CN102308004A

CN102308004A - 评价rna图案的方法

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Publication number: CN102308004A
Application number: CN2009801505509A
Authority: CN
Inventors: M·克拉斯; C·库斯利驰; G·波斯特
Original assignee: Caris Life Sciences Luxembourg Holdings SARL
Current assignee: Caris Life Sciences Luxembourg Holdings SARL
Priority date: 2008-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2012-01-04
Also published as: US20130045882A1; WO2010062706A2; EP2358912A4; EP2358912A2; US7888035B2; IL212591A0; IL212591A; BRPI0919882A8; EP2358912B1; US20100113290A1; BRPI0919882A2; US20110159506A1; IL233188A; WO2010062706A3; US8192954B2; IL233188A0; CA2742324A1; JP2012507300A

Abstract

本发明提供通过评价RNA水平(如确定RNA图案)而表征癌症的方法和组合物。可以通过检测一种或多种RNA(如小分子RNA)来进行癌症的诊断、预后、监测和治疗。

Description

评价RNA图案的方法

相关交叉引用

本专利申请要求下列临时申请的优先权：2008年10月30日提交的美国临时申请No.61/109,742；2008年11月7日提交的美国临时申请No.61/112,571；2008年11月12日提交的美国临时申请No.61/114,045；2008年11月12日提交的美国临时申请No.61/114,058；2008年11月13提交的美国临时申请No.61/114,065；2009年2月9日提交的美国临时申请No.61/151,183；2009年10月2日提交的Caris MPI案卷No.2310(WSGR参考No.37901-706.103)，其名称为“MicroRNA Profiles in Exosomers DerivedFrom prostate Adenocarcinomas”；2009年10月9日提交的美国临时申请No.61/250,454和2009年10月19日提交的美国临时申请No.61/253,027，上述临时申请的每一个的全文均以引用方式并入本文。

发明背景

通过提供疾病或病状的诊断、预后或治疗选择从而提供表征疾病或病状的改善方法可以显著提高患者的医疗保健。可以早期检测疾病或病状，或者确定其所处的阶段，以确定应当选择何种治疗方法。疾病或病状可以是上皮癌或恶性肿瘤。有多种不同种类的上皮细胞，并且这些细胞可以发展为不同种类的癌症。例如，上皮细胞可以构成被称为扁平细胞的平面表层。此外，上皮细胞可以呈现腺状形式(被称为腺瘤状细胞)。另外，上皮细胞可以形成弹性层(被称为移行细胞)。恶性肿瘤占所有癌症的约约85％，并且包括乳癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌和卵巢癌。

基于上皮的癌症通常导致这样的实体或肿瘤，癌症细胞由其迁移到整对象内，从而最终驻留于其它的位置，并形成继发瘤或转移瘤。用于导致实体瘤的癌症的一种主要疗法是手术切除或通过物理或化学手段将肿瘤消融。在将癌症从对象中除去之后(例如，通过手术切除)，可以对癌症在相同位置或继发位置的复发的监测或检测情况进行指示，从而可以针对应当采用的治疗而采用额外的疗法。同样，可以在治疗期指示监测癌症治疗成功度的一些手段，以确定该疗法是否成功，以及适当地适应相应的疗法。

需要表征癌症(如上皮癌)的方法。例如，虽然前列腺特异性抗原(PSA)测试对前列腺癌的控制做出了贡献，但是其也具有明显的缺陷，该缺陷来自于抗原对前列腺组织是特异性的而对前列腺癌不具有特异性。虽然该测试对PSA抗原是高度特异性的，但是并非所有前列腺癌都向血清中释放过量水平的抗原。这导致缺乏临床灵敏度，并且导致采用常规的PSA检测经常错过具有临床意义的癌症。

目前认为正常的PSA值小于4.0ng/mL。据信，至少20％的患有明显前列腺癌的人可能具有小于4.0ng/mL的PSA值。然而，由于PSA是通过正常的、无痛增生的、恶化前的组织和恶化组织进行的，因此发现升高的PSA(大于4.0ng/mL)并不总是指示癌症。如果血清PSA在4.0至10ng/mL的范围内，即使使用重复的并且更彻底的活组织检查(10-12个核芯)也只有25-30％的几率发现前列腺癌。发现PSA值升高通常导致对象进行不舒服的并且经直肠的活组织检查。为了确认血清PSA升高的原因，对具有明显升高的PSA的人进行两次或更多次活组织检查也不是罕见的。

因此，需要改善的方法来表征癌症。本文提供的是满足这种要求的方法和系统，并且也提供相关的优点。

以引用方式的并入

本说明书所提到的所有文献公开和专利申请均以引用的方式并入，引入的程度好像是每一篇单独的文献公开或专利文献被具体地并且独立地指出以引用的方式并入。

发明概述

本发明提供的是通过检测或评价RNA或RNA图案而表征疾病或病状的方法。表征病状的方法可以包括：诊断、预后、监测、选择治疗方法或将疾病或病状(如癌症)分类。癌症可以是上皮癌，如乳癌、脑癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺或卵巢癌。RNA图案可以包括检测miRNA，如miRNA的表达水平。

在一些实施方案中，所述方法包括表征对象内的癌症，包括确定所述对象的生物样品内的miRNA图案，其中miRNA图案包括所述样品中多种miRNA的每一种的表达水平。在一些实施方案中，与通过检测少于多种miRNA的每一种的表达水平而进行的表征相比，所述表征具有提高的灵敏度。miRNA可以选自表1。

本发明还提供将癌症分类(如良性癌或恶性癌)的方法，以及确定在进行非活组织样品的初始分析后是否应当获取实体活组织的方法。该方法还可以包括基于分类或活组织检查的结果选择疗法或治疗方案。将癌症分类或确定是否应当获取活组织的方法可以包括确定miRNA的表达水平，如miRNA的拷贝数/微升。所述方法还包括确定确定PSA的表达水平(如蛋白水平)或PCA3评分，所述PCA3评分为生物样品的PCA3表达水平与PSA表达水平之间的比值。所述方法还可以包括确定乘积值以表征癌症。可以通过将miRNA的表达水平(如miR-141)与PSA的水平相乘来获得所述乘积值。例如，miRNA的拷贝数/微升可以乘以每纳克。

本文还提供通过确定一种或多种miRNA的表达水平来表征癌症(如前列腺癌)的方法，所述miRNA例如为miR-141、miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222或miR-370。

RNA或RNA图案还可以与其它非RNA生物标志物结合用于表征癌症。

附图简述

通过附图和以下的描述来阐述一个或多个实例性实施方案的详细情况。其它特征、目标和优点从这些描述和附图以及权利要求书是显而易见的。

图1：示出前列腺癌样品的基因分析的结果。A)在第一个研究中，在Agilent 44K表达谱平台上分析14个前列腺癌组织的基因表达谱。列出了最经常过表达的基因。B)在独立的研究中，通过采用与A)相同的平台分析6个前列腺癌组的基因表达水平。确认头100个表达基因。列出6个前列腺癌中有5个和6个存在列入头100个基因的那些基因。C)通过免疫组织化学(IHC)检测得自22个对象的前列腺癌样品中的基因过表达。列出22个样品中至少10个过表达的那些基因。

图2示出6个前列腺癌样品的表达谱。该图示出对6个前列腺癌样品进行Agilent基因芯片分析所得的表达谱(其中基因名称列于右侧)。暗色或阴影表示高的表达水平。

图3示出癌症样品的分析。分析6个前列腺癌的组的基因表达水平，并且列出头100个表达基因。将6个前列腺癌中有5个和6个存在列入头100个基因的那些基因列于图1B中。

图4为示出通过以下方法获得的miRNA的频率(列于x轴上)的图，所述方法为：分析数据库中最经常过表达的基因(通过免疫组织化学(IHC)和在Agilent 44K芯片的基因表达图谱而进行)，检索可公共进入的miRNA数据库中的已知与这些基因相关的小分子RNA(例如，检索http://www.小分子RNA.org)，并且将通过观察的频率将miRNA分级。

图5为示出PSA值与miR-141的水平的乘积(25个确认具有前列腺癌的对象相对于25个没有前列腺癌的对象)。A)列出前列腺癌对象和正常对象的miR-141拷贝、PSA水平和乘积值；B)为示出正常对象和前列腺癌对象(PrCa)中的miR-141和PSA的平均值、标准偏差、置信水平和上限水平以及下限水平。

图6为示出与本文公开的一种或多种方法一起施用的代表性逻辑器件的框图，如接收数据、确定RNA表达水平、计算乘积值、表征癌症、传输结果或数据并且输出结果的器件。

发明详述

本文提供通过评价对象的生物样品中的RNA或RNA图案而表征病状或疾病的方法。表征疾病或病状的方法可以包括检测、诊断、预后或监测疾病或病状。表征还可以包括检测或诊断(包括发病前早期检测)，确定预后或疗法，或者确定疾病或病状的状态或发展情况。表征还包括确定药物效力，或选择疾病或病状的治疗方法以及疾病或病状的预后和可能性分析，如基于RNA或多种RNA(如RNA图案)确定疾病或病状的复发、扩散或反弹。表征疾病或病状还可以包括将疾病或病状分类。此外，在样品中确认的RNA或RNA图案可以用于确定是否需要获取另外的样品(如活组织)以进行进一步分析。

可以根据本文公开的方法和组合物表征的疾病或病状可以是癌症。癌症的例子包括膀胱癌、食道癌、肺癌、胃癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、乳癌、淋巴瘤；尤文肉瘤、造血组织肿瘤、实体瘤、胃癌、结肠癌、脑癌、上皮癌；鼻咽癌、子宫癌、肝癌、头颈癌、肾癌、雄性生殖细胞肿瘤、恶性间皮瘤、骨髓增生异常综合症、胰腺或胆汁癌、前列腺癌；甲状腺癌、尿道上皮、肾癌、胚胎性癌肉瘤(Wilm′s tumor)、小细胞肺癌、黑色素瘤、皮肤癌、骨肉瘤、成神经细胞瘤、白血病(急性淋巴球肉瘤、急性骨髓肉瘤、急性淋巴肉瘤)、多形性成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、淋巴瘤或横纹肌肉瘤。癌症可以是上皮癌。上皮癌为覆盖并包被身体的皮肤组织的癌症，如乳癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌或肺癌。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌。

样品

可以基于由对象获得生物样品评价一种或多种RNA。生物样品可以是得自对象的任何生物组织、液体或细胞。样品可以是固体或液体。样品可以是异质细胞群。样品可以是痰、血液、血细胞(例如，白细胞)、活组织、尿、腹膜液、胸膜液或得自它们的细胞。活组织可以是细针吸气活组织、核芯针活组织、真空辅助活组织、开放手术活组织、剃刮活组织、穿刺活组织、切口活组织、刮除活组织或深剃刮活组织。生物样品还可以包括组织的片段，如为了组织学用途而采取的冷冻片段或福尔马林固定的片段。样品可以是肿瘤组织、围绕肿瘤的组织或非肿瘤组织。

对象可以包括哺乳动物，如牛、鸟、狗、马、猫、羊、猪或灵长类动物(包括人类或非人类灵长类动物)。在一些实施方案中，对象可以是具有特定性别或年龄的人类。例如，对象的年龄可以是约30、35、40、45、50、55或60岁。为了表征前列腺癌，对象可以是至少50岁的男性人类。对象可以患有既往疾病或病状，或者具有既往疾病或病状的家族史(如癌症)。或者，对象可以不具有任何已知的既往病状。对象还可以对目前或以前的治疗(如癌症的治疗)不反应。

外来体

在一些实施方案中，可以由生物样品的外来体评价本文公开的一种或多种RNA。外来体为由各种不同的细胞释放到细胞外环境中的囊泡，所述细胞包括(但不限于)树状细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞、间皮细胞、上皮细胞或来自不同组织或器官的细胞。当细胞膜的片段自发收入鞘中并且最终发生胞外分泌时，在细胞内产生外来体(Keller et al.，Immunol.Lett.107(2)：102-8(2006))。外来体也可以成为微囊泡、纳米囊泡、囊泡、膜小泡(dexosome)、水泡、前列腺小体、微、腔内囊泡、内涵体状囊泡或胞外分泌的囊泡。

外来体还可以包括来自血浆膜或内膜的任何排出膜结合颗粒。外来体还可以包括结合有脂质双层膜的细胞源结构，所述双层膜源于血浆膜的多个部分的突出外翻(起泡)分离和蜜蜂，或者含有各种细胞来源的膜相关蛋白的任何细胞内膜结合小泡结构的排出，包括源自主体循环的表面结合分子(其与外来体腔内包含的分子一起选择性地结合源自肿瘤的蛋白)，所述源自肿瘤的蛋白包括但是不限于源自肿瘤的小分子RNA、mRNA和细胞内蛋白。外来体还可以包括膜片段。

外来体由肿瘤细胞分泌以及它们与输送蛋白和核酸(例如micro RNA)的相关性表明其参与病理过程。已经在多种体液中发现外来体，所述体液包括但不限于血浆、支气管肺泡灌洗液和尿，从而指明其体内相关性。已经指出外来体具有多种不同的作用，并且认为其参与细胞之间的连通，以及蛋白、RNA、DNA、病毒和朊病毒囊泡的输送。

评价一种或多种来自外来体的RNA可以为癌症检测提供改善的灵敏度和特异度，所述癌症检测例如为癌症的预后、监测、疾病分期和治疗决定。

评价一种或多种RNA以表征癌症的方法包括检测具有特定RNA或特定RNA图案的外来体的量。在其它实施方案中，检测外来体的RNA或RNA图案可以用于表征癌症。用于分析的外来体可以为异质的外来体群或匀质或基本匀质的外来体群。在分析外来体之前可以将外来体纯化或浓缩。可以使用分子排阻色谱、密度梯度离心、差式离心、纳米膜超滤、免疫吸附剂捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合，由生物样品浓缩或分离外来体。例如，可以采用分子排阻色谱(如凝胶渗透柱)、离心或密度梯度分离或过滤方法)。例如，外来体可以通过以下方法分离：差式分离、阴离子交换和/或凝胶渗透色谱(例如美国专利No.6,899,863和6,812,023所述的方法)、琼脂糖密度梯度、细胞器官电泳(例如，如美国专利No.7,198,923所述的那样)、磁性细胞分选(MACS)或者施用纳米膜超滤浓缩器的方法。可以采用分离或浓缩方法的各种组合。

结合剂或捕获剂可以通过结合外来体成分，从而用于分离外来体。可以在将外来体由生物样品浓缩或分离之后使用结合剂或捕获剂。例如，可以首先从生物样品分离出外来体，然后将具有特定生物标记物的外来体用该生物标记物用的结合剂进行分离。因此，由异质的外来体群中分离出具有特定生物标记物的外来体。或者，可以将结合剂用于含有外来体的生物样品中，而不提前进行外来体的分离步骤。例如，结合剂可以用于从生物样品中分离具有特定生物标记物的外来体。

结合剂可以包括但不限于DNA、RNA、适配子、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab、Fab单链抗体、合成抗体、适配子(DNA/RNA)、类胨、zDNA、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、外源凝集素、合成或天然存在的化合物(包括但不限于药物、标记试剂)或树枝状大分子。

在一些实施方案中，前列腺特异性外来体或前列腺外来体(如来自血样或尿的外来体)被用于评价一种或多种RNA，以表征癌症。可以采用对前列腺癌源细胞具有特异性的抗原用的抗体或任何其它结合剂来分离得自前列腺癌细胞的外来体，所述抗原例如为PSA、TMPRSS2、FASLG、TNFSF10、PSMA、NGEP、Il-7RI、CSCR4、CysLT1R、TRPM8、Kv1.3、TRPV6、TRPM8、PSGR、MISIIR、半乳糖凝集素-3、PCA3、TMPRSS2:ERG、它们的片段、它们的任意组合或对前列腺癌细胞具有特异性的抗原的任意组合。结合剂可以为PSA、PSMA、mAB 5D4、XPSM-A9、XPSM-A10、半乳糖凝集素-3、E-选凝素、半乳糖凝集素-1、E4(IgG2a k)或它们的任意组合物。用于分离外来体的结合剂或捕获剂还可以是结合核外体“管家蛋白”(如CD63、CD9、CD81或Rab-5b)的试剂，或者采用EpCAM用的结合剂来分离外来体。

RNA

可以采用评价任何种类的RNA来表征疾病或病状，如癌症。RNA可以是小分子RNA(miRNA或miR)、mRNA、小核RNA、siRNA、小核仁RNA或核糖RNA。RNA图案可以包含任何的RNA种类，如小分子RNA(miRNA或miR)、mRNA、小核RNA、小核仁RNA、核糖RNA或它们的组合。RNA图案可以包含单一种类的RNA或多种RNA的任意组合，如miRNA和mRNA。评价RNA可以包括确定或检测RNA的表达水平，如与对照相比的过表达或低表达、是否存在RNA、或RNA的拷贝数(如样品的拷贝数/微升，如血浆的拷贝数/微升或血清的拷贝数/微升)。在一些实施方案中，评价RNA为检测或确定RNA的序列，或检测RNA的突变或变型。

可以采用多种RNA来表征疾病或病状，如癌症。例如，RNA图案可以包含2种或更多种不同的RNA，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2500、5000、7500、10,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、750,000或1,000,000种不同的RNA。在一些实施方案中，RNA图案包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2500、5000、7500、10,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、750,000或1,000,000种不同的miRNA。RNA图案还可以包含一种或多种不同的miRNA与其它种类的RNA(如mRNA)的组合。

本文提供评价一种或多种RNA的方法，该方法可用于诊断癌症。诊断可以包括负诊断，如不存在癌症。在其它实施方案中，诊断可以包括确认癌症的阶段，或者癌症的发病前阶段。一种或多种RNA还可以用于提供癌症的预后，如提供患有癌症的风险或易感性或者癌症的侵入性或恶性程度。

评价样品中的一种或多种RNA还可以用于选择癌症疗法。还可以采用检测一种或多种RNA来确认癌症疗法或治疗的效力，如对象病状的相对改善程度或恶化程度。可以确认用有效的疗法或无效疗法治疗的患者的样品中的一种或多种RNA的评价情况，并且将其用作选择对象的疗法的参照。在另一个实施方案中，随着对象的癌症逐渐恶化或变好，一种或多种RNA的水平可以改变，并且与处于癌症的恶化或变好阶段中的患者中的一种或多种RNA的参照进行比较。

基于一种或多种RNA选择的治疗或疗法可以是癌症的疗法，如抗癌方案或选自以下疗法中的疗法：免疫疗法、抗生长因子或信号传导疗法、放射疗法、内分泌疗法或人抗体疗法、化疗法。治疗可以包括施用DNA破坏剂、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂或它们的组合。许多化疗剂目前在本领域内是已知的，并且可以与本文所述的一种或多种化合物组合使用。例如，化疗剂可以选自由下列化合物组成的组：有丝分裂抑制剂、烷基化试剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞循环抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素、血管形成抑制剂和抗雄激素。如本文所用，癌症治疗、癌症疗法等包括诸如手术之类的治疗，例如切除、侵蚀、消融(通过物理或化学手段或者物理手段或化学手段的组合进行)、缝合、激光或者其它方式物理改变身体的组织或器官)；放射疗法；施用化疗剂或上述任意两种或所有方法的组合。组合疗法可以依次进行或者同时进行。在手术之前进行的诸如放射疗法和/或化疗法等治疗被称为非侵入性疗法。在手术之后进行的诸如放疗和/或化疗等治疗在本文中被称为辅助疗法。可用于前列腺治疗的手术的例子包括但不限于前列腺的径向前列腺切除术、冷冻疗法、经尿道切除术等。

还可以采用一种或多种RNA的检测来确认癌症疗法或治疗的效力，如对象病状的相对改善情况或恶化情况。可以确认正在进行癌症治疗的患者的一种或多种RNA，并且将其与改善或有意效果进行相关化，然后将其用作参照。例如，通常通过确认是否发生下列一种或多种事件来评价改善情况或有益效果：肿瘤尺寸减小、肿瘤细胞增殖的减少、细胞数量的降低、心血管发生的减少和/或细胞凋亡增加。在一些情况下，一种或多种这些事件可以导致肿瘤部分或完全消除，并且延长对象的存活期。或者，对于末期癌症而言，治疗可能导致疾病停滞、生活治疗更好并且/或者存活期延长。这些事件中的任意一者的相反结果和/或停滞可能指示治疗或疗法无效。评价治疗的其它方法是本领域内已知的，并且包括在本文内。不同的评价方法可以与不同的RNA或RNA图案相关。

评价一种或多种RNA还可以用于监测对象内抗癌治疗方案或治疗的进展，或者癌症的复发。例如，整个治疗过程中多个时间点的RNA或RNA图案。RNA或RNA图案还可以用于监测患者内的癌症扩散。例如，miR-141可以用于检测结肠癌的复发。目前，结肠癌的复发通过抗原CEA(癌胚抗原)测量。然而，CEA在单独使用时可能具有复杂的组织。例如，并不是所有的转移性结肠癌都表达CEA，从而导致需要额外的标记物，如miR-141。对于基于上皮的癌症(如卵巢癌、乳癌、肺癌和膀胱癌)而言，其它的单抗原测试的相似组织也是已知的。

可以通过周期性地从对象中获取样品并且周期性地由对象的样品监测RNA或RNA图案，从而确认复发。例如，如果与对照样品中的miR-141量(对应于没有上皮癌的对象)相比，周期性血样中的miR-141的量显示出稳定的变化或者其量显著提高，则上皮癌已经复发。在一个实施方案中，在从对象中除去癌症(例如通过手术)后，监测对象，并且通过评价RNA或RNA图案，可以确认癌症在相同位置或继发位置的复发，从而可以采用额外的疗法进行治疗。在另一个实施方案中，通过在治疗阶段使用在治疗中或治疗之前采取的样品(用于分析RNA或RNA图案)监测来检测对象。基于RNA或RNA图案，可以确认疗法是否成功，疗法是否合适，或者患者是否还应当试试其他的疗法。

分类

在另一个实施方案中，评价一种或多种RNA可以用于将癌症分类或分期。分类和分期也可以用于评价癌症的治疗。

例如，可以基于恶性肿瘤的TNM分类将癌症分类。该癌症分期系统可以用于描述对象身体内的癌症程度。T描述肿瘤的大小，以及是否肿瘤是否已经侵入相邻组织，N描述所涉及的区域淋巴结，并且M描述远距离的转移。TNM由国际抗癌联合会(UICC)维护，并且被美国癌症联合委员会(AJCC)和国际妇产科协会(FIGO)使用。人们将会理解，并不是所有肿瘤都具有TNM分类，如脑瘤。通常测量T(a，is，(0)，1-4)作为原发肿瘤的大小或直接程度。N(0-3)是指扩散到区域淋巴结的程度：N0表示区域淋巴结中不存在肿瘤细胞，N1表示肿瘤细胞扩散到最近的或少量的区域淋巴结，N2表示肿瘤细胞扩散到N1和N3之间的程度；N3表示肿瘤细胞扩散到最远的或者大量的区域淋巴结。M(0/1)是指是否存在癌症转移：M0表示不存在远距离的转移；M1表示转移已经达到远距离的器官(区域淋巴结之外)。还可以评价其它的参数。G(1-4)是指癌症细胞的级别(即，如果癌症细胞看起来与正常细胞相似，它们处于低级，而如果癌症细胞看起来分化较差，则它们处于高级)。R(0/1/2)是指手术的完整性(即，切割边界是否存在癌细胞)。L(0/1)是指侵入淋巴管的程度。V(0/1)是指侵入静脉的程度。C(1-4)是指V的确定度(质量)的改型。

所述方法还包括基于Gleason评分系统将前列腺癌分类。Gleason评分系统基于由病理学家评价的显微肿瘤模式，同时解析活组织样品。当活组织内存在前列腺癌时，Gleason评分基于正常腺状组织结构的损失的程度(即腺体的形状、大小和分化)。典型的Gleason评分系统具有5个基本的组织模式(其在技术上被称为肿瘤“级别”)。显微确定由癌症导致的正常腺状结构的损失程度由级别(1至5中的数值)表示，其中5表示最差的级别。级别1通常是患癌前列腺非常类似于正常的前列腺组织。在级别2时，前列腺组织仍然具有完好的腺体，但是它们较大，并且在其之间具有更多的组织，而在级别3，组织仍然具有可识别的腺体，但是细胞较暗。在高的放大倍数下，级别为3的样品的一些细胞已经离开腺体，并且开始侵入周围的组织。级别为4的样品具有含有极少可识别的腺体的组织，并且许多细胞正侵入周围的组织。位于级别为5的样品，组织不具有可识别的腺体，并且通常在整个周围组织内都是细胞片。

例如，在初始分析生物样品的一种或多种RNA之后，基于一种或多种RNA的水平可以由病理学家进行另外的分析，其中病理学家确定样品的Gleason评分。可以在获取活组织之前，分析生物液体(如尿)的一种或多种RNA，以确定对象的Gleason。

评价一种或多种RNA还可以用于将癌症分类为恶性癌症(例如，侵入性癌症)或两性癌癌症(例如无痛癌症)。例如，可以确定生物样品的miRNA图案，并且将其用于是将癌症分类为侵入性癌症还是无痛癌症。例如，本文所公开的方法可以通过区别良性癌(例如无痛癌)和恶性癌(例如，侵入性癌)，从而将前列腺癌分类。

分类可以基于RNA的量或水平，或者基于多种RNA中的每一种的水平。例如，当RNA(如miRNA)的水平少于约3000拷贝/微升样品(如血清样品)时，癌症的类别为无痛的上皮癌。如果RNA的水平介于约1000和约3000拷贝/微升之间，则癌症的类别可以为良性癌，其中所述RNA的水平例如为少于约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000拷贝/微升。在一些实施方案中，如果检测的RNA亚组的表达水平少于约3000拷贝/微升样品，则癌症被分裂为良性癌。在其它实施方案中，当检测的RNA亚组的表达水平介于约1000至约3000拷贝/微升样品之间时，则癌症被分类为良性癌，其中所述RNA亚组的表达水平例如为少于约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000拷贝/微升。

在一些实施方案中，当RNA(如miRNA)的水平为至少约9000拷贝/微升样品(如血清样品)，如介于约9000至约26000拷贝/微升之间时，上皮癌(如前列腺癌)的类别为恶性癌。例如，样品的RNA表达水平为至少约9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000、12100、12200、12300，12400、12500、13000、13500、14000、14500、15000、15500、16000、16500、17000、17500、18000、18500、19000、19500、20000、20500、21000、21500、22000、22500、23000、23500、24000、24500、25000或25,500拷贝/微升。

第二生物样品

可以用以非侵入方式获取的样品(如尿或血液样品)进行一种或多种RNA的评价，以表征疾病或病状，如癌症。这可以减少对象的不必要的活组织检查的次数，或者其它侵入性过程。因此，在一些实施方案中，对得自对象的第一样品进行一种或多种RNA的评价。基于对该第一样品进行的一种或多种RNA的评价情况，可以获取用于分析的第二样品，以表征癌症。例如，第二样品可以与第一样品的种类不同，并且用于不同类型的分析，如组织学检查，如免疫组织化学(IHC)、原位杂交(荧光原位杂交)、PCR、实时PCR、微阵列分析或测序。

可以按照比第二样品更少介入或侵入的方式获取第一样品。例如，第一样品可以为尿或血液，而第二样品可以为活组织。例如，第一样品可以是用于评价一种或多种RNA的血样，并且根据RNA的水平，可以获取组织学检查用活组织，以表征癌症，如诊断患癌组织是否存在或癌症的阶段。

例如，如果第一样品中的RNA水平介于约1500至约9000拷贝/微升之间，则从对象采取第二样品(如用于组织学检查的活组织或组织样品)，其中所述RNA水平例如为约1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、或8900拷贝/微升。在一些实施方案中，如果该水平介于约1500至约4500拷贝/微升，则从对象中采取第二样品。在又一些实施方案中，如果RNA(如miRNA)的水平少于约1500拷贝/微升(如少于约1100、1200、1300、1400或1500拷贝/微升)，则不从对象采取第二样品。

在一些实施方案中，评价一种或多种评价一种或多种RNA被用于确定是否需要第二或第三样品，如第二或第三活组织。例如，在初始观察到血清miR-141升高后，则随后采用负活组织或负第二活组织。该方法包括这样的步骤：从对象获取血样，并且确定对象血样的血清中miR-141的量，然后当血清miR-141的量显著不同于对照样品中的miR-141量或者不同于相同患者以前测定的miR-141水平时，则指示活组织，miR-141水平的任何升高都指示需要另外的活组织。

灵敏度和特异度

本文公开的方法和组合物还可以使得癌症表征的灵敏度和特异度提高，所述癌症的表征例如为检测、诊断、预后或监测癌症的复发和疗效。

灵敏度可以通过(真阳性的数量)/(真阳性的数量+假阴性的数量)确定。特异度可以通过(真阴性的数量)/(真阴性的数量+假阳性的数量)。

评价本文公开的一种或多种RNA可以用于以至少约70％或75％的特异度表征癌症。例如，癌症可以以下列特异度表征：约76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、或97％。癌症可以以下列特异度表征：约97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、998.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。在又一个实施方案中，癌症可以以100％的特异度表征。

在一些实施方案中，癌症可以以至少约60％的灵敏度表征，所述灵敏度例如为约60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97％。癌症可以以下列灵敏度表征：约97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、998.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。在又一些实施方案中，癌症可以以100％的灵敏度表征。

在一些实施方案中，评价多种RNA使得癌症表征的特异度和灵敏度与评价少于所述的多种RNA的情况相比得到提高。例如，与检测少于所述的多种RNA相比，灵敏度或特异度可以增加至少约5、10、15、20、30、35、40、50、75、100、150、200、250、500、1000％或更多。例如，使用一种RNA表征癌症的灵敏度为50％，而使用附加的RNA使得灵敏度提高至60％(提高了20％)。因此，在一些实施方案中，被分析RNA的数量为使得数量的增加提供增加的灵敏度或特异度的数量。在一些实施方案中，在表征癌症时，评价至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2500、5000、7500、10,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、750,000或1,000,000种RNA与评价少于该数量的RNA相比，提供增加的特异度或灵敏度。例如，在表征癌症时，评价至少两种RNA(如至少两种miRNA)与评价两种miRNA中的一种相比，可以提供增加的特异度或灵敏度。

小分子RNA

本文评价的一种或多种RNA可以包含一种或多种小分子RNA(miRNA、miR)。MiRNA是长度为约21-23个核苷酸的短链RNA。MiRNA被由DNA转录的基因编码，但是并不被转录为蛋白(非编码RNA)。相反，它们首先由被称为pri-miRNA的初级转录体加工为短臂环状结构(被称为pre-miRNA)，最后被加工为功能miRNA，因为其前体通常形成在自互补区域彼此向后折叠的结构。然后，它们被动物中的核酸酶Dicer或植物中的DCL1加工。成熟的miRNA分子与一种或多种信使RNA(mRNA)分子是部分互补的。miRNA的序列可以在可公众获得的数据库获得(如http://www.microRNA.org或http://www.mirz.unibas.ch/cgi/miRNA.cgi)。

有多种miRNA参与基因调节，并且miRNA为一类不断增多的非编码RNA中的一部分(目前其被认为是基因调控的主要层次)。在一些情况下，miRNA可以通过结合其目标mRNA的3-UTR中嵌入的调节位置而干扰转录。目标识别包括目标位置(具有种子区域，即miRNA的5端的位置2-8)的互补碱基对，但是种子互补的正确程度并没有精确确定，并且可以由3’对进行调节。在其它情况中，miRNA起到类似于小干扰RNA(siRNA)的作用，并且结合精确互补的mRNA序列，从而破坏目标转录体。

多种miRNA的表征提示它们影响多种过程，包括早期发育、细胞增殖和细胞死亡、凋亡和脂肪代谢。例如，已经表明一些miRNA(如lin-4、let-7、mir-14、mir-23和bantam)在细胞分化和组织发育中起到重要作用。据信，其它miRNA由于具有分化的位相和时序表达模式而类似地具有重要作用。

在一些实施方案中，评价单一一种miRNA以表征癌症。在另一些实施方案中，评价至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2500、5000、7500、10,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、750,000或1,000,000种miRNA。在一些实施方案中，评价1种以上的miRNA与其它种类的RNA的组合，以表征癌症。

在一些实施方案中，用miRNA检测前列腺癌。例如，样品中小分子RNA的可检测的水平可以指示前列腺癌，并且不可检测的水平不指示前列腺癌。在一些实施方案中，采用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2500、5000、7500、10,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、750,000、1,000,000或更多种miRNA，以评价前列腺癌。表达水平的改变(如是否存在、miRNA与参照水平相比的低表达或过表达)可以用于表征癌症，其中所述参照水平例如为根据没有癌症的对象(如受控的年龄和性别)而确定的水平。

例如，用于将前列腺癌分类为良性癌或恶性癌的参照水平可以包括：从对象获取血样，确定对象血样中的miRNA的量，并且将该miRNA的量与具有良性前列腺癌或恶性前列腺癌的一种或多种对照进行比较。比较miRNA的量与一种或多种对照的步骤可以包括获取具有良性前列腺癌的多个对象的血液中的存在的miRNA范围，以得到第一对照范围；获取具有恶性前列腺癌的多个对象的血液中的存在的miRNA范围，以得到第二对照范围并且比较对象血液中的miRNA的量与第一和第二对照范围，以确定对象的前列腺癌是分为良性前列腺癌还是恶性前列腺癌。

MiR-200家族

在一些实施方案中，miRNA是miR-200家族的成员。据认为，miR-200家族通过针对E-钙粘蛋白阻遏因子ZEB1和ZEB2而确定癌细胞的上皮表型。miR-200家族包括miR-141、miR-236、miR-200a、mir-200b、mir-200c和mir-429。在一些实施方案中，分析一种以上的miR-200家族成员，以检测上皮癌。

例如，miR-141可以由血液取(血清或血浆)中获得，并且将其与转移性上皮癌的发生相关化。MiR-141可用于检测癌症复发和上皮癌(如前列腺癌)的疗效，包括采用miR-141监测进行过癌症手术切除的对象。例如，目前用诸如血清PSA等其它标记物监测对象的前列腺癌。血清PSA的平稳升高表示癌症的复发和扩散。然而，许多前列腺癌转移瘤并不表达PSA，因此使用该方法会错过许多前列腺癌。到检测出癌症时，其通常已经扩散至超出了任何治疗方案的范围。就目前的诊断方案而言，其它的上皮癌具有类似的组织。

基因相关的MiRNA

miRNA也可以是与下列物质的mRNA相作用的miRNA：PFKFB3、RHAMM(HMMR)、cDNA FLJ42103、ASPM、CENPF、NCAPG、雄激素受体、EGFR、HSP90、SPARC、DNMT3B、GART、MGMT、SSTR3或TOP2B。例如，可以检测的小分子RNA以及与其相关的基因列于表1中。miR可以用于表征上皮癌(如前列腺癌)。

表1：基因名称及其相关miRNA

因此，如果表1中的一种或多种miRNA存在的浓度大于9000拷贝/微升样品(如血清样品)，则可以将对象诊断为良性前列腺癌。如果表1中的一种或多种miRNA存在的浓度小于3000拷贝/微升样品，则可以将对象诊断为恶性前列腺癌。在一些实施方案中，如果表1中的一种或多种miRNA存在的浓度介于约1000至约4500拷贝/微升得自对象的样品之间，则从对象获取第二生物样品。可以通过诸如免疫组织化学等组织化学分析来分析第二样品。

此外，在多个实施方案中，本发明的方法和组合物中使用的与基因相关的小分子RNA(例如，在前列腺癌中过表达的那些)可以于在线的小分子RNA数据库找到www.microrna.org或microrna.sanger.ac.uk/sequences，或者为在http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/检索的预测miRNA)。

与PFKFB3相互作用的miRNA可以是miR-513a-3p、miR-128、miR-488、miR-539、miR-658、miR-524-5p、miR-1258、miR-150、miR-216b、miR-377、miR-135a、miR-26a、miR-548a-5p、miR-26b、miR-520d-5p、miR-224、miR-1297、miR-1197、miR-182、miR-452、miR-509-3-5p、miR-548m、miR-625、miR-509-5p、miR-1266、miR-135b、miR-190b、miR-496、miR-616、miR-621、miR-650、miR-105、miR-19a、miR-346、miR-620、miR-637、miR-651、miR-1283、miR-590-3p、miR-942、miR-1185、miR-577、miR-602、miR-1305、miR-220c、miR-1270、miR-1282、miR-432、miR-491-5p、miR-548n、miR-765、miR-768-3p或miR-924。与PFKFB3相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与RHAMM相互作用的miRNA可以是miR-936、miR-656、miR-105、miR-361-5p、miR-194、miR-374a、miR-590-3p、miR-186、miR-769-5p、miR-892a、miR-380、miR-875-3p、miR-208a、miR-208b、miR-586、miR-125a-3p、miR-630、miR-374b、miR-411、miR-629、miR-1286、miR-1185、miR-16、miR-200b、miR-671-5p、miR-95、miR-421、miR-496、miR-633、miR-1243、miR-127-5p、miR-143、miR-15b、miR-200c、miR-24或miR-34c-3p。与RHAMM相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与CENPF相互作用的miRNA可以是miR-30c、miR-30b、miR-190、miR-508-3p、miR-384、miR-512-5p、miR-548p、miR-297、miR-520f、miR-376a、miR-1184、miR-577、miR-708、miR-205、miR-376b、miR-520g、miR-520h、miR-519d、miR-596、miR-768-3p、miR-340、miR-620、miR-539、miR-567、miR-671-5p、miR-1183、miR-129-3p、miR-636、miR-106a、miR-1301、miR-17、miR-20a、miR-570、miR-656、miR-1263、miR-1324、miR-142-5p、miR-28-5p、miR-302b、miR-452、miR-520d-3p、miR-548o、miR-892b、miR-302d、miR-875-3p、miR-106b、miR-1266、miR-1323、miR-20b、miR-221、miR-520e、miR-664、miR-920、miR-922、miR-93、miR-1228、miR-1271、miR-30e、miR-483-3p、miR-509-3-5p、miR-515-3p、miR-519e、miR-520bmiR-520c-3p或miR-582-3p。与CENPF相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与NCAPG相互作用的miRNA可以是miR-876-5p、miR-1260、miR-1246、miR-548c-3p、miR-1224-3p、miR-619、miR-605、miR-490-5p、miR-186、miR-448、miR-129-5p、miR-188-3p、miR-516b、miR-342-3p、miR-1270、miR-548k、miR-654-3p、miR-1290、miR-656、miR-34b、miR-520g、miR-1231、miR-1289、miR-1229、miR-23a、miR-23b、miR-616或miR-620。与NCAPG相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与雄激素受体相互作用的一种或多种miRNA可以为miR-124a、miR-130a、miR-130b、miR-143、miR-149、miR-194、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-30a-5p、miR-30d、miR-30e-5p、miR-337、miR-342、miR-368、miR-488、miR-493-5p、miR-506、miR-512-5p、miR-644、miR-768-5p或miR-801。与雄激素受体相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与EGFR相互作用的miRNA可以为miR-105、miR-128a、miR-128b、miR-140、miR-141、miR-146a、miR-146b、miR-27a、miR-27b、miR-302a、miR-302d、miR-370、miR-548c、miR-574、miR-587或miR-7。与EGFR相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与HSP90相互作用的一种或多种miRNA可以为miR-1、miR-513a-3p、miR-548d-3p、miR-642、miR-206、miR-450b-3p、miR-152、miR-148a、miR-148b、miR-188-3p、miR-23a、miR-23b、miR-578、miR-653、miR-1206、miR-192、miR-215、miR-181b、miR-181d、miR-223、miR-613、miR-769-3p、miR-99a、miR-100、miR-454、miR-548n、miR-640、miR-99b、miR-150、miR-181a、miR-181c、miR-522、miR-624、miR-130a、miR-130b、miR-146、miR-148a、miR-148b、miR-152、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-204、miR-206、miR-211、miR-212、miR-215、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-301、miR-31、miR-325、miR-363、miR-566、miR-9或miR-99b。与HSP90相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与SPARC相互作用的一种或多种miRNA可以为miR-768-5p、miR-203、miR-196a、miR-569、miR-187、miR-641、miR-1275、miR-432、miR-622、miR-296-3p、miR-646、miR-196b、miR-499-5p、miR-590-5p、miR-495、miR-625、miR-1244、miR-512-5p、miR-1206、miR-1303、miR-186、miR-302d、miR-494、miR-562、miR-573、miR-10a、miR-203、miR-204、miR-211、miR-29、miR-29b、miR-29c、miR-339、miR-433、miR-452、miR-515-5p、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-592或miR-96。与SPARC相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与DNMT3B相互作用的一种或多种miRNA可以为miR-618、miR-1253、miR-765、miR-561、miR-330-5p、miR-326、miR-188、miR-203、miR-221、miR-222、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-370、miR-379、miR-429、miR-519e、miR-598、miR-618或miR-635。与DNMT3B相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与GART相互作用的一种或多种miRNA可以为miR-101、miR-141、miR-144、miR-182、miR-189、miR-199a、miR-199b、miR-200a、miR-200b、miR-202、miR-203、miR-223、miR-329、miR-383、miR-429、miR-433、miR-485-5p、miR-493-5p、miR-499、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-569、miR-591、miR-607、miR-627、miR-635、miR-636或miR-659。与GART相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与MGMT相互作用的miRNA可以为miR-122a、miR-142-3p、miR-17-3p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-199b、miR-200a、miR-217、miR-302b、miR-32、miR-324-3p、miR-34a、miR-371、miR-425-5p、miR-496、miR-514、miR-515-3p、miR-516-3p、miR-574、miR-597、miR-603、miR-653、miR-655、miR-92、miR-92b或miR-99a。与MGMT相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与SSTR3相互作用的miRNA可以为miR-125a、miR-125b、miR-133a、miR-133b、miR-136、miR-150、miR-21、miR-380-5p、miR-504、miR-550、miR-671、miR-766或miR-767-3p。与SSTR3相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

与TOP2B相互作用的miRNA可以为miR-548f、miR-548a-3p、miR-548g、miR-513a-3p、miR-548c-3p、miR-101、miR-653、miR-548d-3p、miR-575、miR-297、miR-576-3p、miR-548b-3p、miR-624、miR-548n、miR-758、miR-1253、miR-1324、miR-23b、miR-320a、miR-320b、miR-1183、miR-1244、miR-23a、miR-451、miR-568、miR-1276、miR-548e、miR-590-3p、miR-1、miR-101、miR-126、miR-129、miR-136、miR-140、miR-141、miR-144、miR-147、miR-149、miR-18、miR-181b、miR-181c、miR-182、miR-184、miR-186、miR-189、miR-191、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-206、miR-210、miR-218、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-27a、miR-302、miR-30a、miR-31、miR-320、miR-323、miR-362、miR-374、miR-383、miR-409-3p，miR-451、miR-489、miR-493-3p、miR-514、miR-542-3p、miR-544、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-559、miR-568、miR-575、miR-579、miR-585、miR-591、miR-598、miR-613、miR-649、miR-651、miR-758、miR-768-3p或miR-9。与TOP2B相互作用的一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

在一些实施方案中，一种或多种miRNA选自由miR-498、miR-503miR-198、miR-302c、miR-345、miR-491-5p、miR-513、miR-26a-1/2、miR-375、miR-425、miR-194-1/2、miR-181a-1/2、let-7i、miR-25、miR-449、和miR-92-1/2组成的组。一种或多种miRNA也可以选自由let-7a、let-7b，let-7c、let-7d、let-7g、miR-145、miR-195、miR-199、miR-497、let-7f、miR-22、miR-30_5p、miR-490、miR-133a-1、miR-1-2、miR-218-2、miR-345、miR-410、miR-7-1/2、miR-145、miR-34a、miR-487或let-7b组成的组。在其它实施方案中，一种或多种miRNA为miR-99、miR-101、miR-130、miR-135、miR-141、miR-148、miR-182、miR-186、miR-206、miR-320、miR-374、miR-433、miR-496、miR-517、miR-590、miR-620、miR-768、miR-223、miR-203、miR-199、miR-519、miR-302、miR-30、miR-20、miR-200、miR-23、miR-29、miR-181、miR-548和miR-370。一种或多种miRNA可以在对象的样品中检测到(如确定一种或多种miRNA的拷贝数/微升)，并且用于表征癌症。miRNA的拷贝数/微升可以用于确定是否需要从对象获取另外的生物样品，以进一步分析，如由病理学家分析。

在另一个实施方案中，一种或多种miRNA为miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222、miR-141或miR-370。选自miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222和miR-141组成的组中的一种或多种miRNA可以用于表征前列腺癌。

此外，一种或多种miRNA(如表1所述的那些)可以与AR、PCA3或其任意组合的mRNA形成RNA图案，并且用于表征癌症，如前列腺癌。RNA图案还可以包含snoRNA U50。

RNA的评价

评价RNA可以定性或定量的。评价RNA包括检测RNA，如确定表达水平(如相比于对照物的过表达或低表达，是否存在RNA)、确定RNA的序列、确定RNA的任何改性或检测RNA的任何突变或变型。可以将RNA水平确定为是否存在、大于或小于对照或RNA两的给定数值(如RNA拷贝数/微升)。可以通过绝对或相对定量法将RNA的表达水平定量。可以通过引入已知浓度的一种或多种目标核酸，并且将未知物的杂交强度与已知目标核酸进行参比(例如通过产生标准曲线)从而进行绝对定量。或者，通过比较两种或更多种基因之间的杂交信号或两种或更多种处理之间的杂交信号以定量杂交强度的变化并且通过推断、转录水平，从而进行相对定量。

评价用的RNA可以由生物样品分离。RNA可以由生物样品的外来体(如使用上述方法分离的外来体)分离。

可以使用进行基于膜的RNA纯化用的试剂盒(其是市售可得的)分离RNA。通常，试剂盒可供用于从细胞或组织小批量(30mg或更少)制备RNA(例如，QIAGEN RNeasy Mini kit)，中等批量制备RNA(250mg组织)(例如，QIAGEN RNeasy Midi kit)以及大批量制备RNA(最大为1g)(QIAGEN RNeasy Maxi kit)。或者，可以使用美国专利No.7,267,950或美国专利7,267,950所述的方法分离RNA。

RNA或得自RNA的核酸可以用于分析。如本文所用，得自RNA的核酸是指这样的核酸，其中RNA、mRNA转录体或其序列最终用作其合成的模板。因此，由转录体逆转录的cDNA、由cDNA转录的RNA、由cDNA扩增的DNA、由扩增DNA转录的RNA等均得自这些衍生产物的转录和检测，并且指示样品中的原转录体是否粗在和/或过量。因此，合适的样品包括(但不限于)一种或多种基因的转录体、由转录体逆转录的cDNA、由cDNA转录的cRNA、由基因扩增的DNA、由扩增DNA转录的RNA等。

可以通过检测附连在样品RNA上的一种或多种标记物来检测RNA。标记物可以通过本领域内的技术人员已知的多种手段中的任意手段引入。适合于本发明的可检测标记物包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。本发明中可用的标记物包括用抗生蛋白链菌素结合物染色的生物素、磁珠(例如，DynabeadsTM)、荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红。罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射标记物(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶和ELISA中使用的任何酶)和比色标记物(如胶体金或着色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、胶乳等)珠。检测这些标记物的手段是本领域内的技术人员公知的。因此，例如，可以使用照相膜或闪烁计数器检测放射标记物，可以使用光检测器检测发射的光来检测荧光标记物。通过通过将酶与底物接触，并且检测底物上酶的作用而产生的反应产物来检测酶标记物，并且通过简单地观看着色的标记物来检测比色标记物。例如，可以标记并且检测miRNA，如利用多核苷酸激酶在miRNA群的5′末端使用放射活性磷酸酯(Krichevsky AM，King KS，Donahue CP，Khrapko K，Kosik KS(2003)RNA 9：1274-1281)，或者利用RNA连接酶在3′末端使用放射标记的单核苷酸(参见，例如US7541144)。可以采用市售可得的试剂盒来标记RNA。例如，可以使用得自下列公司的试剂盒标记miRNA：Ambion(例如，mirVana^TM labeling kit)、Exiqon(例如，miRCURYLNA小分子RNA Array Hy3^TM/Hy5^TM Power Labeling kit)、Integrated DNATechnologies(例如，miRNA StarFire Nucleic Acid Labling)、Mirus生物公司(例如，LabelIT miRNA Labeling Kit)等。

在一个实施方案中，在分离出RNA后，为了检测关注的RNA，可以合成cDNA，并且根据制造商的说明书对特定的mRNA目标进行Taqman分析，或者可以进行表达微阵列分析，以在一个实验中研究高度多元的表达标记物组。确立基因表达谱的方法包括确定由能够编码蛋白或肽的基因产生的RNA的量。这可以通过下列技术实现：逆转录酶PCR(RT-PCR)、竞争RT-PCR、实时RT-PCR、差示显示RT-PCR、定量RT-PCR、Northern印迹分析和其它相关测试手段。可以使用单独的PCR反应进行这些技术。

在一些实施方案中，通过微阵列分析由mRNA产生的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)。可以使用适合于评价生物样品中的RNA表达水平的任何技术测量样品中的miRNA基因产物的水平，所述技术包括但不限于Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交或微阵列分析。RNA检测也可以通过以下技术进行：使用等位基因特异性探针的杂交、酶突变检测、连接酶链反应(LCR)、寡核苷酸连接分析(OLA)、流式细胞异源双链分析、失配物的化学裂解、质谱、核酸测序、单链构象多态性(SSCP)、变性凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、限制片段多态性、基因表达的序列分析(SAGE)或它们的任意组合。

如果需要定量结果，本文公开的方法通常使用一种或多种扩增核酸的相对频率用的对照，以实现定量扩增。定量扩增的方法是本领域技术人员公知的。例如，定量PCR包括同时扩增已知量的使用相同引物的对照序列。这提供了可以用于校正PCR反应的内标。其它合适的扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，参见Innis，et al.，PCR Protocols，A guide toMethods and Application Academic Press，Inc.San Diego，(1990))，ligase chainreaction(LCR)(参见Wu and Wallace，Genomics，4：560(1989)，Landegren，et al.，Science，241：1077(1988)and Barringer，et al.，Gene，89：117(1990))，transcription amplification(Kwoh，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：1173(1989))和self-sustained sequence replication(Guatelli，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87：1874(1990))。本领域内已知的其它核酸定量方法包括RT-PCR、Christmas树、连接酶链反应、质谱、TMA、NASBA、分支链反应和逆转录酶连接酶链反应。

其它的检测和/测量方法包括核酸杂交。简言之，核酸杂交包括使探针和目标核酸在探针与其互补目标物能够通过互补碱基对形成稳定的杂交双链的条件下接触。如本文所用，杂交条件是指核酸分子用于确认相似核酸分子的标准杂交条件。这些标准条件在(例如)文献Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989.Sambrook et al.，ibid.中公开，其全文以引用方式并入本文(具体见9.31-9.62页)。此外，计算合适的杂交和洗涤条件以实现允许各种程度的核苷酸失配的杂交的公式公开在(例如)文献Meinkoth et al.，1984，Anal.Biochem.138，267-284；Meinkoth et al.，ibid.中，其全文以引用方式并入本文中。不形成杂交双链的核酸从杂交的核酸中洗去，然后可以检测杂交的核酸，通常通过检测附连的可检测标记物进行检测。通常应当认识到，通过增加温度或降低含有核酸的缓冲液的盐浓度可以使核酸变性。在低严格条件(例如，低温和/或高盐)下，杂交双链(例如，DNA:DNA、RNA:RNA或RNA:DNA)会形成退火的链不是精确互补的情况。因此，在低严格条件下，杂交的特异度会降低。反之，在较高的严格条件(例如，高温或低盐)下，成功的杂交要求较少的失配。

核酸阵列可用于检测样品中的一种或多种RNA。基因表达监测中的高密度阵列的制备和引用之前在下列文献中已经公开：例如，WO 97/10365；WO 92/10588；WO95/35505；美国专利No.6,040,138；5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734和5,700,637；和Haciaet al.(1996)Nature Genetics 14：441-447；Lockhart et al.(1996)NatureBiotechnol.14：1675-1680；和De Risi et al.(1996)Nature Genetics14：457-460。

通常，在阵列中，已知序列的寡核苷酸或cDNA、基因组DNA或其片段占据底物上的已知位置。核酸样品与阵列杂交，并且将与各探针杂交的核酸的量定量。一种定量方法是使用共聚焦显微镜和荧光标记。可以使用市售可得阵列平台系统，如得自下列公司的产品：Affymetrix(SantaClara，CA)、Agilent(Santa Clara，CA)、Atlas^TM(Clontech，Mountain View，CA)、Exiqon(Denmark)等。人们可以使用本文记载的基因知识设计新的多核苷酸、cDNA或基因组DNA阵列，以筛选本文所述的方法。

在又一些实施方案中，可以使用微珠、颗粒或基于珠子的平台检测RNA。例如，可以将结合并且检测RNA的寡核苷酸偶联到珠子上。在一些实施方案中，可以使用市售可得平台，如得自Luminex的FlexmiR^TM(Austin，TX)或得自Illumina的DASL assay(San Diego，CA)。

此外，可以使用微流体装置进行上述的方法。这些系统将允许结合并且检测目标RNA的过程微型化，并且隔开。在一些实施方案中，还可以在微流体装置中分离RNA。可以使用的微流体装置在下列文献中具有记载：美国专利No.7,591,936，7,581,429，7,579,136，7,575,722，7,568,399，7,552,741，7,544,506，7,541,578，7,518,726，7,488,596，7,485,214，7,467,928，7,452,713，7,452,509，7,449,096，7,431,887，7,422,725，7,422,669，7,419,822，7,419,639，7,413,709，7,411,184，7,402,229，7,390,463，7,381,471，7,357,864，7,351,592，7,351,380，7,338,637，7,329,391，7,323,140，7,261,824，7,258,837，7,253,003，7,238,324，7,238,255，7,233,865，7,229,538，7,201,881，7,195,986，7,189,581，7,189,580，7,189,368，7,141,978，7,138,062，7,135,147，7,125,711，7,118,910和7,118,661。

在一些实施方案中，可以进行多路复用技术。例如，可以使用基于颗粒的分析方法(如基于珠子的分析方法)与流式细胞法组合进行多路复用。可以使用多参数免疫分析或其它高通量检测分析，该分析使用具有同源配体和报道分子的珠涂层(其具有与高灵敏度自动化一致的特定活性)。例如，在基于颗粒的分析系统中，可以将所关注RNA用的结合剂(如寡核苷酸)固定在可寻址的柱子或微球上。用于各单独结合分析(如当结合剂为抗体时的免疫分析)的各结合剂可以偶联到不同类型的微球(即微珠)上，并且在微球的表面进行结合分析反应。微球可以通过不同的标记区分，例如，与具有不同结合剂的其它微球相比，具有特定结合剂的微球具有不同的信号标记物。例如，微球可用独立的荧光强度染色，使得具有特定结合剂的微球的荧光强度不同于具有不同结合剂的其它微球的荧光强度。

RNA检测方法可以用于确定样品中RNA的水平，如平均拷贝数/微升血清。在一些实施方案中，用平均值的95％置信区间计算各RNA的水平(例如，15,648+/-10,431拷贝/微升)。在其它实施方案中，用80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94％的置信区间计算各RNA的水平。在又一些实施方案中，用平均值的95、96、97、98、99或100％的置信区间计算各RNA的水平。

RNA图案和PSA/PCA3水平

可以用一种或多种非RNA生物标记物评价一种或多种RNA，以表征癌症。可以使用单独的样品用于评价一种或多种RNA，如检测一种或多种miRNA、检测一种或多种mRNA和检测一种或多种非RNA生物标记物。在一些实施方案中，使用一种以上的样品。例如，可以使用单独的样品(如血液或尿)来检测一种或多种miRNA、PSA mRNA、PCA3 mRNA和PSA蛋白。

可以使用RNA水平和蛋白水平的组合来表征癌症。在一些实施方案中，使用miRNA和mRNA的表达水平的组合。例如，mRNA水平可以涉及基因或融合基因，如TMPRSS2:ERG或TMPRSS2:ETS。在其它实施方案中，mRNA涉及PCA或PCA3。在又一些实施方案中，使用一种或多种miRNA、一种或多种mRNA、一种或多种蛋白或其组合的水平表征癌症。在又一些实施方案中，确定对象的第一样品(如尿或血样)中的一种或多种miRNA、一种或多种mRNA、一种或多种蛋白或其组合的表达水平，并且将其用于确定是否应当从对象中获取第二样品，以进一步分析。例如，第二样品可以为活组织。

例如，一种或多种RNA和PSA的表达水平可以用于表征前列腺癌。可以确定第一样品中的一种或多种RNA和PSA的表达水平，并且将其用于确定是否应当从对象中获取第二样品，以进一步分析，例如，进一步组织学检查。与单独评价一种或多种RNA或单独评价PSA蛋白水平相比，评价RNA图案和PSA蛋白水平可以提供增加的特异度或灵敏度。例如，与单独用一种或多种RNA或单独用PSA水平进行的检测情况相比，灵敏度或特异度可以高至少约5、10、15、20、30、35、40、50、75、100、150、200、250、500、1000％或更高。

在一些实施方案中，PCA3水平用于表征癌症或确定是否应当获取第二样品(如活组织)以进行分析。例如，在一些实施方案中，使用miRNA水平和PCA3 mRNA水平。与单独评价miRNA水平或单独评价PCA3mRNA水平相比，评价miRNA水平和PCA3 mRNA水平可以在表征前列腺癌时提供提高的特异度或灵敏度。例如，灵敏度或特异度可以为至少约5、10、15、20、30、35、40、50、75、100、150、200、250、500、1000％或更高。

在又一些实施方案中，miRNA水平、PCA3 mRNA水平和PSA mRNA水平用于表征癌症或确定是否应当获取第二样品(如活组织)以进行分析。与评价miRNA水平、PCA3 mRNA水平和PSA mRNA中的一种或两种相比，评价miRNA水平、PCA3 mRNA水平和PSA mRNA水平可以在表征前列腺癌时提供提高的特异度或灵敏度。例如，灵敏度或特异度可以为至少约5、10、15、20、30、35、40、50、75、100、150、200、250、500、1000％或更高。

在又一些实施方案中，miRNA水平、PCA3 mRNA水平、PSA mRNA水平和PSA蛋白水平用于表征癌症或确定是否应当获取第二样品(如活组织)以进行分析。与评价miRNA水平、PCA3 mRNA水平、PSA mRNA水平和PSA蛋白水平中的一种、两种或三种相比，评价miRNA水平、PCA3mRNA水平、PSA mRNA水平和PSA蛋白水平可以在表征前列腺癌时提供提高的特异度或灵敏度。例如，灵敏度或特异度可以为至少约5、10、15、20、30、35、40、50、75、100、150、200、250、500、1000％或更高。

在一些实施方案中，PCA3 mRNA水平和PSA mRNA水平被用于获得PCA3得分，该得分为PCA3 mRNA水平与PSA mRNA水平的比值，如PCA3 mRNA拷贝数相对于PSA mRNA拷贝数的比值。PCA3得分可以被用于表征前列腺癌，或确定是否应当获取第二样品(如活组织)以进行分析。

在一些实施方案中，PCA3得分与一种或多种RNA的表达水平(如miRNA的水平)一起用于表征表征前列腺癌，或确定是否应当获取第二样品(如活组织)以进行分析。与单独评价一种或多种RNA或单独评价PCA3得分相比，评价RNA图案和PCA3得分可以可以在表征前列腺癌时提供提高的特异度或灵敏度。例如，灵敏度或特异度可以为至少约5、10、15、20、30、35、40、50、75、100、150、200、250、500、1000％或更高。

在又一些实施方案中，PCA3得分与一种或多种RNA的表达水平和PSA蛋白的表达水平一起用于表征表征前列腺癌，或确定是否应当获取第二样品(如活组织)以进行分析。与评价RNA图案、PSA蛋白水平和PCA3得分中的一种或2种相比，评价一种或多种RNA和PAS蛋白以及确定PCA3得分可以可以在表征前列腺癌时提供提高的特异度或灵敏度。例如，灵敏度或特异度可以为至少约5、10、15、20、30、35、40、50、75、100、150、200、250、500、1000％或更高。

在又一些实施方案中，可以通过确定将RNA的水平与PSA的水平相乘得到的乘积值来表征前列腺癌。然后该乘积值可用于表征前列腺癌。乘积值可用于诊断对象、将癌症分类为良性癌或恶性癌或选择用于对象的疗法。可以将对象的乘积值与参考值比较，以表征癌症。例如，可以通过确定患有前列腺癌的患者的乘积值来确定参考值，以诊断前列腺癌。还可以针对前列腺癌的不同阶段、或者针对良性前列腺癌或恶性前列腺癌来确定参考值。还可以针对药物疗效确定参考值，例如，基于进行有效前列腺癌治疗的患者确定参考值。

乘积值可以以约70％或75％的特异度用于表征癌症。例如，可以使用具有下列特异度的乘积值表征前列腺癌：大于约76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97％。可以以下列的特异度表征前列腺癌：至少约97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、998.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。在又一些实施方案中，可以以100％的特异度表征癌症。

在一些实施方案中，可以使用具有至少约60％的灵敏度的乘积值表征癌症，所述灵敏度例如为至少约60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97％。可以以下列灵敏度表征癌症：至少约97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、998.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。在又一些实施方案中，可以以100％的灵敏度表征癌症。此外，乘积值可以以100％的特异度和100％的灵敏度表征前列腺癌。例如，可以以100％的特异度和100％的灵敏度诊断前列腺癌。

RNA的水平可以是miRNA的拷贝数/微升样品，并且PSA的水平可以蛋白的量/微升样品，如ng/ml。样品中的miRNA的量乘以PSA蛋白的量可以用于确定正常对象的乘积值以及患有前列腺癌的对象的乘积值。因此，可以确定正常对象和患有前列腺癌的对象的参考水平。可以确定由对象获得的样品的乘积值，并且与参考水平比较，以表征对象的癌症，如诊断癌症。例如，可以通过将血清样品中的miR-141的拷贝/微升乘以血清样品中的纳克PSA/微升(例如，参见图5)而获得乘积值。如果乘积值小于1500、1550、1400、1450或1400，可以提供对象不具有前列腺癌的诊断。或者，如果乘积值大于1500、1600、1700、1800、1900或2000，可以提供对象具有前列腺癌的诊断。在一些实施方案中，如果乘积值大于约2000、2100、2200或2300，提供对象具有前列腺癌的诊断。如果乘积值小于1500，则将前列腺癌分类为良性癌。或者，如果乘积值大于1500，则将癌症分类为恶性癌。

乘积值可以用于将前列腺癌分类，或者确定是否应当采取第二样品(如活组织)以进行分析。例如，如果乘积值小于1500、1200或1000，则无需获取活组织。在其它实施方案中，如果乘积值大于1500、1700、1800或2000，则应获取活组织。

在另一个实施方案中，提供将前列腺癌分类为良性癌或恶性癌的方法以及确定是否应当获取第二样品的方法。例如，当PSA蛋白低于约3ng/mL(如至少2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1或2.0ng/mL)，miRNA小于约3000拷贝/微升(如小于约2500、2000、1500、1000或500拷贝/微升并且PCA3得分可任选地小于35(如小于30、25或20)，则将前列腺癌分类为良性癌，无需获取第二样品(如活组织)，或者进行以上的两者。

在另一个实施方案中，当miRNA小于约3000拷贝/微升(如小于约2500、2000、1500、1000或500)并且PCA3得分小于35(如小于30、25或20)，则将前列腺癌分类为良性癌，无需获取第二样品(如活组织)，或者进行以上的两者。

当PSA蛋白大于约4ng/mL(如至少4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0ng/mL)，miRNA大于约9000拷贝/微升(如大于约9500、10,000、15,000或20,000拷贝/微升)，并且PCA3得分可任选地大于35(如至少40、45或50)时，则将前列腺癌分类为恶性癌，获取第二样品(如活组织)，或者进行以上的两者。

在另一个实施方案中，当miRNA大于约9000拷贝/微升(如大于约9500、10,000、15,000或20,000拷贝/微升)，并且PCA3得分可任选地大于35(如至少40、45或50)时，则将前列腺癌分类为恶性癌，获取第二样品(如活组织)，或者进行以上的两者。

检测系统和试剂盒

还提供一种检测系统，该系统被构造为确定一种或多种RNA，以表征癌症。例如，检测可以被构造为评价至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2500、5000、7500、10,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、750,000或1,000,000种RNA。例如，检测系统被构造为评价2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2500、5000、7500、10,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、750,000、1,000,000种或更多种miRNA，其中一种或多种miRNA选自表1。在一些实施方案中，由该系统检测的一种或多种miRNA选自由下列组成的组：miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222、miR-141。在又一些实施方案中，一种或多种miRNA选自由miR-99、miR-101、miR-130、miR-135、miR-141、miR-148、miR-182、miR-186、miR-206、miR-320、miR-374、miR-433、miR-496、miR-517、miR-590、miR-620、miR-768、miR-223、miR-203、miR-199、miR-519、miR-302、miR-30、miR-20、miR-200、miR-23、miR-29、miR-181、miR-548或miR-370组成的组。检测系统还可以被构造为检测PSA、PCA或这两者的mRNA水平。

检测系统可以为低密度检测系统或高密度检测系统。例如，低密度检测系统可以检测高达约100、200、300、400、500或1000种RNA，而高密度检测系统可以检测至少约2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9,000、10,000、15,000、20,000、25,000、50,000或100,000种RNA。检测系统可以对RNA的种类(如miRNA)是特异性的。用于miRNA的低密度检测系统可以检测高达约100、200、300、400、500或1000种miRNA。用于miRNA的高密度检测系统可以检测至少约2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9,000、10,000、15,000、20,000、25,000、50,000或100,000种miRNA。

检测系统可以包含选择性地与一种或多种RNA结合的探针组。例如，检测系统可以包含选择性地与至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、2500、5000、7500、10,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、750,000或1,000,000种miRNA结合的探针组。例如，探针组可以选择性地与选自表1中的一种或多种miRNA杂交，所述一种或多种miRNA选自由下列组成的组：miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p miR-324-5p、miR-148b、miR-222、miR-141。在又一些实施方案中，一种或多种miRNA选自由miR-99、miR-101、miR-130、miR-135、miR-141、miR-148、miR-182、miR-186、miR-206、miR-320、miR-374、miR-433、miR-496、miR-517、miR-590、miR-620、miR-768、miR-223、miR-203、miR-199、miR-519、miR-302、miR-30、miR-20、miR-200、miR-23、miR-29、miR-181、miR-548或miR-370组成的组。检测系统还可以包含用于PSA、PCA或这两者的mRNA水平的探针。

检测系统可以是包含用于检测RNA的探针的低密度检测系统或高密度检测系统。例如，低密度检测系统可以包含用于检测高达约100、200、300、400、500或1000种RNA的探针，而高密度检测系统可以包含用于检测至少约2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9,000、10,000、15,000、20,000、25,000、50,000或100,000种RNA的探针。探针可以对检测RNA的种类(如miRNA)是特异性的，使得用于miRNA的低密度检测系统可以包含用于检测高达约100、200、300、400、500或1000种miRNA的探针。用于miRNA的高密度检测系统可以包含用于检测至少约2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9,000、10,000、15,000、20,000、25,000、50,000或100,000种miRNA的探针。

探针可以附连至固体基材(如阵列或珠子)上。或者，探针不是附连的。检测系统可以是基于阵列的系统、测序系统、基于PCR的系统或基于珠子的系统，如上述的系统。检测系统可以是试剂盒的一部分。或者，试剂盒可以包含本文所述的一种或多种组。例如，试剂盒可以包含用于检测选自下列的一种或多种miRNA的探针：miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222或miR-141。在又一些实施方案中，一种或多种miRNA选自由miR-99、miR-101、miR-130、miR-135、miR-141、miR-148、miR-182、miR-186、miR-206、miR-320、miR-374、miR-433、miR-496、miR-517、miR-590、miR-620、miR-768、miR-223、miR-203、miR-199、miR-519、miR-302、miR-30、miR-20、miR-200、miR-23、miR-29、miR-181、miR-548或miR-370组成的组。一些实施方案中，试剂盒还包含选择性地与PSA或PCA3结合的一种或多种试剂。例如，试剂盒可以包含试剂(如探针)，以检测PSA蛋白水平或PSA mRNA水平。试剂盒还可以包含检测PCA3 mRNA水平的试剂。

计算机系统

本文还提供用于表征癌症的计算机系统。因此，图6为示出代表性的逻辑装置的框图，通过该逻辑装置可以产生表型图谱和报告。

图6示出计算机系统(或逻辑装置)600，其接收得自生物样品的表达水平数据，分析表达水平，确定癌症的特征(例如但不限于将癌症分类、确定是否应当获取第二样品、提供诊断、提供预后、选择治疗方法、确定药物效力)，并且产生结果，如输出在屏幕上，打印出报告或者输送至其它计算机系统。计算机系统600可以理解为能够由介质611和/或网络站点605读取指令的逻辑装置，其可任选地连接至具有固定介质612的服务器609。图6所示的系统包括CPU 501、盘驱动器603、可任选的输入装置(如键盘615和/或鼠标616)以及可任选的监视器607。

可以通过通过制定的通信介质将数据传输至局部或远程为止的服务器609。通信介质可以包括传输和/或接收数据的任何手段。例如，通信介质可以是因特网连接。这种连接可以在万维网上提供连通。还构想到，与本发明相关的数据可以通过这些网络或连接被用户622接收和/或阅览，所述数据例如为一种或多种RNA的表达水平、表达水平的分析结果(如癌症的表征或分类)。接收方622可以为(但不限于)对象、意料服务商或医疗管理方。在一些实施方案中，信息储存在计算机可读介质中。

实施例

实施例1：由对象获取血清样品

可以由对象(健康对象以及患有前列腺癌的对象)将血液收集在EDTA管、柠檬酸盐管或10-ml Vacutainer SST以及血液收集管(BD367985或BD366643，BD Biosciences)中。在收集2小时内将血液处理，以进行血浆分离。

使样品在室温下静置最短30分钟，最长2小时。通过在1,000-1,300xg、4℃的条件下离心15-20分钟实现凝块的分离。除去血清，并且将其以500μl的等分形式分配至500-750μl的冷冻管内。将样品储存在-80℃下。

在给定的时间，取出的血液量可以为～20至～90ml。将来自几个EDTA管的血液汇集，并且转移至不含RNAse/DNA酶的50-ml圆锥管(Greiner)，并且在Hettich Rotanta 460R台式离心机中于室温、1,200x g的条件下离心10分钟。将血浆转移至新管内，留下团块以上的固定高度为0.5cm的血浆上清液，以避免影响团块。将血浆等分，倒置，以在各等分物之间混合，并且储存在-80℃下。

实施例2：从人血浆和血清样品中分离RNA

将400μl的人血浆或血清在冰上冷冻，并且用等体积的2X变性液(Ambion)将其裂解。使用mirVana PARIS试剂盒根据制造商对于液体样品的说明(Ambion)分离RNA，其中操作过程被改变为用等体积的酸-苯酚氯仿(由Ambion kit提供)提取两次。根据制造商的说明用105μl Ambion洗脱液洗脱RNA。由各柱子回收的洗脱物的平均体积为约80μl。

还使用了mirVana PARIS(Ambion)的放大形式：将10ml血浆在冰上冷冻，将两个5ml的等分物转移至50-ml管中，用等体积的mirVana PARIS2X变性溶液稀释，通过涡旋30秒而彻底混合并且在冰上培育5min。然后向各等分物中加入等体积(10ml)的酸/苯酚/氯仿(Ambion)。将所得的溶液涡旋1分钟，并且JA17转子中以8,000rpm、20℃的条件旋转5分钟。将酸/苯酚/氯仿提取重复3次。将所得的水性物与1.25倍体积的100％分子梯度乙醇彻底混合，并且将其以连续的700-μl等分量通过mirVana PARIS柱。根据制造商的说明将柱子洗涤，并且将RNA稀释在105μl洗脱缓冲液内(95℃).。通过Nanodrop将总共1.5μl洗脱物定量。

实施例3：使用TaqMan qRT-PCR分析测量血浆和血清的RNA中的 miRNA水平

将1.67μl的定量RNA溶液(得自由给定样品的RNA分离获得的约～80μl洗脱物)用作引入逆转录(RT)反应的被操作物。对于其中从400-μl血浆或血清样品分离RNA的样品，例如，1.67μl RNA溶液表示对应于(1.67/80)X400＝8.3μl血浆或血清的RNA。为了生成对应于已知miRNA的化学合成的RNA寡核苷酸的标准曲线，在水中制备不同稀释度的各寡核苷酸，使得引入RT反应的最终被操作物的体积为1.67μl。使用TaqManmiRNA逆转录试剂盒和miRNA特异性茎环引物(Applied BioSystems)在小型RT反应中将引入的RNA进行逆转录，所述RT反应包含：1.387μl的H2O、0.5μl的10X逆转录缓冲液、0.063μl的RNase抑制剂(20单位/μl)、0.05μl的100mM dNTP(含有dTTP)、0.33μl的Multiscribe逆转录酶和1.67μl被引入的RNA；除了被引入的RNA之外的其它成分可以使用Tetrad2 Peltier热循环仪(BioRad)在以下条件下以大量贮备料的形式制备在16℃下进行30分钟，在42℃下进行30分钟并且在85℃下进行5分钟。在Applied BioSystems 7900HT热循环仪上于95℃下进行实时PCR 10分钟，随后进行95℃、15秒和60℃、1分钟的40个循环。使用SDS相对定量软件版本2.2.2(Applied BioSystems.)分析数据，其中使用自动Ct设置来分配基线和阈值，以进行Ct测定。

操作规程还可以被更改为包括预扩增步骤，如为了检测miRNA。将等分为1.25-μl的未稀释RT产物与3.75μl预扩增PCR试剂混合[所述试剂在每个反应中包含2.5μl的TaqMan PreAmp母混合液(2X)和1.25μl的0.2X TaqMan miRNA测定(在TE中稀释)]，以进行5.0-μl预扩增PCR，其在Tetrad2 Peltier热循环仪(BioRad)上以如下条件进行：加热到95℃并保持10分钟，随后进行95℃、15秒和60℃、4分钟的14个循环。将预扩增PCR产物稀释(通过将20μl的H₂O加入到5-μl的预扩增反应产物中来实现)，随后，将2.25μl的稀释材料引入到实时PCR，并且按照所述的方式进行反应。

实施例4：生成用于对miRNA进行绝对定量的标准曲线

对应于成熟miRNA序列(miRBase Release v.10.1)的合成单链RNA寡核苷酸购自Sigma公司。将合成miRNA在实证的拷贝范围内引入RT反应，以生成以上所述的各miRNA TaqMan分析的标准曲线。通常，基于引入RT反应的最少拷贝数的被操作物设计用于各分析的精确定量的下限，所述最少拷贝数的被操作物产生在标准曲线的线性范围内的Ct值，并且也不等于或高于由较少拷贝数的RT操作物获得的Ct。使用线性范围内的Ct值将所得的线与得自各稀释系列的数据拟合，由此得到方程式y＝mln(x)+b，以定量各样品Ct(y)的绝对miRNA拷贝。基于下列的知识将引入RT反应的miRNA的绝对拷贝数换算为miRNA的拷贝/微升血浆：引入RT反应的材料对应于总起始量的血浆中的2.1％的RNA[即，总RNA洗脱物量(平均80μl)中的1.67μl被引入RT反应]。合成的miRNA序列的例子为miR-141，5’UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG3’(SEQ ID NO.1)，其可以(例如)从Sigma公司(St.Louis，MO)商购获得。

实施例5：使用免疫组织化学分析鉴别前列腺癌的基因表达谱

切下实体瘤的样品，将其固定并且嵌入石蜡中。将肿瘤块切成用于置于玻璃载玻片上的切片。将切片用于病理学家选择的组织抗原反应的指定初级抗体染色。将标记的二级抗体与初级抗体反应，并且偶联到抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶。将该复合物与色原体反应，以生成着色的色斑。由病理学家在光学显微镜下观察该染色的载玻片。病理学家对染色强度进行半定量解析。通常利用0-4个级别，其中0表示没有染色或负性结果。然后病理学家估测被阳性染色的肿瘤细胞的比例。通常利用0至100％的级别。病理学家将各抗体解析结果在患者报告中进行注解。对22个前列腺癌样品的分析结果表明在22个样品中的至少10个过表达的基因为雄激素受体-EGFR、HSP90和SPARC(图1C)。

实施例6：用于鉴别前列腺癌基因表达谱的组织制备

组织制备

在开始之前，使用无粉末手套将工作区域用RNAseAway(Sigma目录No.83931)或70％乙醇(70％200酒度的乙醇和30％的纯水)彻底清洁。从-80℃的冷冻机中取出冷冻的组织，并且理解转移至含有干冰的托盘，使组织在任何时间都不停留在室温下。如果组织较小的话尤其应如此，因为其会迅速解冻，从而最终导致RNA不可逆降解。

将直径为100mm的Petri培养皿(塑料)或组织培养皿置于干净的冰上以进行预冷，以及将干净的锯齿状小镊子和新的干净的重型刀片也预冷。

培养皿中的组织如果卷绕在金属箔或其它材料中，则在与冰接触的同时(以防止其解冻)仔细地将其解绕。甚至组织的部分解冻(其可能在数秒内发生)也会使得RNA不可逆地降解，从而降低微阵列分析的质量或使其难以分析。

使用预冷的镊子和刀片从组织中切下小片，因此用于微阵列分析的小片的厚度不大于约1mm。通常“刮下”肿瘤的一部分是最容易和最快的方法。将镊子和刀片每隔数秒就在一片干冰上冷却，使得它们在与组织接触时保持很冷。使用约100-400mg的组织(大约20mm3，不大于茶叶大小)。

将组织切片仔细地置于预先在干冰上冷却的抗静电称重皿(优选为“倾船型”)上。然后将组织由称重皿迅速转移至预冷的硼硅酸管(其预先用适当的样品编号标注)中，从而确保组织切片不粘连到管的壁上(因为该组织会迅速解冻)。在转移组织时保持管很冷并且直立(这是避免上述情况的最佳方式)。

任何剩余的组织都应当在干冰上保持冷冻，直至将其放回至-80℃的冷冻机中为止。

使用Covaris组织处理器进行匀质化

首先将循环水浴(Multitemp III)打开，因此其开始冷却水。确保水浴含有足量的水(只有超纯水)。打开Covaris S-2仪器。将Covaris系统的水槽填充95％超纯水和5％自来水。启动与Covaris S-2仪器相连的计算机，并且打开SonoLab软件。

通过点击SonoLab窗口上的“脱气”按钮从而启动脱气过程；水应当脱气并且预冷约30分钟(通过Multitemp III冷却器水槽)，因此温度在样品的匀质化期间保持在17至20℃之间。此外，应当在整个试验期间都运行脱气过程，只有在准备关闭SonoLab软件和Covaris S-2仪器时才停止脱气。

将预先切割的冷冻组织保持在干冰上的Covaris硼硅酸盐管内，直至一切都准备好进行匀质化。

打开SonoLab程序中的程序“MPI/IGC处理”(注：应非常快速地进行下列步骤，以便冷冻的组织在匀质化之前最后一秒都保持冷冻。组织在各步骤之间的解冻时间越长，则通常有更多的RNA降解)。

使用过滤型1000μL吸移头和P-1000吸移管将500μL RLT缓冲液(得自Qiagen RNeasy微型试剂盒)加入到冷冻组织内。理解将螺盖盖回，并且非常迅速地将管插入Covaris S-2仪器中的管支架内。在使用之前向RLT中加入2-巯基乙醇。每1ml RLT缓冲液加入10μL 2-巯基乙醇。然后按下用于开始匀质化的启动按钮。

在完成上述过程之后取出管，并且将其置于湿冰上。打开盖子，并且加入500μL TRIzol。然后将管再次改善，并且通过左右移动管而将其迅速混合。

如果在匀质化之后很快就进行RNA提取，则将管保持在湿冰上，否则将所有样品在干冰中或-80℃下冷冻，直至准备用于RNA提取。

在匀质化过程结束时，关闭脱气，从Covaris S-2仪器的水槽中取出水，然后脱气约2秒，以将剩余的水从管线中排出。首先关闭SonoLab程序，然后关闭Multitemp III冷却器水槽，并且关闭Covaris S-2仪器。

实施例7：用于鉴别前列腺癌基因表达谱的RNA提取和纯化

TRIzol提取

如果已经预先将匀质化的组织存储在-80℃下，则将组织在室温或65℃下解冻。使用无粉末的手套将工作区域将工作区域再次用RNAseAway

(Sigma目录No.83931)或70％乙醇彻底清洁。(注：除非另外说明，否则下列步骤均在室温下进行并且使用室温试剂)。

将管的内容物转移至具有螺盖的灭菌的不含有RNAse的2mL管中，确保盖子良好密封。将样品在65℃下的数字加热块中加热5分钟。如果预先冷冻，则将样品在65℃下培育7分钟。

然后将样品从加热中取出，并且立即在管仍然热的条件下加入200μL氯仿。将盖子密封，然后通过剧烈振摇而混合15-30秒(不进行涡旋，否则DNA分子会被剪切，并且可能污染RNA)。

然后将管在冰上冷却5分钟，随后在室温下以10,000x g的转速将管离心10分钟。使用过滤型头缓慢地取出含有总RNA的大约0.7ml的上层水相，并且将其置于经标记的新的1.5mL管内。

然后向匀质化的裂解物中加入0.7mL室温下的70％乙醇，并且通过吸移操作混合均匀。

用RNeasy小型或微型试剂盒纯化含有RNA的水相(注：在处理针刺活组织样品时，使用微型柱结合RNA和添加到裂解物中的载体RNA。Rneasy微型试剂盒(Qiagen目录No.74004)含有作为载体RNA加入的聚-AN RNA。在第一次使用之前，将载体RNA(310μg)溶解于1ml不含Rnase的水中。在-20℃下存储该贮备液，并且用于制备各组RNA制备用的新鲜稀释液)。

为了制备用于10次制备的工作溶液(4ng/μL)，将5μL溶解的RNA加入到34μL缓冲液RLT中，并且通过吸移操作进行混。将6μL经稀释的该溶液加入到54μL缓冲液RLT中。最终的浓度为4ng/μL。

将至多0.7mL样品(包括可能形成的任何沉淀物)施加到置于2mL收集管中的RNeasy小型或微型柱上。将该管轻柔封闭，并且在8000x g下离心30秒。将其余的0.7mL样品混合物加入到相同的RNeasy小型或微型柱上，并且再次在8000x g下离心30秒。

然后将0.7mL缓冲液RW1加入到RNeasy小型或微型柱。将该管轻柔封闭，并且在8000x g下离心30秒，以洗涤柱子。将通过柱子并且进入2ml收集管的流出物抛弃。

在不接触柱子的底部的条件下，将RNeasy小型或微型柱转移至新的2mL收集管。将0.5mL缓冲液RPE吸移到RNeasy小型或微型柱。将该管轻柔封闭，并且在8000x g下离心30秒，以洗涤柱子。然后抛弃通过柱子的流出物。

然后再次将0.5mL缓冲液RPE加入到Rneasy柱上。将管轻柔封闭，并且在8000x g下离心2分钟，以干燥Rneasy硅胶膜。然后抛弃通过柱子并且进入收集管的流出物。

为了进行洗脱，将RNeasy小型或微型柱转移至新的1.5mL收集管(该管用病例号标记)。在Rneasy硅胶膜中心上方吸移不含Rnase的H2O(对于小型管为30-40μL，或者对于微型管为7-14μL)，而不接触该膜。将管封闭，并且2-4分钟后，将管在16,100x g下离心1分钟。

然后将小型或微型柱抛弃，并且将RNA置于冰上。

将1μL各样品等分至PCR管中，以进行生物分析。按照如下方式通过在分光光度计中测量光学密度或吸光率来确定RNA浓度：将TE pH 8.0用作稀释缓冲液，并且作为空白。制备1∶100的稀释液(1μL RNA和99μLTE pH 8.0)，并且利用Agilent分光光度计读取260和280nm下的吸光度(使用石英容器)。分光光度计的设置为“比例”，并且所获得的比例为260nm下的吸光度相对于280nm下的吸光度的比例，其优选为1.8至2.2。在260nm下的吸光度超出线性范围(低于0.1或高于1)的情况下，分别通过增加RNA的量或者进一步稀释而重复在TE中稀释RNA的操作。然后将RNA置于指定的-80℃下的冷冻机中，直至准备进行RNA标记。

实施例8：用于鉴别前列腺癌基因表达谱的RNA扩增和荧光标记

在由组织纯化RNA之后，该RNA的扩增和标记是使用微阵列分析进行基因表达图谱分析中的关键步骤。该技术允许使用纯化的总RNA作为模板，以通过逆转录RNA扩增中的第一步来合成互补DNA(cDNA)。通过在引入与荧光氰蓝染料(氰蓝-3(粉红色)或氰蓝-5(蓝色))结合的核苷酸(CTP)的同时使用cDNA作为模板进行体外转录，从而合成荧光互补RNA(cRNA)。然后通过将所得的荧光RNA与标记有不同氰染料的其它RNA在cDNA阵列上杂交，从而将二者进行同时比较。

A)由总RNA合成cDNA：

在开始之前，使用无粉末手套将工作区域用RNAseAway

(Sigma目录No.83931)或70％乙醇(70％200酒度的乙醇和30％的纯水)彻底清洁。工作区域、所用的材料和仪器非常干净、无尘屑并且不含RNase是非常重要的。

将2μg总RNA加入到体积为10.3μL至0.2mL的微离心管中。总浓度应当至少为5ng/μL。在使用超过500ng的总RNA(或10ng以上的聚A+RNA)时，总体积应为6.5μL。

然后加入3μL T7启动子引物(得自试剂盒)。然后使用不含核酸酶的水，使得总反应体积达到11.5μL。通过在热循环仪中在65℃下培育反应10分钟，从而使得引物和模板变性。将反应在4℃下培育5分钟(这可以在冰上或热循环仪中进行)。

在使用之前即时通过在室温下进行抽吸操作将下列成分按照所列的次序轻柔混合(通过培育在80℃的热块中温育容器1-2分钟而将5X第一链缓冲液预热)。为了确保最优的再悬浮，简短地进行涡旋，并且在微离心管中以全速度简短地使管旋转，以促使内容物与壁和盖子分开)。在室温下保存直至使用。

表2：cDNA母混合液

成分	体积(μL/rxn)	体积(μL/6.5rxn)
			5X第一链缓冲液	4.0	26
0.1M DTT	2.0	13
			10mM dNTP混合物	1.0	6.5
MMLV RT	1.0	6.5
			RNaseOUT	0.5	3.3
总体积	8.5	55.3

向各样品管中加入8.5μL cDNA母混合液。然后将管在低设置下以短的脉冲进行涡旋，以避免形成气泡。存在气泡可能导致酶变性，从而损害酶活性。

然后将样品在热循环仪中于40℃下培育2小时。然后将热循环仪的温度转换为65℃，并且将样品培育15分钟(在65℃下的培育使得MMLV-RT(莫罗尼鼠白血病病毒逆转录酶)失活)。

然后将反应在4℃下培育5分钟(这可以在冰上或热循环仪中进行)。将样品在微离心管中以全速度间断地旋转，以促使管内容物与管壁和盖子分离。

B.荧光cRNA合成：体外转录以及引入氰蓝3或氰蓝5CTP

向各样品管中加入2.4μL氰蓝3-CTP(10mM)或2.4μL氰蓝5-CTP(10mM)。氰蓝3为浅粉红色，并且氰蓝5为浅蓝色。这两种物质都是光敏性的，因此应当最低程度地接触光。氰蓝3-CTP(粉红色)通常用于正常参照RNA标记，而氰蓝5-CTP(蓝色)用于患者(肿瘤患者)的RNA标记。通过将含有50％PEG(聚乙二醇)溶液的容器在40℃的热块内温育1分钟而将该溶液预热。为了确保最优的再悬浮，简短地进行涡旋，并且在微离心管中以全速度简短地使管旋转，以促使内容物与壁和盖子分开。在室温下保存直至使用。

按照表3制备转录用母混合液。

在使用之前即时迅速地使含有反应成分的所有管旋转，以使得内容物脱落(达数秒)，并且在室温下按照指定的次序组合下列成分(然后在地设置下轻柔地涡旋母混合液，并且在微离心管中以全速度旋转，然后再加入至样品管中)(注：直至进行反应之前再加入酶)。

表3：转录用母混合液

成分	体积(μL/rxn)	体积(μL/6.5rxn)
			不含核酸酶的水	15.3	99.4
4X转录缓冲液	20	130
			0.1M DTT	6.0	39
NTP混合物	8.0	52
			50％PEG	6.4	41.6
RNA seOUT	0.5	3.3
			无机焦磷酸酶	0.6	3.9
T7 RNA聚合酶	0.8	5.2
			总体积	57.6	374.4

向各样品管中加入57.6μL转录用母混合液，并且通过在低设置下仔细地以短的脉冲涡旋而进行混合，以避免形成气泡。然后迅速地以全速度将管在微离心器中旋转，以使得管的内容物脱落(达数秒)。

然后将样品在40℃下的热循环仪浴中培育2小时。

C.纯化扩增的cRNA(注：记住在第一次使用试剂盒之前向缓冲RLT中加入4倍量的100％乙醇(见瓶子上对特定体积的标记)).

将20μL不含核酸酶的水加入到cRNA样品中，使得总体积为100μL。加入350μL缓冲RLT，然后通过轻柔地涡旋而进行完全混合。加入250μL乙醇(100％纯度)，然后通过涡旋完全混合。样品此后不进行离心。

将700μL cRNA阳平加入到2mL收集管中的RNeasy小型柱上。将样品在13,000x g下离心30秒。在第一次离心之后，如果标记成功的话，则柱子膜上应存在颜色(对于氰蓝-3而言为粉红色，对于氰蓝-5而言为蓝色)。

使样品第二次通过柱子。这允许捕获在第一次通过时没有保留的标记RNA。然后废弃通过柱子的流出物并且收集管。

然后将RNeasy柱转移至新的收集管中，并且向柱子上加入500μL的缓冲RPE。然后将样品在13,000x g下离心30秒。将通过柱子的流出物废弃，并且将收集管再次使用。

再次将500μL的缓冲RPE加入到柱子上。然后将样品在13,000x g下离心1分钟，并且废弃通过柱子的流出物并且收集管。

通过将RNeasy柱转移至新的1.5mL收集管内，从而将清洗的cRNA样品洗脱。将30μL不含RNase的水直接加入到RNeasy过滤膜上。在2-3分钟之后，将管在13,000x g下离心30秒。保留流出物和收集管(这是标记的cRNA；应当存在粉红色(氰蓝3)或蓝色(氰蓝5))。

通过按照以下方式在分光光度计(Agilent Technologies)中测量光学密度或吸光度来确定RNA浓度：将TE pH 8.0用作稀释缓冲液，并且作为空白。制备1∶20稀释液(4μl RNA与76μl TE pH 8.0)。使用石英容器在Agilent分光光度计中确定260(RNA)nm、550(氰蓝3)nm和650(氰蓝5)nm下的吸光度。分光光度计的设置为“光谱/峰”，并且其范围为220至700nm。然后将对应于RNA和氰蓝染料的吸光度用于计算标记RNA的量和引入氰蓝染料的比率。

实施例8：使用用于鉴别前列腺癌基因表达谱的全人基因组微阵列进行杂交

荧光互补RNA(cRNA)与60-mer的寡聚微阵列的杂交是基因表达图谱分析中的关键步骤。通过使用Agilent微阵列技术可以确定所关注基因的基因表达谱，同时比较已经预先用不同荧光染料(氰蓝3或氰蓝5)标记的两种RNA(即，肿瘤RNA相对于正常RNA)。

使用cRNA标记的目标物进行的杂交

A)制备在4x44K Agilent寡聚微阵列上使用的2x cRNA目标溶液

在开始之前，使用无粉末手套将工作区域用RNAseAway(Sigma目录No.83931)或70％乙醇(70％200酒度的乙醇和30％的纯水)彻底清洁。工作区域、所用的材料和仪器非常干净、无尘屑并且不含RNase是非常重要的。

通过下列方法制备10x阻断剂(Agilent目录No..5188-5281)(如果第一次使用贮备管的话)：使用不含RNase的过滤型吸移头向冷冻的团块中加入0.5mL不含RNase的水(或DEPC水)，通过涡旋轻柔混合，并且离心5-10秒。在用水重构之后，应将10x阻断剂冷冻存储在-20℃下至多2个月。

向0.2mL不含RNAse的PCR管中加入不含核酸酶的水，使其体积达到52.8μL。

使用不含RNAse的过滤型吸移头加入825ng氰蓝3标记的cRNA和825ng氰蓝5标记的cRNA(如果其中的一者的标记效率较低的话，应加入更多的该者，以便在两者中加入大致相同量的氰蓝染料)。

使用不含RNAse的过滤型吸移头加入11μL的10x阻断剂。

可以将该2x目标溶液在干冰中迅速冷冻，并且存储在黑暗的-80℃冷冻机中达到1个月。

B)cRNA断裂和1x杂交溶液的制备

向52.8μL 2x cRNA目标溶液中加入2.2μL of 25x断裂用缓冲液，并且通过低速涡旋而轻柔混合，然后快速离心(5-10秒)，以将内容物从管壁和管盖子上脱落。

将管在热循环仪(如得自MJ Research的热循环仪)中于60℃下培育30分钟。该培育使cRNA断裂为对于杂交最优的理想大小的片段。在培育后，将管在微离心机中简短地旋转，以促使样品与管壁和盖子分离，

加入55μL的2x GE HI-RPM杂交缓冲液，然后通过仔细的吸移操作混合均匀(小心避免引入气泡)。然后将管在微离心器中简短地旋转，以促使样品与壁和盖子分离，然后立即使用。

将样品置于冰上，并且尽快负载于阵列上。

C)氰蓝3-标记和氰蓝5-标记的样品与Agilent 4x 44K寡聚微阵列的杂交

作为多个组装不锈钢杂交室，获得完成微阵列杂交所需的密封垫玻片(密封垫玻片)和微阵列。

在用杂交混合物负载各阵列之前，通过记录下相应的微阵列的条形码和各样品所负载的位置(阵列1_1、1_2、1_3、1_4)，从而以数字次序记录下待分析的样品。

将第一密封垫置于第一杂交室的底部，确保密封垫玻片的标记朝上，并且将其良好放置，并且与室底部齐平。在“分配并拖拉”杂交溶液之前，将100μL杂交溶液缓慢地(避免形成气泡)由第一样品管引导至密封垫玻片的中心，因此使用抽吸头使得溶液缓慢地扩散到整个密封垫玻片，同时将其分配，但是在溶液与围绕其的密封垫之间应留有约2-3mm的空间。

一旦溶液进行分配，使得具有密封垫玻片的杂交室底部不移动，并且尽快将微阵列置于密封垫玻片上。

使用干净的无粉末的手套从包装中取出合适的Agilent寡聚微阵列。为了避免损坏微阵列表面，只操作条形码所处的区域和其末端(一对包覆有特氟龙的小头镊子也可能有助于操作微阵列，并且将它们置于密封垫玻片上)。在条形码朝上(“Agilent一侧朝下”)时还有助于从塑料包装中取出微阵列，因为其必须以该方向放置，并且更容易确认是否将正确的阵列(具有正确条形码的阵列)分配至样品。

将阵列仔细地下落，并且与杂交室底部的4个导柱对准。一旦对准，并且轻微在密封垫玻片上(或与密封垫玻片平行)，将微阵列玻片置靠在密封垫玻片上，以获得夹住的玻片对。迅速地评价玻片，以确保它们完全对准，并且寡聚微阵列不是微开着。

将不锈钢室盖置于夹住的玻片上，然后将夹持组件滑入合适的位置，直至其位于杂交室底部中央的终止点，并且覆盖玻片对。通过逆时针旋转将指旋螺钉上紧，直至其完全用手上紧(不是使用工具使其过紧，因为这可能损坏部件并且使玻璃密封垫玻片和微阵列破裂)。

将杂交室组件竖直保持，并且逆时针旋转2-3次，以允许杂交溶液润湿密封垫和微阵列。当形成大的混合气泡时，检查夹住的玻片是否形成气泡。如果存在离散的混合气泡并且其在杂交室旋转时不移动，则轻轻得将杂交室叩击你的手或其它表面，并且再次旋转杂交室(保持竖直位置的同时)，以确定静置的气泡现在是否移动。在将组装的杂交室装入杂交转头架和烘箱之前，排出静置的气泡是重要的。

一旦组装完所有的杂交室，将其装入杂交转头架，确保装入的杂交室与相对的其它杂交室平衡(也能够使用空地杂交室)。将杂交转头架设置为以10rpm的速度旋转，并且在65℃下杂交17小时。

D.用稳定和干燥溶液洗涤

按照如下方式将基因表达洗涤缓冲液2预热至37℃：直接将1000mL的基因表达洗涤缓冲液2分配至灭菌的1000-mL瓶子内，并且重复该操作直至获得足量的预热试验用洗涤溶液2。将1000ml瓶子的盖拧紧，并且在分析之前置于37℃的水浴中过夜。

氰蓝5容易被臭氧降解，因此，如果实验室内的臭氧水平超过5ppb，则通常进行下列的过程(注：各洗涤组(最多8个玻片)均匀使用新的基因表达洗涤缓冲液1和2)。对于最多三组玻片的洗涤可以再次使用乙腈以及稳定和干燥溶液。

Agilent稳定和干燥溶液含有溶解在乙腈中的臭氧清除化合物。溶液内的化合物以饱和量存在，并且在正常的存储条件下可能从溶液中沉淀。如果溶液显示出可见的衬垫，则温热溶液以使化合物再溶解。用稳定和干燥溶液洗涤玻片显示出可见的沉淀物通常对微阵列性能产生复杂的不利作用。将溶液在置于密封容器内的水浴或通风的常规烘箱(40℃)中温热，所述密封容器留有充分的上部空间，以允许膨胀。如果需要的话，可以在远离明火或其它可燃源的通风橱内将溶液轻柔地混合，以获得均匀的溶液。将溶液仅在符合当地防火规范要求的受控的包围区域内加热。

待沉淀物完全溶解后，将封盖的溶液置于室温下，允许其在使用之前平衡至室温(注：最初的容器可用于加热溶液。完全再溶解沉淀物所需的时间取决于所存在的沉淀物的量，并且如果沉淀较多的话可能需要彻夜加热。稳定和干燥溶液不应过滤)。

应当将稳定和干燥溶液置于通风橱内。洗涤1和洗涤2放置区域应当接近，并且优选置于相同的通风橱内。在加热过程的每一个步骤中都应当使用手套和眼/脸保护。

在室温下用基因表达洗涤缓冲液1将玻片染色皿#完全充满。将玻片架置于玻片染色皿#2中。然后加入磁力搅拌棒，并且在室温下用足量的基因表达洗涤缓冲液1充入玻片染色皿#2，以覆盖玻片架。将该皿置于磁力搅拌台上。

将空的皿#3置于搅拌台上，并且加入磁力搅拌棒。在开始第一洗涤步骤之后再加入预热(37℃)的基因表达洗涤缓冲液2。

用乙腈填充玻片染色皿#4至约3/4满，加入磁力搅拌棒，并且将该皿置于磁力搅拌台上。

用稳定和洗涤溶液填充玻片染色皿#5至约3/4满，加入磁力搅拌棒，并且将该皿置于磁力搅拌台上。

将杂交室从培育器中取出，并且将其准备拆卸。将杂交室组件置于平坦表面上，并且松开指旋螺钉，逆时针旋转。将夹具组件滑开，并且取下杂交室盖。

通过用戴手套的手指抓住阵列-密封垫夹件的末端从杂交室中将其取出。保持微阵列玻片数字条形码朝上，并且将夹件迅速转移至玻片染色皿#1。

在不松开玻片的条件下将阵列-密封垫夹件浸入含有基因表达洗涤缓冲液1的玻片染色皿1中。在夹件完全浸入基因表达洗涤缓冲液1内的条件下，将夹件仅从条形码端打开。

使镊子的钝端中的一个在玻片之间滑移，轻柔地使镊子往上或往下翻转，以分离玻片，从而使密封垫玻片脱落至染色皿的底部。取出微阵列玻片，并且在室温下置于含有基因表达洗涤缓冲液1的玻片染色皿#2的玻片架上。应当最低程度地使玻片接触空气，并且仅触碰微阵列条形码部分，或其边缘。

在小组中的所有玻片均置于玻片染色皿#2中的玻片架上时，使用设置4开始搅拌1分钟。在洗涤步骤期间，从37℃的水浴中取出基因表达洗涤缓冲液2，并且倒入洗涤2皿中。在升高的温度下将玻片架转移至含有基因表达洗涤缓冲液2的玻片染色皿#3中，并且使用设置4搅拌1分钟。

从基因表达洗涤缓冲液2取出玻片架，并且将玻片架稍微倾斜，以最大程度地减少洗涤缓冲液残留。立即将玻片架转移至含有乙腈的玻片染色皿#4中，并且使用设置4搅拌30秒。

将玻片架转移至填充有稳定和干燥溶液的器皿#5中，并且使用设置4搅拌1分钟。

将玻片架缓慢取出，以最大程度地减少玻片上的液滴。应当花费5至10秒取出玻片架。废弃所用的基因表达洗涤缓冲液1和基因表达洗涤缓冲液2。

理解扫描玻片，以最大程度地减少环境氧化物对信号强度的影响。如果需要的话，将玻片储存在暗处的N₂吹扫的箱子内的橙色玻片盒内。

为了扫描微阵列玻片，打开扫描器，并且数分钟之后，打开Agilent扫描器控制系统。选择待扫描的玻片的数量(最多48个)，并且在标示对应于待扫面的狭缝的行之后，选择“浏览”并且选择输出路径或图像文件保存的位置。

为了改变任何设置，点击设置＞更改默认设置。窗口弹出，由此你可以改变设置。扫描分辨率应当设置为5μm。扫描器读取条形码，并且自动以该数码命名各文件。

当扫描器状态显示出“准备扫描”时，点击扫面，并且各阵列需要花费约7分钟进行扫描。在完成所有扫描后，会自动出现报告，其列出序列码，以及扫描状态(成功与否)。

最常见过表达的基因示于图1A中。在另一个研究中，鉴别出头100个过表达的基因，并且在这些基因中确定6个样品中有5个表达的基因，然后示于图1B中。前列腺癌样品的结果的例子示于图2中。

实施例9：生成用于表征前列腺癌的乘积值

通过下列方法确定乘积值：将由对象的血样获得miR-141值与PSA值联合，从而生成用于检测前列腺癌的乘积值。由下列文献获得25个患有转移性前列腺癌的人和25个正常人的血清PSA水平和miR-141水平的数据：Mitchell et al.，PNAS July 29，2008 Vol 105 No.30p.10513-10518。通过将miR-141拷贝数乘以PSA水平来确定乘积值(图5A)。

来自患有前列腺癌的人的miR-141的平均拷贝数/微升血清为15,648，其中+/-10,431拷贝/微升的平均值周围的置信区间为95％。来自没有前列腺癌的人的miR-141的平均拷贝数/微升血清为560，其中+/-223拷贝/微升的平均值周围的置信区间为95％(图5B)。患有前列腺癌的人与没有前列腺癌的人之间具有明显的区别。

通过使用对象的miR-141的拷贝数和PSA乘积值指示前列腺癌，乘积值提供了新型的数据分析。乘积值以100％的灵敏度和100％的特异度区分患有前列腺的人和没有前列腺癌的人。

除了本文所述的实施方式之外，本发明的各种更改方式从上述说明中对于本领域内的技术人员而言是显而易见的。也希望这些更改方式落在所附权利要求的范围内。本专利申请所引用的每一篇文献的全文均以引用方式并入本文。

Claims

1.一种表征前列腺癌的方法，包括：

(a)确定对象的生物样品中的一种或多种miRNA的表达水平，以及

(b)由所述对象的生物样品确定PCA3评分，

其中所述的PCA3评分是PCA3的表达水平与PSA的表达水平之间的比值；以及

(c)基于所述miRNA和PCA3评分中的至少亚组表征所述前列腺癌。

2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)和(b)中使用单独的生物样品。

3.权利要求1所述的方法，其中通过下列步骤表征所述的前列腺癌：当所述的miRNA水平低于约3000拷贝/微升并且所述的PCA3评分小于约35时，将所述癌症分类为良性癌。

4.权利要求1所述的方法，其中通过下列步骤表征所述的前列腺癌：当所述的miRNA水平大于约9000拷贝/微升并且所述的PCA3评分大于约35时，将所述的癌症分类为恶性癌。

5.一种表征对象内的癌症的方法，包括：

(a)确定所述对象的生物样品中的多种miRNA中的每一种的表达水平，以及

(b)基于所述的多种miRNA的每一种的所述表达水平表征所述癌症，

其中与通过检测少于所述多种miRNA中的每一种的表达水平所进行的表征相比，步骤(b)中的表征具有增加的灵敏度或特异度。

6.权利要求5所述的方法，其中所述的多种包括至少10种miRNA。

7.权利要求5所述的方法，其中所述的多种miRNA中的至少亚组选自表1。

8.权利要求5所述的方法，其中所述多种miRNA中的至少亚组选自由下列组成的组：miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222、miR-141、miR-99、miR-101、miR-130、miR-135、miR-148、miR-182、miR-186、miR-206、miR-320、miR-374、miR-433、miR-496、miR-517、miR-590、miR-620、miR-768、miR-223、miR-203、miR-199、miR-519、miR-302、miR-30、miR-20、miR-200、miR-23、miR-29、miR-181、miR-548和miR-370。

9.一种将癌症分类为良性癌的方法，包括：

(b)当在所述样品中检测出少于约3000拷贝/微升的所述miRNA中的至少亚组时，将所述癌症分类为良性癌。

10.一种将癌症分类为恶性癌的方法，包括：

(b)当在所述样品中检测出大于约9000拷贝/微升的所述miRNA中的至少亚组时，将所述癌症分类为恶性癌。

11.权利要求9或10所述的方法，还包括基于所述的分类将选择疗法或治疗方案。

12.权利要求9或10所述的方法，其中将所述分类的结果通过网络传输。

13.一种表征癌症的方法，包括：

确定所述对象的第一生物样品中的一种或多种miRNA的表达水平，

其中如果在所述样品中检测出约1000至约4500拷贝/微升的所述miRNA中的至少亚组，则获取第二生物样品。

14.权利要求13所述的方法，其中所述第一生物样品选自由异质细胞样品、痰、血液、血细胞、血清、活组织、尿、腹膜液和胸膜液所组成的组。

15.权利要求13所述的方法，其中所述第一生物样品不是活组织。

16.权利要求13所述的方法，其中所述第二生物样品是活组织。

17.权利要求13所述的方法，其中通过免疫组织化学、原位杂交(如荧光原位杂交)、PCR、实时PCR、微阵列分析或测序来分析所述第二生物样品。

18.权利要求5、9、10或13所述的方法，其中所述癌症为上皮癌。

19.权利要求18所述的方法，其中所述上皮癌为乳癌、脑癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺或卵巢癌。

20.一种表征前列腺癌的方法，包括：

(b)确定对象的生物样品中的前列腺特异性抗原(PSA)的表达水平，以及

(c)基于所述miRNA和所述PSA水平中的至少亚组表征所述前列腺癌。

21.权利要求20所述的方法，其中将单独的生物样品用于步骤(a)和(b)。

22.权利要求20所述的方法，其中所述PSA的所述表达水平为蛋白水平。

23.权利要求20所述的方法，其中通过下列步骤表征所述前列腺癌：当所述miRNA水平小于约3000拷贝/微升并且所述PSA水平小于约3ng/ml时，将所述前列腺癌分类为良性癌。

24.权利要求20所述的方法，其中通过下列步骤表征所述前列腺癌：当所述miRNA水平大于约9000拷贝/微升并且所述PSA水平大于约4ng/ml时，将所述前列腺癌分类为恶性癌。

25.权利要求20所述的方法，还包括将所述miRNA中的一种的表达水平与所述PSA水平相乘，以获得乘积值，其中将所述乘积值用于表征所述前列腺癌。

26.权利要求25所述的方法，其中所述miRNA为miR-141。

27.权利要求25所述的方法，其中所述表征的灵敏度至少为约75％。

28.权利要求25所述的方法，其中所述表征的特异度至少为约75％。

29.权利要求25所述的方法，其中通过下列步骤表征所述前列腺癌：当所述乘积值小于约1500时，将所述前列腺癌分类为良性癌。

30.权利要求23或29所述的方法，其中不从所述对象获取另外的生物样品。

31.权利要求25所述的方法，其中通过下列步骤表征所述前列腺癌：当所述乘积值大于约1500时，将所述前列腺癌分类为恶性癌。

32.权利要求24或31所述的方法，其中不从所述对象获取另外的生物样品。

33.权利要求32所述的方法，其中所述另外的生物样品为活组织。

34.权利要求32所述的方法，其中通过免疫组织化学、原位杂交(如荧光原位杂交)、PCR、实时PCR、微阵列分析或测序来分析所述另外的生物样品。

35.权利要求1、9、10、13或20所述的方法，其中所述多种miRNA中的至少亚组选自表1。

36.权利要求1、9、10、13或20所述的方法，其中所述多种miRNA中的至少亚组选自由下列组成的组：miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222、miR-141、miR-99、miR-101、miR-130、miR-135、miR-148、miR-182、miR-186、miR-206、miR-320、miR-374、miR-433、miR-496、miR-517、miR-590、miR-620、miR-768、miR-223、miR-203、miR-199、miR-519、miR-302、miR-30、miR-20、miR-200、miR-23、miR-29、miR-181、miR-548和miR-370。

37.一种表征对象内的前列腺癌的方法，包括：

(a)确定对象的生物样品中的一种或多种miRNA的表达水平，

其中所述miRNA中的至少亚组选自由下列组成的组：miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b和miR-222，以及

(b)基于步骤(a)中的所述表达水平表征所述前列腺癌。

38.权利要求37所述的方法，还包括检测miR-141。

39.权利要求37所述的方法，其中在(a)中选择所述miRNA中的至少2种。

40.权利要求37所述的方法，其中在(a)中选择所述miRNA中的至少5种。

41.权利要求1、5、9、10、13、20或37所述的方法，其中所述生物样品选自选自由异质细胞样品、痰、血液、血细胞、血清、活组织、尿、腹膜液和胸膜液所组成的组。

42.权利要求1、5、13、20或37所述的方法，其中所述表征的结果通过网络传输。

43.权利要求9或10所述的方法，其中其中所述分类的结果通过网络传输。

44.一种检测系统，其被构造为评价选自由下列组成的组中的两种或多种miRNA：miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222和miR-141。

45.权利要求44所述的检测系统，其中所述系统包含选择性地与所述的两种或多种miRNA杂交的探针组。

46.权利要求44所述的检测系统，其中所述系统包含PSA用的探针。

47.权利要求44所述的检测系统，其中所述系统包含PCA3用的探针。

48.一种试剂盒，包含选择性地与选自由下列组成的组中的两种或更多种miRNA结合的探针组：miR-629、miR-671-3p、miR-9、miR-491、miR-182、miR125a-3p、miR-324-5p、miR-148b、miR-222和miR-141。

49.权利要求48所述的试剂盒，其中所述探针中的每一个均与基材相连。

50.权利要求48所述的试剂盒，还包含PSA用的探针。

51.权利要求48所述的试剂盒，还包含PCA3用的探针。

52.权利要求48所述的试剂盒，还包含检测PSA蛋白用的试剂。