测量体液样本中微泡内的海帕西啶mRNA将允许人们诊断或监测受试者中的贫血或血色素沉着病。
因此，可以通过从体液分离微泡并将所述微泡中的海帕西啶mRNA与来自正常受试者的mRNA相比较以诊断和/或监测受试者中贫血和血色素沉着病。对于贫血受试者，mRNA的拷贝数比正常的非贫血水平高。在患有血色素沉着病的受试者中，相对于正常受试者中的mRNA，所述拷贝数减少。
实施例11：用于糖尿病肾病诊断的外来体非侵入式转录谱
糖尿病肾病(DN)是目前缺乏特效疗法的危及生命的并发症。因此，需要开发灵敏的诊断方法以鉴别发展DN或具有发展DN风险的患者，从而能够进行早期干预和监测。
尿液分析提供了不必通过活组织检查而进行肾功能检查的方法。迄今为止，该分析限于尿液中蛋白质的研究。本实施例说明了从来自细胞的尿液转录谱获得通常只能通过肾活组织检查获得的结果的方法。具体地，该方法包含以下步骤：分离尿液外来体并分析所述外来体内的RNA以获得转录谱，其可以用于检验糖尿病个体中肾细胞所造成的分子变化并提供肾所产生的任何新蛋白质的“快照”。目前获得外来体转录谱的技术包括，但不限于，同时杂交阵列(contemporary hybridization arrays)、基于PCR的技术和下一代测序方法。由于直接测序不需要预设计的引物或点DNA寡核苷酸(spotted DNA oligos)，因此它将为外来体RNA谱提供客观的说明。通过Illumina基因组分析仪提供了下一代测序技术的实例，它利用了大规模平行测序技术，其允许每次运行对相当于1/3人类基因组的量进行测序。从该分析可得到的数据将使得人们能够快速并广泛地检验尿液外来体转录谱并允许与全肾进行比较。使用该方法，人们可以获得与尿液外来体转录谱有关的许多需要的信息。对照中的转录本与糖尿病来源的尿液外来体中转录本的比较还可以向人们提供糖尿病肾病的预测和新型生物标志物的综合列表。
为了证明上述诊断方法的可行性，设计并实施了实验以分离尿液外来体以及确认这些外来体内是否存在肾特异性生物标志物。在该实验中，从28岁健康男性受试者中采集了220mL新鲜的晨尿样本并经由差速离心处理以分离尿液外来体。具体地，先将尿液以300×g旋转离心10分钟以从该样本中除去任何细胞。收集上清液，然后以16,500×g旋转离心20分钟以沉淀任何细胞碎片或蛋白聚集体。然后将该上清液通过0.22μM膜过滤器以除去直径大于0.22μm的碎片。最后，将该样本在100,000×g下超离心1小时以使外来体成颗粒(Thery et al.，2006)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中轻轻冲洗所述颗粒，并按照生产商的说明书使用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA。使用Omniscript RT试剂盒(Qiagen)将分离的RNA转化为cDNA，然后对肾特异性基因进行PCR扩增。
所考察的肾特异性基因以及表达这些基因的相应肾区域为如下：AQP1-近端小管；AQP2-远端小管(主细胞)；CUBN-近端小管；LRP2-近端小管；AVPR2-近端和远端小管；SLC9A3(NHE-3)-近端小管；ATP6V1B1-远端小管(闰细胞(intercalated cell))；NPHS1-肾小球(足细胞(podocyte cell))；NPHS2-肾小球(足细胞)和CLCN3-集合管(collecting duct)的B型闰细胞。设计用于扩增各个基因的引物序列为AQP1-F(SEQ ID NO：17)和AQP1-R(SEQ ID NO：18)；AQP2-F(SEQ ID NO：19)和AQP2-R(SEQ ID NO：20)；CUBN-F(SEQ ID NO：21)和CUBN-R(SEQID NO：22)；LRP2-F(SEQ ID NO：23)和LRP2-R(SEQ ID NO：24)；AVPR2-F(SEQ ID NO：25)和AVPR2-R(SEQ ID NO：26)；SLC9A3-F(SEQ ID NO：27)和SLC9A3-R(SEQ ID NO：28)；ATP6V1B1-F(SEQ ID NO：29)和ATP6V1B1-R(SEQ ID NO：30)；NPHS1-F(SEQ ID NO：31)和NPHS1-R(SEQ ID NO：32)；NPHS2-F(SEQ ID NO：33)和NPHS2-R(SEQ ID NO：34)；CLCN5-F(SEQID NO：35)和CLCN5-R(SEQ ID NO：36)。
对于每个基因的PCR产物的预计尺寸为AQP1-226bp、AQP2-208bp、CUBN-285bp、LRP2-220bp、AVPR2-290bp、SLC9A3-200bp、ATP6V1B1-226bp、NPHS1-201bp、NPHS2-266bp和CLCN5-204bp。PCR循环方案为在95℃保持8分钟；在95℃保持30秒；在60℃保持30秒；在72℃保持45秒，循环30次；最后一步为在72℃保持10分钟。
如图14a所示，肾小管细胞含有多泡体，它是外来体产生过程中的中间步骤。可以通过电子显微镜鉴别从这些细胞分离的外来体(图14b)。对从尿液外来体中提取的总RNA的分析表明存在具有大范围尺寸的RNA种类(图14c)。未发现18S和28S核糖体RNA。PCR分析确认了尿液外来体内存在肾特异性转录本(图14d)。这些数据表明，肾细胞将外来体脱落到尿液中并且这些尿液外来体含有肾起源的转录本，以及所述外来体方法可以检测与某些肾病和/或其他医学病况有关的肾生物标志物。
为了进一步确认尿液外来体中存在肾特异性mRNA转录本，使用来自六位个体的尿液样本进行了一组独立实验。按照如上所提到的程序，从每位个体的200ml晨尿样本中提取了外来体核酸。具体地，以1000×g的离心作用起始对尿液样本进行差速离心以使全细胞和细胞碎片旋转沉降。小心除去上清液，并将其在16,500×g离心20分钟。然后，移出离心后的上清液并通过0.8μm过滤器过滤从而从含有外来体的上清液中除去残留碎片。然后，将最终上清液以100,000×g超离心1小时10分钟。在不含核酸酶的PBS中清洗颗粒，并以100,000×g再次离心1小时10分钟以获得准备用于核酸提取的外来体颗粒。使用Arcturus PicoPure RNA分离试剂盒从成粒的外来体提取核酸，并使用生化分析仪(Agilent)皮可芯片分析核酸浓度和完整性。如图14e所示，不同个体之间从尿液外来体分离的核酸也不相同。为了测试不同个体之间肾生物标志物的存在性是否也不相同，使用一组新引物对对水通道蛋白1(Aquaporin 1)、水通道蛋白2和Cubilin基因(或吞饮受体基因)进行PCR扩增，其中所述引物对为：AQP1新引物对：SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38；AQP2新引物对：SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40；CUBN新引物对：SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。特别地设计了这些引物对以扩增拼接和反转录的cDNA片段。使用Qiagen Sensiscript试剂盒进行反转录。如图14f所示，在个体1中未发现扩增，这可能是由于核酸提取失败所造成的。仅在个体2中扩增了AQP1。在个体2和3中扩增了CUBN。而在个体2、3、4和5中扩增了AQP2。相比之下，在个体2、3、4、5和6中扩增了肌动蛋白基因(图14f中用“House(方框)”表示)。这些数据提供了更多证据，即尽管在不同个体之间表达水平不同，但是尿液外来体含有肾特异性mRNA转录本。
为了测试尿液外来体中是否存在cDNA，将200ml人尿液样本分成两个100ml的尿液样本。从每个样本中分离尿液外来体。用DNA酶处理来自一个样本的外来体，而对来自另一个样本的外来体进行模拟处理。然后，使用PicoPure RNA分离试剂盒(Acturus)使每个样本中的外来体细胞溶解以进行核酸提取。在事先不进行反转录的情况下，将核酸用作巢式PCR扩增(实施例9中所述的PCR规程)的模板。扩增肌动蛋白基因的引物对为肌动蛋白-正向(Actin-FOR)(SEQ ID NO：43)和肌动蛋白-反向(Actin-REV)(SEQ ID NO：44)；肌动蛋白-巢式-正向(Actin-nest-FOR)(SEQ IDNO：45)和肌动蛋白-巢式-反向(Actin-nest-REV)(SEQ ID NO：46)，其中基于肌动蛋白基因cDNA序列预计的最终扩增子为100bp。如图14g所示，该100bp片段存在于阳性对照(以人肾cDNA作为模板)、DNA酶处理的和未处理的外来体中，但在阴性对照泳道中不存在(无模板)。因此，肌动蛋白cDNA存在于DNA酶处理的和未处理的尿液外来体中。
为了测试使用该方法提取的大部分核酸是否存在于外来体内，将从DNA酶处理的和未处理的外来体中提取的核酸以等体积溶解并使用RNA皮可芯片(Agilent Technologies)分析。如图14h所示，从DNA酶处理的样本中分离的核酸的浓度为1.131pg/ul，而从未处理样本中提取的浓度为1.378pg/ul。因此，使用上述方法从尿液外来体提取的核酸中有超过80％的核酸来自外来体内部。
为了系统地鉴别尿液外来体的内含物，从尿液外来体提取核酸并将其送至博德研究所(Broad Institute)进行测序。产生了约1400万个序列阅读，每个长度为76个核苷酸。这些序列阅读对应于尿液外来体内存在的DNA/RNA转录本片段。使用极其严格的比对参数(全长序列上100％的同一性)，将约15％的阅读与人基因组进行比对。如果使用不太严格的比对标准，则该百分比可能会提高。这15％的阅读中的大多数未与蛋白质编码基因比对而是与非编码基因组元件比对，如转座子和各种LINE & SINE重复元件。值得注意地，对于未与人基因组比对的那些阅读，许多与病毒序列比对。在包含于尿液外来体中的核酸组合物和水平相对于疾病状态而变化的程度上，根据本发明方法，可以将核酸谱用作疾病诊断的生物标志物。
这个实施例证明分析尿液外来体的外来体方法可以用于确定糖尿病相关肾病中肾的细胞变化而不必采用高风险、侵入式的肾活组织检查。该方法提供了使用外来体进行肾病(如糖尿病肾病)早期检测的新的并且灵敏的诊断工具。这将使得能够立即进行干预和治疗。总而言之，本文所述的外来体诊断方法和技术为糖尿病肾病以及与包含于尿液外来体内核酸的某些谱图有关的其他疾病提供了急需的诊断方法。
实施例12：前列腺癌诊断和尿液外来体
目前，前列腺癌是男性中最常见的癌症。前列腺癌的风险为约16％。2008年，美国诊断出了超过218,000位男性患者。越早期检测出前列腺癌，则成功治疗的机会越大。根据美国癌症学会(American Cancer Society)，如果在前列腺癌处于前列腺本身或附近区域时发现，则五年相对存活率超过98％。
通过测量血液中前列腺特异性抗原(PSA)水平，结合数字直肠检查进行一种已建立的诊断方法。然而，PSA测试的灵敏度和特异性均需要明显改善。该低特异性导致产生了较高数量的假阳性，其造成了很多不必要并且昂贵的活组织检查。通过检测新近鉴别的生物标志物的遗传谱而实施其他诊断方法，其中的生物标志物包括，但不限于，前列腺癌基因3(PCA3)(Groskopf et al.，2006；Nakanishi et al.，2008)、跨膜蛋白酶丝氨酸2和ETS相关基因之间的融合基因(TMPRSS2-ERG)(Tomlins et al.，2005)、谷胱甘肽S-转移酶π(Goessl et al.，2000；Gonzalgo et al.，2004)和在体液如血清和尿液中发现的前列腺癌细胞中的α-甲基酰基辅酶A消旋酶(AMACR)(Groskopf et al.，2006；Wright and Lange，2007)(Zehentner et al.，2006；Zielie et al.，2004)。尽管由于这些生物标志物在前列腺癌细胞中过表达(例如，前列腺癌细胞中PCA3表达提高了60至100倍)而可能提高特异性，但是需要数字直肠检查从而在样本采集前将前列腺细胞抽取到尿液中(Nakanishi et al.，2008)。这样的直肠检查固有的缺陷如收集易于抽取到尿液中的那些癌细胞的偏差和昂贵并且耗时的医学医生的参与。
本文中，提出了检测这些生物标志物的遗传谱的新方法以克服如上所提到的限制。该方法包括从体液分离外来体并分析来自该外来体的核酸的步骤。所述方法的程序与实施例9中详细说明的类似。在本实施例中，尿液样本来自4位诊断为前列腺癌的患者。如图15c所示，以等级、格里森级(Gleason stage)和PSA水平表征癌症阶段。另外，通过实施例7中详细说明的巢式RT-PCR分析的核酸为TMPRSS2-ERG和PCA3，它们是两种新近鉴别的前列腺癌生物标志物。对于TMPRSS2-ERG的扩增，第一扩增步骤的引物对为TMPRSS2-ERG F1(SEQ ID NO：47)和TMPRSS2-ERG R1(SEQID NO：48)；而第二扩增步骤的引物对为TMPRSS2-ERG F2(SEQID NO：49)和TMPRSS2-ERG R2(SEQ ID NO：50)。预计的扩增子为122个碱基对(bp)并且在用限制性内切酶HaeII消化后得到两个片段(一个为68bp，另一个为54bp)。对于PCA3的扩增，第一扩增步骤的引物对为PCA3F1(SEQ ID NO：51)和PCA3R1(SEQID NO：52)；而第二扩增步骤的引物对为PCA3F2(SEQ ID NO：53)和PCA3R2(SEQ ID NO：54)。预计的扩增子长度为152bp并且用限制性内切酶Sca1消化后得到两个片段(一个为90bp，另一个为62bp)。
如图15a所示，在患者1和2中可以检测TMPRSS2-ERG的预计扩增子并且其可以消化成预计尺寸的两个片段，但是在患者3和4中不可以。如图15b所示，在所有4位患者中，可以检测PCA3的预计扩增子并且其可以消化成预计尺寸的两个片段。因此，可以在来自所有4位患者的尿液样本中检测PCA3表达，但是只可以在患者1和2的尿液样本中检测TMPRSS2-ERG表达(图15c)。尽管由于样本量较小而不能得出结论，但是这些数据证明了所述新方法在检测前列腺癌生物标志物中的可应用性。而且，该外来体方法不局限于诊断，而且可以用于前列腺癌相关其他医学病况的预后和/或监测。
实施例13：非侵入式产前诊断中的微泡
目前，产前诊断是全世界已建立的产科实践的一部分。获得用于遗传分析的胎儿组织的常规方法包括羊膜穿刺术和绒膜绒毛采样，这两种方法都是侵入式的并且会对未出生的胎儿造成风险。在临床遗传学中，对开发非侵入式诊断方法有长期的需要。已广泛研究的一种方法是基于母体血浆中循环胎儿细胞的发现。然而，有多种障碍妨碍其在临床环境中应用。这些障碍包括胎儿细胞不足(每毫升母体血液中仅有1.2个细胞)，这需要相对大量的血液样本；以及上次怀孕时残留的胎儿细胞较长的半衰期，这可能导致假阳性。另一种方法是基于母体血浆中胎儿DNA的发现。充足的胎儿DNA量以及较短的清除时间克服了与胎儿细胞方法有关的阻碍。然而，DNA仅提供可遗传的遗传信息和一些后生信息(epigenetic information)，两者均不能代表与胎儿医学病况有关的动态基因表达谱。母体血浆中循环胎儿RNA的发现(Ng et al.，2003b；Wong et al.，2005)可能是非侵入式产前诊断的所选方法。
几种研究表明胎儿RNA具有较高的诊断价值。例如，胎儿促肾上腺皮质激素-释放激素(CRH)转录本表达的提高与怀孕期间的先兆子痫(表现为高血压、浮肿和蛋白尿的临床病况)有关(Ng et al.，2003a)。另外，母体血浆中的胎盘特异性4(PLAC4)mRNA已成功用于非整倍体妊娠(如21-三体(trisomy 21)、唐氏综合征)的非侵入式测试(Lo et al.，2007)。此外，母体血浆中的胎儿人绒毛膜促性腺激素(hCG)转录本可以是妊娠滋养层疾病(GTD)的标志物，该疾病为母体宿主中胎儿组织的肿瘤性生长。循环胎儿RNA主要来源于胎盘(Ng et al.，2003b)。可以早在妊娠第4周检测这些胎儿RNA，并且该RNA在产后快速清除。
尽管如此，使用母体血浆中的循环胎儿RNA的产前诊断具有多种限制。第一种限制是循环的胎儿RNA与循环的母体RNA混合并且未被有效地分离。目前，根据以下假设鉴别了胎儿转录本，即在分娩前的孕妇中以及在她们的婴儿的脐带血中检测到的胎儿转录本在产后24或36小时内在母体血液中显著降低或消失(Maron et al.，2007)。第二种限制是由于仍不了解胎儿RNA的包装和释放，因此未建立富集循环胎儿RNA以提高诊断灵敏度的方法。克服这些限制的方法可能在于微泡的分离以及对其中胎儿RNA的分析。
若干事实表明，真核细胞脱落的微泡是母体血浆中循环胎儿RNA的载体。第一，微泡内的循环RNA受到保护而不受RNA酶的降解作用。第二，已证实循环胎儿RNA保留在母体血浆的非细胞部分中，这与包含这些胎儿RNA的微泡能够通过0.22μm膜过滤的主张一致。第三，与已知脱落微泡的肿瘤组织类似，作为假恶性胎儿组织的胎盘细胞最可能能够脱落微泡。因此，非侵入式产前诊断的新方法由以下步骤组成：从母体血浆中分离胎儿微泡，然后分析所述微泡内核酸的与某些疾病和/或其他医学病况有关的任何遗传性变体。
非侵入式产前诊断的假设情况如下：从孕妇中采集周围血液样本并进行磁力活化细胞分选(MACS)或其他亲和纯化以分离和富集胎儿特异性微泡。将微泡颗粒在PBS中重新悬浮并立即使用或保存在-20℃以备随后处理使用。按照生产商的说明使用Qiagen RNA提取试剂盒从分离的微泡中提取RNA。对胎儿人绒毛膜促性腺激素(hCG)转录本的表达水平分析RNA内含物。与标准范围相比hCG表达水平的提高指示了妊娠滋养层疾病(GTD)的发展并且还需要对胎儿中该异常生长进行临床治疗。微泡技术的灵敏度使得有可能在表现出任何症状之前或在通过超声检查可检测结构变化之前的极早阶段检测出GTD。可以通过检查统计学显著个数的正常孕妇中的循环胎儿RNA样本确定hCG转录本水平的标准范围。
通过检查与这些疾病或医学病况有关的那些转录本，可以将产前诊断方法推广到其他疾病或医学病况的产前诊断和/或监测。例如，从来自母体血液的胎儿起源微泡中提取间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)核酸并进行分析是成神经细胞瘤的非侵入式产前诊断，它与激酶结构域内的突变或与ALK表达的提高密切相关(Mosse et al.，2008)。因此，本文所述的微泡方法和技术可以导致开创急需的非侵入式产前遗传诊断的新纪元。
实施例14：黑素瘤诊断
黑素瘤为黑素细胞(色素细胞)的恶性肿瘤，并且主要在皮肤中发现。它是皮肤癌的严重形式，并且占与皮肤癌相关所有死亡的75％。BRAF的体细胞激活突变(例如，V600E)是在人黑素瘤发生中所检测到的最早期和最常见的遗传畸形。激活的BRAF促进黑素瘤的细胞周期发展和/或存活。
目前，黑素瘤的诊断是基于身体检查和切除的活组织检查进行的。然而，活组织检查仅可以采集病变内有限数目的病灶并且可能得到假阳性或假阴性结果。外来体方法提供了诊断黑素瘤的更准确的方法。如上所讨论的，所述方法包括从受试者体液分离外来体并分析来自所述外来体的核酸的步骤。
为了确定黑素瘤脱落的外来体是否含有BRAF mRNA，我们在添加了除去外来体的FBS的DMEM培养基上培养原代黑素瘤细胞并使用实施例2中详细说明的类似程序收获培养基中的外来体。原代细胞系为Yumel和M34。Yumel细胞在BRAF不具有V600E突变，而M34细胞在BRAF具有V600E突变。从外来体提取RNA，然后通过RT-PCR分析是否存在BRAF mRNA。用于PCR扩增的引物为：BRAF正向(SEQ ID NO：55)和BRAF反向(SEQ ID NO：56)。扩增子的长度为118个碱基对(bp)并且覆盖了V600E突变所在的BRAF cDNA序列部分。如图16a所示，在来自原代黑素瘤细胞(Yumel和M34细胞)的外来体中检测到了118bp的条带，但是在来自人成纤维细胞或阴性对照的外来体中未检测到。由于可以在来自黑素瘤细胞和人成纤维细胞的外来体中检测GAPDH转录本，因此118bp PCR产物条带的阴性检测不是由于错误的RNA提取所造成的(图16b)。还对118bp PCR产物进行测序以检测V600E突变。如图16c和16d所示，如所预计的，来自Yumel细胞的PCR产物含有野生型BRAF mRNA。相反，如所预计的，来自M34细胞的PCR产物含有具有T-A点突变的突变体BRAF mRNA，其使得BRAF蛋白的氨基酸位置600处的氨基酸缬氨酸(V)被谷氨酸(E)代替。此外，在来自正常人成纤维细胞的外来体中不能检测到BRAFmRNA，表明并非所有组织来源的外来体中都含有BRAF mRNA。
这些数据表明，黑素瘤细胞将外来体脱落到血液循环中，因此通过从血清分离这些外来体并分析从其中所获得的核酸在BRAF中是否存在突变(例如，V600E)而可以诊断黑素瘤。还可以使用上述方法诊断与其他BRAF突变以及其他基因中的突变有关的黑素瘤。可以使用该方法诊断与BRAF以及其他核酸表达谱有关的黑素瘤。
实施例15：检测来自外来体的MMP水平以监测移植后病况。
器官移植是器官损坏的常用有效治疗。肾衰竭、心脏病、晚期肺病和肝硬化都是可以通过移植有效治疗的病况。然而，移植后并发症所引起的器官排异是异源移植受体长期存活的主要障碍。例如，在肺移值中，闭塞性细支气管炎综合征是影响存活率的严重并发症。在肾移植中，慢性异源移植肾病仍是肾异源移植失败的主要原因之一。局部缺血-再灌注损伤使心脏移植后的供体心脏受损，还使正位肝移植后的供体肝脏受损。一旦在早期检测到这些移植后并发症，则它们可以得到改善。因此，为了减轻有害并发症，监测移植后病况是至关重要的。
胞外基质中的改变有助于移植后并发症中的间质重塑。基质金属蛋白酶(MMP)参与胞外基质(ECM)蛋白的周转和降解。MMP是蛋白水解、锌依赖性酶的家族，目前已描述的成员有27个，它们表现出多结构域结构和底物特异性，并且在多种可溶性因子的加工、活化和失活中起作用。血清MMP水平可以指示移植后病况的状态。的确，循环MMP-2与血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)、移植后持续时间和肾移植受体中的糖尿病有关(Chang et al.，2008)。MMP-9的不均衡表达与肺移植后闭塞性细支气管炎综合征的发展有关(Hubner et al.，2005)。
如实施例4和表10所表明的，在成胶质细胞瘤细胞脱落的外来体中可以检测MMP mRNA(MMP1、8、12、15、20、21、24、26和27)。可以使用本发明的外来体方法监测移植状况，所述方法为从体液分离外来体并分析来自所述外来体的核酸。外来体分离程序与实施例2中详细说明的类似。实施例9中详细说明了分析外来体内所包含的核酸的本发明程序。肾移植后MMP-2表达水平的显著提高将表明移植后并发症的发病和/或恶化。类似地，肺移植后MMP-9水平的显著提高表明闭塞性细支气管炎综合征的发病和/或恶化。
因此，通过确定与移植后并发症有关的MMP蛋白的表达水平，所述外来体方法可以用于监测移植后状况。还预计可以推广该方法从而通过确定其他标志物基因的表达以监测移植后状况以及通过确定与这些医学病况有关的核酸遗传谱而监测其他医学病况。
实施例16-18：微泡可以是治疗剂或治疗剂的递送载体。
实施例16：微泡蛋白质诱导体外血管生成。
设计并实施了研究以证明成胶质细胞瘤微泡有助于血管生成。将脑内皮细胞系HBMVEC(30,000个细胞)(Cell Systems，产品号#ACBRI-376，Kirkland，WA，USA)在24孔板的涂覆了Matrigel的孔上在以下培养基中进行培养：仅基础培养基(EBM)(Lonza Biologics Inc.，Portsmouth，NH，USA)、添加了成胶质细胞瘤微泡的基础培养基(EBM+MV)(7μg/孔)或添加了血管生成因子混合物的基础培养基(EGM；氢化可的松、EGF、FGF、VEGF、IGF、抗坏血酸、FBS和肝素；Singlequots(EBM阳性对照)。16小时后测量小管形成并用图像J软件分析。在存在成胶质细胞瘤微泡的情况下培养的HBMVEC表明小管长度在16小时内加倍。该结果相当于在存在血管生成因子的情况下培养的HBMCEC所得到的结果(图18a)。这些结果表明成胶质细胞瘤源微泡在引起脑内皮细胞中血管生成中起作用。
还分析了微泡中血管生成蛋白的水平并与成胶质细胞瘤供体细胞中的水平进行比较。使用人血管生成抗体阵列，我们能够检测参与血管生成的19种蛋白质。具体地，在细胞溶解缓冲液(Promega，Madison，WI，USA)中使来自原代成胶质细胞瘤细胞的或来自从所述细胞分离的纯化微泡的总蛋白溶解并按照生产商的推荐加入至人血管生成抗体阵列中(Panomics，Fremont CA，USA)。扫描阵列并用图像J软件分析。如图18b所示，在微泡中容易地检测到了19种血管生成蛋白中的7种，其中与成胶质细胞瘤细胞相比，基于总蛋白，有6种(血管生成素、IL-6、IL-8、TIMP-I、VEGF和TIMP-2)以较高水平存在(图18c)。与肿瘤细胞相比，微泡中含量最高的三种血管生成蛋白为血管生成素、IL-6和IL-8，其全部与神经胶质瘤血管生成有关，并且肿瘤恶性程度提高，则它们的水平也越高(25-27)。
还发现从原代成胶质细胞瘤细胞分离的微泡促进了人U87神经胶质瘤细胞系的增殖。在这些研究中，将100,000个U87细胞接种到24孔板的孔中，并允许在(DMEM-5％FBS)上或在添加了从原代成胶质细胞瘤细胞分离的125μg微泡的DMEM-5％FBS上生长三天。三天后，发现使用比尔克尔室(Burker chamber)所确定的未处理U87细胞(图19a)的数目比添加微泡的那些细胞少(图19b)。在这段时间，未添加和添加的U87细胞分别提高了5倍和8倍(图19c)。因此，成胶质细胞瘤微泡看起来刺激了其他神经胶质瘤细胞的增殖。
实施例17：成胶质细胞瘤微泡被HBMVEC吸收。
为了证明成胶质细胞瘤微泡能够被人脑微泡内皮细胞(HBMVEC)吸收，用PKH67绿色荧光标记试剂盒(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)标记纯化的成胶质细胞瘤微泡。将标记的微泡与HBMVEC在培养基(5μg/50000个细胞)中在4℃培育20分钟。清洗细胞并在37℃培育1小时。30分钟内，PKH67标记的微泡内化到HBMVEC内的内含体样结构中(图17a)。这些结果表明成胶质细胞瘤微泡可以通过脑内皮细胞内化。
当将荧光标记的微泡加入到原代成胶质细胞瘤细胞中时，获得了类似的结果。
实施例18：由成胶质细胞瘤微泡递送的mRNA可以在受体细胞中翻译。
为了确定成胶质细胞瘤来源的微泡mRNA是否可以递送到受体细胞并在其中表达，使用CMV启动子以＞95％的感染效率用表达分泌型长腹水蚤荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)的自失活慢病毒载体感染原代人成胶质细胞瘤细胞。在此后的传代中，这些细胞稳定转导并产生微泡(分析了2-10个传代)。如上所述，从所述细胞中分离微泡并进行纯化。RT-PCR分析显示Gluc(555bp)和GAPDH(226bp)的mRNA存在于微泡中(图17b)。如使用定量RT-PCR所评价的，Gluc mRNA的水平比GAPDH的更高。
将50微克纯化的微泡加入至50,000个HBMVE细胞并培育24个小时。在加入微泡后(0小时)、加入后15小时以及24小时，直接测量上清液中Gluc的活力。将上清液中的Gluc活力归一化为与微泡有关的Gluc蛋白活力。将结果表示为平均值±SEM(n＝4)。具体地，受体HBMVE细胞中的活力表明了微泡Gluc mRNA的连续翻译。因此，可以将掺入到肿瘤微泡中的mRNA递送到受体细胞中并产生功能性蛋白。
所有实施例中的统计学分析是使用学生t-检验进行的。
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表1：可以将成胶质细胞瘤微泡中的RNA用作敏感生物标志物。
使用巢式RT-PCR监测神经胶质瘤活检组织中以及从相同患者的冷冻血清样本纯化的外来体中的EGFRvIII mRNA。以蒙眼方式分析了来自30位患者的样本并且PCR反应对每个样本至少重复3次。在来自30位正常对照的血清微泡中未发现EGFRvIII mRNA。PP1表示由SEQ ID No：13和14组成的引物对。PP2表示由SEQ IDNo：15和16组成的引物对。“-”表示“不可获得”。
Figure BPA00001231626400751
*肿瘤移除手术后的天数
表2：表3中使用的缩写
缩写         术语
A            扩增
AEL          急性嗜酸细胞白血病
AL           急性白血病
ALCL         间变性大细胞淋巴瘤
ALL          急性淋巴细胞性白血病
AML          急性髓性白血病
AML*         急性髓性白血病(主要为治疗相关的)
APL          急性早幼粒细胞白血病
B-ALL        B-细胞急性淋巴细胞性白血病
B-CLL        B-细胞淋巴细胞性白血病
B-NHL        B-细胞非霍奇金淋巴瘤
CLL          慢性淋巴细胞性白血病
CML          慢性粒细胞性白血病
CMML         慢性骨髓单核细胞性白血病
CNS          中枢神经系统
D            大片段缺失
DFSP         隆凸性皮肤纤维肉瘤
DLBL         弥漫性大B细胞淋巴瘤
DLCL         弥漫性大细胞淋巴瘤
Dom          显性
E            上皮的
F            框架
GIST         胃肠道间质瘤
JMML         幼年型粒单核细胞白血病
L            白血病/淋巴瘤
M            间充质的
MALT         粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤
MDS          骨髓发育异常综合征
Mis          错义
MLCLS        伴硬化的纵隔大细胞淋巴瘤
MM           多发性骨髓瘤
MPD          骨髓增生殖性疾病
N            无义
NHL          非霍奇金淋巴瘤
NK/T         自然杀伤T细胞
NSCLC        非小细胞肺癌
O            其他
PMBL         原发性纵隔B细胞淋巴瘤
pre-B All    前B细胞急性淋巴细胞白血病
Rec          隐性
S            拼接位点
T            易位
T-ALL        T-细胞急性淋巴母细胞性白血病
T-CLL        T-细胞慢性淋巴细胞性白血病
TGCT         睾丸生殖细胞瘤
T-PLL        T细胞前淋巴细胞性白血病
Figure BPA00001231626400771
Figure BPA00001231626400781
Figure BPA00001231626400801
Figure BPA00001231626400811
Figure BPA00001231626400821
Figure BPA00001231626400831
Figure BPA00001231626400851
Figure BPA00001231626400881
Figure BPA00001231626400901
Figure BPA00001231626400911
Figure BPA00001231626400921
Figure BPA00001231626400931
没有研究(癌症类型)对测试基因具有可用的表达数据。
其测试基因的表达被上调或下调的癌症类型的上调#或下调#数。
在大多数癌症类型中，所有这些基因被显著性一致地上调(P＜10)。
doi：10.137/journal pone.0001149.001
Figure BPA00001231626400941
在大多数癌类型中，所有这些基因被显著性一致地下调(P＜10-5)。
doi：10.1371/journal.pone.0001149.t002
Figure BPA00001231626400951
Figure BPA00001231626400961
Figure BPA00001231626400971
Figure BPA00001231626400981
Figure BPA00001231626400991
Figure BPA00001231626401001
注意：登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
Figure BPA00001231626401031
Figure BPA00001231626401041
Figure BPA00001231626401051
注意：登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
表8：成胶质细胞瘤细胞中上调的微小RNA。
Figure BPA00001231626401061
表9：成胶质细胞瘤细胞中下调的微小RNA。
Figure BPA00001231626401062
表10.从成胶质细胞瘤细胞系中分离的微泡内包含的MMP基因。
注：基因符号是Entrz Gene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)分配的标准符号。
登录号是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
Figure BPA00001231626401081
Figure BPA00001231626401091
Figure BPA00001231626401101
Figure BPA00001231626401111
Figure BPA00001231626401121
注：Hugo基因符号是HUGO基因命名委员会分配给各个基因的(http://www.genenames.org/)。Entrez_Gene_Ids是EntrzGene分配给各个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.g ov/sites/entrez？db＝gene)。
Figure BPA00001231626401141
Figure BPA00001231626401151
Figure BPA00001231626401161
Figure BPA00001231626401181
Figure BPA00001231626401191
Figure BPA00001231626401201
Figure BPA00001231626401211
Figure BPA00001231626401221
Figure BPA00001231626401231
Figure BPA00001231626401251
Figure BPA00001231626401261
Figure BPA00001231626401271
注：基因符号是Entrz Gene分配的标准符号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)。登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。登录号“CCDSXXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/)。登录号“ENSTXXXXXXXXXXX”是Ensembl唯一地分配给每个基因的(http://www.ensembl.org/index.html)。
Figure BPA00001231626401281
基因符号    登录号            基因符号      登录号          基因符号  登录号
C2orf10     CCDS2291.1        CD86          CCDS3009.1      COL14A1   NM_021110
C2orf29     CCDS2050.1        CDC42BPA      CCDS1558.1      COL17A1   CCDS7554.1
C3          NM_000064         CDH1          CCDS10869.1     COL22A1   CCDS6376.1
C3orf15     CCDS2994.1        CDH10         CCDS3892.1      COL4A1    CCDS9511.1
C3orf18     CCDS2829.1        CDH20         CCDS11977.1     COL4A4    NM_000092
C4orf9      NM_003703         CDH7          CCDS11993.1     COL5A1    CCDS6982.1
C6orf103    ENST00000326916   CDKN2A        CCDS6510.1      COL6A3    NM_004369
C6orf213    NM_001010852      CDSN          NM_001264       COLEC12   NM_130386
C6orf54     CCDS5304.1        CEBPZ         CCDS1787.1      CORO2A    CCDS6735.1
C6orf60     NM_024581         CEECAM1       CCDS6901.1      CPAMD8    NM_015692
C7orf27     CCDS5334.1        CEL           NM_001807       CPLX2     ENST00000274615
C9orf138    CCDS6487.1        CELSR1        CCDS14076.1     CPN1      CCDS7486.1
C9orf39     NM_017738         CENTD1        CCDS3441.1      CPT1C     CCDS12779.1
C9orf45     CCDS6850.1        Cep192        NM_032142       CPZ       CCDS3404.1
C9orf91     CCDS6808.1        CEP290        NM_025114       CREBBP    CCDS10509.1
C9orf98     CCDS6954.1        CFHR4         NM_006684       CSF2RB    CCDS13936.1
CABLES2     NM_031215         CGI-09        CCDS13093.1     CSMD1     NM_033225
CACNA1A     NM_000068         CGN           CCDS999.1       CSMD2     CCDS380.1
CACNA1E     NM_000721         CHD1          NM_001270       CSS3      NM_175856
CACNA2D1    CCDS5598.1        CHD5          CCDS57.1        CTAG2     CCDS14759.1
CACNG5      CCDS11666.1       CHD7          NM_017780       CTNNA2    NM_004389
CAD         CCDS1742.1        CHI3L1        CCDS1435.1      CTNNA3    CCDS7269.1
CALB1       CCDS6251.1        CHMP1B        NM_020412       CTNND2    CCDS3881.1
CALCR       CCDS5631.1        CHPPR         CCDS6182.1      CUBN      CCDS7113.1
CAMSAP1     NM_015447         CHST1         CCDS7913.1      CUL4B     NM_003588
CAMTA1      NM_015215         CHURC1        NM_145165       CUTL1     CCDS5720.1
CAND2       ENST00000295989   CIAS1         CCDS1632.1      CX40.1    CCDS7191.1
CAPN12      CCDS12519.1       CILP          CCDS10203.1     CXorf9    CCDS14614.1
CARD9       CCDS6997.1        CKLFSF4       CCDS10817.1     CYFIP1    CCDS10009.1
CASKIN2     CCDS11723.1       CLEC4M        CCDS12187.1     CYFIP2    NM_014376
CASP10      CCDS2338.1        CLIPR-59      CCDS12486.1     CYP1A1    CCDS10268.1
CAT         CCDS7891.1        CLK1          CCDS2331.1      DACH2     CCDS14455.1
CBFA2T2     CCDS13221.1       CLSTN2        CCDS3112.1      DAXX      CCDS4776.1
CBLN4       CCDS13448.1       CLUAP1        NM_015041       DBT       CCDS767.1
CCDC11      CCDS11940.1       CMAS          CCDS8696.1      DCC1      CCDS6330.1
CCDC18      NM_206886         CMYA1         CCDS2683.1      DCHS1     CCDS7771.1
CCKAR       CCDS3438.1        CMYA3         NM_152381       DCHS2     CCDS3785.1
CCL2        CCDS11277.1       CMYA5         NM_153610       DCT       CCDS9470.1
CCNB3       CCDS14331.1       CNGB1         NM_001297       DDX51     NM_175066
CCNYL3      ENST00000332505   CNGB3         CCDS6244.1      DDX58     CCDS6526.1
CCR1        CCDS2737.1        CNTN4         CCDS2558.1      DEPDC2    CCDS6201.1
CCT6A       CCDS5523.1        CNTN5         NM_014361       DEPDC5    NM_014662
CCT6B       NM_006584         CNTN6         CCDS2557.1      DET1      NM_017996
CD163       CCDS8578.1        CNTNAP2       CCDS5889.1      DFNB31    CCDS6806.1
CD1A        CCDS1174.1        CNTNAP4       CCDS10924.1     DGKA      CCDS8896.1
CD200R1     CCDS2969.1        COBLL1        CCDS2223.1      DGKD      CCDS2504.1
CD44        CCDS7897.1        COCH          CCDS9640.1      DGKK      NM_001013742
CD6         CCDS7999.1        COH1          CCDS6280.1      DGKZ      CCDS7918.1
CD79A       CCDS12589.1       COL11A1       CCDS778.1       DHCR24    CCDS600.1
基因符号        登录号           基因符号         登录号            基因符号    登录号
DHX33           CCDS11072.1      EME2             NM_001010865      FAM53B      CCDS7641.1
DHX8            CCDS11464.1      EMILIN1          CCDS1733.1        FAM54B      NM_019557
DICER1          CCDS9931.1       EML1             NM_004434         FAM55C      CCDS2945.1
DIP2B           NM_173602        ENC1             CCDS4021.1        FAT         NM_005245
DKFZp313G1735   CCDS4073.1       ENST00000294635  ENST00000294635   FAT3        ENST00000298047
DKFZP434B0335   NM_015395        ENST00000298876  ENST00000298876   FAT4        CCDS3732.1
DKFZP434G1415   CCDS8743.1       ENST00000309390  ENST00000309390   FBN2        NM_001999
DKFZP434L1717   CCDS3805.1       ENST00000322493  ENST00000322493   FBN3        CCDS12196.1
DKFZp434O0527   CCDS2430.1       ENST00000324303  ENST00000324303   FBXO15      CCDS12002.1
DKFZP564J0863   NM_015459        ENST00000326382  ENST00000326382   FBXO3       CCDS7887.1
DKFZp566O084    CCDS11215.1      ENST00000326952  ENST00000326952   FBXO41      ENST00000295133
DKFZP586P0123   NM_015531        ENST00000332477  ENST00000332477   FBXO9       NM_033481
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MSLN       NM_013404          NIPSNAP3B        CCDS6761.1      OR4L1       NM_001004717
MTF1       NM_005955          NKX2-2           CCDS13145.1     OR4X1       NM_001004726
MTMR12     NM_019061          NLGN1            CCDS3222.1      OR51B4      CCDS7757.1
MTMR2      CCDS8305.1         NMUR1            CCDS2486.1      OR51E1      NM_152430
MTO1       CCDS4979.1         NOD3             NM_178844       OR51F2      NM_001004753
MTR        CCDS1614.1         NOL5A            CCDS13030.1     OR52I2      NM_001005170
MUC1       CCDS1098.1         NOPE             CCDS10206.1     OR52L1      ENST00000332249
MUC15      CCDS7859.1         NOR1             CCDS409.1       OR5C1       NM_001001923
MUC16      NM_024690          NOS1             NM_000620       OR5D13      NM_001001967
MUC2       NM_002457          NOX5             NM_024505       OR5D3P      ENST00000333984
MUF1       CCDS533.1          NP_0010358261    ENST00000331090 OR5F1       NM_003697
MUM1L1     NM_152423          NP_0010743111    ENST00000326096 OR5J2       NM_001005492
MYBL1      ENST00000331406    NPD014           CCDS260.1       OR5T1       NM_001004745
MYBPHL     NM_001010985       NPHP4            NM_015102       OR6A2       CCDS7772.1
MYCBPAP    NM_032133          NPY1R            NM_000909       OR6K2       NM_001005279
MYH2       CCDS11156.1        NRG2             CCDS4217.1      OR8D2       NM_001002918
MYH3       CCDS11157.1        NRXN2            CCDS8077.1      OR8H1       NM_001005199
MYH6       CCDS9600.1         NRXN3            CCDS9870.1      OR8K1       NM_001002907
MYH9       CCDS13927.1        NSE1             CCDS1684.1      OR8K5       NM_001004058
MYLIP      CCDS4536.1         NTF3             CCDS8538.1      OR9I1       NM_001005211
MYO10      NM_012334          NTRK3            CCDS10340.1     OR9K2       NM_001005243
MYO15A     NM_016239          NUDT5            CCDS7089.1      ORC5L       CCDS5734.1
MYO1G      NM_033054          ENST00000318605  ENST00000318605 OSBPL6      CCDS2277.1
MYO3A      CCDS7148.1         NUP210           NM_024923       OSCAR       CCDS12873.1
MYO6       NM_004999          NURIT            CCDS9399.1      OSMR        CCDS3928.1
MYO7B      ENST00000272666    NXN              CCDS10998.1     OSTN        CCDS3299.1
MYO9A      CCDS10239.1        NXPH3            CCDS11550.1     OTOF        CCDS1724.1
MYOM1      NM_003803          OBSCN            CCDS1570.1      OTP         CCDS4039.1
MYST3      CCDS6124.1         OBSL1            ENST00000265318 OTX1        CCDS1873.1
NAALAD2    CCDS8288.1         OCA2             CCDS10020.1     OVCA2       NM_001383
NAALADL2   NM_207015          ODZ4             ENST00000278550 OVCH1       NM_183378
基因符号   登录号             基因符号    登录号           基因符号        登录号
P11        CCDS8754.1         PLCB2       NM_004573        PUM1            CCDS338.1
PABPC5     CCDS14460.1        PLCB3       CCDS8064.1       PWP2H           NM_005049
PACS2      NM_015197          PLCB4       CCDS13104.1      PXDN            ENST00000252804
PADI2      CCDS177.1          PLEC1       NM_201380        PXDNL           NM_144651
PALMD      CCDS758.1          PLEC1       NM_201378        PYHIN1          CCDS1178.1
PAPPA      CCDS6813.1         PLEK2       CCDS9782.1       Q08AG5_HUMAN    ENST00000334213
PARP10     NM_032789          PLEKHA6     CCDS1444.1       Q5JX50_HUMAN    ENST00000325076
PARP14     NM_017554          PLEKHG2     NM_022835        Q5SYT8_HUMAN    ENST00000279434
PARP2      NM_005484          PLK5_HUMAN  ENST00000334770  Q6ZMX6_HUMAN    ENST00000269197
PARP9      CCDS3014.1         PLXNA1      NM_032242        Q6ZT40_HUMAN    ENST00000296564
PAX6       NM_000280          PLXNB1      CCDS2765.1       Q7Z2Q7_HUMAN    ENST00000334994
PB1        CCDS2859.1         PMP22CD     NM_001013743     Q7Z7L8_HUMAN    ENST00000339446
PCDH15     CCDS7248.1         PNPLA1      NM_001039725     Q8N2V9_HUMAN    ENST00000324414
PCDH17     NM_014459          PODN        CCDS573.1        Q8N5S4_HUMAN    ENST00000326474
PCDH18     NM_019035          PODXL       NM_001018111     Q8N6V7_HUMAN    ENST00000324928
PCDH9      CCDS9443.1         POLR2A      NM_000937        Q8N800_HUMAN    ENST00000322516
PCDHA13    NM_031864          POLRMT      CCDS12036.1      Q8N9F6_HUMAN    ENST00000317122
PCDHB16    CCDS4251.1         PON1        CCDS5638.1       Q8N9G5_HUMAN    ENST00000313957
PCDHB2     CCDS4244.1         PPA2        CCDS3667.1       Q8N9S5_HUMAN    ENST00000329388
PCDHB3     CCDS4245.1         PPFIA2      NM_003625        Q8N9V7_HUMAN    ENST00000309765
PCDHGA1    NM_031993          PPP1CA      CCDS8160.1       Q8N9Z1_HUMAN    ENST00000326413
PCDHGA11   NM_032091          PPP1R15B    CCDS1445.1       Q8NCK2_HUMAN    ENST00000325720
PCDHGA8    NM_014004          PPP1R3A     CCDS5759.1       Q8NGP7_HUMAN    ENST00000341231
PCDHGC4    CCDS4260.1         PPP2R1A     CCDS12849.1      Q8NH06_HUMAN    ENST00000324144
PCNT       NM_006031          PPP2R3A     CCDS3087.1       Q8NH08_HUMAN    ENST00000327198
PCNXL2     ENST00000344698    PPP2R4      CCDS6920.1       Q96GK3_HUMAN    ENST00000315264
PCSK2      CCDS13125.1        PPP5C       CCDS12684.1      Q96M18_HUMAN    ENST00000335239
PCSK6      NM_138321          PRDM10      CCDS8484.1       Q96MJ2_HUMAN    ENST00000327832
PDE6A      CCDS4299.1         PRDM5       CCDS3716.1       Q96QE0_HUMAN    ENST00000301647
PDZRN3     NM_015009          PRDM9       NM_020227        Q96RX8_HUMAN    ENST00000301719
PDZRN4     CCDS8739.1         PRELP       CCDS1438.1       Q96S27_HUMAN    ENST00000301682
PEG3       CCDS12948.1        PREX1       CCDS13410.1      Q9H557_HUMAN    ENST00000237253
PER3       CCDS89.1           PRG-3       CCDS6751.1       Q9H5F0_HUMAN    ENST00000360484
PFAS       CCDS11136.1        PRKACG      CCDS6625.1       Q9H8A7_HUMAN    ENST00000053084
PGM5       CCDS6622.1         PRKCG       CCDS12867.1      Q9HA39_HUMAN    ENST00000329980
PGR        CCDS8310.1         PRKD1       CCDS9637.1       Q9HCM3_HUMAN    ENST00000242365
PHACTR3    CCDS13480.1        ProSAPiP1   CCDS13049.1      Q9NSI0_HUMAN    ENST00000328881
PHB2       NM_007273          PRR12       ENST00000246798  Q9NT86_HUMAN    ENST00000314272
PIAS4      CCDS12118.1        PRSS23      CCDS8278.1       Q9P169_HUMAN    ENST00000342338
PIGK       CCDS674.1          PSMD3       CCDS11356.1      Q9P193_HUMAN    ENST00000359406
PIGT       CCDS13353.1        PSME4       NM_014614        Q9P1M5_HUMAN    ENST00000303007
PIK3CG     CCDS5739.1         PTCHD2      ENST00000294484  Q9Y6V0-3        ENST00000333891
PIK3R2     CCDS12371.1        PTCHD3      NM_001034842     QRICH2          NM_032134
PIP5K3     CCDS2382.1         PTF1A       CCDS7143.1       RAB6B           CCDS3082.1
PITRM1     NM_014889          PTGER3      CCDS652.1        RAD9B           CCDS9148.1
PKD1L2     NM_182740          PTN         CCDS5844.1       RAG1            CCDS7902.1
PKHD1L1    NM_177531          PTPN12      CCDS5592.1       RAG2            CCDS7903.1
PKIA       CCDS6222.1         PTPRK       CCDS5137.1       RaLP            CCDS10130.1
PKP2       CCDS8731.1         PTPRZ1      NM_002851        RANBP2          CCDS2079.1
基因符号   登录号           基因符号  登录号           基因符号        登录号
RARB       CCDS2642.1       SCN5A     NM_000335        SLC6A15         CCDS9026.1
RARRES2    CCDS5902.1       SCN5A     NM_198056        SLC6A17         NM_001010898
RASEF      ENST00000330861  SCN7A     NM_002976        SLC6A2          CCDS10754.1
RASGRP3    NM_170672        SCNM1     CCDS987.1        SLC6A3          CCDS3863.1
RASGRP4    NM_170603        SCNN1B    CCDS10609.1      SLC9A5          NM_004594
RASIP1     CCDS12731.1      SCNN1G    CCDS10608.1      SLCO1A2         CCDS8686.1
RASSF6     CCDS3558.1       SCRIB     CCDS6411.1       SLCO1B1         CCDS8685.1
RBAF600    CCDS189.1        SDPR      CCDS2313.1       SLCO1C1         CCDS8683.1
RBBP6      CCDS10621.1      SDS       CCDS9169.1       SLCO4C1         NM_180991
RBM27      ENST00000265271  SEC14L3   CCDS13877.1      SLITRK2         CCDS14680.1
RC74       NM_018250        SEMA4D    CCDS6685.1       SLITRK3         CCDS3197.1
RCHY1      CCDS3567.1       SEMA5B    CCDS3019.1       SLITRK5         CCDS9465.1
RDH8       CCDS12223.1      SENP1     NM_014554        SMAD3           CCDS10222.1
RELN       NM_005045        SESN2     CCDS321.1        SMAD4           CCDS11950.1
RENBP      CCDS14738.1      SEZ6L     CCDS13833.1      SMARCA4         CCDS12253.1
REPIN1     NM_013400        SF3A1     CCDS13875.1      SMOC1           CCDS9798.1
RFX1       CCDS12301.1      SF3B1     NM_012433        SMTN            CCDS13886.1
RFX3       CCDS6449.1       SFRS12    CCDS3991.1       SN              CCDS13060.1
RFXDC1     CCDS5113.1       SFRS16    CCDS12652.1      SNCAIP          CCDS4131.1
RGS11      CCDS10403.1      SGEF      NM_015595        SNRPC           NM_003093
RGS17      CCDS5244.1       SH2D1B    NM_053282        SNX16           CCDS6234.1
RHBDF1     NM_022450        SH3GL3    CCDS10325.1      SNX26           CCDS12477.1
RHOT2      CCDS10417.1      SH3TC1    CCDS3399.1       SORL1           CCDS8436.1
RIC3       CCDS7788.1       SHANK2    CCDS8198.1       SOX3            CCDS14669.1
RIMBP2     NM_015347        SHKBP1    CCDS12560.1      SP8             CCDS5372.1
RIMS1      NM_014989        SI        CCDS3196.1       SPAP1           CCDS1168.1
RIMS2      NM_014677        SIDT1     CCDS2974.1       SPATA13         ENST00000360220
RLF        CCDS448.1        SIGLEC11  CCDS12790.1      SPINLW1         CCDS13359.1
RNF175     NM_173662        SIPA1L2   NM_020808        SPTAN1          CCDS6905.1
RNUT1      CCDS10281.1      SIX2      CCDS1822.1       SPTBN2          CCDS8150.1
RODH       CCDS8925.1       SKD3      CCDS8215.1       SR140_HUMAN     ENST00000319822
RP1        CCDS6160.1       SLC14A1   CCDS11925.1      SRCRB4D         CCDS5585.1
RPGRIP1    NM_020366        SLC17A1   CCDS4565.1       SRRM2           NM_016333
RREB1      NM_001003699     SLC17A7   CCDS12764.1      SST             CCDS3288.1
RTL1E      NST00000331067   SLC1A6    CCDS12321.1      ST6GAL2         CCDS2073.1
RTTN       NM_173630        SLC22A15  NM_018420        ST6GALNAC5      CCDS673.1
RUNX1T1    CCDS6256.1       SLC22A7   CCDS4893.1       ST8SIA5         CCDS11930.1
RYR1       NM_000540        SLC25A26  CCDS2905.1       STAB1           NM_015136
RYR2       NM_001035        SLC28A3   CCDS6670.1       STAC            CCDS2662.1
SACS       CCDS9300.1       SLC2A1    CCDS477.1        STAC2           CCDS11335.1
SARS2      NM_017827        SLC2A3    CCDS8586.1       STAMBP          CCDS1929.1
SART3      CCDS9117.1       SLC2A5    CCDS99.1         STARD13         CCDS9348.1
SBLF       CCDS1840.1       SLC33A1   CCDS3173.1       STARD8          CCDS14390.1
SCAP2      CCDS5400.1       SLC39A10  NM_020342        STAT4           CCDS2310.1
SCFD2      NM_152540        SLC39A6   NM_012319        STIM1           CCDS7749.1
SCGN       CCDS4561.1       SLC45A1   ENST00000289877  STK10           NM_005990
SCN11A     NM_014139        SLC4A10   NM_022058        STK23           NM_014370
SCN2A2     NM_021007        SLC4A8    CCDS8814.1       STK33           CCDS7789.1
SCN4A      NM_000334        SLC4A9    NM_031467        STMN4           CCDS6055.1
基因符号    登录号           基因符号   登录号             基因符号       登录号
STN2        CCDS9875.1       TMEM63B    NM_018426          VIM            CCDS7120.1
SULF1       CCDS6204.1       TMEM8      CCDS10407.1        VIT            NM_053276
SULF2       CCDS13408.1      TMEPAI     CCDS13462.1        VLDLR          CCDS6446.1
SV2A        CCDS940.1        TMPO       CCDS9064.1         VMD2L1         NM_017682
SYNE1       CCDS5236.1       TMPRSS13   NM_032046          VPS13A         CCDS6655.1
SYNE1       CCDS5237.1       TNF        CCDS4702.1         VPS13D         NM_018156
SYNE2       CCDS9761.1       TNFRSF8    CCDS144.1          VPS16          CCDS13036.1
SYP         CCDS14321.01     TNK1       NM 003985          VPS39          CCDS10083.1
SYT1        CCDS9017.1       TNNI3      NM_000363          VSIG1          CCDS14535.1
SYT6        CCDS871.1        TNR        CCDS1318.1         VWF            CCDS8539.1
SYT7        NM_004200        TOR3A      CCDS1329.1         WASF3          CCDS9318.1
T           CCDS5290.1       TP53       CCDS11118.1        WBSCR14        CCDS5553.1
TAF1B       NM_005680        TP53BP1    CCDS10096.1        WBSCR17        CCDS5540.1
TAF1L       NM_153809        TPO        CCDS1642.1         WDR1           NM_005112
TAF4        NM_003185        TREH       NM 007180          WDR17          CCDS3825.1
TAS2R41     NM_176883        TRERF1     CCDS4867.1         WDR27          NM_182552
TATDN2      NM_014760        TRIM37     NM_001005207       WDR42B         ENST00000329763
TBC1D14     CCDS3394.1       TRIM58     CCDS1636.1         WDR44          CCDS14572.1
TBX15       NM_152380        TRPM1      CCDS10024.1        WHSC1          CCDS3357.1
TBX18       ENST00000330469  TRPM2      CCDS13710.1        WIRE           CCDS11364.1
TBX5        CCDS9173.1       TRPM3      CCDS6634.1         WNT9A          NM_003395
TBX6        CCDS10670.1      TSC2       CCDS10458.1        WRNIP1         CCDS4475.1
TCEB3B      CCDS11932.1      TSP-NY     CCDS9237.1         XKR4           NM_052898
TCFL1       CCDS989.1        TSTA3      CCDS6408.1         XPNPEP1        CCDS7560.1
TDRD7       CCDS6725.1       TTBK2      NM_173500          XPO7           NM_015024
TENC1       CCDS8842.1       TTC12      CCDS8360.1         XR_017918.1    ENST00000258651
TESSP2      NM_182702        TTC21B     NM_024753          XYLT2          CCDS11563.1
TEX14       NM_198393        TTC24      ENST00000340086    YLPM1          ENST00000238571
TFCP2L1     CCDS2134.1       TTF1       CCDS6948.1         YN002_HUMAN    ENST00000334389
TFF2        CCDS13684.1      TTK        CCDS4993.1         ZAN            NM_173059
TFPI2       CCDS5632.1       TTN        NM_133378          ZBTB24         NM_014797
TFR2        NM_003227        TTN        NM_133437          ZBTB33         CCDS14596.1
TFSM1HUMAN  ENST00000314720  TUBB3      CCDS10988.1        ZBTB7          CCDS12119.1
TG          NM_003235        TXNDC6     CCDS3099.1         ZC3H12B        NM_001010888
TGFBR2      CCDS2648.1       UBE1L      CCDS2805.1         ZC3HDC7        CCDS10550.1
TGIF2       CCDS13278.1      UBE2M      CCDS12987.1        ZDHHC4         CCDS5352.1
THNSL1      CCDS7147.1       UBQLN4     CCDS1127.1         ZFHX1B         CCDS2186.1
THSD7B      ENST00000272643  UBR2       CCDS4870.1         ZFP36          CCDS12534.1
TIMELESS    CCDS8918.1       UBXD7      ENST00000296328    ZHX3           CCDS13315.1
TJP1        NM_175610        UCP3       CCDS8229.1         ZIM3           NM_052882
TLL2        CCDS7449.1       ULBP1      CCDS5223.1         ZMAT4          NM_024645
TM7SF4      CCDS6301.1       UNC13C     ENST00000260323    ZNF133         CCDS13134.1
TM9SF4      CCDS13196.1      USP20      NM_001008563       ZNF136         NM_003437
TMCC2       NM_014858        USP31      CCDS10607.1        ZNF148         CCDS3031.1
TMEFF2      CCDS2314.1       USP38      CCDS3758.1         ZNF238         CCDS1623.1
TMEM132B    NM_052907        USP42      NM_032172          ZNF253         ENST00000327867
TMEM16A     NM_018043        UTRN       NM_007124          ZNF31          NM_145238
TMEM16C     NM_031418        VDAC2      CCDS7348.1         ZNF333         CCDS12316.1
TMEM16G     NM_001001891     VGCNL1     CCDS9498.1         ZNF334         NM_199441
基因符号   登录号
ZNF365     CCDS7264.1
ZNF423     NM_015069
ZNF443     NM_005815
ZNF451     CCDS4960.1
ZNF507     NM_014910
ZNF537     CCDS12421.1
ZNF560     CCDS12214.1
ZNF614     CCDS12847.1
ZNF638     CCDS1917.1
ZNF645     CCDS14205.1
ZNF648     ENST00000339948
ZNF682     NM_033196
ZYG11B     NM_024646
注：基因符号是Entrz Gene分配的标准符号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)。登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。登录号“CCDSXXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/)。登录号“ENSTXXXXXXXXXXX”是Ensembl唯一地分配给每个基因的(http://www.ensembl.org /index.html)。
Figure BPA00001231626401381
基因符号  登录号         基因符号   登录号          基因符号        登录号
C9orf37   NM_032937      CNTN5      NM_014361       DGKB            NM_004080
C9orf67   NM_032728.2    CNTN6      NM_014461.2     DGKE            NM_003647.1
CACNA1B   NM_000718      COG3       NM_031431.2     DGKG            NM_001346.1
CACNA1F   NM_005183      COH1       NM_017890.3     DHX32           NM_018180.2
CACNA1G   NM_198385      COL11A1    NM_001854.2     DIP             NM_015124
CACNA1H   NM_021098      COL12A1    NM_004370       DIP2B           NM_173602
CACNA1I   NM_001003406   COL19A1    NM_001858.3     DKFZP564B1023   NM_031306.1
CACNA2D3  NM_018398      COL4A4     NM_000092       DKFZP564J102    NM_001006655
CAMTA1    NM_015215      COL7A1     NM_000094.2     DKFZp761I2123   NM_031449
CAPN11    NM_007058      COMMD7     NM_053041       DKFZp779B1540   NM_001010903
CBFB      NM_001755.2    COPG       NM_016128       DKK3            NM_015881.4
CCDC16    NM_052857      COQ9       NM_020312       DLEC1           NM_007335.1
CCDC18    NM_206886      CPA3       NM_001870.1     DMD             NM_004006.1
CCDC66    NM_001012506   CPAMD8     NM_015692       DNAH17          NM_003727
CD2       NM_001767.2    CPEB1      NM_030594       DNAH5           NM_001369.1
CD74      NM_001025159   CPS1       NM_001875.2     DNAH9           NM_001372.2
CD97      NM_001784      CPSF3      NM_016207.2     DNAJA3          NM_005147.3
CDC27     NM_001256.2    CROCC      NM_014675       DNAJA5          NM_194283.1
CDH10     NM_006727.2    CRR9       NM_030782.2     DNAJC10         NM_018981
CDH20     NM_031891.2    CRSP2      NM_004229.2     DNAJC13         NM_015268
CDH8      NM_001796.2    CRTC1      NM_025021       DNASE1L3        NM_004944.1
CDKL2     NM_003948.2    CRX        NM_000554.2     DNM2            NM_004945
CDON      NM_016952.2    CRYAA      NM_000394.2     DNM3            NM_015569
CDS1      NM_001263.2    CSEN       NM_013434.3     DOCK1           NM_001380
CENPE     NM_001813      CSMD1      NM_033225       DPAGT1          NM_001382.2
CENTB1    NM_014716.2    CSMD3      NM_198123.1     DPAGT1          NM_203316.1
CENTD3    NM_022481.4    CSNK1D     NM_001893.3     DPP10           NM_020868
CENTG1    NM_014770.2    CSPP1      NM_024790       DPP6            NM_130797
CEP290    NM_025114      CST4       NM_001899.2     DPYD            NM_000110
CFHL5     NM_030787.1    CTF8       NM_001039690    DRIM            NM_014503.1
CFL2      NM_138638.1    CTNNA1     NM_001903       DSCR6           NM_018962.1
CGI-14    NM_015944.2    CTNNA2     NM_004389       DSG2            NM_001943
CGI-37    NM_016101.2    CTNND1     NM_001331       DTNA            NM_032978.4
CHD1      NM_001270      CUBN       NM_001081.2     DTX3L           NM_138287.2
CHD5      NM_015557.1    CUTC       NM_015960.1     DUOX1           NM_017434
CHD7      NM_017780      CUTL1      NM_001913.2     DVL3            NM_004423.3
CHD8      NM_020920      CUTL2      NM_015267       DYSF            NM_003494.2
CHD9      NM_025134      CYP1A1     NM_000499.2     ECT2            NM_018098.4
CHRND     NM_000751.1    CYP1A2     NM_000761       EDEM1           NM_014674
CIC       NM_015125.2    CYP26A1    NM_000783.2     EDNRA           NM_001957.1
CLCA2     NM_006536.3    CYP2D6     NM_000106       EEF1G           NM_001404
CLCN1     NM_000083.1    CYP4A22    NM_001010969    EGFL6           NM_015507.2
CLCN3     NM_001829      DACH1      NM_080759       EHBP1           NM_015252.2
CLEC6A    NM_001007033   DAZAP1     NM_018959.2     EHMT1           NM_024757.3
CLSPN     NM_022111.2    DBN1       NM_004395.2     EIF4A2          NM_001967.2
CLUAP1    NM_015041      DC2        NM_021227.2     EIF4B           NM_001417
CMYA1     NM_194293.2    DDO        NM_003649.2     EIF5            NM_183004.3
CMYA4     NM_173167.1    DDX10      NM_004398.2     ELA1            NM_001971.3
CNGA2     NM_005140.1    DDX18      NM_006773.3     ELAVL3          NM_001420
CNGB1     NM_001297      DDX3X      NM_024005.1     ENPEP           NM_001977.2
CNNM4     NM_020184.2    DEFB128    NM_001037732    EOMES           NM_005442.2
CNTN3     NM_020872      DENND2A    NM_015689       EP400           NM_015409
基因符号  登录号         基因符号    登录号         基因符号  登录号
EPC2      NM_015630      FLJ23584    NM_024588      GJB1      NM_000166.2
ERCC3     NM_000122.1    FLJ25955    NM_178821.1    GKN1      NM_019617.2
ERCC6     NM_000124.1    FLJ31413    NM_152557.3    GLG1      NM_012201
EREG      NM_001432.1    FLJ32115    NM_152321.1    GLI1      NM_005269.1
ETV5      NM_004454      FLJ32363    NM_198566.1    GLT25D2   NM_015101.1
EVI2A     NM_001003927   FLJ32440    NM_173685.1    GMCL1L    NM_022471.2
EVI5      NM_005665      FLJ32830    NM_152781.1    GNB1L     NM_053004.1
EXOC2     NM_018303      FLJ34521    NM_001039787   GNPAT     NM_014236.1
EXOC5     NM_006544      FLJ36180    NM_178556.3    GOLGA7    NM_016099
EXOSC3    NM_016042      FLJ36748    NM_152406      GOLGB1    NM_004487.1
FAAH      NM_001441.1    FLJ40342    NM_152347.3    GOLPH4    NM_014498.2
FABP4     NM_001442.1    FLJ40869    NM_182625.2    GORASP2   NM_015530
FAM44A    NM_148894.1    FLJ41821    NM_001001697   GP5       NM_004488.1
FAM47B    NM_152631.1    FLJ45455    NM_207386      GPC1      NM_002081.1
FAM80B    NM_020734      FLJ46321    NM_001001670   GPC2      NM_152742.1
FANCA     NM_000135      FLJ46354    NM_198547.1    GPHB5     NM_145171
FANCM     NM_020937      FLJ46481    NM_207405.1    GPNMB     NM_002510.1
FARP1     NM_005766.1    FLJ90579    NM_173591.1    GPR115    NM_153838.1
FBXO40    NM_016298      FLNA        NM_001456      GPR45     NM_007227.3
FBXO8     NM_012180.1    FLNB        NM_001457.1    GPR7      NM_005285.1
FBXW11    NM_012300      FLNC        NM_001458      GPR81     NM_032554.2
FCHO1     NM_015122      FMNL3       NM_175736      GRIK2     NM_021956.2
FCMD      NM_006731.1    FMOD        NM_002023      GRIK3     NM_000831.2
FCRH3     NM_052939.2    FN1         NM_002026.2    GRIN2C    NM_000835
FEM1C     NM_020177.2    FNDC3B      NM_022763.2    GRIN2D    NM_000836.1
FER1L3    NM_133337      FOLR2       NM_000803.2    GRIPAP1   NM_207672
FGD3      NM_033086      FOXP2       NM_014491.1    GRM6      NM_000843.2
FGD6      NM_018351      FOXP4       NM_138457.1    GSDML     NM_018530.1
FGFR2     NM_022970.1    FREM1       NM_144966      GSN       NM_000177.3
FHOD1     NM_013241.1    FRMPD1      NM_014907.1    GTF2A1    NM_015859.2
FHOD3     NM_025135      FUCA1       NM_000147.2    GTF3C1    NM_001520
FLG2      NM_001014342   FUS         NM_004960.1    GUCY2F    NM_001522.1
FLJ10241  NM_018035      FXR1        NM_005087.1    HADHB     NM_000183.1
FLJ10292  NM_018048.2    G3BP2       NM_203505.1    HCN3      NM_020897.1
FLJ10324  NM_018059      G6PC        NM_000151.1    HDAC4     NM_006037.2
FLJ10458  NM_018096.2    GA17        NM_006360.2    HDAC7A    NM_015401.1
FLJ10726  NM_018195.2    GAB1        NM_002039.2    HDLBP     NM_203346.1
FLJ10874  NM_018252.1    GABRA4      NM_000809.2    HEBP1     NM_015987
FLJ13089  NM_024953.2    GABRP       NM_014211.1    HEL308    NM_133636.1
FLJ13231  NM_023073      GALK2       NM_001001556   HIST1H4L  NM_003546.2
FLJ13479  NM_024706.3    GALNT17     NM_001034845   HIST2H2AB NM_175065.2
FLJ13868  NM_022744.1    GALNT5      NM_014568.1    HK3       NM_002115.1
FLJ14503  NM_152780.2    GALNTL2     NM_054110      HLCS      NM_000411.4
FLJ14624  NM_032813.1    GARNL1      NM_194301      HM13      NM_030789.2
FLJ16331  NM_001004326   GDF6        NM_001001557   HMG2L1    NM_001003681
FLJ20152  NM_019000      GGA1        NM_013365.2    HOMER2    NM_199331
FLJ20184  NM_017700.1    GGA3        NM_014001.2    HOOK1     NM_015888.3
FLJ20422  NM_017814.1    GIMAP1      NM_130759.2    HOOK2     NM_013312
FLJ20584  NM_017891.2    GIMAP8      NM_175571      HOOK3     NM_032410.2
FLJ20604  NM_017897.1    GIOT-1      NM_153257      HOXA3     NM_153631.1
FLJ21839  NM_021831.3    GIPC3       NM_133261      HOXA4     NM_002141.2
FLJ21945  NM_025203.1    GJA8        NM_005267      HS3ST4    NM_006040
基因符号     登录号        基因符号    登录号          基因符号     登录号
HSD11B1      NM_181755.1   KIAA0703    NM_014861       LOC339745    NM_001001664
HSD17B8      NM_014234.3   KIAA0774    NM_001033602    LOC340156    NM_001012418
HSHIN1       NM_199324.1   KIAA0789    NM_014653       LOC374955    NM_198546.1
HSPA14       NM_016299.1   KIAA0863    NM_014913       LOC388595    NM_001013641
HSPA1B       NM_005346     KIAA0913    NM_015037       LOC388915    NM_001010902
HSPC049      NM_014149     KIAA0934    NM_014974.1     LOC389151    NM_001013650
HTF9C        NM_182984.2   KIAA0999    NM_025164.3     LOC389549    NM_001024613
HUMCYT2A     NM_015848.1   KIAA1012    NM_014939.2     LOC440925    NM_001013712
HUWE1        NM_031407     KIAA1117    NM_015018.2     LOC440944    NM_001013713
ICAM5        NM_003259.2   KIAA1161    NM_020702       LOC441070    NM_001013715
IFNA2        NM_000605.2   KIAA1324    NM_020775.2     LOC646870    NM_001039790
IFNB1        NM_002176.1   KIAA1377    NM_020802       LOC652968    NM_001037666
IKBKAP       NM_003640.2   KIAA1414    NM_019024       LOC88523     NM_033111
IKBKB        NM_001556.1   KIAA1632    NM_020964.1     LOC90529     NM_178122.2
IL1RAPL2     NM_017416.1   KIAA1797    NM_017794       LOC91461     NM_138370
IL7R         NM_002185.2   KIAA1826    NM_032424       LOXL2        NM_002318
INA          NM_032727.2   KIAA1914    NM_001001936    LPO          NM_006151
INHBE        NM_031479.3   KIAA1946    NM_177454       LRBA         NM_006726.1
IPLA2(GAMMA) NM_015723     KIBRA       NM_015238.1     LRRC16       NM_017640
IPO7         NM_006391     KIF14       NM_014875       LRRC4        NM_022143.3
IQSEC2       NM_015075     KIR2DS4     NM_012314.2     LRRC43       NM_152759
IRF8         NM_002163.1   KLHL10      NM_152467       LRRC7        NM_020794.1
IRS4         NM_003604.1   KLHL15      NM_030624       LRRFIP1      NM_004735.1
IRTA2        NM_031281.1   KLK15       NM_017509.2     LUZP5        NM_017760
ITGA9        NM_002207.1   KPNA5       NM_002269.2     LYST         NM_000081
ITGAE        NM_002208     KRTAP10-8   NM_198695.1     LYST         NM_001005736
ITGAL        NM_002209     KRTAP20-1   NM_181615.1     LZTS2        NM_032429.1
ITGB2        NM_000211.1   KTN1        NM_182926.1     MACF1        NM_012090.3
ITPR1        NM_002222     LAMA1       NM_005559       MAGEA1       NM_004988.3
ITR          NM_180989.3   LAMA2       NM_000426.2     MAGEA4       NM_002362.3
JARID1B      NM_006618     LAMA4       NM_002290       MAGEB10      NM_182506
JMJD1A       NM_018433.3   LAMB4       NM_007356       MAGEC2       NM_016249.2
JMJD1C       NM_004241     LAP1B       NM_015602.2     MAGED2       NM_201222.1
JUP          NM_021991.1   LDHB        NM_002300.3     MAGEE1       NM_020932.1
KCNA5        NM_002234.2   LEPREL1     NM_018192.2     MAGI1        NM_173515.1
KCNC2        NM_139136.2   LGALS2      NM_006498.1     MANEA        NM_024641.2
KCNJ1        NM_000220.2   LHCGR       NM_000233.1     MAOA         NM_000240.2
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KIAA0664     NM_015229     LOC255374   NM_203397       MEF2C        NM_002397
KIAA0672     NM_014859     LOC283849   NM_178516.2     MFAP5        NM_003480.2
KIAA0676     NM_015043.3   LOC339123   NM_001005920    MGC11332     NM_032718.2
基因符号  登录号         基因符号   登录号          基因符号   登录号
MGC17299  NM_144626.1    NAV3       NM_014903       OR2M4      NM_017504
MGC21688  NM_144635.3    NCAM1      NM_000615       OR2W3      NM_001001957
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MGC33212  NM_152773      NDRG2      NM_201541.1     OR52A1     NM_012375
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MIA2      NM_054024.3    NEDD4      NM_198400.1     OR8B12     NM_001005195
MICAL1    NM_022765.2    NEF3       NM_005382.1     OR8D2      NM_001002918
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MKLN1     NM_013255      NF1        NM_000267.1     OR9Q2      NM_001005283
MLL4      NM_014727      NF2        NM_000268.2     OSBP2      NM_030758
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MMP10     NM_002425.1    NFIX       NM_002501       OTC        NM_000531.3
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MRE11A    NM_005590.2    NGLY1      NM_018297       PANX2      NM_052839.2
MSI1      NM_002442.2    NHS        NM_198270.2     PAPPA2     NM_020318
MTA1      NM_004689      NID2       NM_007361.2     PARP1      NM_001618.2
MTAC2D1   NM_152332.2    NIPBL      NM_133433.2     PCDH19     NM_020766
MTL5      NM_004923.2    NOD27      NM_032206.2     PCDH20     NM_022843.2
MTMR3     NM_021090.2    NOS2A      NM_000625.3     PCDH8      NM_002590.2
MTMR8     NM_017677.2    NOTCH1     NM_017617       PCDHA10    NM_031859
MUC16     NM_024690      NOTCH4     NM_004557       PCDHA11    NM_031861
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MUF1      NM_006369.3    NRCAM      NM_005010.2     PCDHB15    NM_018935.2
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MYH9      NM_002473.2    NUP205     NM_015135       PCM1       NM_006197
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MYO15A    NM_016239      NUP98      NM_016320.2     PDCD11     NM_014976
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MYR8      NM_015011      ODZ1       NM_014253.1     PDZD7      NM_024895
MYST4     NM_012330.1    OR10A2     NM_001004460    PDZK2      NM_024791.2
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NALP1     NM_014922      OR1J2      NM_054107       PER1       NM_002616.1
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NALP8     NM_176811.2    OR1S1      NM_001004458    PEX14      NM_004565
NALP9     NM_176820.2    OR2AK2     NM_001004491    PFC        NM_002621.1
基因符号  登录号          基因符号  登录号         基因符号   登录号
PFKFB4    NM_004567.2     PRODH     NM_016335.2    ROR1       NM_005012.1
PGBD3     NM_170753.1     PRPF39    NM_017922.2    RP1L1      NM_178857
PHACS     NM_032592.1     PRPF4B    NM_176800.1    RPGRIP1    NM_020366
PHC1      NM_004426.1     PRPS1     NM_002764.2    RPL3       NM_000967.2
PHF19     NM_015651       PRPS1L1   NM_175886      RPRC1      NM_018067
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PHKB      NM_000293.1     PRSS7     NM_002772.1    RPS6KA3    NM_004586.1
PIGN      NM_176787       PSD       NM_002779      RPS9       NM_001013.2
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PIK3C2G   NM_004570       PSPC1     NM_018282      RREB1      NM_001003699
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PKD1L1    NM_138295       PTPN14    NM_005401.3    RUFY1      NM_025158.2
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PKN1      NM_213560       PURG      NM_013357.2    SAPS1      NM_014931
PLA2G4A   NM_024420.1     PUS1      NM_025215.3    SATL1      NM_001012980
PLB1      NM_153021       PUS7      NM_019042      SBNO1      NM_018183.2
PLCB1     NM_015192.2     RAB41     NM_001032726   SCARF2     NM_153334.3
PLCB2     NM_004573       RABEP2    NM_024816      SCGB3A2    NM_054023.2
PLCD3     NM_133373       RAC2      NM_002872.3    SCML1      NM_006746.2
PLCG1     NM_002660.2     RAI17     NM_020338.1    SCN2A2     NM_021007
PLD2      NM_002663.2     RANBP1    NM_002882.2    SCN3A      NM_006922
PLEKHA8   NM_032639.2     RANBP3    NM_007321      SCNN1B     NM_000336.1
PLEKHG2   NM_022835       RANBP3    NM_007322      SCP2       NM_002979.2
PLOD1     NM_000302.2     RAP1GA1   NM_002885.1    SEC31L1    NM_014933.2
PLS3      NM_005032.3     RAPH1     NM_213589.1    SEMA3A     NM_006080.1
PLXNB1    NM_002673.3     RARG      NM_000966.3    SEMA4B     NM_198925
PNCK      NM_198452.1     RASAL2    NM_170692.1    SEMA4G     NM_017893.2
PNLIPRP1  NM_006229.1     RASGRF2   NM_006909.1    SEMA5B     NM_018987.1
PNPLA1    NM_001039725    RASL10B   NM_033315.2    SEMA6D     NM_153616
PODXL     NM_001018111    RBAF600   NM_020765.1    SEMA7A     NM_003612.1
POLH      NM_006502.1     RBM25     NM_021239      SEPHS2     NM_012248
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POU4F2    NM_004575       RG9MTD2   NM_152292.2    SF3B1      NM_012433
PP        NM_021129.2     RGL1      NM_015149.2    SF3B2      NM_006842
PPAPDC1A  NM_001030059    RGS22     NM_015668      SFRS1      NM_006924.3
PPFIBP2   NM_003621R      HAG       NM_000324.1    SFRS16     NM_007056.1
PPHLN1    NM_201439.1     RHD       NM_016124.2    SGKL       NM_013257.3
PPM1E     NM_014906.3     RIF1      NM_018151.1    SH2D3A     NM_005490.1
PPM1F     NM_014634.2     RIMS1     NM_014989      SH3RF1     NM_020870
PPP1R12A  NM_002480       RIMS2     NM_014677      SHCBP1     NM_024745.2
PPP1R3A   NM_002711.2     RLTPR     NM_001013838   SIGLEC5    NM_003830
PRDM13    NM_021620       RNF123    NM_022064      SIPA1L1    NM_015556.1
PRDM4     NM_012406.3     RNF127    NM_024778.3    SIX4       NM_017420.1
PRDX5     NM_012094.3     RNF149    NM_173647.2    SKIP       NM_016532.2
PRKAA1    NM_006251.4     RNU3IP2   NM_004704.2    SKIV2L     NM_006929.3
PRKAA2    NM_006252.2     ROBO3     NM_022370      SLAMF1     NM_003037.1
基因符号  登录号         基因符号  登录号         基因符号   登录号
SLC12A3   NM_000339.1    ST8SIA3   NM_015879      TM4SF7     NM_003271.3
SLC16A2   NM_006517.1    STAB1     NM_015136      TMED1      NM_006858.2
SLC17A6   NM_020346.1    STARD8    NM_014725.2    TMEM123    NM_052932
SLC22A2   NM_003058.2    STAT1     NM_007315.2    TMEM132B   NM_052907
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SLC25A30  NM_001010875   STATIP1   NM_018255.1    TMEM37     NM_183240
SLC35A2   NM_005660.1    STRBP     NM_018387.2    TMEM39A    NM_018266.1
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SLC6A5    NM_004211.1    SURF1     NM_003172.2    TNS        NM_022648.2
SLC7A7    NM_003982.2    SUSD3     NM_145006.2    TOP1       NM_003286.2
SLC8A3    NM_033262.3    SUV39H2   NM_024670.3    TOP2B      NM_001068
SLC8A3    NM_182932.1    SYNE2     NM_182914.1    TP53       NM_000546.2
SLC9A10   NM_183061      SYT3      NM_032298.1    TPM4       NM_003290.1
SLC9A2    NM_003048.3    SYTL2     NM_032943      TPTE       NM_199261.1
SLCO2B1   NM_007256.2    TAC4      NM_170685      TRAD       NM_007064.1
SLFN13    NM_144682      TACC2     NM_206862.1    TREM1      NM_018643.2
SLICK     NM_198503.2    TAF1      NM_004606.2    TREML1     NM_178174.2
SMARCAL1  NM_014140.2    TAF1B     NM_005680      TREML4     NM_198153
SMC4L1    NM_005496.2    TA-KRP    NM_032505.1    TRIAD3     NM_207116
SMC6L1    NM_024624.2    TAS2R13   NM_023920.1    TRIF       NM_182919.1
SMOX      NM_175839.1    TAX1BP1   NM_006024.4    TRIM25     NM_005082.3
SN        NM_023068.2    TBC1D19   NM_018317.1    TRIM29     NM_012101.2
SNTG2     NM_018968      TBC1D2B   NM_015079      TRIM36     NM_018700.2
SNX25     NM_031953      TBX1      NM_005992.1    TRIOBP     NM_001039141
SOHLH1    NM_001012415   TBXAS1    NM_001061.2    TRIP12     NM_004238
SORBS1    NM_015385.1    TCEAL5    NM_001012979   TRPC4      NM_016179.1
SORCS1    NM_052918.2    TCF1      NM_000545.3    TRPM5      NM_014555
SORL1     NM_003105.3    TCF7L1    NM_031283.1    TSN        NM_004622
SOX13     NM_005686      TCFL1     NM_005997.1    TTC15      NM_016030.5
SOX15     NM_006942      TCP1      NM_030752.1    TTC21B     NM_024753
SP110     NM_004509.2    TCP10     NM_004610      TTC3       NM_003316.2
SPAG6     NM_012443.2    TDRD6     NM_001010870   TTC7A      NM_020458
SPATS2    NM_023071      TECTA     NM_005422.1    TTN        NM_133378
SPCS2     NM_014752      TEK       NM_000459.1    TXNDC3     NM_016616.2
SPEN      NM_015001.2    TESK1     NM_006285.1    UBE2I      NM_194261.1
SPG4      NM_014946.3    TESK2     NM_007170      UBE2O      NM_022066
SPINK5    NM_006846      TEX11     NM_031276      UGT1A9     NM_021027.2
SPO11     NM_012444.2    TFAP2D    NM_172238.1    UNQ9356    NM_207410.1
SPOCD1    NM_144569.3    TG        NM_003235      UQCR       NM_006830.2
SPTA1     NM_003126      TGM3      NM_003245      USP29      NM_020903
SPTAN1    NM_003127.1    THBS3     NM_007112.3    USP34      NM_014709
SPTBN1    NM_178313      THG-1     NM_030935.3    USP54      NM_152586.2
SPTLC1    NM_006415.2    TIAM2     NM_001010927   UTP14C     NM_021645
SPTY2D1   NM_194285      TIFA      NM_052864      UTS2R      NM_018949.1
SREBF2    NM_004599.2    TIMELESS  NM_003920.1    VAV3       NM_006113.3
SRGAP3    NM_014850.1    TLL1      NM_012464.3    VEPH1      NM_024621.1
SSFA2     NM_006751.3    TLN1      NM_006289      VGCNL1     NM_052867.1
SSNA1     NM_003731.1    TLN2      NM_015059      VWF        NM_000552.2
基因符号  登录号          基因符号  登录号
WARS      NM_173701.1     ZNF10     NM_015394.4
WBP4      NM_007187.3     ZNF124    NM_003431
WBSCR28   NM_182504       ZNF142    NM_005081
WDR48     NM_020839       ZNF161    NM_007146
WDR53     NM_182627.1     ZNF183    NM_006978.1
WDR60     NM_018051       ZNF22     NM_006963.2
WDSOF1    NM_015420       ZNF25     NM_145011.2
WFDC1     NM_021197.2     ZNF267    NM_003414
WNK1      NM_018979.1     ZNF277    NM_021994.1
WNT2      NM_003391.1     ZNF281    NM_012482.3
XAB2      NM_020196       ZNF318    NM_014345.1
XBP1      NM_005080.2     ZNF37A    NM_001007094
XDH       NM_000379.2     ZNF425    NM_001001661
XKR7      NM_001011718    ZNF432    NM_014650.2
XPO5      NM_020750       ZNF436    NM_030634.1
XPO7      NM_015024       ZNF529    NM_020951
YY2       NM_206923.1
ZBTB3     NM_024784.2
ZBTB39    NM_014830
ZCCHC14   NM_015144.1
ZCSL3     NM_181706.3
ZDHHC4    NM_018106.2
ZFHX4     NM_024721
ZFP64     NM_199427.1
ZFYVE26   NM_015346.2
ZIC3      NM_003413.2
ZNF532    NM_018181.3
ZNF541    NM_032255.1
ZNF546    NM_178544.2
ZNF548    NM_152909
ZNF569    NM_152484.2
ZNF644    NM_201269.1
ZNF646    NM_014699.2
ZNF674    NM_001039891
ZNF694    NM_001012981
ZNF707    NM_173831
ZNF75A    NM_153028.1
ZNHIT2    NM_014205.2
注：基因符号是Entrz Gene分配的标准符号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)。登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
Figure BPA00001231626401461
基因符号     登录号        基因符号  登录号         基因符号    登录号
COL3A1       NM_000090.2   DPEP1     NM_004413.1    FLJ10665    NM_018173.1
COL4A6       NM_001847.1   DPP10     NM_020868      FLJ10996    NM_019044.2
CORO1B       NM_020441.1   DPYSL2    NM_001386.3    FLJ11000    NM_018295.1
CORO2B       NM_006091.1   DSCAML1   NM_020693.2    FLJ12770    NM_032174.3
CPAMD8       NM_015692     DSTN      NM_006870.2    FLJ13305    NM_032180
CPE          NM_001873.1   DTNB      NM_183361      FLJ14803    NM_032842
CPO          NM_173077.1   DUSP21    NM_022076.2    FLJ16171    NM_001004348
CRB1         NM_201253.1   DUX4C     NM_001023569   FLJ16542    NM_001004301
CRNKL1       NM_016652     EDA       NM_001399.3    FLJ20294    NM_017749
CSDA         NM_003651.3   EDD1      NM_015902      FLJ20729    NM_017953.2
CSE1L        NM_001316.2   EFS       NM_005864.2    FLJ21019    NM_024927.3
CSMD1        NM_033225     EIF2S2    NM_003908.2    FLJ21986    NM_024913
CSMD3        NM_198123.1   EIF4G1    NM_198241.1    FLJ22679    NM_032227.1
CSNK1A1L     NM_145203.2   EML1      NM_004434      FLJ25477    NM_199138.1
CTCFL        NM_080618.2   EML2      NM_012155.1    FLJ32252    NM_182510
CTEN         NM_032865.3   EN1       NM_001426.2    FLJ32312    NM_144709.1
CTNNA1       NM_001903     ENPP2     NM_006209.2    FLJ33534    NM_182586.1
CTNND2       NM_001332.2   EPHA3     NM_005233.3    FLJ34633    NM_152365.1
CTSH         NM_004390.2   EPHA4     NM_004438.3    FLJ34922    NM_152270.2
CUBN         NM_001081.2   EPHA7     NM_004440.2    FLJ35834    NM_178827.3
CUTL1        NM_001913.2   EPHB1     NM_004441      FLJ36119    NM_153254.1
CX40.1       NM_153368.1   EPHB6     NM_004445.1    FLJ38964    NM_173527
CXorf53      NM_024332     ERCC6     NM_000124.1    FLJ40142    NM_207435.1
CYP4F8       NM_007253     ESSPL     NM_183375      FLJ42418    NM_001001695
DACT1        NM_016651.4   ETAA16    NM_019002.2    FLJ43339    NM_207380.1
DBC1         NM_014618.1   ETFDH     NM_004453.1    FLJ43980    NM_001004299
DCC          NM_005215.1   EVC2      NM_147127.2    FLJ44653    NM_001001678
DCHS1        NM_003737.1   EVL       NM_016337.1    FLJ45273    NM_198461.1
DDEFL1       NM_017707.2   EYA4      NM_004100.2    FLJ46082    NM_207417.1
DDHD2        NM_015214     EZH2      NM_004456.3    FLJ46154    NM_198462.1
DDI1         NM_001001711  F5        NM_000130.2    FLNC        NM_001458
DDIT3        NM_004083.3   F8        NM_000132      FMN2        NM_020066
DDN          NM_015086     FAM102B   NM_001010883   FN1         NM_002026.2
DDX53        NM_182699     FAM19A5   NM_015381      FNDC1       NM_032532
DEFA4        NM_001925.1   FAM26A    NM_182494      FOLH1       NM_004476.1
DEFB111      NM_001037497  FAM3A     NM_021806      FRAS1       NM_025074
DENND1C      NM_024898     FAM40A    NM_033088      FRAS1       NM_032863
DEPDC2       NM_024870.2   FANCG     NM_004629.1    FRMPD2      NM_152428.2
DGCR2        NM_005137     FAT       NM_005245      FRMPD4      NM_014728
DHRS2        NM_005794.2   FBN1      NM_000138      FRY         NM_023037
DJ167A19.1   NM_018982.3   FBN2      NM_001999      FSTL5       NM_020116.2
DKFZp761I21                FBXL2     NM_012157.2    FZD4        NM_012193.2
             NM_031449
23                         FBXO30    NM_032145.3    GAB4        NM_001037814
DLG3         NM_021120.1   FBXW7     NM_033632.1    GABPB2      NM_016654.2
DMD          NM_004021.1   FCN1      NM_002003.2    GABRA6      NM_000811.1
DMD          NM_004006.1   FCN2      NM_004108.1    GALGT2      NM_153446.1
DMRTA1       NM_022160.1   FERD3L    NM_152898.2    GALNS       NM_000512.2
DNAH1        NM_015512     FGF13     NM_033642.1    GDAP1L1     NM_024034.3
DNAH11       NM_003777     FGF14     NM_175929.1    GFI1        NM_005263
DNAH3        NM_017539.1   FHOD3     NM_025135      GFI1B       NM_004188.2
DNAH8        NM_001371.1   FIGN      NM_018086.1    GHRHR       NM_000823.1
DNAJC10      NM_018981     FLJ10241  NM_018035      GJA8        NM_005267
DNAJC6       NM_014787     FLJ10404  NM_019057      GLB1        NM_000404
DNALI1       NM_003462.3   FLJ10490  NM_018111      GLI3        NM_000168.2
DNAPTP6      NM_015535     FLJ10521  NM_018125.2    GLIPR1      NM_006851.1
DNASE1L3     NM_004944.1   FLJ10560  NM_018138.1    GMCL1L      NM_022471.2
基因符号   登录号         基因符号     登录号         基因符号   登录号
GNAS       NM_000516.3    KCNB2        NM_004770.2    LOC167127  NM_174914.2
GNRH1      NM_000825      KCNC4        NM_004978.2    LOC223075  NM_194300.1
GPBP1      NM_022913      KCND3        NM_004980.3    LOC388199  NM_001013638
GPR112     NM_153834      KCNH4        NM_012285.1    LOC91807   NM_182493.1
GPR124     NM_032777.6    KCNQ5        NM_019842.2    LPIN1      NM_145693.1
GPR158     NM_020752      KCNT1        NM_020822      LPPR2      NM_022737.1
GPR50      NM_004224      KCTD16       NM_020768      LRCH4      NM_002319
GPR8       NM_005286.2    KDR          NM_002253.1    LRP1       NM_002332.1
GPR87      NM_023915.2    KIAA0182     NM_014615.1    LRP2       NM_004525.1
GPX1       NM_000581      KIAA0367     NM_015225      LRRC4      NM_022143.3
GRID1      NM_017551      KIAA0415     NM_014855      LRRN6D     NM_001004432
GRID2      NM_001510.1    KIAA0528     NM_014802      LRTM2      NM_001039029
GRIK1      NM_175611      KIAA0555     NM_014790.3    LSP1       NM_001013253
GRIK3      NM_000831.2    KIAA0556     NM_015202      LZTS2      NM_032429.1
GRM1       NM_000838.2    KIAA0789     NM_014653      MAMDC1     NM_182830
GTF2B      NM_001514.2    KIAA0934     NM_014974.1    MAN2A2     NM_006122
GUCY1A2    NM_000855.1    KIAA1078     NM_203459.1    MAP1B      NM_005909.2
HAPIP      NM_003947.1    KIAA1185     NM_020710.1    MAP2       NM_002374.2
HAPLN1     NM_001884.2    KIAA1285     NM_015694      MAP2K7     NM_145185
HAT1       NM_003642.1    KIAA1409     NM_020818.1    MAPK8IP2   NM_012324
HBXIP      NM_006402.2    KIAA1468     NM_020854.2    MARLIN1    NM_144720.2
HCAP-G     NM_022346.2    KIAA1529     NM_020893      MAST1      NM_014975
HDC        NM_002112.1    KIAA1727     NM_033393      MCF2L2     NM_015078.2
HECTD1     NM_015382      KIAA1875     NM_032529      MCM3AP     NM_003906.3
HIC1       NM_006497      KIAA2022     NM_001008537   MCP        NM_172350.1
HIST1H1B   NM_005322.2    KIF13A       NM_022113      MCRS1      NM_006337.3
HIST1H1E   NM_005321.2    KL           NM_004795.2    MED12L     NM_053002
HIST1H2BM  NM_003521.2    KLF5         NM_001730.2    MEF2C      NM_002397
HIVEP1     NM_002114      KLRF1        NM_016523      MEGF6      NM_001409
HIVEP3     NM_024503.1    KRAS         NM_004985.3    MET        NM_000245
HK3        NM_002115.1    KRT20        NM_019010.1    MFN1       NM_033540.2
HOXC9      NM_006897.1    KRTAP10-2    NM_198693      MGC13125   NM_032725.2
HPS3       NM_032383.3    KRTAP10-8    NM_198695.1    MGC15730   NM_032880.2
HR         NM_005144.2    KSR2         NM_173598      MGC16943   NM_080663.1
HRH1       NM_000861.2    LAMA1        NM_005559      MGC20470   NM_145053
HS3ST4     NM_006040      LAMA4        NM_002290      MGC26733   NM_144992
HSPG2      NM_005529      LAMB3        NM_000228.1    MGC29671   NM_182538.3
HTR3C      NM_130770.2    LAMB4        NM_007356      MGC32124   NM_144611.2
HTR5A      NM_024012.11   LAMC1        NM_002293.2    MGC33407   NM_178525.2
HUWE1      NM_031407      LAS1L        NM_031206.2    MGC33846   NM_175885
IDH1       NM_005896.2    LCN10        NM_001001712   MGC39325   NM_147189.1
IGFBP3     NM_000598.2    LCN9         NM_001001676   MGC39545   NM_203452.1
IGSF22     NM_173588      LDB1         NM_003893.3    MGC48628   NM_207491
IGSF9      NM_020789.2    LDLRAD1      NM_001010978   MGC52022   NM_198563.1
IK         NM_006083      LEF1         NM_016269.2    MGC52282   NM_178453.2
IL6ST      NM_002184.2    LGR6         NM_021636.1    MGC5242    NM_024033.1
IQSEC3     NM_015232      LIFR         NM_002310.2    MGC8685    NM_178012.3
IREM2      NM_181449.1    LIG1         NM_000234.1    MKRN3      NM_005664.1
IRS2       NM_003749.2    LIG3         NM_013975.1    MLF2       NM_005439.1
IRS4       NM_003604.1    LILRB1       NM_006669      MLL3       NM_170606.1
ISLR       NM_201526.1    LMNB2        NM_032737.2    MMP11      NM_005940.2
ITGAE      NM_002208      LMO7         NM_005358.3    MMP2       NM_004530.1
ITGB3      NM_000212.2    LOC122258    NM_145248.2    MMRN2      NM_024756.1
ITPR1      NM_002222      LOC126147    NM_145807      MN1        NM_002430
K6IRS3     NM_175068.2    LOC129531    NM_138798.1    MPO        NM_000250.1
KCNA10     NM_005549.2    LOC157697    NM_207332.1    MPP3       NM_001932
基因符号  登录号          基因符号   登录号         基因符号  登录号
MRGPRE    NM_001039165    OSBPL5     NM_145638      PRIMA1    NM_178013.1
MRPL23    NM_021134       OTOP2      NM_178160.1    PRKCE     NM_005400.2
MS4A5     NM_023945.2     OVCH1      NM_183378      PRKCZ     NM_002744.2
MTHFD1L   NM_015440.3     OVGP1      NM_002557.2    PRKD1     NM_002742.1
MUC1      NM_002456.3     OXCT1      NM_000436.2    PRKDC     NM_006904
MUC16     NM_024690       P2RX7      NM_002562.4    PRNPIP    NM_024066
MYADML    NM_207329.1     P2RY14     NM_014879.2    PRO0149   NM_014117.2
MYO18B    NM_032608       PAK6       NM_020168.3    PROL1     NM_021225
MYO1B     NM_012223.2     PANK4      NM_018216.1    PROS1     NM_000313.1
MYO1D     NM_015194       PAOX       NM_207128.1    PRPS1     NM_002764.2
MYO5C     NM_018728       PARP8      NM_024615.2    PRSS1     NM_002769.2
MYOHD1    NM_001033579    PBEF1      NM_005746.1    PRTG      NM_173814
MYR8      NM_015011       PBX4       NM_025245.1    PSMA2     NM_002787.3
NALP7     NM_139176.2     PBXIP1     NM_020524.2    PSMC5     NM_002805.4
NALP8     NM_176811.2     PCDH11X    NM_032968.2    PTEN      NM_000314
NAV3      NM_014903       PCDHA9     NM_014005      PTPRD     NM_130391.1
NBEA      NM_015678       PCDHGA7    NM_032087      PTPRH     NM_002842
NCDN      NM_014284.1     PCDHGB4    NM_032098      PTPRN2    NM_002847.2
NCR1      NM_004829.3     PCP4       NM_006198      PTPRS     NM_130853.1
NDST3     NM_004784.1     PCSK2      NM_002594.2    PTPRU     NM_005704.2
NDUFA1    NM_004541.2     PDE11A     NM_016953      PTPRZ1    NM_002851
NEB       NM_004543       PDGFD      NM_033135.2    PZP       NM_002864.1
NELL1     NM_006157.2     PDILT      NM_174924.1    QKI       NM_006775.1
NEUGRIN   NM_016645.1     PDZD2      NM_178140      RAB38     NM_022337.1
NF1       NM_000267.1     PDZRN3     NM_015009      RAB5C     NM_201434.1
NFATC1    NM_006162.3     PDZRN4     NM_013377.2    RABEP1    NM_004703
NID       NM_002508.1     PEBP4      NM_144962      RALGDS    NM_006266.2
NLGN4X    NM_181332.1     PEG3       NM_006210.1    RAPGEF4   NM_007023
NODAL     NM_018055.3     PER1       NM_002616.1    RARB      NM_000965.2
NOS3      NM_000603.2     PERQ1      NM_022574      RASAL2    NM_170692.1
NR3C2     NM_000901.1     PEX5L      NM_016559.1    RASGRF2   NM_006909.1
NTNG1     NM_014917       PF6        NM_206996.1    RASGRP1   NM_005739
NUP210    NM_024923       PHIP       NM_017934.4    RASSF2    NM_170774.1
NUP210L   NM_207308       PHKB       NM_000293.1    RASSF4    NM_032023.3
OBSCN     NM_052843.1     PIGO       NM_032634.2    RAVER2    NM_018211
ODZ1      NM_014253.1     PIK3CA     NM_006218      RB1CC1    NM_014781
OLFM2     NM_058164.1     PIK3R5     NM_014308.1    RBM10     NM_005676.3
OMA1      NM_145243.2     PKHD1      NM_138694.2    RBP3      NM_002900.1
OR10G3    NM_001005465    PKHD1L1    NM_177531      RCN1      NM_002901.1
OR13F1    NM_001004485    PKNOX1     NM_004571.3    RDH13     NM_138412
OR1E2     NM_003554.1     PLA2G4B    NM_005090      RELN      NM_005045
OR2T33    NM_001004695    PLA2G4D    NM_178034      RET       NM_020975.2
OR2T34    NM_001001821    PLB1       NM_153021      REV3L     NM_002912.1
OR4A16    NM_001005274    PLCG2      NM_002661      RFC4      NM_181573.1
OR4K14    NM_001004712    PLEC1      NM_201378      RHEB      NM_005614.2
OR51E1    NM_152430       PLXND1     NM_015103      RHPN1     NM_052924
OR51T1    NM_001004759    PNLIPRP2   NM_005396      RIC3      NM_024557.2
OR5H6     NM_001005479    PNMA3      NM_013364      RIMBP2    NM_015347
OR5J2     NM_001005492    PNPLA1     NM_001039725   RIMS2     NM_014677
OR5K1     NM_001004736    PPM1F      NM_014634.2    RNF182    NM_152737.1
OR6C1     NM_001005182    PPP1R12A   NM_002480      RNF31     NM_017999
OR6C6     NM_001005493    PQBP1      NM_005710.1    RNPEPL1   NM_018226.2
OR6C75    NM_001005497    PQLC1      NM_025078.3    ROBO1     NM_002941
OR8K3     NM_001005202    PRDM9      NM_020227      ROBO2     NM_002942
OSBP      NM_002556.2     PRF1       NM_005041.3    RORA      NM_002943.2
OSBPL5    NM_020896       PRG2       NM_002728.4    RPA3      NM_002947.2
基因符号   登录号         基因符号   登录号         基因符号  登录号
RPAP1      NM_015540.2    SNRPB2     NM_198220.1    TRIM3     NM_033278.2
RPL6       NM_000970.2    SNTG2      NM_018968T     RIM71     NM_001039111
RPS6KB1    NM_003161.1    SNX5       NM_152227.1    TRMT5     NM_020810
RREB1      NM_001003699   SNX8       NM_013321.1    TSKS      NM_021733.1
RTN4       NM_207521.1    SOCS6      NM_004232.2    TSN       NM_004622
RUNX1T1    NM_175634.1    SORL1      NM_003105.3    TSP-NY    NM_032573.3
RYR2       NM_001035      SPOCK3     NM_016950      TSPYL5    NM_033512
SACS       NM_014363.3    SPTBN2     NM_006946.1    TTID      NM_006790.1
SALL2      NM_005407      ST8SIA4    NM_005668.3    TTLL3     NM_015644.1
SALL3      NM_171999.1    STAB1      NM_015136      TTN       NM_133378
SCN10A     NM_006514      STAM       NM_003473.2    TTYH2     NM_032646
SCN1A      NM_006920      STK32C     NM_173575.2    TXLNB     NM_153235
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SCNN1B     NM_000336.1    SUHW4      NM_001002843   UGDH      NM_003359.1
SCNN1G     NM_001039.2    SYNE1      NM_182961.1    UHRF2     NM_152896.1
SDBCAG84   NM_015966.2    SYNPO      NM_007286.3    UNC13B    NM_006377.2
SDCBP2     NM_080489.2    SYT9       NM_175733.2    UNC84B    NM_015374.1
SDK1       NM_152744      SYTL2      NM_206927      UNQ689    NM_212557.1
SEC24B     NM_006323      T3JAM      NM_025228.1    UQCRC2    NM_003366.1
SEC8L1     NM_021807.2    TAF1L      NM_153809      USP28     NM_020886
SEMA3D     NM_152754      TAF2       NM_003184      USP32     NM_032582
SERPINA3   NM_001085      TAIP-2     NM_024969.2    USP52     NM_014871.2
SETBP1     NM_015559.1    TA-KRP     NM_032505.1    UTP14C    NM_021645
SEZ6       NM_178860      TBC1D2B    NM_015079      UTX       NM_021140.1
SF3A1      NM_005877.3    TBX1       NM_005992.1    VEST1     NM_052958.1
SFMBT2     NM_001029880   TBX15      NM_152380      VIM       NM_003380.1
SFRS6      NM_006275.4    TBX22      NM_016954.2    VPS13A    NM_033305.1
SGEF       NM_015595      TCEB3B     NM_016427.2    WAC       NM_016628.2
SH3TC1     NM_018986.2    TCERG1L    NM_174937.1    WDR19     NM_025132
SHANK1     NM_016148.1    TCF3       NM_003200.1    WDR49     NM_178824.3
SHQ1       NM_018130      TCF7L2     NM_030756.1    WNK1      NM_018979.1
SIGLEC7    NM_014385.1    TCFL5      NM_006602.2    WNT16     NM_016087.2
SKIP       NM_030623      TCOF1      NM_000356.1    WNT8B     NM_003393.2
SKIV2L     NM_006929.3    TFEC       NM_012252.1    WRN       NM_000553.2
SLB        NM_015662.1    TFG        NM_006070.3    XKR3      NM_175878
SLC11A2    NM_000617.1    TGFBR2     NM_003242.3    XPO4      NM_022459
SLC12A5    NM_020708.3    TGM2       NM_004613.2    XRCC1     NM_006297.1
SLC12A7    NM_006598      TGM3       NM_003245      YEATS2    NM_018023
SLC1A7     NM_006671.3    THAP9      NM_024672.2    ZAN       NM_173059
SLC22A15   NM_018420      THRAP1     NM_005121      ZBTB8     NM_144621.2
SLC22A9    NM_080866.2    TIAM1      NM_003253.1    ZD52F10   NM_033317.2
SLC26A10   NM_133489.1    TLR8       NM_138636.2    ZDHHC7    NM_017740.1
SLC29A1    NM_004955.1    TLR9       NM_017442.2    ZFHX1B    NM_014795.2
SLC33A1    NM_004733.2    TM7SF4     NM_030788.2    ZFHX4     NM_024721
SLC37A4    NM_001467      TMEM132B   NM_052907      ZFPM2     NM_012082
SLC39A7    NM_006979      TMEM16B    NM_020373      ZNF155    NM_198089.1
SLC4A9     NM_031467      TMPRSS4    NM_019894      ZNF217    NM_006526.2
SLCO1A2    NM_134431.1    TNFRSF9    NM_001561.4    ZNF232    NM_014519.2
SLCO1B3    NM_019844.1    TNN        NM_022093      ZNF235    NM_004234
SLITRK4    NM_173078.2    TNNI3K     NM_015978.1    ZNF262    NM_005095.2
SLITRK6    NM_032229      TOP2A      NM_001067      ZNF291    NM_020843
SMAD2      NM_005901.2    TP53       NM_000546.2    ZNF43     NM_003423.1
SMAD3      NM_005902.2    TP53BP1    NM_005657.1    ZNF435    NM_025231.1
SMAD4      NM_005359.3    TPX2       NM_012112.4    ZNF442    NM_030824.1
SMTN       NM_006932.3    TREX2      NM_080701      ZNF471    NM_020813.1
基因符号    登录号
ZNF480      NM_144684.1
ZNF521      NM_015461
ZNF536      NM_014717
ZNF540      NM_152606.2
ZNF560      NM_152476.1
ZNF568      NM_198539
ZNF572      NM_152412.1
ZNF582      NM_144690
ZNF624      NM_020787.1
ZNF659      NM_024697.1
ZNF714      NM_182515
ZNHIT1      NM_006349.2
ZNRF4       NM_181710
ZSCAN5      NM_024303.1
ZZZ3        NM_015534.3
注：基因符号是Entrz Gene分配的标准符号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene)。登录号“NM_XXXX”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)唯一地分配给每个基因的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore)。
Figure ISB00000308631900011
Figure ISB00000308631900021
Figure ISB00000308631900031
Figure ISB00000308631900041
Figure ISB00000308631900051
Figure ISB00000308631900061
Figure ISB00000308631900071
Figure ISB00000308631900081
Figure ISB00000308631900091
Figure ISB00000308631900101

Claims (61)

1.一种诊断方法，其中，所述方法辅助检测受试者的疾病或其他医学病况，所述方法包括以下步骤：
(a)从来自所述受试者的生物样本中分离微泡部分；
(b)检测在所述微泡部分内是否存在生物标志物，其中所述生物标志物与所述疾病或其他医学病况有关。
2.一种监测方法，其中，所述方法辅助监测受试者的疾病或其他医学病况的状态，所述方法包括以下步骤：
(a)从来自所述受试者的生物样本中分离微泡部分；
(b)检测在所述微泡部分内是否存在生物标志物，其中所述生物标志物与所述疾病或其他医学病况有关。
3.一种评价方法，其中，所述方法辅助评价在患有疾病或其他医学病况的受试者中的治疗效力，所述方法包括以下步骤：
(a)从来自所述受试者的生物样本中分离微泡部分；
(b)检测在所述微泡部分内是否存在生物标志物，其中所述生物标志物与所述疾病或其他医学病况的治疗效力有关。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述生物样本是体液样本。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是：
(i)核酸物质；
(ii)核酸的表达水平；
(iii)核酸变体；或
(iv)它们的组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是信使RNA、微小RNA、siRNA或shRNA。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是DNA、单链DNA、互补DNA或非编码DNA。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述疾病或其他医学病况是肿瘤性疾病或病况。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述生物标志物是表3-15的任一个中列出的核酸，或它的变体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述疾病或其他医学病况是成胶质细胞瘤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述生物标志物是表8-12的任一个中列出的核酸，或它的变体。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是微小RNA-21。
13.根据权利要求8所述的方法，其中，所述生物标志物与临床上独特的肿瘤类型或亚型有关。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是EGFR基因中的变体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述生物标志物是EGFRvIII突变。
16.根据权利要求8所述的方法，其中，所述生物标志物与前列腺癌有关。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述生物标志物是TMPRSS2-ERG、PCA-3、PSA或它们的变体。
18.根据权利要求8所述的方法，其中，所述生物标志物与黑素瘤有关。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述生物标志物是BRAF变体。
20.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是选自由let-7a、miR-15b、miR-16、miR-19b、miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-92、miR-93、miR-320和miR-20组成的组中的一种或多种核酸的表达水平。
21.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述疾病或其他医学病况是代谢疾病或病况。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述代谢疾病或状况是糖尿病、炎症或围产期病况。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述代谢疾病或病况与铁代谢有关。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述生物标志物是编码海帕西啶的核酸，或者它的片段或变体。
25.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述医学病况是移植后病况。
26.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是编码基质金属蛋白酶家族成员的mRNA。
27.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是表10中列出的核酸。
28.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述疾病或其他医学病况是癌症并且所述生物标志物是Kras基因的核酸变体。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，所述微泡部分中的微泡的直径在约30nm至约800nm的范围内。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述范围为约30nm至约200nm。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，通过尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来实施步骤(a)。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述生物标志物是核酸并且所述方法进一步包括所述核酸的扩增。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，通过微阵列分析、PCR、与等位基因特异探针杂交、酶促突变检测、连接链反应(LCR)、寡核苷酸连接测定(OLA)、流式细胞法异源双链分析、错配的化学切割、质谱、核酸测序、单链构型多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、限制性片段多态性、基因表达的系列分析(SAGE)或它们的组合来实施所述检测步骤b)。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，进一步包括分离来源于特定类型细胞的选择性微泡部分。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述细胞是肿瘤细胞。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述微泡部分来源于肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结直肠、乳腺、前列腺、脑、食管、肝、胎盘、胎儿细胞或它们的组合。
37.根据权利要求34所述的方法，其中，所述选择性微泡部分基本上由尿液微泡组成。
38.一种诊断方法，其中，所述方法辅助检测受试者的疾病或其他医学病况，所述方法包括以下步骤：
(a)从所述受试者获得生物样本；和
(b)确定所述生物样本内的微泡的浓度。
39.一种监测方法，其中，所述方法辅助监测受试者的疾病或其他医学病况的状态，所述方法包括以下步骤：
(a)从所述受试者获得生物样本；和
(b)确定所述生物样本内的微泡的浓度。
40.根据权利要求38或39所述的方法，进一步包括在确定所述浓度之前从所述生物样本中分离微泡部分的步骤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来实施所述分离步骤。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中，所述微泡部分来源于特定类型的细胞。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述细胞是肿瘤细胞。
44.根据权利要求42所述的方法，其中，所述微泡部分来源于肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结直肠、乳腺、前列腺、脑、食管、肝、胎盘、胎儿细胞或它们的组合。
45.根据权利要求42所述的方法，其中，所述选择性微泡部分基本上由尿液微泡组成。
46.根据权利要求38-45中任一项所述的方法，其中，所述微泡的直径在约30nm至约800nm的范围内。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述范围为约30nm至约200nm。
48.一种用于将核酸或蛋白质递送到个体中的靶细胞的方法，包括将含有所述核酸或蛋白质的一个或多个微泡、或产生这样的微泡的一个或多个细胞给予所述个体，以使所述微泡进入所述个体的所述靶细胞。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，微泡被递送到脑细胞。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中，递送的所述核酸是siRNA、shRNA、mRNA、微小RNA、DNA或它们的组合。
51.一种用于实施体液输注的方法，包括以下步骤：获得完全不含或基本上完全不含微泡、或完全不含或基本上完全不含来自特定细胞类型的微泡的供体体液部分，并将所述不含微泡的部分引入到患者。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述细胞类型是肿瘤细胞类型。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中，所述体液是血液、血清或血浆。
54.一种物质的组合物，包含完全不含或基本上完全不含微泡、或完全不含或基本完全不含来自特定细胞类型的微泡的体液样本。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中，所述体液是血液、血清或血浆。
56.一种用于实施体液输注的方法，包括以下步骤：获得供体体液的富含微泡部分并将所述富含微泡部分引入到患者。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述部分富含来源于特定细胞类型的微泡。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中，所述体液是血液、血清或血浆。
59.一种物质的组合物，包含富含微泡的体液样本。
60.根据权利要求59所述的组合物，其中，所述微泡来源于特定细胞类型。
61.根据权利要求59或60所述的组合物，其中，所述体液是血液、血清或血浆。
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