CN111902546A

CN111902546A - 量化物质中的生物负荷的方法

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Publication number: CN111902546A
Application number: CN201980021800.2A
Authority: CN
Inventors: M.L.里德; J.哈彻森
Original assignee: Buckman Laboratories International Inc
Current assignee: Buckman Laboratories International Inc
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2020-11-06
Also published as: JP2021516985A; US20190292608A1; BR112020019458A2; AU2019242012A1; EP3743529A1; CA3093562A1; MX2020009985A; WO2019190673A1

Abstract

提供量化工业物质中存在的生物负荷的方法，其利用聚合酶链反应(PCR)和经多个PCR热循环的扩增信号的检测。PCR靶向在经常在工业物质中发现的一种或多种生物污着剂中发现的DNA的片段。从所述物质取得的样品可被直接使用或首先过滤、纯化、裂解、稀释、或者经历这样的预处理的组合。所述物质被用于例如如下的工业应用和场所中或者被测试对于用于例如如下的工业应用和场所中的准备状态：非制药应用、非医疗应用、造纸设施、皮革处理设施等。提供控制或处理物质或者利用这样的物质的系统、或者控制或处理旨在与所述物质进行接触的方法。

Description

量化物质中的生物负荷的方法

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年3月26日提交的在先美国临时专利申请No.62/648,013、和2018年5月11日提交的在先美国临时专利申请No.62/670,056的权益，将其完全引入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及工业物质中或工业应用中的生物负荷。更详细地，本发明涉及量化或获悉或测定工业应用(例如，但不限于，造纸、纸浆生产、皮革加工、油气采收或生产、发酵过程、水处理、和/或污水处理)中存在或使用的物质中的生物负荷的方法。

生物负荷量化可以菌落形成单位(CFU)表示。生物负荷还与例如其中微生物聚集在装置的表面上或者风扇冷却的设备内的生物污着有关。这可增加人感染的风险。生物负荷通常定义为生活在尚未被杀菌(sterilized，消毒)的表面上的细菌的数量。针对在美国制造或使用的医疗装置的生物负荷测试通过联邦法规法典第21篇管控并且在全世界通过ISO 11737管控。

生物负荷测试的目的是测量活微生物的总数(总微生物计数)。在工业制造和生产以及处理设施中，获悉生物负荷是重要的，因此可考虑和/或采取适当的步骤以避免或控制正在生产的产品的生物污着和/或避免正在所述制造和生产以及处理设施处使用的机械或系统或原材料或加工材料的生物污着。

目前，在工业制造和生产以及处理设施中，生物负荷多半是使用皮氏(petri)膜或ATP测试而研究或评估的。ATP测试是通过检测三磷酸腺苷而快速测量活跃生长的微生物的过程。ATP测试虽然快速，但是提供了被认为灵敏性较低的结果和/或提供具有提高的变化性的结果和/或提供具有‘噪声’的结果。换而言之，ATP测试可提供生物负荷的一般了解，但是不是如下的非常精确的了解：即，其可用于关于生物负荷的细节对生物负荷进行量化，使得例如，生物负荷的处理可为足够的并且不通过过剂量而浪费处理用化学品。

工业应用中常用的另一方法是使用其中准备琼脂的常规的平板培养(plating)方法或者使用提供多合一平板培养系统的皮氏膜平板。虽然所述皮氏膜平板和方法由于其成本效益、简单性、便利性和易使用性而被使用，但是所述方法存在在获得结果方面花时间(有时24小时-48小时)的问题，并且所述方法进一步存在对于正在皮氏膜上生长或者繁殖的确切生物体不是特异性的问题。所述平板培养方法局限于典型地不类似于实际样品的限定的介质并且因此限制了可成功生长的生物体。

因此，对于可解决用于获悉生物负荷的当前方法的问题的方法存在需要。进一步地，需要提供如下方法：其可更精确地和/或以快速方式量化生物负荷和/或提供关于具体的生物体物种的生物负荷细节，这全部导致获悉和因此处理或控制生物负荷的更有效能力。

发明内容

本发明的一个特征是提供用于对一系列工业过程中的生物污着剂(biofoulingagents)进行计数(enumeration)的快速方法。可根据本发明测试和计数的生物污着剂包括，但不限于，细菌、藻类、真菌、和/或酵母。对生物污着剂例如细菌进行计数在决定是否需要或推荐液体、纸浆、水、盐水、鞣液、悬浮液、分散体、乳液、污泥、或其它物质的处理以及应当使用多少处理剂方面可为重要的。例如，通过对工业样品例如造纸用纸浆中的细菌菌落进行计数或量化，可算出(calculate)、计算(compute)、或者以其它方式确定可被投配(dosed，计量添加)到造纸用纸浆中用于控制和/或杀灭细菌的杀生物剂的有效但是最小的量。可避免过量杀生物剂的使用，并且可在最少的杀生物剂污染和消耗的情况下产生成本有效的处理。

根据本教导的检测方法和处理可用于如下工业中：其包括，但不限于，造纸用纸浆生产、皮革加工、油气采收或生产、发酵过程、冷却水塔、水处理、和/或污水处理。根据本发明，可快捷且同时对许多不同的生物污着剂进行测试和计数。所述计数可限于通常或经常在具体工业物质中发现的特定生物污着剂，或者限于一组或一群生物污着剂。例如，来自冷却水塔的水的分析可包括对细菌和藻类进行计数，皮革处理用盐水或洗涤物(wash)的分析可包括对细菌和真菌进行计数，和造纸用纸浆的分析可包括对细菌、藻类、和真菌进行计数。所述分析可例如针对特定工业物质、环境、先前的测试结果、其它历史数据、或其组合设计(tailored，定制)。

根据本教导的方法可用于对物质中存在的生物负荷进行量化。所述方法可涉及获得所述物质的样品，任选地过滤所述样品，任选地稀释所述样品，和对于所述样品或其一部分进行聚合酶链反应(PCR)。所述PCR可在配置成对被怀疑在所述物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA的序列或片段进行扩增的引物对的存在下进行。对于其中有可能存在或者已知存在已知类型或物种的细菌或其它生物污着性生物体的样品，可使用特定引物对来靶向所述类型或物种。对于其中不知晓什么类型或物种的生物体(一种或多种)可能存在或者可能不存在并且有可能导致生物负荷的样品，可使用多种多样的引物对，或者可使用通用引物对来对所述至少一种生物体的DNA的序列或片段进行扩增。

可使用靶向特定生物体或者靶向特定基因的引物对。例如，可使用引物对来对在实际上所有已知细菌中发现的16S基因进行计数。因此，即使不靶向特定类型的细菌，也可分析通常可归因于细菌的生物污着。类似地，靶向在实际上所有已知的真核细胞中发现的18S基因的引物对即使不靶向特定类型的藻类也可用于对藻类计数。

所述方法可涉及经许多热循环对所述至少一种生物体的DNA的序列或探针片段进行扩增，如本领域中公知的。相对于热循环数的扩增率可例如通过公知的荧光检测方法检测，并且可将荧光发射相对于循环数以图形方式表示(或以其它方式作图或分析)以产生荧光曲线或信号，可将其与标准、标准曲线、查阅表、或其它预定值比较或关联以测定所述物质中的生物污着性生物体的估计量或浓度。

可使用荧光检测来测量PCR产物(扩增子)的量，如本领域中公知的。可使用插入染料例如

绿(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)、和

(Biotium,Fremont,CA)。可使用荧光探针(包括，例如，具有报告(reporter)染料和猝灭(quencher)染料的FRET染料)并且其是本领域中公知的。可使用已知生物污着剂的配置成退火为已知DNA序列或片段的特定探针并且其可用特定报告染料制成，例如，以优化使用具体检测系统的检测。对于不同的探针可使用不同的报告染料，使得可(例如通过对于激发辐射、发射辐射、或两者使用波长过滤器)在单一样品中检测和计数超过一种生物污着剂。

本发明的另一特征是提供测定物质中的生物污着性生物体的估计量或浓度并且可在工业场所(现场和便携)进行，而无需将样品送至实验室并且等待结果的快捷、高效和便宜的方法。这样的特征部分地通过聚合酶链反应(PCR)方法和机器方面近来的发展而得以实现，所述发展已经为便携地现场并且在三小时或更短内(例如在两小时或更短内或者在一小时或更短内)进行PCR提供了低成本选项。

本发明的一个进一步的特征是产生用于比较或关联定量PCR(qPCR)结果以推测或算出物质中的生物污着性生物体的估计量或浓度的标准的方法。可在已知工业物质中制备已知浓度的生物污着性生物体物种并且可在特定的一组条件(包括，例如，特定聚合酶酶，在特定引物对、特定的一组试剂、特定的可检测染料存在下，和/或在特定的热循环温度廓线下)下进行PCR(例如qPCR)，以产生阈循环值，所述阈循环值取决于所述样品中的所述物种的初始浓度而不同。对于不同的初始浓度所检测的量化循环(Cq)或阈循环(Ct)可通过荧光检测而测定，如热循环和聚合酶链反应化验领域中公知的。所产生的标准图、标准斜率、标准曲线、或其它标准值可被打印、显示、存储在存储器中、列于查阅表中、或者以其它方式可用以用于与由未知样品产生的Cq值、Cq图、Cq斜率、Cq曲线、Ct值、Ct图、Ct斜率、或Ct曲线比较。可将该标准或该组标准与由使来自工业场所、具有未知浓度的相同生物污着剂的样品经历相同条件所获得的结果比较。

本发明的另外的特征和优点将部分地在随后的描述中阐明，并且部分地将从所述描述明晰，或者可通过本发明的实践而获知。本发明的目的和其它优点将通过在说明书和所附权利要求中所具体指出的要素和组合而实现和获得。

应理解，前面的一般描述和以下详细描述两者均仅是示例性和说明性的并且意图提供如要求保护的本发明的进一步说明。

附图说明

图1A和1B为示出可作为用于复制在工业物质中发现的已知生物污着性生物体的DNA序列的引物对使用的引物的表的第一和二部分。各图列出了对于所述图中列出的序列的相应的SEQ ID NO:。

图2为示出具有已知的生物污着剂细胞浓度/微升(μL)的工业样品的Cq的标准值并且示出基于Cq测量结果算出的浓度显示出与已知、实际、所给浓度的良好对应性的表。为了用作量的量度，可将一种样品的Cq与另一样品(经常称作校准剂)的Cq相关联以测定相对量化，或者与一组已知拷贝数的标准相关联，以测定绝对量化。

图3为示出将图2中所示的细胞的各种系列稀释物的量化循环值(Cq)关联的标准曲线或线的图。所述细胞为已知生物污着性生物体的。所述数据和/或图可作为一个标准或者一组标准使用，或者用于制备一个标准或一组标准，例如，以比较来自工业物质的样品的现场测试结果。基于Cq或循环阈值(Ct)的标准可用作标准、或者用于产生标准。

图4为示出包括生物污着剂的皮革盐水样品和洗涤物样品的表，所述生物污着剂在进行PCR时产生指示该表中所示试剂浓度的Cq值。各样品在运行用于产生所述Cq值的PCR之前被稀释1000倍。

具体实施方式

本教导提供对工业物质中存在的生物负荷进行量化或计数的方法，其利用聚合酶链反应(PCR)和经多个PCR热循环的PCR扩增子的数量的变化率的检测。所述PCR可被设计成靶向在经常在这样的工业物质中发现的一种或多种生物污着剂中发现的DNA的一个或多个片段。作为一个实例，肠杆菌属(Enterobacter)细菌可经常在造纸用纸浆中发现，并且可生物污着造纸用纸浆。本教导涵盖用于靶向肠杆菌属的一个或多个特征(signature)DNA片段以测定所述纸浆中所述细菌的存在和浓度的方法。然后可将一种或多种适当的杀生物剂添加至所述纸浆或者与所述纸浆混合，以控制、减少、或消除否则将由所述细菌的存在所产生的生物负荷。因此，基于在所述纸浆中的所述细菌的所算出或计算的浓度，可使用恰当剂量的杀生物剂。可避免过量杀生物剂的使用和与其相关的过度成本。

可从物质取得样品并且将所述样品直接使用或者首先过滤、纯化、裂解、稀释，或者进行这样的预处理的组合。样品规模可为任何合适的体积，例如，0.1微升(μl)-10毫升(ml)、1μl-5ml、10μl-2ml、100μl-1ml、或约1ml。然后可将所述样品稀释，或者原样使用。作为一个实例，可取1ml样品，然后将其稀释10倍、100倍、或1000倍，然后可使用经稀释样品的等分试样(aliquot)，例如已经被稀释的1ml样品的1μl等分试样。所述物质可为在工业应用和场所(例如非制药应用、非医疗应用、造纸设施、醇生产设施、发酵设施、皮革处理设施等)中或处使用的多种多样的工业物质的任意者。另外或替代地，本发明的方法还可在实验室或其它远程位置处进行。所述方法可用于控制或处理物质或者利用所述物质的系统，或者控制或处理旨在与所述物质进行接触的表面。

本发明涉及用于对一系列工业过程中的细菌快速计数的方法。对细菌或微生物进行计数在确定是否需要或推荐液体、纸浆、水、盐水、鞣液、悬浮液、分散体、乳液、混合物、污泥、或其它物质的处理和应使用多少处理剂方面可为重要的。例如，通过对工业样品例如造纸用纸浆中的细菌(和/或其它微生物)的菌落进行计数或量化，可确定可被投配到所述造纸用纸浆中以控制或减少微生物计数的杀生物剂(或杀微生物剂)的有效但是最小的量。可避免过量杀生物剂的使用并且在最少的杀生物剂污染和消耗的情况下产生成本有效的处理。

根据本教导的检测方法和处理可用于工业(包括，但不限于，造纸用纸浆生产、皮革加工、油气采收或生产、发酵过程、水处理、冷却水系统、和/或污水处理)中。

根据本教导的方法可用于对物质中存在的生物负荷进行量化。所述方法可涉及获得所述物质的样品，任选地过滤所述样品，任选地稀释所述样品，和对所述样品或其一部分在被怀疑在所述物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA的序列或片段的扩增用引物对和检测用检测试剂的存在下进行聚合酶链反应(PCR)。对于其中有可能存在或者已知存在已知类型的细菌或其它污着性生物体的样品，可使用特定引物对来靶向所述物种的细菌或其它污着性生物体。对于其中不知晓什么物种可能存在或可能不存在并且有可能导致生物负荷的样品，可使用多种多样的引物对，可使用通用引物对，或者可使用指向公共基因的引物对来对所述至少一种生物体的DNA的序列或片段，或基因进行扩增。

所述方法可涉及经多个热循环对所述至少一种生物体的DNA的序列或片段进行扩增，如本领域中公知的。相对于热循环数的扩增率可例如通过公知的荧光检测方法检测。可将所述荧光发射相对于所述循环数以图形方式表示或者以其它方式作图，以产生荧光曲线或信号，可将其与一个标准、一组标准、标准曲线、查阅表、存储值、或其它预定值比较或关联，以测定所述物质中的所述生物污着性生物体的估计量或浓度，即，以对所述生物污着剂进行计数。

根据本教导，所述方法可包括获得所述物质的样品，任选地过滤所述样品，任选地稀释所述样品，和对所述样品进行聚合酶链反应(PCR)。然后可测量、测定、或算出由DNA的序列或片段的扩增得到的扩增数据，然后将其与一种或多种标准关联以测定所述物质中的所述生物体的估计量或浓度。所述扩增数据可包含扩增率、Cq值、Ct值、荧光发射强度数据、或其组合。所述物质可为来自或供应至造纸设备、纸浆制造设备、皮革制造或加工设备、发酵设施、油气采收现场或生产设施、水处理设备、水冷却设施、或污水处理设备的工业物质。如果必要，可将所述样品清洁、纯化、分离、或者以其它方式处理以除去否则可能干扰所述PCR的组分。作为一个实例，可将样品在进行PCR之前裂解和过滤。

所述样品可包含细胞、内生孢子、活生物体、或来自生物体的活细胞、或其组合。如果例如所述样品包含内生孢子和活细胞，则可使用至少两种引物对，并且各引物对可靶向和扩增在所述工业物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA的相应片段。所述样品可包含内生孢子和活细胞，并且所述方法可包括将内生孢子从所述样品分离，之后对内生孢子部分进行PCR。所述方法可包括将活细胞从所述样品分离，之后对活细胞级分进行PCR。所述方法可涉及制备所述样品。如果所述样品包含生物污着性生物体的活细胞，则所述制备可包括将所述活细胞裂解。

所述工业物质可主要包含液体、纸浆、水、盐水、鞣液、溶液、分散体、悬浮液、乳液、混合物、固体、污泥、或其组合。所述物质可包含液体和固体，并且所述方法可包括在进行PCR之前基本上除去所述固体。所述方法可包括在具有所述物质的位置处，例如直接在所述样品从其取得的位置处处理所述物质(例如，现场分析和处理)。所述处理可涉及基于所述物质中检测到的生物污着性生物体的估计量或浓度，即基于所算出或计算出的生物负荷，给予至少一种杀生物剂或杀微生物剂。所述处理可涉及在保留所述物质、含有所述物质、或者配置成加工所述物质的加工设施处处理所述物质。用至少一种杀生物剂或杀微生物剂的处理可以基于所述物质中的生物体(一种或多种)的估计量或浓度，或其生物负荷所算出的剂量给予。

所述方法可进一步包括稀释所述样品以至少形成第一样品部分和第二样品部分。可将所述样品稀释，例如连续稀释。可进行三次、四次或更多次连续稀释并且进行测试。有时，一度(one degree)稀释可导致更好、更清楚的结果，以及更小的标准偏差。使用不同地稀释的样品，进行PCR可包括对第一样品部分利用靶向和扩增已知在所述物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA的片段的引物对进行PCR，并且对第二样品部分利用该引物对或不同引物对进行PCR。可将由对第一样品部分进行的PCR测定的DNA的片段的扩增率、Cq或Ct与一个标准或一组标准关联以测定所述物质中的所述生物体的第一估计量或浓度。可将由对第二样品部分进行的PCR测定的DNA的片段的扩增率、Cq或Ct与该相同的标准或组标准关联以测定所述物质中的所述生物体的第二估计量或浓度。而且，可将第一估计量或浓度与第二估计量或浓度比较并且可确定平均量或浓度以及标准偏差。由所述结果，可将一定剂量的杀生物剂或杀微生物剂给予至所述物质，其中所述剂量是基于所述平均量或浓度算出的。当确定存在较高浓度的生物污着剂时，可使用较高剂量的杀生物剂来处理所述物质。作为一个实例，随着各Cq减小5，可将杀生物剂的剂量加倍，使得对于呈现出15的Cq的工业物质例如造纸用纸浆，可给予相对于对于除了呈现出20的Cq之外相同的物质所给予的杀生物剂的量两倍那么多的杀生物剂。

所述引物对可与具有至少一种共轭或结合荧光染料的探针一起使用。所述引物对和探针退火为DNA的片段，之后延伸，可导致未猝灭的荧光染料，如本领域中公知的。可使用激发波长来激发未猝灭的染料并且可使用荧光发射光谱和强度来绘制相对于热循环数的Cq或Ct图。在PCR的各热循环期间可将所述方法激发波长指向所述样品，其激发未猝灭的荧光染料。在PCR的各热循环期间，可检测、测量或感测所述荧光发射的强度。可通过以图形方式表示每个热循环的荧光发射的强度的曲线而测定DNA的片段的扩增率，或者Cq或Ct。如果测定了阈循环(Ct)，则可将其与具有已知浓度的所述至少一种生物体的已知的一个标准或一组标准的Ct值关联。如果测定了量化循环(Cq)，则可将其与具有已知浓度的所述至少一种生物体的已知的一个标准或一组标准的Cq值关联。所述方法可进一步包括产生和检测如下信号：其(1)指示DNA的片段的存在，和(2)随着DNA的片段的得自PCR的扩增子的浓度增加而增强。

所述引物对可包含通用引物对，其包括设计成使已知在所述物质中导致生物负荷的多于一种不同的生物体的DNA的片段扩增的正向引物和反向引物。所述引物对可设计成使来自细菌的DNA的一个或多个片段扩增。所述引物对可包含设计成使来自一种或多种真菌的DNA的一个或多个片段扩增的引物对。所述引物可包含设计成使16S基因或18S基因的一个或多个片段扩增的引物。

所述方法可用于检测内生孢子。内生孢子是由最常见地来自厚壁菌门(Firmicutephylum)的某些细菌产生的休眠、韧性且非生殖性结构体。其为细菌可将其自身减小至的简装(stripped down)休眠形式。内生孢子形成通常由营养物的缺乏触发，并且通常在革兰氏阳性的细菌中出现。内生孢子使得细菌能够长期、甚至数个世纪处于休眠。当环境变得更良好时，内生孢子可将其复活至营养(vegetative)状态。通过能够检测内生孢子，可在细菌本身无法被检测到时检测细菌的形式。

一些类别的细菌可变成外生孢子(也称作微生物孢囊)而不是内生孢子。外生孢子和内生孢子是在一些类别的微生物中看到的两种“冬眠”或休眠阶段。所述方法可检测和量化细菌的存在于内生孢子中或外生孢子中的DNA。

本发明的另一特征是提供测定物质中的生物污着性生物体的估计量或浓度并且可在工业场所进行而无需将样品送至实验室和等待结果的快捷、高效且便宜的方法。本发明允许现场分析(在被分析的物质的场所处)并且允许在3小时或更短、两小时或更短、一小时或更短、20分钟-3小时、30分钟-2小时、或30分钟-1小时内量化。

本发明还允许避免可为耗时的DNA提取或纯化的能力或选项。

本发明使用聚合酶链反应(PCR)方法和机器，其已经为便携地现场和在三小时或更短内(例如在两小时内或在一小时内)进行PCR提供了低成本选项。作为一个实例，可使用磁感应热循环仪。可提供便携性(即在工业场所对样品进行PCR的能力)和非常快速的循环时间(例如，在三小时或更短、两小时或更短、或者一小时或更短内30个热循环)的示例性的机器为由Bio Molecular Systems制造和可得自Bioline USA Inc或TauntonMassachusetts的MIC磁感应循环仪。可使用任何合适的热循环PCR机器并且可使用除了磁感应循环仪之外的装置。可使用具有液体加热和冷却热循环区块(block)的热循环仪，可使用具有珀尔帖(Peltier)加热元件的热循环仪，等等。用于产生一个标准或一组标准的相同机器或相同型号的机器可用于通过与该标准或该组标准比较而对工业物质进行测试。可在实验室中使用公知的PCR仪器产生多个标准或多组标准，这花费相对长的时间来产生结果。现场测试和与一个标准或一组标准的比较可使用便携的、相对更快的机器，例如，以上描述的MIC磁感应循环仪。

本发明的一个进一步的特征是产生用于比较或关联定量PCR(qPCR)结果以推测或算出物质中的生物污着性生物体的估计量或浓度的标准的方法。可在已知的工业物质中制备已知浓度的生物污着性生物体物种并且可在特定的一组条件(包括，例如，特定聚合酶酶、在特定引物对存在下、在特定一组试剂存在下、在特定荧光染料存在下、和在特定热循环温度廓线下)下进行PCR，以产生阈循环值，所述阈循环值取决于所述样品中的所述物种的初始浓度而不同。对于不同的初始浓度所检测的量化循环(Cq)或阈循环(Ct)可通过荧光检测测定，如在热循环和聚合酶链反应化验的领域中公知的。所产生的标准图、标准斜率、标准曲线、或其它标准值可被打印、显示、存储在存储器中、或者以其它方式可用以用于与由使具有未知浓度的相同物种的样品在相同条件下进行现场测试而产生的Cq值、Cq图、Cq斜率、Cq曲线、Ct值、Ct图、Ct斜率、或Ct曲线比较。

为了产生标准，可实施对将用于热循环的温度进行校准的方法。所述校准可涉及一组加样孔(well)的多个循环温度，使用光谱上可区分的物种，和在不同的温度循环期间测量来自各加样孔的信号，如例如在Gunstream等人的美国专利No.7,875,425 B2(将其完全引入本文作为参考)中描述的。

所述方法可涉及使用标准曲线的斜率来评估PCR扩增效率。可将qPCR标准曲线以图形方式表示为半对数回归线图。如果起始模板为RNA，则可将qPCR标准曲线以图形方式表示为Cq值对所输入的cDNA的对数的半对数回归线图。如在Enke,R.,qPCR PrimerEfficiency Standard Curve Analysis,CSHL DNALC RNA-Seq for the Next GenerationWorking Group(2016),http://www.rnaseqforthenextgeneration.org/profiles/raymond-enke.html#teaching(Enke论文)中描述的，–3.32的斜率指示具有100％效率的PCR反应。更负的斜率指示小于100％效率的反应。更正的斜率指示样品品质或移液问题。100％效率的反应将在指数扩增阶段期间每3.32个循环产生PCR扩增子的10倍提高(log210＝3.3219)。然后百分比PCR效率可由斜率算出：

PCR效率＝[10(-1/m)]-1

其中m＝斜率；100的效率＝1。将该Enke论文特此完全引入作为参考。另外或代替地使用熔融曲线分析来确定得自PCR的扩增产物是单一产物，还是得自多种不同的物种或DNA片段，例如如也在该Enke论文中描述的。

所述方法可涉及检测细胞中的至少一种目标核酸，例如，以检测造纸用纸浆或其它物质中的生物负荷细菌或微生物(一种或多种)。所述方法可涉及：(a)将细胞在多功能裂解缓冲液中裂解以产生细胞裂解物；和(b)使用定量核酸检测化验来检测细胞裂解物中的至少一种目标核酸。可使用的示例性的定量核酸检测化验包括qPCR和如例如在Shannon等人的美国专利No.8,012,685B2(将其完全引入本文作为参考)中描述的其它方法。

为了检测扩增产物即扩增子，可使用插入染料或可检测探针。如本领域中知晓的，可将荧光共振能量转移(FRET)染料配对和附着至DNA探针寡核苷酸序列的相反末端以形成可检测探针。所述对可包括报告染料和猝灭染料。在自由漂移状态下，即在被退火为目标序列然后通过聚合酶切断之前，来自报告染料的荧光发射被保持接近报告染料的猝灭染料猝灭。一旦探针被退火为目标(靶)，然而并且在PCR的延伸阶段期间，聚合酶酶的核酸外切酶活性破坏探针并且将报告染料与猝灭染料物理地分离，从而导致荧光的永久性增加。可以使得能够测量和/或计算Ct和Cq值的方式对所述荧光进行监测、记录和制图表。荧光报告染料在用激发波长照射时可被激发以产生增加的荧光，所述荧光是可检测的并且指示目标DNA序列的存在。存在的目标分子越多，则反应的引物和探针越多并且变成未猝灭的荧光报告染料分子越多。在具有高起始浓度的目标分子或目标DNA序列的样品中，为了产生最大或平台化的荧光信号所花费的热循环越少，并且阈循环(Ct)和定量循环(Cq)数越低。

为了产生最佳结果，可使用热循环周期的非常紧密的温度控制和轻微变化的温度。有时，将退火温度或变性温度改变仅一个摄氏度或者更小可改善扩增结果和可检测的信号强度。在一个标准或一组标准的产生期间优化温度和其它条件可有助于确定为了测试工业样品而应该现场使用的相同的温度和其它条件。可用于优化用于热循环的温度廓线的设备、系统、和方法包括例如在Atwood等人的美国专利No.US 7,238,517 B2(将其完全引入本文作为参考)中描述的那些。

合适的试剂盒可包括适合于进行多个单重(single-plex)定量或实时扩增反应的试剂。这样的试剂可包括：一组定量或实时扩增用引物，用适合于监测定量实时扩增反应的标记系统标记的寡核苷酸探针(例如FRET探针)，浓度适合于单重扩增的DNA聚合酶，和适合于模板依赖性DNA合成的多种dNTP的混合物。

样品的qPCR测试、和用于产生标准的qPCR样品加工可使用适合于这样的扩增的试剂和试剂盒进行。这样的试剂盒可包括适合于进行单一或多重化(multiplexed)扩增的多个扩增用引物组。所述引物组可被单独地包装或者包装在单个容器中。所述试剂盒可任选地包括用于进行扩增的一种或多种另外的试剂，例如DNA聚合酶酶，逆转录酶酶，和适合于经由模板依赖性DNA合成将引物延伸的三磷酸核苷(“dNTPs”)的混合物。所述试剂盒中包括的任选的聚合酶的量可适合于优化扩增反应的效率。各种试剂可被以组合形式包装以达到最大便利性和可在用于进行常规的PCR和/或RT-PCR扩增反应的可商购获得的试剂的组合之后被模型化(model)。示例性的试剂盒可包括，并且所述方法可使用，可得自AppliedBiosystems,Foster City,California的

Universal PCR Master Mix和/或

Gold RT-PCR试剂盒。所述试剂盒可进一步包括其它试剂，例如如例如在如下中描述的“特制”引物：Bengra等人，2002，Clin，Chem.48:2131-2140；Myakishev等人，2001，Genome Res.11:163-169；和美国专利No.6,395,486)，将其完全引入本文作为参考。

所述方法可涉及以多重方式扩增感兴趣的多核苷酸序列以同时测定多于一种目标或生物体的存在和量。可用于这样的目的的方法、试剂和试剂盒包括例如在Anderson等人的美国专利No.8,323,897 B2(将其完全引入本文作为参考)中描述的那些。可将一种或多种多核苷酸例如通过聚合酶链反应(“PCR”)或逆转录聚合酶链反应(“RT-PCR”)，使用各自对于将感兴趣的不同多核苷酸序列扩增而言合适或有效的多个扩增用引物对或组，和使用不同的可检测探针(每个目标一个)扩增。可选择如下探针：其发射不同波长的荧光，因此可识别多个不同目标序列的哪一个是存在的和被扩增。多重扩增方法允许在单个反应容器中同时扩增和检测感兴趣的多个不同序列。多重扩增可在各种各样的情况下使用以有效地提高可用于定量分析的样品的浓度或量。

DNA和RNA目标多核苷酸两者均可使用低的引物浓度进行多重扩增。具体地，经由逆转录将RNA逆转录为cDNA和随后将所得cDNA用DNA聚合酶进行多重扩增可使用以低浓度的多种引物(例如，对于各引物而言45nM)完成。DNA和RNA目标多核苷酸两者的扩增可以分别使用常规聚合酶链反应(PCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的原理的多重方式进行。

此外，不需要优化单独引物的浓度；将所有引物以大致等摩尔浓度使用可产生良好的结果。低引物浓度的使用减少了非特异性引物相互反应的可能性。可快速地实现几乎任意的序列组合的多重扩增而无需耗时的优化步骤。

通过多重化，多重扩增反应可使用现成的可商购获得的试剂进行。包含扩增用引物和探针的现成试剂可被汇聚在一起并且用于多重扩增反应中而无需事先除去探针。像在不存在这样的寡核苷酸探针的情况下进行的多重扩增一样，在这样的寡核苷酸探针存在下进行的多重扩增可在进行或未进行预先稀释的情况下分成多个等分试样来用于后续分析而无需进一步纯化或处理(manipulation)。

所述单重或多重扩增方法可在一种或多种能够在与双链多核苷酸结合时产生可检测信号的插入染料(例如，

Green I或II、

Gold、溴化乙啶、或YO-PRO-1；Molecular Probes,Eugene,Oregon)的存在下进行。

可使用任何合适的引物对，条件是所述对具有如下的相应序列：其被设计成退火为期望被复制的DNA的序列或片段的相应相反末端。例如，可期望扩增和检测已知在工业物质中导致生物负荷的已知生物污着剂的DNA。待复制和扩增的序列或片段可为在如下中发现的DNA的已知或预定序列：(1)特定生物体，(2)特定基因，(3)某一类型生物体例如某一种、属、科、目、纲、门、界、或域的生物体，或者(4)在特定类型生物体中发现的基因。

参照附图，图1A和1B为示出可作为用于复制和扩增在工业物质中发现的已知生物污着性生物体的DNA序列的引物对使用的引物的两部分表格的第一和二部分。图1A和1B还在“注释”栏中示出其中描述和鉴定这样的引物和其中鉴定被相应的引物所靶向的相应的序列或基因的文献的相应来源。所列出的引物几乎完全是作为对分组的，其中各对包括包括表示为“F-”的正向引物和表示为“R-”的反向引物。“F-”和“R-”标签不是核苷酸，而是简单地表示跟在连字符(-)之后的序列为该对的正向引物还是反向引物。图1B中所示的最后一组为一组三个引物，其中两个反向引物的任一个可与单一正向引物配对；取决于使用哪个反向引物，可对均在一个末端处在相同末端处开始的不同长度的序列进行测试和计数。

可选择、调配(order)和使用合适的引物对来复制感兴趣的相应生物体或基因的相应的DNA片段。前两个条目可用于构成用于复制来自肠杆菌属的细菌DNA序列的引物对。例如，所列出的第一个引物可充当正向引物并且与可充当反向引物的所列出的第二个引物一起使用，并且该对或组可用于复制和扩增目标序列。通常，该列表上的由相同符号标记的两个相继的引物可用作可一起使用的引物对，包括例如在该表中列出的第一对、第二对和第三对。对于可用于复制来自16S基因的模板的所列出的许多引物，由相同符号标记的在该列表上的两个相继的引物的出现可用作一起复制来自16S基因的模板的引物对。来自Tanner等人的所列出的两个引物表示引物对，来自Liesack等人的所列出的两个引物表示引物对，来自Medlin等人的所列出的两个引物表示引物对，来自Giovannoni等人的所列出的两个引物表示引物对，和来自Burggraf等人的所列出的两个引物表示引物对。来自用于复制相同基因例如16S基因的多个部分的引物的列表的两个引物的许多组合可作为引物对一起使用，条件是它们以相对于双链模板的正确方向聚合。

图3为示出将图2中所示的细胞的各种系列稀释物的量化循环值(Cq)关联的标准曲线或线的图。所述细胞为已知生物污着性生物体的。所述数据和/或图可作为一个标准或者一组标准使用，或者用于制备一个标准或一组标准，例如，以比较来自工业物质的样品的现场测试结果。基于Cq或循环阈值(Ct)的标准可用作标准、或者用于产生标准。所述标准可基于已知生物污着剂或生物体的已知浓度的样品产生。本方法可涉及首先制备现场测试结果可与其比较的一个标准或一组标准。可产生、存储、使用、显示、打印、保持、维护、和升级标准的库和组标准的库。

图4为示出包括生物污着剂的皮革盐水样品和洗涤物样品的表，所述生物污着剂在进行PCR时产生指示该表中所示试剂的浓度的Cq值。各样品在运行用于产生所述Cq值的PCR之前被稀释1000倍。测试盐水样品和相应的洗涤物样品。洗涤物#1样品是通过洗涤已经在盐水样品#1中鞣制的皮革而产生的，洗涤物#2样品是通过洗涤已经在盐水样品#2中鞣制的皮革而产生的，诸如此类。用于复制和扩增样品中存在的细菌的引物对被显示为图1A中的第一对引物，即，由Anderson等人描述的用于肠杆菌属的引物对。PCR是使用来自BioMolecular Systems,Taunton,MA的MIC qPCR循环仪进行的。平均Cq值是使用也可得自BioMolecular Systems的MIC软件计算的。基于所测定的浓度，可将有效量的杀生物剂投配到皮革处理用盐水中而不使用或浪费过量的杀生物剂，从而使得皮革处理过程更便宜并且更安全。

通过本发明的方法，更加可能精确地和有效地控制生物处理反应器，引导杀生物剂投配程序，确定饮用水清洁度，管理发酵过程，化验土壤活性，确定腐蚀/沉积过程类型，测量设备或产物的微生物污染等等。

本发明包括以任意次序和/或任意组合的以下方面/实施方式/特征：

1.本发明涉及量化物质中存在的生物负荷的方法，所述方法包括：

a)获得所述物质的样品；

b)任选地过滤所述样品；

c)任选地从所述样品提取DNA；

d)任选地稀释所述样品；

e)对所述样品或其一部分利用设计成靶向和扩增在所述物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA的片段的引物对进行聚合酶链反应(PCR)，和形成扩增数据；和

f)将所述扩增数据与标准关联，以测定所述物质中所述生物体的估计量或浓度，

其中所述物质来自、或被供应至造纸设备、纸浆制造设备、皮革制造或加工设备、发酵设施、油气采收现场或生产设施、水处理设备、水冷却塔、或污水处理设备。

2.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述样品包含内生孢子。

3.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述样品包含活生物体、来自生物体的活细胞、或其组合。

4.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述样品包含内生孢子和活细胞，并且所述引物对包含至少两种引物对，各引物对靶向和扩增在所述物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA的相应片段。

5.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述样品包含内生孢子和活细胞，并且所述方法进一步包括在进行所述PCR之前将所述内生孢子从所述样品分离。

6.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述样品包含内生孢子和活细胞，并且所述方法进一步包括在进行所述PCR之前将所述活细胞从所述样品分离。

7.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述物质主要包含液体。

8.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述物质主要包含固体。

9.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述物质包含液体和固体，并且所述方法进一步包括在所述步骤(e)之前基本上除去所述固体。

10.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其进一步包括基于所述物质中所述生物体的所述估计量或浓度，在具有所述物质的位置处将所述物质用至少一种杀生物剂或杀微生物剂处理。

11.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其进一步包括在具有所述物质和配置成加工所述物质的加工设施处将所述物质用以基于所述物质中所述生物体的所述估计量或浓度算出的剂量给予的至少一种杀生物剂或杀微生物剂处理。

12.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述物质包含生物污着性生物体的活细胞并且所述获得样品包括裂解所述活细胞。

13.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其进一步包括稀释所述样品以至少形成第一样品部分和第二样品部分，其中所述进行聚合酶链反应包括：

对所述第一样品部分利用靶向和扩增已知在所述物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA片段的引物对进行聚合酶链反应(PCR)；

对所述第二样品部分利用所述引物对进行聚合酶链反应(PCR)；

将由对所述第一样品部分进行的PCR测定的来自DNA片段的扩增的扩增数据与一个标准或一组标准关联以测定所述物质中所述生物体的第一估计量或浓度；

将由对所述第二样品部分进行的PCR测定的来自DNA片段的扩增的扩增数据与该标准或该组标准关联以测定所述物质中所述生物体的第二估计量或浓度；

将所述第一估计量或浓度与所述第二估计量或浓度比较并且确定其平均量或浓度；和

将至少一种杀生物剂或杀微生物剂以基于所述平均量或浓度算出的剂量给予至所述物质。

14.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中PCR在荧光共振能量转移(FRET)寡核苷酸探针的存在下进行，PCR的延伸阶段从所述探针释放未猝灭的报告染料，并且所述方法进一步包括：

在PCR的各热循环期间将激发波长朝着所述样品照射，这激发所述未猝灭的报告染料；和

在PCR的各热循环期间感测荧光发射的强度

其中将DNA的片段的扩增率关联包括以图形方式表示每个热循环的所检测到的荧光发射的强度的曲线图，以测定定量循环(Cq)，和将所测定的Cq与具有已知浓度的所述至少一种生物体的已知标准物的Cq值关联。

15.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中引物对包含设计成扩增在已知在所述物质中导致生物负荷的多于一种不同生物体中出现的基因的片段的引物对。

16.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述引物对包含设计成扩增来自细菌的DNA的一个或多个片段的引物对。

17.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中引物对包含设计成扩增来自一种或多种真菌的DNA的一个或多个片段的引物对。

18.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其进一步包括产生和检测如下信号：其(1)指示DNA的所述片段的存在，和(2)随着DNA的所述片段的得自PCR的扩增子的浓度增加而增强。

19.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其进一步包括制备一组标准，该组包含已经作图、以图形方式表示、保存、或制表、或其任意组合的结果，所述制备包括对各自包含已知浓度的已知生物污着剂的已知样品进行聚合酶链反应(PCR)，其中对各已知样品的PCR使用所述引物对并且扩增所述至少一种生物体的DNA的所述片段，并且所述已知样品包含具有不同浓度的所述至少一种生物体的至少两种已知样品。

20.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述扩增数据包含扩增率、Cq值、Ct值、或其组合。

21.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述方法在所述造纸设备、纸浆制造设备、皮革制造或加工设备、发酵设施、油气采收现场或生产设施、水处理设备、水冷却塔、或污水处理设备处进行。

22.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中进行所述方法并且在所述获得所述样品的3小时内提供结果。

23.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述方法在不存在任何DNA提取步骤的情况下进行。

24.任一前述或以下实施方式/特征/方面的方法，其中所述方法进一步包括DNA提取步骤。

本发明可包括以上和/或以下如在句子和/或段落中阐述的这些各种特征或实施方式的任意组合。本文中公开的特征的任意组合被认为是本发明的一部分并且对于可组合的特征不意图有限制。

申请人将所有引用的参考文献的全部内容具体地引入到本公开内容中。进一步地，当量、浓度、或者其它值或参数作为范围、优选范围、或者一系列优选上限值和优选下限值给出时，这应被理解为具体公开了由任意范围上限或上部优选值和任何范围下限或下部优选值的任意对形成的所有范围，而不管范围是否被独立地公开。在本文中陈述数值范围的情况下，除非另有说明，否则该范围意图包括其端点、以及在该范围内的所有整数和分数。不意图，当限定范围时，本发明的范围限于所陈述的具体值。

对于本领域技术人员而言，由对本说明书的考虑和本文中公开的本发明的实践，本发明的其它实施方式将是明晰的。意图是，本说明书和实施例被认为仅是示例性的，并且本发明的真实范围和精神由所附权利要求和其等同物指示。

序列表

<110> Buckman Laboratories International, Inc.

<120> 量化物质中的生物负荷的方法

<130> 3597-284-02 PCT

<140> PCT未转让

<141> 2019-02-26

<150> 62/670,056

<151> 2018-05-11

<150> 62/648,013

<151> 2018-03-26

<160> 41

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 由来自Anderson等人(2011)中描述的肠杆菌属的细菌得到的DNA引物。

<400> 1

accacaatgc cagagtgaca ac 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<400> 2

tacctggtct ccagctttca gtt 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 由来自Kondo等人(2004)和Leloup等人(2007)中描述的SRBs属的细菌，基因dsr得到的DNA引物。

<400> 3

acscactgga agcacgccgg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 由Kondo等人(2004)和Leloup等人(2007)中描述的SRBs属的细菌，基因dsr得到的DNA引物。

<400> 4

gtggmrccgt gcakrttgg 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0024166

描述的由18S真菌引物组得到的DNA引物

<400> 5

cgataacgaa cgagacct 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0024166

描述的由18S真菌引物组得到的DNA引物

<220>

<221> misc_特征

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_特征

<222> (17)..(17)

<223> n为a、c、g、或t

<400> 6

anccattcaa tcggtant 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> spoA基因的DNA引物，由来自芽胞杆菌属的形成孢子的细菌得到

<400> 7

tgcgcgaagc aatctcaatg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<400> 8

cggcttgcgg ttgtgttaaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<400> 9

gggcaggaag atgtcacgaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> spoA基因，由来自芽胞杆菌属的形成孢子的细菌得到

<400> 10

tggccgacaa ggttttccat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 使用NCBI测序数据库设计的枯草芽孢杆菌16S基因

<400> 11

acttaagaaa ccgcctgcga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 使用NCBI测序数据库设计的枯草芽孢杆菌16S基因

<400> 12

acctaaccag aaagccacgg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 使用NCBI测序数据库设计的枯草芽孢杆菌16S基因

<400> 13

atgcaccacc tgtcactctg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 使用NCBI测序数据库设计的枯草芽孢杆菌16S基因

<400> 14

acgcgaagaa ccttaccagg 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 经由文献检索发现的细菌通用16S基因

<400> 15

atcagatgtg cccagatgg 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 经由文献检索发现的细菌通用16S基因

<400> 16

ccgtgtctca gttccagtg 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 经由文献检索发现的细菌通用16S基因

<400> 17

agtggaacgg tctggaaagg 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 经由文献检索发现的细菌通用16S基因

<400> 18

tcggtcagtc aggagtattt agc 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 经由文献检索发现的细菌通用16S基因

<400> 19

aaactcaaak gaattgacgg 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 经由文献检索发现的细菌通用16S基因

<400> 20

ctcacrrcac gagctgac 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 经由文献检索发现的细菌通用16S基因

<400> 21

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 经由文献检索发现的细菌通用16S基因

<400> 22

aaggaggtgw tccarcc 17

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Marchesi等人(1998)中描述的16S基因

<400> 23

caggcctaac acatgcaagt c 21

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Marchesi等人(1998)中描述的16S基因

<400> 24

gggcggwgtg tacaaggc 18

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Hongoh等人(2003)中描述的16S基因

<400> 25

caggcctaac acatgcaagt t 21

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Osborn等人(2000)中描述的16S基因

<400> 26

acgggcggtg tgtacaag 18

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Tanner等人(1998)中描述的16S基因

<400> 27

ccgaattcgt cgacaacaga gtttgatcct ggctcag 37

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Tanner等人(1998)中描述的16S基因

<400> 28

cccgggatcc aagcttaagg aggtgatcca gcc 33

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Liesack等人(1991)中描述的16S基因

<400> 29

gcgggatccg agtttgatcc tggctcag 28

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Liesack等人(1991)中描述的16S基因

<400> 30

cgcggatcca gaaaggaggt gatccagcc 29

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Edwards等人(1989)中描述的16S基因

<400> 31

aaggaggtga tccagccgca 20

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Eden等人(1991)中描述的16S基因

<400> 32

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Medlin等人(1988)中描述的16S基因

<400> 33

ccgaattcgt cgacaacctg gttgacctgc cagt 34

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Medlin等人(1988)中描述的16S基因

<400> 34

cccgggatcc aagcttgatc cttctgcagg ttcacctac 39

<210> 35

<211> 34

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Giovannoni等人(1991)中描述的16S基因

<400> 35

ccgtcgacga gctcagagtt tgatcmtggc tcag 34

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Giovannoni等人(1991)中描述的16S基因

<220>

<221> misc_特征

<222> (31)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 36

cccgggtacc aagcttaagg aggtgatcca nccrca 36

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Burggraf等人(1991)中描述的16S基因

<400> 37

ctccggttga tcctgcc 17

<210> 38

<211> 16

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Burggraf等人(1991)中描述的16S基因

<400> 38

ggaggtgatc cagccg 16

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Lane等人(1991)中描述的16S基因

<400> 39

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Lane等人(1991)中描述的16S基因

<400> 40

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 41

<211> 16

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Lane等人(1991)中描述的16S基因

<400> 41

aggaggtgwt ccarcc 16

Claims

1.量化物质中存在的生物负荷的方法，所述方法包括：

a)获得所述物质的样品；

b)任选地过滤所述样品；

c)任选地从所述样品提取DNA；

d)任选地稀释所述样品；

f)将所述扩增数据与标准关联，以测定所述物质中所述生物的估计量或浓度，

2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含内生孢子。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含活生物体、来自生物体的活细胞、或其组合。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含内生孢子和活细胞，并且所述引物对包含至少两种引物对，各引物对靶向和扩增在所述物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA的相应片段。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含内生孢子和活细胞，并且所述方法进一步包括在进行所述PCR之前将所述内生孢子从所述样品分离。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含内生孢子和活细胞，并且所述方法进一步包括在进行所述PCR之前将所述活细胞从所述样品分离。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述物质主要包含液体。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述物质主要包含固体。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述物质包含液体和固体，并且所述方法进一步包括在所述步骤(e)之前基本上除去所述固体。

10.如权利要求1所述的方法，其进一步包括基于所述物质中所述生物体的所述估计量或浓度，在具有所述物质的位置处将所述物质用至少一种杀生物剂或杀微生物剂处理。

11.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在具有所述物质和配置成加工所述物质的加工设施处将所述物质用以基于所述物质中所述生物体的所述估计量或浓度算出的剂量给予的至少一种杀生物剂或杀微生物剂处理。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述物质包含生物污着性生物体的活细胞并且获得样品包括裂解所述活细胞。

13.如权利要求1所述的方法，其进一步包括稀释所述样品以至少形成第一样品部分和第二样品部分，其中进行聚合酶链反应包括：

对所述第一样品部分利用靶向和扩增已知在所述物质中导致生物负荷的至少一种生物体的DNA的片段的引物对进行聚合酶链反应(PCR)；

将由对所述第一样品部分进行的PCR测定的来自DNA的片段的扩增的扩增数据与一个标准或一组标准关联以测定所述物质中所述生物体的第一估计量或浓度；

将由对所述第二样品部分进行的PCR测定的来自DNA的片段的扩增的扩增数据与该标准或该组标准关联以测定所述物质中所述生物体的第二估计量或浓度；

14.如权利要求1所述的方法，其中PCR在荧光共振能量转移(FRET)寡核苷酸探针的存在下进行，PCR的延伸阶段从所述探针释放未猝灭的报告染料，并且所述方法进一步包括：

在PCR的各热循环期间感测荧光发射的强度

15.如权利要求1所述的方法，其中引物对包含设计成扩增在已知在所述物质中导致生物负荷的多于一种不同生物体中出现的基因的片段的引物对。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述引物对包含设计成扩增来自细菌的DNA的一个或多个片段的引物对。

17.如权利要求1所述的方法，其中引物对包含设计成扩增来自一种或多种真菌的DNA的一个或多个片段的引物对。

18.如权利要求1所述的方法，其进一步包括产生和检测如下信号：其(1)指示DNA的所述片段的存在，和(2)随着DNA的所述片段的得自PCR的扩增子的浓度增加而增强。

19.如权利要求1所述的方法，其进一步包括制备一组标准，该组包含已经作图、以图形方式表示、保存、或制表、或其任意组合的结果，所述制备包括对各自包含已知浓度的已知生物污着剂的已知样品进行聚合酶链反应(PCR)，其中对各已知样品的PCR使用所述引物对并且扩增所述至少一种生物体的DNA的所述片段，并且所述已知样品包含具有不同浓度的所述至少一种生物体的至少两种已知样品。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增数据包含扩增率、Cq值、Ct值、或其组合。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述方法在所述造纸设备、纸浆制造设备、皮革制造或加工设备、发酵设施、油气采收现场或生产设施、水处理设备、水冷却塔、或污水处理设备处进行。

22.如权利要求1所述的方法，其中进行所述方法并且在获得所述样品的3小时内提供结果。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述方法在不存在任何DNA提取步骤的情况下进行。

24.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括DNA提取步骤。