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CN108136276B - 通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复合物 - Google Patents

通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复合物 Download PDF

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CN108136276B CN201680055445.7A CN201680055445A CN108136276B CN 108136276 B CN108136276 B CN 108136276B CN 201680055445 A CN201680055445 A CN 201680055445A CN 108136276 B CN108136276 B CN 108136276B
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洪性熙
裴城敏
权世昌
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Abstract

提供了复合物组合物，当免疫球蛋白Fc区被用作运载体时，通过将免疫球蛋白Fc区的N‑端用作结合位点，最小化所述复合物组合物的位置异构体。还提供了蛋白质复合物、其制备方法、和包括其的用于改进生理学活性多肽的体内持续性和稳定性的药物组合物，所述蛋白质复合物通过免疫球蛋白Fc区的N‑端特异性结合制备，从而延长生理学活性多肽的血液半衰期，维持体内效力处于高水平，并且不具有免疫应答的风险。通过本发明制备的蛋白质复合物可以被有用地应用于多种生理学活性多肽药物的长效制剂的研发。

Description

通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复 合物
技术领域
本发明涉及蛋白质复合物、其制备方法、和包括其的用于改进生理学活性多肽的体内持续性和稳定性的药物组合物，所述蛋白质复合物通过如下制备：经由非肽基聚合物将免疫球蛋白Fc区连接至生理学活性多肽，其中非肽基聚合物被特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N-端。另外，本发明涉及蛋白质复合物的群体，其包括通过上面的方法制备的蛋白质复合物。
背景技术
一般而言，多肽由于其低稳定性而容易变性，并且被血液中的蛋白水解酶分解以通过肾或肝而容易地去除。因此，为了维持蛋白质药物——其包括作为药理学活性成分的多肽——的血液浓度和效价，必须频繁地给患者施用蛋白质药物。然而，在主要以可注射制剂的形式施用给患者的蛋白质药物的情况下，频繁注射以维持活性多肽的血液浓度可能引起患者过度痛苦。为了解决这样的问题，已经存在不懈努力以通过增加蛋白质药物的血液稳定性和维持其血液浓度持续较长时间来最大化药理学功效。这样的蛋白质药物的长效制剂需要增加蛋白质药物的稳定性，并且同时维持药物自身的效力处于足够高的水平，以及不引起患者中的免疫反应。
在现有技术中，为了稳定蛋白质并且抑制与蛋白水解酶接触和通过肾损失，已经使用了用于将具有高溶解度的聚合物比如聚乙二醇(在下文称为“PEG”)化学地添加至蛋白质药物的表面的方法。已经知道PEG通过非特异性地结合至靶标蛋白的特异性位点或多个位点以增加其溶解度而对稳定蛋白质和防止蛋白质的水解是有效的，而不引起任何不良副作用(Sada et al.,J.Fermentation Bioengineering 71:137-139,1991)。然而，结合PEG可以增加蛋白质的稳定性，但是显著地降低生理活性蛋白的效价。随着PEG的分子量增加，其与蛋白质的反应性也降低，导致低产率。通过将PEG结合至蛋白质可能产生的另一个问题是缀合物的连接异构化，其由许多可能的连接位点的竞争引起。
这在使用PEG的缀合物药物的制备中是重要问题，并且对在引发最大功效和效果的条件下制备的均质药物存在要求。如果包括通过将PEG结合至影响药物的功效的结合位点生成的大量相关化合物，则可能引起非期望的功效降低。
发明内容
技术问题
本发明人已经研究了能够在如下位点处连接生理学活性多肽缀合物的方法，所述位点通过适合批量生产缀合物的过程显示最高功效，并且结果，通过指定作为运载体被包括的免疫球蛋白Fc片段的结合位点，他们已经研发出以最高功效制备高纯度缀合物的方法，从而完成本发明。
技术方案
本发明的目标是提供蛋白质复合物，其通过如下制备：经由非肽基聚合物连接生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc片段，其中非肽基聚合物被位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc片段的N-端。
本发明的另一个目标是提供制备蛋白质复合物的方法。
本发明的还另一个目标是提供用于改进生理学活性多肽的体内持续性和稳定性的药物组合物，该组合物包括作为活性成分的蛋白质复合物。
有益效果
本发明涉及具有改进的体内持续性的蛋白质复合物，其在蛋白质复合物的制备期间使用特异性位点制备。具体地，本发明涉及蛋白质复合物，其中生理学活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的N-端通过共价键彼此连接，从而改进生理学活性多肽的体内持续性。通过本发明制备的蛋白质复合物可以被应用于制备多种生理学活性多肽药物的长效制剂。
附图说明
图1a显示了通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的IFNα-PEG-Fc复合物的SDS-PAGE和蛋白质印迹的结果。
图1b显示了通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的hGH-PEG-Fc复合物的SDS-PAGE和蛋白质印迹的结果。
图1c显示了通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的17,65Ser-G-CSF-PEG-Fc复合物的SDS-PAGE和蛋白质印迹的结果。
图1d显示了通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的胰岛素-PEG-Fc复合物的SDS-PAGE和蛋白质印迹的结果。
图1e显示了通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的EPO-PEG-Fc复合物的SDS-PAGE和蛋白质印迹的结果。
图1f显示了通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc复合物的SDS-PAGE和蛋白质印迹的结果。
图1g显示了通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的FacVII-PEG-Fc复合物的SDS-PAGE和蛋白质印迹的结果。
图2a显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的IFNα-PEG-Fc复合物的纯度的IE-HPLC和SE-HPLC的结果。
图2b显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的hGH-PEG-Fc复合物的纯度的IE-HPLC和SE-HPLC的结果。
图2c显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的17,65Ser-G-CSF-PEG-Fc复合物的纯度的IE-HPLC和SE-HPLC的结果。
图2d显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的胰岛素-PEG-Fc复合物的纯度的IE-HPLC和SE-HPLC的结果。
图2e显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的EPO-PEG-Fc复合物的纯度的IE-HPLC和SE-HPLC的结果。
图2f显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc复合物的纯度的IE-HPLC和SE-HPLC的结果。
图3a显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的IFNα-PEG-Fc复合物的Fc区N-端结合的肽作图的结果。
图3b显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的hGH-PEG-Fc复合物的Fc区N-端结合的肽作图的结果。
图3c显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的17,65Ser-G-CSF-PEG-Fc复合物的Fc区N-端结合的肽作图的结果。
图3d显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的胰岛素-PEG-Fc复合物的Fc区N-端结合的肽作图的结果。
图3e显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的EPO-PEG-Fc复合物的Fc区N-端结合的肽作图的结果。
图3f显示了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N-端反应制备的CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc复合物的Fc区N-端结合的肽作图的结果。
具体实施方式
为了实现上面的目标，本发明的一方面提供了蛋白质复合物，其包括经由非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc区的生理学活性多肽，其中非肽基聚合物被位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N-端。
本发明的具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中非肽基聚合物的两端经由共价键通过其两端处的反应基团被分别连接至生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区。
本发明的另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中免疫球蛋白Fc区是去糖基化的。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3、和CH4结构域的一种至四种结构域构成。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中免疫球蛋白Fc区进一步包括铰链区。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中免疫球蛋白Fc区是源自IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM的免疫球蛋白Fc片段。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中免疫球蛋白Fc片段的每个结构域是结构域的杂合，并且每个结构域具有不同起源，其源自选自IgG、IgA、IgD、IgE、和IgM的免疫球蛋白。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中免疫球蛋白Fc片段是由包括具有相同起源的结构域的单链免疫球蛋白构成的二聚体或多聚体。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中免疫球蛋白Fc片段是IgG4Fc片段。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中免疫球蛋白Fc片段是人去糖基化IgG4Fc片段。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、和其组合。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中非肽基聚合物是聚乙二醇。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中非肽基聚合物的反应基团选自醛基团、马来酰亚胺基团、和琥珀酰亚胺衍生物。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中醛基团是丙醛基团、或丁醛基团。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中非肽基聚合物在两端处具有作为反应基团的醛基团。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中非肽基聚合物在两端处分别具有作为反应基团的醛基团和马来酰亚胺基团。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中非肽基聚合物在两端处分别具有作为反应基团的醛基团和琥珀酰亚胺基团。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中非肽基聚合物的每端被连接至免疫球蛋白Fc区的N-端和分别地生理学活性多肽的赖氨酸残基、组氨酸残基、或半胱氨酸残基的N-端、C-端、或游离反应基团。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中生理学活性多肽选自激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录因子、凝血因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白、和受体。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中生理学活性多肽选自人生长激素，生长激素释放激素，生长激素释放肽，干扰素，干扰素受体，集落刺激因子，胰高血糖素样肽(GLP-1等)，毒蜥外泌肽(毒蜥外泌肽4等)，泌酸调节肽，G蛋白偶联受体，白介素，白介素受体，酶，白介素偶联蛋白，细胞因子偶联蛋白，巨噬细胞活化因子，巨噬细胞肽，B细胞因子，T细胞因子，蛋白A，过敏抑制因子，细胞坏死糖蛋白，免疫毒素，淋巴毒素，肿瘤坏死因子，肿瘤阻抑因子，转化生长因子，α-1抗胰蛋白酶，白蛋白，α-乳白蛋白，载脂蛋白-E，红细胞生成素，糖基化红细胞生成素，血管生成素(angiopoietin)，血红蛋白，凝血酶，凝血酶受体活化肽，凝血调节蛋白，凝血因子VII、VIIa、VIII、IX和XIII，纤溶酶原激活剂，纤维蛋白结合肽，尿激酶，链激酶，蛭素，蛋白C，C-反应蛋白，肾素抑制剂，胶原酶抑制剂，超氧化物歧化酶，瘦蛋白，血小板源生长因子，上皮生长因子，表皮生长因子，制管张素，血管紧张素，骨形态发生生长因子，骨形态发生刺激蛋白，降钙素，胰岛素，心钠素，软骨诱导因子，依降钙素(elcatonin)，结缔组织活化因子，组织因子途径抑制剂，促卵泡激素，促黄体生成激素，促黄体生成激素释放激素，神经生长因子，甲状旁腺激素，松弛素，促胰液素，生长调节素，胰岛素样生长因子，肾上腺皮质激素，胰高血糖素，缩胆囊素，胰腺多肽，胃泌素释放肽，促肾上腺皮质激素释放因子，促甲状腺激素，自体毒素(autotaxin)，乳铁蛋白，肌肉生长抑制素(myostatin)，受体，受体拮抗剂，细胞表面抗原，病毒源疫苗抗原，单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段，和其衍生物。
本发明的还另一个具体实施方式提供了蛋白质复合物，其中生理学活性多肽是人生长激素、干扰素-α、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、凝血因子、胰岛素、泌酸调节肽、胰高血糖素样肽、毒蜥外泌肽、和其衍生物。
本发明的另一个方面提供了制备蛋白质复合物的方法，方法包括：
(a)通过如下制备蛋白质复合物：通过共价键连接至少一个在两端处具有反应基团的非肽基聚合物、至少一个生理学活性多肽、和至少一个免疫球蛋白Fc区，和
(b)分离在步骤(a)中制备的蛋白质复合物，其基本上包括共价连接的生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区，其中非肽基聚合物被连接至免疫球蛋白Fc片段的N-端。
本发明的具体实施方式提供了制备方法，其中步骤(a)包括：
(a1)通过如下制备缀合物：通过共价键将非肽基聚合物的一端连接至免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽；和
(a2)分离在步骤(a1)中制备的缀合物，并且通过共价键将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽中的另一个。
本发明的另一个具体实施方式提供了制备方法，其中在步骤(a1)中，生理学活性多肽和非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:30的范围中，并且免疫球蛋白Fc片段和非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:20的范围中。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中步骤(a1)以4.0至9.0的pH条件进行。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中步骤(a1)在4.0℃至25℃的温度下进行。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中在步骤(a1)中，免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的反应浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中在步骤(a2)中，缀合物和免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽之间的反应摩尔比在1:0.1至1:20的范围中。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中步骤(a2)以4.0至9.0的pH条件进行。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中步骤(a2)在4.0℃至25℃的温度下进行。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中在步骤(a2)中，免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中步骤(a1)和步骤(a2)在存在还原剂的情况下进行。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中还原剂选自氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、硼氢化钠、硼酸二甲胺、和硼酸吡啶。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中在步骤(a2)，分离通过选自如下的单一或组合纯化方法进行：阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析、和大小排阻层析。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中阴离子交换层析树脂的官能团是选自季铵(Q)、季氨基乙基(QAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、聚乙烯胺(PEI)、二甲基氨基甲基(DMAE)、和三甲基氨基乙基(TMAE)的任一种。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中阳离子交换层析树脂的官能团是选自甲基磺酸盐(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、和聚天冬氨酸的任一种。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中疏水层析树脂的官能团是选自苯基、辛基、(异)丙基、丁基、和乙基的任一种。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中亲和层析树脂的官能团是选自蛋白A、肝素、蓝色剂(blue)、苄脒、金属离子(钴、镍、和铜)、和针对蛋白质复合物——其中非肽基聚合物的两端被分别缀合至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽——的部分或全部构成组分的抗体的任一种。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中大小排阻层析的树脂选自Superdex、Sephacryl、Superpose、和Sephadex。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中分离步骤(b)的蛋白质复合物通过选自如下的单一或组合方法进行：阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析、和大小排阻层析。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中阴离子交换层析树脂的官能团是选自季铵(Q)、季氨基乙基(QAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、聚乙烯胺(PEI)、二甲基氨基甲基(DMAE)、和三甲基氨基乙基(TMAE)的任一种。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中阳离子交换层析树脂的官能团是选自甲基磺酸盐(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、和聚天冬氨酸的任一种。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中疏水层析树脂的官能团是选自苯基、辛基、(异)丙基、丁基、和乙基的任一种。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中亲和层析树脂的官能团是选自蛋白A、肝素、蓝色剂(blue)、苄脒、金属离子(钴、镍、和铜)、和针对蛋白质复合物——其中非肽基聚合物的两端被分别缀合至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽——的部分或全部构成组分的抗体的任一种。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中大小排阻层析的树脂选自Superdex、Sephacryl、Superpose、和Sephadex。
本发明的还另一个具体实施方式提供了制备方法，其中步骤(b)分离蛋白质复合物，其中构成蛋白质复合物的非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区通过免疫球蛋白Fc区的N-端连接。
本发明的还另一方面提供了制备位置特异性蛋白质复合物的方法，方法包括：
(a')通过如下制备缀合物：通过共价键将非肽基聚合物的一端连接至免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽，其以4.0至9.0的pH条件进行；
(b')分离在步骤(a')中制备的缀合物，并且通过共价键将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽中的另一个，其以4.0至9.0的pH条件进行；和
(c')分离在步骤(b')中制备的蛋白质复合物，其基本上包括共价连接的生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区，其中非肽基聚合物被连接至免疫球蛋白Fc片段的N-端。
具体而言，非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的N-端之间的结合的反应速率的重要条件是pH，并且位点特异性结合可以在中性pH以下——即pH 7.0以下——的pH值下良好地发生。
在中性pH以下的pH值下进行，但是在弱酸性至酸性pH——其不使蛋白质的三级结构或活性变性——下合适地进行非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区的N-端的连接，但是不限于此。作为非限制性实例，在本发明中使用的免疫球蛋白Fc区具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且其确认在大约pH 8.2的弱碱性条件下具有N-端特异性(实施例5)。
即，当使用一般免疫球蛋白Fc区时，免疫球蛋白Fc区的N-端和非肽基聚合物的结合的反应速率在中性pH以下的pH下增加。然而，当使用突变以具有较低pH敏感性的免疫球蛋白Fc区时，结合的反应速率可以不局限于该条件。
本发明的还另一方面提供了制备蛋白质复合物的方法，方法包括：
(a')通过如下制备缀合物：通过共价键将非肽基聚合物的一端连接至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽中的任一个，其中生理学活性多肽和非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:30的范围中，并且免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:20的范围中，以1mM至100mM的范围包含还原剂，并且反应以4.0至9.0的pH条件、在4.0℃至25℃的温度下进行，并且免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的反应浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中；
(b')分离在步骤(a')中制备的缀合物，并且通过共价键将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽中的另一个，其中缀合物和免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽之间的反应摩尔比在1:0.1中1:20的范围中，以1mM至100mM的范围包含还原剂，并且反应以4.0至9.0的pH条件、在4.0℃至25℃的温度下进行，并且免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的反应浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中；和
(c')分离在步骤(b')中制备的蛋白质复合物，其基本上包括共价连接的生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区，其中非肽基聚合物被连接至免疫球蛋白Fc片段的N-端。
本发明的还另一个具体实施方式提供了用于制备具有90％或更高的N-端选择性的蛋白质复合物的方法。
本发明的还另一方面提供了用于改进生理学活性多肽的体内持续性和稳定性的药物组合物，其包括作为活性成分的蛋白质复合物。
本发明的具体实施方式提供了以90％或更高的量包括蛋白质复合物的组合物。
本发明的还另一方面提供了蛋白质复合物的群体，其以90％或更高的量包括根据上面用于制备蛋白质复合物的方法制备的蛋白质复合物。
在下文中，将详细地描述本发明。
本发明的一方面提供了通过如下制备的蛋白质复合物：经由非肽基聚合物连接生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区，其中非肽基聚合物被位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N-端。
如本文使用的，术语“蛋白质复合物”或“复合物”指的是如下结构：其中至少一个生理学活性多肽、至少一个在其两端处具有反应基团的非肽基聚合物、和至少一个免疫球蛋白Fc区经由共价键彼此连接。进一步，选自生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区的仅仅两种分子经由共价键彼此连接的结构被称为“缀合物”，以便将其与“复合物”进行区分。
本发明的蛋白质复合物可以是如下蛋白质复合物：其中非肽基聚合物经由共价键通过其两端处的反应基团被分别连接至生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区。
如本文使用的，术语“生理学活性多肽”、“生理活性蛋白”、“活性蛋白”、或“蛋白质药物”指的是在体内对生理学事件具有一些种类的拮抗活性的多肽或蛋白质，并且这些术语可以被可交换地使用。
如本文使用的，术语“非肽基聚合物”指的是生物相容性聚合物，其包括通过排除肽键的任何共价键彼此连接的两个或更多个重复单元，但是不限于此。
如本文使用的，术语“免疫球蛋白Fc区”指的是免疫球蛋白分子的分区，除免疫球蛋白的重链与轻链的可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)以外。免疫球蛋白Fc区可以在重链恒定区处进一步包括铰链区。具体而言，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是包括部分或全部Fc区的片段，并且在本发明中，免疫球蛋白Fc区可以与免疫球蛋白片段可交换地使用。
天然Fc在重链恒定区1的Asn297位处具有糖链，但是大肠杆菌源重组体Fc被表达为去糖基化形式。从Fc去除糖链导致Fcγ受体1、2、和3以及补体(c1q)与重链恒定区1的结合亲和力降低，造成抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或损失。
如本文使用的，术语“免疫球蛋白恒定区”可以指的是Fc片段，其包括重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)(或包含重链恒定区4(CH4))，除免疫球蛋白的重链与轻链的可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区(CL)以外，并且可以在重链恒定区处进一步包括铰链区。进一步，本发明的免疫球蛋白恒定区可以是延伸的免疫球蛋白恒定区，其包括部分或全部Fc区，所述Fc区包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区(CL)，除免疫球蛋白的重链与轻链的可变区以外，只要它具有基本上类似于或优于天然蛋白的生理学功能。另外，它可以是在CH2和/或CH3的相对长部分的氨基酸序列中具有缺失的分区。即，本发明的免疫球蛋白恒定区可以包括(1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、和CH4结构域，(2)CH1结构域和CH2结构域，(3)CH1结构域和CH3结构域，(4)CH2结构域和CH3结构域，(5)恒定区和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的一个或多个结构域的组合，和(6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。包括免疫球蛋白Fc片段的免疫球蛋白恒定区是生物可降解多肽，其可以在体内代谢，使得它可以被安全地用作药物运载体。此外，免疫球蛋白Fc片段由于其相对低的分子量与完整免疫球蛋白分子相比在复合物的生产、纯化、和产率方面是更有利的。进一步，由于缺少Fab——其由于一种抗体与另一种在氨基酸序列中的差异而展现高的非同质性，预期显著地增强同质性和降低诱发血液抗原性的可能性。
同时，免疫球蛋白恒定区可以起源于人或动物，比如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等，并且可以优选地具有人起源。此外，免疫球蛋白恒定区可以选自这样的恒定区，其源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其组合或杂合，优选地源自IgG或IgM，其在人血液中是最丰富的，并且最优选地源自IgG，其已知改进配体结合蛋白的半衰期。在本发明中，免疫球蛋白Fc区可以是由相同起源的结构域的单链免疫球蛋白构成的二聚体或多聚体。
如本文使用的，术语“组合”意思是编码相同起源的单链免疫球蛋白恒定区(优选地Fc区)的多肽被连接至不同起源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、和IgE Fc的Fc片段的两种或更多种片段制备。
如本文使用的，术语“杂合”意思是编码不同起源的两种或更多种免疫球蛋白恒定区的序列存在于免疫球蛋白恒定区(优选地，Fc区)的单链中。在本发明中，多种杂合形式是可能的。例如，杂合结构域可以由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc、和IgD Fc的CH1、CH2、CH3、和CH4的一种至四种结构域组成，并且可以进一步包括铰链区。
IgG可以被划分为IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4亚类，并且本发明可以包括其组合或杂合。优选的是IgG2和IgG4亚类，并且最优选的是几乎不具有效应子功能比如补体依赖性细胞毒性(CDC)的IgG4的Fc区。
免疫球蛋白恒定区可以具有与天然形式相比相同程度或更大或更小程度的糖基化形式，或可以是脱糖基化形式。免疫球蛋白恒定区的增加的或降低的糖基化或脱糖基化可以通过典型方法实现，例如，通过使用化学方法、酶促方法或使用微生物的遗传工程方法。在此，当脱糖基化时，结合至免疫球蛋白恒定区的补体(C1q)变得显著减少，并且抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性被降低或去除，从而不在体内诱发不必要的免疫应答。在此背景下，脱糖基化或去糖基化免疫球蛋白恒定区与药物运载体的目的更一致。因此，免疫球蛋白Fc区可以更具体地是源自人IgG4的去糖基化Fc区，即，人IgG4源去糖基化Fc区。人源Fc区与非人源Fc区相比是更优选的，所述非人源Fc区可能在人体中充当抗原，并且引起非期望的免疫应答比如产生针对抗原的新抗体。
进一步，本发明的免疫球蛋白恒定区不仅包括天然氨基酸序列，而且包括其序列衍生物(突变体)。氨基酸序列衍生物意思是它由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、保守或非保守置换、或其组合具有不同于野生型氨基酸序列的氨基酸序列。例如，已知对连接重要的IgG Fc中214至238、297至299、318至322、或327至331位处的氨基酸残基可以被用作适合修饰的位点。可以使用多种衍生物，比如通过去除能够形成二硫键的位点、从天然Fc去除数个N-端氨基酸、或将甲硫氨酸添加至天然Fc的N-端制备的那些。此外，补体结合位点，例如，C1q结合位点或ADCC位点可以被消除以去除效应子功能。在国际专利公布号WO 97/34631和WO 96/32478中公开了制备免疫球蛋白恒定区的序列衍生物的技术。
不改变分子的活性的蛋白质或肽分子中的氨基酸置换是本领域熟知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的置换在氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly之间以两个方向发生。任选地，可以通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰氨基酸。
上面描述的免疫球蛋白恒定区衍生物可以是如下衍生物：其与本发明的免疫球蛋白恒定区具有等价的生物学活性，但是具有增加的免疫球蛋白恒定区针对热、pH等的结构稳定性。进一步，免疫球蛋白恒定区可以获得自从人或动物比如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等分离的天然型，或可以是获得自转化动物细胞或微生物的它们的重组体或衍生物。在此，它们可以通过如下获得自天然免疫球蛋白：从人或动物生物体分离完整免疫球蛋白和使用蛋白水解酶处理该完整免疫球蛋白。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化为Fab和Fc区，并且木瓜蛋白酶处理导致产生pF'c和F(ab)2片段。这些片段可以经受例如大小排阻层析以分离Fc或pF'c。
优选地，人源免疫球蛋白恒定区可以是获得自微生物的重组免疫球蛋白恒定区。
本发明的蛋白质复合物可以包括[生理学活性多肽/非肽基聚合物/免疫球蛋白Fc区]的单元结构的一种或多种，其中所有组分可以通过共价键以线性形式连接。非肽基聚合物在其两端处可以具有反应基团，并且经由共价键通过反应基团被分别连接至生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区。即，生理学活性多肽和非肽基聚合物的至少一种缀合物通过共价键被连接至一个免疫球蛋白Fc区，从而形成生理学活性多肽的单体、二聚体、或多聚体，其由免疫球蛋白Fc区介导。因此，可以更有效地实现体内活性和稳定性的增加。
非肽基聚合物的两端处的反应基团优选地选自反应性醛基团、丙醛基团、丁醛基团、马来酰亚胺基团、和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、或琥珀酰亚胺基碳酸酯。具体而言，当非肽基聚合物在两端处具有反应性醛基团时，其在以最小的非特异性反应将两端与生理学活性多肽和免疫球蛋白连接中是有效的。与当通过酰胺键连接时相比，经由醛键通过还原性烷基化生成的最终产物稳定得多。
本发明的非肽基聚合物的两端处的反应基团可以彼此相同或不同。非肽聚合物在两端处可以具备醛反应基团，或它可以在一端处具备醛基团和在另一端处具备马来酰亚胺反应基团，或在一端处具备醛基团和在另一端处具备琥珀酰亚胺反应基团，但是不限于此。
例如，非肽聚合物可以在一端处具备马来酰亚胺基团和在另一端处具备醛基团、丙醛基团、或丁醛基团。另外，非肽聚合物可以在一端处具备琥珀酰亚胺基和在一端处具备丙醛基团或丁醛基团。当在其两端处具有反应性羟基的聚乙二醇被用作非肽基聚合物时，可以通过已知的化学反应将羟基活化至多种反应基团，或可以使用具有修饰的反应基团的商购的聚乙二醇，以便制备本发明的蛋白质复合物。
当生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区经由非肽基聚合物被连接时，非肽基聚合物的两端中的每个可以结合至免疫球蛋白Fc区的N-端和生理学活性多肽的N-端(氨基端)，C-端(羧基端)，或赖氨酸残基、组氨酸残基、或半胱氨酸残基的游离反应基团。
如本文使用的，术语“N-端”指的是肽的N-端，出于本发明的目的，其是包括非肽基聚合物的连接体可以被缀合至其的位点。N-端的实例不仅可以包括N-端的远端处的氨基酸残基，而且可以包括N-端附近的氨基酸残基，但是不限于此。具体地，可以包括距远端的第1至第20个氨基酸残基。
本发明的非肽基聚合物可以选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物比如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、和其组合，并且具体地，聚乙二醇，但是不限于此。另外，本领域熟知和本领域技能内容易制备的其衍生物被包括在本发明的非肽基聚合物中。非肽基聚合物可以具有1kDa至100kDa和具体地1kDa至20kDa的范围中的分子量。
本发明的生理学活性多肽可以由多种生理学活性多肽示例，比如激素、细胞因子、白介素、白介素结合蛋白、酶、抗体、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂、和其衍生物或类似物。
具体地，生理学活性多肽包括人生长激素，生长激素释放激素，生长激素释放肽，干扰素和干扰素受体(例如，干扰素-α、-β、和-γ，可溶性I型干扰素受体)，集落刺激因子，白介素(例如，白介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30等)和白介素受体(例如，IL-1受体、IL-4受体等)，酶(例如，葡糖脑苷脂酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-半乳糖苷酶-A、半乳糖苷酶α,β、α-L-艾杜糖醛酸酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂肪酶、尿酸氧化酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶等)，白介素结合蛋白和细胞因子结合蛋白(例如，IL-18bp、TNF结合蛋白等)，巨噬细胞活化因子，巨噬细胞肽，B细胞因子，T细胞因子，蛋白A，过敏抑制剂，细胞坏死糖蛋白，免疫毒素，淋巴毒素，肿瘤坏死因子，肿瘤阻抑因子，转化生长因子，α-1抗胰蛋白酶，白蛋白，α-乳白蛋白，载脂蛋白-E，红细胞生成素，糖基化红细胞生成素，血管生成素，血红蛋白，凝血酶，凝血酶受体活化肽，凝血调节蛋白，血液因子VII、VIIa、VIII、IX、和XIII，纤溶酶原激活剂，纤维蛋白结合肽，尿激酶，链激酶，蛭素，蛋白C，C-反应蛋白，肾素抑制剂，胶原酶抑制剂，超氧化物歧化酶，瘦蛋白，血小板源生长因子，上皮生长因子，表皮生长因子，制管张素，血管紧张素，骨生长因子，骨刺激蛋白，降钙素，胰岛素，泌酸调节肽，胰高血糖素，胰高血糖素衍生物，胰高血糖素样肽，毒蜥外泌肽(毒蜥外泌肽4)，心钠素，软骨诱导因子，依降钙素，结缔组织活化因子，组织因子途径抑制剂，促卵泡激素，促黄体生成激素，促黄体生成激素释放激素，神经生长因子(例如，神经生长因子、纤毛神经营养因子、轴突发生(axogenesis)因子-1、脑-排钠利尿肽、神经胶质源神经营养因子、导蛋白、中性粒细胞抑制因子、神经营养因子、神经生长因子(neurturin)等)，甲状旁腺激素，松弛素，促胰液素，生长调节素，胰岛素样生长因子，肾上腺皮质激素，胰高血糖素，缩胆囊素，胰腺多肽，胃泌素释放肽，促肾上腺皮质激素释放因子，促甲状腺激素，自体毒素，乳铁蛋白，肌肉生长抑制素，受体(例如，TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体、B细胞活化因子受体等)，受体拮抗剂(例如，IL1-Ra等)，细胞表面抗原(例如，CD 2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69等)，单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段(例如，scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、和Fd)，和病毒源疫苗抗原。
具体地，本发明的生理学活性多肽可以是人生长激素、干扰素(干扰素-α、-β、-γ等)、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、胰岛素、泌酸调节肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、毒蜥外泌肽、抗体片段、其衍生物等，其出于治疗或预防疾病的目的被频繁地施用给人体。此外，某些突变体或衍生物被包括在本发明的生理学活性多肽的范围中，只要它们具有与生理学活性多肽的天然形式相比基本上相同或更高的功能、结构、活性、或稳定性。
在本发明中，抗体片段可以是具有结合至特异性抗原的能力的Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、或scFv，并且优选地，Fab'。Fab片段包括轻链的可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)以及重链的可变结构域(VH)和第一恒定结构域(CH1)。在添加数个氨基酸残基——包括来自CH1结构域的羧基端处的铰链区的一个或多个半胱氨酸残基——的方面，Fab'片段不同于Fab片段。Fd片段是由仅VH和CH1结构域构成的片段，并且通过经由二硫键合或化学反应结合Fab'片段的两个分子产生F(ab')2片段。scFv片段是单个多肽链，其中仅VL和VH结构域通过肽连接体彼此连接。
进一步，本发明的蛋白质复合物可以被用于研发动物生长激素比如牛科生长激素或猪科生长激素的长效蛋白制剂，和用于治疗或预防动物疾病的长效蛋白制剂，比如干扰素。
本发明的另一方面提供了制备本发明的蛋白质复合物的方法。具体而言，本发明提供了制备位置特异性蛋白质复合物的方法，方法包括：(a)通过如下制备蛋白质复合物：通过共价键连接至少一个在两端处具有反应基团的非肽基聚合物、至少一个生理学活性多肽、和至少一个免疫球蛋白Fc区，和(b)分离在步骤(a)中制备的蛋白质复合物，其基本上包括共价连接的生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区，其中非肽基聚合物被连接至免疫球蛋白Fc片段的N-端。
本发明的免疫球蛋白Fc区可以是二聚体的形式，或同源二聚体或异源二聚体的形式。因此，构成本发明的蛋白质复合物的免疫球蛋白Fc区可以包括一个或两个或更多个N-端。因而，免疫球蛋白Fc区可以经由N-端被连接至至少一个非肽基聚合物。具体而言，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是同源二聚体的形式，并且因此，经由在免疫球蛋白Fc区的同源二聚体中包括的两个N-端被连接至一个或两个非肽基聚合物。就这一点而言，非肽基聚合物可以分别结合至生理学活性多肽，从而形成蛋白质复合物。
因此，可以经由共价键通过连接一个或两个或更多个的非肽基聚合物、一个或两个或更多个的生理学活性多肽、和一个或两个或更多个的免疫球蛋白Fc区来制备本发明的蛋白质复合物。
在步骤(a)中，三种组分之间的共价键可以顺序地或同时出现。例如，当生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区被分别连接至非肽基聚合物的两端时，生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区中的任一个可以首先被连接至非肽基聚合物的一端，并且然后另一个可以被连接至非肽基聚合物的另一端。此方法是有利的，在于副产物而非期望的蛋白质复合物的产生被最小化并且以高纯度制备蛋白质复合物。
因此，步骤(a)可以包括：
(i)经由共价键将免疫球蛋白Fc区的特异性位点或生理学活性多肽连接至非肽基聚合物的一端；
(ii)从反映混合物同质地分离缀合物，其中通过将免疫球蛋白Fc区的特异性位点或生理学活性多肽连接至非肽基聚合物来制备缀合物；和
(iii)通过将生理学活性多肽或免疫球蛋白Fc区的特异性位点连接至分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端来产生蛋白质复合物。
同时，在本发明中，步骤(a)包括(a1)通过如下制备缀合物：通过共价键将非肽基聚合物的一端连接至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽中的任一个；和(a2)分离在步骤(a1)中制备的缀合物，并且通过共价键将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接至生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区中的另一个。
具体地，步骤(a)可以包括(a1')通过如下制备缀合物：通过共价键将非肽基聚合物的一端连接至免疫球蛋白Fc区；和(a2')分离在步骤(a1')中制备的缀合物，并且通过共价键将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接至生理学活性多肽。
可选地，步骤(a)可以包括(a1”)通过如下制备缀合物：通过共价键将非肽基聚合物的一端连接至生理学活性多肽；和(a2')分离在步骤(a1”)中制备的缀合物，并且通过共价键将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接至免疫球蛋白Fc区。
在本发明的步骤(a1)、(a1')、或(a1”)中，生理学活性多肽和非肽基聚合物之间的反应摩尔比可以在1:1至1:30的范围中，并且免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物之间的反应摩尔比可以在1:1至1:20的范围中。具体地，在步骤(a1')中，免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物之间的反应摩尔比可以在1:1至1:20的范围中，和具体而言，1:1至1:15、1:1至1:10、或1:1至1:4的范围中。在步骤(a1”)中，生理学活性多肽和非肽基聚合物之间的反应摩尔比可以在1:1至1:30的范围中，和具体而言，1:1至1:15或1:1至1:10的范围中。制备产率和成本可取决于反应摩尔比进行优化。
在本发明中，步骤(a1)、(a1')、或(a1”)可以以4.0至9.0的pH条件进行；步骤(a1)、(a1')、或(a1”)可以在4.0℃至25℃的温度下进行；在步骤(a1)、(a1')、或(a1”)中，免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的反应浓度可以在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中。
在本发明的步骤(a2)、(a2')、或(a2”)中，缀合物和免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽之间的反应摩尔比可以在1:1至1:20的范围中，和具体而言，1:0.2至1:10的范围中。具体地，在步骤(a2')中，缀合物和生理学活性多肽之间的反应摩尔比可以在1:0.1至1:20的范围中，并且在步骤(a2”)中，缀合物和免疫球蛋白Fc区之间的反应摩尔比可以在1:0.1至1:20的范围中。制备产率和成本可取决于反应摩尔比进行优化。
在本发明中，步骤(a2)、(a2')、或(a2”)可以以4.0至9.0的pH条件进行；步骤(a2)、(a2')、或(a2”)可以在4.0℃至25℃的温度下进行；在步骤(a2)、(a2')、或(a2”)中，免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的反应浓度可以在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中。
同时，本发明的制备方法可以是制备位置特异性蛋白质复合物的方法，其包括(a')通过如下制备缀合物：通过共价键将非肽基聚合物的一端连接至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽中的任一个，其中生理学活性多肽和非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:30的范围中，免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:20的范围中，以1mM至100mM的范围包含还原剂，反应以4.0至9.0的pH条件、在4.0℃至25℃的温度下进行，并且免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的反应浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中；
(b')分离在步骤(a')中制备的缀合物，并且通过共价键将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽中的另一个，其中缀合物和免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽之间的反应摩尔比在1:0.1至1:20的范围中，以1mM至100mM的范围包含还原剂，反应以4.0至9.0的pH条件、在0℃至25℃的温度下进行，并且免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中；和
(c')分离在步骤(b')中制备的蛋白质复合物，其基本上包括共价连接的生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区，其中非肽基聚合物被连接至免疫球蛋白Fc片段的N-端，但是不限于此。
本发明的步骤(a1)、步骤(a1')、步骤(a1”)、步骤(a2)、步骤(a2')、和步骤(a2”)中的反应可以在存在还原剂的情况下进行，如果必要的话，考虑参与反应的非肽基聚合物的两端处的反应基团的类型。本发明的还原剂可以是氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、硼氢化钠、硼酸二甲胺、或硼酸吡啶。就这一点而言，还原剂(例如，氰基硼氢化钠)的浓度、反应溶液的温度和pH、以及参与反应的生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区的总浓度在生产率和纯度方面是重要的。为了最大化高纯度同质性复合物的产生，需要条件的多种组合。根据待制备的生理学活性多肽的特征，多种条件是可能的，但是不限于如下：可以以1mM至100mM的范围包含还原剂(例如，氰基硼氢化钠)，反应溶液可以在0℃至25℃的温度下和以4.0至9.0的pH条件，和反应蛋白的浓度(在反应时包括的免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的浓度)可以在5mg/mL至100mg/mL的范围中。
同时，如果必要的话，考虑分离的缀合物需要的性质比如纯度、疏水性、分子量、和电荷，可以通过选自用于蛋白质分离的一般方法的方法进行步骤(a2)、步骤(a2')、和步骤(a2”)中缀合物的分离。例如，分离可以通过应用多种已知的方法进行，包括大小排阻层析、亲和层析、疏水层析、或离子交换层析，并且如果必要的话，多种不同的方法被组合用于以较高的纯度纯化缀合物。
根据待制备的生理学活性多肽的特征，多种条件是可能的。然而，为了分离连接至非肽基聚合物的免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽缀合物，一般进行大小排阻层析。对于进一步扩大和分离通过在除期望位置以外的位置处结合非肽基聚合物生成的异构体或在制备期间生成的少量的变性形式，也可以使用亲和层析、疏水层析、或离子交换层析。
在本发明中，如果必要的话，考虑性质比如疏水性、分子量、和电荷，可以通过选自用于蛋白质分离的一般方法的方法进行步骤(b)，以便最终纯化高纯度复合物。例如，分离可以通过应用多种已知的方法进行，包括大小排阻层析、亲和层析、疏水层析、或离子交换层析，并且如果必要的话，多种不同的方法被组合用于以较高的纯度纯化缀合物。根据由生理学活性多肽、非肽基聚合物、和Fc恒定区构成的期望的复合物的特征，多种分离条件是可能的。然而，为了分离生理学活性多肽和免疫球蛋白Fc区分别被连接至非肽基聚合物的两端的复合物，一般进行大小排阻层析。为了进一步扩大和有效地分离通过在除期望位置以外的位置处结合生理学活性多肽或免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物生成的异构体或副反应产物，或在制备期间生成的少量的变性形式、未反应的生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区，也可以组合使用疏水层析、离子交换层析、或亲和层析。具体而言，疏水层析和离子交换层析可以被组合使用，并且多个疏水层析或多个离子交换层析也是可能的。根据待制备的复合物，离子交换层析或疏水层析可以被单独使用。
在本发明中，离子交换层析通过如下分离蛋白质：使带电蛋白质在特定的pH下穿过带电离子树脂固定化的层析柱和通过蛋白质的迁移速率差异分离蛋白质，并且其可以是阴离子交换层析或阳离子交换层析。
阴离子交换层析使用阳离子树脂，并且构成对应的阴离子交换层析的树脂的官能团可以是选自季铵(Q)、季氨基乙基(QAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、聚乙烯胺(PEI)、二甲基氨基甲基(DMAE)、和三甲基氨基乙基(TMAE)的任一种，但是不限于此。
进一步，阳离子交换层析使用阴离子树脂，并且构成对应的阳离子交换层析的树脂的官能团可以是选自甲基磺酸盐(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、和聚天冬氨酸的任一种，但是不限于此。
在本发明中，构成疏水层析的树脂的官能团可以是选自苯基、辛基、(异)丙基、丁基、和乙基的任一种，但是不限于此。
在本发明中，构成大小排阻层析的树脂的官能团可以是选自superdex、sephacryl、superpose、和sephadex的任一种，但是不限于此。
另外，本发明中的亲和层析通过蛋白质的迁移速率差异分离蛋白质，所述差异由蛋白质和配体——其能够与配体被固定化在其上的树脂中的蛋白质相互作用——之间的相互作用引起。构成亲和层析的树脂的官能团可以是选自蛋白A、肝素、蓝色剂、苄脒、金属离子(钴、镍、和铜)、和针对蛋白质复合物——其中非肽基聚合物的两端被分别缀合至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽——的部分或全部构成组分的抗体的任一种，但是不限于此。
在本发明中，步骤(b)分离蛋白质复合物，其中非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区经由免疫球蛋白Fc区的N-端彼此连接。
本发明的还另一方面提供了用于制备具有90％或更高的N-端选择性的蛋白质复合物的方法。具体地，通过本发明的方法制备的蛋白质复合物可以是如下一种：其中非肽基聚合物的一端可以以90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地98％或更高，和又更具体地99％或更高的N-端选择性被连接至免疫球蛋白Fc区的N-端，但是不限于此。
如本文使用的，术语“以90％或更高的N-端选择性连接”意思是在通过纯化由根据本发明的一系列反应获得的蛋白质复合物级分制备的90％或更多的蛋白质复合物中，非肽基聚合物以位置特异性方式被连接至Fc区的N-端。如本文使用的，术语“90％或更高”可以指的是v/v、w/w、和峰/峰，但是不限于特定的单位。包括以位置特异性方式连接至Fc区的N-端的非肽基聚合物的蛋白质复合物的产率可以通过反应条件、非肽基聚合物的反应器等变化。
在本发明的实施例中，确认可以通过根据本发明的方法，经由制备多种生理学活性多肽、非肽基聚合物、和Fc复合物来制备具有90％或更高的N-端选择性的蛋白质复合物。
本发明的还另一方面提供了用于改进生理学活性多肽的体内持续性和稳定性的药物组合物，组合物包括蛋白质复合物或作为活性成分通过制备方法制备的蛋白质复合物。
具体地，药物组合物可以以90％或更高、更具体地95％或更高、甚至更具体地98％或更高、和又甚至更具体地99％或更高的量包括蛋白质复合物，但是不限于此，所述蛋白质复合物包括生理学活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白Fc区的N-端。如本文使用的，术语“90％或更高”可以指的是v/v、w/w、和峰/峰，但是不限于特定的单位。
药物组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。
可以经由多种途径施用本发明的药物组合物，包括口服、经皮、皮下、静脉内、和肌肉内途径，优选地，以可注射制剂的形式。进一步，可以通过本领域已知的方法配制本发明的药物组合物，以便在其施用给哺乳动物后提供活性成分的快速、长效、或延迟释放。制剂可以是片剂、丸剂、粉末、囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气溶胶、软或硬明胶胶囊、无菌可注射溶液、或无菌粉末。合适的运载体、赋形剂、和稀释剂的实例可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢橡胶(acaciarubber)、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、和矿物油。药物组合物可以进一步包括填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
可以通过多种相关因素——包括待治疗的疾病类型，施用途径，患者的年龄、性别、重量和病患的严重度——以及通过作为活性组分的生理学活性多肽的类型确定本发明的蛋白质复合物的实际施用剂量。由于本发明的蛋白质复合物具有优越的血液持续时间和体内效力，它可以显著地减小包括本发明的蛋白质复合物的肽药物的施用剂量和频率。
本发明的还另一方面提供了蛋白质复合物的群体，其以90％或更高的量包括根据上面的方法制备的蛋白质复合物。
如本文使用的，术语“复合物的群体”和“群体”可以可交换地使用，并且它们指的是一组蛋白质复合物，其包括非肽基聚合物被连接至Fc区的N-端的蛋白质复合物和/或非肽基聚合物被连接至除Fc区的N-端以外的分区的蛋白质复合物。
群体可以仅包括非肽基聚合物被连接至Fc区的N-端的蛋白质复合物，或非肽基聚合物被连接至除Fc区的N-端以外的分区的蛋白质复合物。具体地，群体中包括的非肽基聚合物被连接至除Fc区的N-端以外的分区的蛋白质复合物的百分数可以是90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地98％或更高，和还甚至更具体地99％或更高，但是不限于此。如本文使用的，术语“90％或更高”可以指的是v/v、w/w、和峰/峰，但是不限于特定的单位。
出于本发明的目的，群体可以指的是通过从其制备的蛋白质复合物去除杂质、未反应的材料等具有增加百分数的如下蛋白质复合物的群体：其中非肽基聚合物被连接至被连接至除Fc区的N-端以外的分区。此外，群体可以指的是如下一种：其通过用于制备具有90％或更高的N-端选择性的蛋白质复合物的方法制备，但是不限于此。群体可以通过本发明的方法被高效地纯化。
实施例
在下文，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅出于说明目的，并且本发明不意欲由这些实施例限制。
实施例1：免疫球蛋白Fc的干扰素α(IFNα)-PEG-N-端区的复合物的制备
1-1.IFNα-PEG缀合物的制备
ALD-PEG-ALD(IDB，韩国)，其是具有3.4kDa的分子量和其两端处具有醛反应基团的聚乙二醇(PEG)，以1:5至1:10的hIFNα:PEG的摩尔比被添加至5mg/mL的溶解于100mM磷酸盐缓冲液的人干扰素α-2b(hIFNα-2b，分子量：19kDa)。还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)以20mM的最终浓度被添加至其中，并且使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约1小时。为了获得其中PEG被选择性地连接至干扰素α的氨基端并且PEG和干扰素α以1:1的比率彼此连接的缀合物，反应混合物经受SP HP(GE healthcare，USA)阴离子交换层析而以高纯度纯化IFNα-PEG缀合物。
1-2.IFNα-PEG-Fc复合物的制备
为了将在实施例1-1中纯化的IFNα-PEG缀合物连接至免疫球蛋白Fc的N-端脯氨酸残基，以1:1至1:4的IFNα-PEG缀合物：免疫球蛋白Fc的摩尔比添加和反应免疫球蛋白Fc片段。反应溶液被制备为100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.5至6.5)，并且以20mM至50mM的最终浓度添加作为还原剂的氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)。使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约12小时至16小时。
1-3.IFNα-PEG-Fc复合物的分离和纯化
为了在实施例1-2的结合反应后去除未反应的材料和副产物并且纯化因而产生的IFNα-PEG-Fc蛋白质复合物，反应混合物针对10mM Tris(pH 7.5)进行缓冲液更换，并且然后穿过Source Q(GE healthcare，USA)阴离子交换层析柱以去除未反应的Fc和获得IFNα-PEG-Fc蛋白质复合物级分。详细地，反应溶液被施加至以10mM Tris(pH 7.5)平衡的SourceQ柱，并且柱使用包含50mM氯化钠(NaCl)的20mM Tris(pH 7.5)缓冲溶液经受无梯度溶剂洗涤以去除杂质。然后，使用浓度梯度的包含150mM氯化钠(NaCl)的缓冲溶液洗脱IFNα-PEG-Fc蛋白质复合物。少量的未反应的Fc和干扰素α二聚体作为杂质存在于获得的IFNα-PEG-Fc蛋白质复合物级分中。为了去除杂质，进一步进行Source iso(GE healthcare，USA)疏水层析。详细地，Source iso(GE healthcare，USA)以包含大约1.3M硫酸铵的20mM磷酸钾(pH6.0)缓冲溶液进行平衡，并且然后纯化的IFNα-PEG-Fc蛋白质复合物级分被施加至其中。最后，使用线性浓度梯度的20mM磷酸钾(pH 6.0)缓冲溶液纯化高纯度IFNα-PEG-Fc蛋白质复合物。通过肽作图检查制备的IFNα-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N-端选择性，并且发现选择性是90％或更高。
实施例2：人生长激素(hGH)-PEG-Fc复合物的制备
2-1.hGH-PEG缀合物的制备
ALD-PEG-ALD(IDB，韩国)，其是具有3.4kDa的分子量和其两端处具有醛反应基团的聚乙二醇(PEG)，以1:5至1:10的hGH:PEG的摩尔比被添加至5mg/mL的溶解于100mM磷酸盐缓冲液的人生长激素(hGH，分子量：22kDa)。还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)以20mM的最终浓度被添加至其中，并且使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约1小时。为了获得其中PEG被选择性地连接至人生长激素的氨基端并且PEG和hGH以1:1的比率彼此连接的缀合物，反应混合物经受Source Q(GE healthcare，USA)阴离子交换层析而以高纯度纯化hGH-PEG。
2-2.hGH-PEG-Fc复合物的制备
为了将在实施例2-1中纯化的hGH-PEG缀合物连接至免疫球蛋白Fc的N-端，以1:1至1:4的hGH-PEG缀合物：免疫球蛋白Fc的摩尔比添加免疫球蛋白Fc片段并且进行反应。反应溶液被制备为100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.5至6.5)，并且以20mM的最终浓度添加作为还原剂的氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)。使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应。
2-3.hGH-PEG-Fc复合物的分离和纯化
为了在实施例2-2的结合反应后去除未反应的材料和副产物并且纯化因而产生的hGH-PEG-Fc蛋白，反应混合物针对10mM Tris(pH 7.5)进行缓冲液更换，并且然后穿过Source Q(GE healthcare，USA)阴离子交换层析柱以去除未反应的Fc和获得hGH-PEG-Fc蛋白质复合物级分。详细地，反应溶液被施加至以10mM Tris(pH 7.5)平衡的Source Q柱，并且柱使用包含70mM氯化钠(NaCl)的20mM Tris(pH 7.5)缓冲溶液经受无梯度溶剂洗涤以去除杂质。然后，使用浓度梯度的包含150mM氯化钠的20mM Tris(pH 7.5)缓冲溶液洗脱高纯度hGH-PEG-Fc蛋白质复合物。通过肽作图检查制备的hGH-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N-端选择性，并且发现选择性是90％或更高。
实施例3：人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)-PEG-Fc复合物的制备
使用通过将天然G-CSF的第17和65位处的氨基酸置换为丝氨酸制备的衍生物(17, 65S-G-CSF)来制备17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物，并且然后进行纯化。
3-1.17,65S-G-CSF-PEG缀合物的制备
ALD-PEG-ALD(IDB，韩国)，其是具有3.4kDa的分子量和其两端处具有醛反应基团的聚乙二醇(PEG)，以1:5至1:10的G-CSF:PEG的摩尔比被添加至5mg/mL的溶解于100mM磷酸盐缓冲液的17,65S-G-CSF(分子量：18kDa)。还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)以20mM的最终浓度被添加至其中，并且使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约1小时。为了获得其中PEG被选择性地连接至人粒细胞集落刺激因子的氨基端并且PEG和G-CSF以1:1的比率彼此连接的缀合物，反应混合物经受SP HP(GE healthcare，USA)阳离子交换层析而以高纯度纯化17,65S-G-CSF-PEG缀合物。
3-2.17,65S-G-CSF-PEG-Fc复合物的制备
为了将在实施例3-1中纯化的17,65S-G-CSF-PEG缀合物连接至免疫球蛋白Fc的N-端，以1:1至1:4的17,65S-G-CSF-PEG缀合物：免疫球蛋白Fc的摩尔比添加和反应免疫球蛋白Fc片段。反应溶液被制备为100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.5至6.5)，并且以20mM的最终浓度添加作为还原剂的氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)。使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应。
3-3.17,65S-G-CSF-PEG-Fc复合物的分离和纯化
为了在实施例3-2的结合反应后去除未反应的材料和副产物并且纯化因而产生的17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物，反应混合物针对包含2M NaCl的10mM Tris(pH 8.0)进行缓冲液更换，并且然后穿过Source苯基柱。为了去除杂质，使用浓度梯度的20mM Tris(pH 8.0)缓冲溶液纯化17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物。少量的未反应的免疫球蛋白Fc和17,65S-G-CSF二聚体作为杂质存在于获得的17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物级分中。为了去除杂质，进一步进行Q HP(GE healthcare，USA)阴离子层析。Q HP(GE healthcare，USA)以20mM Tris(pH 8.0)缓冲溶液进行平衡，并且然后纯化的17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物级分被施加至其中。最后，使用线性浓度梯度的包含1M氯化钠的20mM Tris(pH 8.0)缓冲溶液纯化高纯度17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物。通过肽作图检查制备的17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N-端选择性，并且发现选择性是90％或更高。
实施例4：人红细胞生成素(EPO)-PEG-Fc复合物的制备
4-1.人红细胞生成素(EPO)-PEG缀合物的制备
ALD-PEG-ALD(IDB，韩国)，其是具有3.4kDa的分子量和其两端处具有醛反应基团的聚乙二醇(PEG)，以1:15的EPO:PEG的摩尔比被添加至5mg/mL的溶解于100mM磷酸盐缓冲液的人红细胞生成素(EPO，分子量：30.6kDa)。还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)以20mM的最终浓度被添加至其，并且使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约2小时。为了获得缀合物，其中PEG被选择性地连接至人红细胞生成素的氨基端并且PEG和人红细胞生成素以1:1的比率彼此连接，反应混合物经受SP HP(GE healthcare，USA)阳离子交换层析而洗脱包含EPO-PEG的主要级分。
4-2.EPO-PEG-Fc复合物的制备
为了将在实施例4-1中纯化的EPO-PEG缀合物连接至免疫球蛋白Fc的N-端，以1:4的EPO-PEG缀合物：Fc的摩尔比添加和反应免疫球蛋白Fc片段。反应溶液被制备为100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.5至6.5)，并且以20mM的最终浓度添加作为还原剂的氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)。使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约12小时至16小时。
4-3.EPO-PEG Fc复合物的分离和纯化
为了在实施例4-2的结合反应后去除未反应的材料和副产物并且纯化因而产生的EPO-PEG-Fc蛋白质复合物，使反应混合物穿过Source Q(GE healthcare，USA)阴离子交换层析柱以去除未反应的Fc和获得EPO-PEG-Fc蛋白质复合物级分。反应混合物被施加至以20mM Tris(pH 7.5)缓冲液平衡的Source Q柱。使用浓度梯度的包含1M氯化钠(NaCl)的缓冲溶液纯化EPO-PEG-Fc蛋白质复合物。少量的未反应的免疫球蛋白Fc和EPO二聚体作为杂质存在于获得的EPO-PEG-Fc蛋白质复合物级分中。为了去除杂质，进一步进行Source iso(GE healthcare，USA)疏水层析。详细地，Source iso(GE healthcare，USA)以包含1.6M硫酸铵的50mM Tris(pH 7.5)缓冲溶液进行平衡，并且然后纯化的EPO-PEG-Fc蛋白质复合物级分被施加至其中。最后，使用线性浓度梯度的50mM Tris(pH 7.5)缓冲溶液纯化高纯度EPO-PEG-Fc蛋白质复合物。通过肽作图检查制备的EPO-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N-端选择性，并且发现选择性是90％或更高。
实施例5：人胰岛素-PEG-Fc复合物的制备
5-1.胰岛素-PEG缀合物的制备
胰岛素粉末被溶解于10mM HCl，并且然后以1:2的胰岛素：PEG的摩尔比和5mg/mL的胰岛素浓度与3.4K 3-戊酮-ALD2PEG(具有两个丙醛基团的PEG，IDB，韩国)在室温下反应大约2小时以聚乙二醇化胰岛素β链的N-端。此反应在50mM柠檬酸钠pH 6.0和45％异丙醇中实施，并且2mM至20mM的氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)被添加至其中。使用包含柠檬酸钠(pH 3.0)和45％EtOH的缓冲液，以及KCl浓度梯度，以SP HP(GE Healthcare)柱纯化反应溶液。
5-2.胰岛素-PEG-Fc复合物的制备
为了制备胰岛素-PEG-Fc复合物，在实施例5-1中制备的单-聚乙二醇化的胰岛素和Fc以大于1:1的摩尔比以及20mg/mL至50mg/mL的总蛋白质水平在20℃至25℃下反应大约15小时至17小时。就这一点而言，反应溶液是pH 7.5至8.5的100mM HEPES、22mM磷酸钾、和10％乙醇，并且还原剂20mM氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)被添加至其中。
5-3.胰岛素-PEG-Fc复合物的分离和纯化
在完成反应后，使用Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度，使反应溶液穿过Source Q(GE Healthcare)柱以分离和纯化未反应的胰岛素、未反应的免疫球蛋白Fc片段、胰岛素-PEG-Fc复合物、和两个或更多个单-聚乙二醇化的胰岛素(胰岛素-PEG)被偶联的复合物。就这一点而言，通过检查纯化层析在280nm下的UV吸光度来测定胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc片段复合物的制备比(preparation ratio)。
然后，Source iso(GE Healthcare)被用作次级柱以去除任何残余的免疫球蛋白Fc和多-聚乙二醇化的胰岛素复合物。在此情况下，使用浓度梯度的包含硫酸铵的Tris-HCl(pH 7.5)实施洗脱以纯化高纯度胰岛素-PEG-Fc复合物。通过肽作图检查因而制备的胰岛素-PEG-Fc复合物的Fc区的N-端选择性，并且发现选择性是90％或更高。
实施例6：毒蜥外泌肽4衍生物(CA-毒蜥外泌肽4)-PEG-Fc复合物的制备
6-1.CA-毒蜥外泌肽4缀合物的制备
胰岛素粉末被溶解于10mM HCl，并且然后以1:5至1:15的CA-毒蜥外泌肽4：PEG的摩尔比和6mg/mL至12mg/mL的CA-毒蜥外泌肽4浓度与3.4K 3-戊酮-ALD2PEG(具有两个丙醛基团的PEG，IDB，韩国)在4℃到8℃至室温下反应大约4小时至12小时以聚乙二醇化CA-毒蜥外泌肽4的赖氨酸残基。此反应在0.1M HEPES pH 7.5至8.5和45％异丙醇中实施，并且2mM至20mM的氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)被添加至其中。使用包含柠檬酸钠(pH 2.0)和45％EtOH的缓冲液，以及KCl浓度梯度，以Source S(GE Healthcare)柱纯化反应溶液。
6-2.CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc复合物的制备
为了制备CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc复合物，在实施例6-1中制备的单-聚乙二醇化的CA-毒蜥外泌肽4和Fc以10mg/mL至50mg/mL的总蛋白质水平在4℃至8℃下反应大约12小时至17小时。就这一点而言，反应溶液是pH 5.5至8.5的0.1M磷酸钾，并且还原剂20mM氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)被添加至其中。
6-3.CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc复合物的分离和纯化
在完成反应后，使用Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度，使反应溶液穿过Source Phenyl(GE Healthcare)柱以分离和纯化未反应的免疫球蛋白Fc片段。就这一点而言，通过检查纯化层析在280nm下的UV吸光度来测定CA-毒蜥外泌肽4-PEG-免疫球蛋白Fc片段复合物的制备比。
然后，Source Q(GE Healthcare)被用作次级柱以去除任何残余的免疫球蛋白Fc和多-聚乙二醇化的CA-毒蜥外泌肽4复合物。在此情况下，使用浓度梯度的包含NaCl的Tris-HCl(pH 7.5)实施洗脱以纯化高纯度CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc复合物。通过肽作图检查因而制备的CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc复合物的Fc区的N-端选择性，并且发现选择性是90％或更高。
实施例7：使用具有不同反应基团的PEG制备蛋白质复合物
7-1.17,65S-G-CSF-PEG缀合物的制备
SMB-PEG-SMB(Nektar，USA)，其是具有3.4kDa的分子量和在其两端处具有琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯(SMB)反应基团的聚乙二醇(PEG)，以1:3的G-CSF:PEG的摩尔比被添加至溶解于20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)的10mg/mL的17,65S-G-CSF(分子量18kDa)，并且使得在缓慢搅拌下在室温下反应大约30分钟。为了获得其中PEG被选择性地连接至17,65S-G-CSF的氨基端并且PEG和17,65S-G-CSF以1:1的比率彼此连接的缀合物，反应混合物经受SP HP(GEhealthcare，USA)阳离子交换层析。
7-2.17,65S-G-CSF-PEG-Fc复合物的制备
为了将在实施例7-1中纯化的17,65S-G-CSF-PEG缀合物连接至除免疫球蛋白Fc的N-端以外的分区，以1:4至1:8的17,65S-G-CSF-PEG缀合物：免疫球蛋白Fc的摩尔比添加和反应免疫球蛋白Fc片段。使得在缓慢搅拌下在20mM磷酸盐缓冲液(pH 5.5至6.5)中在室温下反应大约2小时。
7-3.17,65S-G-CSF-PEG-Fc复合物的分离和纯化
为了在实施例7-2的结合反应后去除未反应的材料和副产物并且纯化因而产生的17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物，使反应混合物穿过Q HP(GE Healthcare，USA)阴离子交换层析柱，并且因而去除未结合的Fc和获得17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物级分。反应溶液被施加至以20mM Tris(pH 8.0)缓冲液平衡的Q HP柱，并且使用浓度梯度的包含1M氯化钠(NaCl)的缓冲溶液纯化17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物。少量的未反应的免疫球蛋白Fc和17,65S-G-CSF二聚体作为杂质存在于获得的17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物级分中。为了去除杂质，进一步进行Source iso(GE healthcare，USA)疏水层析。
最后，使用Source iso(GE Healthcare，USA)，以线性浓度梯度的包含1.2M硫酸铵的50mM Tris(pH 7.5)缓冲溶液纯化高纯度17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物。通过肽作图检查制备的17,65S-G-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N-端选择性，并且发现选择性是90％或更高。
实施例8：使用具有不同反应基团的PEG制备蛋白质复合物
使用FacVII-ATKAVC——其是先前由本发明人提交的韩国专利申请号10-2012-0111537的FacVII衍生物——制备FacVII-ATKAVC-PEG-Fc复合物。
8-1.PEG-Fc复合物的分离和纯化
首先，将马来酰亚胺-10kDa-PEG-醛(NOF，日本)的醛反应基团连接至免疫球蛋白Fc片段的N-端，免疫球蛋白Fc区和马来酰亚胺-10kDa PEG-醛以1:1的摩尔比在100mM磷酸盐缓冲溶液(pH 5.5至6.5)中混合，并且还原剂20mM氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)在10mg/mL的蛋白质浓度下被添加至其中。使得在低温(4℃至8℃)下反应大约2小时。为了获得单聚乙二醇化的免疫球蛋白Fc片段(马来酰亚胺-10kDa PEG-Fc)，进行Source Q(GEHealthcare，USA)阴离子层析，并且在20mM Tris缓冲液pH 7.5中以浓度梯度的氯化钠进行洗脱。
8-2.FacVII-ATKAVC-PEG-Fc复合物的制备
通过添加0.5mM至2mM三苯基膦-3,3',3”-三磺酸三钠盐水合物作为还原剂，FacVII-ATKAVC在室温下在10mM双甘氨肽缓冲液pH 5.5中反应大约2小时，以便于还原C-端。C-端还原的FacVII-ATKAVC和单聚乙二醇化的免疫球蛋白Fc片段(马来酰亚胺-10kDaPEG-Fc)以1:4至1:20的摩尔比混合，并且使得在室温下在50mM Tris缓冲液pH 7.5中以1mg/mL至2mg/mL的总蛋白质浓度反应大约2小时。
8-3.FacVII-ATKAVC-PEG-Fc复合物的分离和纯化
实施例8-2的反应溶液经受Source Q阴离子层析，并且以20mM Tris缓冲溶液pH7.5中浓度梯度的氯化钠洗脱FacVII-ATKAVC-10kDa PEG-Fc复合物。为了活化FacVII-ATKAVC-PEG-Fc复合物的FacVII，使得在低温(4℃至8℃)下在大约4mg/mL的FacVII的条件下在0.1M Tris-HCl缓冲溶液pH 8.0中反应大约18小时。最后，使用Superdex 200在10mM双甘氨肽缓冲溶液pH 5.5中，通过大小排阻层析(GE Healthcare，USA)纯化高纯度FacVIIa-ATKAVC-PEG-Fc。通过肽作图检查制备的FacVIIa-ATKAVC-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N-端选择性，并且发现选择性是90％或更高。
实施例9：使用具有不同分子量的PEG制备蛋白质复合物
ALD-PEG-ALD(Nektar，USA)，其是具有10kDa的分子量和在其两端处具有醛反应基团的聚乙二醇，被用于以与实施例5-2中相同的方式制备和纯化胰岛素-10kDa PEG缀合物。纯化的胰岛素-10kDa PEG缀合物被浓缩为大约5mg/mL的浓度，并且然后用于以与实施例5-3中相同的方式制备和纯化胰岛素-10kDa PEG-Fc蛋白质复合物。
实施例10：Fab'-S-PEG-N-Fc复合物(-SH基团)的制备
10-1.Fab'的表达和纯化
表达抗肿瘤坏死因子-αFab'的大肠杆菌转化体BL21/poDLHF(登录号：KCCM10511)被接种在100mL的LB培养基中并且振荡过夜培育，并且培养肉汤被接种至5L发酵罐(Marubishi)，接着在30℃的温度和20vvm的通风下以500rpm的搅拌速度进行培育。随着发酵进行，根据微生物的发酵状态供给作为细胞生长必需的能量源的葡萄糖和酵母提取物。当600nm下的吸光度OD值达到80时，添加IPTG以诱导蛋白质表达。培育进行大约40小时至45小时至高浓度，直到600nm下的吸光度OD值达到120至140。发酵液被离心(20,000g，30分钟)以丢弃沉淀物并且仅收集上清液。
获得的上清液经受下列柱层析以纯化纯的抗肿瘤坏死因子-αFab'。上清液被逐滴添加至以20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)平衡的HiTrap蛋白G(Ge Healthcare，USA)柱，并且使用100mM甘氨酸(pH 3.0)进行洗脱。洗脱的Fab'级分被逐滴添加至以10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)平衡的Superdex 200(GE Healthcare，USA)柱，并且使用相同的缓冲液进行洗脱。使用polyCAT 21×250(PolyLC Inc.USA)柱最后纯化洗脱的Fab'级分，并且以线性浓度梯度(氯化钠浓度：0.15M->0.4M)的10mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)洗脱纯的抗肿瘤坏死因子-αFab'级分。
10-2.Fc-PEG缀合物的制备和纯化
免疫球蛋白Fc以5mg/mL的浓度溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 5.5至6.5)，并且由其去除NHS-PEG-MAL。更换缓冲液，并且然后反应物被施加至polyCAT(PolyLC Inc.USA)柱，并且以线性浓度梯度(氯化钠浓度：0.15M->0.5M)的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)首先洗脱免疫球蛋白Fc-PEG缀合物，并且然后洗脱和去除未反应的免疫球蛋白Fc。
10-3.Fab'-S-PEG-N-Fc复合物(-SH基团)的制备和纯化
在实施例10-1中纯化的Fab'以2mg/mL的浓度溶解于100mM磷酸钠缓冲液，并且然后在实施例10-2中制备的免疫球蛋白Fc-PEG缀合物以1:5的Fab'：缀合物的摩尔比被添加至相同的缓冲液。溶液被浓缩为50mg/mL的最终蛋白质浓度，并且使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约24小时。
在完成偶联反应后，反应溶液被逐滴添加至以10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.3)平衡的Superdex 200(GE Healthcare，USA)柱，并且通过以1mL/min的流率施加相同的缓冲液进行洗脱。Fab'-S-PEG-N-Fc复合物由于其高分子量被首先洗脱，并且然后洗脱和去除未反应的免疫球蛋白Fc-PEG缀合物和Fab'。
为了完全地去除未反应的免疫球蛋白Fc，洗脱的Fab'-S-PEG-N-Fc复合物级分被逐滴添加至polyCAT 21×250(PolyLC Inc.USA)柱，并且以线性浓度梯度(氯化钠浓度：0.15M->0.5M)的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)洗脱纯的Fab'-S-PEG-N-Fc复合物(连接至Fab'的C-端处的-SH基团的Fc-PEG缀合物)。
实施例11：Fab'-N-PEG-N-Fc复合物(N-端)的制备
11-1.Fab'-PEG缀合物(N-端)的制备和纯化
40mg的在实施例10-1中获得的纯化的Fab'以5mg/mL的浓度溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 5.5至6.5)，并且然后以1:5的Fab':PEG的摩尔比添加ButylALD-PEG-ButylALD(分子量3.4kDa，Nektar Inc.，USA)。以20mM的最终浓度添加还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)，并且使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约2小时。
在完成反应后，反应缓冲液被更换为20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)。在更换缓冲液后，反应物被施加至polyCAT(PolyLC Inc.USA)柱，并且以线性浓度梯度(氯化钠浓度：0.15M->0.4M)的20mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)首先洗脱Fab'-PEG缀合物级分，并且然后洗脱和去除未反应的Fab'。
11-2.Fab'-N-PEG-N-Fc复合物的制备和纯化
在实施例11-1中纯化的Fab'-PEG缀合物以10mg/mL的浓度溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)，并且然后以1:5的Fab'-PEG缀合物：Fc的摩尔比添加溶解于相同缓冲液的免疫球蛋白Fc。溶液被浓缩为50mg/mL的最终蛋白质浓度。以20mM的最终浓度添加还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)，并且使得在缓慢搅拌下在4℃至8℃下反应大约24小时。
在完成偶联反应后，反应溶液被逐滴添加至以10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)平衡的Superdex 200(GE Healthcare，USA)柱，并且通过以1mL/min的流率施加相同的缓冲液进行洗脱。偶联的Fab'-N-PEG-N-Fc复合物由于其高分子量被首先洗脱，并且然后洗脱和去除未反应的免疫球蛋白Fc和Fab'-PEG缀合物。为了完全地去除未反应的免疫球蛋白Fc，洗脱的Fab'-N-PEG-N-Fc复合物级分被进一步施加至polyCAT 21×250(PolyLC Inc.USA)柱，并且以线性浓度梯度(氯化钠浓度：0.15M->0.5M)的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)洗脱纯的Fab'-N-PEG-N-Fc复合物(连接至Fab'的N-端的免疫球蛋白Fc-PEG缀合物)。
通过下列实验实施例分析在实施例中制备的蛋白质复合物。
实验实施例1：蛋白质复合物的纯度评价
1-1.蛋白质复合物的鉴定
使用4％至20％梯度凝胶和12％凝胶通过非还原性SDS-PAGE分析在上面的实施例中制备的蛋白质复合物。进行使用针对免疫球蛋白Fc和生理学活性多肽的抗体的各个蛋白质复合物的SDS-PAGE分析和蛋白质印迹分析。如图1中显示的，偶联反应导致成功地产生IFNα-PEG-Fc(A)、hGH-PEG-Fc(B)、17,65S-G-CSF-PEG-Fc(C)、胰岛素-PEG-Fc(D)、EPO-PEG-Fc(E)、CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc(F)、和FacVII-PEG-Fc(G)。
1-2.蛋白质复合物的纯度评价
在上面的实施例中制备的蛋白质复合物IFNα-PEG-Fc(A)、hGH-PEG-Fc(B)、17,65S-G-CSF-PEG-Fc(C)、胰岛素-PEG-Fc(D)、EPO-PEG-Fc(E)、和CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc(F)使用HPLC分别经受大小排阻层析、反相层析、或离子交换层析。如图2中显示的，它们在每个分析中展示出对应于95％或更高的高纯度的单峰。
1-3.蛋白质复合物的位点选择性检查
在上面的实施例中制备的蛋白质复合物IFNα-PEG-Fc(A)、hGH-PEG-Fc(B)、17,65S-G-CSF-PEG-Fc(C)、胰岛素-PEG-Fc(D)、和EPO-PEG-Fc(E)使用蛋白酶分别经受肽作图分析(反相层析)。如图3中显示的，确认制备出具有90％或更高的高选择性、经由免疫球蛋白Fc区的N-端连接的蛋白质复合物。
实验实施例2：取决于Fc结合位置的复合物的功效比较
在实施例中制备的蛋白质复合物CA-毒蜥外泌肽4-PEG-Fc、17,65S-G-CSF-PEG-Fc、和EPO-PEG-Fc分别经受体外和体内功效测试。如下列表格中显示的，结合至Fc的N-端(脯氨酸)显示出比结合至其它分区(例如，赖氨酸)更好的功效。
表1
体外活性-CA毒蜥外泌肽-PEG-Fc位置异构体的CHO/GLP-1R生物试验
Figure BDA0001606018650000351
如表1中显示的，CA毒蜥外泌肽-PEG-Fc位置异构体之间体外活性的比较显示本发明的CA毒蜥外泌肽-PEG-Fc复合物——其通过特异性地结合至免疫球蛋白Fc片段的N-端制备——具有比通过结合至免疫球蛋白Fc区的另一个位置制备的CA毒蜥外泌肽-PEG-Fc复合物高6倍的效力。
表2
体外活性-17,65S-G-CSF-PEG-Fc位置异构体的小鼠骨髓细胞增殖试验
Figure BDA0001606018650000352
如表2中显示的，17,65S-G-CSF-PEG-Fc位置异构体之间体外活性的比较显示与通过结合至免疫球蛋白Fc区的另一个位置制备的17,65S-G-CSF-PEG-Fc复合物比较，本发明的17,65S-G-CSF-PEG-Fc复合物——其通过特异性地结合至免疫球蛋白Fc片段的N-端制备——具有大约67％增加的效价。
同时，为了检查本发明的蛋白质复合物——具体而言，EPO-PEG-Fc位置异构体——的体内活性，进行正常红细胞(normocythemic)小鼠试验以在将EPO-PEG-Fc皮下注射入正常红细胞小鼠后测量网状细胞水平。
表3
体内生物效力的测量-EPO-PEG-Fc位置异构体的网状细胞水平(在皮下注射入正常红细胞小鼠后)
Figure BDA0001606018650000361
如表3中显示的，EPO-PEG-Fc位置异构体之间体内活性的比较显示，与通过结合至免疫球蛋白Fc区的另一个位置制备的EPO-PEG-Fc复合物比较，本发明的EPO-PEG-Fc复合物——其通过特异性地结合至免疫球蛋白Fc片段的N-端制备——具有大约40％增加的效价。
这些结果表明，当通过将免疫球蛋白Fc片段的特异性位点用作结合位点来制备包括生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区的蛋白质复合物时，蛋白质复合物显示出生理学活性多肽的改进的体内活性。
将实施例和实验实施例一起考虑，本发明人制备了包括生理学活性多肽、非肽基聚合物、和免疫球蛋白Fc区的蛋白质复合物，以便增加生理学活性多肽的体内持续性和同时增加或维持体内活性(效力)。详细地，使用多种生理学活性多肽制备蛋白质复合物，和具体而言，通过将特异性位点——即，免疫球蛋白Fc区的N-端——用作结合位点来制备蛋白质复合物。
结果，确认，通过本发明的制备方法制备的多种蛋白质复合物显示出免疫球蛋白Fc区的超过90％N-端选择性，并且与通过结合至Fc区的另一个位置制备的蛋白质复合物比较，本发明的蛋白质复合物——其通过特异性地结合至免疫球蛋白Fc片段的N-端制备——具有大约40％至400％增加的效价。
基于上面的描述，本领域技术人员将理解本发明可以以不同的具体形式实施而不改变其技术精神或基本特性。因此，应当理解上面的实施方式在所有方面不是限制性而是说明性的。本发明的范围由所附权利要求而不是说明书限定，并且因此落入权利要求界限或这样的界限的等价物内的所有改变和修改因此意欲由权利要求涵盖。
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<400> 1
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
115 120 125
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220

Claims (39)

1.蛋白质复合物，其包括经由非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc区的生理学活性多肽，其中所述非肽基聚合物被位点特异性地连接至所述免疫球蛋白Fc区的远端处的脯氨酸，
其中所述生理学活性多肽选自粒细胞集落刺激因子衍生物，其中天然G-CSF的第17和65位处的氨基酸置换为丝氨酸；胰岛素；泌酸调节肽；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)；毒蜥外泌肽-4；凝血因子VII；胰高血糖素；和其衍生物，和
其中所述免疫球蛋白Fc区由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述非肽基聚合物的两端经由共价键通过反应基团被分别连接至所述生理学活性多肽和所述免疫球蛋白Fc区。
3.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是去糖基化的。
4.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
5.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述非肽基聚合物的反应基团选自醛基团、马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺衍生物。
6.权利要求5所述的蛋白质复合物，其中所述醛基团是丙醛基团或丁醛基团。
7.权利要求5所述的蛋白质复合物，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
8.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述非肽基聚合物在两端处具有作为反应基团的醛基团。
9.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述非肽基聚合物在两端处分别具有作为反应基团的醛基团和马来酰亚胺基团。
10.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述非肽基聚合物在两端处分别具有作为反应基团的醛基团和琥珀酰亚胺基团。
11.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述非肽基聚合物的每端被连接至所述免疫球蛋白Fc区的远端处的脯氨酸和分别地所述生理学活性多肽的赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基的N-端、C-端或游离反应基团。
12.权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述生理学活性多肽是粒细胞集落刺激因子衍生物，其中天然G-CSF的第17和65位处的氨基酸置换为丝氨酸。
13.制备权利要求1所述的蛋白质复合物的方法，其包括：
(a')通过如下制备缀合物：通过共价键将所述非肽基聚合物的一端连接至所述免疫球蛋白Fc区或所述生理学活性多肽，其以4.0至7.0的pH条件进行；
(b')分离在步骤(a')中制备的所述缀合物，并且通过共价键将所述分离的缀合物的所述非肽基聚合物的另一端连接至免疫球蛋白Fc区或所述生理学活性多肽中的另一个，其以4.0至7.0的pH条件进行；和
(c')分离在步骤(b')中制备的所述蛋白质复合物，其包括共价连接的生理学活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区，其中所述非肽基聚合物被连接至免疫球蛋白Fc片段的远端处的所述脯氨酸，
其中所述方法具有对所述免疫球蛋白Fc区远端处的脯氨酸超过90％的选择性。
14.权利要求13所述的方法，其中所述生理学活性多肽选自粒细胞集落刺激因子衍生物，其中天然G-CSF的第17和65位处的氨基酸置换为丝氨酸；胰岛素；泌酸调节肽；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)；毒蜥外泌肽-4；凝血因子VII；胰高血糖素；和其衍生物。
15.权利要求13所述的方法，其中，在步骤(a')中，所述生理学活性多肽和所述非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:30的范围中，并且所述免疫球蛋白Fc片段和所述非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:20的范围中。
16.权利要求13所述的方法，其中步骤(a')在4.0℃至25℃的温度下进行。
17.权利要求13所述的方法，其中，在步骤(a')中，所述免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的反应浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中。
18.权利要求13所述的方法，其中，在步骤(b')中，所述缀合物和所述免疫球蛋白Fc区或所述生理学活性多肽之间的反应摩尔比在1:0.1至1:20的范围中。
19.权利要求13所述的方法，其中步骤(b')在4.0℃至25℃的温度下进行。
20.权利要求13所述的方法，其中，在步骤(b')中，所述免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中。
21.权利要求13所述的方法，其中步骤(a')和步骤(b')在存在还原剂的情况下进行。
22.权利要求21所述的方法，其中所述还原剂选自氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、硼氢化钠、硼酸二甲胺和硼酸吡啶。
23.权利要求13所述的方法，其中，在步骤(b')中，所述分离通过选自如下的单一或组合纯化方法进行：阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析和大小排阻层析。
24.权利要求23所述的方法，其中阴离子交换层析树脂的官能团是选自季铵(Q)、季氨基乙基(QAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、聚乙烯胺(PEI)、二甲基氨基甲基(DMAE)和三甲基氨基乙基(TMAE)的任一种。
25.权利要求23所述的方法，其中阳离子交换层析树脂的官能团是选自甲基磺酸盐(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)和聚天冬氨酸的任一种。
26.权利要求23所述的方法，其中疏水层析树脂的官能团是选自苯基、辛基、(异)丙基、丁基和乙基的任一种。
27.权利要求23所述的方法，其中亲和层析树脂的官能团是选自蛋白A、肝素、蓝色剂、苄脒、钴、镍、铜和针对蛋白质复合物的部分或全部构成组分的抗体的任一种，在所述蛋白质复合物中，非肽基聚合物的两端被分别缀合至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽。
28.权利要求23所述的方法，其中所述大小排阻层析的树脂选自Superdex、Sephacryl、Superpose和Sephadex。
29.权利要求13所述的方法，其中所述蛋白质复合物的分离通过选自如下的单一或组合方法进行：阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析和大小排阻层析。
30.权利要求29所述的方法，其中阴离子交换层析树脂的官能团是选自季铵(Q)、季氨基乙基(QAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、聚乙烯胺(PEI)、二甲基氨基甲基(DMAE)和三甲基氨基乙基(TMAE)的任一种。
31.权利要求29所述的方法，其中阳离子交换层析树脂的官能团是选自甲基磺酸盐(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)和聚天冬氨酸的任一种。
32.权利要求29所述的方法，其中疏水层析树脂的官能团是选自苯基、辛基、(异)丙基、丁基和乙基的任一种。
33.权利要求29所述的方法，其中亲和层析树脂的官能团是选自蛋白A、肝素、蓝色剂、苄脒、钴、镍、铜和针对蛋白质复合物的部分或全部构成组分的抗体的任一种，在所述蛋白质复合物中，非肽基聚合物的两端被分别缀合至免疫球蛋白Fc区和生理学活性多肽。
34.权利要求29所述的方法，其中所述大小排阻层析的树脂选自Superdex、Sephacryl、Superpose和Sephadex。
35.权利要求13所述的方法，其中所述生理学活性多肽是粒细胞集落刺激因子衍生物，其中天然G-CSF的第17和65位处的氨基酸置换为丝氨酸。
36.制备权利要求1所述的蛋白质复合物的方法，其包括：
(a')通过如下制备缀合物：通过共价键将所述非肽基聚合物的一端连接至所述免疫球蛋白Fc区或所述生理学活性多肽，其中所述生理学活性多肽和所述非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:30的范围中，并且所述免疫球蛋白Fc区和所述非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:20的范围中，以1mM至100mM的范围包含还原剂，反应以4.0至7.0的pH条件、在4.0℃至25℃的温度下进行，并且所述免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中；
(b')分离在步骤(a')中制备的所述缀合物，并且通过共价键将所述分离的缀合物的所述非肽基聚合物的另一端连接至免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽中的另一个，其中所述缀合物和所述免疫球蛋白Fc区或所述生理学活性多肽之间的反应摩尔比在1:0.1至1:20的范围中，以1mM至100mM的范围包含还原剂，反应以4.0至7.0的pH条件、在4.0℃至25℃的温度下进行，并且所述免疫球蛋白Fc区或生理学活性多肽的浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围中；和
(c')分离在步骤(b')中制备的所述蛋白质复合物，其包括共价连接的生理学活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区，其中所述非肽基聚合物被连接至免疫球蛋白Fc片段的远端处的所述脯氨酸，
其中所述方法具有对所述免疫球蛋白Fc区远端处的脯氨酸超过90％的选择性。
37.用于改进生理学活性多肽的体内持续性和稳定性的药物组合物，其包括作为活性成分的权利要求1所述的蛋白质复合物。
38.权利要求37所述的组合物，其中所述药物组合物以90％或更高的量包括所述蛋白质复合物。
39.一种群体，其以90％或更高的量包括根据权利要求13至36中任一项所述的方法制备的蛋白质复合物。
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