FR2981662A1 - Methode de quantification de marqueurs renaux par dosage urinaire. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro de pathologies rénales chez un patient. Selon l'invention, un tel procédé comprend les étapes suivantes : a) obtention d'un échantillon d'urine provenant dudit patient, b) détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur de ladite pathologie rénale et d'au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales, et c) détermination d'un seuil d'expression dudit au moins un marqueur de ladite pathologie rénale par normalisation dudit au moins un marqueur de ladite pathologie rénale par ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales.

Description

Méthode de quantification de marqueurs rénaux par dosage urinaire. 1. Domaine de l'invention Le domaine de l'invention est celui de la néphrologie.

Plus précisément, l'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro de pathologies rénales. 2. Art antérieur Les maladies rénales peuvent atteindre les différents compartiments structurels du rein : les vaisseaux, les glomérules, les tubules, l'interstitium. Ces atteintes conduisent à l'insuffisance rénale aiguë et/ou chronique, leur évolution ultime étant la destruction complète des unités fonctionnelles du rein, remplacées par une expansion de la matrice extracellulaire, c'est-à-dire la fibrose rénale. À ces atteintes du rein correspondent diverses étiologies : obstruction des voies excrétrices, inflammation, auto-immunité, allergie, maladies de dépôts, hypertension, diabète, vasculopathies, ischémie, toxicité... Les maladies rénales peuvent toucher les reins natifs ou les allogreffes après une transplantation rénale. En France, on estime à 3000 nouveaux cas de patients greffés par an (rein, coeur, foie, moelle, poumon...). Le suivi systématique des patients transplantés a permis d'étudier les temps précoces des maladies rénales évoluant vers la fibrose. L'expression dans le tissu rénal de marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), permettent de détecter précocement une maladie fibrosante des tissus rénaux, qui peut être causée par l'ischémie, le rejet, ou la toxicité des immunosuppresseurs (la cyclosporine en particulier) (Slattery and al, Am J Pathol. 2005 August; 167(2): 395-407 ; Hertig et al, American Journal of Transplantation 2006, Galichon et al, Fibrogenesis Tissue Repair 2011 ; Galichon et al,. Transplantation, 2011). La TEM est un processus dynamique au cours duquel des cellules perdent leurs caractéristiques épithéliales et acquièrent des caractéristiques mésenchymateuses. Ces modifications affectent à la fois la morphologie de la cellule ainsi que son fonctionnement. Lorsqu'elle atteint les cellules tubulaires rénales, elle témoigne d'une évolution vers la fibrose et l'insuffisance rénale chronique (Hertig et al, J Am Soc Nephrol 2008). Il est donc nécessaire de surveiller l'apparition de ce phénomène chez les patients ayant subi une transplantation afin d'adapter ou modifier le traitement immunosuppresseur. À l'heure actuelle, la méthode de référence mise en oeuvre pour la détection et la surveillance de toute pathologie rénale est la biopsie. La biopsie consiste à prélever une carotte de tissu dans le rein par voie transcutanée, transveineuse, ou chirurgicale. Cet échantillon est ensuite soumis à un examen histologique pour détecter des signes éventuels de pathologie (destruction, infiltration cellulaire ou hypertrophie des compartiments glomérulaire, tubulaire, vasculaire ou interstitiel). Cette méthode comprend toutefois de multiples inconvénients. Le prélèvement n'est pas sans risque pour le patient. De nombreuses complications sont observées comme l'hématurie, l'insuffisance rénale sur obstacle voire l'anurie, l'apparition d'hématomes dans la région périrénale, l'apparition de fistules artérioveineuses, et de manière plus rare l'hémorragie, la perte du greffon, le décès. Outre les risques liés à tout geste invasif, il est possible de réaliser la biopsie dans une région non représentative de l'état global du rein et par conséquent de sous-estimer ou surestimer la situation réelle du patient du fait de cet échantillonnage. De plus, dans la mesure où les biopsies ne peuvent être réalisées systématiquement à intervalles réguliers, cette méthode ne permet pas non plus de détecter précocement l'apparition d'une pathologie. Par ailleurs, pratiquer une biopsie rénale est une opération coûteuse, complexe, invasive et pénible pour le patient. Il est donc nécessaire de trouver une méthode de diagnostic non-invasive, simple, économique, fiable, précoce et présentant le moins de risque possible pour le 25 patient. 3. Objectifs de l'invention L'invention a notamment pour objectif de pallier ces inconvénients de l'art antérieur.

Plus précisément, un objectif de l'invention est de fournir, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic précoce des pathologies rénales ou des pathologies ayant des répercussions rénales. Un autre objectif de l'invention est de mettre en oeuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic non invasif. L'invention a encore pour objectif de mettre en oeuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic fiable et précis. Un autre objectif de l'invention est de mettre en oeuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic simple à réaliser.

Un autre objectif de l'invention est de mettre en oeuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic plus économique. Un autre objectif de l'invention est de mettre en oeuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de suivi de l'efficacité et la tolérance d'un traitement. Enfin, un autre objectif de l'invention est de mettre en oeuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic moins douloureux pour le patient. 4. Exposé de l'invention Ces objectifs, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints, en tout ou partie, à l'aide d'un procédé de diagnostic in vitro de pathologies chez un 20 patient. Selon l'invention, un tel procédé comprend les étapes suivantes : a) obtention d'un échantillon urinaire provenant dudit patient, b) détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur de ladite pathologie et d'au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales, et c) détermination d'un seuil d'expression dudit au moins un marqueur de ladite pathologie par normalisation dudit marqueur de ladite pathologie par ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales. Ainsi, l'invention repose sur l'utilisation des cellules contenues dans l'urine afin 30 d'en extraire le matériel génétique et de comparer l'expression d'un gène d'intérêt, 25 corrélé à une pathologie, avec l'expression d'un gène spécifique des cellules urinaires non touchées par la pathologie. L'urine contient en effet une petite quantité de cellules urothéliales, provenant du renouvellement normal de l'épithélium du tube urinaire. Elle peut également contenir, en quantité variables (en fonction notamment de la présence d'une pathologie rénale), des leucocytes, des cellules tubulaires ou glomérulaires rénales, des hématies ... Bien que rares, il est possible, avec les méthodes de biologie moléculaire et de biochimie actuelles, d'extraire les acides nucléiques et les protéines des cellules contenues dans l'échantillon d'urine du patient. Afin d'éliminer le biais lié à la quantité de cellules dans l'échantillon, il est d'usage d'exprimer l'expression du gène d'intérêt en fonction de l'expression d'un gène de ménage tel que les gènes de la GAPDH (glycerladéhyde 3-phosphate deshydrogenase), l'ARN ribosomial 18S, la cyclophiline A ou B, la I3-caténine ou encore 1'HPRT (Hypoxantine-guanine PhosphoRibosylTransférase) (Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction, S.A.Bustin, Journal of Molecular Endocrinology, 2000, 25, 169-193). Cependant, cette méthode ne tient pas compte de la spécificité cellulaire des pathologies. Ainsi, la modification de l'expression d'un gène lié à une pathologie affectant un type cellulaire précis peut être masquée par l'importante expression du gène ménager, provenant des autres types cellulaires présents dans l'urine. Un des apports de l'invention est donc la normalisation de l'expression du gène d'intérêt par l'expression d'un gène indépendant du type cellulaire affecté. Cette étape de normalisation permet de déterminer un seuil d'expression du marqueur pathologique par rapport à un marqueur urinaire indépendant des variations quantitatives et qualitatives des cellules urinaires de provenance rénale. Il est alors possible de savoir si ce marqueur est exprimé de manière importante ou, au contraire, très faible. Cette caractéristique permet d'obtenir un test diagnostique fiable, précis et reflétant plus exactement l'état de santé du patient Ainsi, le procédé selon l'invention peut être utilisé à des fins diagnostiques ou pour surveiller l'évolution d'une pathologie.

De plus, travailler à partir d'un échantillon d'urine présente de nombreux avantages : - l'échantillon est facilement accessible; - le prélèvement est non invasif et indolore, - le prélèvement est économique. La simplicité de cette méthode permet également d'être mise en oeuvre dans tous types de laboratoires d'analyse, sans faire appel à des compétences techniques particulières ou du matériel autre que celui habituellement utilisé. L'absence d'investissement particulier pour la mise en oeuvre de cette méthode permet ainsi de diminuer les coûts d'analyse. L'invention concerne en outre un procédé de diagnostic in vitro dans lequel l'étape b) comprend la détection du produit de transcription dudit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et du produit de transcription dudit au moins un marqueur de ladite pathologie.

L'étude des produits de transcription est plus fiable que l'étude de la présence d'un gène dans le génome de la cellule. Il est en effet notoire que la présence d'un gène dans le génome d'une cellule n'est pas nécessairement corrélable à son expression dans ladite cellule, la régulation de l'expression d'un gène particulier étant soumise à de nombreux paramètres. La détection du produit de transcription permet donc d'obtenir un résultat plus précis et plus fiable. Un autre objet de l'invention est un procédé dans lequel l'étape b) est mise en oeuvre au moyen d'une technique d'amplification d'acides nucléiques choisie parmi le groupe comprenant la RT-PCR, la PCR quantitative, la PCR en point final, la PCR semi-quantitative ou leur combinaison.

On entend par PCR( Polymerase Chain Reaction), ou réaction de polymérisation en chaîne, la technique consistant à répliquer in vitro un fragment d'ADN ciblé. On entend par RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), ou réaction de polymérisation en chaîne suite à une transcription inverse, la synthèse in vitro d'ADN complémentaire à partir d'ARN messagers extraits. On entend par PCR quantitative, également appelée PCR en temps réel, la technique de réplication in vitro d'un fragment d'ADN ciblé permettant en outre de mesurer la quantité initiale de ce fragment cible. La PCR semi-quantitative se distingue de la PCR quantitative en ce que la PCR est interrompue en plusieurs points, permettant d'évaluer la quantité d'ADN initiale. Ce type de PCR est utile lorsque la quantité d'ADN est inhabituellement faible. LA PCR en point final associe la technique du Northern Blot à la PCR classique afin d'évaluer la quantité initiale d'ADN grâce à la comparaison des bandes sur gel d'agarose. Ces méthodes, peu coûteuses à mettre en oeuvre, présentent l'avantage de fournir un résultat rapide et fiable, compatible avec les exigences d'un test diagnostique. L'invention concerne en outre un procédé de diagnostic in vitro dans lequel l'étape b) est mise en oeuvre au moyen d'une technique d'hybridation d'acides nucléiques choisie parmi le groupe comprenant l'hybridation in situ (ISH), l'hybridation in situ avec marquage par fluorescence (FISH), la biopuce, le Northern Blot ou le Southern Blot. L'invention concerne également un procédé de diagnostic in vitro dans lequel l'étape b) est mise en oeuvre via une méthode de séquençage des acides nucléiques. L'invention a encore pour un objet un procédé de diagnostic in vitro dans lequel ladite pathologie est une pathologie rénale et est choisie dans le groupe comprenant une fibrose rénale, un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales, un rejet de greffon, un cancer, les maladies glomérulaires (diabète, glomérulonéphrite extramembraneuse, lésions glomérulaires minimes, hyalinose segmentaire et focale...), les maladies tubulaires (nécrose tubulaire aigüe, expression de marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse, atrophie, rejet cellulaire, obstruction des voies excrétrices..), les maladies interstitielles (inflammation, fibrose), les maladies vasculaires du rein (hypertension artérielle, microangiopathie thrombotique, rejet humoral..). Un autre objet de l'invention est un procédé au cours duquel ledit patient a reçu une greffe d'organe et ladite pathologie rénale est la présence de fibrose interstitielle, une atrophie tubulaire ou de marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse dans le greffon rénal.

Le procédé selon l'invention permet donc de détecter efficacement et précocement la survenue d'une pathologie rénale comme l'inflammation ou la TEM, induisant des changements phénotypiques épithéliaux dans le rein. L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro dans lequel au moins un marqueur génétique spécifique de ladite pathologie rénale est choisi parmi 5 le groupe comprenant les gènes humains de CD45 (SEQ ID 1), CD68 (SEQ ID 2), et la vimentine (SEQ ID 3). Les inventeurs ont découvert de façon surprenante que l'expression de ces gènes est considérablement augmentée dans les urines de patients greffés du rein. Cette sur-expression est corrélable à la présence de changements phénotypiques épithéliaux, 10 survenant lors d'une transition épithélio-mésenchymateuse, et de l'atteinte tubulo- interstitielle sur les biopsies d'allogreffe rénale, ces biopsies étant effectuées dans le cadre d'un dépistage systématique trois mois après la transplantation. Il est possible, au sens de l'invention, de ne rechercher l'expression que d'un seul gène, marqueur spécifique d'une pathologie. Il est toutefois préférable, afin d'affiner le diagnostic, de 15 rechercher une combinaison de différents gènes dont l'expression dans les urines rend compte de la présence d'une pathologie rénale particulière. On peut citer à titre d'exemple, la recherche de l'expression des gènes de CD45 et CD68, normalisée par l'uroplakine, pour détecter la présence de cellules inflammatoires dans le greffon. On peut également rechercher l'expression de certains marqueurs tumoraux. On peut citer, 20 à titre d'exemple de marqueurs pour le carcinome à cellules claires, la recherche de la racemase, la caveolin-1 (SEQ ID 29), ROR1 (SEQ ID 30), CD10 (SEQ ID 31), keratine 7, vimentine (SEQ ID 3), TP53 (SEQ ID 26) dans le cadre de la surveillance d'un cancer rénal. Selon un autre mode de réalisation avantageux, ladite pathologie est une 25 pathologie modifiant la quantité de cellules excrétées dans l'urine. Préférentiellement, ladite pathologie modifiant la quantité de cellules excrétées dans l'urine est choisi parmi le groupe comprenant les maladies glomérulaires telle que la hyalinose segmentaire et focale, les maladies tubulaires tubulaires tels que la nécrose tubulaire aigüe, les changements phénotypiques épithéliaux, le rejet cellulaire et les 30 maladies interstitielles tels que le rejet aigu d'un greffon, la maladie de Sjôgren et la sarcoïdose. La nécrose tubulaire se traduit par une augmentation du nombre de cellules tubulaires dans les urines, due à une importante desquamation des parois de l'urètre et uretère. La hyalinose segmentaire ou focale s'accompagne d'une importante quantité de podocytes dans l'urine. L'augmentation du nombre de leucocytes est signe d'un rejet aigu d'un greffon. Un autre objet de l'invention est un procédé de diagnostic in vitro dans lequel ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de l'uroplakine lA (SEQ ID 4), l'uroplakine 1B (SEQ ID 5), l'uroplakine 2 (SEQ ID 6), l'uroplakine 3A (SEQ ID 7), l'uroplakine 3B (SEQ ID 8), l'uroplakine 3BL (SEQ ID 9), Bcasl (SEQ ID 10), CEP152 (SEQ ID 11), CRABP2 (SEQ ID 12), DNASE1 (SEQ ID 13), KRT20 (SEQ ID 14), PLEKHF1 (SEQ ID 15), PLEKHG4B (SEQ ID 16), RCN1 (SEQ ID 17), SEMA5B (SEQ ID 18), SULT2A1 (SEQ ID 19), TFF1 (SEQ ID 20), VILL (SEQ ID 21), ZNF720 (SEQ ID 22).

Ces gènes sont spécifiquement et constamment exprimés par les cellules urothéliales, indépendamment des pathologies rénales. Ils constituent donc des référentiels de choix pour la normalisation de gènes liés à une pathologie affectant spécifiquement les cellules rénales ou modifiant leur quantité dans les urines. On entend par normalisation l'élimination des biais liés à des erreurs de mesure 20 ou de manipulation, et indépendants des variations biologiques. L'étape de normalisation permet donc de produire des résultats plus fiables. Normaliser en utilisant des gènes spécifiques des cellules affectées par la pathologie recherchée permet d'éliminer le biais lié à la proportion de ces mêmes cellules dans l'échantillon urinaire. En effet, la composition quantitative et qualitative de l'urine n'est pas fixe soit du fait 25 du débit urinaire, soit du fait de la maladie. Le risque de mésestimer la progression réelle de la pathologie chez le patient est donc réel, et pourrait se révéler dommageable pour sa prise en charge thérapeutique. À titre d'exemple, lorsque la technique de PCR quantitative a été utilisée, la normalisation constitue en un passage de l'échelle logarithmique (qui correspond au 30 résultat brut) à une échelle linéaire en deux étapes : (1) Cp marqueur spécifique de cellules urothéliales Cp marqueur pathologique = ACp, le Cp, ou crossing point, étant le nombre de cycles d'amplification avant détection du signal fluorescent par l'appareil. (2) Niveau d'expression du marqueur pathologique normalisé = 2 ACp Lorsqu'une migration sur gel est mise en oeuvre pour la visualisation des résultats, comme c'est le cas pour la PCR classique suivie d'une migration sur gel d'agarose, ou pour les techniques de Northern et Southern Blot, l'opérateur devra mesurer les densités optiques de chaque bande de migration avec tout logiciel usuel (Image JTM, UN-SCAN-IT Ge1TM) et en faire le rapport pour déterminer le seuil d'expression du gène d'intérêt chez le patient. Le seuil d'expression se calcule alors comme suit : Niveau d'expression du marqueur pathologique normalisé = densité optique marqueur pathologique/ densité optique marqueur cellules urothélial. L'invention a encore pour objet un procédé de diagnostic in vitro comprenant en outre une étape de comparaison du seuil d'expression dudit marqueur d'une pathologie rénale à un seuil d'expression inchangé par la maladie. La comparaison avec un patient sain permet de constater l'influence positive ou négative d'une pathologie sur la régulation de l'expression d'un gène, normalement exprimé. Elle s'effectue comme suit : Régulation d'un gène = 2 (ACp patient - ACp sain) Outre la comparaison avec un patient sain, il est possible de surveiller l'évolution d'un greffon ou d'un état pathologique grâce au procédé selon l'invention. Il est en effet possible de conserver les résultats précédents d'un patient et de les utiliser comme référentiel. Cette normalisation interne permet d'éliminer les biais dus aux différences interindividuelles. Elle permet également le suivi médical du patient et la surveillance de sa maladie ou du greffon. L'invention comprend en outre un kit de diagnostic in vitro pour la détection de pathologies à partir d'un échantillon urinaire provenant d'un patient comprenant au moins un couple d'amorces pour la détection, dans ledit échantillon, d'au moins un 30 marqueur spécifique d'une pathologie et au moins un couple d'amorces pour la détection d'au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales. Avantageusement, ladite pathologie est une fibrose rénale ou un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales, et ledit au moins un marqueur spécifique d'une pathologie rénale est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de CD45, CD68 et la vimentine. Dans un mode de réalisation d'avantage préféré, ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de l'uroplakine 1A, l'uroplakine 1B, l'uroplakine 2, l'uroplakine 3A, l'uroplakine 3B, l'uroplakine 3BL, Bcasl, CEP152, CRABP2, DNASE1, KRT20, PLEKHF1, PLEKHG4B, RCN1, SEMA5B, SULT2A1, TFF1, VILL, ZNF720. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation du kit de diagnostic in vitro pour la détection d'une pathologie rénale, ladite pathologie rénale étant une fibrose ou un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales. 5. Liste des figures D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation préférentiel, donné à titre de simple exemple illustratif et non limitatif, et des dessins annexés, parmi lesquels : - la figure 1 présente un graphique représentant la corrélation des scores de TEM avec les résultats de PCR urinaire de la vimentine, normalisé par la GAPDH. - la figure 2 illustre la corrélation des mêmes scores de TEM avec les mêmes résultats de PCR urinaire pour la vimentine, lorsque ces derniers sont normalisés par le gène de l'uroplakine. - la figure 3 présente un graphique représentant la corrélation des scores de TEM avec les résultats de PCR urinaire de CD68, normalisé par la GAPDH. - la figure 4 montre la corrélation des mêmes scores de TEM avec les mêmes résultats de PCR urinaire pour CD68, lorsque ces derniers sont normalisés par le gène de l'uroplakine. - la figure 5 représente la corrélation des scores de TEM avec les résultats de PCR urinaire de CD45, normalisé par la GAPDH. la figure 6 décrit la corrélation des mêmes scores de TEM avec les mêmes résultats de PCR urinaire pour CD45, lorsque ces derniers sont normalisés par le gène de l'uroplakine. 6. Description d'un mode de réalisation de l'invention Le principe général de l'invention repose sur la comparaison de l'expression d'un gène corrélé à un phénomène pathologique à l'expression d'un gène de référence indépendant des cellules affectées par cette même pathologie.

Exemple 1 : Diagnostic des changements phénotypiques épithéliaux du greffon rénal grâce au procédé selon l'invention. Afin d'évaluer la sensibilité du procédé de diagnostic selon l'invention, on effectue des biopsies rénales sur des patients ayant subi une transplantation d'organe et traités à la CsA. Parallèlement, un échantillon de leur urine est collecté. Dans ces échantillons, des marqueurs associés à un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales sont recherchés par PCR quantitative. Afin de démontrer la supériorité du procédé selon l'invention, les résultats de PCR quantitative seront normalisés en fonction d'un gène de référence urothélial, conformément au procédé selon l'invention, et en fonction d'un gène de ménage, conformément à la méthode classique et décrite dans la littérature. Les biopsies de contrôle des patients greffés sont analysées par le laboratoire d'anatomopathologie de l'hôpital Tenon (Paris). L'expression protéique de la vimentine et de la B-caténine, marqueurs de TEM, est recherchée selon les méthodes d'immunohistochimie bien connues de l'homme de l'art. Le score de TEM est déterminé en fonction du pourcentage de tubules rénaux exprimant les marqueurs de TEM, c'est-à-dire la vimentine et la 13-caténine (Hertig et al, American Journal of Transplantation 2006). Ces scores s'expriment comme suit : - score = 0 : pas de TEM; - score = 1 : <10% des tubules rénaux sur la biopsie présentent les marqueurs de TEM; - score = 2 : 10-24% des tubules rénaux sur la biopsie présentent les marqueurs de TEM; - score = 3 : 25-50% des tubules rénaux sur la biopsie présentent les marqueurs de TEM; - score = 4 : >50% des tubules rénaux sur la biopsie présentent les marqueurs de TEM. On considère que le patient est positif pour la TEM dès que le score est supérieur ou égal à 2. 1. Prélèvement d'urine et préparation du lysat cellulaire On prélève, chez ces patients, 50 ml d'urine fraîche dans un tube Falcon®. Le prélèvement est effectué dans les trois semaines précédant la biopsie afin d'éviter la présence d'hématie dans les urines. Les patients choisis ne présentent aucune trace d'infection urinaire, et n'avaient pas de diurèse résiduelle avant la transplantation. La première miction de la journée n'est pas utilisée. L'échantillon urinaire est centrifugé à 2000 rpm pendant 20 min, à température ambiante (Tamb). Un volume de 2 ml de surnageant est stocké à -80°C. Le reste du surnageant est éliminé. Le culot, contenant les cellules et les minéraux, est repris dans un volume de 15 ml de solution tampon PBS1X. La suspension cellulaire est à nouveau centrifugée pour éliminer les débris pendant 10 min, à 2000 rpm, Tamb. Le surnageant est éliminé, le culot est égoutté par retournement du tube avant d'être resuspendu dans 150 pl de tampon de lyse RLT, supplémenté par 1% volumique de (3-mercapto-éthanol (solution à 14,3 M). Le tampon RLT est fourni par les laboratoires Qiagen, dans le kit RNeasy® micro. À cette étape, le lysat ainsi obtenu peut être conservé à -80°C ou être directement utilisé pour procéder à l'extraction d'ARN. 2. Extraction des ARN Les ARN messagers (ARNm) sont extraits à partir des cellules présentes dans l'échantillon urinaire. Les marqueurs indicateurs de pathologie, de fibrose ou de la TEM ne sont généralement exprimés que lorsque ces phénomènes apparaissent. Étudier leur transcription est donc plus pertinent que rechercher leur présence dans le génome. Les ARN sont extraits à partir du lysat cellulaire, préparé comme décrit précédemment, grâce au kit RNeasy® micro (Qiagen) conformément au protocole fourni par le fabricant. Plus précisément, le protocole suivi est le protocole « Tissus obtenus par microdissection ». Brièvement, un volume d'éthanol 70% stérile est ajouté au lysat homogénéisé, conformément aux indications du protocole. Le lysat est déposé, en tout ou partie, dans une colonne RNeasy®, fournie avec le kit. Les colonnes sont centrifugées 15 secondes, à une vitesse de rotation supérieure à 10 000 rpm, à 4°C.

L'effluent est éliminé. La colonne est lavée par du tampon RW1, fourni avec le kit. Les ARN sont élués, puis récupérés dans 14 pl d'eau dénuée de RNAse. 3. Synthèse de l'ADN complémentaire. La transcription reverse des ARN extraits précédemment est réalisée à l'aide du kit QuantiTect® Reverse Transcription (Qiagen). Brièvement, la solution d'ARN produite précédemment est additionnée de tampon gDNA Wipeout Buffer, fourni dans le kit, avant d'être incubé à 42°C, pendant 2 min. Cette étape permet d'éliminer l'ADN génomique résiduel. Le mélange rétro-transcriptionnel contient les bases nucléiques (RT Primer Mix), la rétro-transcriptase (Quantiscript® Reverse Transcriptase) et le tampon réactionnel (Quantiscript® RT Buffer). Il est ajouté à la solution d'ARN. Le mélange est incubé 15 min, à 42°C, pour que la rétro-transcription s'effectue. Le mélange est ensuite incubé 3 min, à 95°C, afin d'inactiver la rétro-transcriptase. La solution d'ADN complémentaire ainsi prête peut être conservée ou diluée au 1/10ême avant analyse. 4. PCR quantitative. La PCR quantitative est utilisée pour évaluer la quantité initiale de produits de transcirption dans les cellules. Elle permet ainsi de déterminer si un gène est sur-régulé ou sous-régulé. Brièvement, on prépare un mélange réactionnel contenant : - 5 pl de SYBR® Green Master Mix 2X (Laboratoires Roche) / puits, - 0,25 pl de chaque amorce à 10 pM (Laboratoires Roche) / puits, - 1,5 pl d'eau stérile / puits. 7 pl de ce mélange réactionnel sont déposés par puits, dans une plaque de 96 puits (Laboratoires Roche). 3 pl d'ADN complémentaire de chaque patient, dilué au 1/10', sont ajoutés par puits. La plaque est ensuite centrifugée à 1500 g, pendant 2 min, avant d'être introduite dans l'automate LightCycler 480 (Laboratoires Roche) pour amplification. Les couples d'amorces utilisés sont fournis par les laboratoires Roche : Tableau 1- Séquences des couples d'amorces des gènes humains de la vimentine, CD45, GAPDH et uroplakine lA Gène Amorce Sens Amorce Anti-sens Vimentine gaccagctaaccaacgacaaa gaagcatctcctcctgcaat CD45 agttattgttatgctgacagaactgaa tgctttccttctccccagta CD68 gtccacctcgacctgctct cactggggcaggagaaact Uroplakinla ggtagccagttttggtgtgg agcatgagcaccaggtacg (UPK1A) GAPDH agccacatcgctcagacac gcccaatacgaccaaatcc La vimentine est une protéine, appartenant à la famille des filaments intermédiaires. Elle participe au cytosquelette. CD45 est une protéine tyrosine 15 phosphatase transmembranaire, normalement exprimée par les leucocytes. CD68 est une glycoprotéine, normalement exprimée par les macrophages et les monocytes. Les gènes de la vimentine, CD68 et CD45, ici nos gènes d'intérêt, semblent être particulièrement surexprimés dans les tubules rénaux et/ou l'interstitium rénal lors des atteintes fibrosantes du greffon, qui se manifestent aussi en immunohistochimie par la 20 présence de TEM dans les biopsies rénales. Le gène de la GAPDH est utilisé comme gène de ménage de référence, il est exprimé dans tous les types cellulaires nucléés sans distinction. Le gène de l'uroplakine lA est utilisé comme gène de référence, spécifique aux cellules urothéliales.

Le programme d'amplification est le suivant : - 1 cycle de préincubation (5 min à 95°C) - 45 cycles d'amplification (15 secondes à 60°C; 15 secondes à 72°C) - 1 courbe de fusion (5 secondes à 96°C, 1 min à 60°C, puis chauffage lent de 0,06°C/s pour parvenir à 96°C avec 10 acquisitions /°C). - 1 cycle de refroidissement (30 secondes à 40°C). La plaque contenant l'ADN amplifié est retirée de l'automate, puis conservée à 4°C. Les résultats bruts sont récupérés depuis l'automate pour normalisation. 5. Normalisation Les résultats bruts sont normalisés selon la méthode de référence utilisée pour calculer la quantité d'ADN initiale, lors d'une PCR quantitative. Brièvement, les résultats de chaque patient ont été normalisés puis linéarisés comme suit: - par rapport à un gène de ménage (GAPDH) : Cp GAPDH - Cp gène d'intérêt = ACp, Gène d'intérêt / GAPDH = 2 ACp - par rapport à l'uroplakine, marqueur spécifique des cellules urothéliales : Cp UPK Cp gène d'intérêt = ACp, Gène d'intérêt / uroplakine = 2 ACp le Cp étant le nombre de cycles d'amplification avant détection du signal fluorescent par l'appareil. 6. Résultats Les figures 1 et 2 présentent la corrélation des résultats de PCR quantitative sur le gène de la vimentine, en corrélation avec les scores de TEM. Selon la figure 1, le coefficient de corrélation R2 est très faible et la pente de la droite de régression est nulle. Il est donc impossible de relier de manière concluante l'expression de la vimentine à la présence de changement phénotypique épithéliaux dans les cellules rénales. Toutefois, la normalisation des résultats par l'uroplakine, conformément au procédé selon l'invention, améliore significativement le coefficient de régression. De plus, la pente de la droite de régression devient positive, corrélant ainsi de manière claire et sans équivoque l'expression du gène de la vimentine à des scores de TEM de plus en plus élevés. Ces résultats sont alors cohérents avec les résultats de biopsies. De même, d'après la figure 3, la pente de la droite de régression reliant l'expression de CD68 avec la présence de la TEM est très faible. Ceci signifierait que l'expression de CD68 n'est pas corrélée à l'apparition de changements phénotypiques épithéliaux dans le rein. Or, l'expression de CD68 est positivement régulée dans les affections fibrosantes rénales (Anders et al, Kidney Int., 2011). Il est donc manifeste que la méthode classique de normalisation par un gène de ménage conduit à de faux négatifs. A contrario, la figure 4 montre que la normalisation par l'uroplakine améliore considérablement le test. La pente de la droite de régression devient positive et l'expression de CD68 est positivement régulée lors des phénomènes de changements phénotypiques épithéliaux. Ce résultat concorde avec l'examen anatomopathologique sur les biopsies de contrôle. Concernant l'expression de CD45, la surexpression de CD45 dans le tissu rénal est associée à une évolution défavorable des allogreffes de rein (Scherer et al, Nephrol Dial. Transplant. , 2009). La comparaison des figures 5 et 6 permet de constater que le test par PCR à partir d'urines est considérablement amélioré lorsque la normalisation est effectuée par l'uroplakine En conclusion, la normalisation des résultats par rapport à la GAPDH ne permet pas de discriminer efficacement les patients présentant une TEM des patients « sains », et ce, quel que soit le gène d'intérêt étudié. Comme l'indiquent les pentes, respectivement nulle et négative, des droites de régression des figures 1 et 3, la normalisation par le gène ménager GAPDH, conduit à l'obtention de faux négatifs. Le clinicien ne peut donc se fier aux résultats de ce type d'analyse. Le recours à une biopsie de confirmation reste alors inévitable. Le test s'améliore considérablement lorsque l'uroplakine est utilisé comme gène de référence pour la normalisation des résultats. D'après les figures 2, 4 et 6, l'expression de la vimentine, CD68 et CD45 est positivement régulée dans les phénomènes de TEM dans le rein. Ceci correspond à ce qui est effectivement observé en immunohistochimie sur les biopsies des patients Ainsi, le procédé selon l'invention reflète la situation réelle du patient. Il permet également de surveiller et diagnostiquer avec précision et fiabilité l'apparition de changements phénotypiques épithéliaux dans le rein. Il est donc clair que le procédé selon l'invention permet d'obtenir des résultats fiables, précis et cohérents avec la situation réelle du patient. De plus, ce procédé est indolore pour le patient, rapide, simple et économique à mettre en oeuvre. Il est de plus parfaitement adapté à la surveillance de l'apparition d'une TEM chez un patient ayant subi une greffe d'organe. 7. Applications Le procédé selon l'invention a ainsi démontré son efficacité pour la détection précoce de l'apparition de changements phénotypiques. D'autres applications que la détection de la TEM sont réalisables grâce au procédé selon l'invention. La détection du rejet aigu d'un greffon rénal peut être diagnostiquée grâce au procédé selon l'invention. En ce cas, les marqueurs pathologiques recherchés seront des marqueurs liés à l'activation des cellules immunitaires dans le rein, tels que le granzyme B (SEQ ID 23), la perforine (SEQ ID 24), les interferons ou le Fas-Ligand (SEQ ID 25).

La détection de cellules tubulaires, podocytaires ou inflammatoires pourrait être utilisée grâce au procédé selon l'invention pour le diagnostic de toute maladie rénale. L'évolution d'un cancer rénal chez un patient pourrait également être surveillée grâce au procédé selon l'invention grâce à la détection des marqueurs TP53 (SEQ ID 26), MIB1 (SEQ ID 27), AgNOR, CD44 (SEQ ID 28), racemase, CD10 (SEQ ID 31), keratine 7, vimentine, caveoline-1 (SEQ D 29) et rorl (SEQ ID 30).

Claims (11)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de diagnostic in vitro de pathologies chez un patient comprenant les étapes suivantes : a) obtention d'un échantillon d'urine provenant dudit patient, b) détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur de ladite pathologie et d'au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales, et c) détermination d'un seuil d'expression dudit au moins un marqueur de ladite pathologie par normalisation dudit au moins un marqueur de ladite pathologie par ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales.
2. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'étape b) comprend la détection du produit de transcription dudit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et du produit de transcription dudit au moins un marqueur de ladite pathologie.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel l'étape b) est mise en oeuvre au moyen d'une technique d'amplification d'acides nucléiques choisie parmi le groupe comprenant la RT-PCR, la PCR quantitative, la PCR en point final, la PCR semiquantitative ou leur combinaison.
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel ladite pathologie est une pathologie rénale choisie parmi le groupe comprenant une fibrose rénale, un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales, un rejet de greffon, un cancer, les maladies glomérulaires, les maladies tubulaires, les maladies interstitielles et les maladies vasculaires du rein.
5. 5. Procédé selon la revendication 4 dans lequel ledit au moins un marqueur spécifique de ladite pathologie rénale est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de CD45, CD68 et la vimentine.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel ladite pathologie est une pathologie modifiant la quantité de cellules excrétées dans l'urine.
7. 7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel ladite pathologie modifiant la quantité de cellules excrétées dans l'urine est choisie parmi le groupe comprenant la hyalinose segmentaire et focale, la nécrose tubulaire aiguë, les changements phénotypiques épithéliaux, le rejet aigu du greffon, la maladie de Sjôgren, la sarcoïdose.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 dans lequel ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de l'uroplakine 1A, l'uroplakine 1B, l'uroplakine 2, l'uroplakine 3A, l'uroplakine 3B, l'uroplakine 3BL, Bcasl , CEP152, CRABP2, DNASE1, KRT20, PLEKHF1, PLEKHG4B , RCN1 , SEMA5B , S ULT2A 1 , TFF1 , VILL , ZNF720.
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 comprenant en outre une étape de comparaison dudit seuil d'expression dudit marqueur d'une pathologie normalisé à un seuil d'expression de gène dont l'expression n'est pas modifiée par la maladie.
10. 10. Kit de diagnostic in vitro pour la détection d'un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales à partir d'un échantillon urinaire provenant d'un patient comprenant au moins un couple d'amorces pour la détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur spécifique d'une pathologie choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de CD45, CD68 et la vimentine et au moins un couple d'amorces pour la détection de l'uroplakine 1A.
11. 11. Utilisation du kit de diagnostic in vitro selon la revendication 10 pour la détection d'une pathologie rénale, ladite pathologie rénale étant des changements phénotypiques épithéliaux du rein.