CN102046657A - 针对血管生成素-1和血管生成素-2的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了与血管生成素1和/或血管生成素-2结合的特异性结合剂，例如全人抗体。还公开了所述抗体的重链片段、轻链片段和CDR以及制备和使用所述抗体的方法。

Description

针对血管生成素-1和血管生成素-2的抗体及其用途

相关申请的引用

本申请要求2008年12月19日提交的美国临时申请系列第61/139,361号和2008年6月16日提交的美国临时申请系列第61/061,943号以及2008年2月20日提交的美国临时申请系列第61/066,632号的权益，通过引用将它们并入本文。

发明领域

本发明涉及识别并结合血管生成素-1(Ang-1)和/或血管生成素-2(Ang-2)的特异性结合剂。更具体而言，本发明涉及特异性结合Ang-1和/或Ang-2的单克隆抗体和多克隆抗体以及它们的抗原结合片段的产生、诊断用途和治疗用途。本发明的方面还涉及表达这些抗体的杂交瘤或其他细胞系。所述抗体可用于诊断和治疗与Ang-1或Ang-2的活性和过度产生有关的疾病。

发明背景

血管发生(从现存血管形成新血管)对于许多生理和病理过程是必要的。正常情况下，血管发生由促血管形成因子和抗血管形成因子紧密调控，但在疾病(例如癌症、眼部新生血管性疾病、关节炎和银屑病)的情况下，该过程可能出错。Folkman，J.，Nat.Med.，1：27-31(1995)。

已知有许多疾病与失调的或不期望的血管发生有关。这些疾病包括但不限于：眼部新生血管形成，例如视网膜病，包括糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性；银屑病；成血管细胞瘤；血管瘤；动脉硬化；炎性疾病，例如类风湿性或风湿性炎性疾病，尤其是关节炎(包括类风湿性关节炎)；或其他慢性炎性病症，例如慢性哮喘、动脉的或移植后的动脉粥样硬化、子宫内膜组织异位以及肿瘤疾病，例如所谓的实体瘤和液体肿瘤(或造血肿瘤)(例如白血病和淋巴瘤)。与不期望的血管发生有关的其他疾病对本领域技术人员将是清楚的。

尽管调控血管发生牵涉许多信号转导系统，受到表征最充分的一个和大多数内皮细胞选择性系统包括Tie-2受体酪氨酸激酶(称为“Tie-2”或“Tie-2R”(也称为“ORK”)；鼠的Tie-2也称为“tek”)和它的配体血管生成素(Gale，N.W.和Yancopoulos，G.D.，Genes Dev.13：1055-1066[1999])。存在4种已知的血管生成素；血管生成素-1(“Ang-1”)到血管生成素-4(“Ang-4”)。这些血管生成素也被称为“Tie-2配体”。(Davis，S.，等人，Cell，87：1161-1169[1996]；Grosios，K.，等人，Cytogenet Cell Genet，84：118-120[1999]；Holash，J.，等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，42：1617-1625[1999]；Koblizek，T.I.，等人，Current Biology，8：529-532[1998]；Lin，P.，等人，Proc Natl Acad Sci USA，95：8829-8834[1998]；Maisonpierre，P.C.，等人，Science，277：55-60[1997]；Papapetropoulos，A.，等人，Lab Invest，79：213-223[1999]；Sato，T.N.，等人，Nature，375：70-74[1998]；Shyu，K.G.，等人，Circulation，98：2081-2087[1998]；Suri，C.，等人，Cell，87：1171-1180[1996]；Suri，C.，等人，Science，282：468-471[1998]；Valenzuela，D.M.，等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，96：1904-1909[1999]；Witzenbichler，B.，等人，J Biol Chem，273：18514-18521[1998])。而与Tie-2结合的Ang-1刺激培养的内皮细胞中的受体磷酸化，已观察到Ang-2既激动又拮抗Tie-2受体的磷酸化((Davis，S.，等人，[1996]，同上；Maisonpierre，P.C.，等人，[1997]，同上；Kim，I.，J.H.Kim，等人，Oncogene 19(39)：4549-4552(2000)；Teichert-Kuliszewska，K.，P.C.Maisonpierre，等人，Cardiovascular Research 49(3)：659-70(2001))。

小鼠Tie-2和Ang-1基因敲除的表型是相似的并且表明Ang-1刺激的Tie-2磷酸化通过维持内皮细胞-支持细胞粘附来介导子宫中形成的血管的重塑和稳定(Dumont，D.J.，等人，Genes & Development，8：1897-1909[1994]；Sato，T.N.，等人，Nature，376：70-74[1995]；Suri，C.，等人，[1996]，同上)。Ang-1在血管稳定中的作用被认为在成人中是保守的，在成人中它被广泛且组成型地表达(Hanahan，D.，Science，277：48-50[1997]；Zagzag，D.，等人，Experimental Neurology，159：391-400[1999])。相比之下，Ang-2的表达主要限于血管重塑的部位，它被认为在血管重塑部位阻断Ang-1功能，由此诱导有助于血管发生的血管可塑性的状态(Hanahan，D.，[1997]，同上；Holash，J.，等人，Science，284：1994-1998[1999]；Maisonpierre，P.C.，等人，[1997]，同上)。

许多公布的研究据称已证明在与血管发生有关的疾病状态中的血管选择性Ang-2的表达。这些病理状况包括例如，银屑病、黄斑变性和癌症(Bunone，G.，等人，American Journal of Pathology，155：1967-1976[1999]；Etoh，T.，等人，Cancer Research，61：2145-2153[2001]；Hangai，M.，等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，42：1617-1625[2001]；Holash，J.，等人，[1999]同上；Kuroda，K.，等人，Journal of Investigative Dermatology，116：713-720[2001]；Otani，A.，等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，40：1912-1920[1999]；Stratmann，A.，等人，American Journal of Pathology，153：1459-1466[1998]；Tanaka，S.，等人，J Clin Invest，103：34-345[1999]；Yoshida，Y.，等人，International Journal of Oncology，15：1221-1225[1999]；Yuan，K.，等人，Journal of Periodontal Research，35：165-171[2000]；Zagzag，D.，等人，[1999]同上)。这些研究大多数集中于癌症，其中许多肿瘤类型似乎展示血管Ang-2的表达。与Ang-2在病理性血管发生中的表达相反，其在正常组织中的表达极其有限(Maisonpierre，P.C.，等人，[1997]，同上；Mezquita，J.，等人，Biochemical and Biophysical Research Communications，260：492-498[1999])。在正常的成人中，三个主要的血管发生部位是卵巢、胎盘和子宫；这些是检测到Ang-2 mRNA的正常(即非癌性的)组织中的主要组织。

某些功能性研究表明Ang-2可能涉及肿瘤血管发生。Ahmad等人(Cancer Res.，61：1255-1259[2001])描述了Ang-2的过表达并且显示其据称与小鼠异种移植模型中肿瘤生长的增加有关。还参见Etoh等人，同上和Tanaka等人，同上，其中呈现数据据称将Ang-2过表达与肿瘤过度形成(hypervascularity)相关联。然而，相反，Yu等人(Am.J.Path.，158：563-570[2001])报道的数据显示Ang-2在Lewis肺癌和TA3乳腺癌细胞中的过表达据称延长了用相应转染子注射的小鼠的存活。

在过去数年，多个出版物已表明Ang-1、Ang-2和Tie-2作为抗癌治疗的可能的靶。例如，美国专利第6,166,185、5,650,490和5,814,464号各自公开了抗Tie-2配体的抗体和受体的概念。美国专利申请公开文本第2003/0124129A1号描述了某些抗Ang2抗体和它们在治疗癌症中的用途。Lin等人(Proc.Natl.Acad.Sci USA，95：8829-8834[1998])将表达可溶性Tie-2的腺病毒注射到小鼠中；据称可溶性Tie-2降低由小鼠形成的肿瘤的数目和尺寸。在一项相关研究中，Lin等人(J.Clin.Invest.，100：2072-2078[1997])将可溶形式的Tie-2注射到大鼠中；这种化合物据称减小大鼠中肿瘤的尺寸。Siemeister等人(Cancer Res.，59：3185-3189[1999])产生了表达Tie-2的胞外结构域的人黑素瘤细胞系，将这些细胞系注射到裸鼠中并且断定可溶性Tie-2据称导致肿瘤生长和肿瘤血管发生的“显著抑制”。

所以，有效的抗Ang-2治疗可能使庞大的癌症患者群体受益，因为大多数实体瘤需要新血管生成以长到直径超过1-2毫米。这种治疗可能在其他血管发生相关疾病中也具有更广泛的应用，例如视网膜病、关节炎和银屑病。

发明概述

尽管许多证据表明在不想要的血管发生(或涉及不想要的血管产生的任何亚组的病状，像动脉生成)的治疗中抑制Ang2水平的有用性，现有技术水平并没有澄清同时抑制Ang1在这类治疗中是否有益，并且没有澄清如果有益，除了Ang2抑制以外什么样的Ang1抑制程度可能证明至少提供了附加的治疗效果。因此，本发明解决了对鉴定特异性识别并结合Ang-1和Ang-2配体二者的新药剂的未认识到的需要。所述结合剂例如本发明的抗体在抑制Ang2以及Ang1上具有期望的活性水平，使其在与Ang-1和/或Ang-2活性相关的疾病的多种情况(例如诊断筛选、生物测定和治疗干预)中特别有用，所述疾病例如癌症、炎症以及其他与不期望的血管发生相关的疾病。

本发明的各实施方案涉及与Ang-1和/或Ang-2特异性结合并且其中抑制生理或病理性血管发生的靶向结合剂。这能够藉以实现的机制可包括但不限于：抑制Ang-1和/或Ang-2与Tie1和/或Tie2受体的结合、抑制Ang-1和/或Ang-2诱导的Tie1和/或Tie2信号传导、或者提高Ang-1和/或Ang-2从患者体内的清除，其中降低了Ang-1和/或Ang-2的有效浓度。

本发明的一个实施方案，特异性结合剂是与Ang-1和/或Ang-2特异性结合并且阻止Ang-1和/或Ang-2与Tie1和/或Tie2受体结合的全人抗体。本发明的另一实施方案是与Ang-1和/或Ang-2结合并且也抑制Ang-1和/或Ang-2诱导的Tie1和/或Tie2的磷酸化的全人单克隆抗体。该抗体可能以小于约100pM、30pM、20pM、10pM、5pM或1pM的Kd结合Ang-1和/或Ang-2。本发明的某些实施方案是IgG型的抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。

本发明的另一个实施方案提供了结合剂，例如包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含选自由以下组成的组的重链可变区：H2(SEQ ID NO.1)；H3(SEQ ID NO.2)；H4(SEQ ID NO.3)；H6(SEQ ID NO.4)；H10(SEQ ID NO.5)；H11(SEQ ID NO.6)；H5P(SEQ ID NO.7)；以及它们的抗原结合片段；并且所述轻链包含选自由以下组成的组的轻链可变区：L1(SEQ ID NO.8)；L2(SEQ ID NO.9)；L4(SEQ ID NO.10)；L6(SEQ ID NO.11)；L7(SEQ ID NO.12)；L8(SEQ ID NO.13)；L9(SEQ ID NO.14)；L11(SEQ ID NO.15)；L12(SEQ ID NO.16)；L13(SEQ ID NO.17)；以及它们的抗原结合片段。

本发明还提供了包含选自由以下组成的组的至少一种肽的特异性结合剂：H2(SEQ ID NO.1)；H3(SEQ ID NO.2)；H4(SEQ ID NO.3)；H6(SEQ ID NO.4)；H10(SEQ ID NO.5)；H11(SEQ ID NO.6)；H5P(SEQ ID NO.7)；L1(SEQ ID NO.8)；L2(SEQ ID NO.9)；L4(SEQ ID NO.10)；L6(SEQ ID NO.11)；L7(SEQ ID NO.12)；L8(SEQ ID NO.13)；L9(SEQ ID NO.14)；L11(SEQ ID NO.15)；L12(SEQ ID NO.16)；L13(SEQ ID NO.17)；以及它们的抗原结合片段。

应理解所述特异性结合剂可以是例如抗体，如多克隆、单克隆、嵌合、人源化或全人抗体。所述抗体还可以是单链抗体。特异性结合剂的其他实例包括肽体(peptibody)，例如肽体mL4-3、avimer、其他含有识别并结合蛋白靶(在本情况中是Ang2和或Ang1配体)的肽序列的肽分子形式(例如Fc融合分子和Ab融合分子(参见CovX-Pfizer技术))等等。

本发明的具体实施方案涉及肽体，例如结合Ang1的mL4-3。本发明的其他实施方案包括mL4-3的肽部分以及可通过向该肽或从该肽添加、缺失和/或插入氨基酸来制备的类似的结合Ang1的肽。可以对mL4-3肽体的Fc部分产生类似的添加、缺失或插入。其他针对mL4-3和肽体的改变一般是本领域公知的并且教授于例如WO00/24782和WO03/057134中，二者通过引入并入到本文描述和教授制备结合剂的章节，所述结合剂含有结合期望靶的随机产生的肽。

本发明还涉及产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤以及持续(通过任何方式，例如通过转染、转化、电穿孔)具有表达本发明的特异性结合剂(例如本文所述的抗体)所必要的核酸序列的细胞系。

还将理解本发明涉及本文所述的缀合物。所述缀合物可以是例如与其他蛋白物质(proteinatious)、糖类、脂质或者混合的部分分子缀合的本发明的特异性结合剂(例如抗体)。

本发明还涉及编码本发明的特异性结合剂(例如抗体)的核酸分子以及包含这种核酸分子的载体以及包含该载体的宿主细胞。

另外，本发明提供了制备特异性结合剂的方法，所述方法包括：(a)用至少一种编码该特异性结合剂的核酸分子转化宿主细胞；(b)在所述宿主细胞中表达该核酸分子；以及(c)分离所述特异性结合剂。本发明还提供了制备抗体的方法，所述方法包括：(a)用至少一种编码根据本发明的抗体的核酸分子转化宿主细胞；(b)在所述宿主细胞中表达该核酸分子；以及(c)分离所述特异性结合剂。

此外，本发明涉及通过施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合剂来抑制哺乳动物中不期望的血管发生的方法。此外，本发明还提供了通过施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合剂来治疗哺乳动物的癌症的方法。

本发明还涉及抑制哺乳动物中不期望的血管发生的方法，包括通过施用治疗有效量的根据本发明的抗体。本发明另外提供了治疗哺乳动物的癌症的方法，包括施用治疗有效量的根据本发明的抗体。

将理解本发明还涉及包含根据本发明的特异性结合剂和药学上可接受的配制剂的药物组合物。所述药物组合物可以包含根据本发明的抗体和药学上可接受的配制剂。

本发明提供了通过施用本发明一种或多种特异性结合剂来调节或抑制血管生成素-2活性的方法。本发明还提供了通过施用本发明的抗体来调节或抑制血管生成素-2活性的方法。

本发明还涉及调节哺乳动物中的血管通透性或血浆渗出中的至少一种的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合剂。本发明还涉及治疗哺乳动物中如下疾病的至少一种的方法：眼部新生血管性疾病、肥胖症、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化、炎性疾病、炎性病症、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、肿瘤疾病、骨相关疾病或银屑病，所述方法包括施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合剂。

本发明还提供了调节哺乳动物中的血管通透性或血浆渗出的至少一种的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据本发明的抗体。本发明还涉及治疗哺乳动物中如下疾病的至少一种的方法：眼部新生血管性疾病、肥胖症、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化、炎性疾病、炎性病症、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、肿瘤疾病、骨相关疾病或银屑病，所述方法包括施用治疗有效量的根据本发明的抗体。

此外，本发明涉及治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据本发明的特异性结合剂和化疗剂。本领域技术人员将理解所述特异性结合剂和化疗剂不必同时施用。

本发明还提供了包含以下任何一个的重链互补决定区1(CDR1)的特异性结合剂：SEQ ID NO.18；本发明还涉及包含以下任何一个的重链互补决定区2(CDR2)的特异性结合剂：SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.29；以及它们的抗原结合片段。

本发明还涉及包含以下任何一个的重链互补决定区3(CDR3)的特异性结合剂：SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.37；SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39)；以及它们的抗原结合片段。

本发明还提供了包含以下任何一个的轻链互补决定区1(CDR1)的特异性结合剂：SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.20；SEQ ID NO.21；SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.23；SEQ ID NO.24；SEQ ID NO.25；以及它们的抗原结合片段。

本发明还涉及包含以下任何一个的轻链互补决定区2(CDR2)的特异性结合剂：SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.31；以及它们的抗原结合片段。

本发明还涉及包含以下任何一个的轻链互补决定区3(CDR3)的特异性结合剂：SEQ ID NO.33；SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.40；以及它们的抗原结合片段。

本发明的其他实施方案包括编码本文所述的任意抗体的分离的核酸分子、具有编码抗Ang-1和/或抗Ang-2抗体的分离的核酸分子的载体或用任何这些核酸分子转化的宿主细胞。此外，本发明的一个实施方案是产生抗Ang-1和/或抗Ang-2抗体的方法，即通过在表达核酸分子以产生抗体的条件下培养宿主细胞，接着回收该抗体。应该认识到本发明的实施方案还包括编码本发明的抗体或抗体片段的任何核酸分子，包括在转染到用于抗体生产的宿主细胞中时为提高抗体或其片段的产量而优化的核酸序列。

本文的又一个实施方案包括通过用人的Ang-1或Ang-2或其片段及其一种或多种直系同源序列或片段免疫哺乳动物来产生针对Ang-1和/或Ang-2的高亲和力抗体的方法。

此外，本发明涉及通过如下步骤检测生物样品中的Ang-1或Ang-2水平的方法：(a)使本发明的特异性结合剂与样品接触；以及(b)确定特异性结合剂与该样品的结合程度。本发明还涉及通过如下步骤检测生物样品中的Ang-2水平的方法：(a)使本发明的抗体与该样品接触；以及(b)确定该抗体与该样品的结合程度。

本发明还涉及抑制哺乳动物中不期望的血管发生的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本发明所述的多肽或组合物。本发明还涉及调节哺乳动物中的血管发生的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文所述的多肽或组合物。本发明还涉及抑制哺乳动物中的以不期望的血管发生为特征的肿瘤生长的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文所述的多肽或组合物。另外，本发明涉及治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文所述的多肽或组合物以及化疗剂。如本文所述的特异性多肽或组合物以及化疗剂不必同时施用。在优选的实施方案中，化疗剂是5-FU、CPT-11和多西他赛中的至少一种。然而，将理解可以使用其他适合的化疗剂和其他癌症疗法。

另外，本发明涉及治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文所述的多肽或组合物以及抗VEGF剂或多激酶抑制剂(MKI)。在优选的实施方案中，抗VEGF剂或多激酶抑制剂(MKI)将选自

(贝伐单抗)、

(雷珠单抗)、

(哌加他尼)、

(舒尼替尼)、(索拉非尼)、二磷酸莫替沙尼、

(凡德他尼)、Recentin(AZD 2171)、AG-013736(阿西替尼)。然而，将理解可以使用其他适合的抗血管形成剂和其他癌症疗法。

将理解本发明的特异性结合剂被用来治疗许多与失调或不期望的血管发生有关的疾病。这些疾病包括但不限于：眼部新生血管形成，例如视网膜病(包括糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性)；银屑病；成血管细胞瘤；血管瘤；动脉硬化；炎性疾病，例如类风湿性或风湿性炎性疾病，尤其是关节炎(包括类风湿性关节炎)；或其他慢性炎性病症，例如慢性哮喘、动脉的或移植后的动脉粥样硬化、子宫内膜组织异位以及肿瘤疾病，例如所谓的实体瘤和液体肿瘤(例如白血病)。可通过施用所述特异性结合剂治疗的其他疾病将对本领域技术人员是清楚的。这些其他疾病包括但不限于：肥胖症、血管通透性、血浆渗出和骨相关的病症(包括骨质疏松症)。因此，本发明还涉及治疗这些与失调或不期望的血管发生有关疾病的方法。

本发明的其他实施方案包括含有选自由以下组成的组的至少一种肽的特异性结合剂：SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13；SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15；SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.17；以及它们的抗原结合片段。还考虑含有前面提到的多肽序列的抗体。这些抗体是多克隆、单克隆、嵌合的、人源化的或全人的抗体。它们是单链抗体以及多链抗体。还考虑产生单克隆抗体的杂交瘤以及编码所述多肽和抗体的核酸分子、含有这些核酸分子的载体以及包含并表达这些载体的宿主细胞，例如CHO细胞。制备本发明的结合剂或抗体的方法包括用编码所述结合剂或抗体的至少一种核酸分子转化宿主细胞；在所述宿主细胞中表达核酸分子；以及分离所述特异性结合剂或抗体。

本发明的诊断用途包括检测生物样品中的血管生成素-1和/或血管生成素-的水平的方法，所述方法包括使本文所述的抗体或结合剂与所述生物样品接触；以及确定所述抗体或结合剂与所述样品的结合程度。

本发明的具体治疗用途包括抑制哺乳动物中的不期望的血管发生(或涉及不想要的血管产生的任何亚组的病状，像动脉生成)的方法，所述方法包括施用治疗有效量的分离的多肽或从中制备的结合剂，例如抗体。这些不期望的血管发生(或涉及不想要的血管产生的任何亚组的病状，像动脉生成)包括哺乳动物中的癌症和炎性疾病。因此，考虑药物组合物，所述药物组合物包含与相应药物载体混合的本发明的分离的多肽、结合剂或抗体。药学上可接受的配制剂当然通常被用来制备这些药物组合物以施用给需要它们的受治疗者。

使用本发明的组合物的其他方法包括调节或抑制血管生成素-1和/或血管生成素-2活性的方法，所述方法包括向患者施用本文所述的分离的多肽、结合剂或抗体。这些调节或抑制血管生成素-1和/或血管生成素-2活性的方法包括向患者施用本文所述的多肽、结合剂或抗体。这些方法包括调节哺乳动物中的血管通透性或血浆渗出的至少一种，包括向哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的分离的多肽、结合剂或抗体。还包括治疗至少一种以下疾病的方法：眼部新生血管性疾病、肥胖症、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化、炎性疾病、炎性病症、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、肿瘤疾病、骨相关疾病或银屑病。

还考虑了组合治疗(combotherapy)方法，例如治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的分离的多肽、结合剂或抗体以及化疗剂。在这些方法中，有时分离的多肽、结合剂或抗体以及化疗剂被同时施用，而在其他时候不同时施用，这取决于具体病状、监管机构的批准和医学专家的判断。

其他类型的组合治疗包括治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括向需要它的受治疗者施用治疗有效量的本文所述的分离的多肽、结合剂或抗体以及结合VEGF受体1-3任何一种的配体的第二分子。这些结合VEGF受体1-3任何一个的配体的第二分子的实例是

和

还考虑与小分子剂一起联合使用本文所述的多肽、结合剂或抗体以治疗性施用给需要它们的受治疗者。这些小分子剂包括那些调节任何一种VEGF受体1-3的信号传导的小分子剂以及那些作为多激酶抑制剂的小分子剂。例如，考虑将

二磷酸莫替沙尼、阿西替尼、Zactima、AZD 2171、Recentin和AG-013736用在与本文所述的多肽、结合剂和抗体的组合治疗中。

本发明的某些其他实施方案涉及包含以下任何一种的CDR1的特异性结合剂：SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.20；SEQ ID NO.21；SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.23；SEQ ID NO.24；SEQ ID NO.25；包含以下任何一种的CDR2的特异性结合剂：SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.29；SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.31；以及包含以下任何一种的CDR3的特异性结合剂：SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.33；SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.37；SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39；SEQ ID NO.40。所述特异性结合剂可包含1、2、3、4、5、或6个CDR。

类似地，编码上面提到的特异性结合剂的核酸分子被考虑。还考虑了检测生物样品中的血管生成素-1和/或血管生成素-2水平的方法，所述方法包括使本文所述的特异性结合剂与所述生物样品接触；以及确定所述特异性结合剂与所述样品的结合程度。另外，还考虑了检测生物样品中的血管生成素-1和/或血管生成素-2水平的方法，所述方法包括使本文所述的任何一种抗体与所述生物样品接触；以及确定所述抗体与所述样品的结合程度。

本发明的另一个实施方案是包含重链和轻链的抗体，所述重链包含选自由以下组成的组的重链可变区：SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.6以及SEQ ID NO.7；并且轻链包含选自由以下组成的组的轻链可变区：SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13；SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15；SEQ ID NO.16以及SEQ ID NO.17；以及它们的抗原结合片段。自然地，还考虑编码上述抗体和抗原结合片段的核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含重链和轻链的分离的抗体，所述轻链包含轻链可变结构域并且所述重链包含重链可变结构域，所述重链可变结构域具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1和Ang2配体的至少一种特异性结合。

在又一个实施方案中，本发明是分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含重链可变结构域并且所述轻链包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1和Ang2配体的至少一种特异性结合。

在另外一个实施方案中，本发明涉及分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含重链可变结构域并且所述轻链包含轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域包含选自由以下组成的HC CDR组的1、2或3个重链CDR：SEQ ID NO：18、26、28、32、34、35、37、38和39，并且其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1和Ang2配体的至少一种特异性结合。

在另外一个实施方案中，本发明涉及分离的抗体，所述抗体包含轻链和重链，其中所述轻链包含轻链可变结构域并且所述重链包含重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包含选自由以下组成的LC CDR组的1、2或3个轻链CDR：SEQ ID NO：19、20、21、22、23、27、33、36、40，并且其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1和Ang2配体的至少一种特异性结合。

在又一实施方案中，本发明是分离的抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含重链可变结构域并且所述轻链包含轻链可变结构域，其中所述重链包含3个重链(HC)CDR，并且所述轻链可变结构域包含3个轻链(LC)CDR，其中抗体的所述HC和LC CDR的序列选自由以下组成的组：

(a)HC的SEQ ID NO：18、26、32加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(b)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(c)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：20、27、36；

(d)HC的SEQ ID NO：18、26、37加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(e)HC的SEQ ID NO：18、26、38加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(f)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(g)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：21、27、33；

(h)HC的SEQ ID NO：18、28、39加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(i)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：22、27、33；

(j)HC的SEQ ID NO：18、26、32加上LC的SEQ ID NO：22、27、33；

(k)HC的SEQ ID NO：18、29、39加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(l)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：23、27、33；

(m)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：20、27、40；

(n)HC的SEQ ID NO：18、26、32加上LC的SEQ ID NO：21、27、33；

(o)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：24、27、33；

(p)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：21、27、33；

(q)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：23、27、33；

(r)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：20、30、33；

(s)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：25、27、33；

(t)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：20、30、33；

(u)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：20、27、40；和

(v)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：20、31、33；

其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1配体和Ang2配体的至少一种特异性结合。

本发明还涉及具有重链和轻链的抗体，其中所述轻链具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有上述(a)到(v)的任何一种的三个LC CDR，其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1配体和Ang2配体的至少一种特异性结合。

另外，本发明还涉及具有重链和轻链的抗体，其中所述重链具有重链可变结构域，所述重链可变结构域具有上述(a)到(v)的任何一种的三个HCCDR，其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1配体和Ang2配体的至少一种特异性结合。

还考虑编码上述抗体及其抗原结合片段任一个的核酸分子。本发明的其他实施方案将从特此提供的公开内容中容易地变清楚。

附图简述

图1描绘了与用同种型对照抗体处理相比，在用本发明抗Ang1/2抗体(H4L4、H4L11或H6L7)或高效对照肽体(AMG386)或抗体536处理的荷肿瘤小鼠中肿瘤尺寸(y轴)相对于时间(x轴)的图。细节描述在实施例中。

图2描绘了与用同种型对照抗体处理相比，在用本发明抗Ang1/2抗体(H4L4、H4L11或H6L7)或高效对照肽体(AMG386)或抗体536处理的荷肿瘤小鼠中肿瘤负荷(％存活肿瘤[二等分切片]×肿瘤重量)。细节描述在实施例中。

图3描绘了本发明的H4L4、H4L11和H6L7、高效对照肽体(AMG 386)和抗体536对Colo205荷肿瘤小鼠的内皮细胞增殖的作用。细节描述在实施例中。

图4描绘了在Colo205荷肿瘤小鼠中的H4L4抗体剂量反应关系。细节描述在实施例中。

图5描绘了H4L4抗体对体内Colo205肿瘤负荷的作用。细节描述在实施例中。

图6描绘了抗体H4L4对Colo205荷肿瘤小鼠的内皮细胞增殖的作用。细节描述在实施例中。

图7描绘了全身施用的mL4-3中和小鼠肺中的Ang-1诱导的Tie2磷酸化。每天用L1-7(N)(2mg/kg)、mL4-3(20mg/kg)或Fc对照(20mg/kg)处理小鼠(每组n＝3)持续23天，之后用Ang1或BSA腹膜内攻击。随后收集小鼠的肺，并且通过免疫沉淀-蛋白质印迹分析确定磷酸化Tie2的水平。数据是平均值±SE。^*与Ang1加上Fc相比P＝0.0005，具有Fisher事后检验(Fisher’s post hoc test)的ANOVA。

图8描绘了在早期器官发生期间Ang1的药理学抑制改变了心脏发育。A)相对于在暴露于300mg/kg Fc对照(左侧图)的同期胚胎中发现的具有大、宽的小梁的较大的心脏，暴露于300mg/kg mL4-3(右侧图)的小鼠胚胎具有更小的心脏，心脏具有更少、更窄以及更宽间隔的小梁。显示了代表性图像。B)在Fc和mL4-3处理的胚胎中心脏异常的发病率。^*与Fc相比P＜0.0001，卡方检验。

图9描绘了组合的Ang1和Ang2抑制对Colo205肿瘤异种移植物的生长的作用。用Colo205细胞植入小鼠(每组n＝10)，并且当肿瘤达到大约500mm³时用Fc对照(5.2mg/kg QD)、mL4-3(3.2mg/kg QD)、L1-7(N)(2.0mg/kg QD)、与mL4-3组合的L1-7(N)(以单药剂组中使用的相同给药方案)或AMG 386(5.6mg/kg每周两次)开始处理。显示了四个代表实验之一。数据是平均值±SE。^*与L1-7(N)相比P＜0.0001，具有Schefié事后检验的RMANOVA。

图10描绘了Ang1和Ang2拮抗对肿瘤内皮细胞增殖、角膜血管生成和视网膜血管发生的作用。A)Ang1和Ang2的抑制对源自于Colo205肿瘤异种移植物的小鼠内皮细胞中的BrdU摄取的作用。用Fc(5.7mg/kgQD)、AMG 386(6mg/kg单剂量)、L1-7(N)(2.2mg/kg QD)、mL4-3(3.5mg/kg QD)或与mL4-3组合的L1-7(N)(以单药剂组中使用的相同剂量和方案)处理荷肿瘤小鼠持续3天。每个条代表平均的小鼠内皮细胞：总小鼠细胞BrdU之比(n＝3)。数据是平均值±SE。^*与Fc相比P＜0.05，不成对的Student t检验。B和C)Ang1和Ang2的抑制对(B)VEGF诱导的角膜血管生成和(C)bFGF诱导的角膜血管生成的作用。血管发生通过将VEGF-或bFGF浸泡的尼龙盘植入到大鼠的角膜基质(每组n＝8)中来诱导。使用下述物质在角膜植入之前的一天开始处理并且每3天继续：Fc(60mg/kg)、L1-7(N)(5mg/kg)、mL4-3(60mg/kg)以及与mL4-3组合的L1-7(N)(以单药剂组中使用的相同的剂量和方案)。数据是平均值±SE。

与Fc+VEGF相比P＜0.0001(B)；^#与Fc+bFGF相比P＜0.002(C)，具有Fisher事后检验的ANOVA。D)Ang2的抑制阻止小鼠视网膜中的氧诱导的新生血管形成。在出生后第8天开始，用如下物质每天皮下处理幼鼠(pups)(每组n＝5)持续九天：Fc(200mg/kg)、L1-7(N)(100mg/kg)、mL4-3(100mg/kg)或与mL4-3组合的L1-7(N)(以单药剂组中使用的相同的剂量和方案)。数据是平均值±SE。^§与Fc相比P＝0.0001，具有Fisher事后检验的ANOVA。

图11描绘了Ang1和Ang2抑制剂协作抑制卵泡的血管发生。使用HCG来诱导小鼠中的超数排卵。评估了皮下施用(每组n＝7-10只小鼠)Fc(300mg/kg)、mL4-3(150mg/kg)、L1-7(N)(150mg/kg)或mL4-3/L1-7(N)组合(各150mg/kg)阻止正在排卵的卵泡中新生血管形成的能力。从个别卵泡的抗CD31免疫染色切片计算血管面积。数据是平均值±SE。显示了两个独立的实验。比较mL4-3/L1-7(N)组合与单独的任一单药剂，^*P＝0.005；^#与Fc相比P＜0.05，具有Dunnett事后检验的ANOVA。

发明详述

在此使用章节标题仅出于组织的目的，并且不得被解释为以任何方式限制所述的主题。

标准技术可以被用于重组DNA分子、蛋白和抗体的产生以及用于组织培养和细胞转化。酶促反应和纯化的技术通常是根据制造商的说明书或者如本领域通常完成的那样使用常规程序进行，所述常规程序例如在Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY[1989])中所阐述的或者如本文所述的那些。除非提供具体定义，否则与本文所述的分析化学、有机合成化学以及医学和药物化学的实验程序和技术联合使用的命名是本领域公知的并且常用的。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物的制备、配制和递送、以及患者的治疗。

除非本文具体下定义，否则用来描述本发明的术语将具有其在本领域中所理解和使用的含义。

应该指出术语H5和H5P被互换使用并且是指在本发明的多个实施方案中所用的重链，例如名为H5L7、H5L6、H5L8、H5L4、H5L11、H5L1、H5L12和H5L9的mAb。

术语“Ang-2”是指在通过引用并入本文的美国专利第6,166,185号的图6中所阐述的多肽(“Tie-2配体-2”)或其片段以及相关多肽，所述相关多肽包括等位基因变体、剪接变体、衍生物、置换、缺失和/或插入变体、融合肽和多肽、以及种间同系物。Ang-2多肽根据其制备方式可能包括或可能不包括额外的末端残基，例如前导序列、靶向序列、氨基端甲硫氨酸、氨基端甲硫氨酸和赖氨酸残基、和/或标签或融合蛋白序列。

术语“特异性结合剂”是指以大于其他血管生成素的亲和力结合Ang-2以及Ang-1(以及本文所定义的它们的变体和衍生物)的分子，优选为蛋白质性质的分子。特异性结合剂可以是优先与Ang-2和Ang-1结合的蛋白、肽、核酸、糖类、脂质或小分子量化合物。在优选的实施方案中，根据本发明的特异性结合剂是单独的或与通过已知技术提供的其他氨基酸序列组合的抗体，例如多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化抗体、人源化抗体、人抗体、抗独特型(抗Id)抗体和能够以可溶形式或结合形式标记的抗体、以及它们的抗原结合片段、变体或衍生物。这些技术包括但不限于酶切割、化学裂解、肽合成或重组技术。本发明的抗Ang-2和Ang-1特异性结合剂能够结合Ang-2和Ang-1的调节(例如抑制或促进)Ang-2和Ang-1的生物活性和/或其他Ang-2和Ang-1相关活性的部分。

术语“多克隆抗体”是指识别并结合同一抗原上的不同表位的抗体的异质混合物。多克隆抗体可以从粗血清制备物获得或者可以使用例如抗原亲和色谱或蛋白A/蛋白G亲和色谱来纯化。

术语“单克隆抗体”是指由相同核酸分子编码的抗体的集合，其任选地由单个杂交瘤(或其克隆)或其他细胞系或者由转基因哺乳动物产生以使得每个单克隆抗体通常将识别抗原上的相同表位。术语“单克隆”不受任何用于制备抗体的特定方法限制，并且该术语也不限于在具体物种(例如小鼠、大鼠等)中产生的抗体。

术语“嵌合抗体”是指这样的抗体：其中重链和/或轻链的部分与来源于特定物种的抗体或属于特定抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而该重链和/或轻链的剩余部分与来源于另一物种的抗体或属于另一抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源。还包括表现出期望的生物活性(即特异性结合Ang-2的能力)的这些抗体的抗原结合片段。参见美国专利第4,816,567号以及Morrison等人Proc Natl Acad Sci(USA)，81：6851-6855[1985]。

术语“CDR移植抗体”是指这样的抗体：其中来自特定物种或同种型的一种抗体的CDR被重组地插入到相同物种或不同物种或同种型的另一抗体的构架中。

术语“多特异性抗体”是指具有识别一种或多种抗原上的多于一个表位的可变区的抗体。这种抗体类型的一个亚类是识别相同或不同抗原上的两个不同表位的“双特异性抗体”。

“催化”抗体是指这样的抗体：其中一个或多个细胞毒性部分或者更通常是一种或多种生物活性部分与靶向结合剂相连。

术语“人源化抗体”是指特定类型的CDR移植抗体，其中抗体构架区来源于人，但每个CDR被来源于另外物种的CDR(例如鼠的CDR)取代。术语“CDR”如下文所定义。

术语“全人”抗体是指这样的抗体：其中CDR和构架来源于一种或多种人的DNA分子。

术语“抗独特型”抗体是指与识别抗原的另一种抗体特异性结合的任何抗体。抗独特型抗体的产生可以通过本文所述的用于产生Ang-2特异性抗体的任何方法来进行，不同的是这些抗体产生于例如用Ang-2特异性抗体或其Ang-2结合片段免疫动物，而不用Ang-2多肽本身或其片段免疫动物。

本文所用的术语“变体”包括如下那些多肽：其中氨基酸残基在结合剂的天然存在(或至少已知)的氨基酸序列中被插入、缺失和/或置换。本发明的变体包括如以下所述的融合蛋白。

“衍生物”包括以不同于插入、缺失或置换变体的某种方式被化学修饰的那些结合剂。

“特异性结合”是指本发明的特异性结合剂(例如抗体或其片段)识别并结合成熟的、全长或部分长度的靶多肽(本文Ang-2和Ang-1)或其直向同源物的能力，使得其亲和力(如通过例如本文所述亲和ELISA或BIAcore测定所确定的)或其中和能力(如通过例如本文所述的中和ELISA测定或类似测定所确定的)是相同特异性结合剂对任何其他的血管生成素或其他肽或多肽的亲和力或中和能力的至少10倍，但任选至少50倍，100、250或500倍，或者甚至至少1000倍。

术语“抗原结合结构域”或“抗原结合区”是指特异性结合剂(例如抗体分子)的部分，该部分包含与抗原相互作用并赋予结合剂对抗原的特异性和亲和力的特异性结合剂的氨基酸残基(或其他部分)。在抗体中，抗原结合结构域通常被称为“互补决定区或CDR”。

术语“表位”是指任何分子的部分，其能够被特异性结合剂(例如抗体)在该结合剂的一个或多个抗原结合区识别并结合。表位通常由分子的化学活性表面组群诸如例如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如本文所用表位可以是连续的或不连续的。此外，表位可以是模拟的，因为它们包括与用于产生抗体的表位相同的三维结构，但不包括或只包括一些在用于刺激抗体免疫反应的Ang-2中发现的氨基酸残基。

术语“抑制和/或中和表位”是这样的表位：当被特异性结合剂例如抗体结合时在体内、体外或原位导致含有此表位的分子、细胞或生物体的生物活性损失(或至少是降低)的表位。在本发明的情况中，中和表位位于Ang-2的生物活性区域上或与Ang-2的生物活性区域相缔合。可选地，术语“激活表位”是这样的表位：当被本发明特异性结合剂(例如抗体)结合时导致Ang-2的生物活性构象的激活或者至少是维持的表位。

术语“抗体片段”是指包含小于完全的、完整的抗体的肽或多肽。完全的抗体包括两个功能独立的部分或片段：称为“Fab”的抗原结合片段和称为“Fc”片段的羧基端可结晶的片段。Fab片段包括来自重链和轻链的第一恒定结构域(CH1和CL1)连同结合特异性抗原的来自重链和轻链的可变区。每个重链和轻链可变区包括三个互补决定区(CDR)和分隔单个CDR的构架氨基酸残基。Fc区包括第二和第三重链恒定区(CH2和CH3)并且参与效应功能，例如补体激活和被吞噬细胞攻击。在一些抗体中，Fc和Fab区被抗体“铰链区”分隔，并且取决于全长抗体如何被蛋白酶切割，铰链区可以与Fab或Fc片段相缔合。例如，抗体被木瓜蛋白酶切割得到与产生的Fc片段相缔合的铰链区，而被胃蛋白酶切割提供了其中铰链与两个Fab片段同时缔合的片段。因为这两个Fab片段实际上在胃蛋白酶切割后共价相连，产生的片段称作F(ab’)2片段。

Fc结构域可能具有相对长的血清半衰期，而Fab的寿命短。[Capon等人，Nature，337：525-31(1989)]当表达为融合蛋白的一部分时，Fc结构域能够赋予较长的半衰期或加入如下功能，如Fc受体结合、蛋白A结合、补体固定以及或许甚至是胎盘转移到它所融合的蛋白中。Fc区可以是天然存在的Fc区或者可以被改变以改善某些特性，如治疗特性或循环时间。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的部分，通常包括重链中的氨基端约120个至130个氨基酸和轻链中的约100个至110个氨基端氨基酸。可变区通常在氨基酸序列上(甚至是在相同物种的抗体之中的)广泛不同。抗体的可变区通常决定每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的差异性集中于称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中的更高保守性的区域被称为构架区(FR)。轻链和重链的CDR内包含主要负责抗体与抗原的直接相互作用的氨基酸，然而，FR中的氨基酸能够显著影响如本文下面所讨论的抗原结合/识别。

术语“轻链”当用来提及抗体时合指基于恒定结构域的氨基酸序列的两个不同的类型，称κ(k)或λ(l)。

术语“重链”当用来提及抗体时合指基于重链恒定结构域的氨基酸序列的五个不同的类型，称α、δ、ε、γ和μ。重链和轻链的组合产生了五种已知的抗体种类：分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四种已知亚类，命名为IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

术语“天然存在的”当与生物材料例如核酸分子、多肽、宿主细胞等联合使用时是指在自然界发现并且未被人类修饰的那些物质。

术语“分离的”当与Ang-2或Ang-2的特异性结合剂联合使用时是指不含至少一种其天然环境中发现的污染多肽或化合物并且优选基本不含将干扰其治疗或诊断用途的任何其他的哺乳动物污染多肽的化合物。

术语“成熟的”当与Ang-2、抗Ang-2抗体或Ang-2的任何其他蛋白质性质的特异性结合剂联合使用时是指缺乏前导序列或信号序列的肽或多肽。当本发明的结合剂在例如原核宿主细胞中表达时，“成熟的”肽或多肽还可以包括额外的氨基酸残基(但仍缺乏前导序列)，例如氨基端甲硫氨酸或者一个或多个甲硫氨酸和赖氨酸残基。以这种方式产生的肽或多肽可以在有或没有这些已移除的额外氨基酸残基的条件下利用。

特异性结合剂和抗体

如本文所用，术语“特异性结合剂”是指具有对于识别和结合本文所述的Ang-2和Ang-1的特异性的分子。适合的特异性结合剂包括但不限于抗体及其衍生物、多肽和小分子。适合的特异性结合剂可以使用本领域已知的方法来制备。本发明的示例性Ang-2和Ang-1多肽特异性结合剂能够结合Ang-2和Ang-1多肽的某个部分并且优选地能够调节Ang-2和Ang-1多肽的活性或功能。

特异性结合Ang-2和Ang-1多肽的特异性结合剂(例如抗体和抗体片段)是在本发明的范围之内。抗体可以是多克隆的(包括单特异性多克隆的)、单克隆的(mAb)、重组的、嵌合的、人源化的(例如CDR移植的)、人的、单链的、催化的、多特异性的和/或双特异性的抗体以及它们的抗原结合片段、变体和/或衍生物。

针对Ang2和Ang1多肽的多克隆抗体一般是通过有或没有佐剂的Ang-2和/或Ang-1多肽或其片段的多次皮下或腹膜内注射在动物(例如兔、仓鼠、山羊、绵羊、马、猪、大鼠、沙鼠、豚鼠、小鼠或任何其他适合的哺乳动物以及其他非哺乳动物物种)中产生的。这些佐剂包括但不限于：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、矿物凝胶(如氢氧化铝)以及表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌是可能有用的人佐剂。将抗原多肽与在要免疫的物种中具有免疫原性的载体蛋白相缀合可能是有用的，所述载体蛋白例如钥孔血蓝蛋白、血清、白蛋白、牛甲状球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。而且，聚集剂例如白矾被用来增强免疫反应。在免疫后，对动物采血并且测定血清的抗Ang-2多肽抗体滴度，滴度可以使用“实施例”之下本文所描述的测定法来确定。多克隆抗体可以在它们被检测的血清中使用或者可以使用例如抗原亲和色谱或蛋白A或蛋白G亲和色谱从血清中纯化。

针对Ang-2多肽的单克隆抗体可以使用例如但不限于传统的“杂交瘤”方法或更新的“噬菌体展示”技术来产生。例如，本发明的单克隆抗体可以通过如下方法制备：如在Kohler等人，Nature 256：495[1975]中所述的杂交瘤方法；人B细胞杂交瘤技术[Kosbor等人，Immunol Today 4：72(1983)；Cote等人，Proc Natl Acad Sci(USA)80：2026-2030(1983)；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体生产技术和应用)，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)]以及EBV杂交瘤技术[Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R Liss Inc，New York N.Y.，第77-96页，(1985)]。本发明还提供了产生与Ang-2多肽反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

当采用杂交瘤技术时，可以使用骨髓瘤细胞系。这些适合于在产生杂交瘤的融合程序中使用的细胞系优选是非产生抗体的细胞系，其具有高融合效率和使它们不能在某些选择性培养基中生长的酶缺陷，所述选择性培养基只支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长。例如，在小鼠融合中使用的细胞系是Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；在大鼠融合中使用的细胞系是R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。在细胞融合中有用的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。产生单克隆抗体的杂交瘤和其他细胞系被认为是本发明的新颖组合物。

噬菌体展示技术也可以被用来产生来自于任何物种的单克隆抗体。优选地，使用这种技术来产生全人的单克隆抗体，其中编码单个Fab或Fv抗体片段的多核苷酸在噬菌体粒子的表面上表达。[Hoogenboom等人，J Mol Biol 227：381(1991)；Marks等人，J Mol Biol 222：581(1991)；还参见美国专利第5,885,793号)]。每个噬菌体可以使用本文所述的结合测定来“筛选”以鉴定对Ang-2具有亲和力的那些抗体片段。因此，这些过程通过在丝状噬菌体表面上展示抗体片段表达谱来模拟免疫选择并通过它们与Ang-2的结合来模拟随后的噬菌体选择。这样一种程序描述在以Adams等人为申请人提交的PCT临时申请第PCT/US98/17364号中，描述了使用这种方法分离针对MPL和msk受体的高亲和力和功能拮抗性抗体片段。在这种方法中，人抗体基因的完整的表达谱可以如之前描述的那样通过从外周血淋巴细胞中克隆出自然重排的人V基因来产生[Mullinax等人，Proc Natl Acad Sci(USA)87：8095-8099(1990)]。

一旦鉴定出编码本发明的全长单克隆抗体或者Fab或Fv片段的每条链的多核苷酸序列，可以使用宿主细胞(真核或原核的)来使用本领域公知且常规实施的重组技术表达单克隆抗体的多核苷酸。可选地，产生转基因动物，其中将编码期望的特异性结合剂的多核苷酸以如下方式引入到接收动物(例如小鼠、兔子、山羊或奶牛)的基因组中，所述方式允许编码单克隆抗体或其他特异性结合剂的多核苷酸分子的表达。一方面，可以将编码单克隆抗体或其他特异性结合剂的多核苷酸与哺乳动物特异性调节序列相连接，并且可以将嵌合的多核苷酸引入到靶动物的种系中。然后得到的转基因动物在它的乳中产生期望的抗体[Pollock等人，J Immunol Meth 231：147-157(1999)；Little等人，Immunol Today 8：364-370(2000)]。此外，可以使用植物来表达并产生Ang-2特异性结合剂，例如单克隆抗体，这是通过用编码单克隆抗体或其他特异性结合剂的多核苷酸来转染适合的植物而进行的。

在本发明的另一实施方案中，从非人物种中获得的单克隆抗体或多克隆抗体或其片段可以是“人源化的”或“嵌合化的”。用于使非人抗体人源化的方法是本领域公知的(参见美国专利第5,859,205、5,585,089和5,693,762号)。人源化是例如使用在本领域中描述的方法[Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann 等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)]，其通过用例如啮齿类的互补决定区(CDR)的至少一部分置换人抗体的对应区域来进行的。本发明还提供了如本文所讨论并且本领域中公知的这些人抗体的变体和衍生物。

本发明还涵盖结合Ang-2多肽以及它的抗原结合片段、变体和/或衍生物的全人抗体。这些抗体可以使用上述噬菌体展示技术来产生。可选地，可以使用能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的条件下产生人抗体表达谱的转基因动物(例如小鼠)来产生这些抗体。这可以通过用Ang-2抗原或其片段免疫动物来达成，其中Ang-2片段具有对Ang-2唯一的氨基酸序列。这些免疫原可以任选地与载体相缀合。参见例如，Jakobovits等人，Proc Natl Acad Sci(USA)，90：2551-2555(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno，7：33(1993)。在一种方法中，通过使其中编码免疫球蛋白重链和轻链的内源性基因座失去能力并将编码人重链和轻链蛋白的基因座插入到转基因动物的基因组中产生这些转基因动物。然后将具有少于全部的这些修饰的那些部分改变的动物杂交以获得具有所有期望的免疫系统改变的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物能够产生具有人可变区的抗体，包括对期望抗原具有免疫特异性的人的(而不是例如鼠的)氨基酸序列。参见PCR申请第PCT/US96/05928和PCT/US93/06926号。另外的方法描述在美国专利第5,545,807号、PCR申请第PCT/US91/245、PCT/GB89/01207号以及EP 546073B1和EP 546073A1中。还可以通过在宿主细胞中表达重组DNA或通过在本文所述的杂交瘤细胞中表达来产生人抗体。

以许多不同的方式实现转基因。参见例如，Bruggeman等人，Immunol Today 17：391-7(1996)。在一种方法中，构建了小基因座(minilocus)，这样使得人工地使种系构成中的基因区段彼此靠近。由于大小限制(即具有一般小于30kb)，得到的小基因座将含有限制数目的差别基因区段，但仍能产生抗体的大表达谱。只含有人DNA序列的小基因座(包括启动子和增强子)在转基因小鼠中具有完全功能。

当在转基因动物中期望更大数目的基因区段时，利用酵母人工染色体(YAC)。YAC的大小范围可以是从数百千碱基到1Mb，并且通过直接显微注射到卵中或通过将YAC转移到胚胎干(ES)细胞系中来将YAC引入到小鼠(或其他适当的动物)基因组中。一般而言，通过纯化的DNA的脂质转染或酵母原生质球融合将YAC转移到ES细胞中，其中纯化的DNA载于微胶粒中并且以类似于杂交瘤融合方案的方式进行融合。在DNA转移后选择期望的ES细胞是通过在YAC上包括本领域已知的任何选择性标记来达成。

作为另一种替代，使用在细菌大肠杆菌宿主中扩增的噬菌体P1载体。尽管这些载体通常携带比YAC小的插入DNA，但这些克隆容易以足够高的产率生长以允许直接显微注射到小鼠的卵中。使用不同的P1载体的混合物已经显示产生高水平的同源重组。

一旦使用任何本领域已知的检测循环抗体的血清水平的技术(例如ELISA)鉴定出适当的转基因小鼠(或其他适当的动物)，将该转基因动物与内源性Ig基因座已被破坏的小鼠杂交。结果提供了其中基本上所有B细胞表达人抗体的子代。

仍作为另一种替代，将整个动物的Ig基因座用人的Ig基因座取代，其中得到的动物只表达人抗体。在另一种方法中，动物基因座的部分用人基因座中的特定的且对应的区域取代。在某些情况下，从这个程序得到的动物可以表达与全人抗体相对的嵌合抗体，这取决于在小鼠Ig基因座中的取代的性质。

还可以通过将人的脾细胞(B细胞或T细胞)体外暴露于抗原，然后在无免疫应答的小鼠(例如SCID或结节/SCID)中重构暴露的细胞来产生人抗体。参见Brams等人J Immunol，160：2051-2058[1998]；Carballido等人，Nat Med，6：103-106[2000]。在一种方法中，人胎组织移植到SCID小鼠(SCID-hu)中导致长期的血细胞生成和人T细胞发育[McCune等人，Science 241：1532-1639(1988)；Ifversen等人，Sem Immunol 8：243-248(1996)]。在这些嵌合小鼠中的任何体液免疫反应完全依赖于这些动物中的T细胞的共发育[Martensson等人，Immunol 83：1271-179(1994)]。在替代的方法中，将人的外周血淋巴细胞经腹膜内(或其他方式)移植到SCID小鼠中[Mosier等人，Nature 335：256-259(1988)]。当用引发剂(priming agent)例如葡萄球菌肠毒素A(SEA)[Martensson等人，Immunol 84：224-230(1995)]或抗人CD40单克隆抗体[Murphy等人，Blood 86：1946-1953(1995)]处理移植的细胞时，检测到更高水平的B细胞产生。

可选地，完全合成的人重链表达谱是通过如下手段从未重排的V基因区段产生：通过将每个人VH区段与随机核苷酸的D区段连同人J区段组装在一起[Hoogenboom等人，J Mol Biol 227：381-388(1992)]。同样，通过将每个人V区段与J区段相组合构建轻链表达谱[Griffiths 等人，EMBO J 13：3245-3260(1994)]。编码完整抗体(即重链和轻链二者)的核苷酸连接为单链Fv片段，并且将这种多核苷酸与编码丝状噬菌体次要衣壳蛋白(minor coat protein)的核苷酸相连。当这种融合蛋白在噬菌体表面表达时，通过使用固定的抗原进行选择来鉴定编码特异性抗体的多核苷酸。

又另一种方法中，通过将一条链与噬菌体蛋白相融合并且使另一条链分泌到细菌周质中来将抗体片段组装为两个Fab片段[Hoogenboom等人，Nucl Acids Res 19：4133-4137[1991]；Barbas等人，Proc Natl Acad Sci(USA)88：7978-7982(1991)]。

嵌合的、人源化的、CDR移植的以及全人的抗体或其抗原结合片段的大规模生产通常是通过重组方法产生的。可以使用本文所述的材料和程序将编码每种抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的多核苷酸分子引入到宿主细胞中并将其表达。在优选的实施方案中，抗体是在哺乳动物宿主细胞例如CHO细胞中生产的。这些生产的细节如本文所述。

本发明的特异性结合剂例如本发明的抗体、抗体片段和抗体衍生物还可以包含本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可以是例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人的κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人的α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链的恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。

在一个实施方案中，本发明的特异性结合剂例如本发明的抗体、抗体片段和抗体衍生物包括IgG。

用于从感兴趣的抗体中获得不同亚类或同种型的抗体的技术是已知的，即亚类转换。因此，IgG抗体可以从例如IgM抗体中获得，并且反之亦然。这些技术可供制备新抗体，所述新抗体拥有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合特性但还表现出不同于亲本抗体的与抗体的同种型或亚类相关的生物特性。可以采用重组DNA技术。可以在这些程序中采用编码特定抗体多肽的克隆的DNA，例如编码期望同种型的抗体的恒定结构域的DNA。还参见Lantto等人，2002，Methods Mol.Biol.178：303-16。

本发明的特异性结合剂例如本发明的抗体、抗体片段和抗体衍生物可以包含IgG1重链恒定结构域或IgG1重链结构域的片段。本发明的抗体、抗体片段和抗体衍生物还可以包含恒定的轻链κ或λ结构域或这些结构域的片段。本文在以下提供了轻链恒定区和编码它们的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的抗体、抗体片段和抗体衍生物还包含重链恒定结构域或其片段，例如也在本文以下显示的IgG2的重链恒定区。

本文在以下提供了编码恒定重链和恒定轻链的结构域的核酸(DNA)以及重链和轻链结构域的氨基酸序列。可以将λ可变结构域与λ恒定结构域相融合，并且可以将κ可变结构域与κ恒定结构域相融合。

IgG2重链恒定结构域的DNA(SEQ ID NO：41)：

gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

IgG2重链恒定结构域的蛋白(SEQ ID NO：42)：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

κ轻链恒定结构域的DNA(SEQ ID NO：43)：

cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag

κ轻链恒定结构域的蛋白(SEQ ID NO：44)：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

λ轻链恒定结构域的DNA(SEQ ID NO：45)：

ggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatag

λ轻链恒定结构域的蛋白(SEQ ID NO：46)：

GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

本发明的特异性结合剂例如本发明的抗体、抗体片段和抗体衍生物包括这样的特异性结合剂，其包含例如具有期望同种型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE和IgD)及其Fab或F(ab’)₂片段的可变结构域组合H6L7、H5L7、H4L13、H11L7、H4L7、H10L7、H5L6、H2L7、H5L8、H6L8、H3L7、H5L4、H4L12、H6L6、H4L2、H4L6、H4L4、H5L11、H5L1、H4L11、H5L12、H5L9。此外，如果IgG4是所需的，那么可能还需要如在Bloom等人，1997，Protein Science 6：407(通过引用并入本文)中所述在铰链区中引入点突变以减轻形成H链内二硫键的趋势，所述H链内二硫键能够导致IgG4抗体中的异质性。

另外的有用的序列信息

将IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型的以下序列与本发明的抗体的可变重链序列组合使用以制备所述抗体的特定的期望的同种型：

人IgG1

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG2

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG3

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

人IgG4

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

作为IgG2的本发明的抗体的HC序列

以下序列代表作为IgG2同种型的本发明的抗体的重链序列。在实施例中提供的轻链序列保持相同。加下划线的序列部分代表IgG2序列：

H2

EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIEYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK

H3

EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK

H6

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H10

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H11

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H4

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H5

EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDIWTGYGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK

特异性结合剂的融合配偶体

在本发明的又一个实施方案中，包含Ang-2抗体的氨基酸序列可变结构域的多肽，例如具有本文所述的氨基酸序列的重链可变区或具有本文所述氨基酸序列的轻链可变区，可以在N端或C端与人IgG的Fc区的一个或多个结构域相融合。当与治疗性蛋白(例如Ang-2特异性抗体的Fab)一起构建时，Fc结构域能够提供更长的半衰期或者加入如下功能：例如Fc受体结合、蛋白A结合、补体固定以及或许甚至胎盘转移[Capon等人，Nature，337：525-531(1989)]。

在一个实例中，可以使用熟练技术人员已知的方法将抗体铰链、CH2和CH3区在特异性结合剂多肽例如抗Ang-2Fab或Fv片段(例如从噬菌体展示文库获得)的N端或C端融合。可以通过使用蛋白A或蛋白G亲和柱纯化得到的融合蛋白。已发现与Fc区融合的肽和蛋白表现出比未融合的肽和蛋白明显更大的体内半衰期。而且，与Fc区融合允许融合多肽的二聚作用/多聚作用。Fc区可以是天然存在的Fc区或者可以被改变以改善某些性质，例如治疗性质、循环时间、减少聚集问题等。本领域中已知的其他实例包括这样的实例：其中将Fc区(可以是人的或另外的物种，或者可以是合成的)与CD30L的N端融合来治疗霍奇金病、退行发育淋巴瘤和T细胞白血病(美国专利第5,480,981号)，将Fc区与TNF受体相融合来治疗脓毒性休克[Fisher等人，N Engl J Med，334：1697-1702(1996)]，并且将Fc区与Cd4受体相融合来治疗AIDS[Capon等人，Nature，337：525-31(1989)]。

催化抗体是另一融合分子类型并且包括如下抗体：该抗体所针对的一种或多种细胞毒性部分或者更通常是一种或多种生物活性部分与特异性结合剂相连。参见例如，Rader等人，Chem Eur J 12：2091-2095(2000)。这种类型的细胞毒性剂改善抗体介导的细胞毒性并且包括如下部分：例如直接或间接刺激细胞死亡的细胞因子、放射性同位素、治疗药物(包括前体药物)、细菌毒素(例如假单胞菌外毒素、白喉毒素等)、植物毒素(例如蓖麻毒蛋白、白树毒素等)、化学缀合物(例如美登素类毒素、加里刹霉素等)、放射性缀合物、酶缀合物(RNA酶缀合物、抗体指导的酶/前体药物治疗[ADEPT)])以及类似物。一方面，可以通过细胞毒性剂与抗体上的替代性抗原识别位点之一的结合将该细胞毒性剂与双特性或多特异性抗体的一个组分相“连接”。作为替代，在编码该毒素的多核苷酸与编码该结合剂的多核苷酸连接之后，可以将蛋白细胞毒素表达为具有特异性结合剂的融合蛋白。仍在另一个替代方案中，可以将特异性结合剂共价修饰以包括期望的细胞毒素。

这些融合蛋白的实例是免疫原性多肽、具有长循环半衰期的蛋白例如免疫球蛋白恒定区、标记蛋白、有利于期望的特异性结合剂多肽的纯化的蛋白或多肽、以及促进多聚蛋白的形成的多肽序列(例如在二聚体形成/稳定性中有用的亮氨酸拉链基序)。

这种类型的插入变体通常具有在N端或C端与第二多肽的全部或部分连接的天然分子的全部或大部分。例如，融合蛋白通常利用来自其他物种的前导序列以允许蛋白在异源宿主中的重组表达。另一种有用的融合蛋白包括添加免疫活性结构域(例如抗体表位)来促进该融合蛋白的纯化。在融合连接处或在融合连接处附近包含切割位点将有利于在纯化后移除外来多肽。其他有用的融合包括功能结构域的连接，例如来自酶的活化位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区。

存在可以在本发明中使用的各种可商购获得的融合蛋白表达系统。特别有用的系统包括但不限于谷胱甘肽-S转移酶(GST)系统(Pharmacia)、麦芽糖结合蛋白系统(NEB，Beverley，MA)、FLAG系统(IBI，New Haven，CT)和6xHis系统(Qiagen，Chatsworth，CA)。这些系统能够产生只含有小量额外氨基酸的重组多肽，所述额外氨基酸不可能影响重组多肽的抗原能力。例如，FLAG系统和6xHis系统都只加入短序列，已知二者具有弱抗原性并且不利地影响该多肽折叠成其天然构象。被认为有用的另一种N端融合是Met-Lys二肽在蛋白或肽的N端区域的融合。这样的融合可以产生蛋白表达或活性的有益增加。

特别有用的融合构建体可以是这样的融合构建体：其中将特异性结合剂肽与半抗原相融合来增强特异性结合剂融合构建体的免疫原性，此免疫原性例如在本发明的抗同种型抗体的生产中是有用的。增加免疫原性的这些融合构建体是本领域技术人员公知的，例如特异性结合剂与辅助抗原(例如hsp70)或肽序列(例如来自白喉毒素链或细胞因子如IL-12的肽序列)的融合体在引发免疫反应中将是有用的。在其他实施方案中，可以制备如下融合构建体：其将增强抗原结合剂组合物靶向到特定的位点或细胞。

还考虑了其他融合构建体，包括用于靶向的具有期望特性(例如延长血清半衰期的Ig恒定区)的异源性多肽或抗体或其片段。其他融合系统产生多肽杂合体，其中从期望的多肽中切去融合配偶体是令人期望的。在一个实施方案中，融合配偶体通过含有蛋白酶特异性识别序列的肽序列与重组的特异性结合剂多肽相连。适合的序列的实例是那些由烟草蚀刻病毒(Tobacco Etch Virus)蛋白酶(Life Technologies，Gaithersburg，MD)或Xa因子(Factor Xa)(New England Biolabs，Beverley，MA)所识别的序列。

本发明还提供了融合多肽，所述融合多肽包含Ang-2抗体的全部或部分可变结构域(例如具有如本文所述的氨基酸序列的重链可变区或具有如本文所述氨基酸序列的轻链可变区)与截短的组织因子(tTF)的组合，所述截短的组织因子是由充当肿瘤血管凝固剂的人凝结诱导蛋白的截短形式组成的血管靶向剂组成。tTF与抗Ang-2抗体或其片段的融合体可能有利于抗Ang-2递送至靶细胞。

特异性结合剂的变体

本发明的特异性结合剂的变体包括插入、缺失、和/或置换的变体。在本发明的一个方面，提供了插入变体，其中一个或多个氨基酸残基补充了特异性结合剂的氨基酸序列。插入可以位于蛋白的任一端或两端，或者可以安放在特异性结合剂氨基酸序列的内部区域之内。在一端或两端具有额外残基的插入变体可以包括例如融合蛋白或者包括氨基酸标签或标记的蛋白。插入变体包括特异性结合剂多肽，其中一个或多个氨基酸残基被加入到特异性结合剂的氨基酸序列或其片段。

本发明的变体产物还包括成熟的特异性结合剂产物。这些特异性结合剂产物移除了前导序列或信号序列，然而，得到的蛋白与野生型Ang-2多肽相比具有额外的氨基末端残基。额外的氨基末端残基可以从另一蛋白获得，或者可以包括不可被识别为是从特异性蛋白获得的一个或多个残基。在位置-1具有额外的甲硫氨酸残基的特异性结合剂产物(Met^-1-特异性结合剂)被认为是在位置-2和位置-1具有额外的甲硫氨酸和赖氨酸残基的特异性结合剂产物(Met^-2-Lys^-1-特异性结合剂)。具有额外的Met、Met-Lys、Lys残基(或者一般来说一种或多种碱性残基)的特异性结合剂的变体对于细菌宿主细胞中重组蛋白的产生增强特别有用。

本发明还包括具有从特异性表达系统的使用产生的额外的氨基酸残基的特异性结合剂。例如，使用表达期望的多肽作为谷胱甘肽-S转移酶(GST)融合产物的一部分的可商购获得的载体提供了期望的多肽，在GST组分从期望多肽中切割下来之后，期望的多肽在氨基酸位置-1具有额外的甘氨酸残基。还考虑了从其他载体系统中的表达产生的变体，包括如下变体：其中聚组氨酸标签被加入到一般在该序列的羧基端和/或氨基端的氨基酸序列中。

插入变体还包括如以上所述的融合蛋白，其中特异性结合剂多肽的氨基端和/或羧基端与另一多肽或其片段或一般不被识别成任何特异性蛋白序列的一部分的氨基酸序列相融合。

在另一方面，本发明提供了缺失变体，其中移除了特异性结合剂多肽中的一个或多个氨基酸残基。可以在特异性结合剂多肽的一端或两端进行缺失，或者从特异性结合剂氨基酸序列内移除一个或多个残基来进行缺失。缺失变体必要地包括特异性结合剂多肽的所有片段。

抗体片段包括那些与抗原多肽上的表位结合的抗体部分。这些片段的实例包括例如通过全长抗体的酶切割或化学裂解产生的Fab和F(ab′)₂片段。其他结合片段包括那些通过重组DNA技术产生的片段，例如含有编码抗体可变区的核酸序列的重组质粒的表达。本发明还包括Ang-2结合剂的多肽片段，其中所述片段保持特异性结合Ang-2多肽的能力。本文综合了包含本发明的肽或多肽的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个或更多连续氨基酸的片段。优选的多肽片段展示出对本发明这样的抗原结合剂独特或特异性的免疫特性。具有期望的免疫特性的本发明的片段可以通过本领域公知或常规实践的任意方法来制备。

仍在另一方面，本发明提供了本发明的特异性结合剂的置换变体。置换变体一般被认为与原始多肽“相似”或具有相对于原始多肽的某种“百分比同一性”，并且包括如下那些多肽：其中多肽的一个或多个氨基酸残基被移除或被替代残基取代。在一方面，置换在性质上是保守的，然而，本发明包括也是非保守的置换。

相关多肽的同一性和相似性可以容易地通过已知方法计算。这些方法包括但不限于在以下文献中描述的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编，Oxford University Press，New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(生物计算：信息学和基因组工程)，Smith，D.W.，编，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，部分1，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学中的序列分析)von Heinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，M.和Devereux，J.，编，M.Stockton Press，New York(1991)；以及Carillo等人，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。

设计优选的确定两条多肽的相关性或百分比同一性的方法以给出所测试的序列之间的最大匹配。在公共可获得的计算机程序中描述了确定同一性的方法。优选的确定两条序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.，12：387(1984)；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))。BLASTX程序可以从美国国立生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul等人，上述(1990))公共获得。公知的Smith Waterman算法也可以被用来确定同一性。

用于比对两条氨基酸序列的某些比对方案可能导致仅这两条序列的短区域的匹配，并且即使在这两条全长序列之间没有显著的关系，这种小的比对区域可能具有非常高的序列同一性。因此，在某些实施方案中，所选的比对方法(GAP程序)将导致跨所比较的靶多肽全长的至少10％的比对，即其中至少400个氨基酸的序列被比较的至少40个连续氨基酸，其中至少300个到约400个氨基酸的序列被比较的至少30个连续氨基酸，其中200个到约300个氨基酸的序列被比较的至少20个连续氨基酸，以及其中约100个到200个氨基酸的序列被比较的至少10个连续氨基酸。

例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，对要确定百分比序列同一性的两条多肽进行比对以优化它们的各自氨基酸的匹配(如通过算法所确定的“匹配的跨度”)。在某些实施方案中，将空位开放罚分(它通常被计算为3×平均对角线；“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定的比较矩阵指定给每个完美的氨基酸匹配的得分或数字)和空位延伸罚分(它通常是空位开放罚分的1/10)以及比较矩阵(例如PAM 250)或BLOSUM62与算法组合使用。在某些实施方案中，算法也使用标准的比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵参见Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白质序列和结构的图谱集)，5(3)(1978)；对于BLOSUM 62比较矩阵参见Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：10915-10919(1992))。

在某些实施方案中，用于多肽序列的比较的参数包括以下参数：

算法：Needleman等人，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)；

比较矩阵：来自Henikoff等人的BLOSUM 62，同上(1992)；

空位罚分：12

空位长度罚分：4

相似性的阈值：0

GAP程序可能对以上参数是有用的。在某些实施方案中，上述参数是使用GAP算法的用于多肽比较(连同末端空位无罚分)的默认参数。

在某些实施方案中，用于多核苷酸分子序列比较的参数包括以下参数：

算法：Needleman等人，同上(1970)；

比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0

空位罚分：50

空位长度罚分：3

GAP程序可能对以上参数也是有用的。上述参数是用于多核苷酸分子比较的默认参数。

可以使用其他示例性算法、空位开放罚分、空位延伸罚分、比较矩阵、相似性的阈值等，包括在Program Manual，Wisconsin Package，第9版，1997年9月中描述的那些。要做出的具体选择对本领域技术人员将是清楚的并且将取决于要做出的特定的比较，例如DNA与DNA、蛋白与蛋白、蛋白与DNA；并且另外地，取决于是否比较是在给定的序列对之间(在这种情况下GAP或BestFit一般是优选的)或在一条序列与大的序列数据库之间(在这种情况下FASTA或BLASTA是优选的)。

如本文所用，二十个常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见免疫学--A合成(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren，编，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其出于任何目的通过引用并入本文。

氨基酸可能具有L或D立体化学(除了Gly以外，它既不是L也不是D)并且本发明的多肽和组合物可能包含立体化学的组合。然而，L立体化学是优选的。本发明还提供了反向分子，其中氨基酸序列的氨基端到羧基端序列是反向的。例如，具有正常序列X₁-X₂-X₃的分子的反向是X₃-X₂-X₁。本发明还提供了逆反向分子(retro-reverse molecule)，其中如上，氨基酸序列的氨基端到羧基端序列被颠倒，并且正常为“L”对映异构体的残基被改变为“D”立体异构体形式。

二十个常规氨基酸的立体异构体(例如D氨基酸)、非天然氨基酸例如α-，α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、以及其他非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的适合的组分。非常规氨基酸的实例包括但不限于：氨基己二酸、β丙氨酸、β氨基丙酸、氨基丁酸、哌啶酸(piperidinic acid)、氨基己酸(aminocaprioic acid)、氨基庚酸、氨基异丁酸、氨基庚二酸、二氨基丁酸、锁链素、二氨基庚二酸、二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸(orithine)、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸以及其他类似的氨基酸和氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。

类似地，除非另外指明，否则单链多核苷酸序列的左手端是5′端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5′方向。新生RNA转录物的5′到3′添加方向称为转录方向；在具有与RNA相同的序列的DNA链上并且位于RNA转录物的5′端的5′位置的序列区域称为“上游序列”；在具有与RNA相同的序列的DNA链上并且位于RNA转录物的3′端的3′位置的序列区域称为“下游序列”。

保守性氨基酸置换可以包括非天然存在的氨基酸残基，它们通常是通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成加入。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其他反向或颠倒的形式.

可以基于常见的侧链特性将天然存在的残基分类：

1)疏水的：Met、Ala、Val、Leu、Ile；

2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

3)酸性的：Asp、Glu；

4)碱性的：His、Lys、Arg；

5)影响链方向的残基：Gly、Pro；以及

6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。

例如，非保守型置换可能涉及这些类别之一的成员与另一类别的成员的交换。这些置换的残基可以被引入到与非人抗体同源的人抗体的区域中或引入到该分子的非同源区域中。

在作出这些改变时，根据某些实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于疏水性和电荷特征，每个氨基酸被指定亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。

亲水氨基酸指数在赋予蛋白交互生物功能中的重要性在本领域中被理解。Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)。已知某些氨基酸可能置换具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸并且仍保留相似的生物活性。在作出基于亲水指数的改变中，在某些实施方案中，包括了亲水指数在±2之内的氨基酸的置换。在某些实施方案中，包括那些在±1之内的氨基酸置换，并且在某些实施方案中，包括那些在±0.5之内的氨基酸置换。

本领域中还理解可以基于亲水性有效地作出像氨基酸的置换，尤其是当由此产生的生物功能蛋白或肽旨在用于免疫实施方案中时，如在本情况中。在某些实施方案中，如由蛋白的相邻氨基酸的亲水性所决定的，该蛋白的最大局部平均亲水性与该蛋白的免疫原性和抗原性相关，即与蛋白的生物特性相关。

以下亲水性值指定给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。在作出基于相似的亲水性值的改变中，在某些实施方案中，包括了亲水性值在±2之内的氨基酸的置换，在某些实施方案中，包括那些在±1之内的氨基酸置换，并且在某些实施方案中，包括那些在±0.5之内的氨基酸置换。也可基于亲水性从一级氨基酸序列确定表位。这些区域也称为“表位核心区”。

示例性氨基酸置换阐述在表1中。

表1

氨基酸置换

熟练技术人员将能够使用公知技术确定如本文所阐述的多肽的适合变体。在某些实施方案中，本领域的技术人员可以鉴定所述分子的适合区域，该区域可以通过靶向被认为对活性不重要的区域来改变，而不破坏活性。在某些实施方案中，可鉴定在类似多肽中保守的分子的残基和部分。在某些实施方案中，甚至可以使可能对生物活性或对结构重要的区域经历保守氨基酸置换而不破坏生物活性或者没有不利地影响多肽结构。

另外，本领域技术人员能够查看结构-功能研究，所述研究鉴定了类似多肽中的对活性或结构重要的残基。鉴于这样一种比较，可预测在一种蛋白中与在相似蛋白中对活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择化学上相似的氨基酸置换以用于这些预测的重要的氨基酸残基。

本领域技术人员还能够分析与相似多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于这种信息，本领域技术人员可以预测抗体的氨基酸残基关于其三维结构的比对。在某些实施方案中，本领域技术人员可以选择不对预测位于蛋白表面上的氨基酸残基作出根本改变，因为这些残基可能涉及与其他分子的重要的相互作用。此外，本领域技术人员可以产生在每个期望的氨基酸残基含有单个氨基酸置换的测试变体。然后使用本领域技术人员已知的活性测定来筛选所述变体。这些变体可被用来收集关于适合的变体的信息。例如，如果人们发现对特定氨基酸残基的改变导致破坏的、不期望减少的或不适合的活性，那么可以避免具有此种改变的变体。换言之，基于从这些常规实验收集的信息，本领域技术人员能够容易地确定这样的氨基酸：其中单独或与其他突变组合的另外的置换应该被避免。

许多科学出版物已致力于二级结构的预测。参见Moult J.，Curr.Op.in Biotech.，7(4)：422-427(1996)，Chou等人，Biochemistry，13(2)：222-245(1974)；Chou等人，Biochemistry，113(2)：211-222(1974)；Chou等人，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，47：45-148(1978)；Chou等人，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276以及Chou等人，Biophys.J.，26：367-384(1979)。此外，计算机程序目前可用于帮助预测二级结构。预测二级结构的一种方法是基于同源性建模。例如，具有大于30％序列同一性或大于40％相似性的两条多肽或蛋白通常具有相似的结构拓扑。蛋白质结构数据库(PDB)最近的增长已提供增强的二级结构可预测性，包括在多肽或蛋白结构内的折叠的可能数目。参见Holm等人，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247(1999)。已建议(Brenner等人，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997))在给定多肽或蛋白中存在限制数目的折叠，并且一旦解析关键数目的结构，结构预测将明显地变得更为准确。

另外的预测二级结构的方法包括“穿引法(threading)”(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)：377-87(1997)；Sippl等人，Structure，4(1)：15-19(1996))、“序型分析(profile analysis)”(Bowie等人，Science，253：164-170(1991)；Gribskov等人，Meth.Enzym.，183：146-159(1990)；Gribskov等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)：4355-4358(1987))、以及“进化连锁(evolutionary linkage)”(参见Holm，同上(1999)以及Brenner，同上(1997))。

在某些实施方案中，抗体变体包括糖基化变体，其中糖基化位点的数目和/或类型与亲代多肽的氨基酸序列相比已经被改变。在某些实施方案中，蛋白变体包括比天然蛋白更大或更小数目的N连接的糖基化位点。N连接的糖基化位点的特征为以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸外的任何氨基酸残基。产生这种序列的氨基酸残基的置换提供了用于添加N连接的糖链的可能的新位点。可选择地，消除这种序列的置换将移除现存的N连接的糖链。还提供了N连接的糖链的重排，其中一个或多个N连接的糖基化位点(通常是天然存在的那些糖基化位点)被消除并且一个或多个新的N连接的位点被产生。另外的优选的抗体变体包括半胱氨酸变体，其中相比于亲代氨基酸序列，一个或多个半胱氨酸残基从中被缺失或者置换了另一个氨基酸(例如丝氨酸)。半胱氨酸变体在抗体必须被重折叠成生物活性构象时(例如在分离不溶性包涵体之后)可能是有用的。半胱氨酸变体一般具有比天然蛋白更少的半胱氨酸残基，并且通常具有偶数以使从未配对半胱氨酸中产生的相互作用最小化。

根据某些实施方案，氨基酸置换是如下的氨基酸置换，其：(1)减少对蛋白水解作用的易感性、(2)减少对氧化的易感性、(3)改变对形成蛋白复合物的结合亲和力、(4)改变结合亲和力、和/或(5)赋予或改变这些多肽的其他功能特性。根据某些实施方案，可以在天然存在的序列中(在某些实施方案中，是在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)作出单个或多个氨基酸置换(在某些实施方案中为保守性氨基酸置换)。在某些实施方案中，保守性氨基酸置换通常可以不明显改变亲代序列的结构特征(例如，取代氨基酸不应倾向于破坏存在于亲代序列中的螺旋或破坏表征亲代序列的其他类型的二级结构)。领域公认的多肽二级结构和三级结构的实例描述在Proteins，Structures and Molecular Principles(蛋白质、结构和分子原理)(Creighton，编，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(蛋白质结构介绍)(C.Branden和J.Tooze，编，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；以及Thornton等人Nature 354：105(1991)中。

为多肽或肽置换变体的本发明的特异性结合剂分子可以有高达约10％到12％的原始氨基酸序列被取代。对于抗体变体，重链可以有50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸被取代，而轻链可以有25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸被取代。

特异性结合剂的衍生物

本发明还提供了特异性结合剂多肽的衍生物。衍生物包括带有排除氨基酸残基的插入、缺失或置换之外的修饰的特异性结合剂多肽。优选地，修饰在性质上是共价的并且包括例如与聚合物、脂质、其他有机或无机部分的化学键合。本发明的衍生物可以被制备以提高特异性结合剂多肽的循环半衰期或者可以被设计以改善该多肽对期望的细胞、组织或器官的靶向能力。

本发明还包括被共价地修饰以包括一种或多种水溶性聚合物连接的衍生的结合剂，所述水溶性聚合物例如聚乙二醇、聚氧化亚乙基二醇或聚丙二醇，如在美国专利第4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337号中所述的。还有本领域已知的其他有用的聚合物包括单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他基于糖类的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇以及这些聚合物的混合物。特别优选的是用聚乙二醇(PEG)亚基共价修饰的特异性结合剂产物。水溶性聚合物可以在特定位置键合(例如在特异性结合剂产物的氨基端)或随机与多肽的一个或多个侧链相连。PEG用于改善特异性结合剂和具体而言的人源化抗体的治疗能力的用途描述在2000年10月17号授予Gonzales等人的美国专利6,133,426中。

抗体诱变的靶位点

可以利用某些策略来操纵Ang-1和/或Ang-2特异性抗体的固有特性，例如抗体对它的靶的亲和力。这些策略包括使用编码抗体的多核苷酸分子的位点特异性诱变或随机诱变来产生抗体变体，接着是被设计来回收表现出期望的改变(例如增加或减少的亲和力)的筛选步骤。

在诱变策略中的最常见的目标氨基酸残基是CDR中的那些氨基酸残基。如上文所述，这些区域含有实际与Ang-1和/或Ang-2相互作用的残基以及其他影响这些残基的空间排列的氨基酸。然而，在CDR区外的可变结构域的构架区中的氨基酸也已显示对抗体的抗原结合特性作出重要贡献并且能够被靶向来操纵这些特性。参见Hudson，Curr Opin Biotech，9：395-402(1999)以及其中的参考文献。

抗体变体的更小且更有效筛选的文库可以通过把随机诱变或定点诱变局限于CDR中的位点来产生，所述位点与在体细胞亲和力成熟过程中易于“超突变”的区域对应。参见Chowdhury和Pastan，Nature Biotech，17：568-572[1999]和其中的参考文献。已知以这种方式限定超突变位点的DNA元件的类型包括同向重复序列和反向重复序列、某些共有序列、二级结构以及回文序列。共有DNA序列包括四碱基序列嘌呤-G-嘧啶-A/T(即A或G-G-C或T-A或T)和丝氨酸密码子AGY(其中Y可以是C或T)。

因此，本发明的一个实施方案包括以增加抗体对其靶的亲和力为目标的诱变策略。这些策略包括整个可变重链和轻链的诱变、仅CDR区的诱变、CDR内的共有超突变位点的诱变、构架区的诱变或这些方法的任意组合(在该情况下的“诱变”可以是随机的或定点的)。CDR区的定义性描述和包含抗体的结合位点的残基的鉴定可以使用本领域技术人员已知的技术(例如X射线结晶学)通过解析正在讨论的抗体的结构以及抗体-配体复合物来完成。基于对这些抗体晶体结构的分析和表征的各种方法是本领域技术人员已知的，并且尽管不是定义性的，可以利用它们来估计CDR区。这些常用方法的实例包括Kabat、Chothia、AbM和接触定义。

Kabat定义是基于序列变异性并且是预测CDR区最常用的定义。[Johnson和Wu，Nucleic Acids Res，28：214-8(2000)]。Chothia定义是基于结构环区域的位置。[Chothia等人，J Mol Biol，196：901-17(1986)；Chothia等人，Nature，342：877-83(1989)]。AbM定义是Kabat与Chothia定义之间的折衷。AbM是由Oxford Molecular Group产生的用于抗体结构建模的整套程序[Martin等人.，Proc Natl Acad Sci(USA)86：9268-9272(1989)；Rees，等人，ABM^TM，一种用于建模抗体可变区的计算机程序，Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd.]。AbM套软件使用知识数据库与从头计算法的组合从一级测序中对抗体的四级结构建模。近来已介绍称为接触定义的另外的定义[MacCallum等人，J Mol Biol，5：732-45(1996)]。这个定义是基于对可用的复合物晶体结构的分析。

按照惯例，重链中的CDR区通常被称为H1、H2和H3，并且以氨基端到羧基端的次序依次编号。轻链中的CDR区通常被称为L1、L2和L3，并且以氨基端到羧基端的次序依次编号。

CDR-H1约为10到12个残基长度，并且根据Chothia和AbM定义通常在Cys之后的4个残基处开始，或者根据Kabat定义通常在其后5个残基处开始。H1通常后面跟着Trp，通常是Trp-Val，还有Trp-Ile或Trp-Ala。根据AbM定义，H1的长度约为10到12个残基，而Chothia定义排除最后4个残基。

根据Kabat和AbM定义，CDR-H2通常在H1结束之后的15个残基处开始。在H2前面的残基通常是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly，但存在许多变化。H2通常后面紧跟氨基酸序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/he/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。根据Kabat定义，H2的长度约为16到19个残基，其中AbM定义预测该长度通常为9到12个残基。

CDR-H3通常开始于H2结束后的33个残基，并且前面通常是氨基酸序列(通常为Cys-Ala-Arg)。H3通常后面跟着氨基酸序列Gly。H3的长度可以是3到25个残基之间的任何地方。

CDR-L1通常开始于近似第24个残基，并且通常将跟随Cys。在CDR-L1之后的残基总是Trp，并且通常将开始于序列Trp-Tyr-Gln、Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln或Trp-Tyr-Leu。CDR-L1的长度约为10到17个残基。本发明的抗体的惩罚性(punitive)CDR-L1精确地遵循这种模式，其中Cys残基后跟着15个氨基酸，然后是Trp-Tyr-Gln。

CDR-L2开始于L1结束后的约16个残基。它通常将跟随残基Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe。CDR-L2的长度约为7个残基。

CDR-L3通常开始于L2结束后的33个残基并且通常跟随Cys。L3通常后面跟着氨基酸序列Phe-Gly-XXX-Gly。L3的长度约为7到11个残基。

本领域中已描述了用于改变抗体的各种方法。例如，美国专利5,530,101(1996年6月25日授予Queen等人)描述了产生人源化抗体的方法，其中人源化免疫球蛋白重链可变区构架的序列与供体免疫球蛋白重链可变区构架的序列至少65％到95％相同。每条人源化免疫球蛋白链除了CDR外通常将包含来自供体免疫球蛋白构架的氨基酸，所述氨基酸例如能够与CDR相互作用来影响结合亲和力，例如紧靠着供体免疫球蛋白中的CDR的一个或多个氨基酸或者如通过分子建模所预测的约3埃之内的氨基酸。可以通过使用各种位置标准中的任一个或全部来各自设计重链和轻链。当结合成为完整的抗体时，本发明的人源化免疫球蛋白在人体内将基本上无免疫原性，并且保留了与供体免疫球蛋白基本相同的对抗原(例如含有表位的蛋白或其他化合物)的亲和力。还参见在以下文献中的相关方法：1997年12月2日授予Queen等人的美国专利5,693,761(“Polynucleotides encoding improved humanized immunoglobulins(编码改善的人源化免疫球蛋白的多核苷酸)”)；1997年12月2日授予Queen等人的美国专利5,693,762(“Humanized Immunoglobulins(人源化的免疫球蛋白)”)；1996年12月17日授予Queen等人的美国专利5,585,089(“Humanized Immunoglobulins(人源化的免疫球蛋白)”)。

在一个实例中，1996年10月15日授予Hoogenboom等人的美国专利5,565,332(“嵌合抗体的产生-组合方法”)描述了用于产生具有与亲代抗体相似的结合特异性但具有提高的人的特征的抗体和抗体片段的方法。人源化抗体是通过链改组使用例如噬菌体展示技术获得的，并且将包含对感兴趣的抗原具有特异性的非人抗体的重链或轻链可变结构域的多肽与人互补链(轻链或重链)的可变结构域谱(repertoire)相组合。鉴定了对感兴趣的抗原具有特异性的杂交配对，并且将来自所选配对的人链与人互补可变结构域(重链或轻链)谱相组合。在另一个实施方案中，将来自非人抗体的CDR的组分与来自人抗体的CDR的组成部分谱相组合。从得到的抗体多肽二聚物的文库中选出杂合体并将其用在第二人源化的改组步骤中。可选地，如果该杂合体已经具有足够的人类的治疗价值的特性，那么除去这个第二步骤。也描述了提高人类特性的修饰方法。还参见Winter，FEBS Letts 430：92-92(1998)。

作为另一个实例，2000年4月25日授予Carter等人的美国专利6,054,297描述了用于制备人源化抗体的方法，该方法是通过用CDR氨基酸序列取代对应的人CDR氨基酸序列和/或用FR氨基酸序列取代对应的人FR氨基酸序列进行的。

作为另一个实例，1998年6月16日授予Studnicka等人的美国专利5,766,886(“修饰的抗体可变结构域”)描述了用于鉴定抗体可变结构域(所述抗体可变结构域可以被修饰而不减少抗原结合结构域的天然亲和力同时降低其对于异源物种的免疫原性)的氨基酸残基的方法和用于制备这些修饰的抗体可变结构域(所述修饰的抗体可变结构域对于施用给异源物种来说是有用的)的方法。还参见1999年2月9日授予Studnicka的美国专利5,869,619。

如所讨论的，通过本领域任何已知的方法修饰抗体通常被设计以实现对抗原的提高的结合亲和力和/或在受体中减少抗体的免疫原性。在一种方法中，可以修饰人源化抗体来消除糖基化位点以便提高抗体对其同种抗原的亲和力[Co等人，Mol Immunol 30：1361-1367(1993)]。诸如“重构”、“超嵌合(hyperchimerization)”以及“饰面/表面重建(veneering/resurfacing)”这类技术已产生具有更大治疗潜力的人源化抗体[Vaswami等人，Annals of Allergy，Asthma，& Immunol 81：105(1998)；Roguska等人.，Prot Engineer 9：895-904(1996)]。还参见2000年6月6日授予Hardman等人的美国专利6,072,035，该专利描述了用于重构抗体的方法。尽管这些技术通过降低外源残基的数目减少了抗体免疫原性，但是它们没有阻止重复施用抗体之后产生的抗独特型反应和抗异型反应。用于减少免疫原性的这些方法的替代方法描述在Gilliland等人，J Immunol 62(6)：3663-71(1999)中。

在许多情况下，人源化抗体导致抗原结合能力的损失。因此更可取的是将人源化抗体“回复突变”成包括在原始的(最经常是啮齿动物)抗体中发现的一个或多个氨基酸残基以试图恢复抗体的结合亲和力。参见例如，Saldanha等人，Mol Immunol 36：709-19(1999)。

非肽特异性结合剂类似物/蛋白模拟物

此外，提供稳定结构或减少的生物降解的肽的非肽特异性结合剂类似物也被考虑。特异性结合剂肽模拟类似物可以基于选择的抑制性肽通过一个或多个残基被非肽部分取代来制备。优选地，非肽部分允许该肽保留其自然构象或者使优选的例如生物活性构象稳定，所述构象保留了识别并结合Ang-1和/或Ang-2的能力。一方面，得到的类似物/模拟物表现出提高的对Ang-1和/或Ang-2的结合亲和力。用于从特异性结合剂肽制备非肽模拟类似物的方法的一个实例描述在Nachman等人，Regul Pept 57：359-370(1995)中。如果期望，本发明的特异性结合剂肽可以例如通过糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化或者通过产生本发明的肽的酸加成盐、酰胺、酯(特别是C端酯)以及N-乙酰基衍生物来修饰。还可以通过与其他部分形成共价或非共价复合物对特异性结合剂肽进行修饰以产生肽衍生物。共价结合的复合物可以通过将化学部分与包含特异性结合剂肽的氨基酸侧链上的功能基团或者在N端或C端的功能基团相连接来制备。

具体而言，预料可以将特异性结合剂肽缀合至报道基团，所述报道基团包括但不限于：放射性标记、荧光标记、酶(例如催化比色或荧光反应的酶)、底物、固体基质或载体(例如生物素或抗生物素蛋白)。本发明因此提供了包含抗体分子的分子，其中所述分子优选地还包含选自由以下组成的组的报道基团：放射性标记、荧光标记、酶、底物、固体基质和载体。这些标记是本领域技术人员公知的，例如特别考虑生物素标记。这些标记的使用是本领域技术人员公知的并且被描述在例如美国专利第3,817,837号；美国专利第3,850,752号；美国专利第3,996,345号以及美国专利第4,277,437号中。有用的其他标记包括但不限于放射性标记、荧光标记和化学发光标记。涉及这些标记的使用的美国专利包括例如美国专利第3,817,837号；美国专利第3,850,752号；美国专利第3,939,350号以及美国专利第3,996,345号。本发明的任何肽可以包括这些标记的任何一个、两个或更多个。

制备特异性结合剂的方法

作为为蛋白的本发明的特异性结合剂可以根据常规技术通过在溶液中或固体支持体上的化学合成来制备。目前固相合成的局限性是约85-100个氨基酸的长度。然而，化学合成技术往往可以用来以化学手段连接一系列小肽来产生全长多肽。各种自动的合成器是商购的并且可以根据已知方案使用。参见例如，Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，第2版，Pierce Chemical Co.，(1984)；Tam等人，J Am Chem Soc，105：6442，(1983)；Merrifield，Science，232：341-347，(1986)；以及Barany和Merrifield，The Peptides(肽)，Gross和Meienhofer，编，Academic Press，New York，1-284；Barany等人，Int.J.Peptide Protein Res.，30，705-739(1987)；以及美国专利第5,424,398号)，每一篇均通过引用并入本文。

固相肽合成方法使用含有0.1-1.0mM胺/g聚合物的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)。用于肽合成的这些方法使用α氨基的叔丁氧羰基(t-BOC)或9-芴甲氧羰基(FMOC)保护。两种方法均包括逐步合成，从而在每一步从肽的C端开始添加单个氨基酸(参见Coligan等人.，Current Protocols in Immunology(免疫学中的新方案)，Wiley Interscience，1991，9单元)。在完成化学合成后，可以将合成的肽脱保护以移除t-BOC或FMOC氨基酸保护基团，并且通过用酸在降低的温度进行处理(例如在0℃液体HF-10％茴香醚处理约0.25小时到1小时)从聚合物中裂解。在试剂蒸发后，用1％乙酸溶液从聚合物中提取特异性结合剂肽，随后冻干以产生粗材料。这通常可通过诸如凝胶过滤这类技术在Sephadex G-15上使用5％乙酸作为溶剂来纯化。柱的适当级分的冻干将产生均质的特异性结合剂肽或肽衍生物，然后可以通过诸如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱、紫外吸收光谱、摩尔旋光、溶解性这些标准技术来表征并且通过固相埃德曼(Edman)降解来定量。

抗Ang-1和/或抗Ang-2抗体、其衍生物、变体及片段以及其他基于蛋白的Ang-2结合剂的化学合成允许向所述结合剂中加入非天然存在的氨基酸。

重组DNA技术是用于制备本发明的全长抗体和其他大的蛋白质性质的特异性结合剂或其片段的方便的方法。可以将编码所述抗体或片段的cDNA分子插入到表达载体中，进而可以将该载体插入到宿主细胞中用于产生抗体或片段。应理解，可以修饰编码这些抗体的cDNA以便从“原始的”cDNA(从mRNA翻译)改变来提供密码子简并性或允许不同宿主细胞中的密码子偏爱使用。

一般而言，可以使用本文在实施例中描述的程序获得编码抗体的DNA分子。在期望获得与原始抗体分子相关的Fab分子或CDR时，可以使用标准技术筛选适合的文库(噬菌体展示文库；淋巴细胞文库等)来鉴定和克隆相关的Fab/CDR。用于这种筛选的探针可以是编码原始抗体的Fab部分的全长或截短的Fab探针、针对来自原始抗体的Fab部分的一个或多个CDR的探针或其他适合的探针。当使用DNA片段作为探针时，典型的杂交条件是那些例如在Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的新方案)，Current Protocols Press[1994])中阐述的条件。在杂交之后，能够以适合的严格条件洗涤探针标记的印迹，这取决于诸如探针大小、探针与克隆预期的同源性、所筛选的文库的类型以及所筛选的克隆的数目这些因素。高严格条件筛选的实例是在50-65℃的温度，0.1XSSC以及0.1％的SDS。

可以利用各种表达载体/宿主系统来包含和表达编码本发明的特异性结合剂多肽的多核苷酸分子。这些系统包括但不限于：微生物，例如用重组的噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti质粒或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。

在重组的特异性结合剂蛋白的产生中有用的哺乳动物细胞包括但不限于：VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞以及本文所述的杂交瘤细胞系。哺乳动物细胞对于制备通常是糖基化的并且为了活性需要正确的重折叠的那些特异性结合剂(例如抗体和抗体片段)来说是优选的。优选的哺乳动物细胞包括CHO细胞、杂交瘤细胞和骨髓细胞。

本文在以下描述了一些用于特异性结合剂蛋白的重组表达的示例性方案。

术语“表达载体”是指用于从DNA(RNA)序列中表达多肽的质粒、噬菌体、病毒或载体。表达载体可以包含转录单元，所述转录单元包含以下的组件：(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如启动子或增强子；(2)编码被转录成mRNA并且被翻译成蛋白的结合剂的结构或序列；以及(3)适当的转录起始序列和转录终止序列。旨在用于酵母或真核表达系统中的结构单元优选地包括使得宿主细胞翻译的蛋白能够分泌到胞外的前导序列。可选地，在重组的特异性结合剂蛋白被表达而没有前导序列或运输序列时，它可以包括氨基端的甲硫氨酸残基。接着这种残基可能或可能不从表达的重组蛋白中切割来提供最终的特异性结合剂产物。

例如，可以使用商购的表达系统例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)遵循制造商的说明书在酵母中重组地表达特异性结合剂。这个系统还也依赖pre-pro-α序列来指导分泌，但是插入物的转录是在甲醇诱导时由醇氧化酶(AOX1)启动子驱动的。

通过例如用于从细菌和哺乳动物细胞上清液中纯化肽的方法来从酵母生长培养基中纯化分泌的特异性结合剂肽。

可选地，可以将编码特异性结合剂肽的cDNA克隆到杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen，San Diego，CA)中。可以根据制造商的指导(PharMingen)使用这种载体来感染无sF9蛋白的培养基中的草地夜蛾细胞并产生重组蛋白。可以使用肝素琼脂糖柱(Pharmacia)将特异性结合剂蛋白从培养基中纯化和浓缩。

可选地，所述肽可以在昆虫系统中表达。用于蛋白表达的昆虫系统是本领域技术人员公知的。在一个这样的系统中，可以使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来在草地夜蛾细胞或在夜蛾幼虫中表达外来基因。可以将特异性结合剂肽的编码序列克隆到该病毒的非必需区中(例如多角体蛋白基因)并且置于多角体蛋白启动子的控制之下。特异性结合剂肽的成功插入将引起多角体蛋白基因失活并且产生缺乏衣壳蛋白外壳的重组病毒。可以用重组病毒来感染草地夜蛾细胞或夜蛾幼虫，肽在其中被表达[Smith等人，J Virol 46：584(1983)；Engelhard等人，Proc Nat Acad Sci(USA)91：3224-7(1994)]。

在另一个实例中，编码特异性结合剂肽的DNA序列可以通过PCR来扩增并且被克隆到适当的载体中，例如，pGEX-3X(Pharmacia)。设计pGEX载体来产生由该载体编码的包含谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白以及由插入到该载体的克隆位点中的DNA片段所编码的特异性结合剂蛋白。可以产生包括例如适当的切割位点的用于PCR的引物。在特异性结合剂融合部分被唯一用来促进表达或者其他情况下不期望与感兴趣的肽相连时，可以将重组的特异性结合剂融合蛋白从该融合蛋白的GST部分上切割下来。将pGEX-3X/特异性结合剂肽构建体转化到大肠杆菌XL-1蓝细胞(Stratagene，La Jolla CA)中，并且使单个的转化子分离并生长。来自单个转化子的质粒DNA可以被纯化并且使用自动化测序仪部分地测序以证实编码期望的特异性结合剂的核酸插入物以正确的方向存在。

使用上述重组系统表达编码抗Ang-1和/或抗Ang-2抗体及其片段的多核苷酸可能导致如下抗体或其片段的产生：必须是“重折叠的”(为了正确产生各种二硫键)以便具有生物活性。这些抗体的典型重折叠程序被阐述在本文的实施例以及以下章节中。

在细菌细胞中制备的特异性结合剂可以作为不溶的包涵体在细菌中产生，可以如下被纯化。可以通过离心致死宿主细胞；在0.15M NaCl、10mM Tris，pH 8、1mM EDTA中洗涤；并且用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma，St.Louis，MO)在室温下处理15分钟。溶菌产物可以通过超声处理变澄清，并且细胞碎片可以通过在12,000Xg离心10分钟来沉淀。可以将含有特异性结合剂的沉淀重悬在50mM Tris，pH 8和10mM EDTA中，经50％甘油而分层，并在6000Xg离心30分钟。可以将沉淀重悬在不含Mg⁺⁺和Ca⁺⁺的标准的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。可以通过将重悬的沉淀物在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级分离来进一步纯化特异性结合剂(Sambrook等人，上文)。将凝胶浸泡在0.4M KCl中以使蛋白可见，可以将蛋白切离并将其在缺乏SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。如果GST融合蛋白在细菌中作为可溶性蛋白产生，那么它可以使用GST Purification Module(Pharmacia)来纯化。

用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统是本领域技术人员公知的。可以根据拥有表达的蛋白或产生将用于提供蛋白活性的某些翻译后修饰的特殊能力来选择宿主细胞株。多肽的这些修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化以及酰化。不同的宿主细胞例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38以及杂交瘤细胞系等具有用于此类翻译后活性的特定的细胞机器和特征机制，并且可以被选择以确保所引入的外来蛋白的正确的修饰和加工。

许多选择系统可以用于回收已被转化用于产生重组蛋白的细胞。这些选择系统包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶以及腺嘌呤-磷酸核糖转移酶的基因。同样，抗代谢物抗性可以用作如下物质的选择基础：赋予对甲氨蝶呤的抗性的DHFR；赋予对麦考酚酸的抗性的gpt；赋予对氨基糖甙G418的抗性并且赋予对氯磺隆的抗性的neo；以及赋予对潮霉素的抗性的hygro。可能有用的另外的选择性基因包括允许细胞利用吲哚而代替色氨酸的trpB或者允许细胞利用组氨醇(histinol)而代替组氨酸的hisD。给出用于识别转化子的目视指征的标记包括花色苷、β-葡萄糖醛酸酶及其底物GUS、以及萤光素酶及其底物荧光素。

特异性结合剂的纯化和重折叠

在一些情况下，使用上述程序产生的特异性结合剂可能需要被“重折叠”并且被氧化成正确的四级结构并产生二硫键以便具有生物活性。可以使用本领域公知的许多程序完成重折叠。这些方法包括例如将溶解的多肽剂暴露于在离液剂存在下的通常7以上的pH。离液剂的选择与用于包涵体溶解的选择相似，然而离液剂通常以较低浓度使用。示例性离液剂是胍。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还将包含处于特定比例的还原剂加上它的氧化形式以产生特定的氧化还原电势，该氧化还原电势允许二硫键改组(dusykfide shuffling)发生以形成半胱氨酸桥。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT以及2-巯基乙醇(bME)/二硫代-bME。在许多情况下，可用共溶剂来提高重折叠的效率。常用的共溶剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇以及精氨酸。

纯化本发明的特异性结合剂蛋白或其变体将是令人期望的。蛋白质纯化技术是本领域的技术人员公知的。这些技术在一个层次上包括多肽和非多肽级分的粗分级分离。已经将特异性结合剂多肽从其他蛋白中分离出来，可以使用色谱技术和电泳技术进一步纯化感兴趣的多肽以实现部分或完全纯化(或针对均质性的纯化)。特别适合于制备纯的特异性结合剂肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白液相色谱法或甚至HPLC。

本发明的某些方面涉及编码的特异性结合剂蛋白或肽的纯化，以及在具体的实施方案中它们的大量纯化。如本文使用，术语“纯化的特异性结合剂蛋白或肽”旨在表示可从其他组分分离的一种组合物，其中所述特异性结合剂蛋白或肽被纯化至相对于其天然获得状态的任何程度。因此，纯化的特异性结合剂蛋白或肽还指从其可以天然存在的环境中游离出来的特异性结合剂蛋白或肽。

一般而言，“纯化的”将指这样的特异性结合剂组合物：该组合物已经历分级分离来除去各种其他组分并且所述组合物基本上保留了其表达的生物活性。在使用术语“基本上纯化的”时，该名称将指这样的特异性结合剂组合物：其中特异性结合剂蛋白或肽形成了该组合物的主要部分，例如组成了该组合物中蛋白的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。

由于本公开内容，用于对特异性结合剂的纯化程度进行定量的各种方法对本领域的技术人员是已知的。这些方法包括例如：确定活性级分的特异性结合活性或者通过SDS/PAGE分析估计级分内特异性结合剂多肽的量。用于估计特异性结合剂级分的纯度的优选方法是计算该级分的结合活性、将其与最初的提取物的结合活性相比较以及由此计算出纯化的程度，本文通过“-纯化倍数(fold purification number)”来估计。当然，用来表示结合活性的量值的实际单位将取决于纯化后所选择的具体测定技术以及是否表达的特异性结合剂蛋白或肽表现可检测结合活性。

适合用于特异性结合剂蛋白纯化的各种技术将是本领域技术人员公知的。这些技术包括例如：使用硫酸铵、PEG、抗体(免疫沉淀)等沉淀或通过热变性的沉淀，接着离心；色谱步骤，例如亲和色谱(例如蛋白-A-琼脂糖)、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、羟基磷灰石色谱以及亲和色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些和其他技术的组合。如本领域通常已知的，相信进行各种纯化步骤的次序可以被改变，或者某些步骤可以被省略，并且仍产生用于制备基本上纯化的特异性结合剂的适合的方法。

一般不需要特异性结合剂总是以其最纯的状态提供。实际上，考虑到较不显著特异性结合剂产物在某些实施方案中有效用。部分纯化可以通过在组合中使用更少的纯化步骤或通过利用相同的通用纯化方案的不同形式来实现。例如，应了解利用HPLC装置进行的离子交换柱色谱法通常将产生比利用低压色谱系统的相同技术更大的纯化“倍”。表现出较低的相对纯化程度的方法在特异性结合剂蛋白产物的总回收或保持表达的特异性结合剂蛋白的结合活性上可能具有优点。

已知多肽的迁移有时能够显著地随不同的SDS/PAGE条件而改变[Capaldi等人，Biochem Biophys Res Comm，76：425(1977)]。因此将理解在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的特异性结合剂表达产物的表观分子量可以不同。

结合测定法

免疫结合测定法通常利用捕获剂来特异性结合分析物靶抗原并且通常使其固定。捕获剂是与该分析物特异性结合的部分。在本发明的一个实施方案中，捕获剂是特异性结合Ang-2和/或Ang-1的抗体或其片段。这些免疫结合测定法是本领域公知的[参见Asai，编，Methods in Cell Biology(细胞生物学中的方法)，第37卷，Antibodies in Cell Biology(细胞生物学中的抗体)，Academic Press，Inc.，New York(1993)]。

免疫结合测定法通常利用标记剂，所述标记剂将对捕获剂和抗原所形成的结合复合物的存在发出信号。所述标记剂可以是包含结合复合物的分子之一，即它可以是标记的特异性结合剂或标记的抗特异性结合剂抗体。可选地，标记剂可以是与结合复合物相结合的第三分子，通常是另一种抗体。所述标记剂可以是例如含有标记的抗特异性结合剂抗体。对结合复合物具有特异性的第二抗体可以缺乏标记但是可以被第四分子结合，所述第四分子对第二分子为所属成员之一的抗体种类具有特异性。例如，第二抗体可以用可检测的部分修饰例如生物素，其随后被第四分子(例如酶标记的链霉抗生物素)结合。其他能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的蛋白例如蛋白A或蛋白G也可以被用作标记剂。这些结合蛋白是链球菌细胞壁的正常组分并且表现出很强的与来自多个物种的免疫球蛋白恒定区的非免疫原反应性[一般参见Akerstrom，J Immunol，135：2589-2542(1985)；以及Chaubert，Mod Pathol，10：585-591(1997)]。

纵观这些测定，在每种试剂组合之后可能需要孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可以从约5秒到几小时，优选地从约5分钟到约24小时不等。然而，孵育时间将取决于测定形式、分析物、溶液体积、浓度以及诸如此类。通常，这些测定将在环境温度进行，但是它们能够在一个温度范围内进行。

A.非竞争性结合测定法：

免疫结合测定可以是非竞争类型的。这些测定具有被直接测量的捕获分析物的量。例如，在一个优选的“夹心”测定中，捕获剂(抗体)可以直接与它在其中被固定的固体基质结合。然后这些固定的抗体捕获(结合)测试样品中存在的抗原。由此固定的蛋白就与标记剂(例如具有标记的第二抗体)结合。在另一个优选的“夹心”测定中，第二抗体缺乏标记但是能够被对该第二抗体所来源的种类的抗体具有特异性的标记抗体结合。第二抗体还可以用可检测的部分(例如生物素)修饰，第三分子(例如链霉抗生物素)可以与所述可检测的部分特异性结合。[参见Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1988)，通过引用并入本文]。

B.竞争性结合测定法：

免疫结合测定可以是竞争类型的。在样品中存在的分析物的量间接地通过测量添加的分析物的量来测量，所述添加的分析物被该样品中存在的分析物从捕获剂置换或竞争掉。在一个优选的竞争性结合测定中，将已知量的分析物(通常为标记的)加入到样品中，然后将样品与抗体(捕获剂)接触。与抗体结合的标记的分析物的量是与样品中存在的分析物的浓度成反比。(参见Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，第14章，第579-583页，上文)。

在另一个优选的竞争性结合测定中，抗体被固定在固体基质上。与抗体结合的蛋白的量可以通过测量蛋白/抗体复合物中存在的蛋白的量或者替代地通过测量剩余非复合的蛋白的量来确定。蛋白的量可以通过提供标记的蛋白来检测。参见Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，第14章，上文)。

而另一个优选的竞争性结合测定，利用了半抗原抑制。这里，已知的分析物被固定在固体基质上。将已知量的抗体加入样品，然后将样品与固定的分析物接触。与固定的分析物结合的抗体的量是与样品中存在的分析物的量成反比。可以通过检测抗体的固定级分或保留在溶液中的级分来检测固定的抗体的量。检测可以是直接的(在抗体被标记时)或间接的(通过随后加入与上述抗体特异性结合的标记部分)。

C.竞争性结合测定法的利用：

将可以将竞争性结合测定法用于交叉反应性测定以允许技术人员确定被本发明的特异性结合剂识别的蛋白或酶复合物是否是期望的蛋白并且不是交叉反应的分子，或者确定是否抗体对抗原具有特异性并且不结合不相关的抗原。在这种类型的测定法中，可以将抗原固定到固体支持体上并且将未知的蛋白混合物加至该测定中，所述未知的蛋白混合物将同特异性结合剂竞争与固定的抗原的结合。竞争分子还结合与该抗原无关的一种或多种抗原。将所述蛋白同特异性结合剂抗体竞争与固定的抗原结合的能力与被固定到固体支持体的同种抗体结合相比较，来确定蛋白混合物的交叉反应性。

D.其他结合测定法：

本发明还提供了蛋白质印迹方法来检测或定量样品中Ang-1和/或Ang-2的存在。该技术一般包括：通过基于分子量的凝胶电泳分离样品并将蛋白转移至适合的固体支持体，例如消化纤维素滤膜、尼龙滤膜或衍生的尼龙滤膜。将样品与特异性结合Ang-1和/或Ang-2的抗体或其片段一起孵育并检测得到的复合物。这些抗体可以被直接标记，或者替代地可以使用与该抗体特异性结合的标记抗体随后进行检测。

在本文的实施例中阐述了检测那些破坏Ang-2与其受体结合的Ang-1和/或Ang-2特异性结合剂的结合测定法。

诊断测定法

本发明的抗体或其抗原结合片段可用于诊断以Ang-1和/或Ang-2或亚基的表达为特征的病况或疾病，或者用在监测用Ang-1和/或Ang-2、其片段的诱导剂、Ang-1和/或Ang-2活性的激动剂或抑制剂治疗的患者的测定中。用于Ang-1和/或Ang-2的诊断测定包括利用特异性结合剂和标记来检测人体液或者细胞或组织的提取物中的Ang-1和/或Ang-2的方法。本发明的特异性结合剂可以在有或没有修饰的条件下使用。在优选的诊断测定中，特异性结合剂将通过连接例如标记或报道分子来标记。多种标记和报道分子是已知的，其中一些已在本文描述。具体而言，本发明对于诊断人类疾病是有用的。

使用对相应的蛋白具有特异性的多克隆抗体或单克隆抗体测量Ang-1和/或Ang-2蛋白的各种方案是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。利用对Ang-1和/或Ang-2上的两个非干扰表位有反应性的单克隆抗体的两点的、基于单克隆的免疫测定是优选的，但是可以采用竞争性结合测定。这些测定描述在例如Maddox等人，J Exp Med，158：1211[1983]中。

为了提供诊断的基础，通常确立人的Ang-1和/或Ang-2表达的正常值或标准值。这种确定可以通过在本领域公知的适合于复合物形成的条件下将来自正常受治疗者(优选为人)的体液或细胞提取物与特异性结合剂(例如针对Ang-1和/或Ang-2的抗体)相组合来完成。标准的复合物形成的量可以通过将特异性结合剂与已知数量的Ang-1和/或Ang-2蛋白的结合与对照样品和疾病样品进行比较来定量。然后，可以比较从正常样品中获得的标准值与从可能受疾病影响的受治疗者的样品获得的值。在标准值与受治疗者值之间的偏差表明了在疾病状态下Ang-1和/或Ang-2的作用。

对于诊断性应用，在某些实施方案中，特异性结合剂通常将用可检测的部分来标记。可检测的部分可以是能够直接或间接产生可检测的信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素，例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光化合物或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；或酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶[Bayer等人，Meth Enz，184：138-163，(1990)]。

疾病

本发明提供与Ang-1和/或Ang-2结合的特异性结合剂，这对于治疗人类疾病和病理状况是有用的。调节Ang-1和/或Ang-2结合活性或其他细胞活性的药剂可以与其他治疗剂联合使用来增强其治疗效果或降低潜在的副作用。

一方面，本发明提供了可用于治疗以细胞中不期望的或异常的Ang-1和/或Ang-2活性水平为特征的疾病和病况的试剂和方法。这些疾病包括癌症和其他过度增生性病况，例如增生、银屑病、接触性皮炎、免疫病症和不育。

本发明还提供治疗动物(包括人)的癌症的方法，所述方法包括向动物施用有效量的抑制或降低Ang-1和/或Ang-2活性的特异性结合剂。本发明还涉及抑制癌细胞生长的方法，所述癌细胞生长包括生物系统中的细胞增殖、侵入和转移的过程。方法包括使用本发明的化合物作为癌细胞生长的抑制剂。优选地，采用所述方法来抑制或降低活体动物(例如哺乳动物)中的癌细胞生长、入侵、转移或肿瘤发生率。本发明的方法也可容易地适用于测定系统，例如测定癌细胞生长及其特性以及鉴定影响癌细胞生长的化合物。

可通过本发明的方法治疗的癌症优选地发生在哺乳动物中。哺乳动物包括例如：人类和其他灵长类；以及宠物或伴侣动物，例如狗和猫；实验动物，例如大鼠、小鼠和兔子；以及家畜，例如马、猪、羊和牛。

肿瘤或赘生物包括组织细胞的生长，其中所述细胞的倍增是不受控制的和渐进性的。这些生长有些是良性的，但其他被称为恶性的并且可能导致生物体死亡。恶性赘生物或癌症与良性生长的区别在于，除了表现出侵蚀性细胞增殖以外，它们可侵入周围组织并转移。此外，恶性赘生物的特征在于它们显示出相对于彼此和它们周围组织的更大的分化损失(更大的去分化)和它们的组织构成的损失。这种特性也称为“间变”。

可通过本发明治疗的赘生物还包括实体肿瘤，即癌和肉瘤。癌包括那些来源于上皮细胞的浸润(侵入)周围组织并产生转移酶的恶性赘生物。腺癌是来源于腺体组织或形成可识别的腺体结构的癌。另一广阔类别或癌症包括肉瘤，肉瘤是细胞嵌入纤维物质或均匀物质(像胚性结缔组织)中的肿瘤。本发明还使骨髓或淋巴系统的癌症(包括白血病、淋巴瘤和其他癌症)的治疗成为可能，所述骨髓或淋巴系统的癌症不作为肿瘤块存在，而是分布在血管或淋巴网状系统中。

适用于根据本发明治疗的癌症或肿瘤细胞的类型包括例如：产生ACTH的肿瘤、急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、食管癌、尤因氏肉瘤、胆囊癌、多毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金氏淋巴瘤、卡济波氏肉瘤、肾癌、肝癌、肺癌(小细胞和非小细胞)、恶性腹腔积液、恶性胸腔积液、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢(生殖细胞)癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌以及维尔姆斯氏肿瘤。

本文特别地阐述本发明是关于治疗某些以实验确定的癌症类型。在这些阐述性治疗中，已使用标准的现有技术体外和体内模型。这些方法能够被用来鉴定可能预期在体内治疗方案中有效的药剂。然而，将理解本发明的方法不限于治疗这些肿瘤类型，但是延伸到来源于任何器官系统的任何实体肿瘤。通过本发明的手段，本身的侵入或转移与Ang-2的表达或活性有关的癌症尤其易被抑制或者甚至被诱导以退化。

还可以通过包括本发明的特异性结合剂(例如抗体)与另一种抗癌化疗剂(例如任何常规的化疗剂)的组合来实践本发明。特异性结合剂与其他这些药剂的组合可能增强化疗方案。许多化疗方案本身将存在于熟练执业医生的头脑中，如能够并入到本发明的方法中一样。可以使用任何化疗剂，包括烷化剂、抗代谢物、激素和拮抗剂、放射性同位素以及天然产品。例如，本发明的化合物可以与以下物质一起施用：抗生素，例如多柔比星和其他蒽环类抗生素类似物；氮芥类，例如环磷酰胺；嘧啶类似物例如5-氟尿嘧啶；顺铂；羟基脲；紫杉酚以及它的天然和合成的衍生物等。作为另一个实例，在混合的肿瘤的情况下，例如乳腺腺癌，其中肿瘤包括促性腺激素依赖性细胞和促性腺激素非依赖性细胞，化合物可以联合亮丙瑞林和戈舍瑞林(LH-RH的合成肽类似物)一起施用。其他抗瘤方案包括四环类化合物与另外的治疗模式(例如，手术、放射等)一起使用，本文也称为“辅助抗瘤模式”。因此，本发明的方法可以与这些具有降低副作用和增强疗效的益处的常规方案一起使用。

本发明因此提供了可用于治疗包括实体肿瘤和白血病在内的广泛种类的癌症的组合物和方法。可被治疗的癌症类型包括但不限于：乳腺、前列腺和结肠的腺癌；所有形式的肺支气管原癌；骨髓瘤(myeloid)；黑素瘤；肝癌；成神经细胞瘤；乳头瘤；胺前体摄取脱羧细胞瘤(apudoma)；迷芽瘤；鳃原瘤；恶性类癌综合征；类癌心脏病；癌(例如Walker癌、基底细胞癌、鳞状细胞基底细胞癌(basosquamous)、Brown-Pearce癌、导管癌、Ehrlich瘤、Krebs 2癌、梅克尔细胞癌、粘蛋白性癌、非小细胞癌、燕麦细胞癌、乳突状癌、硬癌、支气管癌、支气管原癌、鳞状细胞癌以及过渡细胞癌)；组织细胞疾患；白血病；恶性组织细胞增生症；霍奇金氏病；免疫增殖性小细胞肺癌；非霍奇金氏病；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑素瘤；成软骨细胞瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞肿瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；含有粘液瘤组织的肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养细胞肿瘤。此外还可以治疗以下癌症类型：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤(cyclindroma)；囊腺癌；囊腺瘤；粒层细胞瘤；两性胚细胞瘤；肝癌；汗腺瘤；胰岛细胞瘤；睾丸间质细胞瘤；乳头瘤；塞尔托利细胞瘤(Sertoli cell tumor)；卵泡膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；神经胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；成神经细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；神经节细胞瘤；非嗜铬性副神经节瘤；血管角质瘤；血管淋巴样增生伴嗜酸细胞增多；硬化性血管瘤；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊性肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；含有粘液瘤组织的肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；赘生物；神经纤维瘤病(nerofibromatosis)；以及宫颈非典型增生。

本发明的另一方面是使用本发明的材料和方法来阻止和/或治疗皮肤的任何过度增生性病况，包括银屑病以及接触性皮炎或其他过度增生性疾病。已显示患有银屑病和接触性皮炎的患者在这些损伤内具有增高的Ang-2活性[Ogoshi等人，J.Inv.Dermatol.，110：818-23(1998)]。优选地，对Ang-2具有特异性的特异性结合剂将与其他药物剂组合使用来治疗表现这些临床症状的人。特异性结合剂可以使用多种载体的任一种通过本文所述的施用途径以及其他本领域公知的施用途径来递送。

本发明的其他方面包括治疗其中涉及血管发生的各种视网膜病(包括糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性)以及雌性生殖道的疾患/疾病，例如子宫内膜异位、子宫肌瘤以及其他这类与雌性生殖周期期间的血管增生异常(包括子宫内膜微血管的生长)有关的病况。

本发明又一方面涉及治疗包括脑动静脉畸形(AVM)在内的异常的血管生长、胃肠粘膜损伤和修复、有消化溃疡病史的患者中的胃十二指肠溃疡形成(包括中风产生的局部缺血)、肝病中的各种肺部血管疾患以及患有非肝门静脉高血压的患者的肝门高血压。

本发明的另一方面是利用本发明提供的组合物和方法阻止癌症。这些试剂将包括Ang-2的特异性结合剂。

药物组合物

Ang-1和/或Ang-2特异性结合剂的药物组合物是在本发明的范围之内。包含抗体的药物组合物详细描述在例如2001年1月9日授予Lam等人的美国专利6,171,586中。这些组合物包含与药学上可接受的物质相混合的治疗有效量或预防有效量的特异性结合剂，例如本文描述的抗体或其片段、变体、衍生物或融合体。在优选的实施方案中，药物组合物包含与药学上可接受的物质相混合的部分或完全调节Ang-1和/或Ang-2中至少一种生物活性的拮抗剂特异性结合剂。通常，特异性结合剂将被充分地纯化以施用给动物。

药物组合物可以包含用于改变、维持或保存例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌、稳定性、溶解或释放的速率、吸附或穿透的配制材料。适合的配制材料包括但不限于：氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其他有机酸)；增量剂(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂[例如乙二胺四乙酸(EDTA)]；络合剂(咖啡因、聚乙烯比咯酮、β环糊精或羟丙基β环糊精)；填充剂；单糖；二糖和其他糖类(例如、葡萄糖、甘露糖或环糊精)；蛋白(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯酮)；低分子量多肽；形成盐的反离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酯、对羟苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如普流尼克、PEG、山梨醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal))；稳定性增强剂(蔗糖或山梨醇)；张度增强剂(例如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇)；递送媒介物(delivery vehicle)；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿氏制药科学)，第18版，A.R.Gennaro，编，Mack Publishing Company，1990)。

最佳的药物组合物将由本领域技术人员根据例如打算的施用途径、递送形式和期望剂量来确定。参见例如，上文的雷明顿氏制药科学。这些组合物可以影响特异性结合剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

在药物组合物中的主要媒介物或载体可以在性质上是水性或非水性的。例如，适合的媒介物或载体可以是可能补充了肠胃外施用组合物中常见的其他材料的注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液。中性缓冲盐水或混有血清白蛋白的盐水是另外的示例性媒介物。其他示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，所述缓冲液还可以因此包括山梨醇或适合的代用品。在本发明的一个实施方案中，可以通过将具有期望纯度的所选组合物与任选的处于冻干的结块或水溶液形式的配制剂(上文的雷明顿氏制药科学)相混合来制备结合剂组合物以供储藏。此外，可以使用适当的赋形剂例如蔗糖将结合剂产物配制成冻干物(lyophilizate)。

可以选择药物组合物用于肠胃外递送。可选地，可以选择组合物用于吸入或用于肠内递送，例如经口、经耳、经眼、经直肠或经阴道。这些药学上可接受的组合物的制备是在本领域技术之内。

配制组分以施用部位可接受的浓度存在。例如，缓冲液可以用来将组合物保持在生理pH或稍微低的pH，通常在约5到约8的pH范围之内。

当考虑肠胃外施用时，供本发明中使用的治疗组合物可以处于无热原、包含药学上可接受的媒介物中的期望的特异性结合剂的肠胃外可接受的水溶液的形式。特别适用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，在其中结合剂被配制成适当地保存的无菌、等渗的溶液。还有另一种制备可以包括用提供可随后通过积存注射递送的产物的控释或缓释的剂来配制期望的分子，所述剂例如可注射的微球、生物可蚀解的颗粒、多聚化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠子或脂质体。还可以使用透明质酸，并且这可能具有提升在循环中的持续时间的作用。其他适合于引入期望分子的手段包括可植入的药物递送装置。

另一方面，适合于肠胃外施用的药物制剂可以配制在水溶液中，优选地在生理上相容的缓冲液中，例如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理缓冲盐水。含水的注射悬浮液可以含有增加该悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以被制备成适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体)。非脂质聚阳离子氨基聚合物也可以用于递送。任选地，悬浮液还可以含有提高化合物的溶解性并允许制备高浓缩溶液的适合的稳定剂或试剂。

在另外的实施方案中，药物组合物可以被配制用于吸入。例如，结合剂可以被配制为用于吸入的干粉。多肽或核酸分子吸入溶液还可以与推进剂一起配制以用于气溶胶递送。又在另一个实施方案中，溶液可以是喷雾的。肺部施用另外描述在PCR申请第PCT/US94/001875号中，它描述了化学修饰的蛋白的肺部递送。

还考虑某些制剂可以口服施用。在本发明的一个实施方案中，以这种方式施用的结合剂分子可以在有或没有固体剂型(例如片剂和胶囊)的配合中惯常使用的那些载体的条件下配制。例如，可以将胶囊设计为在胃肠道中的某点释放制剂的活性部分，此时生物利用度最大并且系统前降解最小。可以包括另外的剂以促进结合剂分子的吸收。还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片崩解剂和粘合剂。

还可以使用本领域公知的药学上可接受的载体以适合于口服施用的剂量配制用于口服施用的药物组合物。这些载体使得药物组合物能够被配制成供患者摄入的片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂、悬浮剂以及诸如此类。

口服使用的药物制品可以通过以下方式获得：将活性化合物与固体赋形剂组合在一起并加工得到的颗粒混合物(任选地在研磨之后)以获得片剂或糖衣片核心。如果需要，可以加入适合的辅料。适合的赋形剂包括糖类或蛋白填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；胶质，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；以及蛋白，例如明胶和胶原。如果需要，可以加入崩解剂或溶解剂，例如交联的聚乙烯吡咯酮、琼脂和海藻酸及其盐(例如海藻酸钠)。

糖衣片核心可以与适合的包衣(例如浓缩的糖溶液)联合使用，包衣还可以含有胶质阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入到片剂或糖衣片包衣中用于产品标识或表征活性化合物的数量，即剂量。

可口服使用的药物制品还包括明胶制成的推合式胶囊(push-fit capsule)、以及由明胶和包衣(例如甘油或山梨醇)制成的软的密封胶囊。推合式胶囊可以含有与填充剂或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂相混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可被溶解或悬浮在适合的液体中，例如脂肪油、液体或者有或没有稳定剂的液体聚乙二醇。

另外的药物组合物可以包括有效量的在与适于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的结合剂。通过在无菌水或其他适当媒介物中溶解片剂，可以制备单位剂量形式的溶液。适合的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。

其他的药物组合物对本领域技术人员将是明显的，包括涉及缓释或控释递送的制剂中的结合剂分子的制剂。用于配制各种其他缓释或控释递送工具的技术也是本领域技术人员已知的，所述工具例如脂质体载体、可生物蚀解的微粒或多孔珠子以及积存注射。参见例如PCT/US93/00829，它描述了用于递送药物组合物的多孔聚合微粒的控制释放。缓释制品的另外的实例包括处于成形产品形式的半渗透性聚合物基质，例如膜或微胶囊。缓释基质可以包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(U.S.3,773,919、EP 58,481)、L谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物[Sidman等人，Biopolymers，22：547-556(1983)]、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)[Langer等人，J Biomed Mater Res，15：167-277，(1981)]和[Langer等人，Chem Tech，12：98-105(1982)]、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。缓释组合物还包括可以通过本领域已知的几种方法中任一种制备的脂质体。参见例如，Eppstein等人，Proc Natl Acad Sci(USA)，82：3688-3692(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949。

用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过无菌滤膜过滤实现。在组合物被冻干的情况下，使用该方法除菌可在冻干和复溶之前或之后进行。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液储存。此外，通常将肠胃外组合物放到具有无菌获取通道的容器中，例如具有可通过皮下注射针穿透的塞的静脉输液袋或小瓶。

在配制药物组合物后，可将它作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或者脱水或冻干的粉末储存在无菌小瓶中。这些制剂可以被储存成即用形式或施用前需要复溶的形式(例如冻干的)。

在具体的实施方案中，本发明涉及用于产生单剂量施用单位的试剂盒。试剂盒各自可以同时包含具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器两者。本发明范围之内还包括含有单腔和多腔预装填的注射器(例如液体注射器和lyo注射器(lyosyringe))的试剂盒。

治疗上采用的药物组合物的有效量将取决于例如治疗情况和治疗目标。本领域技术人员将理解，用于治疗的适当的剂量水平将因此改变，这部分地取决于递送的分子、使用结合剂分子所针对的适应症、施用途径、患者的大小(体重、体表或器官的大小)和状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医师可以滴定剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果。典型剂量范围可以在约0.1mg/kg至约100mg/kg或更大，这取决于上面提到的因素。在其他实施方案中，剂量范围可以在0.1mg/kg至约100mg/kg；或1mg/kg至约100mg/kg；或5mg/kg至约100mg/kg。

对于任何化合物，可以在细胞培养物测定或在动物模型中最初估计治疗有效剂量，上述动物模型例如小鼠、大鼠、兔子、狗或猪。动物模型还可以用来确定适当的浓度范围和施用途径。然后这些信息可以用来确定在人类中的有用的剂量和施用途径。

准确的剂量将根据需要治疗的受治疗者相关的因素来确定。调整剂量和施用以提供足够水平的活性化合物或维持期望的效果。可纳入考虑的因素包括疾病状态的严重度，受治疗者的一般健康状态，受治疗者的年龄、重量和性别，施用的时间和频率，药物组合，反应敏感性，以及对治疗的反应。长效药物组合物可以每3天到4天、每周或两周施用一次，这取决于具体制剂的半衰期和清除速率。

给药频率将取决于使用的制剂中结合剂分子的药物代谢动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现期望效果的剂量。因此，组合物可以按单剂量或按多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)随时间施用或连续输注施用。可常规地作出适当剂量的其他改进。可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当的剂量。

药物组合物的施用途径是依据已知方法，例如：口服；通过静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内、损伤内途径(intralesional route)、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠的方式注射；通过缓释系统或通过植入装置。在需要时，可以通过弹丸注射(bolus injection)或连续输注或通过植入装置施用组合物。

可选地或另外地，可以通过已经吸收或封装期望的分子的膜、海绵或另一种适当材料的植入来施用组合物。当使用植入装置时，可以将装置植入到任何适合的组织或器官中，并且可以通过扩散、定时释放的药丸或连续施用来递送期望的分子。

在一些情况下，以活体外方式使用药物组合物可能是令人期望的。在这些情况下，将已从患者中移除的细胞、组织或器官暴露于药物组合物，之后这些细胞、组织和/或器官接着被植入回患者中。

在其他情况下，可以通过植入某些细胞来递送多肽，所述细胞已使用例如本文所述的方法进行基因工程化改造以表达和分泌该多肽。这些细胞可以是动物细胞或人细胞，并且可以是自体的、异源的或异基因的。任选地，细胞可以是永生化细胞。为了降低免疫反应的机会，可以封装细胞以避免周围组织的浸润。封装材料通常是可生物降解的、半渗透聚合的外壳或膜，它们允许蛋白产物的释放，但阻止细胞被患者的免疫系统或被其他来自周围组织的有害因素破坏。

组合治疗

本发明的特异性结合剂可以与治疗Ang-1和/或Ang-2病理的其他治疗剂联合使用。这些其他治疗剂包括例如放射治疗、化疗剂以及其他生长因子或抑制剂。

化学疗法可以采用抗肿瘤药，包括例如：烷化剂，包括氮芥类，例如氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)以及司莫司汀(甲基-CCNU)；乙烯亚胺/甲基三聚氰胺，例如三亚乙基三聚氰胺(TEM)、三乙烯、三亚乙基硫代磷酰胺(噻替派)、六甲三聚氰胺(HMM、六甲蜜胺)；烷基硫酸酯类，例如白消安；三嗪类，例如达卡巴嗪(DTIC)；抗代谢药，包括叶酸类似物，例如甲氨蝶呤和三甲曲沙，嘧啶类似物，例如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿糖核苷(AraC、阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷、2，2′-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物，例如6巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2’-脱氧助间型霉素(喷司他丁)、赤羟基壬烷基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine，EHNA)、磷酸氟达拉滨以及2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨、2-CdA)；自然产物，包括抗有丝分裂药物，例如紫杉酚、长春花生物碱类(包括长春碱(VLB)、长春新碱以及长春瑞滨)、多西他赛、雌氮芥、以及磷酸雌二醇氮芥；表鬼臼毒素(ppipodophylotoxin)，例如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素类，例如放线菌素D(actimomycin D)、道诺霉素(红比霉素)、多柔比星、米托蒽醌、伊达比星、博莱霉素、普利霉素(普卡霉素)、丝裂霉素C以及放线菌素；酶类，例如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂，例如干扰素α、IL-2、G-CSF以及GM-CSF；混杂剂(miscellaneous agent)，包括铂配位复合物(platinium coordination complexe)，例如顺铂和卡铂，蒽二酮类，例如米托蒽醌、取代的脲(例如羟基脲)、包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼的甲基肼衍生物，肾上腺皮质抑制剂类，例如米托坦(o，p′-DDD)和氨鲁米特；激素类和包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂的拮抗剂类，例如泼尼松及等同物、地塞米松和氨鲁米特；黄体酮，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，例如乙底酚和炔雌醇等同物；抗雌激素类，例如他莫昔芬；雄激素类，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等同物；抗雄激素类，例如氟他胺、促性腺素释放激素类似物和亮丙瑞林；以及非甾体类抗雄激素，例如氟他胺。

可以与以下列出的生长因子或与被设计来抑制以下列出的生长因子的药剂相结合进行组合治疗。生长因子包括细胞因子、淋巴因子、生长因子或其他血细胞生成因子，例如M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNF0、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血小板生成素、干细胞因子和促红细胞生成素。其他是可以包括已知的血管生成素的组合物，所述血管生成素例如Ang-1、-2、-4、-Y和/或人Ang样多肽和/或血管内皮生长因子(VEGF)。生长因子包括血管生成因子、成骨蛋白-1、成骨蛋白-2、成骨蛋白-3、成骨蛋白-4、成骨蛋白-5、成骨蛋白-6、成骨蛋白-7、成骨蛋白-8、成骨蛋白-9、成骨蛋白-10、成骨蛋白-11、成骨蛋白-12、成骨蛋白-13、成骨蛋白-14、成骨蛋白-15、成骨蛋白受体-IA、成骨蛋白受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子-1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞、趋化因子-2、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子-2、内皮细胞生长因子、内皮缩血管肽-1、表皮生长因子、上皮源性嗜中性粒细胞吸引剂、成纤维细胞生长因子-4、成纤维细胞生长因子-5、成纤维细胞生长因子-6、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-8、成纤维细胞生长因子-8b、成纤维细胞生长因子-8c、成纤维细胞生长因子-9、成纤维细胞生长因子-10、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系来源的神经营养因子受体-1、神经胶质细胞系来源的神经营养因子受体-2、生长相关蛋白、生长相关蛋白-2、生长相关蛋白-2、生长相关蛋白-3、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体-1、神经生长因子神经生长因子受体、神经营养因子-3、神经营养因子-4、胎盘生长因子、placenta生长因子-2、血小板源内皮细胞生长因子、血小板源生长因子、血小板源生长因子A链、血小板源生长因子AA、血小板源生长因子AB、血小板源生长因子B链、血小板源生长因子BB、血小板源生长因子受体-1、血小板源生长因子受体-2、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子-1、转化生长因子-2、转化生长因子-3、转化生长因子-1.2、转化生长因子-4、转化生长因子-5、潜在的转化生长因子-1、转化生长因子结合蛋白I、转化生长因子结合蛋白I、转化生长因子结合蛋白III、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、血管内皮生长因子和嵌合蛋白类以及它们的生物学或免疫学活性片段。

也可以用本发明的特异性结合剂(例如抗体)联合细胞凋亡诱导剂实现组合治疗，所述细胞凋亡诱导剂例如通过DR4(TRAIL R-1)和/或DR5(TRAIL R-2)受体诱导凋亡的特异性结合剂(例如对抗抗体或TRAIL配体)。在通过引用并入本文的WO 2007/027713中提供了这些特异性结合剂的实例，它公开了通过DR5受体诱导凋亡的对抗抗体。

免疫治疗剂

免疫治疗剂通常依赖于靶向并破坏癌细胞的免疫效应细胞和分子的使用。免疫效应物可以是例如识别靶细胞表面上的某种标记的本发明的抗体。单独的抗体可以充当治疗的效应物或者它可以募集其他细胞来实际实现细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并因此只充当靶向剂。

根据本发明，可以通过本发明的抗体或抗体缀合物免疫治疗来靶向Ang-1和/或Ang-2的突变体形式。特别考虑本发明的抗体组合物可以被用在与Ang-2靶向治疗相结合的组合的治疗方法中。

被动免疫疗法已证实对许多癌症特别有效。参见例如WO 98/39027。

以下实施例仅意在说明的目的，并且不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

通过噬菌体展示产生针对Ang-2的亲和力成熟的抗体

总策略

采用CDR随机化来增强Ang2抗体的活性，类似于之前的方法(ChenY等人，1999 J Mol Biol(293)865-881；Yelton DE等人，1995J Immunol(155)1994-2004；Yang W-P等人，1995 J Mol Biol(254)392-403)。简言之，将Ang2抗体536的可变区克隆到TargetQuest改良的pCES-1载体中(Dyax Corp，de Haard HJ等人1999J Biol Chem(274)18218-30)。通过诱变使用含有NNK的寡核苷酸将所有的CDR区靶向用于每个CDR残基的随机化。在诱变反应之后，使用噬菌体ELISA检查噬菌体克隆的每个位置以识别有益的突变(方法参见WO 2004/046306、WO 2003/03057134以及US 2003/0099647 A1，对于一般的噬菌体抗体参考Marks JD等人，1991 J Mol Biol(222)581-597；Hoogenboom HR等人1992 J Mol Biol(227)381-388；Griffiths AD等人，1993 EMBO J(12)725-734；Vaughan TP等人，1996 Nat Biotechnol(14)309-314)。将带有有益突变的克隆转变成完全的抗体。将重链克隆与轻链克隆配对，并且对得到的IgG测试中和活性。另外表征最佳的22个克隆。

A.Ab536Fab模板构建

使用标准分子生物学技术(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)将536抗体的可变区克隆到pCES-1载体中。通过PCR使用以下寡核苷酸产生了重链可变片段和全长轻链片段：

重链反向引物：CCGCTGTGCCCCCAGAGGTGC

重链正向引物：ttttttccatggccgaggtccagctggtgcagtc

轻链反向引物：TTTTTTGGCGCGCCTTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT

轻链正向引物：ttttttgtgcacttgacattgtgatgactcagtct

将重链可变区在限制性酶切位点NcoI和BstEII之间插入。将全长轻链在限制性酶切位点ApaLI和AscI之间插入。用得到的构建体作为CDR随机化的模板。

B.CDR突变

通过逐步的定点诱变针对每个CDR位置使用带有NNK(N＝ATCG；K＝GT)密码子的寡核苷酸使载体pCES-1中的作为Fab的抗体536亲和力成熟。遵循制造商推荐的方案使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene #200518-5)。为了鉴定具有增强的结合Ang2能力的噬菌体，进行了噬菌体ELISA，用生物素化的人Ang2蛋白在PBS中以2ug/ml包被到96孔板Maxisorp板上(NUNC)。简言之，在用PBS中的2％的乳封闭后，孵育有辅助噬菌体生长的过夜噬菌体培养物并用缀合了HRP的抗M13抗体(Pharmacia)检测结合的噬菌体。相对于亲代536Fab，比较发光信号，并选择具有优异信号的克隆用于进一步分析。

C.噬菌体Fab的IgG转变

在噬菌体ELISA和序列分析之后，选择分别来自轻链和重链诱变的对Ang2具有增强的结合的95个克隆并将它们转变为IgG。简言之，使用一对引物PCR扩增每个克隆的可变区。LC的引物序列是CTG CTG CTG TGG CTG AGA GGT GCG CGC TGT GAT ATT GTG ATG ACT CAG TCT CCA CTC TCC和AAAAAA CGT ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CC。HC的引物是TTTTTTTTGCGCGCTGTGAGGTCCAGCTGGTGCAGTC和AAAAAAGGCACTA GAGACGGTGACCAGGGTTCC。在BssHII和BsiWI对LC以及用BssHII和BsmBI对HC消化以后，使用标准分子生物学技术将可变区插入到含有VK1前导序列以及人κ和人IgG1的恒定序列的pcDNA3载体中。将每种连接混合物转化到两个96孔板的XL 10金色感受态细胞(Stratagene)中，并且使转化混合物生长过夜用于第二天的质粒制备。将得到的DNA与相对的亲代536LC或HC DNA配对，并使用Fugene6将其瞬时转染到OPTI-MEM中的293T细胞中。7天后，收集来自转染的细胞的培养基，并且通过Lance测定使用以铕标记的抗人IgG抗体(Fc特异性的)和以APC标记的抗人IgG抗体(Perkin Elmer)对IgG浓度进行定量。

D.IgG克隆的选择

在HTRF中和测定中测试含有IgG的条件培养基对Tie-2与Ang1或Ang2相互作用的抑制作用。从最初的筛选中，挑出显示改善活性的15LC克隆和11HC克隆。制备所选克隆的DNA并通过测序证实。然后将每个LC和HC突变体的组合连同536亲代克隆一起转染到接种有293细胞的两个96孔板。收集条件培养基，并分析IgG浓度和在Tie2中和测定中的抑制作用。从这个组合中选择含有每个LC和HC单一突变的22个克隆用于进一步分析。

E.人亲和力成熟的Ang2抗体在CHO细胞中的表达和纯化

用于转染抗Ang2IgG表达质粒的CS-9细胞为不含血清的悬浮CHO细胞系。它们是通过使DXB-11CHO细胞逐步适应在无血清的培养基中生长而获得的，如在Rasmussen等人，1998中所述(Rasmussen，B.，Davis，R.，Thomas，J.，Reddy，P.1998.Isolation，characterization and recombinant protein expression in Veggie-CHO：A serum-free CHO host cell line(在Veggie-CHO：一种无血清的CHO宿主细胞系中的分离、表征和重组蛋白表达).Cytotechnology.28：31-42)。DXB-11细胞是来自CHO-K1细胞的DHFR缺陷的突变衍生物。(Chasin和Urlaub，1983；Urlaub和Chasin.1980.Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity(缺乏二氢叶酸还原酶活性的中华仓鼠细胞突变体的分离).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4216-4220.；Chasin L.A.，Graf，L，Ellis，N.，Lanzberg，M.，Urlaub，G.1982.Gene amplification in dihydro folate reductase deficient mutants(在缺乏二氢叶酸还原酶的突变体中的基因扩增).Schimke，R.T.(编)Gene amplification(基因扩增)；Cold Spring Harbor，N.Y.Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，N.Y.，第161-166页)。CHO-K1是最初从中华仓鼠卵巢中分离的上皮细胞系(Kao和Puck.Genetics of somatic mammalian cells(哺乳动物体细胞的遗传学).VII.Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells(中华仓鼠细胞中营养突变体的诱导和分离).Proc.Nat.Acad.Sci.60：1275-1281，1968.)。

为了获取CS-9宿主细胞系，使DXB-11细胞生长在培养基中，经100次传代逐步减少血清以获得无血清适应性细胞，称为SF-CHO(Rasmussen等人，1998)。随后通过有限稀释克隆法对SF-CHO细胞进行亚克隆，并且评估单个的克隆。选择CS-9克隆作为表达重组蛋白的宿主细胞系并将其库存于无血清的培养基中。测试该库的外源因子(adventious agent)和无菌并发现该库不含病毒、支原体和微生物剂。宿主细胞系CS-9是一种甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(GHT)营养缺陷的缺乏DHFR的CHO细胞系。质粒pDC323和pDC324各自编码DHFR cDNA的一部分，并且这2种质粒必须彼此互补来表达由两个DHFR片段在体内缔合的功能性DHFR分子。

以下二十二种抗体各自由在以下表2中命名的两条重链和两条轻链(κ或λ)组成。

表2

^*测试与本文所述的hAng-2、mAng-2和hAng-1的结合。

表3和表4阐述了22种从噬菌体转变成全长IgG1抗体的抗Ang-1和/或抗Ang-2抗体的重链和轻链(κ和λ)的序列和SEQ ID NO。使用VBASE数据库预测单克隆抗体的互补决定区(CDR)，这使用了Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest(NIH公开号91-3242；美国卫生和服务部，第5版)中描述的技术。将Fab区与具有最接近的种系序列的数据库中的序列进行比对，然后与这些序列目测比较。每个可变区(重链或轻链)的CDR(残基和序列)在表5中列出。

表3

重链可变区

表4

轻链可变区

表5

Ang-1和/或Ang-2抗体的重链(HC)和轻链(LC)的互补决定区(CDR)；

残基和序列

实施例2

评估Ang-2抗体的分子测定

开发分子测定(亲和ELISA、中和ELISA和BIAcore)来评定直接与Ang-2和相关家族成员(例如Ang-1)结合的抗体以及抗体对Ang-2：Tie2相互作用的影响。这些体外测定和基于细胞的测定被描述如下。

A.亲和ELISA

对于最初筛选候选抗Ang-2抗体，使用了纯化的人Ang-2(R and D Systems，Inc；目录号623-AN；Ang-2以2种截短形式的混合物提供)或鼠Ang-2多肽(如上所述制备)。对于确认性结合测定，从人293细胞的条件培养基中获得了人Ang-2，人293T细胞转染了全长人Ang-2DNA并且被培养在含有约50微克/ml的牛血清白蛋白(BSA)的无血清的DMEM中。

使用微量滴定板，将大约100微升每孔的Ang-2加至每个孔并且将这些板孵育约2小时，之后用含有约0.1％的Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)将板洗涤四次。然后用约250微升每孔的PBS中的大约5％的BSA封闭这些孔，并将这些板在室温下孵育约2小时。在孵育后，除去过量封闭溶液，并将系列稀释的约100微升的候选抗Ang-2抗体加至每个孔，候选抗Ang-2抗体的系列稀释在约40纳摩的浓度开始，然后在含有约1％BSA的PBS中系列地稀释4倍。然后将板在室温孵育过夜。在孵育后，用含有约0.1％的Tween-20的PBS洗涤这些板。洗涤另外重复四次，之后加入之前在含有1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS中1∶5000稀释的约100微升每孔的山羊抗人IgG(Fc)-HRP(Pierce Chemical Co.，目录#31416)。将板在室温下孵育大概1小时。然后将板在含有约0.1％Tween-20的PBS中洗涤五次，之后加入约100微升每孔的TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺液体底物系统；Sigma chemical Company，St.Louis，MO，目录号T8665)底物，并将板孵育约5-15分钟直至显现蓝色。然后在约370nm的分光光度计上读取吸光度。

B.中和ELISA

如在亲和ELISA中所述制备与人Ang-2多肽结合的微量滴定板。按以上亲和ELISA所述的系列稀释在含有约1％BSA和约1nM Tie2(提供为Tie2-Fc分子，其中Tie2部分只含有该分子的可溶性胞外部分；R and D Systems，目录号313-TI)的PBS的溶液中制备候选抗Ang-2抗体。在向每个孔加入约100微升的抗体/Tie2溶液后，将板在室温过夜孵育，然后在含有约0.1％Tween-20的PBS中洗涤五次。在洗涤后，将约100微升每孔的抗Tie2抗体(Pharmingen Inc.，目录#557039)加至约1微克每毫升的终浓度，并将板在室温下孵育约1小时，然后在含有约0.1％Tween-20的PBS中洗涤五次。接下来，在含有约1％BSA的PBS中以1∶10,000的稀释度加入约100微升每孔的山羊抗小鼠IgG-HRP(Pierce Chemical CO.，目录#31432)。将板在室温下孵育约1小时，之后用含有约0.1％Tween-20的PBS洗涤它们五次。然后加入约100微升每孔的TMB底物(以上所述)并使其显色。然后在370nm的分光光度计上读取吸光度。

C.亲和BIAcore

用PBS和0.005％P20表面活性剂(BIAcore，Inc)作为电泳缓冲液在

2000(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)上进行每种候选Ang-2抗体的亲和力分析。使用胺偶联试剂盒(Amine Coupling Kit)(Biacore，Inc.)根据制造商建议的方案将重组的蛋白G(Repligen，Needham，MA)通过伯胺基团固定在研究级的CM5传感芯片(Biacore，Inc.)上。

通过首先将约100Ru的每种候选抗Ang-2抗体连接到固定的蛋白G上，然后将各种浓度(0-100nM)的huAng-2或mAng-2以约50ul/min的流速注射在结合的抗体表面上方约3分钟。使用BIA评估3.1计算机程序(BIAcore，Inc.)确定包括k_a(缔合速率常数)、k_d(解离速率常数)和KD(解离平衡常数)在内的抗体结合动力学。较低的解离平衡常数指示抗体对Ang-2的较大的亲和力。

使用亲和ELISA和中和ELISA(如以上实施例3中所述)以及BIAcore中和测定测试所有二十二种抗体和阴性对照IgG1(称为RDB1)以确定它们的亲和力、中和能力和特异性能力。在以下(表2)阐述了结果并使用标准程序计算结果。使用以上所述的ELISA分析评估了三种抗体H6L7、H4L4和H4L11针对人和鼠的Ang-1和Ang-2的IC50中和浓度。所有三种抗体显示与小鼠、兔子和食蟹猴的Ang1和Ang2交叉反应，表现出在血管生成素直向同源物之间的相似效价。在以下表3中报道了这些结果。

D.HTRF hAng-1和hAng-2抗体的IC50以及IC90

将等体积的1.6nM链霉抗生物素-铕(SA-EU)与8nM生物素化血管生成素2(自制)或生物素化血管生成素1(R&D目录号BAF923)混合并在室温下于黑暗中孵育30分钟，在15ml锥管(Fisher 352096)中旋转。然后将50ul的以上SA-EU/生物素化Ang 2(1)混合物加入到混合板(Mixing Plate)(Costar 3356)上的每个孔中。在该混合板中，向每个孔加入4x终浓度的50ul的系列稀释的Ang1和Ang2抗体。然后将混合板在室温下于黑暗中的振荡器上孵育1小时。在测定板(Assay Plate)(Costar 3356)上，向每个孔加入20ul的10nM huTie-2-Fc-APC(Prozyme Custom批号DF99-048)。然后将混合板上每个孔的混合物转移至测定板上的每个孔。将分析板在室温下于黑暗中孵育2小时伴随旋转。然后在RUBYstar读板仪(BMG labtechnologies，INC)上读取测定板。在测定中的所有试剂用HTRF缓冲液(50mM Tris HCl、100mM NaCl、0.1％BSA以及0.05％Tween 20)稀释。用GRAFIT 5.0计算IC50和IC90。

表6

针对hAng1和hAng2的抗体的生化效价

实施例3：

血管生成素抗体的分子表征

选择具有强大hAng2抑制活性和一定范围的hAng1抑制活性的四种全人IgG2抗体(Ab536、H4L4、H6L7和H4L11)用于进一步研究。所有4种抗体显示与小鼠、兔子和食蟹猴的Ang1和Ang2交叉反应，表现出在血管生成素直向同源物之间的相似效价(表7和表8)。

表7

针对Ang2直向同源物的血管生成素抗体的生化效价

测量对配体/受体相互作用的中和的ELISA。

表8

针对Ang1直向同源物的血管生成素抗体的生化效价

测量对配体/受体相互作用的中和的ELISA。

实施例4：

在Colo205肿瘤异种移植物中的血管生成素抗体的活性

在Colo205人结肠直肠癌异种移植模型中评估了三种抗体(H6L7、H4L4和H4L11)。对于每个研究组，对小鼠右协处经皮下注射Matrigel^TM中的2x106个细胞。将具有300mm3平均肿瘤体积的十只动物随即分配到每个实验组。在植入后第17天开始，用300μg的血管生成素靶向的抗体或同种型对照抗体每周IP注射动物两次。在这个模型中将AMG 386以每周两次14μg(SC)的最适生物剂量(OBD)作为阳性对照加入，并将抗体536LC1以300μg每周两次加入。每周两次测量体重和肿瘤尺寸。

如在图1中所示，与用同种型对照抗体处理相比，所有三种抗体显著抑制肿瘤生长(p＜0.0001)。相比于536LC1，用H6L7和H4L4处理导致对肿瘤生长的显著更大的抑制。数据表示平均值±SEM。在试验结束时，收集肿瘤，在锌-福尔马林中固定并进行石蜡包埋。肿瘤的组织切片用苏木素染色。然后使用RGB阈值设定以及自动化像素计数从整个肿瘤横切面的1x数字图像评价可见的肿瘤分数。可见的肿瘤负荷被计算为可见的分数乘以最终肿瘤重量。数据表示平均值±SEM(n＝10)。图2显示，相对于对照，抗体H6L7、H4L4和H4L11也显著减少肿瘤负荷(p＜0.0001)，表明基于体积的肿瘤测量低估了抗体的抗肿瘤作用。

在图1和图2显示的研究中对来自小鼠的肿瘤和正常组织进行组织病理学。用血管生成素抑制剂(AMG 386、536LC1、H4L4、H4L11或H6L7)处理荷有异种移植物的裸鼠在非靶组织中没有引起不利的解剖效果。

实施例5

抗Ang-1和/或Ang-2抗体对内皮细胞增殖的作用

在平行实验中，用536LC1(AKA LC1)、H4L11、H4L4、H6L7、AMG386或对照IgG2处理具有近似400mm³肿瘤的动物72小时。在处死前十七小时，用含有3mg/mL BrdU的渗透微型泵植入动物。在处死后，从荷有Colo205肿瘤的小鼠中分离内皮细胞并通过流式细胞术进行分析以评定增殖。将解离的细胞用抗小鼠CD45-FITC和CD31-PE抗体染色，接着固定并用抗BrdU-alexa647抗体染色。数据表示平均值±SEM(n＝5)。如在图3中所示，用所有抗体处理显著降低了BrdU阳性细胞的百分比(与IgG2对照相比p＜0.002)。这些数据与血管生成素靶向的抗体籍以抑制体内肿瘤内皮细胞增殖的抗生成血管的治疗机制是一致的。

实施例6

在Colo205肿瘤异种移植中H4L4的剂量调整

选择抗体H4L4用于探测H4L4介导的肿瘤生长抑制的剂量依赖性的更广返的分析。用H4L4每周两次IP注射动物，在第14天开始，剂量范围从3μg到300μg。将AMG 386以每周两次14μg(SC)的最适生物剂量作为阳性对照加入。如在图4中所示，H4L4的所有剂量都显著抑制肿瘤生长和可见的肿瘤负荷(p＜0.0001)，在可见的肿瘤负荷分析中具有约30μg的OBD(图5)。

实施例7

H4L4对体内Colo205肿瘤内皮细胞增殖的作用

在一个平行实验中，具有近似450mm³的肿瘤的Colo205荷肿瘤小鼠用单剂量的H4L4、AMG 386或对照IgG2处理72小时，然后如在图3中那样进行分析。如图6所示，用H4L4处理以剂量依赖性方式显著抑制内皮细胞增殖，OBD为30μg。

实施例8

在小鼠、大鼠和食蟹猴中H4L4、H6L7、H4L11和536LC1的药物代 谢动力学

已在单剂量静脉内(IV)或腹膜内(IP)施用后的CD-1小鼠中表征了H4L4、H6L7、H4L11和536LC1的药物代谢动力学(PK)。还在单剂量IV施用的斯普拉格-道利大鼠和食蟹猴中表征了H4L4和H6L7的PK。

在单剂量IV和IP施用给小鼠之后，H4L4暴露似乎在0.1到10mg/kg剂量范围中大致与剂量成比例地增加(表4)。总体平均终末半衰期(t_1/2，z)、清除率(CL)和稳态分布体积(V_ss)分别是207小时、0.43mL/小时/kg和128mL/kg。对于所有剂量组，在IP施用后的生物利用度(％F)大于90％。相比之下，H6L7、H4L11和536LC1在小鼠中表现出非线性PK，暴露增加大于与从0.1到10mg/kg剂量成比例的增加。在大鼠和猴子中，在0.1到10mg/kg的单IV剂量之后，H6L7暴露的增加也大于与剂量成比例的增加。

与小鼠中的线性PK概况相比，H4L4表现出非线性大鼠和猴子PK。在大鼠中的平均停留时间(MRT)范围从57到217小时；CL范围从0.3到1.4mL/小时/kg；V_ss范围从57到68mL/kg。在猴子中，MRT范围从40到163小时；CL范围从0.4到1.9mL/小时/kg；V_ss范围从49到75mL/kg。

在一项药理学研究中还在荷有Colo205肿瘤异种移植物的裸鼠中评定了H4L4的PK，每只小鼠以3、10、30、100或300μg的剂量每周IP施用两次持续4周。血清H4L4暴露大致与剂量成比例地提高，如通过血清波谷浓度所评定的。在裸鼠中H4L4的PK与在CD-1小鼠中观察到的PK相似，并且PK似乎并不随时间改变。

表9

H4L4和H6L7在临床前物种中的PK参数

实施例9

血管生成素1的中和介导血管发生和肿瘤生长的背景依赖性抑制

尽管血管生成素2(Ang2)是出生后血管发生的关键介体，但血管生成素1(Ang1)在此背景下的作用却不太清楚。为了调查Ang1的出生后功能，我们已经开发了抑制Ang1与它的受体Tie2之间的相互作用的有效的和选择性肽体(肽Fc融合蛋白)。我们显示选择性Ang1拮抗作用在血管发生相关疾病(癌症和糖尿病性视网膜病)的模型中不具有独立作用，但它能够在正常的幼年大鼠中诱导卵巢萎缩并在激素诱导的排卵模型中抑制卵泡血管发生。出人意料地，当与Ang2抑制剂组合时，Ang1抑制剂的活性似乎在一些疾病模型中被揭露。Ang1和Ang2的双重抑制协同阻遏卵泡(ovarian follicular)血管发生和肿瘤异种移植物生长；然而，Ang1抑制作用不能增进Ang2抑制作用在阻遏肿瘤内皮细胞增殖、角膜血管发生和氧诱导的视网膜血管发生中的活性。Ang1抑制作用绝不会显示出1)提供优于Ang2抑制作用或双重Ang1/Ang2抑制作用的活性或者2)拮抗Ang2抑制作用的影响。这些结果暗示Ang1在促进出生后血管发生和血管发生相关病理中起背景依赖性作用。

Ang1在发育性血管发生中起重要作用，但是它在出生后新生血管形成中的功能不太清楚。Ang1已显示在多种出生后背景中介导促生成血管作用和抗生成血管作用。通过抑制内源性Ang1调查Ang1的功能。为了此目的，我们已开发Ang1中和肽体并且在出生后血管发生的临床前模型中单独或联合Ang2抑制剂对它们进行测试。

我们产生了Ang1中和肽体来调查Ang1在血管发生中的功能作用。淘选噬菌体展示肽文库来鉴定结合Ang1但不结合Ang2的肽。通过在大肠杆菌中将肽表达成与人IgG1的Fc部分的融合体，将得到的克隆转变为肽体。然后通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和均相时间分辨荧光(HTRF)测定对肽体中和Tie2与血管生成素之间的相互作用的能力进行筛选。使这些肽体之一亲和力成熟以提高其拮抗Ang1的能力，并选择得到的肽体mL4-3用于本文的研究。mL4-3表现出抗几种Ang1直向同源物的相似效力，并且它展示出超过Ang2大于40,000倍的选择性(表10和表11)。还在表10中显示之前所示的肽体：AMG 386[也称为2xCon4(C)]和L1-7(N)。L1-7(N)是一种非常强效的且选择性的Ang2抑制剂，并且AMG 386是一种Ang1和Ang2的双重抑制剂。mL4-3在啮齿类中的药物代谢动力学概况从每天到每周皮下给药是可接受的(表3)。

mL4-3可用作检查Ang1体内功能的试剂。为了评定mL4-3是否能够选择性地使Ang1在体内隐退，mL4-3、L1-7(N)和Fc皮下施用给小鼠，接着用重组的Ang1静脉内攻击。Ang1诱导小鼠肺内皮中的Tie2磷酸化(大约5倍)，这是可能被mL4-3阻止但不被L1-7(N)或Fc阻止的作用(图7)。

接下来，我们想要确定是否mL4-3能够在Ang1已知起生理相关作用的背景下中和内源性Ang1。发育基因敲除研究已经显示Ang1缺失减少了胚胎的心脏大小和心内膜折叠。尝试在药理学上重复这种表型，将mL4-3施用给早期和中期妊娠的怀孕小鼠。在胚胎第12.5天收集胚胎，在这个时间观察在Ang1裸鼠胚胎中的致死率。小鼠胚胎裂解物的药物代谢动力学评定显示平均mL4-3低谷水平为3.0μg/g组织，证实mL4-3能够穿过胎盘。组织学分析揭示了减少的心脏大小和小梁，这与在Ang1裸胚胎中观察到的相似，但不如其明显(图8)。mL4-3处理的胚胎的较不显著的表型可能是次佳胚胎mL4-3暴露和不完全的Ang1隐退的结果。尽管如此，mL4-3清楚地诱导为Ang1基因敲除小鼠的拟表型的胚胎心脏缺陷，证实mL4-3作为调查Ang1体内功能的试剂的效用。

Ang1拮抗作用在阻遏肿瘤生长中增进了Ang2拮抗作用。在之前的报道中，我们证明系统施用的L1-7(N)和AMG 386能够抑制植入到裸鼠中的Colo205肿瘤异种移植物的生长。在那项研究中，AMG 386的抗肿瘤作用稍微优于L1-7(N)的抗肿瘤作用(P＝0.006)。为了证实双重Ang1/Ang2抑制提供比单独的Ang2抑制更好的肿瘤生长阻遏，进行了相似的实验，但是这次还测试了用mL4-3或mL4-3与L1-7(N)的组合处理的组(图9)。AMG 386处理组和mL4-3/L1-7(N)组合处理组显示了相当的抗肿瘤效力；此外，两组表现出的效力均胜过由单独的L1-7(N)或mL4-3介导的效力。事实上，mL4-3对肿瘤生长没有可识别的单剂作用，暗示将Ang2拮抗作用与Ang1拮抗作用相组合可能揭示了对Ang1抑制的抗肿瘤作用。这些实验的另外的重复证实AMG 386和mL4-3/L1-7(N)组合比单独的L1-7(N)介导更大的肿瘤生长阻遏作用(未显示数据)。然而，在少数情况下，这些不同并没有达到统计显著性，或许反映出由双重Ang1/Ang2抑制提供的胜过选择性Ang2抑制的优点增加的微妙性质。选择性Ang1抑制本身在任何它被测试的实验中都没有抗肿瘤作用(图9并且未显示数据)。

Ang2拮抗作用而不是Ang1拮抗作用抑制肿瘤内皮细胞增殖、角膜血管生成和视网膜血管发生。我们之前显示双重Ang1/Ang2抑制能够阻遏Colo205肿瘤内皮细胞的体内增殖。为了调查这种作用是否是通过Ang1抑制、Ang2抑制或二者的组合提供，用mL4-3、L1-7(N)、mL4-3/L1-7(N)或AMG 386处理荷有Colo205肿瘤的小鼠。因为对于在之前章节中描述的肿瘤体积读数来说，mL4-3对肿瘤内皮细胞增殖没有单剂作用，而L1-7(N)有抑制作用(图10A)。然而，奇怪的是，双重Ang1/Ang2抑制没有提供比单独的Ang2抑制更大的对内皮细胞增殖的作用(图10A)，观察结果已被重复地再现(数据未显示)并且与组合的Ang1/Ang2抑制对Colo205肿瘤生长的表观协同作用相反。这种不相似性暗示内皮细胞增殖的阻遏只是由血管生成素拮抗作用所介导的肿瘤生长抑制之下潜在的一个因素。

接下来在眼睛血管发生的两个模型中测试了这些药剂，一个涉及角膜而另一个涉及视网膜。角膜通常是无血管的，但是在诸如角膜炎和角膜移植排斥这些病况之后，角膜中能够发生病理性血管发生。使用VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的角膜血管发生模型来测试Ang1和Ang2拮抗作用在新血管形成中的作用。如对内皮细胞增殖所观察到的那样，角膜血管发生似乎依赖于Ang2但不依赖于Ang1(图10B和10C)。相同的结论可以从Tie2依赖性视网膜血管发生模型中的这些拮抗血管生成素的肽体中得出，在所述模型中新生血管形成是由环境氧张力的改变诱导的(图10D)。因此，在三个临床前背景下(内皮细胞增殖、角膜血管发生和视网膜血管发生)，Ang2抑制引人注目地阻遏新血管形成，而Ang1抑制单独或在与Ang2抑制的组合中没有作用。

Ang1或Ang2的选择性抑制诱导卵巢萎缩，但不诱导骺板增厚。为了评定血管生成素抑制在正常动物中的作用，用mL4-3、L1-7(N)或AMG 386系统地处理大鼠一个月。已观察到AMG 386(像VEGF拮抗剂)诱导骺板增厚和卵巢萎缩，其被认为是基于机制的抗生成血管治疗的结果的作用。在本研究中，AMG 386在所有处理的动物中引起骺板增厚，而值得注意的是，L1-7(N)和mL4-3不能在任何大鼠中改变骨骺的形态(表13)。因此，骺板增厚的诱导似乎需要同时抑制Ang1和Ang2两者。在明显对比中，所有三种肽体以相似的发病率产生卵巢萎缩，表明对Ang1或Ang2的选择性抑制足以诱导卵巢萎缩。

Ang1和Ang2抑制剂协同抑制卵泡血管发生。为了更好地理解血管生成素抑制对卵巢的作用，我们采用激素诱导的卵泡血管发生模型，该模型允许对之前从未排卵的小鼠中新生血管形成的受控的评定。在这个模型中，使用孕马血清(PMS)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)来诱导多个卵泡中快速的、同步的排卵(图11)。用Fc对照、mL4-3、L1-7(N)或mL4-3/L1-7(N)组合系统处理小鼠来确定这些药剂对在转化Graafian卵泡中的新血管形成的作用。在不同的日子进行这个实验的两个完全相同设计的重复，并且值得注意的是，二者在血管面积的百分比抑制上产生了几乎相同的活性特征(重复1、重复2)：L1-7(N)(8％、11％)、mL4-3(15％、14％)、mL4-3/L1-7(N)(24％、26％)。除了实验1中的L1-7(N)组以外，所有单剂和组合肽体组介导相对于Fc对照的统计学上显著的血管发生抑制(P＜0.05)(图11)。因此，卵巢血管发生的抑制和卵巢萎缩的诱导可以通过抑制Ang1、Ang2或二者而引起，这与观察到的卵巢萎缩是由于失败的新血管发育的意见是一致的。

我们证明Ang1抑制在临床前疾病模型和正常动物中的血管发生的抑制中起背景依赖性作用。在子宫内，药理学Ang1抑制部分地模拟Ang1的遗传消融(genetic ablation)表型，这与Ang1在发育的血管发生中的重要作用是一致的。出生后，选择性Ang1拮抗作用抑制卵巢血管发生并诱导卵巢萎缩，这些作用也可以通过抑制单独的Ang2或Ang1加Ang2一起来实现。然而，在出生后的疾病模型中，Ang1抑制对它本身有很少的作用，尽管它的生物活性在与Ang2抑制作用组合在一起时似乎在某些背景下被揭露。在这些背景下对Ang1不同的依赖性潜在的机制仍有待确定。

卵巢(凭借它在生殖循环中的作用)是经历成人中的正常血管发生的少数几个器官之一。基于Ang1和Ang2在激素诱导的排卵大鼠中的卵巢表达类型，已提出Ang2在血管侵入的早期起作用，并且Ang1起较晚的作用以使新形成的血管成熟。在这个假设之下，Ang1和Ang1执行相反的功能，其中Ang2最初从Tie2替换Ang1，导致血管不稳定和血管发生。当Ang1将Ang2从受体中逐出以重新建立血管静止和稳定性时这种可塑性状态随后被逆转。与这个模型有冲突，来自当前研究的数据暗示Ang1和Ang2在卵巢中都起促生成血管的作用。

在Colo205肿瘤异种移植模型中，Ang1和Ang2的拮抗作用介导的肿瘤抑制作用比通过单独抑制Ang1或Ang2所达到的抑制作用大，表明这个模型依赖于两种血管生成素。然而，在同一个模型中，只有Ang2抑制能够下调肿瘤内皮细胞增殖，表明Ang1抑制不涉及这个功能。这两个终点对Ang1不同的依赖性说明了什么？一个可能性是Ang1抑制对肿瘤细胞具有直接作用。然而，考虑到Ang1和Ang2的双重抑制剂AMG 386对培养的Colo205肿瘤细胞的体外生长没有作用，这个可能性似乎不可能。第二个可能性是Ang1拮抗作用起抗血管形成的作用，所述作用不是通过对内皮细胞增殖的抑制提供的，而是通过可能影响功能(例如内皮细胞迁移或侵入)的机制提供的。如果Ang1和Ang2通过Tie2介导在质量上或在数量上不同的信号，或者如果Ang1通过不响应Ang2的另外的受体发信号的话，则这种解释可能是适用的。第三个可能性是Ang1通过非内皮细胞(例如表达Tie2的单核细胞(TEM))上的Tie2发信号。TEM被募集到肿瘤，在那里它们群集在新血管周围。TEM在荷有肿瘤的小鼠中的选择性消融阻遏肿瘤血管发生并抑制肿瘤生长，并且已推测TEM通过提供刺激新血管的旁分泌信号促进肿瘤血管发生。或许Ang1刺激TEM以释放除了血管生成素以外的促生成血管的细胞因子。在这种背景下，Ang1的抑制可能具有间接的抗新血管作用，所述间接的抗新血管作用可能补充Ang2抑制的直接的抗血管形成作用。

与Ang1抑制的微妙的且背景依赖的作用相反，Ang2抑制常常介导与由Ang1和Ang2的联合的拮抗作用提供的作用等同或几乎等同的作用，暗示Ang2可能是参与出生后血管发生的优势的血管生成素。Ang1似乎是参与出生前血管发生的优势的血管生成素，表明出生时间前后对这两种因子的依赖性的转移。我们的抑制剂没有拮抗Ang4，但是考虑到这个因子肺限制性表达模式，它的功能关联性是不清楚的。

Ang1和Ang2已显示在体外和体内系统中起相似和相反的功能作用。不能通过多个刊物在这点上得出一致结论可能部分地是由于检验问题的条件不同。这些不同包括评估：1)体外系统对体内系统、2)出生前血管发生对出生后血管发生、3)不同的血管床、4)病理性血管发生对正常的血管发生、以及5)功能获得的实验设计对功能损失的实验设计。这种最终的不同可能是特别重要的，因为将外源因素加入到模型系统中可能是比移除外源因素生理学上相关性小的解释功能的手段。或许在这点上最能提供信息的公开实验是在啮齿类种系中Ang1和Ang2已被基因缺失的那些实验。这些研究提供了对Ang1和Ang2的发育作用的重要见解。然而，在不利用条件性基因敲除系统的条件下，在遗传上检验Ang1和Ang2的出生后体内功能更为困难；组成型Ang1敲除小鼠在子宫中死亡(如同对某些品系背景的组成型Ang2敲除一样)，并且存活的Ang2敲除小鼠的出生后表型可能受发育基因缺失的残留影响。通过使用药理学Ang1和Ang2抑制剂来检验Ang1和Ang2在体内的出生后作用，我们已经规避了这些问题。当前研究的结果暗示Ang1和Ang2在出生后系统中并非彼此在功能上相反，并且在某些情况下，它们似乎协同起作用。

病理性血管发生与许多疾病中的血管生成素水平改变有关，所述疾病包括癌症、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、类风湿性关节炎、骨性关节炎以及银屑病。在这些治疗适应症中的血管生成素靶向干预可能提供临床益处。本文呈现的数据表明在某些背景下，Ang1和Ang2的联合抑制可能提供胜过单独靶向Ang2介导的治疗效力的治疗效力。

方法

Ang1结合肽的噬菌体展示选择。三种丝状噬菌体文库TN8-IX(5x10⁹个独立的转化子)、TN12-I(1.4x10⁹个独立的转化子)以及Linear(2.3x10⁹个独立的转化子)(Dyax Corp.，Cambridge，MA)用于选择结合Ang1的噬菌体。在对2％牛血清白蛋白(BSA)封闭的空链霉抗生物素Dynabeads(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)或载有生物素酰化的Ang2的珠子((R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)进行阴性选择后，将剩余的噬菌体与载有生物素酰化的Ang1的珠子(R&D Systems，Inc.)一起孵育。在广泛的洗涤后，使用100mM三乙胺溶液(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)以非特异性方式洗脱每轮选择的噬菌体。将洗脱的噬菌体在大肠杆菌菌株XL-1Blue MRF’中扩增，通过沉淀来纯化，然后用于下一轮选择。

在三轮选择之后，分离单个的噬菌体克隆并且通过噬菌体ELISA和DNA测序进行分析。简言之，将Ang1蛋白包被在96孔Maxisorp板(Nunc brand，Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)上，并且用含有4％脱脂乳的PBST(具有0.05％Tween-20的PBS)封闭。在孔中孵育噬菌体上清液，并且用HRP缀合的抗M 13抗体(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)检测结合的噬菌体。为了检查对Ang2或链霉抗生物素的交叉反应性，以相似方式处置对照板。ELISA结果和DNA测序数据被用作选择以肽体形式表达的肽序列的标准。在HTRF测定中评估了肽体，并且选择若干肽体用于亲和力成熟。

通过产生和淘选核苷酸掺杂的噬菌体展示文库来进行肽亲和力成熟。获得了具有超过1x10⁹个独立转化子的文库。通过类似于淘选初级文库所用的程序来淘选这些关注的文库。

肽的表达和纯化。如在Oliner，J.，等人2004.，Cancer Cell 6：507-51中所述那样表达并纯化肽体mL4-3。mL4-3的氨基酸序列如下，其中加粗斜体的Fc表示在Oliner，J.，等人2004.，Cancer Cell 6：507-516中所述的人IgG1 Fc序列：

MREWTEEMQVIFDAMMFGPRNDRGGSGSATGSGSTASSGSGSATHREWTEEMQVIFDAMMFGPRNDRGGGGG-Fc(SEQ ID NO：47)

肽体mL4-3的Fc部分的氨基酸序列如下(从氨基端到羧基端)：DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：48)

血管生成素：Tie2中和HTRF测定。将铕标记的链霉抗生物素(LANCE试剂，PerkinElmer Inc.，Boston，MA)与生物素酰化的人Ang1(R&D Systems，Inc.)或Ang2在HTRF缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5、100mM NaCl、0.05％Tween 20、0.1％BSA)中混合并且在室温下于黑暗中振荡器上孵育30分钟。将等体积的以上混合物与系列稀释的肽体或Fc混合并且在室温下孵育1小时。将等体积的缀合别藻蓝蛋白的Tie2-Fc(Tie2-APC )(Prozyme，San Leandro，CA)与以上混合物相混合并且在室温下孵育2小时。在该测定中试剂的终浓度是4nM铕链霉抗生物素、2nM生物素酰化的Ang1或Ang2以及5nM Tie2-APC。将肽体从10,000nM系列稀释到0.5nM或者从100nM系列稀释到0.005nM以产生完全滴定曲线。血管生成素：Tie2相互作用的中和是通过在APC与铕之间减少的能量转移来测量的，并且是使用Rubystar读板仪(BMG Labtechnologies，Offenberg，Germany)来定量的。血管生成素/Tie2中和的效价是通过计算关于最大抑制对照(在测定混合物中无血管生成素)和最小抑制对照(在测定混合物中无肽体)的每种肽体稀释度的百分比抑制来确定的。IC₅₀值是通过使用XLfit4对百分比抑制作图而计算出的，其中拟合＝A+((B-A)/(1+((C/X)^D)))(IDBS，Guildford，UK)。

血管生成素：Tie2中和ELISA。在37℃用293T细胞条件培养基(DMEM/50ug/ml BSA)中的一组重组血管生成素包被九十六孔微量滴定板1小时。以一定血管生成素浓度使用条件培养基，所述血管生成素浓度提供与1nM hTie2-Fc(重组的hTie2-Fc，目录号313-TI，R&D Systems Inc.)的最大可达到70％的结合。用PBS/0.1％Tween-20将板洗涤三次，然后用PBS/5％BSA在室温下封闭2小时。除去封闭溶液而不洗涤板。将在1nMTie2-Fc/1％BSA/PBS溶液中系列稀释的mL4-3或Fc加至血管生成素包被的板，将这些板在室温下孵育过夜，然后用PBS/1％Tween-20洗涤。将获自小鼠的抗Tie2抗体(目录号557039，BD Pharmingen Inc.，San Jose，CA)以1ug/ml的终浓度加至每个孔并且在室温下孵育1小时。然后用PBS/0.1％Tween-20将板洗涤3次。将山羊抗小鼠IgG-HRP(缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠抗体，目录号31432，Pierce，Rockford，IL)以在PBS/1％BSA中的1∶10,000的稀释度加至每个孔，并且将板在室温下孵育1小时。在加入TMB底物(SureBlue Reserve TMB，目录号53-00002，KPL，Gaithersburg，Maryland)之前用PBS/0.1％Tween-20将板洗涤三次，并且在读板仪(SpectraMax，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上测量650nM的光密度。血管生成素：Tie2中和的程度(IC₅₀)是根据使用XLfit的Tie2标准曲线(在不存在竞争物的条件下系列稀释的Tie2的结合活性)的比较来确定的。

动物研究。所有的程序是被安进动物照管和使用委员会(Amgen Animal Care and Use Committee)批准的，并且符合实验动物评估认证管理委员会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)的标准。

药物代谢动力学评定。三只CD-1小鼠接受3.2mg/kg的mL4-3的单次皮下注射，并且两只斯普拉格-道利大鼠接受10mg/kg的mL4-3的单次静脉注射。从小鼠中采集血样直至274小时并且从大鼠中采集血样直到336小时，用于血清药物代谢动力学评定。在来自每个物种的血清样品中的mL4-3浓度是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量的。用人Ang1包被聚苯乙烯96孔板，接着用含有mL4-3的血清样品孵育。在洗掉任何未结合的物质之后，将辣根过氧化物酶标记的单克隆小鼠抗IgG1抗体加至孔中。在除去任何未结合的单克隆抗体的洗涤步骤之后，将TMB-过氧化物酶底物加至孔中。通过与同时分析的标准曲线进行比较，将在450-650nm测量的光密度单位转变为浓度。

通过单独的血清浓度-时间数据的无房室分析(WinNonlin Professional，3.3版；Pharsight Corp，Mountain View，CA)计算出药物代谢动力学参数。将终末阶段半衰期(t_1/2)计算为t_1/2＝ln(2)/λ_z，其中λ_z是通过终末对数线性衰减阶段的线性回归估算的一级终末阶段消除速率常数(frst-order terminal phase elimination rate constant)。在血清浓度-时间曲线下的面积(AUC_0-最后)是通过从时间0到最后可定量的浓度(C_最后)的时间的线性/对数梯形法估算的。从0到无穷大的AUC_0-无穷大被估算为AUC_0-无穷大＝AUC_{0- 最后}+C_最终/λ_z。AUC_0-无穷大值被标准化成1mg/kg剂量。

因为mL4-3、L1-7和AMG 386的药物代谢动力学特性是不相似的，所以在可能时选择每种剂的剂量水平和方案以达到药理学研究中的等摩尔血清稳定状态浓度C_min。

向怀孕小鼠施用mL4-3。两组六只129/SV雌性小鼠由C57BL/6雄性小鼠受孕。受孕的雌性小鼠以300mg/kg Fc对照或mL4-3通过在妊娠日子E4.5、E7.5和E11.5皮下施用来给药。在第E12.5天移去孕体(胚胎和胎盘)，评估总的异常，并通过浸入IHC-锌(mL4-3处理的，n＝10；Fc对照处理的，n＝10)或鲍音液(mL4-3处理的，n＝5；Fc对照处理的，n＝6)中来固定。石蜡包埋的组织通过心脏(纵向和横向两个方向的胚胎)和胎盘的中部以50-μm间隔被一步切开。将每个间隔的连续切片用苏木素和曙红(H&E)染色或者用常规的间接免疫组织化学程序染色，使用多克隆抗CD31(大鼠抗小鼠单克隆MEC 13.3，BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)来特异性标记血管。用于评价变化的标准是通过评估具有预知处理的切片来建立。随后，使用分级量表(最小的、轻的、中等的或显著的)和盲分析范例快速对损伤严重度分级。这些有序的病理学数据是使用包含在JMP统计学软件包(v.5.1；SAS Institute Inc.，Cary，NC)中的卡方检验来分析的。在第E12.5天从每个受孕的母鼠收集的胚胎通过ELISA分析，使用人Ang1作为捕获试剂以及辣根过氧化物酶标记的单克隆小鼠抗IgG1抗体作为检测试剂。

Tie2磷酸化的测定。选择性血管生成素抑制剂对小鼠肺中Ang1诱导的Tie2磷酸化的作用是如以下文献中所述进行的：Hodous，B.L.，等人2007.，J.Med.Chem 50：611-626)。简言之，用Fc对照(20mg/kg)、mL4-3(20mg/kg)或L1-7(N)(2mg/kg)每天一次皮下处理CD-1裸鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)持续23天。然后通过静脉注射重组Ang1(R&D Systems Inc.)施用小鼠12μg。十五分钟后，收集小鼠的肺，并且通过免疫沉淀-蛋白质印迹分析确定磷酸化Tie2的水平。使用方差分析(ANOVA)接着是使用StatView 5.0.1软件(SAS Institute Inc.)的Fisher事后检验来进行统计学分析。结果被表达为平均值±标准误差(SE)。

肿瘤异种移植模型。在所有实验中使用了8到10周龄的雌性CD1裸鼠(Charles River Laboratories)。以三分之一体积基质胶(BD Biosciences，San Jose，CA)中的2x10⁶个Colo205细胞皮下注射小鼠。一旦确立肿瘤，通过皮下注射施用肽体或Fc对照。AMG 386被每周给药两次；另外的肽体和Fc对照每天给药一次。在必要时，将Fc对照蛋白加至处理组以匹配在组合组中递送的蛋白的总量(5.2mg/kg)。肿瘤测量和体重被每周记录两次。所有的肿瘤研究是以盲方式进行的。肿瘤体积被计算为长度×宽度×高度，单位为mm³。结果被表达为平均值±SE。使用重复测量方差分析(repeated measures analysis ofvariance)接着是使用StatView 5.0.1软件(SAS Institute Inc.)的Scheffé事后检验来进行统计学分析。

肿瘤内皮细胞增殖测定。肿瘤内皮细胞增殖是如之前所述那样测定(Oliner，J.，等人2004.，Cancer Cell 6：507-516)。简言之，荷有Colo205肿瘤的小鼠用肽体系统地处理72小时，并在安乐死之前16小时植入含有3mg/mL BrdU的渗透泵。肿瘤被收集、分离、固定并染色以允许确定在肿瘤内皮细胞中BrdU的加入。使用不成对的t检验进行统计学分析。

角膜血管发生模型。如在Coxon，A.，等人.Arthritis Rheum 46：2604-2612，2002中所述在雌性CD大鼠(每组n＝8)进行VEGF和bFGF诱导的血管发生研究。白细胞介素1而不是肿瘤坏死因子的抑制阻遏了角膜血管发生和佐剂性关节炎的大鼠模型中的新生血管形成。在手术之前一天开始用Fc(60mg/kg)、L1-7(N)(5mg/kg)、mL4-3(60mg/kg)或L1-7(N)与mL4-3的组合(以单剂组使用的相同剂量)处理并且持续到第3天和第6天。在第8天终止研究并对角膜拍照，如所述那样(Oliner，J.，等人.2004.，Cancer Cell 6：507-516)。对于每个角膜图像，在植入的盘和缘之间的中点相交的血管的数目被计数。所有的评估是以盲方式进行的。统计学意义是通过ANOVA接着是Fisher事后检验来评定的。

视网膜新生血管形成。局部缺血视网膜病是使用由Smith等人.，Invest.Ophthalmol Vis Sci 35.：101-111，1994描述的方法在C57BL/6J小鼠中产生的。将出生后7天(P7)的幼鼠和它们的妈妈放在含氧量高的室(75±0.5％氧气)中持续5天，然后返回到室内空气持续另外5天(每组n＝7只幼鼠)。将室的温度维持在20℃和22℃之间，并且通过一个氧气控制设备(与E702型氧气传感器偶联的P110型ProOx，Biospherix Ltd，Redfield，NY)恒定地控制氧气。具有P7幼鼠的一个笼子保持在室内空气中(含氧量正常条件)。在P8开始，每天一次皮下施用Fc对照(200mg/kg)、mL4-3(100mg/kg)、L1-7(N)(100mg/kg)或mL4-3/L1-7(N)组合(各100mg/kg)持续九天。从P8到P11，使用获得进入室的机会的通道施用注射。在P17，将幼鼠处死并将它们的眼睛取出，使用Davidson固定剂固定。然后使用标准方法将眼睛加工到石蜡中。平行于光轴以100-μm间隔切割逐层切片。将这些块完全切片，产生每只眼睛15或16个切片。所有的切片用H&E染色。在逐层切片系列中15或16个玻片中，将中间的10个连续玻片用于分析，托起光轴的任一侧。就每个切片而言，在内界膜的玻璃体端的血管细胞核(内皮和周皮细胞的细胞核)的数目被计数。记录了单个玻片计数，并对每只动物所有十个切片计数求和。在每个研究组中五只小鼠被计数。所有的技术以盲方式进行，没有获知处理条件。统计学分析是通过ANOVA接着是Fisher事后检验来进行的。

卵泡的血管发生。使用标准方法在研究的小鼠中诱导了超排卵。简言之，用5-7IU PMS注射四周龄雌性C57BL/6J小鼠，有效地重设定发情周期。四十八小时后，用5IU的HCG注射小鼠以诱导超排卵。然后对雌性小鼠进行人工繁殖(faux-bred)并使其保持研究持续24小时。研究小鼠用肽体每天处理两次。在最初PMS注射时开始给药并且持续连续的两天，第四次给药同时给予HCG注射。在HCG注射后48小时使小鼠安乐死。取出右侧和左侧卵巢并将其浸没固定在冷的锌tris溶液中。在48小时后，将卵巢转移至70％乙醇并且使用标准方法加工到石蜡中。从每对卵巢中切下两个连续的切片，并且各自用H&E染色或使用DAB作色原体对血管内皮免疫染色(CD31，大鼠抗小鼠单克隆MEC 13.3，BD Biosciences Pharmingen)。另外，苏木素对抗CD31IHC切片进行轻微复染。基于转染的状态来鉴定被选定用于分析的单个卵泡。这是通过在低功耗下对H&E切片的盲处理检查而确定的。然后在可行时以10x目镜放大从抗CD31免疫染色的切片中捕获每只动物十个转化的卵泡的对应图像。卵泡切片区域被描绘为ROI，并且使用MetaMorph图像分析软件(MetaMorph v6.1，UIC，Downingtown，PA)通过RGB阈值设定来确定CD31阳性区域分数。统计学分析是通过ANOVA接着是Dunnett事后检验来进行的。

在处理的大鼠中正常组织的评估。在斯普拉格-道利大鼠(Charles River Laboratories)中评估了肽体对正常组织的作用。动物每周两次静脉内接受300mg/kg的AMG 386、L1-7(N)或mL4-3持续28天(每组n＝10只动物)。在安排好的尸体剖检中，一个完全的组织集合(tissue set)被切片、染色并观察显微镜下的变化。

表10

肽体完全抑制血管生成素：Tie2相互作用

h，人

表11

mL4-3选择性中和Ang1：Tie2相互作用

H，人；m，小鼠；r，兔子；c，食蟹猴

表12

在小鼠和大鼠中的血管生成素抑制剂的平均药物代谢动力学参数

^a从Oliner等人(18)改编。

表13

Ang1或Ang2的选择性抑制诱导卵巢萎缩但是不诱导骺板增厚

每组n＝10

Claims (17)

1.一种分离的抗体，所述分离的抗体包含具有选自由以下组成的组的序列的重链可变结构域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1配体和Ang2配体中的至少一种特异性结合。

2.一种分离的抗体，所述分离的抗体包含具有选自由以下组成的组的序列的轻链可变结构域：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1配体和Ang2配体中的至少一种特异性结合。

3.一种分离的抗体，所述分离的抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述重链包含3个CDR并且所述轻链包含3个CDR，其中所述抗体的所述CDR的序列选自由以下组成的组：

(a)HC的SEQ ID NO：18、26、32加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(b)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(c)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：20、27、36；

(d)HC的SEQ ID NO：18、26、37加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(e)HC的SEQ ID NO：18、26、38加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(f)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(g)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：21、27、33；

(h)HC的SEQ ID NO：18、28、39加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(i)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：22、27、33；

(j)HC的SEQ ID NO：18、26、32加上LC的SEQ ID NO：22、27、33；

(k)HC的SEQ ID NO：18、29、39加上LC的SEQ ID NO：19、27、33；

(l)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：23、27、33；

(m)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：20、27、40；

(n)HC的SEQ ID NO：18、26、32加上LC的SEQ ID NO：21、27、33；

(o)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：24、27、33；

(p)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：21、27、33；

(q)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：23、27、33；

(r)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：20、30、33；

(s)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：25、27、33；

(t)HC的SEQ ID NO：18、26、35加上LC的SEQ ID NO：20、30、33；

(u)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：20、27、40；和

(v)HC的SEQ ID NO：18、26、34加上LC的SEQ ID NO：20、31、33；

其中所述抗体与Tie 2受体的Ang1配体和Ang2配体中的至少一种特异性结合。

4.如权利要求3所述的分离的抗体，其中所述抗体选自由以下组成的组：H6L7、H5L7、H4L13、H11L7、H10L7、H4L7、H5L6、H2L7、H5L8、H6L8、H3L7、H5L4、H4L12、H6L6、H4L2、H4L6、H4L4、H5L11、H5L1、H4L11、H5L12和H5L9。

5.如权利要求4所述的分离的抗体，所述分离的抗体是全人抗体。

6.权利要求3所述的抗体的抗体片段，所述抗体片段包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的CDR区：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：40。

7.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码权利要求1或权利要求6所述的抗体或抗体片段。

8.一种载体，所述载体包含权利要求7的核酸分子。

9.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求8所述的载体。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，所述宿主细胞是CHO细胞。

11.一种制备权利要求4所述的抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述抗体。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述宿主细胞是CHO细胞。

13.一种药物组合物，所述药物组合物包含与相应的药学上可接受的载体混合的、选自由以下组成的组的抗体中的任一种：H6L7、H5L7、H4L13、H11L7、H10L7、H4L7、H5L6、H2L7、H5L8、H6L8、H3L7、H5L4、H4L12、H6L6、H4L2、H4L6、H4L4、H5L11、H5L1、H4L11、H5L12和H5L9。

14.如权利要求13所述的药物组合物，所述药物组合物还包含选自由以下组成的组的分子：报道分子、水溶性聚合物、抗体Fc区和细胞毒剂。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是药物配制剂。

16.一种抑制不期望的血管发生的方法，所述方法包括向需要它的受治疗者施用有效量的选自由以下组成的组的抗体中的任一种：H6L7、H5L7、H4L13、H11L7、H10L7、H4L7、H5L6、H2L7、H5L8、H6L8、H3L7、H5L4、H4L12、H6L6、H4L2、H4L6、H4L4、H5L11、H5L1、H4L11、H5L12和H5L9。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述不期望的血管发生是癌症。

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