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CN101258164B - 用于大量生产缺失起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法 - Google Patents

用于大量生产缺失起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用包含编码重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列的重组表达载体大规模生产单体的或二聚体的无起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法，所述重组免疫球蛋白Fc区包含在其N末端经肽键与免疫球蛋白Fc区相连的免疫球蛋白Fc区。

Description

用于大量生产缺失起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法
技术领域
本发明涉及通过利用包含编码含免疫球蛋白铰链区的重组免疫球蛋白Fc区的重组表达载体大规模生产单体的或二聚体的无起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法。 
背景技术
随着遗传工程学的发展，已经开发并使用了大量的蛋白质类药物。但是，蛋白质类药物易受到机体内的变性或蛋白水解降解的影响而难以长时间保持体内浓度和滴度。体内蛋白质稳定性的提高可以使得蛋白质类药物的体内浓度保持在合适的水平，这是非常重要的，不仅促进了治疗的效力，还在便利性和费用方面给需要频繁注射蛋白质类药物的患者提供了帮助。 
已经进行了多种尝试以长时间增强蛋白质类药物的体内稳定性，例如通过改变蛋白质组成、将一种蛋白质与另一种蛋白质相融合、或将合适的多聚体以化学方式或生物学方式附着于蛋白质的表面。 
其中一种技术是制备与免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。 
Fc片段介导效应物功能例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、以及抗原结合能力，这是免疫球蛋白的独特功能。Fc片段也含有参与结合新生儿Fc受体(FcRn)的序列，其通过增加母体IgG向新生儿的运输及IgG的半衰期在调节血清IgG水平方面发挥作用(Ghetie and Ward，Immunology Today 18：592-598，1997)，且该序列调节蛋白A和蛋白G之间的相互作用。已经通过该Fc片段与治疗性蛋白质的融合进行了多个研究，以增强该治疗性蛋白质的稳定性。 
例如，KR 249572公开了一种融合蛋白质，其通过将IgG1重链Fc区(Fc)的氨基末端与蛋白质(例如IL4受体、IL7受体、G-CSF受体或EPO受体)的羧基末端连接，并在哺乳动物细胞中生成所形成的融合蛋白质而制备。US 5,605,690描述了一种在动物细胞中生成的融合蛋白质，所述融合蛋白质包含在其羧基末端与人IgG1 Fc衍生物融合的肿瘤坏死因子受体。在US 5,723,125和5,908,626中，Tanox Inc.也报道了一种杂合分子，所述杂合分子包含以其羧基末端经肽接头与天然人IgG4 Fc连接的人干扰素α或β，并在动物细胞中生成。在PCT申请WO 00/69913中，LexigenInc.，通过未使用接头的遗传重组制备以其羧基末端与人干扰素的氨基末端连接的天然IgG1 Fc，并在动物细胞中生成所述融合蛋白质。公开号为20030082679的美国专利申请公开了一种具有延长的血清半衰期的融合蛋白质，包含以其羧基末端与IgG1 Fc的氨基末端连接的人G-CSF，且所述融合蛋白质在动物细胞中生成。公开号为20010053539的美国专利申请、US 6,030,613、PCT申请WO 99/02709和WO 01/03737以及EP0464533B1公开了比天然蛋白质具有更长的血清半衰期的Fc融合蛋白质，所述Fc融合蛋白质包含以其氨基末端经肽接头或不经肽接头与人EPO、TPO、人生长激素或人干扰素β的羧基末端连接的IgG1 Fc或Fc衍生物，且所述Fc融合蛋白在动物细胞中生成。 
如上所述的这些Fc融合蛋白质增加了靶蛋白的血清半衰期，但是这也带来了与Fc片段介导的效应物功能相关的问题(US 5,349,053)。所述Fc融合蛋白质通过Fc片段的效应物功能固定补体或结合表达FcγR的细胞，造成特定细胞的裂解，并诱导生成并分泌一些诱导炎症的细胞因子，造成不必要的炎症。融合作用也在Fc片段与蛋白伴侣之间的连接区域生成新的氨基酸序列，如果长期施用，可能会诱导免疫应答。 
在这个方面，已经在制备具有长的血清半衰期但缺乏效应物功能的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段方面做了很多努力。Co1e等报道，当用丙氨酸取代CH2区的第234位、第235位和第237位氨基酸残基(已知所述 氨基酸残基在结合Fc受体方面发挥重要作用)从而生成具有降低的Fc受体结合亲和力的Fc衍生物时，抑制了ADCC活性(Cole et al.，J.Immunol.159：3613-3621，1997)。但是，在所有的这些变体中，与天然的人Fc片段相比较，由于存在不适合的氨基酸使得Fc可能具有增强的免疫原性或抗原性，并可能丧失所需的Fc功能。 
在去除或降低不需要的效应物功能、同时保持高血清浓度的免疫球蛋白的方法中，一种方法是基于去除免疫球蛋白的糖部分。如US 5,585,097所述，可以通过用另一个氨基酸取代抗体的糖基化残基(CH2结构域第297位的天冬酰胺残基)而制备非糖基化(aglycosylated)的抗体衍生物(如抗CD3抗体)。该非糖基化抗体衍生物表现出降低的效应物功能，但仍保留其与FcRn受体的结合亲和力，且不改变其血清半衰期。但是，该衍生物也存在问题，由于生成了具有异常序列的新重组构建体，使得其可能被免疫系统识别为外来物质并加以排斥。公开号为20030073164的美国专利申请公开了一种利用没有糖基化能力的大肠杆菌(E.coli)生产Fc衍生物，以制备缺乏效应物功能的治疗性抗体的方法。 
在US 6,660,843和公开号为20040044188和20040053845的美国专利申请中，美国Amgen Inc.公司描述了一种在铰链区的头5个氨基酸残基存在氨基酸缺失的人IgG1 Fc衍生物，所述衍生物与治疗性蛋白质或肽所模拟的治疗性蛋白质的氨基或羧基末端融合；以及利用大肠杆菌宿主生产所述融合蛋白质。但是，这一没有信号序列的融合蛋白质以包涵体的形式表达，因此必须进行额外的重折叠处理。这种蛋白质重折叠处理会降低产率，特别是在表现为同二聚体或异二聚体的蛋白质中显著地减少二聚体的生成。当在大肠杆菌中表达没有信号序列的蛋白质时，由于大肠杆菌的蛋白表达系统的特征，也使得甲硫氨酸残基被添加至表达产物的N末端。前面提及的Amgen Inc.的表达产物具有N末端甲硫氨酸残基，在给机体反复或过量施用后可能诱导免疫应答。同样，因为在大肠杆菌中通过将编码治疗性蛋白质的基因与Fc基因相连接表达这些融合蛋白形式的融 合分子，所以它们难以在大肠杆菌内得到表达；或者如果治疗性蛋白质以融合蛋白质的形式在大肠杆菌中表达造成活性的显著降低或丧失，则其难以在大肠杆菌中得到表达。此外，因为两个分子的融合在两个蛋白之间的连接区域形成了非天然存在的异常氨基酸序列，所以该融合蛋白质可能被免疫系统识别为“非己”，并因此诱导免疫应答。 
为了解决这些问题，本发明人先前制备了分离的多肽形式的Fc片段和蛋白质类药物，没有使用基于遗传重组的融合方法，但使用了最好的表达系统，并将两个多肽共价地连接在一起以将Fc片段用作药物载体。在这种情况中，可能制备糖基化多肽药物和非糖基化Fc的偶联物，其不会诱导不需要的免疫应答，但是具有满意的生理学药物活性、体内持续时间和稳定性等性能。 
在上述情况中，因为Fc优选为非糖基化形式，因此使用原核表达系统例如大肠杆菌。利用大肠杆菌表达系统的蛋白质制备方法与利用动物细胞的传统方法相比较有如下一些优点。可以容易地构建大肠杆菌表达载体，因此容许快速地评价蛋白质表达。由于其快速的生长速率，大肠杆菌容许低成本地大量生产感兴趣的蛋白质。也可以使用相对简单的表达方法。因此，对于商品化生产而言，大肠杆菌比其他的宿主细胞更为有用。 
在大肠杆菌中过表达之后，大多数Fc区都以包涵体的形式存在。为此，工业上需要在大肠杆菌中以水溶性形式表达Fc区。EP 0227110公开了在过表达免疫球蛋白G1 Fc区之后，仅利用以水溶性形式表达的产物(细胞裂解物)生产免疫球蛋白G1 Fc区。但是，仅以水溶性形式表达的免疫球蛋白的产率低至15mg/L，这在工业应用上没有价值。申请号为0092783的韩国专利申请克服了现有技术中所遇到的问题，介绍了一种通过对应于Fc区的核苷酸序列与大肠杆菌信号序列的融合在大肠杆菌中以水溶性形式而非包涵体的形式表达免疫球蛋白Fc区的新技术。基于在大肠杆菌中的表达，感兴趣的蛋白质以没有信号肽的可溶性形式存在，其产率增加至600mg/L。 
通过本发明人对生产有活性的但不产生免疫应答的非糖基化免疫球蛋白Fc区的方法所进行的长期深入的研究，产生了本发明，目的是将产率增加到适合于工业化的水平，结果发现当编码免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列以其N末端与特异性铰链区相融合的形式进行表达时，所述免疫球蛋白Fc区以包涵体的形式表达，该包涵体通过增溶作用和重折叠处理最终形成无起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的二聚体或单体。 
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种大量生产无起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法，包括构建包含编码含免疫球蛋白铰链区的重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列的载体；用所述载体转化原核细胞；培养所得的转化体；以及从转化体中分离和纯化以包涵体形式表达的免疫球蛋白Fc区。 
本发明的另一个目的是提供经上述方法制备的免疫球蛋白Fc区的二聚体或单体。 
附图说明
结合附图和下面的详细说明可以更清楚地了解本发明的上述的和其他的目的、特点以及其他优点，其中： 
图1是显示从利用具有编码人免疫球蛋白IgG4 Fc区的核苷酸的表达载体表达的包涵体形成单体的和二聚体的Fc区片段的凝胶电泳照片。 
图2显示了人免疫球蛋白IgG4 Fc区的C1q结合能力的ELISA结果。 
图3显示了人免疫球蛋白IgG Fc区的FcγRI结合能力的ELISA结果。 
图4显示了人免疫球蛋白IgG Fc区的FcγRIII结合能力的ELISA结果。 
图5显示了人免疫球蛋白IgG Fc区的FcRnαβ2结合能力的ELISA结果。 
图6显示了利用人免疫球蛋白IgG Fc区作为载体制备的EPO-PEG-Fc偶联物的血清半衰期的结果。 
图7是15％SDS-PAGE凝胶的照片，其中通过在允许表达的条件下于发酵罐中生长实施例2的微生物转化株所获得的一部分发酵液与等体积的2x蛋白样品缓冲液混合后在所述凝胶上跑胶。 
图8是SDS-PAGE凝胶的照片，其中分离自经实施例2的转化体所表达的包涵体重折叠的蛋白质，并显示出条带。 
图9是15％SDS-PAGE凝胶的照片，其中通过在允许表达的条件下于发酵罐中生长实施例3的微生物转化株所获得的一部分发酵液与等体积的2x蛋白样品缓冲液混合后在所述凝胶上跑胶。 
图10是15％SDS-PAGE凝胶的照片，其中在实施例3中所表达并纯化到的各产物与无还原剂(例如DTT或β-巯基乙醇)的蛋白样品缓冲液混合后在所述凝胶上跑胶。 
具体实施方式
一方面，本发明涉及一种大量生产免疫球蛋白Fc区的方法，包括构建包含编码含免疫球蛋白铰链区的重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列的载体；用所述载体转化原核细胞；培养所得到的转化体；和从所述转化体分离并纯化以包涵体形式表达的免疫球蛋白Fc区。 
本发明涉及一种大量生产用作蛋白质类药物的载体的免疫球蛋白Fc区的方法。当免疫球蛋白Fc区以其N末端与铰链区融合时，发现所形成的重组免疫球蛋白Fc区以包涵体的形式表达，然后所述Fc区被溶解并重折叠成无起始密码子编码的起始甲硫氨酸残基的活性形式的二聚体或单体。本发明的重要意义在于发现当将铰链区与免疫球蛋白Fc区融合时，铰链区在将该重组Fc区加工处理并重折叠成无起始密码子编码的起始甲 硫氨酸残基的天然序列形式方面起着关键作用。 
能够允许以重组体形式大量生产免疫球蛋白Fc区的铰链区可以是来自人和其他动物(包括山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠)的IgG、IgA、IgM、IgE或IgD的衍生物，优选IgG的衍生物例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(SEQ ID NO.14-17)。可用于本发明的铰链区可以是全长的铰链区或其片段。优选具有两个或多个连续氨基酸序列的铰链区片段，更优选所述氨基酸序列中含有至少一个半胱氨酸残基。本发明实际应用的片段是衍生自SEQ ID NO.17的Ig4的铰链区的片段，用序列SEQID NO.18、19、20和21表示。当采用SEQ ID NO.18、19和20的铰链区时，可以制备二聚体或单体形式的免疫球蛋白Fc区。SEQ ID NO.21的铰链区能有效地支持免疫球蛋白Fc区单体的制备。在本发明的其他实施方式中，以SEQ ID NO.48-55表示的衍生自SEQ ID NO.14的IgG1的铰链区的片段，以及以SEQ ID NO.56-60表示的衍生自SEQ ID NO.15的IgG2的铰链区的片段都被用于生产免疫球蛋白Fc区的二聚体。 
能通过本发明生产的免疫球蛋白Fc区可以是从人和其他动物(包括山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠)分离的天然形式，或者可以是其获自转化的动物细胞或微生物的重组体或衍生物。优选来自人的IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的Fc区，或其组合体(combination)或杂合体(hybrid)。本申请所用术语“组合体”意指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc片段的多肽与不同来源的单链多肽相连接形成二聚体或多聚体。本申请所用术语“杂合体”意指在单链免疫球蛋白Fc片段内存在编码不同来源的两个或多个免疫球蛋白Fc片段的序列。免疫球蛋白优选是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区或其组合体或杂合体。可用于本发明的编码人免疫球蛋白Fc区和限于所述Fc区的氨基酸序列的核苷酸序列可以是那些由来自GenBank和/或EMBL数据库的核苷酸序列所编码的序列。 
本发明的免疫球蛋白Fc区包括氨基酸序列衍生物。术语“氨基酸序列衍生物”意指其中有一或多个氨基酸残基不同于野生型氨基酸序列的序 列，这可以是天然存在的或者可以是人工生成的。免疫球蛋白Fc区包括由于缺失、插入、非保守性或保守性取代或这些形式的组合所产生的衍生物。典型地，通过添加约1到20个氨基酸的连续氨基酸序列实现插入，或者也可以用更长的序列实现插入。典型地，缺失是约1到30个氨基酸残基范围内的缺失。蛋白质和肽中一般不改变蛋白质或肽的活性的氨基酸交换是本领域中已知的(H.Neurath，R.L Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly的双向交换。这些衍生物可以通过本领域已知的化学肽合成方法或基于DNA序列的重组方法制备(Sambrook et al.，Molecular Cloning，Gold SpringHarbor Laboratory Press，New York，USA，2d Ed.，1989)。 
另外，如果需要，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等来修饰所述免疫球蛋白Fc区。 
本发明的免疫球蛋白衍生物优选地是其天然形式的功能性等价体，因此具有相似的生物学活性；或者如果需要，可以通过改变所述天然形式的特性制备本发明的免疫球蛋白衍生物。优选地，免疫球蛋白Fc区的衍生物是具有增加的对抗热、pH等的结构稳定性或溶解度的蛋白质，或者是在二硫键形成、与表达宿主的兼容性、补体结合、Fc受体结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)方面的特性改善的蛋白质，只要所生成的衍生物与人的天然形式之间的差异不至于使得所述衍生物在人和动物体内诱导不需要的免疫应答。优选的衍生物是IgG1 Fc区，其中改变了一个特定的残基，使得对介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的Fc受体的亲和力降低。所生成的衍生物可以含IgG1 CH2序列的第234位的亮氨酸残基的缺失或者另一种氨基酸的取代(氨基酸残基的编号见来自Kobat数据库的序列)。最优选，用IgG4的相应位点的氨基酸残基苯丙氨酸取代Leu234。 
根据本发明，制备编码重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列，其中免疫球蛋白Fc区与免疫球蛋白铰链区相融合。本申请所用术语“重组免疫球蛋白Fc区”意指以其N末端经肽键与铰链区相连的免疫球蛋白Fc区。 
可以根据免疫球蛋白Fc区选择待融合的铰链区。优选与免疫球蛋白Fc区来源相同的铰链区。在本发明的实际实施中，制备编码由SEQ IDNO.7、9、11或13所示的氨基酸序列组成的重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列，其中衍生自IgG4的Fc区与由SEQ ID NO.18、19、20或21所示的氨基酸序列组成的铰链区相融合。分别用SEQ ID NO.6、8、10和12表示编码重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列。 
在另一个实施方式中，制备编码由SEQ ID NO.23、25、27、29、31、33、35或37所示的氨基酸序列组成的重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列，其中衍生自IgG1的Fc区与由SEQ ID NO.48-55所示的任一氨基酸序列组成的铰链区相融合。用SEQ ID NO.22、24、26、28、30、32、34和36表示所形成的编码重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列。 
在另一个实施方式中，制备编码由SEQ ID NO.39、41、43、45、或47所示的氨基酸序列组成的重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列，其中衍生自IgG2的Fc区与由SEQ ID NO.56-60所示的任一氨基酸序列组成的铰链区相融合。用SEQ ID NO.38、40、42、44和46表示所形成的编码重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列。 
根据本发明，提供了与编码重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列可操纵地连接的重组表达载体。 
本申请所用术语“重组表达载体”描述了能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的载体，指的是包含必需的调控元件的遗传学构建体，其中基因插入物按可在宿主细胞中被表达的方式与所述调控元件可操纵地连接。 
本申请所用术语“可操纵地连接”指核酸表达控制序列与编码靶蛋白的第二种核酸序列之间的功能性连接的方式容许实现一般的功能。可以利 用本领域公知的遗传重组技术制备与重组载体的可操纵连接，并可以利用本领域广泛已知的酶进行位点特异性DNA裂解和连接。合适的表达载体包括表达调控元件例如启动子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子。起始密码子和终止密码子对于已施用遗传构建体的个体中的功能性是必需的，并且必须位于编码序列的读框内。所述载体的启动子可以是组成型的或诱导型的。另外，表达载体包括容许选择含载体的宿主细胞的选择性标记和包括复制起点的复制型表达载体。在本发明的具体实施过程中，制备以下重组表达载体：pmSCPFc、pmPSCFc、pmCPSFc、pmCPFc、pMEPKFC1、pMSCKFc1、pMDKTFc1、pMCPAFc1、pMPKSFc1、pMCPPFc1、pMPPCFc、pMPCPFc、pmPPCG2Fc、pmPCPG2Fc、pmCPG2Fc、pmCCVG2Fc和pmCVE2Fc。 
将表达蛋白质的重组表达载体转化进宿主细胞中。 
就本发明的目的而言，宿主细胞是其中不会发生糖基化的原核细胞。这些原核细胞的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，优选大肠杆菌。大肠杆菌菌株的示例性、非受限性实例包括BL21(DE3)、JM109、DH系列、TOP10和HB101。更优选BL21(DE3)菌株。因为大肠杆菌缺少用于蛋白质糖基化的系统，因此它可以被用作其中生成没有糖部分的形式的免疫球蛋白Fc区的宿主细胞，所述糖部分存在于天然免疫球蛋白的CH2结构域。免疫球蛋白CH2结构域的糖部分不会影响免疫球蛋白的结构稳定性，但是会引起免疫球蛋白在与表达Fc受体的细胞和免疫细胞后结合介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，以分泌诱导炎症的细胞因子。糖部分也与第一个补体组分C1的C1q部分结合，产生补体结合。因此，当以非糖基化形式生成免疫球蛋白Fc区并将其与治疗性蛋白质连接时，所述治疗性蛋白质可以在血清中存在更长一段时间，且没有不需要的免疫球蛋白的效应物功能。 
通过允许将核酸导入细胞内的任何本领域已知的方法可以实现重组表达载体向原核细胞内的转化，并可以根据宿主细胞选择合适的标准技术进行转化。这些方法包括但不限于电穿孔、原生质体融合、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、碳化硅纤维搅拌、以及由PEG-、硫酸葡聚糖及阳离子脂质体介导的转化。 
在本发明的具体实施中，所述重组表达载体被单个地导入到大肠杆菌中，从而生成以下转化体：BL21/pmSCPFc(HM11200)、BL21/pmPSCFc(HM11201)、BL21/pmCPSFc(HM11204)、BL21/pmCPAFc(HM11205)、BL21/pMEPKFc1(HM11206)、BL21/pMSCDFc1(HM11207)、BL21/pMDKTFc1(HM11208)、BL21/pMCPAFc1(HM11209)、BL21/pMPKSFc1(HM11210)、BL21/pMCPPFc1(HM11211)、BL21/pMPPCFc1(HM11212)、BL21/pMPCPFc1(HM11213)、BL21/pmPPCPG2Fc(HM11214)、BL21/pmPCPG2Fc(HM11215)、BL21/pmCPG2Fc(HM11216)和BL21/pmCCVG2Fc(HM11217)、BL21/pmCVEG2Fc(HM11218)。 
通过一般方法培养锚定重组表达载体的转化体。 
本领域熟练人员可以根据细菌菌株容易地调整培养条件。典型地，用于培养的培养基应当含有细胞生长和存活所必需的所有养分。培养基应当含有多种碳源、氮源和微量元素。可利用的碳源的实例包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、碳水化合物(如纤维素)、脂肪(例如大豆油、葵花子油、蓖麻油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)、以及有机酸(例如乙酸)。可以单个地使用这些碳源或联合使用其中两种或多种碳源。可利用的氮源的实例包括有机氮源(例如蛋白胨、酵母提取液、肉浸膏、麦芽浸膏、玉米浆(CSL)和大豆乳清)以及无机氮源(例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。可以单个地使用这些氮源或联合使用其中两种或多种氮源。所述培养基中可以含有磷源，包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和对应的 含钠盐。另外，所述培养基可以含有金属盐例如硫酸镁或硫酸亚铁。所述培养基还可以包括氨基酸、维生素、合适的前体等等。利用适当的方法向培养物中加入化合物(例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸)可以调节培养物的pH值。在培养期间，也可以使用消泡剂例如聚乙二醇脂肪酸酯预防气泡形成。为了将培养物保持在所需的状态，可以向培养物中引入氧气或含氧气体(例如空气)。培养温度一般是20℃到45℃，优选25℃到45℃。也可以用发酵罐进行大规模的蛋白质生产。利用发酵罐进行蛋白质生产应当结合考虑一些因素包括宿主细胞的生长速率和蛋白质表达水平。通过在合适的培养条件下向培养基中加入例如IPTG可以诱导蛋白质表达。 
通过一般技术可以纯化以包涵体形式过表达的免疫球蛋白Fc区。通过用弗氏细胞压碎器、超声发生器等破碎细胞；通过离心仅收集含有免疫球蛋白Fc区的不溶于水的包涵体；用重折叠剂例如尿素、胍、精氨酸、半胱氨酸(cystein)、β-巯基乙醇等将所收集到的部分溶解并变性为其重折叠形式；以及通过透析、各种层析(例如凝胶过滤、离子交换和反相柱层析)、和超过滤(单独地或上述方法的组合)纯化重折叠的融合蛋白质可以获得在转化体中生成的免疫球蛋白Fc区。通常，这一重折叠过程是非常复杂的，并且已知能产生非常低的重折叠产率，并且确信重折叠蛋白质只能具有比水溶性蛋白质更低的活性。 
但是，本发明的方法可以克服上述的问题，并大规模地生产无起始甲硫氨酸残基的活性免疫球蛋白Fc区。大体上而言，当在大肠杆菌中表达并生成的外源蛋白质时，所述蛋白质具有起始密码子编码的起始甲硫氨酸残基。给人体重复地或过量地施用具有起始甲硫氨酸的蛋白质产品可能引起足以降低其治疗作用或造成毒性的免疫应答。但是，当在大肠杆菌中表达本发明的重组免疫球蛋白Fc区时，发现如通过N末端测序分析(Adams et al.，J.Mol.Biol.33：571-589，1968；Takeda，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 60：1487-1494，1968)所测定的那样，起始甲硫氨酸残基通过氨肽酶 (一种内源性细胞质酶)剪切掉。已知这种氨肽酶的活性取决于感兴趣的蛋白质的序列和结构(Moerschell et al.，J.Biol.Chem.265：19638-19643，1990；James et al.，Protein Expression and Purification 41：45-52，2005)。当铰链区与免疫球蛋白Fc区融合时，铰链区受到氨肽酶的影响，使得起始甲硫氨酸受到了一定程度的加工处理，所述程度取决于铰链区的氨基酸序列。 
因为铰链区的特性决定蛋白酶的翻译后修饰，因此可以通过选择合适的铰链区有效地控制二聚体与单体的比例。另外，当包涵体被重折叠时，通过二硫键中的半胱氨酸的错配会妨碍精确的二聚体的形成。但是，本发明的方法确保了精确的二硫键的形成，从而导致活性二聚体的形成。 
另外，本发明可以比传统的方法更大的规模生产免疫球蛋白Fc区。例如，根据欧洲专利EP0227110的方法可以15mg/L的产率生产免疫球蛋白Fc区，其中过表达G1 Fc区，并只从含有其水溶性形式的细胞裂解液中纯化出所述G1 Fc区；根据KR 0092783的方法可以50-600mg/L的产率生产免疫球蛋白Fc区，其中与大肠杆菌信号序列融合的免疫球蛋白Fc区以水溶性形式表达而不是作为包涵体形式表达。但是，本发明通过纯化含铰链区的重组免疫球蛋白Fc区的包涵体可以高达3-6g/L的产率生产免疫球蛋白Fc区。因此，本发明的方法确保了用于工业规模生产免疫球蛋白Fc区的高度有用的系统，其比传统的方法有着更高的产率。 
另一方面，本发明涉及经上述方法制备的免疫球蛋白Fc区。 
根据本发明的方法在原核细胞例如大肠杆菌中生成的免疫球蛋白Fc区不会特异地限制工业性应用。一个示例性的应用是用作与某种药物形成偶联物的载体。构建包含与药物相连的免疫球蛋白Fc区的偶联物并不受特别的限制。例如，可以将不同比例的免疫球蛋白Fc区和药物连接在一起，以及可以通过例如接头介导所述连接。 
所述药物包括多肽、化合物、提取物和核酸。优选多肽(通常具有与“蛋白质”相同的含义)药物。可用于本发明的接头的实例包括肽接头和 非肽接头，优选非肽接头，更优选非肽聚合物。免疫球蛋白重链的优选实例是Fc。 
如果需要增加血清半衰期，可以使用任何生理学活性的多肽作为根据本发明所制备的免疫球蛋白Fc区的蛋白质伴侣以形成偶联物，而没有特别的限制。这些生理学活性的多肽包括那些用于治疗或预防人类疾病的多肽，其包括细胞因子、白细胞介素、白细胞介素结合蛋白、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、凝血因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂、及其衍生物和类似物。 
具体地，所述生理学活性的多肽的非限制性实例包括人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素和干扰素受体(例如干扰素-α、-β和-γ、水溶性I型干扰素受体等)、集落刺激因子、白细胞介素(如白细胞介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30等)和白细胞介素受体(例如IL-1受体、IL-4受体等)、酶(例如葡糖脑苷酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、α-半乳糖苷酶-A、agalsidaseα和β、α-L-艾杜糖醛酸酶(alpha-L-iduronidase)、丁酰胆碱酯酶、壳多糖酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶等)、白细胞介素和细胞因子结合蛋白(例如IL-18bp、TNF结合蛋白等)、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏症抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制剂、转移生长因子、α-1胰蛋白酶抑制剂、白蛋白、α乳清蛋白、载脂蛋白E、促红细胞生成素、高糖基化促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX和因子XIII、纤维蛋白溶酶原活化因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板源生长因子、上皮生长因子、表皮生 长因子、制管张素、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、房肽素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子通道抑制剂、滤泡刺激素、黄体生成素、促黄体生成素释放激素、神经生长因子(例如神经生长因子、睫状神经营养因子、axogenesis因子-1、脑利钠肽、胶质细胞衍生的神经营养因子、神经生长因子、亲神经抑制物因子、神经营养因子、neuturin等)、甲状旁腺素、松弛素、肠促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子、乳铁蛋白、筒箭毒碱、受体(例如TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体、B细胞活化因子受体等)、受体拮抗剂(例如IL1-Ra等)、细胞表面抗原(例如CD2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69等)、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2和Fd)、和病毒衍生的疫苗抗原。可用于本发明的生理学活性的多肽可以是天然形式的，可以利用原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞和动物细胞)通过遗传重组生成，或者可以是具有一或多个氨基酸突变但是表现出与天然形式相同的生物学活性的衍生物。 
在本发明的优选的实施方式中，用聚乙二醇连接利用HM11201转化体生成的免疫球蛋白Fc区片段和人促红细胞生成素(EPO)，从而提供EPO-PEG-免疫球蛋白Fc区蛋白偶联物。发现该蛋白偶联物呈现比天然EPO以及Aranesp(Amgen)(已知为具有增加的血清半衰期的第二代EPO)更长的血清半衰期。因此，根据本发明利用铰链区从包涵体中获得的无起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区可用于增加与其相连接的生理学活性多肽的血清半衰期和生理学活性，且不增加诱导免疫应答的风险。 
通过下面的实施例可以获得对本发明的更好的理解，下面的实施例只是用于举例说明，而不作为对本发明的限制。 
实施例1：人免疫球蛋白IgG4 Fc区表达载体的构建、IgG4 Fc区的表达和纯化、以及N末端序列分析 
<1-1>IgG4 Fc区表达载体的构建 
为克隆包含人免疫球蛋白IgG4的铰链区的重链Fc区，用来自人血细胞的RNA作为模板进行RT-PCR，方案如下：首先，利用Qiamp RNA血液试剂盒(Qiagen)从约6ml血液中分离出总RNA，借助于一步RT-PCR试剂盒(Qiagen)的帮助下，将总RNA作为模板进行基因扩增。使用以SEQ ID NO.1和2、3和2、4和2、以及5和2表示的引物对扩增具有不同的N末端序列的基因。为了促进随后的基因克隆操作，将蛋白质表达所必需的NdeI识别位点和起始密码子ATG导入SEQ ID NO.1、3、4和5的5’引物中，将含终止密码子的BamHI识别位点导入SEQ IDNO.2的3’引物中。用Ndel和Hind III消化所扩增的Fc区产物，并将其插入经相同限制性内切酶处理的pET22b(Novagen)中，从而得到了相应的重组质粒。将这些质粒设计成具有IgG4铰链区的全部氨基酸序列Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro的一部分，如下所述。 
含有以SEQ ID NO.1和2扩增的基因的质粒被称作pmSCPFc，并将其锚定到编码起始序列为Met-Ser-Cys-Pro的N末端氨基酸序列的DNA序列，所述质粒经碱基测序被确定为具有SEQ ID NO.6的序列(对应于SEQ ID NO.7的氨基酸序列)。含有经SEQ ID NO.3和2扩增的基因的质粒被称作pmPSCFc，并将其锚定到编码起始序列为Met-Pro-Ser-Cys-Pro的N末端氨基酸序列的DNA序列，所述质粒经碱基测序被确定为具有SEQ ID NO.8的序列(对应于SEQ ID NO.9的氨基酸序列)。含有经SEQID NO.4和2扩增的基因的质粒被称作pmCPSFc，并将其锚定到编码起始序列为Met-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro的N末端氨基酸序列的DNA序列，所述质粒经碱基测序被确定为具有SEQ ID NO.10的序列(对应于SEQ IDNO.11的氨基酸序列)。含有经SEQ ID NO.5和2扩增的基因的质粒被称作pmCPFc，并将其锚定到编码起始序列为Met-Cys-Pro的N末端氨基酸序列的DNA序列，所述质粒经碱基测序被确定为具有SEQ ID NO.12的序列(对应于SEQ ID NO.13的氨基酸序列)。
将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中制备分别命名为BL21／pmSCPFc(HM11200)、BL21／pmPSCFc(HM11201)、BL21／pmCPSFc(HM11204)和BL21／pmCPAFc(HM11205)的转化体。转化体BL21／pmSCPFc(HM11200)和BL21／pmPSCFc(HM11201)于2005年6月20日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号分别为KCCM-10659P和KCCM-10660P；转化体BL21／pmCPSFc(HM11204)和BL21／pmCPAFc(HM11205)于2005年7月28日保藏于KCCM，保藏号分别为KCCM-10665P和KCCM-10666P。 
<1-2>IgG4Fc的表达和纯化 
将在实施例<1-2>中制备的细菌转化体分别接种到发酵罐(Marubishi公司)中，并容许其生长，随后确定它们是否表达免疫球蛋白Fc区片段。 
首先，每个转化体都生长在100ml LB培养基中，搅拌过夜，将其接种于发酵罐内进行大规模培养。将发酵罐保持在28°C或35°C。为了避免好氧环境向厌氧环境的转变，用20vvm空气给培养物充气，并以500rpm进行搅拌。为了补偿发酵期间的用于细胞生长的养分不足，根据细菌的发酵状态给培养物补充葡萄糖和酵母提取物。当培养物的OD600值达到80时，向培养物内加入诱导剂IPTG，以诱导蛋白质表达。进一步培养该培养物40到45个小时，使得600nm处的OD值增加至100到120。 
如下检查大肠杆菌转化体中的免疫球蛋白Fc的表达、包涵体的形成、以及所表达的Ig Fc的二聚体的形成。为了研究免疫球蛋白Fc区的总体细胞内表达，将部分发酵液与等体积的2x蛋白样品缓冲液混合，并在15%SDS-PAGE凝胶上进行电泳(Criterion凝胶，Bio-Rad)。结果，观察到免疫球蛋白Fc在所形成的所有转化体内都过表达。然后，用超声发生器(Misonix公司)破碎细胞。离心如此获得的细胞裂解液，以从水不溶性物质中分离出水溶性物质。如通过在15％SDS-PAGE上进行的电泳所测定的那样，发现大多数过表达的物质以包涵体的形式存在。对包涵体进行下面的重折叠加工，以检查Fc重折叠的程度以及是否形成了二聚体的Fc区和相应的程度。将10g发酵液在100mL裂解缓冲液(10mM Tris，pH9.0、1mM EDTA、0.5％Triton X-100、0.2M NaCl)中进行超声处理以破碎细胞。10,000rpm离心20分钟，将细胞裂解液分成水溶性部分和包涵体形式的水不溶性部分。将2g这种包涵体溶解于20mL的1M Tris(pH9.0)和20mL增溶缓冲液(6M胍，50mM Tris)的混合物中，并容许在4℃，轻微搅拌的条件下反应30分钟。反应完成之后，轻微搅拌的同时，将包涵体溶液与10倍体积的重折叠缓冲液(2M尿素、50mM Tris、0.25M精氨酸、3mM半胱氨酸，pH9.0)混合过夜。向该混合物中加入无任何还原剂例如DTT或β-巯基乙醇的蛋白样品缓冲液，随后在15％SDS-PAGE(Criterion Gel，Bio-Rad)上进行电泳。用染料例如考马斯蓝显像蛋白质条带。图1是从经转化体HM11201在32℃(泳道1)和28℃(泳道2)、HM11200在28℃(泳道3)和32℃(泳道4)、HM11204在28℃(泳道5)和32℃(泳道6)、HM11205在32℃(泳道7)和28℃(泳道8)表达的包涵体中重折叠出的蛋白质以及作为对照的用传统方法从大肠杆菌中纯化的Fc蛋白(泳道C)一起在电场中跑胶的凝胶照片。从图1可见，总蛋白质的主要部分是Fc蛋白，在重折叠之后，大部分Fc蛋白都以二聚体的形式存在。但是，各个转化体中的Fc蛋白的二聚体和单体的比例有所不同，即取决于转化体所表达的N末端氨基酸序列。例如，大部分HM11201的Fc蛋白(以Met-Pro-Ser-Cys-Pro-CH2-CH3起始)都以二聚体的形式存在。几乎所有的HM11205的Fc蛋白(以Met-Cys-Pro-CH2-CH3起始)都以单体的形式存在，但不以二聚体的形式存在。相信这是因为大肠杆菌宿主细胞中的氨肽酶的加工特异性根据Fc N末端序列的不同而有所不同的事实。
<1-3>N-末端序列分析 
由于起始甲硫氨酸残基的存在，从包涵体重折叠得到的二聚体的Fc区片段在氨基酸序列上不同于野生型。为了确定甲硫氨酸残基是否受大肠杆菌蛋白酶的加工处理，韩国首尔的基础科学研究所分析了蛋白质的N-末端氨基酸序列。如下制备用于N-末端氨基酸序列分析的样品。 
首先，将PVDF膜(Bio-Rad)在甲醇中浸泡约2到3秒钟以激活所述膜，并用封闭缓冲液(170mM甘氨酸、25mM Tris-HCl(pH 8.0)、20％甲醇)充分湿化膜。用印迹试剂盒(Hoefer Semi-Dry Transfer unit，Amersham)将实施例<1-2>制备的在非还原SDS-PAGE凝胶上分离的蛋白质样品转印到PVDF膜上约1个小时。用蛋白质染料考马斯蓝R-250(Amnesco)染色转移到PVDF膜上的蛋白质片刻(3-4秒钟)，用脱色液(水∶乙酸∶甲醇＝5∶1∶4)洗涤。然后，用剪刀剪下含蛋白质的膜片段，进行N末端序列分析。 
结果，发现含铰链区的IgG4Fc蛋白的N末端序列为Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys Pro-Ser-Cys-Pro-CH2-CH3。下表1给出了在转化体中表达的蛋白质的氨基酸序列和N末端序列。 
表1 
  转化体   N-末端序列   序列分析结果  
  二聚体   单体    
  HM11200   Met-Ser-Cys-Pro-CH2-   Ser-Cys-Pro-CH2   Pro-CH2
  HMl1201   Met-Pro-Ser-Cys-Pro-CH2-   Pro-Ser-Cys-Pro-   CH2   Pro-Ser-Cys-   Pro-CH2
  HM11204   Met-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro-CH2   Pro-Ser-Cys-Pro-   CH2   mixed
  HM11205   Met-Cys-Pro-CH2-CH3     Pro-CH2
[0074] 氨基酸测序分析的数据揭示从经本发明的大肠杆菌转化体生成的包涵体重折叠到的Fc片段被加工成具有正确的无起始甲硫氨酸的N末端序列。甚至在重折叠后仍保持单体形式的蛋白质产物丧失了半胱氨酸残基，因此其不能形成二聚体。另外，从图1中显而易见的是，各个转化体间的重折叠Fc片段中的单体部分有所不同，HM11205不存在二聚体。这些结果表明N末端位点的氨基酸序列对N末端的加工有着极大的影响，因此可以通过调控N末端序列获得具有所需N末端序列的蛋白质。如通过下面的试验所揭示的那样，即使蛋白质具有相同的氨基酸序列，根据大肠杆菌宿主细胞的培养条件特别是培养温度可以对它们进行不同的加工。当HM11200在低温(28℃～32℃)下生长时，其所表达的可溶性形式的Fc融合蛋白的量与包涵体形式的量相同。Fc融合蛋白的可溶性形式以没有N末端氨基酸序列Met-Ser-Cys的单体形式存在。因此，本发明人认识到通过调控Fc融合蛋白的N末端氨基酸序列和宿主细胞的培养条件可以获得可控的单体和二聚体的免疫球蛋白Fc片段的比例。 
为了定量确定免疫球蛋白Fc区在大肠杆菌转化体中的表达，如下所述用已知具有强免疫球蛋白亲和力的蛋白A亲和柱纯化出重折叠溶液的免疫球蛋白Fc区。 
重折叠经离心收集到的包涵体，然后经柱层析进行纯化。用PBS平衡5ml蛋白A亲和柱(Pharmacia)，然后以5ml/min的流速将细胞裂解液加载到柱上。用PBS洗去未结合的蛋白质，用100mM柠檬酸(pH 3.0)洗脱出结合的蛋白质。利用HiPrep26/10脱盐柱(Pharmacia)以10mMTris缓冲液(pH 8.0)给所收集到的级分脱盐。然后，用50ml Q HP 26/10柱(Pharmacia)进行二次阴离子交换柱层析。将初步纯化的重组免疫球蛋白Fc区加载于Q-Sepharose HP 26/10柱(Pharmacia)上，以线性梯度(0-0.2M NaCl)在10mM Tris缓冲液(pH 8.0)中对柱进行洗脱，从而得到高纯度的级分。经蛋白A亲和柱部分纯化后，测确重组Ig Fc区的表达水平，下面的表2给出了结果。 
表2 
  质粒   转化体  蛋白A纯化后的表达产率
  pmSCPFc   HM11200  5-6gL
  pmPSCFc   HM11201  4-5gL
  pmCPSFc   HM11204  4-5gL
  pmCPAFc   HM11205  3-4gL
实施例2:人免疫球蛋白IgG1Fc区表达载体的构建、IgG1Fc区的表达和纯化、以及N末端序列分析 
<2-1>IgG1Fc区表达载体的构建 
为了克隆包含人免疫球蛋白IgG1的铰链区的重链Fc区，按与实施例<1-1>相同的方式进行RT-PCR。为扩增具有不同N末端序列的基因，使用以下引物。 
表3 
所用的5’引物序列 
    5'引物序列
  MEPK 5'GGA ATT CCA TAT GGA GCC CAA ATC TTG TGA CAA AAC TCA C 3'
  MSCD 5'GGA ATT CCA TAT GTC TTG TGA CAA AAC TCA CAC ATG CCC 3'
  MDKT 5'GGA ATT CCA TAT GGA CAA AAC TCA CAC ATG CCC ACC GTG C 3'
  MCPA 5'GGG AAT TCC ATA TGT GCC CAG CAC CTG AAC TCC TGG GG
  MPKS 5'GGG AAT TCC ATA TGC CCA AAT CTT GTG ACA AAA CTC AC
  MCPP 5'GGG AAT TCC ATA TGT GCC CAC CGT GCC CAG CAC CTG AAC TCC
  MPPC 5'GGA ATT CCA TAT GCC ACC GTG CCC AGC ACC TGA ACT CCT G 3'
  MPCP 5'GGA ATT CCA TAT GCC GTG CCC AGC ACC TGA ACT CCT GGG G 3'
对于3’引物而言，其具有序列5′-CGC GGA TCC TCA TTT ACC CGGAGA CAG GGA GAG GCT CTT C-3′，并被用于扩增所有具有不同N末端序列的基因。为了促进随后的基因克隆过程，将Nde I识别位点引入每个5’引物中，将BamHI识别位点引入3’引物中。将经引物对扩增的Fc区产物插入载体，从而得到如下各具有IgG1铰链区的全部氨基酸序列Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro的一部分的重组质粒。含有经MEPK引物扩增的基因的质粒被命名为pMEPKFc1，将其锚定到编码起始序列为Met-Glu-Pro-Lys的IgG1的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.22的序列(对应于SEQ ID NO.23的氨基酸序列)。含有经MSCD引物扩增的基因的质粒被命名为pMSCKFc1，将其锚定到编码起始序列为Met-Ser-Cys-Asp的IgG1的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.24的序列(对应于SEQ ID NO.25的氨基酸序列)。含有经MDKT引物扩增的基因的质粒被命名为pMDKTFc1，将其锚定到编码起始序列为Met-Asp-Lys-Thr的IgG1的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.26的序列(对应于SEQ ID NO.27的氨基酸序列)。含有经MCPA引物扩增的基因的质粒被命名为pMCPAFc1，将其锚定到编码起始序列为Met-Cys-Pro的IgG1的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.28的序列(对应于SEQ ID NO.29的氨基酸序列)。含有经MPKS引物扩增的基因的质粒被命名为pMPKSFc1，将其锚定到编码起始序列为Met-Pro-Lys-Ser的IgG1的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.30的序列(对应于SEQ ID NO.31的氨基酸序列)。含有经MCPP扩增的基因的质粒被命名为pMCPPFc1，将其锚定到编码起始序列为Met-Cys-Pro-Pro的IgG1的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.32的序列(对应于SEQID NO.33的氨基酸序列)。含有经MPPC引物扩增的基因的质粒被命名 为pMPPCFc，将其锚定到编码起始序列为Met-Pro-Pro-Cys的IgG1的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序确定为具有SEQ ID NO.34的序列(对应于SEQ ID NO.35的氨基酸序列)。含有经MPCP引物扩增的基因的质粒被命名为pMPCPFc，将其锚定到编码起始序列为Met-Pro-Cys-Pro的IgG1的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.36的序列(对应于SEQ ID NO.37的氨基酸序列)。将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，制备分别命名为BL21/pMEPKFc1(HM11206)、BL21/pMSCDFc1(HM11207) 、BL21/pMDKTFc1(HM11208)、BL21/pMCPAFc1(HM11209)、BL21/pMPKSFc1(HM11210)、BL21/pMCPPFc1(HM11211)、BL21/pMPPCFc1(HM11212)和BL21/pMPCPFc1(HM11213)的转化体。 
<2-2>IgG1 Fc的表达和纯化 
和IgG4一样，将在实施例<2-1>中制备的细菌转化体分别接种到发酵罐(Marubishi公司)中，并容许其生长，随后确定它们是否表达免疫球蛋白Fc区片段。 
首先，每个转化体都生长在100ml LB培养基中，搅拌过夜，将其接种于发酵罐内进行大规模培养。将发酵罐保持在28℃或35℃。为了避免好氧环境向厌氧环境的转变，用20vvm空气给培养物充气，并以500rpm进行搅拌。为了补偿发酵期间的用于细胞生长的养分不足，根据细菌的发酵状态给培养物补充葡萄糖和酵母提取物。当培养物的OD600值达到80时，向培养物内加入诱导剂IPTG，以诱导蛋白质表达。进一步培养该培养物40到45个小时，使得600nm的OD值增加至100到120。 
如下检查大肠杆菌转化体中的免疫球蛋白Fc的表达、包涵体的形成、以及所表达的Ig Fc二聚体的形成。为了研究免疫球蛋白Fc区的总体细胞内表达，在诱导前后等分发酵液。 
在下面的还原条件下，将部分发酵液与等体积的2x蛋白样品缓冲液 混合，在15％SDS-PAGE凝胶上进行电泳(Criterion凝胶，Bio-Rad)。图7给出了电泳结果。泳道1是IgG4 Fc的对照，而泳道2到4显示了HM11208转化体按时间的表达水平，泳道5到7是HM11206转化体按时间的表达水平。泳道8到13分别显示了HM11207、HM11212、HM11209、HM11210、HM11213和HM11211转化体的表达水平。如图7中所示，在所有进行IPTG诱导的样品中非常清楚地显示出一条单独的30kDa的条带(Fc区)，这在进行IPTG诱导之前观察不到，这表明表达了重组IgG1 Fc区，这与G4Fc对照不同。Fc区同样也被过表达，过表达的量至少为所表达的蛋白质总量的约30％。 
为了定量测定免疫球蛋白Fc区在大肠杆菌转化体中的表达，以用于IgG4 Fc的相同方式用已知具有强免疫球蛋白亲和力的蛋白A亲和柱纯化重折叠溶液的免疫球蛋白Fc区。 
在转化体中，pMSCDFc质粒转化体被测定出具有最高的表达率，量达到每10g包涵体340mg，而pMDKTFc、pMEPKFc、pMPPCFc和pMPCPFc转化体分别显示出133.3mg、159mg、110mg和120mg的表达率。 
以用于测定二聚体IgF4 Fc含量的相同方式测定表达产物中的二聚体IgG1 Fc的含量。用超声发生器(Misonix公司)破碎发酵液中的细胞。离心所获得的细胞裂解液，以从水不溶性物质中分离出水溶性物质。如通过15％SDS-PAGE凝胶电泳所测定的那样，发现大多数过表达的物质以包涵体的形式存在。重折叠包涵体，以检查Fc重折叠的程度以及是否形成了二聚体Fc区和相应的程度。用蛋白A亲和柱纯化重折叠的Fc蛋白，并与无还原剂如DTT或β-巯基乙醇的蛋白样品缓冲液混合，随后在15％SDS-PAGE(Criterion Gel，Bio-Rad)上进行电泳。用染料如考马斯蓝显像蛋白质条带。 
图8是从经转化体HM11208(泳道1)、转化体HM11206(泳道2)和转化体HM11207(泳道4)、转化体HM11212(泳道5)和转化体HM11213 (泳道7)表达的包涵体重折叠出的蛋白A柱的蛋白分离物以及作为对照的IgG4Fc蛋白(泳道3、6和8)一起于非还原条件下在电场中跑胶的凝胶照片。如图8中所示，发现在本试验中所用的所有IgG1Fc片段都形成二聚体，尽管所述二聚体的量有一定程度的不同。 
<2-3>N末端序列分析 
和IgG4Fc一样，N末端氨基酸序列决定着翻译后加工，例如起始甲硫氨酸残基是否被保留或者起始甲硫氨酸残基是否被正确加工，或者起始甲硫氨酸是否与其他氨基酸残基一起生成了不同于所需氨基酸序列的氨基酸序列。为了检查甲硫氨酸残基是否被大肠杆菌蛋白酶的加工，韩国首尔的基础科学研究所分析了IgG1Fc区的不同N末端氨基酸序列。下面的表4概括了分析结果。 
表4 
 转化体  N末端测序结果(二聚体)
 HM11208  Met
 HM11206  Met
 HM11207  Ser
 HM11212  Pro
 HM11213  Pro
如表4中所示，转化体HM11208和HM11206中的起始甲硫氨酸残基仍然是未加工的，其中过表达二聚体形式的IgG1Fc区，而HM11207、HM11212和HM11213的发酵产物由于正确的翻译后加工因此不具有起始甲硫氨酸残基。 
总而言之，通过上述试验所得到的数据表明当在大肠杆菌中表达IgG1Fc区时，其N末端序列决定着表达、表达水平、二聚体比例及其N 末端加工；以及通过利用N末端序列可以大规模地生产无起始甲硫氨酸残基的Fc区。本发明所获得的IgG1 Fc区可以用于增加与其相连接的生理学活性多肽的血清半衰期和生理学活性，且没有由于添加外源氨基酸残基所诱导的免疫应答。 
实施例3：人免疫球蛋白IgG2 Fc区表达载体的构建 
<3-1>IgG2 Fc区表达载体的构建 
为了克隆包含IgG2的铰链区的重链Fc区，以用于IgG4 Fc区的相同方式进行RT-PCR。为了扩增具有不同N末端序列的基因，使用以下引物。 
表5 
   5′引物序列
G2MPPCSS 5′GGG AAT TCC ATA TGC CAC CGT GCC CAG CAC CAC CTG TGG CAG G 3’
G2MPCPSS 5′GGG AAT TCC ATA TGC CGT GCC CAG CAC CAC CTG TGG CAG GAC 3’
G2MCPSS 5′GGG AAT TCC ATA TGT GCC CAG CAC CAC CTG TGG CAG GAC 3’
G2MCCVSS 5′GGG AAT TCC ATA TGT GTT GTG TCG AGT GCC CAC CGT GCC CAG C 3’
G2MCVESS 5′GGG AAT TCC ATA TGT GTG TCG AGT GCC CAC CGT GCC CAG CAC C 3’
3’引物具有序列5′-CGC GGA TCC TCA TTT ACC CGG AGA CAGGGA GAG GCT CTT C-3′，并被用于扩增所有具有不同N末端序列的基因。为了促进随后的基因克隆过程，将Nde I识别位点引入每个5’引物中，将BamHI识别位点引入3’引物中。将经引物对扩增的Fc区产物插入载体，从而得到如下各具有IgG1铰链区的全部氨基酸序列G1u-Arg-Lys-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro的一部分的重组质粒。含有经G2MPPCSS引物扩增的基因的质粒被命名为pmPPCG2Fc，将其锚定到编码起始序列为Met-Pro-Pro-Cys的IgG2的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.38的序列(对应于SEQ ID NO.39的氨基酸序列)。含有经G2MPCPSS引物扩增的基因的质粒被命名为pmPCPG2Fc，将其锚定到编码起始序列为Met-Pro-Cys-Pro的IgG2的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.40的序列(对应于SEQ ID NO.41的氨基酸序列)。含有经G2MCPSS引物扩增的基因的质粒被命名为pmCPG2Fc，将其锚定到编码起始序列为Met-Cys-Pro的IgG2的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.42的序列(对应于SEQ ID NO.43的氨基酸序列)。含有经G2MCCVSS引物扩增的基因的质粒被命名为pmCCVG2Fc，将其锚定到编码起始序列为Met-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro的IgG2的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.44的序列(对应于SEQ ID NO.45的氨基酸序列)。含有经G2MCVESS引物扩增的基因的质粒被命名为pmCVEG2Fc，将其锚定到编码起始序列为Met-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro的IgG2的CH2和CH3的DNA序列，所述质粒经碱基测序分析确定为具有SEQ ID NO.46的序列(对应于SEQ ID NO.47的氨基酸序列)。将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，制备到被分别命名为BL21/pmPPCPG2Fc(HM11214)、BL21/pmPCPG2Fc(HM11215)、BL21/pmCPG2Fc(HM11216)、BL21/pmCCVG2Fc(HM11217)和BL21/pmCVEG2Fc(HM11218)的转化体。 
<3-2>IgG2Fc的表达、纯化和N末端序列分析 
和IgG4一样，将在实施例<3-1>中制备的细菌转化体分别接种到发酵罐(Marubishi公司)中，并容许其生长，随后确定它们是否表达免疫球蛋白Fc区片段。培养条件与给IgG4Fc设定的的培养条件没有显著不同。如在还原条件下通过SDS-PAGE所测定的那样，发现在各种条件(包括温度、培养基组成、诱导剂浓度等)下都过表达IgG2 Fc区片段。图9显示了与等体积2x蛋白样品缓冲液混合的发酵液的15％SDS-PAGE电泳结果。泳道1的IgG4 Fc片段用作对照，而HM11214、HM1215、HM11216、HM11217和HM11218表达的片段分别在泳道2到6中跑胶。如图9所示，本试验中所用的全部5种转化体都过表达Fc片段。
用与上述相同的方式测量表达产物中的二聚体IgG4 Fc的含量。破碎发酵液中的细胞，并重折叠细胞裂解液的水不溶性物质，此后用蛋白A亲和柱仅仅纯化出Fc区片段。将纯化的表达产物与无还原剂(如DTT或β巯基乙醇)的蛋白样品缓冲液相混合，并在15％SDS-PAGE(CriterionGel，Bio-Rad)上分离所述表达产物。用染料如考马斯亮蓝显像蛋白质条带。图10显示了电泳结果。泳道1和7的IgG4 Fc片段用作对照，在泳道2到6中观察来自HM11214、HM11215、HM11216、HM11217和HM11218的片段的二聚体。从图10的数据可以看到，尽管转化体的表达产物在N末端序列或表达条件上彼此有所不同，但是它们都能形成二聚体。 
为了检查甲硫氨酸残基是否被大肠杆菌蛋白酶加工，韩国首尔的基础科学研究所分析了二聚体IgG4 Fc区的不同N末端氨基酸序列。从HM11214和HM11215转化体的产物去除起始甲硫氨酸，两者在第2位都是脯氨酸残基。 
从这些试验显而易见的是，可以在大肠杆菌中大规模表达IgG2 Fc区。另外，在上述试验中获得的数据表明IgG1 Fc区的N末端序列决定着表达、表达水平、二聚体比例及其N末端加工；通过利用N末端序列可以大规模地生产无起始甲硫氨酸残基的Fc区。本发明所获得的IgG1Fc区可以用于增加与之连接的生理学活性多肽的血清半衰期和生理学活性，且没有由于添加外源氨基酸残基所诱导的免疫应答。 
实施例4：利用ELISA进行C1q结合检测 
为了确定在实施例<1-2>中生成的衍生物和对应于在大肠杆菌转化体中表达并经纯化的免疫球蛋白的Fc区的蛋白质是否与人C1q结合，如下进行酶联免疫吸附检测(ELISA)。将通过在上面实施例中制备的HM11200和HM11201转化体生成的免疫球蛋白Fc区用作测试组。将糖基化免疫球蛋白(IVIGG-球蛋白S，Green Cross PBM)用作标准物。在10mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中制备浓度为1μg/ml的测试样品和标准样品。将样品按200ng/孔的量分装到96孔板((Nunc)中，将板于4℃包被过夜。然后，用PBS-T(137mM NaCl、2mM KCl、10mMNa2HPO4、2mM KH2PO4、0.05％Tween 20)洗涤每孔3次，用250μl封闭缓冲液(于PBS-T中的1％牛血清白蛋白)在室温下封闭1小时，然后再用相同的PBS-T洗涤3次。将标准样品和测试样品稀释在PBS-T中至预定浓度，并将其添加到经抗体包被的孔中，在室温下孵育板1个小时，用PBS-T洗涤3次。之后，给板添加2μg/ml C1q(R&D Systems)，并在室温下反应2个小时，用PBS-T洗涤板6次。向每个孔添加200μl经封闭缓冲液稀释的人抗人C1q抗体过氧化物酶偶联物(Biogenesis，USA)的1∶1000稀释液，并在室温下反应1个小时。用PBS-T洗涤每个孔3次后，混合等体积的显色剂A和B(显色剂A：稳定的过氧化物；显色剂B：稳定的色素原；DY999，R&D Systems)，并向每个孔添加200μl混合物，然后孵育30分钟。然后向每个孔添加50μl反应终止溶液(2M硫酸)。用酶标仪(Molecular Device)读板。于450nm测定标准样品和测试样品的吸光度，结果见图2。 
如图2所示，本发明的在大肠杆菌中生成的免疫球蛋白Fc区蛋白质呈现显著降低的C1q结合亲和力。这些结果表明当本发明的免疫球蛋白Fc区蛋白质用作偶联物形式的生理学活性多肽的载体时，其很少有诱导机体的免疫应答(例如细胞毒性和炎症)的风险。 
实施例5：利用ELISA检测对FcγRI、FcγRIII和FcRnαβ2的结合 
已知免疫球蛋白Fc能够结合血细胞受体FcγRI及FcγRIII，以介导效应物功能例如抗体依赖性细胞毒性。为了确定大肠杆菌中生成的免疫球蛋白Fc是否能够介导这种效应物功能，获取每种受体并通过ELISA检测其结合能力。也用相同的方式检测免疫球蛋白Fc结合受体FcRn的能力，已知所述受体FcRn影响免疫球蛋白的体内代谢。 
<5-1>人FcγRI、FcγRIII和FcRnαβ2表达株的构建 
用试剂盒(Qiagen，Cat.No.？？？)从人外周血单个核细胞中分离总RNA，并通过RT-PCR和PCT将所述总RNA用于钓取编码人FcγRI、FcγRIII和FcRnαβ2的细胞外配体结合结构域的基因。将所述基因与GST(谷胱甘肽S-转移酶)融合，并将其克隆到相应的锚定于二氢叶酸还原酶基因的哺乳动物细胞表达载体中。将所制备到的重组pHM000质粒转染到CHO细胞中。按每6cm培养皿1x106个细胞的量接种所述CHO细胞，并在37℃、于5％CO2培养箱内孵育24小时，用Opti-MEM(Gibco.，Cat.no.31985-070)洗涤2次。将1ml含10μg pHM000的Opti-MEM和1ml LipofectamineTM试剂(Invitrogen，Cat.no.18324-020)相混合。保持20分钟之后，将所形成的混合物加入所制备的CHO细胞。将这些细胞在5％CO2培养箱内、于37℃孵育18小时，更换加有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM/F12，然后再孵育48小时。为了选出转化株，用于含有10％的经透析的胎牛血清、1％青霉素-链霉素和800μg/ml遗传霉素(Mediatech，Cat.No.6 1-234RG)的选择培养基α-MEM(Welgene，Cat.no.LM008-02)中的0.5％胰蛋白酶(Gibco.，Cat.no.15400-054)处理所述细胞，随后进行离心。将如此转化的细胞转移到T25培养皿(Nunc)内，并在5％CO2培养箱内、于37℃孵育至90％或更高的汇合度。为了确定FcγRI、FcγRIII和FcRnαβ2的表达水平，以渐增浓度的MTX(Sigma， Cat.No.M-8407)(从20nM开始，每2周增加20nM)在5％CO2培养箱内、于37℃孵育选出的菌株。 
<5-2>人FcγRI、FcγRIII和FcRnαβ2的生产和纯化 
如下纯化FcγRI、FcγRIII和FcRnαβ2。将所选出的细胞株按每工厂3.5×108个细胞的量接种于细胞工厂(Nunc，Cat.no.170009)中，并在5％CO2培养箱内、于37℃生长48小时，然后以每工厂1升PBS的量洗涤2次。给细胞补充1升含0.3mM丁酸钠(Sigma，Cat.no.B-5887)的生产培养基CHO-A-SFM，并在5％CO2培养箱内、于33℃进行培养，期间隔日回收表达上清液，总共7次。离心所收集到的上清液，经0.22μm过滤系统(Coming)过滤并用浓缩系统(PALL，Cat.no.PN OS010C70)进行浓缩，将其加载于装有0.1M硫化镍(Sigma，Cat.no.N4887)的螯合琼脂糖FF树脂(Amersharm pharmacia，Cat.no.17-0575-02)，使FcγRI、FcγRIII和FcRnαβ2的GST与镍结合。用50mM NaPi(pH 8.0)、300mM NaCl和250mM咪唑从柱中分析并纯化结合的FcγRI、FcγRIII和FcRnαβ2。 
<5-3>结合FcγRI的检测 
用PBS将在实施例<5-2>中纯化到的FcγRI稀释于PBS(pH 7.4)中至0.75μg/ml的浓度，然后按100μl/孔的量分装到96孔板(Nunc，Maxisorp)中，于4℃孵育18小时，使所述受体吸附于96孔板的底部。用300μl含有0.05％Tween-20(Amresco，Cat.no.0777)的洗涤缓冲液PBS(pH 7.4)洗涤96孔板的每个孔3次。然后，向每个孔中加入300μl含0.1％Tween-20和3％BSA(牛血清白蛋白，Amresco，Cat.no.0332)的PBS(pH7.4)，以避免其他物质与孔底部的非所需的吸附，并在37℃孵育1小时，之后从中完全去除反应液。用检测缓冲液分别将作为对照的人血清IgG、经木瓜蛋白酶处理人血清IgG分离到的Fc、在实施例2中纯化到的HM11200和HM11201产物稀释至9μg/ml的浓度，随后用检测缓冲液重 复1∶3系列稀释7次。在96孔板的每个孔中加入100μl稀释液，并容许其在恒速震荡条件下、于25℃反应2小时，用洗涤缓冲液洗涤孔6次。为了检查所有锚定于孔板底部的HM11200、HM11201产物和对照是否都与FcγRI结合，往每个孔内加入100μl体积的经检测缓冲液以1∶100000稀释的HRP偶联的山羊抗人重链抗体(Chemicon，AP309P)，并容许其在恒速震荡条件下、于25℃反应2小时。用洗涤缓冲液洗涤6次之后，向每孔中加入100μl能够和与抗体偶联的HRP反应的底物(BD bioscience，Cat.no.555214)，并在25℃反应20分钟。用2N硫酸终止反应，并用ELISA酶标仪(Molecular Devices，酶标仪)在450nm处测定颜色强度。如图3所示，在大肠杆菌中生成的Fc蛋白几乎都不结合FcγRI，而人IgG和Fc(两者都是糖基化的)都与FcγRI强烈结合。 
<5-4>结合FcγRIII的检测 
用碳酸盐缓冲液(pH 9.0)分别将作为对照的人血清IgG和经木瓜蛋白酶处理人血清IgG分离到的Fc、在实施例<1-2>中纯化到的HM11200和HM11201产物稀释至9μg/ml的浓度，随后用碳酸盐缓冲液重复1∶3系列稀释7次。向96孔板的每个孔中加入100μl稀释液，并在4℃孵育18小时，使得它们吸附于96孔板的底部。用300μl由含有0.05％Tween-20(Amresco，Cat.no.0777)的PBS(pH 7.4)组成的洗涤缓冲液洗涤96孔板的每个孔3次。然后，向每个孔中加入300μl由含0.1％Tween-20和5％脱脂干奶粉(Difco，Cat.No.232100)的PBS(pH 7.4)组成的检测缓冲液，以避免其他物质与孔底部的非所需的吸附，并在37℃孵育1小时，之后从中完全去除反应溶液。用检测溶液将在实施例<4-2>中纯化到的FcγRIII稀释至1μg/ml的浓度。向96孔板的每个孔中加入100μl稀释液，并容许其在恒速震荡下、于25℃反应2小时。用洗涤缓冲液洗涤孔6次。用检测缓冲液按1∶10000稀释能够与HM11200、HM11201产物以及对照相连的FcγRIII的GST(谷胱甘肽S-转移酶)结合的兔抗GST抗体 (Chemicon，AB3282)，向每个孔中加入100μl稀释液，并容许其在恒速震荡条件下、于25℃反应2小时。随后，在用洗涤缓冲液洗涤孔6次之后，向每孔中加入100μl针对于检测缓冲液中的兔抗体的1∶7500的抗体稀释液。 
在恒速震荡条件下、于25℃反应2小时之后，用洗涤缓冲液洗涤96孔板6次。按与实施例<5-3>相同的方式加入底物，并用ELISA酶标仪测量颜色强度。如图4所示，在大肠杆菌中生成的FcγRIII蛋白几乎都不结合FcγRI，而人IgG和Fc(两者都是糖基化的)都与FcγRIII强烈结合。 
<5-5>结合FcRnαβ2的检测 
用碳酸盐缓冲液(pH 9.0)分别将作为对照的人血清IgG和经木瓜蛋白酶处理人血清IgG分离到的Fc、在实施例<1-2>中纯化到的HM11200和HM11201产物稀释至20μg/ml浓度，随后用碳酸盐缓冲液重复1∶3系列稀释7次。向96孔板的每个孔中加入100μl稀释液，并在4℃孵育18个小时，使得它们吸附于96孔板的底部。用300μl由含有0.05％Tween-20(Amresco，Cat.no.0777)的PBS(pH 7.4)组成的洗涤缓冲液洗涤96孔板的每个孔3次。然后，向每个孔中加入300μl由含0.1％Tween-20和5％BSA(Amresco，Cat.No.0332)的PBS(pH 7.4)组成的检测缓冲液，以避免其他物质与孔底部的非所需的吸附，并在37℃孵育1小时，之后从中完全去除反应溶液。用检测溶液将在实施例<5-2>中纯化到的FcRnαβ2 稀释至3μg/ml的浓度。向96孔板的每个孔中加入100μl稀释液，并容许其在恒速震荡条件下、于25℃反应2小时。用洗涤缓冲液洗涤孔6次。用检测缓冲液按1∶10000稀释能够与HM11200、HM11201产物以及对照相连的FcRnαβ2的GST(谷胱甘肽S-转移酶)结合的兔抗GST抗体(Chemicon，AB3282)，向每个孔中加入100μl稀释液，并容许其在恒速震荡条件下、于25℃反应2小时。随后，在用洗涤缓冲液洗涤孔6次之后，向每个孔中加入100μl针对于检测缓冲液中的兔抗体的1∶7500抗体 稀释液。 
在恒速震荡条件下、于25℃反应2小时之后，用洗涤缓冲液洗涤96孔板6次。按与实施例<5-2>相同的方式加入底物，并用ELISA酶标仪测定出颜色强度。如图5所示，与人IgG和糖基化Fc一样，在大肠杆菌中生成的Fc蛋白与FcRnαβ2强烈结合。 
实施例6：人EPO偶联物的制备和药物代谢动力学分析 
<6-1>人EPO的制备 
为了制备人EPO(促红细胞生成素)偶联物，首先利用从血细胞中分离的总RNA通过RT-PCR扩增EPO基因，并将该基因克隆到pBluscriptII(Stratagen)载体中，生成pBlueEP载体。为了将所克隆的EPO基因转移到含有dhfr基因的动物细胞表达载体pCMV/dhfr-(pCDNA3.1(Invitrogen公司))内，用HindIII和BamHI消化pBlueEP，将据此获得的含EPO基因的片段插入经相同限制性内切酶处理的动物细胞表达载体中，从而得到pcmvEP。利用Lipofectamine试剂(Gibco)将该携带EPO基因的表达载体转染到CHO细胞(一种蛋白质表达株)中。用渐增浓度的MTX(最大浓度为120nM)处理所述细胞，以增加其表达水平。高水平地表达EPO，表达水平超过100mg/升。 
<6-2>人EPO-PEG复合物的制备 
将其两个末端都具有醛反应基团的3.4kDa聚乙二醇ALD-PEG-ALD(Shearwater)与100mM含有浓度为5mg/ml的在<6-1>中制备的EPO的磷酸盐缓冲液相混合，所述磷酸盐缓冲液的量适于形成1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10和1∶20EPO∶PEG摩尔比。向该混合物加入还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)，终浓度为20mM，并在轻微搅拌的条件下于4℃反应2小时，以容许PEG选择性地与EPO的氨基末端连接。为了获得1∶1的 PEG与EPO的复合物，用SuperdexR柱(Pharmacia)对反应混合物进行分子排阻色谱。用10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)作为洗脱缓冲液，从柱中洗脱出EPO-PEG复合物，同时去除未与PEG结合的EPO、未反应的PEG和二聚体副产物(其中PEG与两个EPO分子相连接)。将纯化的EPO-PEG复合物浓缩至5mg/ml。通过这个试验发现，为了得到最高的反应性并产生最少量的副产物(例如二聚体)，EPO与PEG的最佳反应摩尔比是1∶2.5到1∶5。 
<6-3>人EPO-PEG复合物和重组免疫球蛋白Fc区的偶联物的制备 
将在实施例<6-2>制备的EPO-PEG复合物连接至在实施例<1-3>中利用HM11201制备的免疫球蛋白Fc区。具体地，将在实施例<1-3>中制备的免疫球蛋白Fc区片段(约53kDa)溶解于10mM磷酸盐缓冲液中，并按1∶1、1∶2、1∶4和1∶8的EPO-PEG复合物∶Fc区的摩尔比与EPO-PEG复合物相混合。在反应溶液的磷酸盐缓冲液浓度被调整到100mM后，向反应溶液中加入还原剂NaCNBH3(终浓度为20mM)，并在轻微搅拌的条件下于4℃反应20小时。通过这个试验发现，为了得到最高的反应性并产生最少的副产物(例如二聚体)，EPO-PEG复合物与Fc区片段的最佳反应摩尔比为1∶2。 
在偶联反应之后，对反应混合物进行高压液相色谱处理，以除去未反应的物质和副产物。利用HiPrep 26/10脱盐柱(Pharmacia)以10mM Tris缓冲液(pH 8.0)给偶联反应溶液脱盐。然后，按8ml/min的流速将反应溶液加载于50ml Q HP 26/10柱(Pharmacia)中，用0M到0.2M的NaCl线性梯度洗脱该柱，以获得所需的级分。再次按15ml/min的流速将所收集到的级分加载于经10mM乙酸盐缓冲液(pH 5.2)平衡的polyCAT21.5×250柱中，用0.1M到0.3M的NaCl线性梯度洗脱该柱，从而得到高纯度级分。 
<6-4>药物代谢动力学分析 
给每组各5只SD大鼠皮下注射剂量为100μg/kg的实施例<5-1>中制备的天然EPO、具有更高唾液酸含量以增加其半衰期的Aranesp(Amgen)、和实施例<5-3>中制备的EPO-PEG-Fc偶联物(测试组)。皮下注射之后，在第0.5、1、2、4、6、12、24和48小时收集对照组的血样，以及在第1、12、24、30、48、72、96、120、144、168、192、240、288、336和384小时收集测试组的血样。将血样收集于1.5ml试管中、凝固、用Eppendorf高速微量离心机离心10分钟，以除去血细胞。利用特异于EPO的抗体通过ELISA测定血清蛋白质水平。 
下表6以及图6显示了天然蛋白质和蛋白质偶联物的血清半衰期。利用本发明生成的作为载体的免疫球蛋白Fc区制备的EPO-PEG-Fc(大肠杆菌)蛋白质偶联物呈现出比天然EPO更长的血清半衰期。发现这种延长的半衰期要比Aranesp的半衰期更长，已知Aranesp是具有长血清半衰期的第二代EPO。 
表6 
    EPO   EPO-PEG-Fc偶联物   Aranesp
  Cmax 1(ng/ml)   30.4   192.8   96.8
  Tmax 2(hr)   12.0   48.0   12.0
  T1/2 3(hr)   6.1   47.0   16.4
  AUC4   (ng.hr/ml)   713   20436   4064
  MRT5(hr)   15.1   88   32
  1最大血清浓度  2达最大药物浓度所需的时间  3药物的血清半衰期  4血清浓度对时间曲线的曲线下面积  5药物分子在机体内停留的平均时间      
[0142] 工业实用性 
如上所述，本发明允许利用包含铰链区的重组免疫球蛋白Fc区在大肠杆菌内大规模地生产包涵体形式的免疫球蛋白Fc区。当与生理学活性蛋白质相连接时，所生成的免疫球蛋白Fc区可用以有效地增加所述生理学活性蛋白质的血清半衰期和生理学活性，而没有诱导免疫应答的风险。 
序列表
<110>韩美药品工业株式会社
<120>用于大量生产缺失起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法
<160>60
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplification of IgG4 Fc
<400>1
gggcatatgt catgcccagc acctgagttc ctgggggga
39
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplification of IgG4 Fc
<400>2
gggggatccc tatttaccca gagacaggga ga
32
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplification of IgG4 Fc
<400>3
gggcatatgc catcatgccc agcacctgag ttcctgggg
39
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplification of IgG4 Fc
<400>4
gggcatatgt gcccatcatg cccagcacct gagttcctgg
40
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplificaiton of IgG 4Fc
<400>5
gggcatatgt gcccagcacc tgagttcctg ggggga
36
<210>6
<211>663
<212>DNA
<213>homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(663)
<223>Met-Ser-Cys-Pro-Fc
<400>6
atg tca tgc cca gca cct gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg
48
Met Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
  1               5                  10                  15
ttc ccc cca aaa ccc aag gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag
96
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
             20                  25                  30
gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag
144
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
         35                  40                  45
ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag
192
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
     50                  55                  60
ccg cgg gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc
240
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag
288
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                 85                  90                  95
gtc tcc aac aaa ggc ctc ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa
336
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            100                 105                 110
gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc
384
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        115                 120                 125
cag gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa
432
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    130                 135                 140
ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag
480
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145                 150                 155                 160
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc
528
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                165                 170                 175
tcc ttc ttc ctc tac agc agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag
576
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            180                 185                 190
gag ggg aat gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac
624
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        195                 200                 205
cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa
663
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215                 220
<210>7
<211>221
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>7
Met Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
  1               5                  10                  15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
             20                  25                  30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
         35                  40                  45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
     50                  55                  60
Pro Arg GLu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                 85                  90                  95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            100                 105                 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    130                 135                 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145                 150                 155                 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                165                 170                 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            180                 185                 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        195                 200                 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215                 220
<210>8
<211>666
<212>DNA
<213>homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(666)
<223>Met-Pro-Ser-Cys-Pro-Fc
<400>8
atg cca tca tgc cca gca cct gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc
48
Met Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
  1               5                  10                  15
ctg ttc ccc cca aaa ccc aag gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct
96
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
             20                  25                  30
gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc
144
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
         35                  40                  45
cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca
192
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
     50                  55                  60
aag ccg cgg gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc
240
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
 65                  70                  75                  80
ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc
88
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                 85                  90                  95
aag gtc tcc aac aaa ggc ctc ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc
336
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            100                 105                 110
aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca
384
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        115                 120                 125
tcc cag gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc
432
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    130                 135                 140
aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg
480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145                 150                 155                 160
cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac
528
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                165                 170                 175
ggc tcc ttc ttc ctc tac agc agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg
576
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            180                 185                 190
cag gag ggg aat gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac
624
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        195                 200                 205
aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa
666
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215                 220
<210>9
<211>222
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>9
Met Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
             20                  25                  30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
         35                  40                  45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
     50                  55                  60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
 65                  70                  75                  80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                 85                  90                  95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            100                 105                 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        115                 120                 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    130                 135                 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145                 150                 155                 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                165                 170                 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            180                 185                 190
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        195                 200                 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215                 220
<210>10
<211>669
<212>DNA
<213>homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(669)
<223>Met-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro-Fc
<400>10
atg tgc cca tca tgc cca gca cct gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc
48
Met Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
  1               5                  10                  15
ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag gac act ctc atg atc tcc cgg acc
96
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
             20                  25                  30
cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa gac ccc gag
144
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
         35                  40                  45
gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag
192
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
     50                  55                  60
aca aag ccg cgg gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt gtg gtc agc
240
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
 65                  70                  75                  80
gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag
288
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
                 85                  90                  95
tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc
336
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
            100                 105                 110
tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc
384
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
        115                 120                 125
cca tcc cag gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg
432
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
    130                 135                 140
gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat
480
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145                 150                 155                 160
ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc
528
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                165                 170                 175
gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc agg cta acc gtg gac aag agc agg
576
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
            180                 185                 190
tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg
624
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        195                 200                 205
gac aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa
769
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215                 220
<210>11
<211>223
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>11
Met Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
  1               5                  10                  15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
             20                  25                  30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
         35                  40                  45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
     50                  55                  60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
 65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Val Leu His GLn Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
                 85                  90                  95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
            100                 105                 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
        115                 120                 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
    130                 135                 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145                 150                 155                 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                165                 170                 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
            180                 185                 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        195                 200                 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215                 220
<210>12
<211>660
<212>DNA
<213>homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>Met-Cys-Pro-Fc
<400>12
atg tgc cca gca cct gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc
48
Met Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
  1               5                  10                  15
ccc cca aaa ccc aag gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc
96
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
             20                  25                  30
acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc
144
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
         35                  40                  45
aac tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg
192
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
     50                  55                  60
cgg gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc
240
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
 65                  70                  75                  80
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc
288
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                 85                  90                  95
tcc aac aaa ggc ctc ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc
336
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
            100                 105                 110
aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag
384
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
        115                 120                 125
gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc
432
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    130                 135                 140
ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg
480
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145                 150                 155                 160
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc
528
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                165                 170                 175
ttc ttc ctc tac agc agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag
576
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
            180                 185                 190
ggg aat gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac
624
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        195                 200                 205
tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa
660
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215                 220
<210>13
<211>220
<212>PRT
<213>homo sapuens
<400>13
Met Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
  1               5                  10                  15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
             20                  25                  30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
         35                  40                  45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
     50                  55                  60
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
 65                  70                  75                  80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                 85                  90                  95
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
            100                 105                 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
        115                 120                 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145                 150                 155                 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                165                 170                 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
            180                 185                 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        195                 200                 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215                 220
<210>14
<211>15
<212>PRT
<213>homo sapiens
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(15)
<223>Ig G1 hinge
<400>14
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
  1               5                  10                  15
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>homo sapiens
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(12)
<223>Ig G2 hinge
<400>15
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
  1               5                  10
<210>16
<211>62
<212>PRT
<213>homo sapiens
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(62)
<223>Ig G3hinge
<400>16
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
  1               5                  10                  15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
             20                  25                  30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
         35                  40                  45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
     50                  55                  60
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>homo sapiens
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(12)
<223>Ig G4 hinge
<400>17
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
  1               5                  10
<210>18
<211>3
<212>PRT
<213>homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgG4 hinge
<400>18
Ser Cys Pro
  1
<210>19
<211>4
<212>PRT
<213>homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(4)
<223>fragment of IgG4 hinge
<400>19
Pro Ser Cys Pro
  1
<210>20
<211>5
<212>PRT
<213>homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(5)
<223>fragment of IgG4 hinge
<400>20
Cys Pro Ser Cys Pro
  1               5
<210>21
<211>2
<212>PRT
<213>homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(2)
<223>fragment of IgG4 hinge
<400>21
Cys Pro
  1
<210>22
<211>699
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(699)
<223>Met-Glu-Pro-Lys-Fc
<400>22
atg gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca
48
Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
  1               5                  10                  15
gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa
96
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
             20                  25                  30
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg
144
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
         35                  40                  45
gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac
192
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
     50                  55                  60
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag
240
Val Asp Gly VaL Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
 65                  70                  75                  80
cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac
288
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                 85                  90                  95
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa
336
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
            100                 105                 110
gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag
384
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
        115                 120                 125
ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg
432
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
    130                 135                 140
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc
480
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145                 150                 155                 160
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac
528
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
                165                 170                 175
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc
576
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
            180                 185                 190
tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc
624
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
        195                 200                 205
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag
672
The Ser Cys Ser Val Met His GLu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
    210                 215                 220
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
699
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>23
<211>233
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>23
Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
  1               5                  10                  15
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
             20                  25                  30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
         35                  40                  45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
     50                  55                  60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
 65                  70 7                 5                  80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                 85                  90                  95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
            100                 105                 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
        115                 120                 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
    130                 135                 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
                165                 170                 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
            180                 185                 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
        195                 200                 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
    210                 215                 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>24
<211>690
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(690)
<223>Met-Ser-Cys-Asp-Fc
<400>24
atg tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa
48
Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
  1               5                  10                  15
ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac
96
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
             20                  25                  30
acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac
144
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
         35                  40                  45
gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc
192
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
     50                  55                  60
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac
240
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg
288
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                 85                  90                  95
ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca
336
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            100                 105                 110
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag
384
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        115                 120                 125
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac
432
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
    130                 135                 140
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc
480
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc
528
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                165                 170                 175
acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag
576
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            180                 185                 190
ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc
624
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        195                 200                 205
tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc
672
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    210                 215                 220
tcc ctg tct ccg ggt aaa
690
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>25
<211>230
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>25
Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
  1               5                  10                 15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
             20                  25                  30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
         35                  40                  45
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
     50                  55                  60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                 85                  90                  95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            100                 105                 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        115                 120                 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
    130                 135                  140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                165                 170                 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            180                 185                 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        195                 200                 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>26
<211>684
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(684)
<223>Met-Asp-Lys-Thr-Fc
<400>26
atg gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg
48
Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
  1               5                  10                  15
ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc
96
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
             20                  25                  30
atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc
144
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
         35                  40                  45
cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag
192
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
     50                  55                  60
gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg
240
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
 65                  70                  75                  80
tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat
288
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                 85                  90                  95
ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc
336
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            100                 105                 110
atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag
384
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        115                 120                 125
gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc
432
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    130                 135                 140
agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg
480
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145                 150                 155                 160
gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct
528
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                165                 170                 175
ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc
576
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            180                 185                 190
gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg
624
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        195                 200                 205
atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg
672
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    210                 215                 220
tct ccg ggt aaa
684
Ser Pro Gly Lys
225
<210>27
<211>228
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>27
Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
  1               5                  10                  15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
             20                  25                  30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
         35                  40                  45
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
     50                  55                  60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
 65                  70                  75                  80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                 85                  90                  95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        115                 120                 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145                 150                 155                 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            180                 185                 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        195                 200                 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210>28
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>Met-Cys-Pro-Fc
<400>28
atg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc
48
Met Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
  1               5                  10                  15
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc
96
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
             20                  25                  30
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc
144
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
         35                  40                  45
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg
192
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
     50                  55                  60
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc
240
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
 65                  70                  75                  80
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc
288
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                 85                  90                  95
tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc
336
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
            100                 105                 110
aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg
384
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
        115                 120                 125
gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc
432
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    130                 135                 140
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg
480
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145                 150                 155                 160
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc
528
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                165                 170                 175
ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag
576
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
            180                 185                 190
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac
624
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        195                 200                 205
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
660
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>29
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>29
Met Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
  1               5                  10                  15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
             20                  25                  30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
         35                  40                  45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
     50                  55                  60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
 65                  70                  75                  80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                 85                  90                  95
Ser Asn Lys A1a Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
            100                 105                 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
        115                 120                 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145                 150                 155                 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                165                 170                 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
            180                 185                 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        195                 200                 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>30
<211>696
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(696)
<223>Met-Pro-Lys-Ser-Fc
<400>30
atg ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca
48
Met Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
  1               5                  10                  15
cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc
96
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
             20                  25                  30
aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg
144
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
         35                  40                  45
gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg
192
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
     50                  55                  60
gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag
240
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
 65                  70                  75                  80
tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag
288
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                 85                  90                  95
gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc
336
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc
384
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc
432
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc
480
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac
528
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac
576
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc
624
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag
672
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
696
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>31
<211>232
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>31
Met Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
  1               5                  10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
             20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
         35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
     50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
 65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                 85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>32
<211>669
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(669)
<223>Met-Cys-Pro-Pro-Fc
<400>32
atg tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc
48
Met Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
  1               5                  10                  15
ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc
96
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
             20                  25                  30
cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag
144
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
         35                  40                  45
gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag
192
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
     50                  55                  60
aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc
240
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
 65                  70                  75                  80
gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag
288
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
                 85                  90                  95
tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc
336
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
            100                 105                 110
tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc
384
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
        115                 120                 125
cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg
432
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
    130                 135                 140
gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat
480
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145                 150                 155                 160
ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc
528
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                165                 170                 175
gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg
576
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
            180                 185                 190
tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg
624
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        195                 200                 205
cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
669
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>33
<211>223
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>33
Met Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
  1               5                  10                  15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
             20                  25                  30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
         35                  40                  45
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
     50                  55                  60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
 65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
                 85                  90                  95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
            100                 105                 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
        115                 120                 125
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
    130                 135                 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145                 150                 155                 160
Gly Gln Pro Glu Asr Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                165                 170                 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
            180                 185                 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        195                 200                 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>34
<211>666
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(666)
<223>Met-Pro-Pro-Cys-Fc
<400>34
atg cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc
48
Met Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
  1               5                  10                  15
ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct
96
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
             20                  25                  30
gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc
144
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
         35                  40                  45
aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca
192
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
     50                  55                  60
aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc
240
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
 65                  70                  75                  80
ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc
288
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                 85                  90                  95
aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc
336
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            100                 105                 110
aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca
384
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        115                 120                 125
tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc
432
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    130                 135                 140
aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg
480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145                 150                 155                 160
cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac
528
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                165                 170                 175
ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg
576
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            180                 185                 190
cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac
624
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        195                 200                 205
aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
666
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>35
<211>222
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>35
Met Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
  1               5                  10                  15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
             20                  25                  30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
         35                  40                  45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
     50                  55                  60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
 65                  70                  75                  80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                 85                  90                  95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            100                 105                 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        115                 120                 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    130                 135                 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145                 150                 155                 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                165                 170                 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            180                 185                 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        195                 200                 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>36
<211>663
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(663)
<223>Met-Pro-Cys-Pro-Fc
<400>36
atg ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc
48
Met Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
  1               5                  10                  15
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag
96
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
             20                  25                  30
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag
144
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
         35                  40                  45
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag
192
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
     50                  55                  60
ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc
240
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag
288
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                 85                  90                  95
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa
336
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            100                 105                 110
gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc
384
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        115                 120                 125
cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa
432
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    130                 135                 140
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag
480
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145                 150                 155                 160
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc
528
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                165                 170                 175
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag
576
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            180                 185                 190
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac
624
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        195                 200                 205
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
663
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>37
<211>221
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>37
Met Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
  1               5                  10                  15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
             20                  25                  30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                 85                  90                  95
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            100                 105                 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    130                 135                 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145                 150                 155                 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                165                 170                 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            180                 185                 190
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        195                 200                 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>38
<211>663
<212>DNA
<213>Homto sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(663)
<223>Met-Pro-Pro-Cys-Fc
<400>38
atg cca ccg tgc cca gca cct ccg gtg gcg gga ccg tca gtc ttc ctc
48
Met Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
  1               5                  10                  15
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag
96
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
             20                  25                  30
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc cag
144
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
         35                  40                  45
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag
192
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    50                  55                  60
ccg cgg gag gag cag ttt aac agc acg ttt cgt gtg gtc agc gtc ctc
240
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
acc gtc gtg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag
288
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                 85                  90                  95
gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa
336
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            100                 105                 110
acc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc
384
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        115                 120                 125
cgg gaa gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa
432
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    130                 135                 140
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag
480
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145                 150                 155                 160
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc
528
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
                165                 170                 175
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag
576
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            180                 185                 190
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac
624
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        195                 200                 205
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
663
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>39
<211>221
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>39
Met Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
  1               5                  10                  15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
             20                  25                  30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
         35                  40                  45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
     50                  55                  60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                 85                  90                  95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            100                 105                 110
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    130                 135                 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145                 150                 155                 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
                165                 170                 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            180                 185                 190
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        195                 200                 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>40
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>Met-Pro-Cys-Pro-Fc
<400>40
atg ccg tgc cca gca cct ccg gtg gcg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc
48
Met Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
  1               5                  10                  15
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc
96
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
             20                  25                  30
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc cag ttc
144
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
         35                  40                  45
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg
192
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
     50                  55                  60
cgg gag gag cag ttt aac agc acg ttt cgt gtg gtc agc gtc ctc acc
240
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
 65                  70                  75                  80
gtc gtg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc
288
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                 85                  90                  95
tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc
336
Ser Asr Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
            100                 105                 110
aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg
384
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
        115                 120                 125
gaa gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc
432
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    130                 135                 140
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg
480
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145                 150                 155                 160
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc tcc
528
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                165                 170                 175
ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag
576
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
            180                 185                 190
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac
624
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        195                 200                 205
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
660
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>41
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>41
Met Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
  1               5                  10                  15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
             20                  25                  30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
         35                  40                  45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
     50                  55                  60
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
 65                  70                  75                  80
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                 85                  90                  95
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
            100                 105                 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
        115                 120                 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145                 150                 155                 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                165                 170                 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
            180                 185                 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        195                 200                 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>42
<211>657
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(657)
<223>Met-Cys-Pro-Fc
<400>42
atg tgc cca gca cct ccg gtg gcg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc
48
Met Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
  1               5                  10                  15
cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca
96
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
             20                  25                  30
tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc cag ttc aac
144
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
         35                  40                  45
tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg
192
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
     50                  55                  60
gag gag cag ttt aac agc acg ttt cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc
240
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
 65                  70                  75                  80
gtg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc
288
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
                 85                  90                  95
aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa
336
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
            100                 105                 110
ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gaa
384
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
        115                 120                 125
aag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc
432
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
    130                 135                 140
tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag
480
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
145                 150                 155                 160
aac aac tac aag acc acg cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc
528
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
                165                 170                 175
ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg
576
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
            180                 185                 190
aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac
624
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
        195                 200                 205
acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa
657
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215
<210>43
<211>219
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>43
Met Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
  1               5                  10                  15
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
             20                  25                  30
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
         35                  40                  45
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
     50                  55                  60
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
 65                  70                  75                  80
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
                 85                  90                  95
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
            100                 105                 110
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
        115                 120                 125
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
                165                 170                 175
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
            180                 185                 190
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
        195                 200                 205
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215
<210>44
<211>678
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(678)
<223>Met-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Fc
<400>44
atg tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cct ccg gtg gcg gga
48
Met Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
  1               5                  10                  15
ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc
96
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
             20                  25                  30
tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa
144
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
         35                  40                  45
gac cct gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat
192
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
     50                  55                  60
aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttt aac agc acg ttt cgt
240
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
 65                  70                  75                  80
gtg gtc agc gtc ctc acc gtc gtg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag
288
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
                 85                  90                  95
gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag
336
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
            100                 105                 110
aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac
384
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
        115                 120                 125
acc ctg ccc cca tcc cgg gaa gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg
432
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
    130                 135                 140
acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg
480
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145                 150                 155                 160
gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc atg
528
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
                165                 170                 175
ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac
576
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
            180                 185                 190
aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat
624
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
        195                 200                 205
gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg
672
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
    210                 215                 220
ggt aaa
678
Gly Lys
225
<210>45
<211>226
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>45
Met Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
  1               5                  10                  15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
             20                  25                  30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
         35                  40                  45
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
     50                  55                  60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
 65                  70                  75                  80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
                 85                  90                  95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
            100                 105                 110
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
        115                 120                 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
    130                 135                 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145                 150                 155                 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
                165                 170                 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
            180                 185                 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
        195                 200                 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
    210                 215                 220
Gly Lys
225
<210>46
<211>675
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(675)
<223>Met-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Fc
<400>46
atg tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cct ccg gtg gcg gga ccg
48
Met Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
  1               5                  10                  15
tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc
96
Ser Val Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
             20                  25                  30
cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac
144
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
         35                  40                  45
cct gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat
192
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
     50                  55                  60
gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttt aac agc acg ttt cgt gtg
240
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
 65                  70                  75                  80
gtc agc gtc ctc acc gtc gtg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag
288
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                 85                  90                  95
tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa
336
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
            100                 105                 110
acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc
384
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
        115                 120                 125
ctg ccc cca tcc cgg gaa gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc
432
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    130                 135                 140
tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag
480
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145                 150                 155                 160
agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc atg ctg
528
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
                165                 170                 175
gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag
576
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
           180                 185                 190
agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag
624
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
        195                 200                 205
gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt
672
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    210                 215                 220
aaa
675
Lys
225
<210>47
<211>225
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>47
Met Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
  1               5                 10                  15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
             20                  25                  30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
         35                  40                  45
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
     50                  55                  60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
 65                  70                  75                  80
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                 85                  90                  95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
            100                 105                 110
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
        115                 120                 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145                 150                 155                 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
                165                 170                 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
            180                 185                 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
        195                 200                 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    210                 215                 220
Lys
225
<210>48
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgGl hinge
<400>48
Glu Pro  Lys
1
<210>49
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgGl hinge
<400>49
Ser Cys Asp
1
<210>50
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgG1 hinge
<400>50
Asp Lys Thr
1
<210>51
<211>2
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(2)
<223>fragment of IgG1 hinge
<400>51
Cys Pro
1
<210>52
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgG1 hinge
<400>52
Pro Lys Ser
1
<210>53
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgG1 hinge
<400>53
Cys Pro Pro
1
<210>54
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgG1 hinge
<400>54
Pro  Pro Cys
1
<210>55
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgG1 hinge
<400>55
Pro Cys Pro
1
<210>56
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgG2 hinge
<400>56
Pro Pro Cys
1
<210>57
<211>3
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(3)
<223>fragment of IgG2 hinge
<400>57
Pro Cys Pro
1
<210>58
<211>2
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(2)
<223>fragment of IgG2 hinge
<400>58
Cys Pro
1
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(9)
<223>fragment of IgG2 hinge
<400>59
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
  1               5
<210>60
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(8)
<223>fragment of IgG2 hinge
<400>60
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
  1               5

Claims (13)

1.生产无起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法，该方法包括：
制备包含编码重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列的重组表达载体，所述重组免疫球蛋白Fc区由以其N末端经肽键与免疫球蛋白铰链区连接的免疫球蛋白Fc区组成；
用上述重组表达载体转化原核细胞，生成转化体；
培养上述转化体，以表达包涵体形式的免疫球蛋白Fc区；和
分离并纯化免疫球蛋白Fc区，
其中免疫球蛋白铰链区具有作为N末端起始氨基酸的半胱氨酸、丝氨酸或者脯氨酸并且在其序列中包括至少一个半胱氨酸，和
其中所述原核细胞是其中不发生糖基化的原核细胞并且其具有氨肽酶活性。
2.权利要求1的方法，其中所述铰链区具有衍生自IgG、IgA、IgM、IgE或IgD的铰链区的两个或多个连续氨基酸序列。
3.权利要求2的方法，其中所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
4.权利要求3的方法，其中所述铰链区的氨基酸序列是SEQ IDNO.18、19、20、21、49、51、53、54、55、56、57、58、59或60。
5.权利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区选自来自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD的Fc区、及其组合体和杂合体。
6.权利要求5的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区是选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合体和杂合体的IgG的Fc区。
7.权利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3、CH4和CL结构域的1到4个结构域组成。
8.权利要求1的方法，其中所述重组免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列是SEQ ID NO.7、9、11、13、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45或47。
9.权利要求1的方法，其中所述重组表达载体包括编码选自SEQ ID NO.7、9、11、13、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47的氨基酸序列的核苷酸序列。
10.权利要求1的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌。
11.权利要求1的方法，其中所述转化体用包括编码选自SEQ IDNO.7、9、11、13、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47的重组免疫球蛋白Fc区的核苷酸序列的重组表达载体转化。
12.通过权利要求1的方法制备的无起始甲硫氨酸残基的单体或二聚体免疫球蛋白Fc区，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自SEQ IDNO.6、8、10、12、24、28、30、32、34、36、40、44和46的核苷酸序列编码。
13.权利要求11的方法，其中所述转化体选自以保藏号KCCM-10659P、KCCM-10660P、KCCM-10665P和KCCM-10666P保藏的转化体组成的组。
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