CN102047814A - 一种微通气椴木栽培樟芝的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“一种微通气椴木栽培樟芝的方法”，属于菌类栽培领域，其特征在于将液体菌种接种于水含量为50％-70％樟木段上，微透气培养，于温度25℃-28℃，湿度85％-95％，培养出子实体。本发明通过对樟木的处理，采用液体发酵扩繁得到液体菌种接种于樟木的表面，采用微透气的方式，并通过控制培养温度，湿度，光照等条件进行培养，生长周期11个月，生物转化率达到15％，其多糖含量与野生樟芝的含量相当，且椴木栽培的樟芝，无论外观、香气、苦味、药效等都与野生樟芝一致。

Description

一种微通气椴木栽培樟芝的方法

技术领域

本发明涉及一种樟芝的培养方法，特别是涉及一种樟芝的微透气椴木栽培方法，从而大量生产樟芝子实体。

背景技术

牛樟芝简称“樟芝”，学名为Antrodia Camphorata，属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科薄孔菌属，俗名牛樟菇、红樟芝、樟内菇、樟菇等，是台湾特有的真菌，仅生长于台湾特有的牛樟树(Cinnamomum kanehira)上，是牛樟树上发现的唯一一种腐木菌。樟芝一般生长在心材已腐朽的老树干的中空内壁，也有少部分生长在树干倒伏的牛樟木材阴暗潮湿的表面。不会生长在一般的樟树、白樟等类似树种上(陈体强，李开本，林章余.台湾食(药)用菌发展现状[J]福建农业科技，2000，(1)：20-21.)。牛樟树是一种常绿阔叶高大乔木，生长在海拔450-2000m的山区，主要分布在桃园复兴乡、角板山；苗栗南庄乡、三湾乡；南投竹山镇、水里乡；高雄六龟，是我国台湾省特有的保育类树种，由林务处或林管局依法保管，窃盗牛樟树者将因涉嫌违反森林保育法而移送法办。

樟芝因其疗效特殊神奇，在民间有“阴阳对口菇”之称，台湾民间称之为“森林中的红宝石”。近年来的研究不但证实樟芝完全没有副作用，且能活化细胞、改善体质、保护肝脏、增强免疫，摆脱现代人经常罹患的文明病。樟芝中含有多种生理活性成分，如多糖、三萜类化合物、超氧歧化酶(SOD)腺苷、蛋白质(含免疫蛋白)、多种维生素、微量元素(钙、磷、楮)、核酸、凝集素、氨基酸、胆固醇、木质素、血压稳定物质等。根据台北医药大学一项“人工栽培红樟芝子实体最新研究成果”显示，当人工栽培红樟芝子实体的浓度达到1500ug/mL时，癌细胞的逆转效果几乎可以达到100％的有效率[4]。樟芝被视为独特而珍贵的药用真菌，因此具有极高的研究和商业价值，也是目前台湾最昂贵的野生真菌，在港澳被称为“神芝”。

近年樟芝子实体的神奇疗效渐为人知，需求殷切，虽已分区展开复育工作，仍然缓不济急，天然樟芝价格每600克高达数十万新台币，被誉为全世界最昂贵的真菌药材。而樟芝人工栽培也成为了一个研究的热点。由于樟芝的寄生树种——樟树资源缺乏以及特殊的生长环境等因素，樟芝很难进行人工栽培。目前关于樟芝的研究大多围绕其液态发酵，而樟芝的人工栽培技术鲜有报道。目前在台湾，对于樟芝人工培育大致可以分为液体发酵法、固体培养法、椴木栽培法三种。

液体发酵法即通过樟芝液体发酵得到菌丝体，约15天可以培养完成，速度快且成本低廉，但是培养出的菌丝体与樟芝子实体药效差异很大。

固体栽培法即为太空包栽培法，大约三月培养完成，将樟芝菌块植入太空包栽培法，速度较快且不易污染。

发明名称”樟芝的培养方法”(ZL200610162766.5)涉及将樟芝接种于椴木中栽培得到子实体，该发明中提到樟芝中的有效物主要是三萜类和多糖体，但该发明的方法是采用固体培养基扩翻菌种，再在椴木上进行子实体的栽培，而且只对人工栽培的樟芝与野生樟芝中三萜类含量进行了比较，而对樟芝中同样具有药用功效且含量较高的多糖体没有涉及。

由于樟芝子实体的特效且难于培养，造成樟芝奇物可居，因此有必要丰富樟芝子实体栽培的方法，为市场提供价廉物美的樟芝。

发明内容

本发明采用的微透气椴木栽培方法，严格控制栽培条件，比如：光照、温度、湿度、通风等，成功的实现了樟芝的人工栽培，生长周期11个月，生物转化率达到15％，其多糖含量与野生樟芝的含量相当，且椴木栽培的樟芝，无论外观、香气、苦味、药效等都与野生樟芝一致。

一种微通气椴木栽培樟芝的方法，包括如下步骤：

(1)樟芝经液体发酵制得液体菌种，(2)樟木段处理：将樟木段浸泡于水中浸泡，使其水含量为50％-70％，再将其放入以海绵硅胶塞封口的容器中，灭菌，(3)接种后盖上海绵硅胶塞，(4)培养：A)于温度25℃-28℃，湿度85％-95％，避光处培养至樟木表面长满菌丝体；B)再将其置于日间温度为25℃-28℃，夜间温度18℃-20℃，日夜温差约为8℃，湿度85％-95％，CO2浓度1.0％-1.5％，微光培养出子实体，所述微光培养，日间光照强度为50-150Lux，夜间光照强度为0.001-0.02Lux。

所述步骤A培养时间为5-6个月，步骤B)培养时间为3-4个月。

所述樟木段处理还包括在樟木段的切面和/或侧面沿垂直方向打孔。

所述孔分布为梅花状，孔深5-10cm。

所述灭菌为121℃，90分钟，再自然冷却至室温。

所述容器为聚丙烯菌袋。

所述步骤(3)中的接种是将液体菌种沿樟木段的每个面流下后再将樟木置于液体菌种中。

所述湿度是通过不断补加水来控制。

所述液体菌种的制作包括如下步骤：

a)菌种活化：将冷藏保存的樟芝块接入母种培养基于28℃恒温避光斜面培养7-10天；

b)一级种子液：将a)培养得到的樟芝菌种接入有液体发酵培养基的容器中，摇床180rpm/min，28℃培养7-12天；

c)二级种子液：无污染的一级种子液接种于有液体发酵培养基的容器中，摇床180rpm/min，28℃培养7-12天即得到液体菌种，

所述母种培养基为葡萄糖2％、香蕉粉0.5％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、MgSO4 0.3％、KH2PO4 0.3％、柠檬酸0.05％、(NH4)2SO4 0.05％、琼脂2％、樟木浸液、pH4.5；所述液体发酵培养基为：葡萄糖2％、香蕉粉0.5％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、MgSO4 0.3％、KH2PO4 0.3％、柠檬酸0.05％、(NH4)2SO4 0.05％、樟木浸液、pH4.5。

所述二级种子液的培养时接种量为10％。

本发明通过对樟木的处理，采用液体发酵扩繁得到液体菌种接种于樟木的表面，采用微透气的方式，并通过控制培养温度，湿度，光照等条件进行培养，并采用微透气方式，既保证透气性又有效的防止了杂菌污染，栽培得到了樟芝子实体。

樟芝的液体发酵法已是常规的技术，且研究的最多，在本发明中，可采用常规的方法，也可采用本发明的液体发酵方案。本发明的发酵液中添加有樟木浸液，从而使得液体发酵的环境与自然生长的环境有些类似，也从而使得本发明的发酵得到的菌种菌丝其多糖含量较高。

香樟学名：Cinnamomum camphora(L.)Presl.科别：樟科，别名：木樟、乌樟、芳樟、番樟、香蕊、樟木子，本发明采用的是樟木来自于湖北孝感的芳樟，它是樟科(Lauracae)樟属(Cinnamomum Schaeffer)樟树(Cinnamomum camphora(Linn.)Presl var.linaloolif ear Fujita)中的一种类型。

在樟木段上打孔(梅花打孔法)有利于菌丝在樟木中的生长，缩短发菌时间，提高透气性。

本发明根据台湾野生樟芝的生活环境，选定樟芝人工栽培的温度、栽培方式以及对栽培原料的处理方法，利用本实验室珍藏的樟芝菌株，采用梅花打孔法以及浸泡法对主要栽培材料樟木进行处理并在樟芝菌丝体以及子实体生长期间模仿野生樟芝的生活环境进行控制和管理，比如：微光、高温加温差、高湿(多次补水法)、微通风等，成功的进行了樟芝的人工栽培，生长周期约11个月，比有关报道的人工栽培樟芝子实体的生长周期2-3年明显缩短，为樟芝子实体的药理研究奠定了基础。

附图说明

图1子实体生长初期

图2老熟后的子实体

图3菌丝生长曲线

图4胞内外粗多糖含量

图5总糖测定标准曲线

图6还原糖测定标准曲线

图7：樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠LPS刺激下腹腔巨噬细胞NO生成的影响

图8：樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠巨噬细胞吞噬中性红的作用的影响

图9樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠NK的杀伤力的影响

图10樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠ConA刺激下的脾淋巴细胞增殖的影响

图11樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠LPS刺激下腹腔巨噬细胞NO生成的影响

图12樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠巨噬细胞吞噬中性红的作用的影响

图13樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠NK的杀伤力的影响

图14樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠ConA刺激下的脾淋巴细胞增殖的影响

其中图上标注：^*P＜0.05，^**P＜0.01

具体实施方式

实施例

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供试菌株：樟芝(Antrodia Camphorata)：青岛农业大学应用真菌省级重点实验室珍藏，可对外公开发放。本实验不仅限于本菌株，同样可适用于其它菌株。

1.1.2母种培养基：葡萄糖2％、香蕉粉0.5％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、MgSO4 0.3％、KH2PO4 0.3％、柠檬酸0.05％、(NH4)2SO4 0.05％、琼脂2％、樟木浸液、pH4.5

1.1.3液体发酵培养基：葡萄糖2％、香蕉粉0.5％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、MgSO4 0.3％、KH2PO4 0.3％、柠檬酸0.05％、(NH4)2SO4 0.05％、樟木浸液、pH4.5樟木浸液的制备：取樟木碎屑500g，加入水5000mL，蒸煮直至浓缩为原体积的1/10，所得液体即为樟木浸液，用量为每100mL液体发酵培养基加入50mL樟木浸液。

1.2菌种活化

挑取冷藏保存的樟芝菌块接入母种斜面培养基中，用棉塞封口，保证良好的透气性。置于28℃恒温避光培养约7-10天，用于后续试验。

1.3制备液体菌种

一级种子液：挑取用母种培养基培养好的樟芝接入三角瓶中，摇床180rpm/min，28℃培养7天。

二级种子液：显微镜镜检及平板划线确定一级种子液无污染后用于制作二级种子液。每个250mL的三角瓶装液量为100mL，接种量为10mL。摇床180rpm/min，28℃液体发酵9天后，用于后续试验。

1.4樟芝栽培材料的预处理

野生樟芝多生长于牛樟树干腐朽的中空内部或倒伏树干的潮湿表面。根据野生樟芝的生长环境本实验采取微光、高温加温差、高湿(多次补水法)、微通风、樟木椴木栽培樟芝。

栽培原料樟木来自于湖北孝感的芳樟，它是樟科(Lauracae)樟属(Cinnamomum Schaeffer)樟树(Cinnamomum camphora(Linn.)Presl var.linaloolif ear Fujita)中的一种类型.

对樟芝栽培原料——樟木进行预处理。将樟木锯成长约20cm的木桩，并在木桩的上下切面以及侧面沿垂直方向做梅花状打孔，孔深约5-10cm。梅花打孔法有利于菌丝在樟木中的生长，缩短发菌时间，提高透气性。将打好孔的樟木在水中完全浸没浸泡2-3天，将多余水分晾干(樟木的含水量控制在50％-70％之间)，装入聚丙烯菌袋中，根据樟木木段粗细每个菌袋约装1-2根木段。用18-23mm的海绵硅胶塞封口，用绳扎紧，既保证透气性又有效的防止了杂菌污染。121℃，灭菌90min，要求灭菌锅自然降到室温后再打开，已达到充分灭菌的效果。

1.5接种、装袋

在超净工作台中将液体发酵种子液充分混匀，以保证种子液质量的一致性。待菌袋冷却后，打开菌袋，每袋接入200mL樟芝液体发酵种子液，保证种子液沿木段的每个面流下，用18-23mm的海绵硅胶塞封口，用绳扎紧，既保证透气性又有效的防止了杂菌污染。

1.6菌丝体生长期及出菇期的管理。

将接种完毕的菌袋置于温度25℃-28℃的避光处培养，菌丝体生长期约6个月，在这个过程中采用多次补水法保持高湿环境，即视季节而定中间补水5-7次，每次补无菌水200-300mL，保证樟芝生长过程中的湿度在85％-95％之间。约6个月之后，待菌丝体长满木段之后，将其置于日间温度为25℃-28℃，夜间温度18℃-20℃，日夜温差约为8℃的环境下继续培养，等待出菇，子实体生长较为缓慢，此时间长约3-4个月。出菇期间仍然要保证樟芝生长环境的湿度以及通风，CO2浓度1.0％-1.5％，采用微光培养，日间光照强度为50-150Lux，夜间光照强度为0.001-0.02Lux。

2.结果与分析

本方法栽培出的樟芝子实体紧贴着生于木材表面，木栓质至木质，质地极其坚硬、边缘平而顿，具有浓郁的樟香味、无柄、外型为板状。子实体表面菌孔较大、多且密集。子实体生长极为缓慢，子实体生长初期表面鲜艳为深红色(图1)，老熟后颜色呈黄褐色(图2)。生物转化率约为15％。

实验例多糖含量的检测

1.樟芝液体发酵过程中菌丝的生长及胞内外粗多糖含量的测定

1.1樟芝液体发酵过程中菌丝体生长曲线

二级种子液接种后每24h测定一次樟芝液体发酵液种多糖的含量及菌球干重并记录数据。以此寻找菌丝干重和多糖含量间的关系，同时确定最佳发酵时间(如图3)。

1.2樟芝发酵过程中胞外(发酵液)粗多糖的提取

将发酵液用八层纱布过滤收集上清液，90℃加热浓缩至原液的1/5，然后5000rpm离心5min，收集上清液，加入3倍体积的95％的酒精，4℃沉淀12h，有絮状沉淀析出，沉淀物分别用无水乙醉、丙酮、乙醚洗涤数次后，真空抽干，然后，放置五氧化二磷干燥器，进一步干燥，得到胞外粗多糖干品，即为胞外粗多糖。

1.3樟芝液体发酵液中胞内(菌球)粗多糖的提取

将发酵液用八层纱布过滤收集菌丝体，置于60℃烘干，取干燥的菌丝用研钵磨碎，按1g菌丝50mL水的比例，将菌丝放入90℃热水中浸提2h，过滤出浸提液，再向沉淀中加入新水再浸提2h，然后合并浸提液，90℃加热浓缩至原液的1/5，此后步骤同胞外多糖，由此可得胞内粗多糖。胞内外粗多糖含量见如图4。

如图1，随着发酵时间的延长，樟芝菌丝生物量的变化趋势，从第4d到第8d生长较快，生物量达到最大值，第8d到第10d菌丝量较稳定，第11d开始生物量下降比较明显。

结合图1和图2可以发现：胞内粗多糖的多少和菌丝体产量有着直接的关系，随着菌丝体重量的变化而变化，到8d以后随着菌丝体的减少也相应的减少，但减少的要更快一些，主要是因为菌丝的自溶，有部分的多糖溶到了发酵液中去；而胞外多糖的多少也与菌丝的产量有着密切的联系。微生物在生长时，能分泌一种酶到细胞外，可以把单糖和多糖连接起来制造葡聚糖，组成自己的细胞壁，这可能是菌丝体生长旺盛时期胞外多糖迅速增加的原因。8d以后虽然菌丝体的重量有所下降，但胞外多糖依然是增加的，主要是因为菌丝体内多糖的溶出，但这以后的增幅有限，而且不久开始下降，以此可以得出结论：樟芝菌丝产量的大小可以反映多糖产量的高低，以后的培养实验可以用菌丝产量的多少来评估多糖的产量；为获取较高的菌丝及多糖产量，樟芝的液体发酵(二级种子)培养以8-9d为宜。

2.樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中多糖含量测定

2.1樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中多糖的提取

樟芝发酵液中粗多糖及菌丝体中粗多糖的提取方法如1.2及1.3，将提取出的粗多糖烘干，加水溶解，离心取上清后用于多糖含量的测定；樟芝栽培子实体按1g子实体50mL水的比例，放入90℃热水中浸提2h，离心取上清直接用于多糖含量的测定。

2.2樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中多糖含量的测定

2.2.1蒽酮-硫酸比色法测定樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中的总糖含量

(1)原理：强酸可使糖类脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，生成物与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在620nm处有最大吸收。

(2)试剂：

①葡萄糖标准液：100μg/mL

准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，定容至1L备用。

②蒽酮：0.2g蒽酮溶于100mL浓硫酸中配制而成，现配现用

(3)葡萄糖标准曲线的制作：

取6支试管，按照表1加入试剂：

表1

加入试剂后，立即摇匀，冰水冷却，管口加盖硅胶塞，以防蒸发。准确煮沸10min取出，用流水冷却，室温放置10min，以0号管为对照，在最大吸收波长620nm比色。以标准葡萄糖含量(μg)作横坐标，以吸光值作纵坐标，做出标准曲线(见图3)。

(4)样品的测定：将提取的胞内多糖用蒸馏水溶解并定容至100mL，胞外多糖稀释为原来的10000倍，吸取1mL样品液于大试管中，以后的操作同标准曲线的制作。

2.2.2 3，5-二硝基水杨酸比色法测定樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中还原糖含量(1)原理：在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在最大吸收波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线并计算，便可求出还原糖的含量。

(2)试剂

①1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

②3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂

将6.3gDNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

(3)制作葡萄糖标准曲线：

取7支试管，按照表2加入试剂：

表2

加入试剂后，摇匀后放入沸水浴中加热5min，取出立即冷却至室温，以蒸馏水定容至25mL，混匀。在最大吸收波长540nm下比色。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以吸光值为纵坐标，做出标准曲线。(见图4)。

(4)样品的测定：将提取的胞内外多糖用蒸馏水溶解并定容至100mL，吸取2mL样品液于大试管中，以后的操作同标准曲线的制作。

2.2.3多糖的计算公式：多糖含量＝总糖含量-还原糖含量

表3

如上表3所示，测得的微透气椴木栽培的樟芝子实体多糖含量为20.4％，与所报道的野生樟芝子实体多糖含量23.8％所差不大。

3、樟芝栽培子实体多糖的抗肿瘤及免疫调节作用的研究

3.1实验材料

3.1.1实验器材

倒置显微镜、显微镜、96孔培养板、1ml灌胃器、5ml注射器、1ml注射器10ml离心管、5ml离心管、长颈吸管、剪刀、培养皿、计数器、计数板、二氧化碳培养箱(MMM集团生产的Galaxy B苏格兰)、酶标仪(型号ELx800)：高压蒸汽灭菌锅、超净工作台

3.1.2试剂

FBS(CLARK)、链霉素和青霉素双抗溶液(Hyclone)、RPMI-1640(GIBCO)、硫乙醇酸盐培养基、肝素、Griess试剂、LPS、ConA、DMSO、MTT染色液、D-hanks溶液、中性红、碳酸氢钠、台盼兰

3.1.3药物

1、环磷酰胺(Clophosphamide)，江苏恒瑞医药股份有限公司，规格200mg/支(批号07032721)。

2、樟芝栽培子实体多糖：将我实验室利用微通气椴木栽培法成功栽培的樟芝子实体晒干后粉碎至粉状，三次热水浸提后，用三倍体积95％酒精沉淀后得樟芝多糖，粗多糖的提取率为2.43％(多糖重量/子实体干重)

3.1.4细胞

YAC-1(小鼠淋巴瘤细胞)细胞株购自上海中科院细胞库，用含10％FBS(CLARK)，终浓度为100ug/ml的链霉素和青霉素双抗溶液(Hyclone)的RPMI-1640(GIBCO)培养液连续传代。

3.1.5动物与瘤株

KM小鼠，SPF级，体重22±2g，雌雄各半，购于山东省青岛市药物检疫所；瘤株为小鼠腹水型肉瘤细胞株S180及腹水型肝癌细胞株H22，购自山东省医学科学院药物研究所。

3.2实验方法

3.2.1肉瘤S180、肝癌H22小鼠移植性肿瘤模型的建立方法

参照移植性肿瘤的研究方法进行，在每只小鼠右前肢腋窝按分组分别接种S180肉瘤细胞、H22肝癌细胞悬液0.2mL，接种浓度为2×106个/mL。

3.2.2试验条件

接种后将小鼠至于室温20-23℃，通风及光照良好的环境中，小鼠自由进食、饮水，每日更换饮水瓶一次，三日更换垫料一次，颗粒饲料由山东大学新药评价中心提供。

3.2.3分组及给药方式

3.2.3.1分组：

将小鼠称重后分为S180组和H22组，每组再各分为5小组，分别为生理盐水组(NS)，环磷酰胺组(CTX)，低剂量组，中剂量组，高剂量组，每组10只。

3.2.3.2给药方式：

接种24h后按照上述分组分别进行连续口腔灌胃10d，每日9:00am给药1次，灌胃体积为20mL/kg，给药量(mg/kg·d)如下表4：

表4：180组和H22组给药量(mg/kg·d)

3.2.4免疫指标测定

3.2.4.1NO生成量的测定

(1)制备巨噬细胞：给药的最后4d，每只小鼠腹腔注射巨噬细胞诱导剂2mL(3％硫乙醇酸盐培养基)，处死小鼠，用5mL含肝素的冷D-hanks液灌洗腹腔，吸取含巨噬细胞的腹腔液，离心计数获得巨噬细胞。

(2)将获得的巨噬细胞2x106/mL100uL加到96孔培养板，1μg/mL LPS作为阳性对照，培养20h后，取50uL培养液与同体积的Griess试剂混匀，在避光室温条件下，培养5min。然后用ELISA，于540nm条件下测吸光度。

3.2.4.2巨噬细胞的吞噬作用

将获取的巨噬细胞调成5×105/mL，取100ul于96孔培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h，然后于培养板每孔中加0.1％中性红100μL，再置于培养箱中30min后，用温D-hanks液洗板，洗去细胞外的中性红，再于培养板每孔中加入细胞溶解液200μL，4℃放置过夜，酶标仪490nm处测OD值。

3.2.4.3脾脏NK细胞活性检测

(1)效应细胞制备：脱颈椎处死小鼠，无菌取其脾脏，用D-Hanks液冲洗，研磨脾脏制成单细胞悬液，经200目钢丝筛网过滤，D-Hanks液洗3次，用RPMI-1640培养液制成细胞悬液，台盼兰染色计数活细胞数在95％以上，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为2×107/mL。

(2)靶细胞的制备：连续传代培养的YAC-1淋巴瘤细胞株为靶细胞，活细胞数在95％以上、细胞浓度调为2×105个/ml。

(3)NK细胞活性测定：取96孔培养板加入效应细胞和靶细胞各100μL，效靶比100∶1，另设效应细胞和靶细胞对照，于37℃，5％CO2培养4h后，加入20μL 5g/LMTT染色液，再培养2h后加入DMSO消化液于次日测各孔570nm OD值，按公式计算NK细胞毒活性。

NK细胞活性％＝{[靶细胞对照组OD均值一(实验组OD均值一效应细胞OD均值)]/靶细胞对照组OD均值}×100％

3.2.4.4淋巴细胞增殖率测定

取96孔板培养板，每孔加入100μl浓度为5×106个/ml的脾细胞，再加ConA()10μl，对照孔加RPMI-1640培养液，于37℃、5％CO2培养72h后，加MTT染色液，再培养4h后加入DMSO消化液，酶标仪测570nm吸光值OD。

淋巴细胞增殖率(％)＝(实验孔OD值-对照孔OD值)/对照孔OD值×100％

3.2.5组织处理：

无菌取肿瘤组织、脾脏、胸腺、肝脏，去血污称重，按下式计算抑瘤率和各脏器指数，比较多糖对免疫器官的影响。(抑瘤率≥30％以上判断为有一定的抗癌作用)

抑瘤率(％)＝[阴性对照组平均瘤重-实验组平均瘤重]/对照组平均瘤重×100％

脾脏指数＝脾重/体重(mg/g)

胸腺指数＝胸腺重/体重(mg/g)

肝指数＝肝重(g)×100/体重(g)

注：免疫器官称重法是目前研究机体免疫体况的方法之一。一般认为免疫器官重量降低为免疫抑制所致，而免疫器官重量增加则为免疫增强的表现。

3.3结果与分析

3.3.1樟芝栽培子实体多糖对肉瘤S180及肝癌H22荷瘤小鼠日常活动的影响环磷酰胺组小鼠背毛疏松、易脱落，毛色灰暗无光泽，眼睛浑浊，行动迟缓；而多糖组小鼠反应敏捷，背毛光亮不易脱落。可见环磷酰胺对小鼠的生活有不良影响，而多糖组小鼠则生活很正常。

3.3.2樟芝栽培子实体多糖对S180移植性实体瘤的抑制作用

表5：樟芝栽培子实体多糖对S180移植性实体瘤的抑制作用

与生理盐水阴性对照比：^**p＜0.01

生理盐水组、环磷酰胺组及多糖组小鼠给药前后体重变化和抑瘤率比较见表5。与生理盐水阴性对照相比，环磷酰胺作为化疗药物，对S180的抑瘤效果最明显，达到70.54％，但是，它对小鼠体重的增加起着抑制作用(p＜0.01)；各剂量的樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠均有较好的抑瘤作用，且能促进小鼠生长，低剂量抑瘤率为45.73％，高剂量为50.38％，特别是中剂量的抑瘤率达到了63.56％，远远大于所报道的同剂量的樟芝菌丝体多糖对S180肉瘤的抑制率(58.8％)。可见，樟芝栽培子实体多糖对S180具有良好的抑制作用，并且呈现非剂量依赖性。

3.3.3樟芝栽培子实体多糖对S180荷瘤小鼠肝指数、脾指数及胸腺指数的影响

表6：樟芝栽培子实体多糖对S180荷瘤小鼠肝指数、脾指数及胸腺指数的影响

与生理盐水阴性对照相比：^**P＜0.01，^*P＜0.5

对于生理盐水组、环磷酰胺组及多糖组S180小鼠肝脏指数、脾脏指数及胸腺指数的比较见表6。与生理盐水阴性对照相比，环磷酰胺对小鼠脾脏免疫器官的抑制作用极为明显，说明环磷酰胺在抑制肿瘤生长的同时能降低机体的免疫能力，且肝脏指数有所下降(P＜0.5)，说明环磷酰胺能对肝脏正常运作产生不利影响；而三个剂量的樟芝栽培子实体多糖在发挥抗肿瘤作用的同时，对小鼠的脾脏指数和胸腺指数均有不同程度的提高，以高剂量的提高最为明显。由此可见，樟芝子实体多糖可提高机体的免疫力。而肝脏作为解毒器官，三个剂量的多糖对肝脏的生长均有一定的促进作用，中剂量显著性的提高肝脏指数，高剂量对肝脏指数的提高极显著性。

3.4樟芝栽培子实体多糖对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响

3.4.1樟芝栽培子实体多糖对LPS刺激下腹腔巨噬细胞NO生成的影响

以5个处理(mg/kg)为横坐标，以NO生成量为纵坐标，由图7可知，在添加LPS(终浓度为1μg/ml)刺激腹腔巨噬细胞培养20h后，不同处理与对照生理盐水组(NS)的NO释放量存在着极显著的差异性。其中樟芝栽培子实体多糖中剂量(PST 200mg/kg)组NO的释放量最高约29uM，其次是高剂量组(PST 400mg/kg)、低剂量组(PST 100mg/kg)。环磷酰胺组NO的释放量最低，并且极显著的低于生理盐水组。这说明了樟芝栽培子实体多糖能够极显著地提高小鼠巨噬细胞释放NO的能力，而环磷酰胺能够极显著地抑制小鼠巨噬细胞释放NO的能力。LPS是一种内毒素和特异性抗原，能够刺激巨噬细胞发生炎症，而NO能够消灭炎症，樟芝栽培子实体多糖能够提高巨噬细胞释放NO的能力，说明了樟芝栽培子实体多糖能够提高小鼠抗炎症的免疫能力。

3.4.2对巨噬细胞的吞噬作用

以5个处理(mg/kg)为横坐标，以OD490为纵坐标，由图8可知，中剂量、高剂量多糖作用小鼠腹腔巨噬细胞后，其吞噬中性红的作用与生理盐水组相比较得到了极显著性地提高；低剂量多糖也显著地提高了腹腔巨噬细胞对中性红的吞噬作用；环磷酰胺处理小鼠的腹腔巨噬细胞显著地抑制了其吞噬作用。由此可见樟芝栽培子实体多糖能够有效的激活吞噬细胞的吞噬作用，且高剂量组的吞噬作用最强(0.38)。

3.4.3NK细胞杀伤力的测定

以5个处理(mg/kg)为横坐标，以NK细胞活力(％)为纵坐标，从不同处理的小鼠脾脏分离的NK杀伤力的影响见图9。NK即自然杀伤细胞，能够直接杀死肿瘤细胞，对抑制肿瘤的生长、转移具有直接意义。与生理盐水组比较低、中、高三个多糖组处理的小鼠脾脏NK的杀伤力均具有极显著性的差异，其中中剂量组(PST 200)杀伤力最强达到了69.78％，依次为高剂量组、低剂量组。环磷酰胺组极显著地抑制了NK的杀伤力，与生理盐水组有明显的差异性，从46.59％降至30.29％。

3.4.4脾淋巴细胞的增殖

以5个处理(mg/kg)为横坐标，以淋巴细胞增值率(％)为纵坐标，ConA能够促进细胞的有丝分裂，樟芝栽培子实体多糖对在ConA刺激培养脾淋巴细胞的增殖作用的影响，如图10所示：中剂量、高剂量多糖组均能极显著地激活脾淋巴细胞的增殖，其中中剂量组的增殖指数最高达到了52.46％，高剂量组达到了45.09％。环磷酰胺组却极显著地抑制了脾淋巴细胞的增殖。ConA刺激的是T淋巴细胞的增殖，而T淋巴细胞介导的免疫是体内的细胞免疫。可见，樟芝栽培子实体多糖能够提高S180小鼠的细胞免疫作用。

3.5樟芝栽培子实体多糖对肝癌H22的抑制作用

表7：樟芝栽培子实体多糖对肝癌H22的抑制作用

与生理盐水阴性对照比：^**p＜0.01

生理盐水组、环磷酰胺组及多糖组肝癌H22小鼠给药前后体重变化和抑瘤率比较见表7。与生理盐水阴性对照相比，环磷酰胺作为化疗药物，对肝癌H22的抑瘤效果最明显，达到74.13％，但是，它对小鼠体重的增加起着抑制作用(p＜0.01)；各剂量的樟芝栽培子实体多糖对肝癌H22小鼠均有较好的抑瘤作用，且能促进小鼠生长，低剂量抑瘤率为40.51％，高剂量的抑瘤率61.20％，中剂量的抑瘤率达到了68.10％，呈现非剂量依赖性。

与相关文献比较，樟芝液体发酵菌粉多糖(100mg/kg/day及200mg/kg/day)对肝癌H22的抑瘤率分别为34％和52％；给予1000mg/(kg·bw)的樟芝子实体粉，对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤率达到74.24％[2]；本实验的樟芝栽培子实体多糖对肝癌H22的抑制作用具有很明显的优势。

3.6樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠肝指数、脾指数及胸腺指数的影响

表8：樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠肝指数、脾指数及胸腺指数的影响

与生理盐水阴性对照相比：^**P＜0.01，^*P＜0.5

对于多糖组、环磷酰胺组、生理盐水组肝癌H22小鼠肝脏指数、脾脏指数及胸腺指数的比较见表8。与生理盐水阴性对照相比，环磷酰胺对小鼠脾脏免疫器官的抑制作用极为明显，说明环磷酰胺在抑制肿瘤生长的同时能降低机体的免疫能力，且肝脏指数有所下降(P＜0.5)，说明环磷酰胺能对肝脏正常运作产生不利影响；而本实验中的三个剂量的樟芝栽培子实体多糖在发挥抗肿瘤作用的同时，对小鼠机体脾脏指数和胸腺指数均有不同程度的提高，与剂量相关，以高剂量对脾脏指数的提高最为明显。由此可见，樟芝栽培子实体多糖可提高机体的免疫力。而肝脏作为解毒器官，三个剂量的多糖对肝脏的生长均有一定的促进作用，中剂量显著性的提高肝脏指数，高剂量对肝脏指数的提高极显著性。

3.7樟芝栽培子实体多糖对肝癌H22荷瘤小鼠免疫功能的影响

3.7.1樟芝栽培子实体多糖对LPS刺激下腹腔巨噬细胞NO生成的影响

以5个处理(mg/kg)为横坐标，以NO生成量为纵坐标，由图11可知，在添加LPS(终浓度为1μg/mL)刺激腹腔巨噬细胞培养20h后，不同处理与对照生理盐水组(NS)的NO释放量存在着极显著的差异性。樟芝栽培子实体多糖中剂量(PST 200mg/kg)组NO的释放量最高约31uM。环磷酰胺组NO的释放量最低，并且极显著的低于生理盐水组。这说明了樟芝栽培子实体多糖能够极显著地提高小鼠巨噬细胞释放NO的能力，而环磷酰胺能够极显著地抑制小鼠巨噬细胞释放NO的能力。LPS是一种内毒素和特异性抗原，能够刺激巨噬细胞发生炎症，而NO能够消灭炎症，樟芝栽培子实体多糖能够提高巨噬细胞释放NO的能力，说明了樟芝栽培子实体多糖能够提高小鼠抗炎症的免疫能力。

3.7.2对巨噬细胞的吞噬作用

以5个处理(mg/kg)为横坐标，以OD490为纵坐标，由图12可知，中剂量、高剂量多糖作用小鼠腹腔巨噬细胞后，其吞噬中性红的作用与生理盐水组相比较得到了极显著性地提高；低剂量多糖也显著地提高了腹腔巨噬细胞对中性红的吞噬作用；环磷酰胺处理小鼠的腹腔巨噬细胞显著地抑制了其吞噬作用。由此可见樟芝栽培子实体多糖能够有效的激活吞噬细胞的吞噬作用，且高剂量组的吞噬作用最强(0.36)。

3.7.3NK细胞杀伤力的测定

如图13，以5个处理(mg/kg)为横坐标，以NK细胞活力(％)为纵坐标。与生理盐水组比较低、中、高三个多糖组处理的小鼠脾脏NK的杀伤力均具有极显著性的差异，其中中剂量组(PST 200)杀伤力最强达到了69.78％，依次为高剂量组、低剂量组。环磷酰胺组极显著地抑制了NK的杀伤力，与生理盐水组有明显的差异性。

3.7.4脾淋巴细胞的增殖

以5个处理(mg/kg)为横坐标，以淋巴细胞增值率(％)为纵坐标，樟芝栽培多糖对在ConA刺激培养脾淋巴细胞的增殖作用的影响，如图14所示：中剂量、高剂量多糖组均能极显著地激活脾淋巴细胞的增殖，其中中剂量组的增殖指数最高达到了36.41％。环磷酰胺组却极显著地抑制了脾淋巴细胞的增殖。ConA刺激的是T淋巴细胞的增殖，而T淋巴细胞介导的免疫是体内的细胞免疫。可见，樟芝栽培子实体多糖能够提高肝癌H22小鼠的细胞免疫作用。

4结论

樟芝多糖的抗肿瘤能力并非直接作用肿瘤细胞，是借由刺激巨噬细胞、T淋巴球细胞、B淋巴球细胞、自然杀手细胞，增强免疫功能进而达到抗肿瘤的功能。

本发明中的多糖能显著性的提高巨噬细胞的吞噬作用，NO释放量，激活T淋巴细胞的增殖，NK细胞的细胞毒性，这些免疫指标的提高表明提高免疫细胞的免疫作用是樟芝栽培子实体多糖对肿瘤的一个重要作用机理。Kanazawa M，Zhang H等也研究表明多糖抗癌作用是通过提高机体的免疫功能来发挥作用的。

本发明表明槐樟芝栽培子实体多糖无论那个剂量都能够增强小鼠机体的细胞免疫功能。综合以上免疫指标，中剂量组即200mg/kg·d作用最为明显，呈现出了非剂量依赖性。这一研究具有重要的意义，为樟芝栽培子实体多糖的进一步研究和应用打下了理论基础。樟芝栽培子实体的成功栽培，又丰富了樟芝资源。

Claims (10)

1.一种微通气椴木栽培樟芝的方法，包括如下步骤：

(1)樟芝经液体发酵制得液体菌种，(2)樟木段处理：将樟木段浸泡于水中浸泡，使其水含量为50％-70％，再将其放入以海绵硅胶塞封口的容器中，灭菌，(3)接种后盖上海绵硅胶塞，(4)培养：A)于温度25℃-28℃，湿度85％-95％，避光处培养至樟木表面长满菌丝体；B)再将其置于日间温度为25℃-28℃，夜间温度18℃-20℃，日夜温差约为8℃，湿度85％-95％，CO2浓度1.0％-1.5％，微光培养出子实体，所述微光培养，日间光照强度为50-150Lux，夜间光照强度为0.001-0.02Lux。

2.根据权利要求1所述的培养方法，所述步骤A)培养时间为5-6个月，步骤B)培养时间为3-4个月。

3.根据权利要求1所述的培养方法，所述樟木段处理还包括在樟木段的切面和/或侧面沿垂直方向打孔。

4.根据权利要求3所述的培养方法，所述孔分布为梅花状，孔深5-10cm。

5.根据权利要求1所述的培养方法，所述灭菌为121℃，90分钟，再自然冷却至室温。

6.根据权利要求1所述的培养方法，所述容器为聚丙烯菌袋。

7.根据权利要求1所述的培养方法，所述步骤(3)中的接种是将液体菌种沿樟木段的每个面流下后再将樟木置于液体菌种中。

8.根据权利要求1所述的培养方法，所述湿度是通过不断补加水来控制。

9.根据权利要求1所述的培养方法，所述液体菌种的制备包括如下步骤：

a)菌种活化：将冷藏保存的樟芝块接入母种培养基于28℃恒温避光斜面培养7-10天；

b)一级种子液：将a)培养得到的樟芝菌种接入有液体发酵培养基的容器中，摇床180rpm/min，28℃培养7-12天；

c)二级种子液：无污染的一级种子液接种于有液体发酵培养基的容器中，摇床180rpm/min，28℃培养7-12天即得到液体菌种，

所述母种培养基为葡萄糖2％、香蕉粉0.5％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、MgSO4 0.3％、KH2PO4 0.3％、柠檬酸0.05％、(NH4)2SO4 0.05％、琼脂2％、樟木浸液、pH4.5；所述液体发酵培养基为：葡萄糖2％、香蕉粉0.5％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、MgSO4 0.3％、KH2PO4 0.3％、柠檬酸0.05％、(NH4)2SO4 0.05％、樟木浸液、pH4.5。

10.根据权利要求9所述的培养方法，所述二级种子液的培养时接种量为10％。

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