CN101558167A

CN101558167A - 分析物和核酸的检测

Info

Publication number: CN101558167A
Application number: CNA2007800361987A
Authority: CN
Inventors: 马克·E·香农; 大卫·W·拉夫
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 2006-08-01
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2009-10-14
Also published as: US20200102592A1; US12385080B2; EP2484781A3; US8012685B2; EP3305915A1; CA2659632A1; EP2049688B1; WO2008016644A1; EP2049688A1; EP3305915B1; AU2007281535A1; EP2484781A2; US20110287436A1; EP2484781B1; BRPI0715346A2; US20150361480A1; US20080032310A1; JP2009545317A

Abstract

本发明提供了检测样品中的至少一种分析物和至少一种核酸的方法。本发明还提供了用于实施所述方法的试剂。

Description

分析物和核酸的检测

本申请要求于2006年8月1日递交的美国临时申请第60/835,118号的利益。通过引用方式将美国临时申请第60/835,118号的全部内容并入本文以用于所有目的。

技术领域

背景技术

包括Western印记、ELISA等各种检测细胞裂解物中的蛋白质的方法是本领域中已知的。包括RT-PCR等各种检测细胞裂解物中的核酸的方法也是本领域中已知的。然而，样品中所检测的蛋白质和所检测的核酸的相对量难于比较，这是因为这些样品通常是分别地、以不同方法制备的。另外，用于蛋白质和核酸的不同检测方法也会给关联它们的相对量带来困难。

发明内容

在各种实施方式中，提供了检测细胞中的至少一种目标分析物和至少一种目标核酸的方法。在各种实施方式中，提供了以下的方法，所述方法包括：在多功能性裂解缓冲液中裂解细胞从而产生细胞裂解物、利用近感检测测定法(proximity detection assay)检测所述细胞裂解物中的至少一种目标分析物、和利用核酸定量检测测定法检测所述细胞裂解物中的至少一种目标核酸。在各种实施方式中，检测至少一种目标分析物和检测至少一种目标核酸是在同一容器中进行的。

在各种实施方式中，提供了以下的方法，所述方法包括：在多功能性裂解缓冲液中裂解细胞从而产生细胞裂解物，将所述细胞裂解物与以下物质(i)、(ii)和(iii)温育：(i)至少一个近感检测探针组，其中每个近感检测探针组包括至少两种近感检测探针，并且其中每种近感检测探针包含至少一种分析物结合部分和至少一种寡核苷酸部分；(ii)至少一种夹板寡核苷酸(splint oligonucleotide)；和(iii)至少一种连接酶，由此形成至少一个经连接的近感检测探针组；将所述细胞裂解物与至少一种蛋白酶温育；检测所述至少一个经连接的近感检测探针组；和检测至少一种目标核酸。

在各种实施方式中，提供了以下的方法，所述方法包括：在多功能性裂解缓冲液中裂解细胞从而产生细胞裂解物，将所述细胞裂解物与至少一个近感检测探针组温育，其中每个近感检测探针组包括至少两种近感检测探针，并且其中每种近感检测探针包含至少一种分析物结合部分和至少一种寡核苷酸部分，由此形成至少一个经杂交的近感检测探针组；将所述细胞裂解物与至少一种蛋白酶温育；检测所述至少一个经杂交的近感检测探针组；和检测至少一种目标核酸。

在各种实施方式中，提供了多功能性裂解缓冲液。在各种实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。

在各种实施方式中，提供了用于检测至少一种目标分析物和至少一种目标核酸的试剂盒。在各种实施方式中，试剂盒包含含有至少一种化学品的至少一种多功能性裂解缓冲液，所述至少一种化学品选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO。

在各种实施方式中，提供了包含裂解液的组合物，其中所述裂解液包含多功能性裂解缓冲液和至少一个近感检测探针组，所述多功能性裂解缓冲液含有选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。

附图说明

图1显示了实施例1中所述的近感连接测定法的结果。其中给出了每种反应的循环阈值数(“平均CT”)。

图2显示了对于实施例1所述的TaqMan一步qRT-PCR反应的荧光的相对增加(ΔRn)对循环数的图。图2中只显示了FAM层。

图3显示了对于实施例1所述的实验的循环阈值数对平板定位(即TaqMan一步qRT-PCR反应)的图。图3中只显示了FAM层。

图4显示了对于实施例1所述的TaqMan一步qRT-PCR反应的荧光相对增加(ΔRn)对循环数的图。图4中只显示了VIC层。

图5显示了对于实施例1所述的实验的循环阈值数对平板定位(即TaqMan一步qRT-PCR反应)的图。图5中只显示了VIC层。

图6显示了如实施例2所述，在含有蛋白酶或不含有蛋白酶的缓冲液Na、缓冲液Nb和缓冲液Nc中制备的裂解物的琼脂糖凝胶电泳。

图7显示了对于实施例2所述的实验的循环阈值数对平板定位(即TaqMan一步qRT-PCR反应)的图。

图8显示了如实施例3所述，使用各种化学品所制备的裂解物的琼脂糖凝胶电泳。泳道1～8分别是NMP、Mackernium、Empigen、NDSB-201、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-14、TMACL和DDMAB。泳道9～16分别是CAPSO、CHAPS、LDAO、Sarkosyl、CTAB、DEDTAB、DLS和DTAB。

图9显示了如实施例3所述，使用2％NDSB-201或5mM CAPSO所制备的裂解物的各种稀释液的琼脂糖凝胶电泳。

图10显示了如实施例4所述，利用了缓冲液N裂解物的各种稀释液的平均循环阈值数(“平均CT”)对近感连接测定的图。

图11显示了如实施例4所述，在存在或不存在核糖核酸酶抑制剂的情况下在37℃温育了不同时间的细胞裂解物的琼脂糖凝胶电泳。

图12显示了如实施例4所述，在含有Tween和不含有Tween的缓冲液Na、缓冲液Nb和缓冲液Nc中的细胞裂解物的琼脂糖凝胶电泳。

图13显示了如实施例4所述，在缓冲液N中与各种浓度的核糖核酸酶A温育的细胞裂解物的琼脂糖凝胶电泳。

图14显示了如实施例4所述，在各种处理条件下、缓冲液N中的细胞裂解物的SDS-丙烯酰胺凝胶电泳。

图15显示了如实施例5所述，在缓冲液Na中与各种蛋白酶温育的细胞裂解物的琼脂糖凝胶电泳。

图16显示了如实施例5所述，在含0.2％LDAO的缓冲液Na中与各种蛋白酶温育的细胞裂解物的琼脂糖凝胶电泳。

图17显示了如实施例5所述，在缓冲液Nc中与各种蛋白酶温育的细胞裂解物的琼脂糖凝胶电泳。

图18显示了用于本文所述的某些近感检测测定法/目标核酸检测测定法的非限制性的示例性作业流程图。在该作业流程设计中，在多重扩增反应中同时检测PDA产物和mRNA。

图19显示了用于本文所述的某些近感检测测定法/目标核酸检测测定法的非限制性的示例性作业流程图。在该作业流程设计中，在蛋白酶处理前取出部分样品以用于检测PDA产物，而剩余样品采用蛋白酶处理并用于mRNA的检测。

图20显示了获得自为检测在含有0.1％鱼源明胶(fish gelatin)或1％BSA的缓冲液中的各种浓度的VEGF而进行的近感连接测定法(PLA)的示例性数据。以平均循环阈值(平均CT)对pM VEGF的形式对示例性数据进行作图。

图21显示了获得自为检测在含有0.1％鱼源明胶和各种核酸封闭剂的缓冲液中的各种浓度的VEGF而进行的近感连接测定(PLA)的示例性数据。A图显示了获得自包含多聚A、多聚dC、多聚dC+多聚dG、和在4℃储存至少2周的多聚A(对照)的近感连接测定法的示例性数据。B图显示了获得自包含多聚A、多聚dC和经剪切的小牛胸腺DNA(CFD)、和在4℃储存至少2周的多聚A(对照)的近感连接测定的示例性数据。以平均循环阈值(平均CT)对pM VEGF的形式对示例性数据进行作图。

图22显示了获得自为利用含有脱氧尿嘧啶(dU)的夹板寡核苷酸来检测各种浓度的MCP-1而进行的近感连接测定法的示例性数据。所述测定法以下述方式进行：在检测连接产物之前，采用或不采用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理，以及经过(虚线)或不经过(实线)冻融循环。以平均循环阈值(平均CT)对pM MCP-1的形式对示例性数据进行作图。

具体实施方式

本文所用的各部分标题只是出于组织的目的，而不应被理解为是对所述主题的限制。将本文所引用的包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍和论文在内的所有文献或文献的一部分的全部内容都由此特地以参考方式引入本文以用于任何目的。在一个或多个所引入的文献或文献的一部分所定义的术语与该术语在本申请中的定义相抵触时，以本申请为准。

除非特别声明，否则单数的使用包括了复数的情况。除非特别声明，否则词语“一个”或“一种”是指“至少一个或至少一种”。除非特别声明，否则“或”的使用是指“和/或”。多项从属权利要求的情况中所使用的“或”只表示择一选择。短语“至少一个或至少一种”的含义等同于短语“一个或多于一个”或“一种或多于一种”的含义。此外，术语“包括”的使用与如“包括有”和“包括了”等其它形式，不具有限制性。另外，除非特别声明，否则如“元件”或“成分”等术语既可以包括含有一个单元的元件或成分，也可以包括含有多于一个的单元的元件或成分。

在本说明书中，除非特别声明，否则对于检测“一种”或“一个”部分(例如目标分析物)的论述，涵盖一种以上或一个以上的该部分。

本文所讨论的所有的范围均包括端点以及端点之间的所有的值。

定义

术语“核苷酸碱基”是指一种或多种经取代的或未经取代的芳香环。在某些实施方式中，所述一种或多种芳香环含有至少一个氮原子。在某些实施方式中，所述核苷酸碱基能够与合适的互补核苷酸碱基形成Watson-Crick氢键(沃森-克里克氢键)和/或Hoogsteen氢键(霍氏氢键)。示例性的核苷酸碱基及其类似物包括但不限于，天然存在的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，和天然存在的核苷酸碱基的类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮腺嘌呤、N6-Δ2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-Δ2-异戊烯基-2-甲硫代腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿嘧啶核苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、O⁶-甲基鸟嘌呤、N⁶-甲基腺嘌呤、O⁴-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氢胸腺嘧啶、5，6-二氢尿嘧啶、吡唑并[3，4-D]嘧啶(见，例如美国专利6,143,877号和6,127,121号以及PCT公布申请WO 01/38584)、亚乙烯基腺嘌呤(ethenoadenine)、诸如硝基吲哚和4-甲基吲哚等吲哚类物质、和诸如硝基吡咯等吡咯类物质。某些示例性核苷酸碱基可参见Fasman，1989，Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology，第385-394页，CRC Press，Boca Raton，Fla.以及其中所引的参考文献。

术语“核苷酸”是指包含有连接到糖的C-1′碳的核苷酸碱基的化合物，所述糖例如是核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖、和它们的糖类似物。术语核苷酸还包含核苷酸类似物。所述糖可以是被取代的，也可以是未被取代的。被取代的核糖包括，但不限于，其中一个或多于一个的碳原子(例如2′-碳原子)被Cl、F、-R、-OR、-NR₂或卤素基团中的一种或多于一种的相同或不同的取代基取代的核糖，其中每个R独立地为H、C₁-C₆的烷基或C₅-C₁₄芳基。示例性的核糖包括，但不限于，2′-(C1-C6)烷氧基核糖、2′-(C5-C14)芳氧基核糖、2′，3′-二脱氢核糖、2′-脱氧-3′-卤代核糖、2′-脱氧-3′-氟代核糖、2′-脱氧-3′-氯代核糖、2′-脱氧-3′-氨基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷氧基核糖和2′-脱氧-3′-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-二脱氧核糖、2′-卤代核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖和2′-烷基核糖，例如2′-O-甲基，4’-α-异头核苷酸、1′-α-异头核苷酸、2′-4′-和′-4′-连接的和其它″锁定的″或“LNA”，双环糖修饰物(例如见PCT公开申请WO 98/22489号、WO 98/39352号和WO99/14226号)。多核苷酸中的示例性LNA糖类似物包括但不限于以下结构：

其中B可以是任何核苷酸碱基。

核糖的2′-位或3′-位上的修饰包括但不限于氢、羟基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧基乙基、烷氧基、苯氧基、叠氮基、氨基、烷基氨基、氟基、氯基和溴基。核苷酸包括但不限于天然D型光学异构体以及L型光学异构体形式(例如见Garbesi(1993)Nucl.Acids Res.21：4159-4165；Fujimori(1990)J.Amer.Chem.Soc.112：7435；Urata，(1993)Nucleic Acids Symposium Ser.No.29：69-70)。当所述核苷酸碱基是如A或G等嘌呤时，则核糖连接到该核苷酸碱基的N⁹-位。当所述核苷酸碱基是如C、T或U等嘧啶时，则该戊糖连接到该核苷酸碱基的N¹-位，但是假尿嘧啶核苷除外，在假尿嘧啶核苷中，戊糖连接到尿嘧啶核苷酸碱基的C5位(例如见，Kornberg和Baker，(1992)DNAReplication，第二版，Freeman，San Francisco，CA)。

核苷酸的一个或多于一个的戊糖碳可以被具有下式的磷酸酯取代：

其中α是0～4的整数。在某些实施方式中，α是2并且该磷酸酯连接到戊糖的3′-或5′-碳。在某些实施方式中，所述核苷酸是其中核苷酸碱基为嘌呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶、或它们的类似物的核苷酸。“核苷酸5′-三磷酸酯”是指在5′-位具有三磷酸酯基的核苷酸，并且有时表示为“NTP”、或“dNTP”和“ddNTP”从而具体指出核糖的结构特征。该三磷酸酯基可以包括取代各种氧的硫取代基，例如α-硫代-核苷酸5′-三磷酸酯。关于核苷酸化学的综述，可见例如Shabarova，Z.和Bogdanov，A.Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids，VCH，New York，1994。

术语“核苷酸类似物”是指其中核苷酸的戊糖和/或核苷酸碱基和/或一种或多于一种的磷酸酯可以被其相应的类似物替代的实施方式。在某些实施方式中，示例性的戊糖类似物是上述的戊糖类似物。在某些实施方式中，核苷酸类似物具有上述的核苷酸碱基类似物。在某些实施方式中，示例性的磷酸酯类似物包括但不限于烷基磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、酰苯胺磷酸酯(phosphoroanilidate)、氨基磷酸酯(phosphoroamidate)、含硼磷酸酯(boronophosphate)等，并且可以包括相关的反离子。

包括在“核苷酸类似物”定义中的还有可以聚合成多核苷酸类似物的核苷酸类似物单体，所述多核苷酸类似物中DNA/RNA磷酸酯和/或糖磷酸酯骨架被不同类型的核苷酸之间的键替代。示例性多核苷酸类似物包括但不限于，肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸酯骨架被肽骨架替代。

如本文所用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可以相互替代使用，并且是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括由核苷酸之间的磷酸二酯键连接的2′-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)、或核苷酸之间的类似物，以及相关的反离子，例如H⁺、NH₄ ⁺、三烷基铵、Mg²⁺和Na⁺等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸组成、完全由核糖核苷酸组成、或由它们的嵌合混合物组成。核苷酸单体单元可以包括本文所述的任何核苷酸，包括但不限于核苷酸及核苷酸类似物。多核苷酸可以包含一种或多种损伤(lesion)。多核苷酸的大小通常从数个单体单元(例如5～40)(这在本领域中有时被称为寡核苷酸)到数千个单体核苷酸单元。除非另外指出，否则只要给出了多核苷酸序列，就应该理解为核苷酸从左到右为5′到3′的顺序，并且除非另外指出，否则“A”表示脱氧腺苷或其类似物，“C”表示脱氧胞苷或其类似物，“G”表示脱氧鸟苷或其类似物，“T”代表胸苷或其类似物。

多核苷酸可以由单一类型的糖部分组成，例如在RNA或DNA的情况中，也可以由不同的糖部分的混合物组成，例如在RNA/DNA嵌合体的情况中。在某些实施方式中，核酸是如以下结构式的核糖多核苷酸和2′-脱氧核糖多核苷酸：

其中每一个B独立地为核苷酸的碱基部分，例如嘌呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶或它们的类似物；每一个m限定了相应核酸的长度并且可以从0到数千、数万甚至更多；每一个R独立地选自由包括氢、羟基、卤素、--R″、--OR″和--NR″R″的组，其中每一个R″独立地为(C₁-C₆)烷基或(C₅-C₁₄)芳基，或者两个相邻的R可以一起成键从而使核糖为2′，3′-二脱氢核糖，并且每一个R’可以独立地为羟基或

其中α是0、1或2。

在如上所示的核糖多核苷酸和2′-脱氧核糖多核苷酸的某些实施方式中，如前所述，核苷酸碱基B共价连接到糖部分的C1′碳。

术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”还可以包括核酸类似物、多核苷酸类似物和寡核苷酸类似物。术语“核酸类似物”、“多核苷酸类似物”和“寡核苷酸类似物”可以相互替代使用，并且是指含有至少一种核苷酸类似物和/或至少一种磷酸酯类似物和/或至少一种戊糖类似物的多核苷酸。多核苷酸类似物可以包含一种或多种损伤。同样包含在多核苷酸类似物的定义之中的还有其中磷酸酯和/或糖磷酸酯键被其它类型的键替代的多核苷酸，所述其它类型的键有例如N-(2-氨基乙基)-甘氨酸酰胺和其它酰胺(见，例如Nielsen等，1991，Science 254：1497-1500；WO92/20702；美国专利5,719,262号；美国专利5,698,685号)；吗啉并(见，例如美国专利5,698,685号；美国专利5,378,841号；美国专利5,185,144号)；氨基甲酸酯(见，例如Stirchak和Summerton，1987，J.Org.Chem.52：4202)；亚甲基(甲基亚氨基)(见，例如Vasseur等，1992，J.Am.Chem.Soc.114：4006)；3′-硫代甲乙缩醛(3′-thioformacetal)(见，例如Jones等，1993，J.Org.Chem.58：2983)；氨基磺酸酯(见，例如美国专利5,470,967号)；2-氨基乙基甘氨酸(通常称为PNA)(见，例如Buchardt，WO 92/20702；Nielsen(1991)Science 254：1497-1500)；以及其它键(见，例如美国专利5,817,781号；Frier和Altman，1997，Nucl.Acids Res.25：4429以及其中所引用的参考文献)。磷酸酯的类似物包括但不限于(i)C₁-C₄烷基磷酸酯，例如甲基磷酸酯；(ii)氨基磷酸酯；(iii)C₁-C₆烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯和(v)二硫代磷酸酯。

术语“退火”和“杂交”可以相互替代使用，并且是指一种核酸与另一中核酸之间的碱基配对相互作用，该作用导致形成双链、三链或其它更高等级的结构。在某些实施方式中，基本相互作用是通过沃森/克里克氢键和霍氏氢键键合的碱基特异性，例如A/T和G/C。碱基堆叠和疏水相互作用也可以有助于双链稳定。

本申请中，关于一个序列与另一个序列相同或互补的表述涵盖两个序列完全相同或彼此互补的情况，和只是其中一个序列的一部分与另一序列的一部分或全部相同或互补的情况。这里，术语“序列”包含但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探针、引物、引物特异性部分和目标物特异性部分。

本申请中，关于一个序列与另一个序列互补的表述包括其中两个序列具有错配的情况。虽然错配，但两个序列在适宜条件下可以相互选择性地杂交。

术语“选择性地杂交”是指，对于非常相似的序列，非常相似的序列的大部分与给定的所需一种或多种序列杂交，并且非常相似序列的大部分不与其它的非所需的序列杂交。各种情况中，“非常相似序列的大部分”是指非常相似序列的总数中的一部分，而不是指单个非常相似序列中的一部分。在某些实施方式中，“非常相似序列的大部分”是指非常相似序列中的至少70％。在某些实施方式中，“非常相似序列的大部分”是指非常相似序列中的至少80％。在某些实施方式中，“非常相似序列的大部分”是指非常相似序列中的至少90％。在某些实施方式中，“非常相似序列的大部分”是指非常相似序列中的至少95％。

在某些实施方式中，可存在的错配的数量随组成的复杂性而变化。因此，在某些实施方式中，组成越复杂，则与非所需的序列杂交的可能性越大。例如，在某些实施方式中，对于给定的错配数量，当对下列二种组成均使用相同的杂交条件和洗脱条件时，探针杂交到具有整个基因组DNA的组成中的非所需序列的可能性要比杂交到具有较少DNA序列的组成中的非所需序列的可能性要大。因此，该给定的错配数量可能适合于具有较少DNA序列的组成，但更少的错配对于具有整个基因组DNA的组成可能更理想。

在某些实施方式中，如果序列具有不超过20％的错配的核苷酸，则它们是互补的。在某些实施方式中，如果序列具有不超过15％的错配的核苷酸，则它们是互补的。在某些实施方式中，如果序列具有不超过10％的错配的核苷酸，则它们是互补的。在某些实施方式中，如果序列具有不超过5％的错配的核苷酸，则它们是互补的。在各种实施方式中，如果序列具有不超过0％、1％、2％或3％的错配的核苷酸，则它们是互补的。

本申请中，关于一个序列与另一个序列杂交或结合的表述包含两个序列的全部彼此杂交或结合的情况，和只有一个序列或二个序列的一部分与另一个序列的全部或另一序列的一部分杂交或结合的情况。这里，术语“序列”包含但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探针、引物、引物特异性部分和目标物特异性部分。

本文所用的术语“引物”或“寡核苷酸引物”是指可以在适合的条件下由其合成引物延伸产物的寡核苷酸。在某些实施方式中，所述适合的条件包括：该引物与互补核酸杂交，并于适合的温度、pH、金属浓度、盐浓度等在例如核苷酸、诸如DNA或RNA聚合酶等聚合引发剂的存在下温育。在各种实施方式中，引物长5个核苷酸～100个核苷酸。在各种实施方式中，引物长8个核苷酸～75个核苷酸、10个核苷酸～60个核苷酸、10个核苷酸～50个核苷酸、10个核苷酸～40个核苷酸或10个核苷酸～35个核苷酸。

本文所用的术语“连接”是指两个多核苷酸末端的共价结合。在各种实施方式中，连接涉及一条多核苷酸的3′末端共价结合到另一条多核苷酸的5′末端的共价结合。在各种实施方式中，连接得到在多核苷酸末端之间形成的磷酸二酯键。在各种实施方式中，连接可以通过导致多核苷酸末端的共价结合的任何酶、化学品或方法介导。在某些实施方式中，连接是由连接酶介导的。

本文所用的术语“分析物”是指要使用一种或多于一种的近感检测探针检测的物质。所述物质包括但不限于，蛋白质、肽、抗体、碳水化合物、激素、小分子、细胞、微生物和可以为其开发出分析物结合部分的任何其它物质。分析物不是核酸。

本文所用的术语“目标核酸”是指被选择用于检测的RNA或DNA。示例性RNA包括但不限于，mRNA、tRNA、snRNA、rRNA、逆转录病毒、非编码的小RNA、microRNA、多核糖体RNA、mRNA前体、内含子RNA和病毒RNA。示例性DNA包括但不限于，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、核仁DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、cDNA、合成的DNA、酵母人工染色体DNA(“YAC”)、细菌人工染色体DNA(“BAC”)、其它染色体外DNA和引物延伸产物。用于检测短核酸的示例性方法，例如使用茎环引物和/或短引物的示例性方法，可参见例如Chen等的美国专利公报US 2005/0266418号和Lao等的美国专利公报US2006/0057595号。

本文所用的术语“多功能性裂解缓冲液”是指能够裂解、匀化和/或提取所选择的生物样品而基本不降解目标核酸、并同时保持适当的分析物结构从而使近感检测探针能够结合裂解物中的分析物的缓冲液。在各种实施方式中，少于1％、少于5％、少于10％、少于15％、少于20％、少于25％、少于30％或少于50％的目标核酸被降解。在各种实施方式中，至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少75％、至少70％或至少50％的目标分析物保持适当的结构从而使近感检测探针能够结合裂解物中的分析物。

在各种实施方式中，在用于进行本文所述方法的适当温度和稀释条件下，多功能性裂解缓冲液与本文所述方法相容。在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含选自NDSB-201(3-(1-吡啶并)-1-丙烷磺酸盐)、LDAO(十二烷基二甲基氧化胺)、CHAPS(3-[(3-胆氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐)、DEDTAB(溴化十二烷基乙基二甲基铵)、Zwittergent3-10(正癸基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐)和CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙烷磺酸)中的至少一种化学品。

本文所用的术语“生物样品”是指被怀疑含有目标分析物和/或目标核酸的任何样品。示例性的生物样品包括但不限于，原核细胞、真核细胞、组织样品、病毒颗粒、噬菌体、传染性颗粒、病原体、真菌、食物样品、体液(包括但不限于粘液、血液、血浆、血清、尿液、唾液和精液)、水样和来自例如水和空气的过滤物。

本文所用的“近感检测探针”是包含共价或非共价连接到至少一种寡核苷酸部分的至少一种分析物结合部分的探针。在某些实施方式中，所述寡核苷酸部分包含结合对的第一成员，所述分析物结合部分包含结合对的第二成员，其中结合对的第一成员和结合对的第二成员在用于近感检测探针结合和杂交和/或连接的条件下能够稳定地相互作用。在各种实施方式中，本领域的技术人员能够选择适合的结合对。在某些实施方式中，近感检测探针包含将至少一种分析物结合部分连接到至少一种寡核苷酸部分的一种或多种接头。在各种实施方式中，本领域的技术人员能够选择适合的接头。

本文所用的“分析物结合部分”是指与目标分析物结合的部分。可被用作分析物结合部分的示例性的部分包括但不限于，能够结合分析物的单克隆抗体及其片段、能够结合分析物的多克隆抗体及其片段、蛋白质、肽、凝集素、核酸、适体、碳水化合物、溶解性细胞表面受体、小分子、和对目标分析物具有特异性的任何其它结合部分。

本文所用的术语“近感检测测定法”或“PDA”是指涉及使分析物与至少两种近感检测探针接触的测定法，其中每种探针包含分析物结合部分和寡核苷酸部分。每种探针的分析物结合部分可以相同，也可以不同。每种探针的寡核苷酸部分可以相同，也可以不同。在某些实施方式中，使分析物与近感检测探针组接触。在各种实施方式中，近感检测探针组包括2、3、4、5或多于5种的近感检测探针。在某些实施方式中，近感检测探针组是一对近感检测探针，或“近感检测探针对”。在某些实施方式中，近感检测探针组中的每种探针的分析物结合部分不相同。在某些实施方式中，近感检测探针组中的每种探针的分析物结合部分能够与分析物中的不同表位结合。如本文所用的，不同表位可以是分析物序列中的和/或三维空间中的重叠表位或非重叠表位。在某些实施方式中，近感检测探针组中的每种探针的寡核苷酸部分包含不同的序列。

在各种实施方式中，在将分析物与至少两种近感检测探针接触之后，近感检测探针中的至少两种的寡核苷酸部分能够彼此相互作用。在各种实施方式中，可以通过一种或多于一种的额外的寡核苷酸介导所述相互作用。在某些实施方式中，近感检测探针中的至少两种的寡核苷酸部分的至少一部分彼此杂交。在某些实施方式中，近感检测探针的寡核苷酸部分中的每一种的至少一部分与另一寡核苷酸杂交。例如，在某些实施方式中，加入至少一种额外的寡核苷酸(本文中称为“夹板寡核苷酸”)，所加入的寡核苷酸通过与近感检测探针中的每一种的寡核苷酸部分的至少一部分杂交，从而介导至少两种近感检测探针之间的相互作用。在下述情况下，近感检测测定法(PDA)也可以被称为“近感相互作用测定法”或“PIA”：其中寡核苷酸部分彼此杂交，或与可在至少两种寡核苷酸部分之间形成接桥的另一寡核苷酸杂交，其中所述寡核苷酸部分不彼此连接。

在某些实施方式中，通过多核苷酸连接酶，近感检测探针中的至少两种的寡核苷酸部分能够被连接在一起。在某些实施方式中，寡核苷酸部分中每一种的连接性末端是通过至少一种其它寡核苷酸(也被称为“夹板寡核苷酸”)而并到一起的，所述其它寡核苷酸能够与每种近感检测探针的寡核苷酸部分中的至少一部分杂交。其中近感检测探针的寡核苷酸部分被连接在一起的近感检测测定法(PDA)也可以被称为“近感连接测定法”或“PLA”。

在各种实施方式中，在至少两种近感检测探针的寡核苷酸部分杂交和/或连接后，可以通过本领域中任何已知的方法检测经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分。检测经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分的示例性方法包括但不限于，直接检测、实时PCR(包括但不限于，5’-核酸酶实时PCR)、滚环扩增、连接和PCR的组合、和预扩增及随后的检测步骤(例如但不限于第二扩增、直接检测、连接等)。本文描述了检测核酸的某些示例性方法。

在例如美国专利6,511,809号B2；美国专利公报US 2002/0064779号；PCT公报WO 2005/123963号；和Gustafsdottir等的Clin.Chem.52：1152-1160(2006)中对示例性的近感检测测定法进行了描述。

本文所用的术语“核酸定量检测测定法”是指能够对样品中的特定核酸序列的量进行定量的测定法。本文的题为“某些示例性方法”的部分中描述了某些示例性的核酸定量检测测定法。

本文所用的术语“检测探针”是指在扩增反应中所用的有利于检测扩增产物的分子。示例性的扩增反应包括但不限于，定量PCT、实时PCR和终点分析扩增反应(end-point analysis amplification reaction)。在各种实施方式中，所述检测探针能够用于监测目标核酸和/或对照核酸的扩增。在各种实施方式中，存在于扩增反应中的检测探针适合于监测随着时间而产生的一种或多种扩增子的量。

在各种实施方式中，检测探针是“基于序列的”，这表示它以序列特异性的方式检测扩增产物。作为非限制性的实例，基于序列的检测探针可以包含能够与特异性扩增产物杂交的寡核苷酸。在某些实施方式中，检测探针是“不依赖序列的”，这表示它不依赖扩增产物的序列而检测扩增产物。

某些示例性检测探针包括但不限于，5′核酸酶测定法中使用的探针(例如，在例如美国专利5,538,848号中所述的Taq

探针)；茎环分子信标(见，例如美国专利6,103,476号和5,925,517号以及Tyagi和Kramer，1996，Nature Biotechnology 14：303-308)；无茎信标或线性信标(见，例如WO 99/21881)、PNA分子信标^TM(见，例如美国专利6,355,421号和6,593,091号)；线性PNA信标(见，例如Kubista等，2001，SPIE 4264：53-58)；非FRET探针(见，例如美国专利6,150,097号)；

探针(美国专利6,548,250号)；茎环探针和双链Scorpion ^TM探针(Solinas等，2001，Nucleic Acids Research 29：E96和美国专利6,589,743号)；凸环探针(美国专利6,590,091号)；假结探针(美国专利6,589,250号)、环状体(cyclicon)(美国专利6,383,752号)；MGB Eclipse ^TM探针(EpochBiosciences)；发夹探针(美国专利6,596,490号)；肽核酸(PNA)照亮探针(light-up probe)；自组装纳米粒子探针；和二茂铁改性的探针。某些示例性检测探针在例如以下文献中有描述：美国专利6,485,901号；Mhlanga等，2001，方法(Methods)25：463-471；Whitcombe等，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology.)17：804-807；Isacsson等，2000，分子细胞探针(Molecular Cell Probes).14：321-328；Svanvik等，2000，分析生物化学(Anal Biochem.)281：26-35；Wolffs等，2001，生物技术(Biotechniques)766：769-771；Tsourkas等，2002，核酸研究(Nucleic Acids Research.)30：4208-4215；Riccelli等，2002，核酸研究(Nucleic AcidsResearch.)30：4088-4093；Zhang等，2002 Shanghai.34：329-332；Maxwell等，2002，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)124：9606-9612；Broude等，2002，生物技术进展(Trends Biotechnol.)20：249-56；Huang等，2002，毒理学化学研究(Chem Res.Toxicol.)15：118-126；和Yu等，2001，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)14：11155-11161。

在各种实施方式中，检测探针可包含淬灭剂。示例性的淬灭剂包括但不限于，黑洞淬灭剂(Biosearch)、Iowa Black(IDT)、QSY淬灭剂(Molecular Probes)和Dabsyl(4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰基)和Dabcel的磺酸酯(或盐)/羧酸酯(或盐)淬灭剂(Epoch)。在某些实施方式中，检测探针可以包含两种探针，例如，其中一种探针含有荧光性部分而另一种探针含有淬灭剂，其中所述两种探针共同在目标物上的杂交可淬灭信号，或者其中所述两种探针在目标物上的杂交可经由荧光的改变而改变信号。在Lao等的例如美国专利公报US 2006/0014191号中描述了某些示例性的包含两种探针的检测探针。某些示例性检测探针还包括但不限于，以SO₃替代羧酸酯(或盐)基团的荧光素(fluorescenin)染料的磺酸酯(或盐)衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、和CY5的亚磷酰胺形式(可从例如Amersham商购获得)。

在某些实施方式中，检测探针包括嵌入标记(intercalating label)。示例性的嵌入标记包括但不限于，溴化乙啶、

Green I(MolecularProbes)和Pico(Molecular Probes)，所述标记在不存在核酸探针的情况下使得扩增产物实时可视化或终点可视化。在某些实施方式中，包含嵌入标记的检测探针是不依赖序列的检测探针。在某些实施方式中，实时可视化可包括不依赖序列的检测探针和基于序列的检测探针。

在某些实施方式中，当未与扩增反应中的互补序列杂交时，检测探针至少被部分淬灭，当与扩增反应中的互补序列杂交时，检测探针至少部分未被淬灭。在各种实施方式中，检测探针可进一步包括各种修饰，例如小沟结合剂(见，例如美国专利6,486,308号)，从而进一步提供所需的热力学特性。在某些实施方式中，检测探针响应识别部分或识别部分互补区，也被称为拉链码(zip-code)。识别部分在例如以下文献中有描述：美国专利6,309,829号(在其中被称为“标签片段”)；6,451,525号(在其中被称为“标签片段”)；6,309,829号(在其中被称为“标签片段”)；5,981,176号(在其中被称为“网格寡核苷酸”(grid oligonucleotide))；5,935,793号(在其中被称为“识别子标签”(identifier tags))；和PCT公报WO 01/92579号(在其中被称为“可寻址支持特异性序列”(addressable support-specificsequence))。

检测探针可以是“差异可检的”，这表示可以通过至少一种检测方法将它们彼此区分。差异可检的检测探针包括但不限于，发射不同波长的光的检测探针、吸收不同波长的光的检测探针、散射不同波长的光的检测探针、具有不同荧光衰减寿命的检测探针、具有不同光谱特征的检测探针、具有不同放射性衰减性质的检测探针、具有不同电荷的检测探针和具有不同大小的检测探针。在某些实施方式中，检测探针发射荧光信号。

“终点聚合酶链式反应”或“终点PCR”是在PCR反应完成后而不在该反应正在进行时检测核酸目标序列的存在或量的聚合酶链式反应方法。

“实时聚合酶链式反应”或“实时PCR”是当反应正在进行时检测核酸目标序列的存在或量的聚合酶链式反应方法。在某些实施方式中，在聚合酶链式反应的每一个循环的过程中，存在于反应组合物中的一种或多于一种的探针所发射的信号被作为引物延伸产物的合成的指示物受到监测。在某些实施方式中，在聚合酶链式反应的每一个循环的过程中所发射的荧光被作为引物延伸产物的合成的指示物受到监测。

“多重扩增反应”是其中在同一反应中扩增两种以上目标核酸序列的扩增反应。“多重聚合酶链式反应”或“多重PCR”是其中在同一反应中扩增两种以上目标核酸序列的聚合酶链式反应方法。

“单重扩增反应”是其中在反应中只扩增一种目标核酸序列的扩增反应。“单重聚合酶链式反应”或“单重PCR”是其中在反应中只扩增一种目标核酸序列的聚合酶链式反应方法。

“循环阈值”或“C_T”被定义为来自核酸定量检测测定法的所观察到的信号超过固定的阈值时的循环数。在某些实施方式中，所述固定的阈值被设定为在不含目标核酸序列的反应中所观察到的信号的量。在某些实施方式中，所述固定的阈值被设定在超出背景噪声信号的水平。例如，在某些实施方式中，所述固定的阈值被设定在对应于背景噪声信号和背景噪声信号的均方根的组合的3倍以上的值。在某些实施方式中，所观察的信号来自荧光标记。

术语“标准化物对照”是指能够被用于将在近感检测测定法中所检测到的目标分析物和/或目标核酸的量标准化的存在于生物样品和/或生物样品的裂解物中的分子。在某些实施方式中，标准化物对照是分析物。在某些实施方式中，标准化物对照是核酸。

在各种实施方式中，标准化物对照可以被称为“外源性”或“内源性”。在某些实施方式中，在收集生物样品之后将外源性标准化物对照加入生物样品。在某些实施方式中，外源性标准化物对照已经被加入到生物样品的裂解物中。在各种实施方式中，生物样品和/或生物样品的裂解物天然地包含一定量的可被用作外源性标准化物对照的相同的分析物和/或核酸，但是由于添加了额外量的分析物和/或核酸，该标准化物对照被认为是外源性的。

在某些实施方式中，在收集样品以用于分析时，内源性标准化物对照就已经存在于生物样品中。在某些实施方式中，内源性标准化物对照已经存在于生物样品的裂解物中，而不必先行向裂解物中添加。在某些实施方式中，当标准化物对照不需先行添加即以高含量存在于生物样品和/或生物样品的裂解物中时，就将其称为“看家的”。在某些实施方式中，看家标准化物对照以高含量存在于多于一种的不同类型的生物样品中。

在某些实施方式中，标准化物对照是内源性分析物。在某些实施方式中，标准化物对照是内源性蛋白质。在某些实施方式中，标准化物对照是内源性的看家蛋白质。某些示例性的内源性看家蛋白质标准化物对照包括但不限于GAPDH、酸性核糖体蛋白质、β-肌动蛋白、HPRT、β-葡糖醛酸糖苷酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、ICAM1和p53。

在某些实施方式中，标准化物对照是外源性分析物。在某些实施方式中，标准化物对照是外源性蛋白质。某些示例性的外源性蛋白质标准化物对照包括但不限于，细菌蛋白质、蛋白质标签、病毒蛋白质、完整的病毒粒子、昆虫蛋白质、在所选的生物样品中非正常表达的哺乳动物蛋白质、和在所选的生物样品中以低水平正常表达的哺乳动物蛋白质。可用作外源性蛋白质标准化物对照的某些示例性的细菌蛋白质包括但不限于，β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。可用作外源性蛋白质标准化物对照的某些示例性的蛋白质标签包括但不限于，组氨酸标签(例如His6标签)、流感标签(flu tag)、血凝素标签、谷胱甘肽-s-转移酶标签、c-myc标签和萤光素酶。在某些实施方式中，外源性蛋白质标准化物包含与另一蛋白质融合的蛋白质标签。

在某些实施方式中，标准化物对照是内源性的核酸。在某些实施方式中，标准化物对照是内源性的基因组DNA片段。在某些实施方式中，内源性的基因组DNA片段包含单一拷贝基因的至少一部分。在某些实施方式中，内源性的基因组DNA片段包含以多于一个拷贝存在于基因组中的基因的至少一部分。某些示例性的内源性单一拷贝基因组DNA标准化物对照包括但不限于，核糖核酸酶P基因的至少一部分和短串联重复(STR)基因座的至少一部分。某些示例性的STR基因座包括但不限于，D3S1358、HUMTH01、D21S11、D18S51、G475、Amelogenin、HUMvWFA31、D8S1179、HUMTPOX、HUMFIBRA、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、HUMCSF1PO和S159。例如美国专利7,008,771中描述了某些STR基因座。

在某些实施方式中，标准化物对照是内源性的RNA。在某些实施方式中，标准化物对照是内源性的看家RNA。某些示例性的内源性看家RNA标准化物对照包括但不限于GAPDH、18S、β-肌动蛋白、酸性核糖体蛋白质、HPRT、β-葡糖醛酸糖苷酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、ICAM1和p53。在某些实施方式中，标准化物对照是编码至少一种待检测的目标分析物的内源性mRNA。

在各种实施方式中，标准化物对照是外源性核酸。在各种实施方式中，外源性核酸包括RNA和/或DNA。示例性的RNA包括但不限于，mRNA、tRNA、snRNA、rRNA、逆转录病毒、非编码的小RNA、microRNA、多核糖体RNA、mRNA前体、内含子RNA和病毒RNA。示例性DNA包括但不限于，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、核仁DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、cDNA、合成的DNA、酵母人工染色体DNA(“YAC”)、细菌人工染色体DNA(“BAC”)、其它染色体外DNA和引物延伸产物。在某些实施方式中，外源性核酸包含PNA。在某些实施方式中，外源性核酸包括一般见于除从其中收集所述生物样品的生物之外的生物中的序列。在某些实施方式中，外源性核酸包括一般见于从其中收集所述生物样品的生物中的序列。在某些实施方式中，外源性标准化物对照包括在已知的生物中不常见的序列。在某些实施方式中，外源性标准化物对照包括在一种类型的核酸(例如mRNA)中常见的序列，但所述外源性标准化物对照包含在另一种类型的核酸(例如DNA)中的序列。在某些实施方式中，外源性核酸标准化物对照是Taq

外源性固有阳性对照试剂(TaqExogenous Internal Positive Control Reagent)(AppliedBiosystems目录号为4308323)。

在各种实施方式中，使用“德尔塔C_T法”或“ΔC_T法”(涉及ΔC_T的计算)可以针对标准化物对照将目标核酸的量标准化。在某些实施方式中，从来自用以检测目标核酸的核酸定量检测测定法的C_T减去来自用以检测标准化物对照的核酸定量检测测定法的C_T，可以算得ΔC_T。在某些实施方式中，由ΔC_T计算标准化物对照和目标核酸的量的倍差(folddifference)。在某些实施方式中，根据公式2^-ΔCT由ΔC_T计算标准化物对照和目标核酸的量的倍差。

在各种实施方式中，使用“德尔塔C_T法”或“ΔC_T法”(涉及ΔC_T的计算)可以针对标准化物对照将目标分析物的量标准化。在某些实施方式中，从来自用以检测目标分析物的核酸定量检测测定法的C_T减去来自用以检测标准化物对照的核酸定量检测测定法的C_T，可以算得ΔC_T。在某些实施方式中，由ΔC_T计算标准化物对照和目标分析物的量的倍差。在某些实施方式中，根据公式2^-ΔCT由ΔC_T计算标准化物对照和目标分析物的量的倍差。

在各种实施方式中，使用“比较C_T法”或“ΔΔC_T法”(涉及ΔΔC_T的计算)可以针对标准化物对照将目标核酸的量标准化。在各种实施方式中，使用“比较C_T法”或“ΔΔC_T法”(涉及ΔΔC_T的计算)可以针对标准化物对照将目标分析物的量标准化。在某些实施方式中，通过从“测试裂解物”的ΔC_T减去“校准物裂解物”的ΔC_T来计算ΔΔC_T。某些示例性校准物裂解物包括但不限于，从未经处理的细胞制备的裂解物和从特定组织制备的裂解物。某些示例性测试裂解物包括但不限于，从经处理的细胞制备的裂解物和从除了制备校准物裂解物的组织之外的组织制备的裂解物。在某些实施方式中，通过从测试裂解物的ΔC_T减去校准物裂解物的ΔC_T来计算ΔΔC_T。

在某些实施方式中，根据公式2^-ΔΔCT由ΔΔC_T计算校准物裂解物和测试裂解物中的目标核酸的量的倍差。在某些实施方式中，根据公式2^-ΔΔCT由ΔΔC_T计算校准物裂解物和测试裂解物中的目标分析物的量的倍差。在Applied Biosystems，“Guide to Performing Relative Quantitation of GeneExpression Using Real-Time Quantitative PCR”；和Applied Biosystems，User Bulletin #2：ABI Prism 7700 Sequence Detection System，(1997年12月11日(2001年10月更新))中对ΔΔC_T方法的使用有描述。

术语“封闭剂”是指包括在反应中以减少非特异性相互作用的物质。在某些实施方式中，反应中包括封闭剂以减少涉及分析物的非特异性相互作用。在某些实施方式中，反应中包括封闭剂以减少涉及核酸的非特异性相互作用。

在某些实施方式中，封闭剂是分析物。作为分析物的封闭剂可以被称为“分析物封闭剂”。在某些实施方式中，封闭剂是蛋白质。作为蛋白质的封闭剂可以被称为“蛋白质封闭剂”。某些示例性蛋白质封闭剂包括但不限于，BSA、酪蛋白、随机肽文库片段、哺乳动物IgG组分的制备物、和脱脂奶粉。在某些实施方式中，封闭剂是明胶。作为明胶的封闭剂可以被称为“明胶封闭剂”。某些示例性的明胶封闭剂包括但不限于，鱼源明胶(包括但不限于冷鱼明胶(cold fish gelatin)(Sigma # G7765))、牛源明胶和猪源明胶。在某些实施方式中，反应中以0.01％～5％的浓度包含分析物封闭剂。在某些实施方式中，反应中以0.01％～2％的浓度包含分析物封闭剂。在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液中以0.05％～0.5％的浓度包含分析物封闭剂。例如Vogt等，J.Immunol.Meth.，101(1)：43-5(1987)描述了某些示例性的封闭剂。

在某些实施方式中，封闭剂是核酸。作为核酸的封闭剂可以被称为“核酸封闭剂”。在各种实施方式中，封闭剂包括RNA和/或DNA。在各种实施方式中，封闭剂包括单链核酸和/或双链核酸。在某些实施方式中，封闭剂主要包含单链核酸。主要是单链核酸的封闭剂可以被称为“单链核酸封闭剂”。在某些实施方式中，封闭剂主要包含双链核酸。主要是双链核酸的封闭剂可以被称为“双链核酸封闭剂”。某些示例性的单链核酸封闭剂包括但不限于多聚A和多聚dC。某些示例性的双链核酸封闭剂包括但不限于基因组DNA、经剪切的基因组DNA、多聚dC+多聚dG和多聚dI+多聚dC。某些示例性的经剪切的基因组DNA包括但不限于经剪切的鲑鱼精DNA和经剪切的小牛胸腺DNA。

某些示例性试剂

某些示例性的近感检测探针

近感检测探针包含至少一种分析物结合部分和至少一种寡核苷酸部分。分析物结合部分能够结合所选的分析物。在某些实施方式中，近感检测探针包含一种分析物结合部分和一种寡核苷酸部分。在某些实施方式中，近感检测探针包含多于一种的分析物结合部分。在某些实施方式中，近感检测探针包含多于一种的寡核苷酸部分。例如Fredriksson的美国专利公报US 2005/0003361A1描述了某些示例性的多价近感探针。

在各种实施方式中，近感检测探针的寡核苷酸部分可以包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸的类似物、和脱氧核糖核苷酸的类似物中的一种或多种。示例性的核糖核苷酸的类似物和脱氧核糖核苷酸的类似物包括但不限于，包含对核苷酸的糖、磷酸和/或碱基部分的一种或多种修饰的类似物。示例性的寡核苷酸类似物包括但不限于，LNA(见，例如美国专利6,316,198号)、PNA(见，例如美国专利6,451,968号)和本文所讨论的或本领域中已知的任何其它核苷酸类似物(见，例如Loakes，Nucleic Acids Res.2001年6月15日；29(12)：2437-2447，和Karkare等，ApplMicrobiol Biotechnol.2006年8月；71(5)：575-586.Epub 2006年5月9日)。

在各种实施方式中，近感检测探针的寡核苷酸部分可以包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少75个、或至少100个核苷酸。在各种实施方式中，近感检测探针的寡核苷酸部分可以包含10～1000个核苷酸。在各种实施方式中，寡核苷酸部分可以包含10～500个核苷酸。在各种实施方式中，寡核苷酸部分可以包含10～200个核苷酸。在各种实施方式中，寡核苷酸部分可以包含10～100个核苷酸。

近感检测探针的寡核苷酸部分和分析物结合部分可以彼此共价地或非共价地相互作用。使分析物结合部分与寡核苷酸部分共价地和非共价地相互作用的某些方法是本领域中已知的。

在某些实施方式中，寡核苷酸部分包含结合对的第一成员，并且分析物结合部分包含结合对的第二成员，其中在用于近感检测探针结合和杂交和/或连接的条件下，结合对的第一成员和结合对的第二成员能够稳定地联合。在某些实施方式中，在检测经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分的过程中，结合对不需要稳定地联合。某些示例性的结合对包括但不限于，抗体/抗原、生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、多种杂交性核酸、受体/配体、叶酸/叶酸结合蛋白、维生素B12/内因子、蛋白A/Fc、和蛋白G/Fc、金属/螯合剂等。在某些实施方式中，通过使用磺基-SMCC试剂(例如见，Pierce目录号为22322)可以使链霉抗生物素蛋白与寡核苷酸部分连接。在某些实施方式中，可以使近感检测探针的分析物结合部分和寡核苷酸部分共价结合。在不同分子之间形成共价键的某些方式是本领域中已知的，并且可参见例如Pierce目录。例如Gullberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.101(22)：8420-8424(2004)中描述了制作近感检测探针的某些示例性方法。

在各种实施方式中，寡核苷酸部分的3′末端或5′末端与分析物结合部分联合。在某些实施方式中，寡核苷酸部分在除了寡核苷酸部分的3′末端或5′末端之外的其它部位与分析物结合部分联合，例如，通过寡核苷酸序列中的一种或多以一种的核苷酸或经修饰的核苷酸联合。

在各种实施方式中，将两种以上近感检测探针组合以形成近感检测探针组。在各种实施方式中，第一近感检测探针与第二近感检测探针配对从而形成近感检测探针对。近感检测探针组中的近感检测探针可以各自与相同的或不同的分析物结合。在某些实施方式中，组中的近感检测探针各自与相同的分析物结合。在某些实施方式中，组中的近感检测探针各自与不同的分析物结合。在某些实施方式中，组中的第一亚组的近感检测探针各自与第一分析物结合，并且组中的第二亚组的近感检测探针各自与第二分析物结合。在某些实施方式中，组中的第一亚组的近感检测探针与第一分析物结合，并且组中的第二亚组的近感检测探针与第二分析物结合，其中在某些条件下所述第一分析物和所述第二分析物能够相互联合。在各种实施方式中，所述近感检测探针组可以例如被用于检测所述第一分析物和所述第二分析物在某些条件下的联合。

在某些实施方式中，通过近感检测探针的同一分析物结合部分或通过近感检测探针的多个分析物结合部分，近感检测探针能够结合一种以上分析物。在某些实施方式中，近感检测探针能够结合相关分析物家族中的两种以上分析物。

在各种实施方式中，近感检测探针组的第一成员的寡核苷酸部分的至少一部分能够与近感检测探针组的第二成员的寡核苷酸部分的至少一部分杂交。在各种实施方式中，经杂交的区域包含至少5个碱基对、至少10个碱基对、至少15个碱基对、至少20个碱基对、至少25个碱基对、至少30个碱基对、至少40个碱基对、至少50个碱基对、至少75个碱基对、或至少100个碱基对。

在各种实施方式中，近感检测探针组的第一成员的寡核苷酸部分不能够与近感检测探针组的第二成员的寡核苷酸部分杂交。例如，在某些实施方式中，可以向所述近感检测测定物添加至少一种夹板寡核苷酸，其中一种或多种所述夹板寡核苷酸能够与第一近感检测探针的寡核苷酸部分的至少一部分杂交，并且还能够与第二近感检测探针的寡核苷酸部分的至少一部分杂交。在各种实施方式中，所述一种或多种夹板寡核苷酸与近感检测探针的寡核苷酸部分之间的杂交区域包含至少5个碱基对、至少10个碱基对、至少15个碱基对、至少20个碱基对、至少25个碱基对、至少30个碱基对、至少40个碱基对、至少50个碱基对、至少75个碱基对、或至少100个碱基对。在各种实施方式中，夹板寡核苷酸是对称的，例如它与每种寡核苷酸部分的相等数量的碱基杂交。在各种实施方式中，夹板寡核苷酸是非对称的，例如它杂交到第一寡核苷酸部分的碱基的数量大于杂交到第二寡核苷酸部分的碱基的数量。例如PCT公报WO 2005/123963号中描述了某些示例性的非对称夹板。

在各种实施方式中，夹板寡核苷酸以下述方式与所述第一寡核苷酸部分和所述第二寡核苷酸部分杂交：寡核苷酸部分中的一个寡核苷酸部分的3′末端与其他寡核苷酸部分的5′末端相邻。在某些实施方式中，近感检测探针对的寡核苷酸部分的3′末端和5′末端能够被连接到一起。在某些实施方式中，寡核苷酸部分中的一个寡核苷酸部分的3′末端以1个以上的核苷酸的空隙与其他寡核苷酸部分的5′末端分开。在某些实施方式中，使用聚合酶填补所述空隙从而使被填补的末端能够被连接到一起。

在各种实施方式中，夹板寡核苷酸可以包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸的类似物和脱氧核糖核苷酸的类似物中的一种或多种。示例性的核糖核苷酸的类似物和脱氧核糖核苷酸的类似物包括但不限于，包含对核苷酸的糖、磷酸和/或碱基部分的一种或多种修饰的类似物。示例性的寡核苷酸类似物包括但不限于，LNA(见，例如美国专利6,316,198号)、PNA(见，例如美国专利6,451,968号)和本文所讨论的或本领域中已知的任何其它核苷酸类似物(见，例如Loakes，Nucleic AcidsRes.2001年6月15日；29(12)：2437-47，和Karkare等，Appl MicrobiolBiotechnol.2006年8月；71(5)：575-86.Epub 2006年5月9日)。在某些实施方式中，夹板寡核苷酸包含代替至少一个脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸的至少一个脱氧尿嘧啶(dU)核苷酸。

本领域的技术人员根据所需的用途能够为近感检测探针的寡核苷酸部分和/或夹板寡核苷酸选择适合的序列和长度。关于选择用于近感检测探针的寡核苷酸部分和或夹板寡核苷酸的示例性方法的讨论可见于例如美国专利6,511,809B2号和PCT公报WO 2005/123963号。

某些示例性多功能性裂解缓冲液

如上所述，多功能性裂解缓冲液能够裂解、匀化和/或提取所选择的生物样品而基本不降解目标核酸，并且同时保持适当的分析物表位结构，从而使近感检测探针能够结合裂解物中的分析物。

在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。在各种实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含0.01％～20％的选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。在各种实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含0.05％～10％、0.05％～5％、0.1％～5％、或0.1％～2％的选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。在各种实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、5％或10％的选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。

在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含一种或多种适合于生物缓冲液的附加成分。示例性的附加成分包括但不限于，缓冲剂、二价阳离子螯合剂(例如EDTA、柠檬酸盐和EGTA)、一价盐、二价盐、还原剂、BSA、酶抑制剂(例如磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂)、核酸(例如多聚A、鲑鱼精DNA等)、单链DNA结合蛋白等。在各种实施方式中，本领域的技术人员根据所需的应用能够选择一种或多种附加成分。在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含至少一种缓冲剂和至少一种二价阳离子螯合剂。在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含选自Tris、Hepes、MOPS、BES、BICINE、CAPS、EPPS、MES、PIPES、TAPS、TES和TRICINE中的至少一种缓冲剂。在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含Tris和EDTA。

在各种实施方式中，多功能性裂解缓冲液包含10mM～200mM、或20mM～100mM的至少一种缓冲剂。

在各种实施方式中，多功能性裂解缓冲液可以具有适于所需用途的pH，例如适于目标核酸和目标分析物的pH。在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液具有5～9的pH。在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液具有6～8.5的pH。在某些实施方式中，多功能性裂解缓冲液具有6.5～8的pH。

某些示例性的多功能性裂解缓冲液含有NDSB-201、Tris和EDTA。

某些示例性蛋白酶

在各种实施方式中，以蛋白酶处理裂解物以释放用于分析的核酸。在某些实施方式中，蛋白酶的选择基于一种或多种的以下特性：使该蛋白酶失活的容易性、该蛋白酶的活性是否需要金属离子、该蛋白酶的活性是否需要去污剂、该蛋白酶消化是否导致核酸的降解、和该蛋白酶是否释放目标核酸。

在某些实施方式中，选择能够被加热失活的蛋白酶。在某些实施方式中，选择能够被化学失活的蛋白酶。能够被用来使蛋白酶失活的某些示例性的化学品包括但不限于，AEBSF、抑酶肽、苯丁抑制素、抑凝乳蛋白酶素、E-64、EDTA、EGTA、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂A、1，10-菲咯啉、膦酰二肽和PMSF。在某些实施方式中，该方法中使用了一种或多种丝氨酸蛋白酶。在某些实施方式中，一种或多种蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg protease)、链霉菌蛋白酶(streptomyces griseusprotease)和蛋白酶K。当选用链霉菌属蛋白酶时，在某些实施方式中，该蛋白酶被热失活。当选用蛋白酶K时，在某些实施方式中，该蛋白酶被化学失活。

在某些实施方式中，在该方法中使用了多于一种的蛋白酶。当使用多于一种的蛋白酶时，所述蛋白酶可以同时加入，也可以在不同时间加入。在各种实施方式中，当使用多于一种的蛋白酶时，该方法可以包括一个失活步骤或多于一个的失活步骤。另外，在各种实施方式中，所述失活步骤可以相同，也可以不同，例如一种或多种失活步骤可以是热处理，而一种或多种失活步骤可以是化学品处理。

在各种实施方式中，例如当目标分析物是蛋白质或肽时，在近感检测探针组杂交和/或连接之后，添加蛋白酶。

某些示例性的方法

可以以所例举的事项的逻辑上可能的任何顺序、以及所例举的事项顺序来进行本文所提供的方法。

对于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养可以使用标准技术。可以根据制造商的说明书和/或如本领域中通常实施的和/或如本文所述来进行酶促反应和纯化技术。一般可以根据本领域中已知的常规方法和按照各种常规的和比较具体的参考文献所描述的方法来进行上述技术和程序，所述参考文献包括但不限于本说明书通篇所引用和讨论的参考文献。例如参见：Sambrook等.分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989))；Lehninger，生物化学(Biochemistry)(WorthPublishers，Inc.)；酶学方法(Methods in Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait编，1984)；分子克隆实用指南(A Practical Guide to MolecularCloning)(第2版，Wily Press，1988)。除非给出特定定义，否则与本文所述的与生物学、生物化学、分析化学和有机合成化学相关而使用的术语和、实验室程序和技术均是本领域中已知和使用的。

本发明提供了检测生物样品中的目标分析物和目标核酸的方法。在各种实施方式中，该方法允许检测同一容器中的至少一种分析物和至少一种目标核酸。例如，在各种实施方式中，将用于检测至少一种分析物而进行的方法和用于检测至少一种核酸而进行的方法应用于同一样品。因此，在各种实施方式中，该方法使得所检测的目标分析物的量和所检测的目标核酸的量之间更好地关联，这是因为例如，该样品未被分开并且未经历不同的条件和方法，而不同的条件和方法可能对某些检测方法的效率产生不同的影响。

在各种实施方式中，方法包括裂解生物样品、利用近感检测测定法检测目标分析物、和检测目标核酸。在各种实施方式中，检测目标分析物和检测目标核酸是在同一容器中进行的。在各种实施方式中，利用同一检测方法检测一种或多于一种的近感检测探针组和一种或多于一种的目标核酸。在各种实施方式中，同时检测一种或多于一种的近感检测探针组和一种或多于一种的目标核酸。在各种实施方式中，该方法在检测一种或多于一种的近感检测探针组和/或检测一种或多于一种的目标核酸之前不包括核酸纯化步骤。例如，在某些实施方式中，使用第一标记来检测近感检测探针组并使用第二标记来检测目标核酸。在某些实施方式中，使用不用的标记来检测各自不同的近感检测探针组和各自不同的核酸分子。

图18和图19显示了用于根据某些实施方式来检测生物样品中的目标分析物和目标核酸的某些示例性作业流程图。

图18显示下述的用于某些方法的非限制性示例性作业流程。在多功能性裂解缓冲液中裂解、匀化和/或提取生物样品，向裂解物加入至少一组近感检测探针。随后，在可使近感检测探针的分析物结合部分与目标分析物结合的条件下温育该裂解物。在各种实施方式中，在0℃～45℃的温度进行温育。在某些实施方式中，在大于45℃进行温育。在各种实施方式中，在0℃～10℃、4℃～15℃、4℃～30℃、10℃～20℃、15℃～30℃、20℃～30℃、或20℃～40℃的温度进行温育。在各种实施方式中，在4℃、10℃、20℃、25℃、30℃、37℃或42℃进行温育。在各种实施方式中，温育进行至少过夜。在各种实施方式中，温育进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时或至少4小时。在各种实施方式中，温育进行1小时～4小时。

在各种实施方式中，在添加至少一个近感检测探针组的之前、同时或之后，向裂解物加入至少一种夹板寡核苷酸。在各种实施方式中，添加至少一个近感检测探针组之后，向裂解物加入连接混合物。在某些实施方式中，该连接混合物在适合的缓冲液中包含适用于将近感检测探针组的寡核苷酸部分的末端连接在一起的连接酶。在某些实施方式中，添加至少一种夹板寡核苷酸之后，添加连接混合物。在某些实施方式中，在添加至少一种夹板寡核苷酸的同时添加连接混合物。

向裂解物加入连接混合物之后，在各种实施方式中，将该裂解物温育至少2分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟或至少1小时。在某些实施方式中，将裂解物温育5分钟～10分钟。在各种实施方式中，添加连接混合物之后，将裂解物在0℃～25℃的温度温育。在某些实施方式中，将裂解物在高于25℃的温度温育。在各种实施方式中，将裂解物在0℃～10℃、4℃～15℃、4℃～20℃、10℃～20℃或15℃～25℃的温度温育。在某些实施方式中，连接反应被终止。在某些实施方式中，通过向反应加入至少一种蛋白酶以终止连接反应。当夹板寡核苷酸包含至少一个dU核苷酸时，在某些实施方式中，通过加入尿嘧啶DNA糖基化酶来终止连接反应。

在各种实施方式中，在向裂解物加入至少一个近感检测探针组的之前、同时或之后，向裂解物加入至少一种夹板寡核苷酸。在各种实施方式中，可省略上述连接步骤。例如，在某些实施方式中，在近感检测探针组加入并温育之后添加至少一种夹板寡核苷酸的情况中，以足以使至少一种夹板寡核苷酸与至少一种近感检测探针杂交的温度和时间进一步温育裂解物。在各种实施方式中，本领域的技术人员能够为所述杂交选择适合的时间和温度。在各种实施方式中，杂交条件包括0℃～75℃的温度。在各种实施方式中，温育在0℃～65℃、4℃～50℃、10℃～45℃、或15℃～40℃进行。在各种实施方式中，温育在10℃、20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、55℃、60℃、或65℃进行。在各种实施方式中，温育进行至少4小时。在各种实施方式中，温育进行至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时或至少2小时。

在各种实施方式中，以至少一种蛋白酶处理裂解物。在各种实施方式中，添加至少一种蛋白酶之后，将裂解物温育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时或至少4小时。在各种实施方式中，在0℃～65℃温育裂解物。在各种实施方式中，在0℃～55℃、4℃～50℃、10℃～45℃或15℃～40℃温育裂解物。在各种实施方式中，在4℃、10℃、20℃、25℃、30℃、37℃或42℃进行温育。在某些实施方式中，使至少一种蛋白酶在温育后失活。在某些实施方式中，例如通过在至少50℃温育裂解物至少5分钟，至少一种蛋白酶因加热而失活。在某些实施方式中，将裂解物在至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃或至少75℃温育以使蛋白酶热失活。在某些实施方式中，例如通过加入至少一种化学品而使至少一种蛋白酶失活。在某些实施方式中，通过加入PMSF而使至少一种蛋白酶失活。

在各种实施方式中，使至少一种蛋白酶失活之后，检测目标核酸和经杂交的和/或经连接的近感检测探针组。在各种实施方式中，对至少一种目标核酸和至少一种经杂交的和/或经连接的近感检测探针组的检测包括多重定量PCR。在某些实施方式中，在目标核酸是RNA的情况中，在检测前将该RNA逆转录，或将该RNA的逆转录作为检测的一部分。

图19显示了以下用于某些方法的非限制性示例性作业流程。图19所示的方法与图18的上述方法相同(贯穿连接步骤)。然而，在蛋白酶处理之前，取出裂解物的一份等分试样用于检测至少一种经杂交的和/或经连接的近感检测探针组。

取出所述等分试样之后，如以上图18所述处理剩余的裂解物。剩余的裂解物被用来检测所述至少一种目标核酸，而所取出的所述等分试样被用来检测所述至少一个经杂交的和/或经连接的近感检测探针组。在某些实施方式中，对所述至少一种目标核酸的检测和/或对所述至少一个经杂交的和/或经连接的近感检测探针组的检测包括定量PCR。在某些实施方式中，在检测多于一种的目标核酸和/或多于一个的经杂交的和/或经连接的近感检测探针组的情况中，该检测包括多重定量PCR。在某些实施方式中，在目标核酸是RNA的情况中，在检测前将该RNA逆转录，或将该RNA的逆转录作为检测的一部分。

下面将进一步详细地描述某些方法的某些方面。

某些示例性裂解

在各种实施方式中，在检测目标分析物和目标核酸之前，将所选择的生物样品裂解、匀化和/或提取。在某些实施方式中，在多功能性裂解缓冲液中进行所述裂解、匀化和/或提取。

在各种实施方式中，在所选的生物样品是个体细胞的形式的情况中，以100细胞/μl～200,000细胞/μl的浓度将细胞重悬在多功能性裂解缓冲液中。在各种实施方式中，将细胞以小于100细胞/μl或大于200,000细胞/μl的浓度重悬。在各种实施方式中，将细胞以500细胞/μl～100,000细胞/μl、1,000细胞/μl～100,000细胞/μl、5,000细胞/μl～75,000细胞/μl或10,000细胞/μl～75,000细胞/μl的浓度重悬。在各种实施方式中，将细胞以至少1,000细胞/μl、至少2,000细胞/μl、至少5,000细胞/μl、至少10,000细胞/μl、至少15,000细胞/μl、至少20,000细胞/μl、至少25,000细胞/μl、至少30,000细胞/μl、至少40,000细胞/μl或至少50,000细胞/μl的浓度重悬。

在各种实施方式中，在所选的生物样品是组织的形式的情况中，考虑到该组织能够被匀化的效率，可以将该组织匀化到多功能性裂解缓冲液中，从而使被裂解的组织细胞的浓度大概相当于以上讨论的独立细胞浓度。例如，在某些实施方式中，如果该组织的20％不能匀化，则为了确定细胞浓度，将其余的80％进行计数。本领域的技术人员能够为多功能性裂解液中的组织样品选择适合的浓度。

相似的是，在所选的生物样品为其它形式的情况中，例如食物产品或水或空气的过滤物，本领域的技术人员能够估计该样品中的细胞(例如病原体)的预期数量，并相应地调整多功能性裂解缓冲液的体积。在各种实施方式中，在以多功能性裂解缓冲液进行裂解、匀化和/或提取之前，可以通过本领域中已知的任何方法浓缩所选的生物样品。

在各种实施方式中，在多功能性裂解缓冲液中悬浮所选的生物样品之后，对该裂解物进行物理处理从而促进该样品的裂解。所述物理处理包括但不限于涡旋、冻融循环(例如，使用干冰、液氮等)、在所选的温度旋转、超声处理等。本领域的技术人员能够选择适合的物理处理来促进所选的生物样品的裂解。

裂解之后，在某些实施方式中，离心裂解物以沉淀固体物质。在各种实施方式中，随后可以将澄清的裂解物转移到新的容器中以存储。在各种实施方式中，将裂解物储存在4℃或冷冻，例如在标准的冷冻机中、或在-80℃冷冻机中或在液氮中冷冻。

某些示例性的近感检测测定法

例如美国专利6,511,809B2号；美国专利公报US 2002/0064779号；PCT公报WO 2005/123963号；美国专利公报US 2005/0003361A1号；美国专利公报US 2007/0026430号；Fredricksson等，自然生物技术(NatureBiotech.)20：473-477(2002)；和Gustafsdottir等，临床化学(Clin.Chem).52：1152-1160(2006)中描述了某些示例性的近感检测测定法。

在各种实施方式中，近感检测测定法包括在使得至少一个近感检测探针组与至少一种目标分析物可相互作用的条件下，将生物样品或裂解物与至少一个近感检测探针组温育。当该近感检测测定法是近感连接测定法时，在各种实施方式中，对于每个近感检测探针组，向混合物中加入至少一种夹板寡核苷酸，并且在使得所述至少一种夹板寡核苷酸和近感检测探针组的寡核苷酸部分之间可杂交的条件下温育该混合物。在某些实施方式中，所述夹板寡核苷酸与两种寡核苷酸部分杂交从而使第一寡核苷酸部分的3′末端与第二寡核苷酸部分的5′末端相邻。在某些实施方式中，第一寡核苷酸部分的3′末端与第二寡核苷酸部分的5′末端被连接在一起。在某些实施方式中，由连接酶介导连接。

在某些实施方式中，通过至少一种本文所述的方法检测经连接的产物。在某些实施方式中，在检测方法之前，使经连接的产物和经杂交的夹板寡核苷酸经历引物延伸反应，或者将所述引物延伸反应作为检测方法的一部分。在某些实施方式中，所述引物延伸反应产生双链寡核苷酸。在某些实施方式中，所述引物延伸反应包括与经连接的产物互补的至少一种寡核苷酸引物。在某些实施方式中，所述夹板寡核苷酸在引物延伸反应中与另一寡核苷酸引物一起作为引物。在某些实施方式中，在引物延伸反应中包括了除所述夹板寡核苷酸之外的两种寡核苷酸引物。在某些实施方式中，在产生双链寡核苷酸的引物延伸反应之后，该双链寡核苷酸的第一条链包含经连接的寡核苷酸部分，并且第二条链包含了夹板寡核苷酸的序列，所述夹板寡核苷酸连接在(i)与第一寡核苷酸部分的至少一部分互补的第一序列，并且还连接在(ii)与第二寡核苷酸部分的至少一部分互补的第二序列。

在各种实施方式中，在检测方法涉及一种或多于一种的寡核苷酸(例如，一种或多于一种的寡核苷酸引物和/或含有寡核苷酸的检测探针)的杂交的情况中，本领域的技术人员能够选择适合的核苷酸序列从而使该寡核苷酸能够被用来特异性地检测经连接的产物。例如，在某些实施方式中，在使经连接的寡核苷酸部分进行引物延伸反应的情况中，可以选择与引物延伸产物杂交并且不与所述寡核苷酸部分或夹板寡核苷酸杂交的一种或多于一种的的寡核苷酸。在各种实施方式中，所述寡核苷酸可以被用于直接检测方法和/或涉及扩增步骤的检测方法。在某些实施方式中，可以选择一种或多于一种的的寡核苷酸来扩增经连接的寡核苷酸部分从而使扩增只当所述部分已被连接在一起时发生。

在各种实施方式中，当近感检测测定法是近感相互作用测定法时，第一近感检测探针的寡核苷酸部分能够与第二近感检测探针的寡核苷酸部分杂交。作为选择，在某些实施方式中，对于每个近感检测探针组，向该混合物中加入至少一种夹板寡核苷酸。在各种实施方式中，随后在可使可杂交的寡核苷酸部分之间、和/或寡核苷酸部分与至少一种夹板寡核苷酸之间杂交的条件下温育该混合物。

在某些实施方式中，在检测方法之前使经杂交的寡核苷酸进行引物延伸反应，或将该延伸反应作为检测方法的一部分。在某些实施方式中，当寡核苷酸部分相互杂交时，引物延伸反应从每一寡核苷酸部分的末端延伸从而产生双链寡核苷酸，该双链寡核苷酸包含：含有与互补于第二寡核苷酸部分的至少一部分的序列相连接的第一寡核苷酸部分的第一条链，和含有与互补于第一寡核苷酸部分的至少一部分的序列相连接的第二寡核苷酸部分的第二条链。在某些实施方式中，利用至少一种寡核苷酸引物对所述双链寡核苷酸进行进一步的引物延伸反应。在某些实施方式中，利用至少两种寡核苷酸引物对所述双链寡核苷酸进行进一步的引物延伸反应。

在某些实施方式中，当至少一种夹板寡核苷酸与寡核苷酸部分杂交时，该夹板寡核苷酸在引物延伸反应中与第二寡核苷酸引物共同作为引物，从而产生双链寡核苷酸。在某些实施方式中，所述双链寡核苷酸包含：含有所述寡核苷酸部分中的每一种寡核苷酸部分的序列的至少一部分的第一条链，和含有所述夹板寡核苷酸的序列的第二条链，所述夹板寡核苷酸的序列连接于与所述寡核苷酸部分中的一种寡核苷酸部分的至少一部分互补的序列。

在某些实施方式中，通过本文所述的至少一种方法检测经杂交的寡核苷酸。在各种实施方式中，在所述检测方法涉及一种或多于一种的寡核苷酸(例如，一种或多于一种的寡核苷酸引物和/或含有寡核苷酸的检测探针)的杂交的情况中，本领域的技术人员能够选择适合的核苷酸序列从而使该一种或多于一种的寡核苷酸能够被用来特异性地检测经杂交的产物。例如，在某些实施方式中，在对经杂交的寡核苷酸部分进行引物延伸反应的情况中，可以选择与引物延伸产物杂交并且不与所述寡核苷酸部分杂交的一种或多于一种的的寡核苷酸。在各种实施方式中，所述寡核苷酸可以被用于直接检测方法中和/或涉及扩增步骤的检测方法中。

用于近感检测测定法的某些示例性的标准化物对照

在各种实施方式中，可以针对至少一种标准化物对照将目标核酸的量标准化。在各种实施方式中，可以针对至少一种标准化物对照将目标分析物的量标准化。例如本文和PCT公报WO 2005/123963号描述了某些示例性的标准化物对照。在各种实施方式中，本领域的技术人员能够为具体应用选择一种或多于一种的标准化物对照。

在各种实施方式中，样品含有至少一种标准化物对照、至少两种标准化物对照、至少三种标准化物对照、至少四种标准化物对照、或至少五种标准化物对照。在某些实施方式中，样品含有至少一种分析物标准化物对照和至少一种核酸标准化物对照。在某些实施方式中，样品含有至少一种内源性标准化物对照和至少一种外源性标准化物对照。在某些实施方式中，样品中的所有标准化物对照均是内源性的。在某些实施方式中，样品中的所有标准化物对照均是外源性的。在某些实施方式中，分析物标准化物对照被用来使目标分析物标准化。在某些实施方式中，核酸标准化物对照被用来使目标分析物标准化。在某些实施方式中，核酸标准化物对照被用来使目标核酸标准化。在某些实施方式中，分析物标准化物对照被用来使目标核酸标准化。在某些实施方式中，使目标核酸和目标分析物针对同一标准化物对照标准化。在某些实施方式中，使目标核酸和目标分析物针对不同的标准化物对照标准化。

在某些实施方式中，在检测目标分析物和/或目标核酸的同一裂解物中检测标准化物对照。在某些实施方式中，在检测目标分析物和/或目标核酸的同一容器中使用相同或不同的方法检测标准化物对照。在各种实施方式中，将裂解物分开或分份，并在不同的容器中使用相同或不同的方法检测标准化物对照以及目标分析物和目标核酸中的至少一种。在各种实施方式中，在检测目标分析物和目标核酸中的至少一种的同时检测标准化物对照。

在某些实施方式中，可以使用ΔC_T法针对标准化物对照将目标分析物的量标准化。在某些实施方式中，可以使用ΔΔC_T法针对标准化物对照将目标分析物的量标准化。在某些实施方式中，标准化物对照的使用使得可以不必使用分析物来制备外部标准曲线，该分析物可以产生与当裂解物中存在相等含量的所述分析物时所观察到的C_T值不同的C_T值。

在某些实施方式中，可以使用ΔC_T法针对标准化物对照将目标核酸的量标准化。在某些实施方式中，可以使用ΔΔC_T法针对标准化物对照将目标核酸的量标准化。在某些实施方式中，标准化物对照的使用使得可以不必使用核酸来制备外部标准曲线，该核酸可以产生与通过裂解物的相等含量的所述核酸所观察到的C_T值不同的C_T值。

在各种实施方式中，使用标准化物对照可以控制近感检测测定法中的变量。近感检测测定法中的某些示例性的变量包括但不限于，核酸降解度、分析物降解度、分析物表位结构得以保持的程度、近感检测探针与分析物结合的效率、连接反应的效率和实时PCR反应的效率。

在各种实施方式中，使用近感检测测定法检测分析物标准化物对照。本文描述了某些示例性的近感检测测定法。在某些实施方式中，使用与目标分析物相同的方法(利用适合的近感检测探针)并在与目标分析物相同的容器中检测分析物标准化物对照。在某些实施方式中，使用与目标分析物相同的方法(利用适合的近感检测探针)但在与目标分析物不同的容器中检测分析物标准化物对照。

在各种实施方式中，通过直接检测法或通过涉及扩增步骤的检测法，检测核酸标准化物对照和/或用于检测分析物标准化物对照的近感检测探针。本文描述了检测核酸和/或近感检测探针的某些示例性方法。在某些实施方式中，使用不同的标记来检测核酸标准化物对照、目标核酸、用于检测分析物标准化物对照的近感检测探针、和/或用于检测目标分析物的近感检测探针。

在核酸标准化物对照是RNA的各种实施方式中，将该核酸标准化物对照进行预处理从而将其转变为能够使用与用于检测近感检测探针、目标核酸和/或第二核酸标准化物对照的方法相同的方法进行检测的形式。

在各种实施方式中，使用实时PCR检测核酸标准化物对照和/或用于检测分析物标准化物对照的近感检测探针。在某些实施方式中，使用PCR和连接的组合来检测核酸标准化物对照和/或用于检测分析物标准化物对照的近感检测探针。例如，在某些实施方式中，通过首先以PCR扩增和随后应用连接探查(ligation inquiry)来检测核酸标准化物对照和/或用于检测分析物标准化物对照的近感检测探针。某些示例性的所述方法是本领域中已知的，并且在例如Chen等，“A homogeneous，ligase-mediated DNAdiagnostic test，”Genome Res.8(5)：549-56(1998)中有描述。

在某些实施方式中，使用涉及首先进行连接反应、随后进行PCR扩增的方法来检测核酸标准化物对照。某些示例性的所述方法是本领域中已知的，并且在例如美国专利4,797,470号中有描述。例如，在某些实施方式中，核酸标准化物对照能够与至少两种寡核苷酸杂交。在某些实施方式中，通过连接使所述至少两种寡核苷酸能够接合。在某些实施方式中，所述寡核苷酸中每一种的可连接末端被核酸标准化物对照带到一起。在某些实施方式中，两种寡核苷酸与连接模板杂交，从而使第一寡核苷酸的3′末端与第二寡核苷酸的5′末端相邻。在某些实施方式中，通过连接将所述寡核苷酸中每一种的可连接末端接合。在某些实施方式中，该连接由连接酶介导。通过涉及连接的方法检测核酸标准化物对照可以在某些实施方式中控制近感检测测定法中的连接反应步骤的效率。

某些示例性封闭剂

在某些实施方式中，在至少一种封闭剂的存在下进行近感检测测定法。在各种实施方式中，在分析物封闭剂和/或核酸封闭剂的存在下进行近感检测测定法。在某些实施方式中，分析物封闭剂是蛋白质。在某些实施方式中，蛋白质封闭剂是明胶。在某些实施方式中，核酸封闭剂主要是单链核酸。在某些实施方式中，核酸封闭剂主要是双链核酸。

在某些实施方式中，向多功能性裂解缓冲液加入至少一种封闭剂。在某些实施方式中，向裂解物加入至少一种封闭剂。在某些实施方式中，在添加一种或多于一种的近感检测探针的之前或同时，向裂解物加入至少一种封闭剂。在某些实施方式中，在检测经杂交的和/或经连接的核酸部分和/或目标核酸之前，向裂解物加入至少一种封闭剂。在某些实施方式中，加入至少一种分析物封闭剂和至少一种核酸封闭剂。在各种实施方式中，当加入多于一种的封闭剂时，可以在相同或不同的时间加入所述多于一种的封闭剂。

图20显示在某些分析物封闭剂、0.1％冷鱼明胶和1％BSA的存在下进行的检测VEGF的近感连接测定法的示例性结果。在这些示例性结果中，近感连接反应在0.1％冷鱼明胶和1％BSA中进行的同样好。

图21显示在某些核酸封闭剂、多聚A、多聚dC、多聚dG+多聚dC、和经剪切的小牛胸腺DNA(“CFD”)的存在下进行的检测VEGF的近感连接测定法的示例性结果。图21中的对照是在于4℃储存至少2周的多聚A的存在下进行的。在这些示例性结果中，在双链核酸封闭剂(多聚dG+多聚dC和经剪切的小牛胸腺DNA)的存在下进行的近感连接测定法比在单链核酸封闭剂(多聚A和多聚dC)的存在下进行的近感连接测定法显示了更大的检测范围。

某些示例性的连接反应终止

在某些实施方式中，在检测经连接的产物之前要终止近感连接测定法中的连接反应。在某些实施方式中，在储存近感连接测定物之前终止连接反应。可以在检测经连接的产物之前或之后储存近感连接测定物。在某些实施方式中，连接反应的终止减少了可以随着时间(例如，在近感检测测定物的储存过程中)而积累的额外的已连接产物的量。

在某些实施方式中，通过以蛋白酶处理来终止该连接反应。本文描述了某些示例性的蛋白酶。在某些实施方式中，通过改变夹板寡核苷酸来终止连接反应。在某些实施方式中，近感检测测定法中所用的夹板寡核苷酸包含替代脱氧胸腺嘧啶(dT)的脱氧尿嘧啶(dU)。在某些实施方式中，通过在连接步骤之后向近感检测测定物中加入尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)来改变含dU的夹板寡核苷酸。在某些实施方式中，改变夹板寡核苷酸减少了可在检测经连接的产物的过程中形成的不需要的引物延伸产物。

图22显示使用含dU的夹板寡核苷酸检测MCP-1的近感检测测定法的示例性结果。在连接反应之后经过和不经过UNG处理，并且在检测连接产物之前经过和不经过冻融循环，由此来进行所述测定法。显示的有以0U、0.002U、0.02U和0.2U的UNG的示例性处理。在该示例性实验中，在37℃持续15分钟、随后在95℃持续3分钟来进行UNG处理。另外，在该示例性实验中，在UNG处理之后立即(实线)、和UNG处理与1循环冻融24小时之后(虚线)进行qPCR来检测连接产物。示例性数据显示UNG温育步骤的引入，在某些实施方式中，减少了连接产物随时间的积累。

近感检测探针和目标核酸的某些示例性检测

在各种实施方式中，可以分别地和/或同时地，在各种实施方式中，检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分和目标核酸。在某些实施方式中，在同一容器中，同时地或不同时地检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分和目标核酸。在某些实施方式中，例如当目标核酸是RNA时，将该目标核酸进行预处理从而将其转变为能够使用与用于检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分的方法相同的方法进行检测的形式。所述预处理包括但不限于逆转录。

在某些实施方式中，将近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分进行预处理从而将它们转变为能够使用与用于检测目标核酸的方法相同的方法进行检测的形式。所述预处理包括但不限于连接和引物延伸反应。在某些实施方式中，当对经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分的检测涉及扩增时，预处理引物延伸反应不是必须的，这是因为扩增条件将使引物延伸反应在扩增之前或扩增的同时发生。

在某些实施方式中，将裂解物分开或分份，并在分开的容器中使用相同的或不同的方法检测目标核酸和近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分。在某些实施方式中，在近感检测探针已被杂交和/或连接之后将裂解物分开。在某些实施方式中，在直到检测之前的所有步骤都已经进行之后将裂解物分开。例如，在某些实施方式中，将裂解物单独分开以利于分别检测近感检测探针组和目标核酸，从而，例如，可以在各自的检测方法中使用相同的检测探针进行检测。在各种实施方式中，可以在裂解之后、近感检测探针结合之后、近感检测探针的杂交和/或连接之后、或蛋白酶处理之后将裂解物分开。

在目标核酸是RNA的某些实施方式中，在所选的检测方法之前或进行该方法的过程中对目标核酸进行逆转录。目标核酸的DNA拷贝也被称为目标核酸(虽然RNA拷贝可以被称为目标RNA核酸，DNA拷贝可以被称为目标DNA核酸)。在各种实施方式中，在目标核酸RNA已经被逆转录成为目标核酸DNA之后，可以通过与检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分的方法相同的方法检测目标核酸DNA。在某些实施方式中，在同一容器中并通过相同的检测方法同时检测目标核酸DNA和近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分。

在某些实施方式中，在同一容器中同时检测多种近感检测探针的经杂交的和/或经连接的多种寡核苷酸部分和多种目标核酸。在某些实施方式中，使用不同的标记以鉴定不同的近感检测探针组和不同的目标核酸。例如，在某些实施方式中，如果在生物样品中检测五种目标分析物和五种目标核酸，并且使用单一的检测反应来检测五种不同的近感检测探针组的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分和五种不同的目标核酸，则可以使用十种不同的标记来分别鉴定不同的产物。在各种实施方式中，所述标记可以是本文所讨论的检测探针的形式、或适合于在该检测方法中使用的本领域中已知的任何其它标记的形式。本领域的技术人员能够根据各种实施方式选择适合的一种或多种标记。

在某些实施方式中，可以使用实时PCR来检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分和/或目标核酸。进行实时PCR的示例性方法包括但不限于，5′核酸酶实时PCR及其多重方案。5′核酸酶实时PCR的某些示例性方法是本领域中已知的，并且在例如Livak，“SNPgenotyping by the 5′-nuclease reaction，”分子生物学方法(Methods MolBiol.)212：129-47(2003)；Lee等，“Seven-color，homogeneous detection of sixPCR products，”生物技术(Biotechniques)27(2)：342-349(1999)；Livak，“Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5′nuclease assay，”遗传分析(Genet Anal.)14(5-6)：143-149(1999)；Heid等，“Real timequantitative PCR，”基因组研究(Genome Res.)6(10)：986-994(1996)；和Lee等，“Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes，”核酸研究(Nucleic Acids Res.)11；21(16)：3761-3766(1993)中有描述。示例性的定量PCR在例如A-Z Quantitative PCR，Bustin，S.编，IUL BiotechnologySeries(2004)中有描述。例如Watson等，Int J Toxicol.2005May-Jun；24(3)：139-145，以及美国专利6,890,718号；6,773,817号和6,258,569号也描述有实时PCR的某些示例性方法。在某些实施方式中，使用TaqMan一步qRT-PCR(Applied Biosystems)检测目标核酸。

在各种实施方式中，可以在定量PCR方法中使用惰性参比染料(passive reference dye)。例如美国专利5,736,333号描述了某些示例性的惰性参比染料。在各种实施方式中，可以在定量PCR方法中使用外部对照。例如美国专利6,890,718号描述了某些示例性的定量对照。

在某些实施方式中，使用PCR和连接的组合来检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分和/或目标核酸。作为非限制性实例，通过首先进行PCR扩增，随后应用连接探查，可以检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分。某些示例性的所述方法是本领域中已知的，并且在例如Chen等，“A homogeneous，ligase-mediatedDNA diagnostic test，”Genome Res.8(5)：549-56(1998)中有描述。作为另一个非限制性实例，通过首先进行连接反应、随后进行PCR扩增，可以检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分。某些示例性的所述方法是本领域中已知的，并且在例如美国专利4,797,470中有描述。

在各种实施方式中，例如在美国专利6,511,810号所述，连接测定物可以包含侧翼核酸内切酶(flap endonuclease)。

在某些实施方式中，将近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分和/或目标核酸在第一“预扩增反应”(例如在PCT公报WO2004/051218号中所述)中扩增，然后在第二扩增反应中译码。某些示例性的所述方法是本领域中已知的，并且在例如美国专利6,605,451号；Lao等的美国专利申请11/090,468号和Andersen等的美国专利申请11/090,830号中有描述。

检测近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分和/或目标核酸的某些示例性方法还在例如美国专利6,511,809B2号；美国公报US 2002/0064779A1号；和PCT公报WO 2005/123963号中有描述。例如Bodeau等的美国专利申请11/372,242号描述了某些示例性的多重检测方法。

在各种实施方式中，检测探针被用于促进对近感检测探针的经杂交的和/或经连接的寡核苷酸部分和/或目标核酸和/或扩增产物的检测。本文讨论了某些示例性的检测探针。在各种实施方式中，本领域的技术人员能够根据所需应用选择一种或多于一种的适合的检测探针。

示例性试剂盒

在各种实施方式中，提供了包含用于进行所述方法的至少一种成分的试剂盒。在各种实施方式中，试剂盒包含至少一种多功能性裂解缓冲液。在各种实施方式中，试剂盒包含至少一个近感检测探针组。在各种实施方式中，试剂盒包含至少一种蛋白酶。在各种实施方式中，试剂盒包含至少一种连接酶。在各种实施方式中，试剂盒包含至少一种标准化物对照。

在各种实施方式中，试剂盒包含检测近感检测探针组和/或目标核酸用的至少一种成分。在各种实施方式中，试剂盒包含检测标准化物对照用的至少一种成分。示例性的成分包括但不限于，检测探针、引物、聚合酶和逆转录酶。

实施例

实施例1：细胞裂解物中蛋白质和mRNA的定量检测

通过在1000×g离心5分钟来沉淀Raji人B-细胞淋巴瘤细胞。以50,000细胞/μl的PBS的浓度重悬细胞。向悬浮液加入等体积的2×缓冲液N(2×缓冲液N是0.2％NDSB-201、50mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mMEDTA(pH 8.0))，并通过涡旋充分混合5秒钟。

近感连接测定法

选择五种目标分析物以通过近感连接测定法检测。所述目标分析物是ADAM9(ADAM金属肽酶结构域9；

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝ADAM9&search＝ADAM9)；CCL5(趋化因子(C-C基元)配体5；

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝CCL5&search＝ccl5)；CSTB(半胱氨酸蛋白酶抑制剂B；

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝CSTB&search＝cystatin+B)；SMAD4(Mothers against DPP同源物4；

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝SMAD4&search＝smad4)；和RUNX1(Runt相关转录因子1；

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝RUNX1&search＝runx1)。在该实验中，对于每一种目标分析物分别进行近感连接测定法。

近感检测探针由Simon Fredriksson提供。PCT公报WO 2005/123963号描述了示例性的近感检测探针和设计近感检测探针的方法。对于每一种分析物，合成两种寡核苷酸，第一种具有5′-结合的链霉抗生物素蛋白，第二种具有3′-结合的链霉抗生物素蛋白。将5μl的200nM的第一种链霉抗生物素蛋白结合的寡核苷酸的储备液与5μl的200nM的生物素化的抗所选目标分析物的多克隆抗体(所有生物素化的多克隆抗体均获得自R&D Systems)在缓冲液C(1×PBS(pH 7.4)，0.1％BSA，5nM EDTA)中的储备液混合。相似地，将5μl的200nM的第二种链霉抗生物素蛋白结合的寡核苷酸的储备液与5μl的200nM的生物素化的抗所选目标分析物的多克隆抗体在缓冲液C中的储备液混合。将混合物在室温温育1小时。通过将99μl缓冲液D(1×PBS(pH 7.4)、1％BSA、1mM生物素和16μg/ml多聚A)加到1μl近感检测探针中，将每种近感检测探针在缓冲液D中稀释至1nM。这得到用于五种目标分析物中每一种的第一和第二近感检测探针(即近感检测探针组)。

为了形成五种单独的溶液，其中每种溶液具有五种不同的近感检测探针组中的一个，将探针组的第一和第二近感检测探针在缓冲液D中以每种近感检测探针100pM的浓度结合。通过以缓冲液D稀释来制备具有5000细胞/μl、500细胞/μl或50细胞/μl的当量的3种浓度的细胞裂解物。向细胞裂解物稀释液中加入磷酸酶抑制剂混合物(100×HALT磷酸酶抑制剂混合物，Pierce目录号为78420)至1×的浓度从而保护第二近感检测探针的5′磷酸。将1μl的在缓冲液N中的细胞裂解物与1μl的近感检测探针对溶液混合并在37℃温育1小时。探针结合混合物中的每一种近感检测探针的浓度为50pM。

对于探针连接，一种或多种夹板寡核苷酸由Simon Fredriksson提供。PCT公报WO 2005/123963号描述了示例性的夹板寡核苷酸和设计夹板寡核苷酸的方法。每种夹板寡核苷酸能够与近感检测探针组的寡核苷酸部分中的每一种的一部分杂交从而使近感检测探针组中的第一寡核苷酸部分的自由3′末端与近感检测探针组中的第二寡核苷酸部分的自由5′末端相邻。每种夹板寡核苷酸均是非对称的(见例如PCT公报WO2005/123963号)。向探针结合混合物中加入120μl的连接溶液(1×PCR II缓冲液(Applied Biosystems)、100nM夹板寡核苷酸、1.5mM MgCl₂、0.3mMNAD、10mM DTT和2.5单位扩增酶(Ampligase)(Epicentre))。Raji细胞在3种连接混合物(对于每个近感检测探针组)中的当量浓度是约41.7细胞/μl、4.17细胞/μl和0.417细胞/μl。将连接混合物在30℃温育10分钟。取出20μl约含有41.7细胞/μl和4.17细胞/μl的连接混合物留作mRNA检测用(在下文描述)。

使用实时PCR按照以下方式检测经连接的近感检测探针组。将10μl的连接混合物与10μl的2×Power SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems；目录号：4367218)和每种0.04μl的正向和反向引物混合(对于每种引物，引物终浓度是400nM)，所述正向和反向引物是为了扩增近感检测探针对的经连接的寡核苷酸部分、而不是扩增未连接的近感检测探针而设计的。正向和反向引物由Simon Fredriksson提供。PCT公报WO2005/123963号描述了示例性的正向和反向引物序列。根据Power SYBRGreen PCR Master Mix方案(Applied Biosystems；目录号4310251)进行实时PCR。

mRNA检测

在37℃以5μl的链霉菌蛋白酶(streptomyces griseus protease)(Fluka目录号81748；6.34U/mg，浓度2.5U/μl)处理20μl连接混合物样品60分钟。随后用10分钟将该混合物加热至75℃以降低或消除蛋白酶活性。经蛋白酶处理的连接混合物被称为“mRNA样品”。Raji细胞在两种mRNA样品(对于每个近感检测探针组)中的当量浓度约为33.3细胞/μl和3.33细胞/μl。

通过加入100μl水和5μl的50μg/μl BSA(Ambion；目录号2616)将25μl的mRNA样品按约1∶5稀释。BSA在经稀释的mRNA样品中的终浓度因此约为2μg/μl，并且Raji细胞在两种经稀释的mRNA样品(对于每个近感检测探针组)中的当量浓度约为6.6细胞/μl和0.66细胞/μl。在25μl TaqMan一步qRT-PCR反应中使用5μl的经稀释的mRNA样品。对于每个近感检测探针组，RT-PCR反应中的Raji细胞的当量总数约为33细胞和3.3细胞，假定RNA浓度为约15Pg/细胞，则其分别约相当于0.5ng总RNA和0.05ng总RNA。以1×的浓度使用TaqMan基因表达测定引物和探针(Applied Biosystems；目录号：SMAD4：Hs00232068_m1；CCL5：Hs00174575_m1；CSTB：Hs00164368_m1；ADAM9：Hs00177638_m1；RUNX1：Hs00234079_m1)，并根据制造商的方案(Applied Biosystems；试剂盒目录号4309169；方案目录号4310299)使用Applied Biosystems TaqMan一步RT-PCR Mastermix试剂盒进行一步RT-PCR反应。将连接混合物中18S RNA的检测作为对照(使用18S RNA对照试剂，Applied Biosystems，目录号4308329)。最后，对于每种所选目标均使用100ng从Raji细胞纯化的RNA作为阳性对照。除了在单一孔中进行的阳性对照，每一反应均按3次重复进行。五种所选的目标分析物全部使用FAM检测，而18S则使用VIC检测。

该实验中的近感连接测定法和mRNA检测测定法的结果如下所示。图1显示了对于每种目标分析物在3种所检测的Raji细胞裂解物浓度的平均循环阈值(Ct)。该数据表明这一近感连接测定法实验成功地以计量依赖的方式检测到了CSTB。

图2显示了如上所述对于用于检测目标mRNA的TaqMan一步qRT-PCR反应中的每一种的荧光相对增加(ΔRn)对循环的关系。图2中只检测了FAM层，所以使用VIC的18S反应是不可检测的。除了阳性对照，每一反应均按3次重复进行。该数据显示了几乎所有的TaqMan一步qRT-PCR反应均产生了可检测的扩增产物。大幅度的荧光相对增加表明对于每种目标mRNA均实现了相对明显的扩增。

图3通过在其中进行反应的96孔板中的孔位，显示了对于TaqMan一步qRT-PCR反应中的每一种的循环阈值(Ct)的图。图3中只检测了FAM层，所以使用VIC的18S反应是不可检测的。反应的孔位如下。孔A1-A12(图3上的1-12)含有对于五种目标mRNA中的四种(ADAM9在孔A1-A3中、CCL5在孔A4-A6中、CSTB在孔A7-A9中、SMAD4在孔A10-A12中)使用较高Raji细胞当量浓度(33细胞/反应)的3次重复反应。孔B1-B6(图3上的13-18)含有对于RUNX1(孔B1-B3)和对照RNA 18S(孔B4-B6)使用最高Raji细胞当量浓度(33细胞/反应)的3次重复反应。孔B7-B12(图3上的19-24)含有阳性对照反应，所述阳性对照反应使用从Raji细胞中纯化的100ng RNA以检测每种所选目标(分别在孔B7-B11中的ADAM9、CCL5、CSTB、SMAD4)和18S RNA(孔B12)。孔C1-C12(图3上的25-36)含有对于五种目标mRNA中的四种(ADAM9在孔C1-C3中、CCL5在孔C4-C6中、CSTB在孔C7-C9中、SMAD4在孔C10-C12中)使用较低的Raji细胞当量浓度(3.3细胞/反应)的3次重复反应。孔D1-D6(图3上的13-18)含有对于RUNX1(孔D1-D3)和对照RNA 18S(孔D4-D6)使用较低的Raji细胞当量浓度(3.3细胞/反应)的3次重复反应。这些数据显示对于全部所选择目标，使用33细胞/反应在TaqMan一步qRT-PCR反应中均检测到mRNA。

假定33细胞/反应相当于约0.5ng/反应，则使用了100ng经纯化的Raji RNA的阳性对照反应含有约200×以上的RNA。对于200×以上的RNA，预计循环阈值(ΔCt)的差异为约7.6，这约等于所观察到的(将孔1-3与孔19相比、孔4-6与孔20相比、孔7-9与孔21相比、孔10-12与孔22相比、孔13-15与孔23相比)。所测定的平均ΔCt对于ADAM9是6.99、对于CCL5是6.00、对于CSTB是5.21、对于SMAD4是4.97、对于RUNX1是3.03。

图4显示了对于用于检测18S RNA的TaqMan一步qRT-PCR反应中的每一反应的荧光相对增加(ΔRn)对循环的关系。图4中只检测了VIC层，所以使用FAM的目标mRNA反应是不可检测的。除了阳性对照，每一反应均按3次重复进行。该数据显示用于检测18S RNA的所有TaqMan一步qRT-PCR反应都产生可检测的扩增产物。大幅度的荧光相对增加表明对于所有反应中的18S RNA均实现了相对明显的扩增。

图5通过在其中进行反应的96孔板中的孔位，显示了对于TaqMan一步qRT-PCR反应中的每一种的循环阈值(Ct)的图。图3中只检测了VIC层，所以只有18S反应是可检测的。这些反应的孔位如图3所述。这些数据显示在每一反应中均可检测18S RNA。

实施例2：使用RT和不使用RT、以及经过蛋白酶处理和不经过蛋白酶处理的mRNA检测

进行mRNA检测实验来测定使用和不使用逆转录酶(RT)反应中的18S RNA的含量。还进行了经过和不经过蛋白酶处理的反应。通过进行使用和不使用RT的反应，能够确定含有RNA和基因组DNA的反应与只含有基因组DNA的反应之间的ΔCt。

在该实验中，将Raji细胞在三种不同的裂解缓冲液中按5000细胞/μl的终浓度裂解。第一缓冲液，即缓冲液Na，含有10％NDSB-201、50mMTris 8.0和1mM EDTA；第二缓冲液，即缓冲液Nb，含有1％NDSB-201、50mM Tris 8.0和1mM EDTA；第三缓冲液，即缓冲液Nc，含有0.1％NDSB-201、50mM Tris 8.0和1mM EDTA。在37℃以链霉菌蛋白酶(2.5U/μl)对每种Raji细胞裂解物中的一半处理30分钟，随后在75℃热处理5分钟。将样品中的另一半在37℃温育30分钟，随后在75℃热处理5分钟，但不加入蛋白酶。经蛋白酶处理的样品变粘，而未经处理的样品不变粘。

图6显示了10μl的每种裂解物的琼脂糖凝胶电泳。该凝胶显示经蛋白酶处理的样品释放RNA和基因组DNA，而未经处理的样品则不释放RNA和基因组DNA。

随后将三种Raji细胞裂解物(在缓冲液Na、缓冲液Nb、和缓冲液Nc中)在50mM Tris(pH 8.0)中稀释，根据需要利用1mM EDTA标准化为0.1％NDSB-201的浓度。结果，经稀释的缓冲液Na裂解物含有50细胞/μl，经稀释的缓冲液Nb裂解物含有500细胞/μl，缓冲液Nc裂解物保持为5000细胞/μl。在每种25μl的TaqMan一步qRT-PCR反应中使用5μl的裂解物以检测18S RNA。将使用和不使用RT的每种裂解物(每种细胞浓度，经过和未经过蛋白酶处理)按3次重复进行测试。使用ABI PRISM7700系统分析反应。

图7显示了该实验的结果。反应的孔位如下。孔A1-A12(图7中的1-12)含有采用RT的反应，这些反应使用经蛋白酶处理的裂解物：250细胞/反应(孔A1-A3)、2500细胞/反应(孔A4-A6)、25,000细胞/反应(孔A7-A9)和无模板的对照(“NTC”)(孔A10-A12)。孔B1-B12(图7中的13-24)含有不使用RT的反应，这些反应使用经蛋白酶处理的裂解物：250细胞/反应(孔B 1-B3)、2500细胞/反应(孔B4-B6)、25,000细胞/反应(孔B7-B9)和无模板的对照(“NTC”)(孔B10-B12)。孔C1-C9(图7中的25-33)含有使用RT的反应，这些反应使用未经蛋白酶处理的裂解物：250细胞/反应(孔C1-C3)、2500细胞/反应(孔C4-C6)和25,000细胞/反应(孔C7-C9)。孔D1-D9(图7中的37-45)含有不使用RT的反应，这些反应使用未经蛋白酶处理的裂解物：250细胞/反应(孔D1-D3)、2500细胞/反应(孔D4-D6)和25,000细胞/反应(孔D7-D9)。

这些数据显示，在可检测地扩增18S RNA或基因组DNA的实验中对裂解物进行蛋白酶处理是必要的。另外，TaqMan一步qRT-PCR反应在检测250细胞/反应时可很好地检测到18S RNA或基因组DNA，但在2500细胞/反应和25,000细胞/反应时不能很好地进行检测(将图7的孔1-3和13-15与孔4-9和15-21比较)。最终，使用RT的反应(孔1-3)和不使用RT的反应(孔13-15)之间的ΔCt约为8.5。该ΔCt表示18S RNA的扩增和18S基因组DNA的扩增之间的ΔCt。据估计，一个二倍体的Raji细胞含有约540拷贝的18S基因组序列和约1,000,000拷贝的18S RNA。因此，18S RNA比18S基因组DNA多2000倍，这将可以预测到会得到约11的ΔCt。所观察到的8.5的ΔCt和预测的11的ΔCt之间的差异可能是18SRNA扩增的较低效率导致的。

实施例3：去污剂测试

测试了不同的去污剂和亲水性化合物在裂解Raji细胞和释放完整核酸方面的效率(通过琼脂糖凝胶确定)。所测试的有以下化学品：NMP(Sigma)、Mackernium(CJ Petrow)、Empigen(Calbiochem)、NDSB-201(Calbiochem)、Zwittergent 3-10(Calbiochem)、Zwittergent 3-14(Calbiochem)、TMACL(Sigma)、DDMAB(Calbiochem)、CAPSO(Sigma)、CHAPS(Calbiochem)、LDAO(Calbiochem)、Sarkosyl(Sigma)、CTAB(Calbiochem)、DEDTAB(Fluka)、DLS(Sigma)和DTAB(Sigma)。以50,000Raji细胞/μl，在含有50mM Tris(pH 8.0)、1mM EDTA的缓冲液中以0.5％测试了每种化学品的裂解。

图8显示了裂解物中的核酸的琼脂糖凝胶电泳的示例性结果。上方的泳道是分别使用NMP、Mackernium、Empigen、NDSB-201、Zwittergent3-10、Zwittergent 3-14、TMACL和DDMAB的裂解物。下方的泳道是分别使用CAPSO、CHAPS、LDAO、Sarkosyl、CTAB、DEDTAB、DLS和DTAB的裂解物。通过该实验可以将NMP、Empigen、NDSB-201、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-14、DDMAB、CAPSO、CHAPS、LDAO、CTAB、DEDTAB和DTAB确认为用于本文所述方法中的可能候选物。

此外，进行了筛选研究以在琼脂糖凝胶上确定使用每种化学品的裂解物在加热后是否含有完整的核糖体RNA带，以及这些化学品在0.1％的浓度是否与TaqMan一步qRT-PCR反应相容(数据未显示)。在这些实验之后，选择NDSB-201(非去污剂磺基甜菜碱-201；3-(1-吡啶并)-1-丙烷磺酸盐)、LDAO(十二烷基二甲氧化胺)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙烷磺酸)和CHAPS(3-[(3-胆胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐)以用于进一步筛选。探究近感连接测定法的抑制的实验还表明DEDTAB(溴化十二烷基乙基二甲基铵)和Zwittergent 3-10(正癸基-N，N-二甲基-3-铵-1--丙烷磺酸盐)也是用于本文所述方法的候选物(数据未显示)。

在可表明抗原/抗体相互作用被保持的ELISA测定法中，测试了全部四种化学品的相容性。在使用VEGF作为目标的夹心ELISA测定法中，全部四种化学品显示了至少部分相容性(数据未显示)。使用NDSB-201、LDAO和CAPSO，以PBS为标准，利用100pg/ml VEGF和R&D SystemsVEGF ELISA试剂盒以及ELISA读板仪进行了第二ELISA实验。在该实验中，CAPSO和LDAO显示了与BSA相当的背景读数和与BSA相当的样品读数。NDSB-201同样显示了与BSA相当的背景读数，但比BSA高的样品读数(数据未显示)。

在另一项实验中，在2％NDSB-201或5mM CAPSO中产生Raji细胞裂解物。随后将每种裂解物按1∶5和1∶10稀释，并且在于37℃温育30分钟、随后于50℃温育5分钟的过程中评价裂解物和裂解物稀释液抑制核糖核酸酶降解核糖体RNA的能力。图9显示了该结果。RNA在所有的被测试样品中均显示保持未被降解。发现LDAO在温育延长时保护RNA的效率较差(数据未显示)。

NDSB-201是相关化学品大家族中的成员，该家族还包括NDSB-195、-211、-221、-256和-256-HT。例如见Calbiochem目录。针对裂解Raji细胞和保护RNA，对这些化学品中的每一种都进行了筛选。在这些实验中，NDSB-201在所测试的化学品中表现最好(数据未显示)。

实施例4：其它试剂测试

使用在缓冲液N中的Raji细胞裂解物的各种稀释液进行近感连接测定法。在用于检测VEGF的近感连接测定法中，使用由在缓冲液N中50,000细胞/μl的Raji细胞裂解物开始，在缓冲液D中1∶5、1∶10、1∶50和1∶100倍的稀释液。该测定法按照以上实施例1中所述的方法进行。结果在图10中显示。在该实验中，裂解物的1∶50的稀释液(在2μl的结合反应中得到1,000个细胞)显示了最佳结果(即最低的平均循环阈值)。

进行实验以确定在缓冲液N中的Raji细胞裂解物中的RNA的稳定性。在存在或不存在1μl抗核糖核酸酶抑制剂(Anti-RNAse inhibitor)(储备液是22u/μl，Ambion；目录号2690)的情况下在37℃将8μl裂解物(50,000细胞/μl)温育0、1或4小时。温育之后，加入含有0.5％SDS和2μg/μl蛋白酶K(Ambion；目录号2546)的32μl溶液，并使裂解物在55℃温育30分钟。随后向每种裂解物加入40μl的2×甘油上样缓冲液(2×GLB；50％甘油、0.5×TBE，含有溴酚蓝和二甲苯青染料)。随后将16μl的裂解物上样于1.4％琼脂糖凝胶上。该结果在图11中显示。在该实验中，在所有被测试的条件下RNA在Raji裂解物中均稳定。在该实验中无需核糖核酸酶抑制剂来保护RNA。

随后在与上一段中所述的测定法相似的RNA稳定性测定法中测试了Tween-20的效果。在这一实验中，以50,000细胞/μl在上述的缓冲液Na(10％NDSB-201)、缓冲液Nb(1％NDSB-201)和缓冲液Nc(0.1％NDSB-201)中制备Raji细胞裂解物。在37℃将8μl裂解物与或不与0.2μl的20％Tween-20(在裂解物中的终浓度，0.5％)温育4小时。温育之后，加入32μl含有0.5％SDS和2μg/μl蛋白酶K的溶液，并使裂解物在55℃温育30分钟。随后向每一裂解物加入40μl的2×GLB。随后将16μl的裂解物上样于1.4％琼脂糖凝胶上。该结果在图12中显示。RNA在只含有NDSB-201的每一种样品中均相对稳定，然而，RNA在还含有含有Tween-20的所有样品中较不稳定。因此表明Tween-20较不适合于在这一实验中的应用。

随后测试了缓冲液N抑制核糖核酸酶A活性的能力。在50mM Tris(pH 8.0)、1mM EDTA和0.5μg/μl BSA中制备核糖核酸酶A(Ambion；目录号2270)的1mg/ml的储备液。将10μl(500ng)的经纯化的Raji细胞RNA(储备液是50ng/μl；Applied Biosystems TaqMan对照总RNA(人)，目录号4307281)与核糖核酸酶A储备液在缓冲液N或50mM Tris、5mMEDTA(pH 8.0)中的1∶100,000、1∶1,000,000和1∶10,000,000倍的5μl稀释液混合。将该反应物在37℃温育10分钟。随后加入1μl的抗核糖核酸酶抑制剂(储备液是22u/μl；Ambion)和4μl的5×RNA上样缓冲液(Ambion；目录号8556；10×储备液，作为5×使用)，并将16μl的反应物上样于1.4％琼脂糖凝胶上。该结果显示在图13中。在该实验中，核糖核酸酶的活力与含有缓冲液N的反应和含有Tris/EDTA的反应相同，这表明缓冲液N不抑制核糖核酸酶A的活力。然而，基于以缓冲液N制备的裂解物中RNA的稳定性，缓冲液N可以通过除抑制核糖核酸酶A以外的其它机制来稳定RNA。

图14显示了在各种处理条件下以缓冲液N制备的Raji细胞裂解物中蛋白质的稳定性。将在各种条件下在缓冲液N中制备10μl裂解物(50,000细胞/μl)于37℃温育4小时。在上样到10％SDS-丙烯酰胺凝胶之前，将裂解物在1×Novagen SDS-变性凝胶上样缓冲液(Novagen；目录号70607)中于95℃处理5分钟。在每一泳道中上样1.5μl裂解物。使用PierceGel Code Stain(Pierce Chemical；目录号24590)将该凝胶染色过夜。在该实验中，在包括于37℃温育至少4小时在内的各种条件下Raji细胞蛋白质在缓冲液N中均稳定。

实施例5：蛋白酶测试

进行实验以确定各种蛋白酶在如实施例1所述的近感连接测定法和mRNA检测测定法中的适用性。在蛋白酶的选择中所考虑的特性包括：该蛋白酶能否被加热失活、对于活性该蛋白酶是否需要金属离子、该蛋白酶是否需要诸如SDS等去污剂、该蛋白酶消化是否降解RNA和该蛋白酶是否充分释放RNA。

筛选了以下的蛋白酶：胃蛋白酶(Sigma)、胶原酶(Sigma)、I型蛋白酶粗制物(来自牛胰)(Sigma)、蛋白酶(枯草杆菌)(Sigma)、X型蛋白酶(嗜热溶蛋白芽孢杆菌，bacillus thermoproteolyticus，Calbiochem)、XIII型蛋白酶(曲霉菌，aspergillus saitoi，Sigma)、XXI型蛋白酶(链霉菌，Fluka)和蛋白酶K(Ambion)。对于每种测试，将Raji细胞在PBS中的2μl悬浮液(50,000细胞/μl)与8μl的缓冲液Na(含有10％NDSB-201)混合从而裂解细胞。向Raji细胞裂解物加入4μl的约20mg/ml蛋白酶，并将该混合物在37℃温育30分钟。30分钟之后，检测裂解物的粘度。枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶和蛋白酶K均使裂解物变得粘稠。牛胰粗制蛋白酶也使裂解物变得稍微粘稠。其余的蛋白酶不显著增加裂解物的粘度。

随后将裂解物在1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳，从而确定蛋白酶是否释放RNA和DNA，以及它们是否引起RNA和DNA的降解。图15显示了该实验的结果。数据显示，在该实验中，枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶和蛋白酶K在释放裂解物中的RNA和DNA方面最有效。该实验显示，牛胰粗制蛋白酶释放DNA，但不释放RNA。该实验显示，胶原酶可能导致DNA和/或RNA的降解。

利用在两种不同的裂解缓冲液中裂解的Raji细胞进行第二次蛋白酶筛选。第一种裂解缓冲液是缓冲液Na加0.2％LDAO。第二种制剂是缓冲液Nc。将5μl的在PBS中的Raji细胞(50,000细胞/μl)与5μl的2×裂解缓冲液混合，并在室温温育15分钟。向Raji细胞裂解物加入4μl的约20mg/ml蛋白酶，并将该混合物在37℃温育30分钟。随后加入5μl的50mM EDTA，并将裂解物在75℃温育5分钟。加入5μl的GLB，并将样品在1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳。该实验中测试了以下的蛋白酶：胃蛋白酶、胶原酶、蛋白酶(枯草杆菌)、X型蛋白酶(嗜热溶蛋白芽孢杆菌)、XIII型蛋白酶(曲霉菌)、XXI型蛋白酶(链霉菌)和蛋白酶K。

该实验的结果在图16和图17中显示。图16显示了利用含有0.2％LDAO的缓冲液Na的结果，而图17显示了利用缓冲液Nc的结果。在该实验中，向含有NDSB-201的缓冲液加入LDAO并不在蛋白酶消化的过程中增强RNA的稳定性(见图16)。

虽然已经通过参考各种应用、方法和组成描述了本文所公开的教导，但应该认识到，可以不背离本文的教导情况下做出各种变化和改进。上述实施例是用以更好地阐明本发明的教导，而不是意图限制本发明的教导的范围。根据所附权利要求书可以进一步理解本发明的教导的某些方面。

Claims

1.一种检测细胞中的至少一种目标分析物和至少一种目标核酸的方法，所述方法包括：

a)在多功能性裂解缓冲液中裂解所述细胞从而产生细胞裂解物；

b)使用近感检测测定法检测所述细胞裂解物中的至少一种目标分析物；和

c)使用核酸定量检测测定法检测所述细胞裂解物中的至少一种目标核酸；

其中(b)和(c)在同一容器中进行。

2.如权利要求1所述的方法，其中至少一种目标分析物选自蛋白质、肽、碳水化合物和激素。

3.如权利要求2所述的方法，其中至少一种目标分析物是蛋白质。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述近感检测测定法包括：

a)将所述细胞裂解物与第一近感检测探针和第二近感检测探针在使得所述第一近感检测探针和所述第二近感检测探针之间能够相互作用的条件下温育；和

b)检测所述第一近感检测探针和所述第二近感检测探针之间的所述相互作用。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一近感检测探针包含第一寡核苷酸部分和第一分析物结合部分，并且其中所述第二近感检测探针包含第二寡核苷酸部分和第二分析物结合部分。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一分析物结合部分和所述第二分析物结合部分能够结合相同的目标分析物。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述第一分析物结合部分和所述第二分析物结合部分能够结合不同的目标分析物。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述第一近感检测探针和所述第二近感检测探针之间的所述相互作用包括选自所述第一寡核苷酸部分和所述第二寡核苷酸部分之间的杂交和所述第一寡核苷酸部分和所述第二寡核苷酸部分的连接中的至少一种方法。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一近感检测探针和所述第二近感检测探针之间的所述相互作用包括所述第一寡核苷酸部分和所述第二寡核苷酸部分的连接。

10.如权利要求4所述的方法，其中所述温育包括至少一种夹板寡核苷酸。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种目标核酸是至少一种mRNA。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述核酸定量检测测定法包括逆转录和实时PCR。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种目标核酸中的至少一种目标核酸编码所述至少一种目标分析物中的至少一种目标分析物。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述多功能性裂解缓冲液包含选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述多功能性裂解缓冲液包含NDSB-201。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述检测至少一种目标分析物包括第一实时PCR反应，并且所述检测至少一种目标核酸包括第二实时PCR反应。

17.一种检测细胞中的至少一种目标分析物和至少一种目标核酸的方法，所述方法包括：

b)将所述细胞裂解物与下述物质温育：

(i)至少一个近感检测探针组，其中每个近感检测探针组包括至少两种近感检测探针，并且其中每种近感检测探针包含至少一种分析物结合部分和至少一种寡核苷酸部分；

(ii)至少一种夹板寡核苷酸；和

(iii)至少一种连接酶；

由此形成至少一种经连接的近感检测探针组；

c)将所述细胞裂解物与至少一种蛋白酶温育；

d)检测所述至少一种经连接的近感检测探针组；和

e)检测至少一种目标核酸。

18.如权利要求17所述的方法，其中至少一种目标分析物是蛋白质。

19.如权利要求17所述的方法，其中(d)和(e)在同一容器中进行。

20.一种检测细胞中的至少一种目标分析物和至少一种目标核酸的方法，所述方法包括：

b)将所述细胞裂解物与至少一个近感检测探针组温育，从而形成至少一个经杂交的近感检测探针组，其中每个近感检测探针组包括至少两种近感检测探针，并且其中每种近感检测探针包含至少一种分析物结合部分和至少一种寡核苷酸部分；

c)将所述细胞裂解物与至少一种蛋白酶温育；

d)检测所述至少一个经杂交的近感检测探针组；和

e)检测至少一种目标核酸。

21.如权利要求20所述的方法，其中至少一种目标分析物是蛋白质。

22.如权利要求20所述的方法，其中(d)和(e)在同一容器中进行。

23.如权利要求20所述的方法，其中(b)中的所述温育包含至少一种夹板寡核苷酸。

24.一种多功能性裂解缓冲液，所述多功能性裂解缓冲液包含选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。

25.如权利要求24所述的多功能性裂解缓冲液，所述多功能性裂解缓冲液包含NDSB-201。

26.如权利要求24所述的多功能性裂解缓冲液，其中至少一种化学品以0.05％～5％的浓度存在。

27.一种用于检测至少一种目标分析物和至少一种目标核酸的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种多功能性裂解缓冲液，所述多功能性裂解缓冲液含有选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。

28.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一种连接酶。

29.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一个近感检测探针组。

30.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一种蛋白酶。

31.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一种引物、至少一种检测探针和至少一种聚合酶。

32.一种含有裂解液的组合物，其中所述裂解液包含多功能性裂解缓冲液和至少一个近感检测探针组，所述多功能性裂解缓冲液含有选自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一种化学品。