CN101056887A

CN101056887A - 用作溶杆菌素衍生物的酰化九酯肽类

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Publication number: CN101056887A
Application number: CNA2005800371138A
Authority: CN
Inventors: 弗朗茨·冯努斯鲍姆; 尼娜·布吕纳; 赖纳·恩德曼; 昌塔尔·菲尔斯特纳; 埃尔克·哈特曼; 霍尔格·保尔森; 雅克·拉戈; 吉多·席费尔; 约阿希姆·舒马赫尔; 尼尔斯·斯文施特鲁普; 约阿希姆·泰尔塞; 索尼娅·安劳夫; 迈克-亚历山大·布吕宁
Original assignee: Aicuris GmbH and Co KG
Current assignee: Aicuris GmbH and Co KG
Priority date: 2004-11-05
Filing date: 2005-10-22
Publication date: 2007-10-17
Also published as: IL182739A; IL182739A0; UA89800C2; CA2586704A1; MX2007005382A; US7531507B2; ZA200703674B; GT200500308A; MA29218B1; KR20070083984A; JP4843614B2; UY29189A1; JP2008518982A; DE102004053407A1; CR9079A; HN2005030779A; SV2006002290A; AU2005300815B2; WO2006048139A1; NO20072854L

Abstract

本发明涉及九酯肽类(溶杆菌素衍生物)，其生产方法，和它们在制备用于治疗和/或预防疾病、特别是细菌感染性疾病的药物中的应用。所述新的溶杆菌素衍生物它们与天然物质的区别在于含有3－(3－吡啶基)－丙氨酰基团的N－末端肽链。

Description

用作溶杆菌素衍生物的酰化九酯肽类

本发明涉及九酯肽类(nonadepsipeptides)和它们的制备方法，还涉及它们在制备用于治疗和/或预防疾病、特别是细菌感染性疾病的药物中的应用。

细菌细胞壁是通过许多酶合成的(细胞壁生物合成)并且对微生物的生存和繁殖是必要的。该大分子的结构，还有涉及它的合成的蛋白质，在细菌内是高度保守的。由于它的关键本性和一致性，细胞壁生物合成是新抗生素理想的攻击点(D.W.Green，The bacterial cell wall as a source ofantibacterial targets，Expert Opin.Ther.Targets，2002，6，1-19)。

万古霉素和青霉素是细菌细胞壁生物合成的抑制剂并且代表该作用原理的抗生素功效的成功实例。它们已经在临床上使用了数十年，用于治疗细菌感染，特别是革兰氏阳性病原体的细菌感染。由于耐抗生素微生物的不断出现，例如耐甲氧西林的葡萄球菌(staphylococci)、耐青霉素的肺炎双球菌(pneumococci)和耐万古霉素的肠球菌(enterococci)(F.Baquero，Gram-positive resistance：challenge for the development of new antibiotics，J.Antimicrob.Chemother.，1997，39，Suppl A：1-6；A.P.Johnson，D.M.Livermore，G.S.Tillotson，Antimicrobial susceptibility of Gram-positive bacteria：what′scurrent，what′s anticipated？，J.Hosp.Infect.，2001，(49)，Suppl A：3-11)和最近也首次出现的耐万古霉素的葡萄球菌(B.Goldrick，First reported case ofVRSA in the United States，Am.J.Nurs.，2002，102，17)，这些物质正日益丧失它们的治疗功效。

本发明描述了一类新的对于已知类别的抗生素没有交叉抗性的细胞壁生物合成抑制剂。

在US 4,754,018中将天然产物溶杆菌素和一些衍生物描述为具有抗菌活性。在EP-A-196 042和JP 01132600中也描述了溶杆菌素的分离和抗菌活性。WO 04/099239描述了具有抗菌活性的溶杆菌素衍生物。

在O’Sullivan，J.等，J.Antibiot.1988，41，1740-1744，Bonner，D.P.等，J.Antibiot.1988，41，1745-1751，Shoji，J.等，J.Antibiot.1988，41，713-718和Tymiak，A.A.等，J.Org.Chem.1989，54，1149-1157中还描述了溶杆菌素和片野菌素(katanosin)A的抗菌活性。

本发明的一个目的是提供具有可比较的或改善的抗菌活性和更好的耐受性的备选化合物，例如更低的中毒性肾损害、和更好的体内分布，即更好的药物代谢动力学性质诸如，例如增加自由级分(f_u)，该化合物用于人和动物中细菌疾病的治疗。

本发明涉及下式的化合物

其中

R¹表示氢，并且

R²表示2，2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁-1-基，2，2-二乙基丁-1-基，2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，

或

R¹表示三氟甲基，并且

R²表示2，2-二甲基丙-1-基，2，2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁-1-基，2，2-二乙基丁-1-基，2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，

和它们的盐，它们的溶剂合物和它们的盐的溶剂合物。

本发明的化合物是式(I)的化合物和它们的盐、溶剂合物、所述盐的溶剂合物和前药，由式(I)包括并且具有下面所提到的分子式的化合物、和它们的盐、溶剂合物、所述盐的溶剂合物和前药，以及由式(I)包括并且如下面例举性实施方案提到的化合物、和它们的盐、溶剂合物、所述盐的溶剂合物和前药，只要在由式(I)包括并且下面提到的化合物还不是盐、溶剂合物、所述盐的溶剂合物和前药。

取决于它们的结构，本发明的化合物可以以立体异构体形式(对映异构体、非对映异构体)存在。本发明因此涉及所述对映异构体或非对映异构体和它们的相应混合物。可以以已知的方式将立体异构纯的组分从对映异构体和/或非对映异构体这样的混合物离析出。

如果本发明的化合物可以以互变异构形式存在，本发明包括全部互变异构形式。

用于本发明目的的优选盐是本发明化合物的生理可接受的盐。然而，也包括自身不适用于药物应用然而可以用于本发明化合物离析或纯化的实例的盐，或混合盐。混盐是指为了本发明目的的加成盐，其包括两种或多种不同的酸或碱，诸如，三氟乙酸盐-甲磺酸盐。

本发明化合物的生理可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸(naphthalenedisulfonic acid)、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。

本发明化合物的生理可接受的盐也包括通常的碱的盐诸如，例如并优选，碱金属盐(例如钠和钾盐)、碱土金属盐(例如钙和镁盐)和从氨或具有1至16个C原子的有机胺衍生的铵盐，诸如，例如并优选，乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲氨基乙醇、普鲁卡因、二苄基胺、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、1，2-乙二胺和N-甲基哌啶。

用于本发明目的的溶剂合物指通过与溶剂分子的配位作用以固态或液态形成配合物的本发明化合物的那些形式。水合物是特定形式的溶剂合物，其中与水发生所述配位作用。

优选式(I)的化合物，其中

R¹表示氢，并且

R²表示2，2-二甲基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，

或者

R¹表示三氟甲基，并且

R²表示2，2-二甲基丙-1-基，2，2-二甲基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，

和它们的盐，它们的溶剂合物和它们的盐的溶剂合物。

还优选式(I)的化合物，其中

R¹表示氢，并且

R²表示2，2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁-1-基，2，2-二乙基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，

和它们的盐，它们的溶剂合物和它们的盐的溶剂合物。

还优选式(I)的化合物，其中

R¹表示氢，并且

R²表示2，2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁-1-基，2，2-二乙基丁-1-基，2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基。

特别优选化合物3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶杆菌素

或者它的盐，它的溶剂合物或它的盐的溶剂合物之一。

本发明还涉及制备式(I)化合物的方法，其中将下式的化合物

与下式的化合物反应

其中

R¹和R²具有如上所述的含义，并且

X¹表示卤素，优选溴、氯或氟，或者是羟基。

如果X¹是卤素，则所述反应一般发生在惰性溶剂中，当合适时存在碱，优选在大气压下在-30℃至50℃的温度范围内。

惰性溶剂是，例如，四氢呋喃、二氯甲烷、吡啶、二噁烷或二甲基甲酰胺；优选二氯甲烷或二甲基甲酰胺。

碱是，例如，三乙胺、二异丙基乙胺或N-甲基吗啉；优选二异丙基乙胺。

如果X¹是羟基，所述反应一般在脱水剂存在下发生在惰性溶剂中，当合适时在碱存在下，优选在大气压下在-30℃至50℃的温度范围内。

惰性溶剂是，例如，卤代烃诸如二氯甲烷或三氯甲烷，烃诸如苯、硝基甲烷、二噁烷、二甲基甲酰胺或乙腈。同样可以采用这些溶剂的混合物。特别优选二氯甲烷或二甲基甲酰胺。

在这里适合的脱水剂是，例如，碳二亚胺诸如，例如，N，N′-二乙基-，N，N，′-二丙基-，N，N′-二异丙基-，N，N′-二环己基碳二亚胺，N-(3-二甲基氨基异丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-环己基碳二亚胺-N‘-丙氧基甲基-聚苯乙烯(PS-碳二亚胺)或羰基化合物诸如羰基二咪唑，或1，2-噁唑鎓化合物诸如2-乙基-5-苯基-1，2-噁唑鎓-3-硫酸盐或2-叔-丁基-5-甲基异噁唑鎓高氯酸盐，或酰氨基化合物诸如2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉，或丙烷膦酸酐，或氯甲酸异丁酯，或双(2-氧代-3-噁唑烷基)磷酰氯或苯并三唑氧基-三(二甲基-氨基)鏻六氟磷酸盐，或邻-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)，2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TPTU)或邻-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)，或1-羟基苯并三唑(HOBt)，或苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)，或N-羟基琥珀酰亚胺，或其和碱的混合物。

碱是，例如，碱金属碳酸盐，诸如，例如，碳酸钠或碳酸钾，或碳酸氢盐，或有机碱诸如三烷基胺，例如，三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、4-二甲基氨基吡啶或二异丙基乙胺。

优选利用HATU或利用EDC在HOBt存在下进行所述缩合。

式(III)的化合物任选含有保护基，以便在这些情况下式(II)化合物与式(III)化合物的反应之后根据本领域技术人员已知的方法用三氟乙酸除去所述保护基。

例如可以通过碱的加入和随后的所述化合物的萃取或沉淀，或者通过用技术人员已知的方法用色谱法分离，获得式(I)化合物的盐的游离碱，所述方法特别是通过利用聚合物-结合的碱诸如，例如，聚合物-结合的碳酸氢盐。

本发明还涉及用于制备根据权利要求1的式(I)化合物或它们的溶剂合物的方法，其中通过加入碱将所述化合物的盐或所述化合物盐的溶剂合物转化成所述化合物。

可以从溶杆菌素(实施例1A)通过双Edmann降解法合成式(II)的化合物，如实验部分中实施例2A中所描述。

式(III)的化合物是已知的或可以通过已知的方法从相应的原材料合成。

可以通过下列合成方案说明本发明化合物的制备。

合成方案：

本发明的化合物显示不能被预测的有价值的药理学和药物代谢动力学效果的谱。它们显示抗菌的效果。

它们因此适用于用作治疗和/或预防人和动物中疾病的药物。

本发明的化合物特征在于与溶杆菌素相比更低的中毒性肾损害。

本发明的化合物特征在于与溶杆菌素相比更好的药物代谢动力学。虽然药理学活性是相同的或改善的，但是它们在体内显示更好的分布，导致更低的治疗剂量和更宽的治疗性治疗窗。

本发明的化合物在血浆中具有比溶杆菌素更高的自由级分(f_u)。

所述九酯肽类作为细菌细胞壁生物合成的抑制剂。

本发明的制剂针对细菌和类细菌的微生物是特别有效的。它们因此特别适于由这些病原体在人和兽医学中所引起的局部和全身感染的预防和化学治疗。

原则上，可以将本发明的制剂用于针对拥有细菌细胞壁(胞壁质球囊)或有关酶系统的全部细菌和类细菌的微生物，例如下列病原体或下列病原体的混合物：

革兰氏阴性球菌(淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae))还有革兰氏阴性杆菌诸如肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、C.divernis)、沙门氏菌属(Salmonella)和志贺氏杆菌属(Shigella)；此外还有肠杆菌属(Enterobacter)(产气肠杆菌(E.aerogenes)、成团肠杆菌(E.agglomerans)、哈夫尼菌属(Hafnia)、沙雷氏菌属(Serratia)(粘质沙雷氏菌(S.marcescens))、普罗威登斯菌属(Providencia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)，还有不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)和衣原体(Chlamydia)。而且，所述抗菌谱包括严格厌氧菌诸如，例如，脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)的代表，还有梭状芽胞杆菌属(Clostridium)；此外还有分枝杆菌属(mycobacteria)，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosus)。本发明的化合物显示对于革兰氏阳性球菌的特别显著的效果，例如葡萄球菌(Staphylococci)(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、肉葡萄球菌(S.carnosus))、肠球菌属(enterococci)(粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium))和链球菌属(streptococci)(无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、化脓链球菌(S.pyogenes))。

上述病原体列表将仅通过实例说明决不作为限制性的。可以提到的由提到的病原体或混合感染所引起并且可以通过本发明的制剂防止、改善或治愈的疾病例如：

在人中的感染性疾病，例如，无并发症的和并发的尿路感染，无并发症的皮肤和表皮感染，并发的皮肤和软组织感染，医院中获得性肺炎和作为门诊患者、医院的肺炎，慢性支气管炎的急性恶化和继发细菌感染，急性中耳炎，急性鼻窦炎，链球菌咽炎，细菌性脑膜炎，无并发症的淋球菌和非-淋球菌尿道炎/宫颈炎，急性前列腺炎，心内膜炎，无并发症的和并发的腹内感染，妇科感染，盆腔炎疾病，细菌性阴道病，急性和慢性骨髓炎，急性细菌性关节炎，发热性中性白细胞减少患者(febrile neutropenicpatients)中的经验疗法，还有菌血症(bacteraemias)，MRSA感染，急性传染性腹泻，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染，手术后的感染，牙原性感染(odontogenic infections)，眼科感染，手术后的感染(包括门静脉周脓肿、创伤感染、胆道感染，乳腺炎和急性阑尾炎)，囊性纤维化病和支气管扩张症。

除人之外，还可以在其它物种中治疗细菌感染。可以提到的实例是：

猪：腹泻、肠源性毒血症(enterotoxaemia)、败血症、痢疾、沙门氏菌病、子宫炎-乳腺炎-乳泌缺乏综合征(agalactiae syndrome)、乳腺炎；

反刍动物(牛、绵羊、山羊)：腹泻、败血症、支气管性肺炎、沙门氏菌病、巴斯德菌病、生殖器感染；

马：支气管性肺炎、关节病、分娩的和分娩后感染、沙门氏菌病；

狗和猫：支气管肺炎、腹泻、皮炎、耳炎、尿路感染、前列腺炎；

家禽(小鸡、火鸡、鹌鹑、鸽子、观赏鸟类及其它)：大肠杆菌感染、慢性呼吸道疾病、沙门氏菌病、巴斯德菌病、鹦鹉热。

它同样可以在饲养和抚养生产性和观赏用鱼类中治疗细菌病，所述抗菌谱从而在上述病原体上还延伸到病原体诸如，例如，巴斯德菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、李斯特菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothris)、棒状杆菌(Corynebacteria)、疏螺旋体属(Borellia)、密螺旋体(Treponema)、诺卡氏菌属(Nocardia)、立克次氏体(Rickettsia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)。

本发明还涉及本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病，特别是细菌感染性疾病的应用。

本发明还涉及本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病，特别是上述疾病的应用。

本发明还涉及本发明的化合物用于生产治疗和/或预防疾病、特别是上述疾病的药物的应用。

优选将本发明的化合物用于生产适于预防和/或治疗细菌疾病的药物。

本发明还涉及利用抗菌有效量的本发明化合物治疗和/或预防疾病的方法，所述疾病特别是上述疾病。

本发明还涉及包含至少一种本发明化合物和至少一种或多种另外的活性化合物的药物，特别是用于治疗和/或预防上述疾病。组合用的优选活性化合物是抗菌活性的化合物，其具有不同的活性谱，特别是补充的活性谱，和/或对于本发明的化合物是协同作用的。

本发明的化合物可以全身和/或局部起作用。为此目的，可以将它们以适合的方式施用，诸如，例如，经口地、肠胃外地、经肺地、经鼻地、舌下地、舌地、含服地、直肠地、皮肤地、透过皮肤地、结膜地、经耳地或作为植入物或支架。

可以将本发明的化合物以适于这些给药途径的形式施用。

适于口服是根据现有技术起作用并且快速和/或以修改方式递送本发明化合物的给药形式，并且其含有结晶和/或无定形和/或溶解形式的本发明化合物，诸如，例如，片剂(无涂层的或包衣片剂，例如具有延迟溶解或者是不可溶的并且控制本发明化合物释放的肠溶衣或涂层)，快速在口腔中崩解的片剂或薄膜/糯米纸囊剂，薄膜/冻干物(lyophilisates)，胶囊(例如硬或软明胶胶囊)，糖衣片剂，颗粒剂，微型药片，粉末，乳剂，混悬剂，气溶胶或溶液。

肠胃外给药的发生可以避免吸收步骤(例如，静脉内、动脉内、心脏内、脊髓内或腰椎内)，或包含吸收(例如，肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)。适合于肠胃外给药的给药形式特别是，用于注射和输注的，以溶液、混悬液、乳剂、冻干物或无菌粉末存在的制剂。

适合于其它给药途径的实例是用于吸入的药物形式(特别是粉末吸气器，喷雾器)，滴鼻剂，溶液，喷雾剂；可以通过舌、舌下或颊施用的片剂，薄膜/糯米纸囊剂或胶囊；栓剂，用于眼和耳的制剂，阴道胶囊，水性混悬液(洗剂，振摇混合物)，亲脂性混悬液，软膏剂，乳膏剂，透皮治疗系统(诸如，例如，贴片)，乳，糊剂，泡沫，扑粉，植入物或支架。

可以将本发明的化合物转化成为列出的给药形式。其可以以本身已知的方式通过混合以惰性、非毒性的药用的赋形剂来进行。这些赋形剂包括，特别是，载体(例如微晶纤维素，乳糖，甘露醇)，溶剂(例如液体聚乙二醇)，乳化剂和分散剂或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠，聚氧基失水山梨糖醇油酸酯)，粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)，合成的和天然的聚合物(例如白蛋白)，稳定剂(例如抗氧化剂诸如抗坏血酸)，颜料(例如无机颜料诸如氧化铁)或味道和/或气味矫正剂。

本发明还涉及包含至少一种本发明化合物的药物，通常连同一种或多种惰性的、非毒性的、药学上可接受的赋形剂，并且涉及其用于上述目的的用途。

通常已经证明有利的是，在静脉内给药上施用约为0.001至100mg/kg体重的量，优选约0.1至10mg/kg体重的量，以实现有效的结果，并且在口服上所述剂量是约0.01至50mg/kg体重，优选0.5至10mg/kg体重。

然而当适当时不同于所述的量可以是必要的，特别是作为体重、给药途径、对于所述活性成分的个体行为、制剂类型和进行给药的时间或时间间隔的函数。因而，在某些情形中以少于前述最少量进行的施用可以是充分的，而在其它情形中，必须超过提及的上限。在更大量的施用的情形中，可以推荐将这些分成一天内的多个单独剂量。

在下述测试和实施例中的百分比数据是重量百分比，除非另外指出；份是重量份。液体/液体溶液的溶剂比率、稀释比率和浓缩数据在每种情形中都是基于体积。

A.实施例

缩写

aq. 水性的

area (峰)面积

BHI 脑心浸液

Boc 叔-丁氧羰基

br. 宽信号(在NMR光谱中)

calc. 计算的

conc. 浓缩的

D 双峰(在NMR光谱中)

DCI 直接化学电离(在MS中)

DCM 二氯甲烷

DIEA N，N-二异丙基乙胺

DMAP 4-N，N-二甲基氨基吡啶

DMSO 二甲亚砜

DMF N，N-二甲基甲酰胺

EA 乙酸乙酯(乙酸乙基酯)

EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(也是

EDCI)

EDCxHCl 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

EI 电子碰撞电离(MS中)

ESI 电喷雾电离(MS中)

ESIneg ESI质谱法中的阴离子扫描

ESIpos ESI质谱法中的阳离子扫描

Ex. 实施例

h 小时

HATU 邻-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N‘，N‘-四甲基脲

鎓六氟磷酸盐

HOBt 1-羟基苯并三唑

HPLC 高压、高效液相色谱法

HR 高分辨率

i.v. 真空

LC-MS 偶联液相色谱-质谱法

LDA 二异丙基氨基化锂

m 中间(在UV和IR光谱中)

m 多重峰(在NMR光谱中)

MALDI 基体-辅助的激光脱附/电离

MIC 最低抑制浓度

min 分钟

m.p. 熔点

MRSA 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌

MS 质谱

NCCLS 国家临床实验室标准委员会(National

Committee for Clinical Laboratory Standards)

neg. 阴性的

NMM N-甲基吗啉

NMR 核磁共振光谱法

p.a. 分析级(pro analysi)

Pd 钯

Pd-C 披钯碳

pos. 正的

PTFE 聚四氟乙烯

quant. 定量的

RP-HPLC 反相HPLC

RT 室温

R_t 保留时间(HPLC中)

s 强(在UV和IR光谱中)

s 单峰(在NMR光谱中)

sat. 饱和的

TBTU 邻-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟

硼酸盐

TCTU 邻-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓

四氟硼酸盐

TFA 三氟乙酸

TFE 2，2，2-三氟乙醇

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱

TOF 飞行时间

UV 紫外线

vis 可见的

VRSA 耐万古霉素的金黄色葡萄球菌

w 弱(在UV和IR光谱中)

Z，Cbz 苄氧基羰基

参考文献

对于肽和环化酯肽(cyclodepsipeptides)的命名法，参考：

1.A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds(Recommendations 1993)，1993，Blackwell Scientific publications.

2.Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides.Recommendations 1983.IUPAC-IUB Joint Commission on BiochemicalNomenclature，UK.Biochemical Journal 1984，219，345-373，和引用的文献。

一般的GC-MS，LC-MS，HR-MS，HPLC和凝胶色谱方法

方法1(TOF-HR-MS)：利用Micromass LCT仪器(毛细管电压：3.2KV，锥形电压(cone voltage)：42V，源极温度：120℃，去溶剂化温度：280℃)记录TOF-HR-MS-ESI+光谱。将输液泵(Harvard Apparatus)用于为此目的的进样。将亮氨酸脑磷脂(encephalin)(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)充当标准。

方法2(制备的HPLC)：仪器：Gilson Abimed HPLC；UV检测器210nm；双泵系统；柱：Waters Symmetry-Prep^TM C₁₈，7μm，300×19mm；洗脱液A：水中的0.2％三氟乙酸，洗脱液B：乙腈；流速：25ml/min；柱温RT；0min 20％B，斜面0-10min 70％B，斜面10-10.1min 20％B，15min 20％B。

方法3(Sephadex LH-20上的凝胶色谱)：在无压力情况下在SephadexLH-20(Pharmacia)上进行凝胶色谱分离。根据UV活性(254nm的UV检测器，Knauer)进行分级(ISCO Foxy 200级分收集器)，柱尺寸：32×7cm(1000-100μmol规模)；30×4cm(100-10μmol规模)；25×2cm(10-1μmol规模)。将尺寸80×30的柱用于从1mmol至11mmol的规模。在此情况下，手动并且无上游UV检测器的情况下收集级分。将所述级分通过HPLC指定(方法9)。

方法4(制备的HPLC；Kromasil，乙酸)：仪器：Gilson Abimed HPLC；UV检测器210nm；双泵系统；柱：Kromasil-100A C₁₈，5μ-m；250×20mm；流速：25ml/min；洗脱液A：水/0.25-0.5％乙酸，洗脱液B：乙腈；梯度：0-3min 5％B，3-30min 5-100％B，30-38min 100％B，然后是所述色谱柱的再生。

方法5(LC-MS)：仪器：Micromass Quattro LCZ mit HPLC Agilent系列1100；柱：Phenomenex Synergi 2μHydro-RP Mercury 20mm×4mm；洗脱液A：1l的水+0.5ml的50％甲酸，洗脱液B：1l的乙腈+0.5ml的50％甲酸；梯度：0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min5％A；流速：0.0min 1ml/min，2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；炉：50℃；UV检测：208-400nm。

方法6(LC-MS)：MS仪器型号：Micromass ZQ；HPLC仪器型号：Waters Alliance 2795；柱：Phenomenex Synergi 2μHydro-RP Mercury 20mm×4mm；洗脱液A：1l的水+0.5ml的50％甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.5ml的50％甲酸；梯度：0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流速：0.0min 1ml/min，2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；炉：50℃；UV检测：210nm。

方法7(LC-MS)：MS仪器型号：Micromass ZQ；HPLC仪器型号：HP 1100series；UV DAD；柱：Phenomenex Synergi 2μHydro-RP Mercury 20mm×4mm；洗脱液A：1l水+0.5ml 50％甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.5ml 50％甲酸；梯度：0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流速：0.0min 1ml/min，2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；炉：50℃；UV检测：210nm。

方法8(分析的HPLC)：HPLC仪器型号：HP 1050系列；UV DAD1100系列；柱：Kromasil C₁₈，60×2mm，3.5μm；洗脱液A：水/0.5％高氯酸，洗脱液B：乙腈；梯度：0-0.5min 2％B，0.5-4.5min 2-90％B，4.5-9.0min 90％B，9.0-9.2min 90-2％B，9.2-10.0min 2％B；流速：0.75ml/min，炉：30℃，UV检测210nm。

方法9(分析的HPLC，Agilent Zorbax C₈)：仪器：具有DAD(G1315B)，双泵(G1312A)，自动进样器(G1313A)，溶剂脱气装置(G1379A)和柱温控器(G1316A)的Agilent 1100；柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C84.6×150×5mm；洗脱液A：0.05％70％水中的高氯酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-1min 10％B，斜面，4-5min 90％B，斜面，5.5min 10％B；流速：2.00ml/min；柱温：30℃。

方法10(Sephadex LH-20上的凝胶色谱)：在无压力下在SephadexLH-20(Pharmacia)上进行凝胶色谱分离。根据UV活性(254nm的UV检测器，Knauer)进行分级(ISCO Foxy 200馏分收集器)，柱尺寸：32×7cm(1000-100μmol规模)；30×4cm(100-10μmol规模)；25×2cm(10-1μmol规模)。

方法11(制备的HPLC Symmetry)：仪器：Gilson Abimed HPLC；双泵系统；柱：SymmetryPrep^TMC₁₈，Waters，7μm；300mm×19mm；洗脱液A：水/0.2％三氟乙酸，洗脱液B：乙腈；梯度：0-10min 15-65％B，然后是色谱柱的再生；流速：25ml/min；UV检测210nm。

方法12(制备的HPLC Kromasil)：仪器：Gilson Abimed HPLC；双泵系统；柱：Kromasil C₁₈，5μm，100，250×20mm；洗脱液A：水中0.05％的三氟乙酸，洗脱液B：乙腈中0.05％的三氟乙酸；梯度：0-3min10％B，斜面，30-38min 90％B，38-45min 10％B；流速：20ml/min；UV检测210nm。

方法13(制备的HPLC Waters Symmetry)：仪器：Gilson AbimedHPLC；双泵系统；柱：Waters Symmetry-Prep^TM C₁₈，7μm，300×19mm；洗脱液A：水中的0.05％三氟乙酸，洗脱液B：0.05％乙腈中的三氟乙酸；梯度：0-3min 10％B，斜面，30-38min 90％B，38-45min 10％B；流速：20ml/min；UV检测210nm。

方法14(制备的HPLC)：仪器：Gilson Abimed HPLC；双泵系统；柱：Waters Symmetry-Prep^TM C₁₈，7μm，300×19mm；洗脱液A：水/0.2％三氟乙酸，洗脱液B：乙腈；梯度：0-10min 25-65％B，然后是色谱柱的再生；流速：25ml/min；UV检测210nm。

方法15(手性HPLC Daicel Chiralpak)：Agilent 1100 HPLC；柱：DaicelChiralpak AD-H 5μm；250×20mm；恒溶剂：75％异己烷，25％的2-丙醇，含0.2％三氟乙酸和1％水；流速：1.0ml/min；炉：25℃；UV检测器212nm。

方法16(制备的HPLC)：仪器：Gilson Abimed HPLC；双泵系统；柱：YMC ODS-AQ 5μm，250×30mm；洗脱液A：水中0.05％的三氟乙酸，洗脱液B：乙腈中0.05％的三氟乙酸；梯度：0-3min 10％B，斜面，30-38min90％B，38-45min 10％B；流速：50ml/min；UV检测器210nm。

方法17(GC-MS)：仪器：Micromass GCT，GC6890；柱：RestekRTX-35MS，30m×250μm×0.25μm；梯度：60℃(保持0.30min)，50℃/min→120℃，16℃/min→250℃，30℃/min→300℃(保持1.7min)；用氦的恒定流速：0.88ml/min；炉：60℃；入口：250℃。

方法18(HPLC)：HPLC仪器型号：HP 1100系列；UV DAD柱：ZorbaxEclipse XBD-C8(Agilent)，150mm×4.6mm，5μm；洗脱液A：5ml的HClO₄/l水，洗脱液B：乙腈；梯度：0-1min 10％B，1-4min 10-90％B，4-5min 90％B；流速：2.0ml/min；炉：30℃；UV检测：210和254nm。

方法19(HPLC)：柱：Kromasil RP-18，60mm×2mm，3.5μm；洗脱液A：5ml的HClO₄/l水，洗脱液B：乙腈；梯度：0min 2％B，0.5min 2％B，4.5min 90％B，9min 90％B；流速：0.75ml/min；炉：30℃；UV检测：210nm。

方法20(HPLC)：柱：Kromasil RP-18，250mm×4mm，5μm；洗脱液A：5ml的HClO₄/l水，洗脱液B：乙腈；梯度：0min 5％B，10min 95％B；流速：1ml/min；炉：40℃；UV检测：210nm。

方法21(HPLC)：柱：Kromasil RP-18，250mm×4mm，5μm；洗脱液A：2ml的HClO₄/l水，洗脱液B：乙腈；恒溶剂：45％B，55％A；流速：1ml/min；炉：40℃；UV检测：210nm。

方法22(LC-MS)：MS仪器型号：Micromass ZQ；HPLC仪器型号：HP 1100系列；UV DAD；柱：Grom-Sil 120ODS-4HE 50×2mm，3.0μm；洗脱液A：水/0.025％甲酸/l，洗脱液B：乙腈/0.025％甲酸；梯度：0-2.9min0-70％B，2.9-3.1min 70-90％B，3.1-4.5min 70-90％B；炉：50℃，流速：0.8ml/min，UV检测：210nm。

方法23(HPLC)：HPLC仪器型号：HP 1050系列；UV DAD 1100系列；柱SymmetryPrep^TMC₁₈，Waters，50×2.1mm，3.5μm；洗脱液A：水/0.05％三氟乙酸，洗脱液B：乙腈；梯度：0-9min 0-100％B，9-11min100％B，11-12min 100-0％B，然后是色谱柱的再生；炉：40℃，流速：0.4ml/min，UV检测：210nm。

方法24(定量的¹⁹F-NMR光谱法)：将近似10mg的精确称重的样品物质和近似20mg精确称重的1，4-二溴四氟苯溶解在吡啶中并且通过¹⁹F-NMR光谱法测量。将δ-74(TFA)和-132.0(1，4-二溴四氟苯)积分并比较。将TFA含量表述为所述样品物质的TFA质量百分比。

方法25(离子色谱法)：具有抑制器系统和电导率检测器的离子色谱法；前柱：A SUPP 4/5Guard，分离柱：A SUPP 5 4.0×250mm；洗脱液：水中的3.2mM碳酸钠和2.4mM碳酸氢钠；流速：0.7ml/min。将所述样品溶解在甲醇中(20％的最终样品体积)，在超声波浴中处理3min并用水补足。将所述样品通过无离子的乙酸纤维素过滤器(孔径0.45μm)过滤并注入。对外标(0.5mg/l-10mg/l)定量。

起始化合物

实施例1A

D-亮氨酰-N¹-{(3S，6S，12S，15S，18R，21S，24S，27S，28R)-6-[(1S)-2-氨基-1-羟基-2-氧乙基]-18-(3-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}丙基)-12-[(1S)-1-羟乙基]-3-(羟甲基)-24-[(1R)-1-羟基-2-甲基丙基]-21-异丁基-15-[(1S)-1-甲基丙基]-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧代-28-苯基-1-氧杂-4，7，10，13，16，19，22，25-八氮杂环八念烷-27-基}-L-亮氨酰胺(leucinamide)双三氟乙酸盐(溶杆菌素)

发酵：

培养基：

YM：酵母-麦芽琼脂：D-葡萄糖(4g/l)，酵母提取物(4g/l)，麦芽提取物(10g/l)，1升的离子交换树脂水(Lewatit water)。在灭菌(121℃下20分钟)之前将pH调节至7.2。

HPM：甘露糖醇(5.4g/l)，酵母提取物(5g/l)，肉蛋白胨(3g/l)。

工作保藏：将冻干的菌株(ATCC 53042)在50ml的YM培养基中培养。

烧瓶发酵：用2ml所述工作保藏接种1升锥形瓶中的150ml的YM培养基或100ml的HPM培养基并且使其在28℃在240rpm的振荡器上生长30-48小时。

30l的发酵：将300ml的烧瓶发酵(HPM培养基)用于接种无菌的30l营养培养基溶液(每升1ml消泡剂SAG 5693)。将该培养在28℃，300rpm并用0.3vvm的无菌空气通气生长21小时。用1M盐酸将pH在pH＝7.2保持恒定。总计，在培养周期期间加入880ml的1M盐酸。

主要培养(200l)：将1l锥形瓶中的15×150ml的YM培养基用2ml的工作保藏接种并使其在振荡器上在28℃和240rpm生长48小时。将2250ml的该培养物用于接种无菌的200l营养培养基溶液(YM)(每升1ml消泡剂SAG 5693)并使其在28℃，150rpm和用0.3vvm无菌空气通气下生长18.5小时。

每小时取样(50ml)以检验所述发酵过程。将1ml的甲醇(0.5％三氟乙酸)加入到2ml的该培养液并且将所述混合物通过0.45μm过滤器过滤。将30μl的该悬浮液通过HPLC(方法18和方法19)分析。

在18.5小时后，将主要培养的培养液在17000rpm分成上清液和沉淀物。

离析：

利用浓缩的三氟乙酸或氢氧化钠溶液将所述上清液(183l)调节到pH6.5-7并且装载到Lewapol柱(OC 1064，60l容量)上。随后用纯水、水/甲醇1∶1并随后用纯甲醇(含有0.1％三氟乙酸)进行洗脱。将该有机相真空浓缩成11.5l的残留水残液。

将残留的水相结合到硅胶C₁₈并分离(MPLC，Biotage Flash 75，75×30cm，KP-C18-WP，15-20μm，流速：30ml/min；洗脱液：含有0.1％三氟乙酸的乙腈/水；梯度：10％，15％和40％乙腈)。将含有实施例1A主要量的40％乙腈相真空浓缩并随后冷冻干燥(～13g)。将该固体混合物首先在制备的HPLC(方法7)上，随后通过Sephadex LH-20(5×70cm，乙腈/水1∶1，在每个情况下含有0.05％三氟乙酸)上的凝胶过滤和进一步的制备HPLC(方法20)分离成1.2g的部分。

该过程提供2250mg的实施例1A。

将所述沉淀物吸收在4l的丙酮/水4∶1中，加入2kg的C盐，将所述混合物利用三氟乙酸调节到pH＝6，搅拌并离心。将所述溶剂真空浓缩，并且将残余物冷冻干燥。将获得的冻干物(89.9g)吸收在甲醇中，过滤，浓缩并在硅胶(方法21)上分离。然后将实施例1A通过凝胶过滤(SephadexLH-20，5×68cm，水/乙腈9∶1(含有0.05％三氟乙酸)，流速：2.7ml/min，级分大小13.5ml)纯化而得到纯物质。

该过程得到447mg的实施例1A。

HPLC(方法18)：R_t＝6.19min

MS(ESIpos)：m/z＝1277(M+H)⁺

¹H NMR(500.13MHz，d₆-DMSO)：δ＝0.75(d，3H)，0.78(d，6H)，0.80(t，3H)，0.82(d，3H)，0.90(d，3H)，0.91(d，3H)，0.92(d，3H)，0.95(d，3H)，0.96(d，3H)，1.05(m，1H)，1.19(d，3H)，1.25(m，2H)，1.50(m，4H)，1.51(m，2H)，1.55(m，1H)，1.61(m，1H)，1.65(m，1H)，1.84(m，1H)，1.85(m，1H)，1.86(m，1H)，1.89(m，1H)，1.95(m，1H)，2.75(m，2H)，3.40(m，1H)，3.52(m，2H)，3.53(dd，1H)，3.64(m，2H)，3.66(m，1H)，3.68(dd，1H)，3.73(m，2H)，4.00(dd，1H)，4.02(br.，1H)，4.13(br.，1H)，4.32(dd，1H)，4.39(t，1H)，4.55(m，1H)，4.75(dd，1H)，5.19(t，1H)，5.29(d，1H)，5.30(br.，1H)，5.58(m，2H)，6.68(m，3H)，6.89(d，1H)，6.93(m，3H)，6.94(br.，1H)，6.98(d，1H)，7.12(br.，1H)，7.20(br.，2H)，7.23(m，2H)，7.42(m，2H)，7.54(d，1H)，7.58(d，1H)，8.32(br.，1H)，9.18(br.，1H)，9.20(m，2H)，9.50(br.，1H).

¹³C-NMR(125.77MHz，d₆-DMSO)：δ＝10.3，15.3，19.0，19.2，19.6，20.0，20.9，22.0，22.4，23.0，23.2，24.3，24.4，25.0，25.4，26.0，27.8，30.9，35.4，39.5，40.8，40.9，41.6，44.1，51.5，52.7，55.9，56.2，56.4，57.9，58.8，60.2，61.1，62.6，70.1，71.6，71.7，75.5，128.1，128.6，136.7，156.8，168.2，170.1，170.4，171.2，171.5，171.9，172.2，172.4，173.7.

根据文献(T.Kato，H.Hinoo，Y.Terui，J.Antibiot.，1988，61，719-725)中描述的指定进行所述信号的指定(assignment)。

实施例2A

脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素双三氟乙酸盐(Edman^2.0降解产物)

在氩气气氛下将溶杆菌素双三氟乙酸盐(60.0g，39.88mmol)溶解在吡啶(840ml)中。然后加入异硫氰酸苯酯(32.35g，239.28mmol，6当量)，并且将反应混合物在37℃搅拌7h。然后在旋转蒸发器上在浴温度为40℃下蒸馏出所述溶剂。将残余物与甲基叔丁基醚(1400ml)混合并剧烈搅拌30min。然后将混合物通过玻璃粉(glass frit)(孔宽度3,13cm直径)抽吸过滤。将中间产物(Edman^0.5降解产物)以粗收率为72g离析并在无后加工(workup)情况下进一步反应。

为此目的，在氩气气氛下将粗产物溶解在三氟乙酸(1026ml)中并在RT搅拌30min。然后将所述溶液在浴温度为20℃下在旋转蒸发器上真空浓缩。将残余物吸收在甲基叔丁基醚(1400ml)中并剧烈搅拌直到产生粉末状无定形固体。将其在玻璃粉(孔宽度3,18cm直径)上通过真空过滤收集。然后将所述固体用二乙醚(1400ml)搅拌并再次通过过滤收集。用2份的二氯甲烷(每份900ml)重复相同的程序。将所述粗产物真空干燥。获得58g的粗脱(1-D-亮氨酰)溶杆菌素双三氟乙酸盐(Edman^1.0降解产物)。

在无进一步后加工的情况下在氮气气氛下将所述粗产物溶解吡啶(1080ml)中。然后加入异硫氰酸苯酯(107g，0.80mol，20当量)并将所述反应混合物在37至40℃搅拌7h。然后在旋转蒸发器上在浴温度为40℃下蒸馏出所述溶剂。将所述残余物与甲基叔丁基醚(1400ml)混合并剧烈搅拌。然后将所述混合物在玻璃粉(孔宽度3,13cm直径)上用抽吸过滤。以粗收率为65g离析所述中间产物(Edman^1.5降解产物)并且，在油泵真空下干燥以后，将中间产物在氩气气氛下直接溶解在三氟乙酸(1240ml)中并在RT搅拌30min。然后将所述溶液在旋转蒸发器上在浴温度为20℃下真空浓缩。将所述残余物吸收在甲基叔丁基醚(1400ml)中并剧烈搅拌直到产生粉末状无定形固体。将粉末状无定形固体在玻璃粉(孔宽度3,18cm直径)上通过真空过滤收集。然后将所述固体首先用二乙醚(1400ml)并然后用二氯甲烷(1400ml)搅拌并且每次通过过滤收集。获得55g的粗产物。将所述粗产物通过制备的HPLC(方法14)纯化。获得28.55g(理论的56％)的标题混合物。

HPLC/UV-Vis(方法23)：R_t＝4.71min，

λ_max(定性的)＝220nm(s)，255-270(w)。

LC-MS(方法22)：R_t＝1.65min；

MS(ESIpos.)：m/z(％)＝526(100)[M+2H]²⁺，1051(15)[M+H]⁺。

实施例3A

(2Z)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)丙烯酸甲酯

将6-三氟甲基吡啶-3-甲醛(4.85g，27.70mmol)和{[(苄氧基)羰基]氨基}(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(9.17g，27.70mmol，1.0当量)溶解在THF(70ml)中并冷却至-70℃。在-70℃，将N，N，N，N-四甲基胍(6.38g，55.39mmol，6.95ml，2.0当量)缓慢逐滴加入并然后将所述混合物在-70℃搅拌4h并随后在RT搅拌12h。将所述反应混合物浓缩并然后用乙酸乙酯(2×100ml)从水萃取，并用饱和盐水洗涤合并的有机相并经过硫酸钠干燥。在真空浓缩后将粗产物色谱分离(硅胶，洗脱液：甲苯然后是甲苯/乙酸乙酯10∶1)。获得6.93g(理论的66％)的标题化合物。

HPLC/UV-Vis(方法8)：R_t＝4.60min。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝4.54min。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)：δ＝3.74(s，3H，OMe)，5.10(s，2H，CH₂)，7.27(s，1H，PyrH)，7.33-7.38(m，5H，ArH)，7.94(d，J＝8.5Hz，1H，PyrH)，8.27(d，J＝8.5Hz，1H，PyrH)，8.93(s，1H，β-CH)，9.51(s，1H，NH)。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.44min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝381(100)[M+H]⁺；MS(ESIneg.)：m/z(％)＝379(100)[M-H]^-。

HR-TOF-MS(方法1)：C₁₈H₁₆N₂O₄F₃[M+H]⁺计算值381.1062，实测的381.1065。

实施例4A

N-[(苄氧基)羰基]-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯

将来自实施例3A的化合物(10.15g，26.69mmol)溶解在甲醇p.a.(100ml)中。利用针，使氩气通过约5min并然后加入(+)-1，2-双[(2S，5S)二乙基-phospholano]苯(环辛二烯)铑(I)三氟化物(289mg，400μmol，0.015当量)。在氢压力为4巴和在RT下将氢化进行12h。然后过滤通过硅藻土(甲醇)，接着是洗出液的浓缩。将粗产物色谱分离(硅胶，洗脱：甲苯/乙酸乙酯5∶1)。获得9.9g(理论的97％)的标题化合物。

[α]²⁰ _Na＝-24(在甲醇中c＝0.093)。

HPLC/UV-Vis(方法8)：R_t＝4.50min。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝4.49min。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)：δ＝2.99(dd，J＝3.5，11.0Hz，1H，β-CH)，3.22(dd，J＝3.5，11.0Hz，1H，β-CH)，3.66(s，3H，OMe)，4.40(m，1H，α-CH)，4.97(s，2H，CH₂)，7.23(m，2H)，7.29-7.33(m，3H)，7.83(d，J＝6.5Hz，1H)，7.93-7.98(m，2H)，8.65(s，1H，NH)。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.40min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝383(100)[M+H]⁺；MS(ESIneg.)：m/z(％)＝273(100)，381(50)[M-H]^-。

HR-TOF-MS(方法1)：C₁₈H₁₈N₂O₄F₃[M+H]⁺计算值383.1219，实测的383.1223。

实施例5A

3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯

将来自实施例4A的化合物(9.90g，25.89mmol)溶解在甲醇(100ml)中。利用针，使氩气通过大约5min并然后加入披钯碳(10％，990mg)。在4巴的氢压力和RT下进行12h的氢化。然后通过硅藻土的过滤，接着是浓缩并在油泵真空下干燥。收率：5.8g(理论的)标题化合物。

[α]^19.9 _Na＝+3(甲醇中c＝0.186)。

HPLC/UV-Vis(方法8)：R_t＝3.34min。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝3.22min。

IRν_max(NaCl，cm^-1)：3415，1734，1339，1136，1087。

¹H-NMR(500MHz，d₆-DMSO)：δ＝2.85(dd，J＝5.5，13.5Hz，1H，β-CH)，3.01(dd，J＝5.5，13.5Hz，1H，β-CH)，3.61(s，3H，OMe)，3.63-3.69(m，1H，α-CH)，7.82(d，J＝7.5Hz，1H)，7.93(d，J＝7.5Hz，1H)，8.61(s，1H)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.74min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝249(100)[M+H]⁺。

HR-TOF-MS(方法1)：C₁₂H₁₅N₃O₂F₃[M+CH₃CN+H]⁺计算值290.1116，实测的290.1122。

实施例6A

N-(叔丁氧基羰基)-3-(叔丁基)-D-丙氨酰-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯

在-30℃将N-甲基吗啉(12.92g，127.72mmol，14.04ml，5当量)和HATU(9.71g，25.54mmol，1当量)缓慢加入到无水DMF(240ml)中的来自实施例5A的化合物(6.34g，25.54mmol)和N-(叔丁氧基羰基)-3-叔-丁基-D-丙氨酸(6.27g，25.54mmol，1.0当量)溶液。将所述反应混合物缓慢(约3h)温热到RT，通过HPLC(方法9)观察到完全的转化。加入磷酸二氢钾(34.76g，255.44mmol，10当量)，并且将所述反应混合物搅拌20min并且然后过滤，用乙酸乙酯稀释并用饱和的碳酸氢钠水溶液(10ml)稀释。将有机相用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过快速色谱分离纯化(硅胶，10∶1至2∶1环己烷/乙酸乙酯梯度)，产生9.74g(理论的73％)的标题化合物。

[α]^19.9 _Na＝+7.0(甲醇中c＝0.044)。

HPLC/UV-Vis(方法8)：R_t＝4.89min。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝4.75min。

IRν_max(NaCl，cm^-1)：2959，1742，1655，1520，1336，1160，1136，1087，1050，1027。

¹H-NMR(500MHz，d₆-DMSO)：δ＝0.74(s，9H，tBu)，0.97-1.00(m，1H，β-CH2)，1.20-1.25(m，1H，β-CH2)，1.35(s，9H，OtBu)，2.99-3.05(m，1H，β-CH2)，3.23-3.26(m，1H，β-CH2)，3.66(s，3H，OMe)，3.94(m，1H，α-CH)，4.60(m，1H，α-CH)，6.82(d，J＝8.5Hz，1H，NH)，7.78(d，J＝8.0Hz，1H，PyrH)，7.94(d，J＝8.0Hz，1H，PyrH)，8.34(d，J＝8.5Hz，1H，NH)，8.64(s，1H，PyrH)。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.67min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝476(100)，[M+H]⁺；MS(ESIneg.)：m/z(％)＝400(80)，474(40)[M-H]^-。

HR-TOF-MS(方法1)：C₂₂H₃₃N₃O₅F₃[M+H]⁺计算值476.2372，实测的476.2364。

实施例7A

N-叔-丁氧基羰基-3-叔-丁基-D-丙氨酰-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酸

在-20℃将水(20ml)中的氢氧化锂水合物的溶液(1.16g，2.5当量，48.37mmol)加入到THF(360ml)和水(100ml)中的来自实施例6A的化合物(9.2g，1.0当量，19.35mmol)的溶液。将反应混合物温热(约1.5h)至+15℃，通过HPLC(方法9)观察到完全的转化。为了后加工，加入磷酸二氢钾(26.33g，10当量，193.5mmol)(大约pH 7)。将反应混合物过滤并真空浓缩。将粗产物通过凝胶色谱法纯化(方法10，流动相甲醇/丙酮4∶1)，产生4.72g(理论的53％)产物。

[α]²⁰ _Na＝+51.3(甲醇中c＝0.402)。

HPLC/UV-Vis(方法8)：R_t＝4.63min。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝4.55min。

IRν_max(NaCl，cm^-1)：3305，2959，1663，1519，1336，1173，1134，1086。

¹H-NMR(500MHz，d₆-DMSO)：δ＝0.77(s，9H，tBu)，1.06-1.13(m，1H，β-CH2)，1.23-1.26(m，1H，β-CH2)，1.34(s，9H，OtBu)，3.01(t_app，J＝11.0Hz，1H，ββ-CH2)，3.23(br d，J＝11.0Hz，1H，ββ-CH2)，3.94(t，J＝8.0Hz，1H，αα-CH)，4.42(br s，1H，αα-CH)，6.90(d，J＝8.5Hz，1H，NH)，7.74(d，J＝7.5Hz，1H，PyrH)，7.86(d，J＝7.5Hz，1H，PyrH)，8.00(br s，1H，NH)，8.56(s，1H，PyrH)。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.42min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝406(100)，462(85)[M+H]⁺；MS(ESIneg.)：m/z(％)＝460(100)[M-H]^-。

HR-TOF-MS(方法1)：C₂₁H₃₁N₃O₅F₃[M+H]⁺计算值462.2216，实测的462.2203。

实施例8A

N-叔-丁氧基羰基-3-叔-丁基-D-丙氨酰-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三氟乙酸盐

在-30℃将N-甲基吗啉(2.77g，3.01ml，5当量，27.38mmol)和HATU(4.37g，2.1当量，11.50mmol)缓慢加入到无水DMF(119ml)中的来自实施例2A的化合物(7.00g，1.0当量，5.48mmol)和实施例7A的化合物(3.03g，1.2当量，6.57mmol)的溶液。将反应混合物缓慢温热(约1h)至RT，通过HPLC/UV-Vis(方法9)观察到完全的转化。将所述反应用磷酸二氢钾(7.45g，10.0当量，54.76mmol)猝灭。将反应混合物通过凝胶色谱法纯化(方法10，流动相甲醇/丙酮4∶1)，产生12.63g(定量的)产物。

HPLC/UV-Vis(方法8)：R_t＝4.78min。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝4.35min。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.28min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝697(100)[M+2H]²⁺，1493(15)[M+H]⁺；MS(ESIneg.)：m/z(％)＝745(100)[M-2H]^2-，1491(5)[M-H]^-。

HR-TOF-MS(方法1)：C₆₇H₁₀₄N₁₆O₁₉F₃[M+H]⁺计算值1493.7616，实测的1493.7594。

实施例9A和实施例10A

(2S)-N-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙氨酸和(2R)-N-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙氨酸

根据M.Merget，K.Günther，M.Bernd，E.Günther，R.Tacke，J.Organomet.Chem.2001 628，183-194进行合成。通过手性相上的制备的HPLC进行对映异构体的分离：手性相：Gilson Abimed HPLC；柱：DaicelChiralpak AD-H 5μm；250×20mm；洗脱液A：异己烷，洗脱液B：0.2％乙酸/1％水/2-丙醇；恒溶剂；流速：15ml/min；UV检测器212nm。通过与N-(叔丁氧基羰基)-L-3-三甲基甲硅烷基丙氨酸(2R化合物，MercachemAMR 39.260)真实样品的HPLC比较指定同分异构体。

实施例9A

N-(叔丁氧基羰基)-D-3-三甲基甲硅烷基丙氨酸(2S化合物)

手性HPLC(方法15)：R_t＝4.16min，e.e.＞99％。

[αα]_D ²⁰＝+1.1(甲醇中c＝0.83)

实施例10A

N-(叔丁氧基羰基)-L-3-三甲基甲硅烷基丙氨酸(2R化合物)

手性HPLC(方法15)：R_t＝9.27min，e.e.＞99％。

[α]_D ²⁰＝-1.6(甲醇中c＝0.66)

实施例11A

N-(叔丁氧基羰基)-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯

类似于B.Neises，W.Steglich，Org.Synth.1985，63，183-187进行制备。

在氩气下将(2S)-N-(叔丁氧基羰基)-3-(吡啶-3-基)丙氨酸(25.00g，93.88mmol)溶解在300ml的二氯甲烷中。加入甲醇(11.4ml，9.02g，281mmol，3当量)和DMAP的小晶体。然后将混合物冷却至0℃。加入EDC(19.80g，103mmol，1.1当量)。5min.后，除去冰浴并且将所述混合物在RT下搅拌1h。然后将混合物真空浓缩，并将残余物用乙酸乙酯混合并用饱和的碳酸氢钠溶液萃取。将水相用乙酸乙酯反萃取一次，并然后将合并的有机相用0.5M柠檬酸洗涤并然后再次用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤。将有机相经过硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。在油泵真空下干燥时结晶的清澈油状物保留。收率：23.60g(理论的90％)。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝3.28min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.21min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝281(100)[M+H]⁺。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)：δ＝1.30(s，9H)，2.86(m，1H)，3.04(m，1H)，3.63(s，3H)，4.22(m，1H)，7.28-7.39(m，2H)，7.69(d，1H)，8.43(m，2H)。

实施例12A

3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯双三氟乙酸盐

将来自实施例11A的化合物(11.8g，42.09mmol)溶解在二氯甲烷中的三氟乙酸(160ml；30％溶液)中并在RT搅拌30min。然后将混合物真空浓缩。将残余物吸收到少量水中并冷冻干燥。然后将冻干物与甲苯混合并在真空下浓缩。最后将产物在油泵真空下干燥至恒重。收率：17.15g(定量的)。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝0.88min。

LC-MS(方法7)：R_t＝0.46min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝181(100)[M+H]⁺。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)：δ＝2.79(dd，1H)，2.92(dd，1H)，3.60(s，3H)，3.63(m，1H)，7.30(m，1H)，7.62(d，1H)，8.41(m，2H)。

实施例13A

N-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯

在0℃将来自实施例9A的化合物(10.31g，39.4mmol)和来自实施例12A的化合物(16.10g，39.4mmol，1当量)溶解在DMF(186ml)中。然后加入N-甲基吗啉(17.34ml，16.00g，4当量)和HATU(22.49g，59.16mmol，1.5当量)。将混合物在RT搅拌两小时。加入叔丁基甲基醚，并且用饱和的碳酸钠溶液洗涤。将水相用叔丁基甲基醚反萃取一次，并且然后将合并的有机相用1M柠檬酸水溶液洗涤并再次用饱和的碳酸钠溶液洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。进行通过硅胶的过滤(环己烷/乙酸乙酯2∶1)。收率：14.1g(理论的84％)。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝3.91min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.90min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝424(100)[M+H]⁺。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)：δ＝-0.09(s，9H)，0.56-0.75(m，2H)，1.47(s，9H)，2.90(dd，1H)，3.09(dd，1H)，3.62(s，3H)，3.98(m，1H)，4.49(m，1H)，6.68(d，1H)，7.26(dd，1H)，7.61(m，1H)，8.20(d，1H)，8.40(m，2H)。

实施例14A

N-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸

将来自实施例13A的化合物(7.4g，17.56mmol)吸收在THF/水(6∶4)中并冷却至0℃，并且加入一水合氢氧化锂(1.47g，35.13mmol，2当量)。将所述混合物在0℃搅拌。一小时后，加入另外当量(0.74g)的一水合氢氧化锂，并且继续搅拌一小时。在真空中蒸馏出大部分THF，并且用两部分甲基叔丁基醚洗涤水相并然后通过加入柠檬酸调节到pH 4。固体沉淀。将混合物用三部分的乙酸乙酯萃取，由此所述固体溶解。将合并的有机相经过硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过凝胶色谱法纯化(方法3，流动相：甲醇)。收率：6.67g(理论的93％)。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝3.73min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.68min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝410(40)[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz，d₆-DMSO)：δ＝-0.090(s，9H)，0.56-0.75(m，2H)，1.35(s，9H)，2.90(dd，1H)，3.09(dd，1H)，3.98(m，1H)，4.41(m，1H)，6.70(d，1H)，7.26(dd，1H)，7.60(m，1H)，8.00(d，1H)，8.37(m，2H)。

实施例15A

N-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三氟乙酸盐

将来自实施例2A的化合物(3.00g，2.35mmol)和来自实施例14A的化合物(1.44g，3.52mmol，1.5当量)溶解在DMF(50ml)中并冷却至0℃。然后首先加入DMF中4.7ml(4.7mmol，2当量)的4-甲基吗啉溶液。紧接其后，加入HATU(1.52g，3.99mmol，1.7当量)并将所述混合物在0℃搅拌15min。然后逐滴加入DMF中另外4.7ml(4.7mmol，2当量)的4-甲基吗啉溶液。然后将所述混合物在RT搅拌2h。将所述粗产物进行凝胶色谱分离(方法3)。在没有精制的情况下将所述产物进一步反应。收率：3.6g(理论的82％)。

HPLC(方法9)：R_t＝3.90min。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.00min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝721.8(100)[M+2H]²⁺；1442.1(5)[M+H]⁺。

备选方法：将来自实施例2A的化合物(14.00g，10.95mmol)和来自实施例14A的化合物(5.38g，13.14mmol，1.2当量)溶解在DMF(280ml)中并冷却至-20℃。然后加入N-甲基吗啉(5.54g，6.02ml，5当量)并随后加入HATU(6.66g，17.52mmol，1.6当量)。将所述混合物缓慢温热至RT并搅拌过夜(约16h)。然后在搅拌时加入磷酸二氢钾(14.91g，10当量)，并将搅拌继续30分钟。将粗产物进行凝胶色谱分离(方法3，流动相：甲醇)。在没有精制的情况下使所述产物进一步反应。收率：14.35g(理论的61％)。

实施例16A

2，2-二甲基-1-丁醛

将2，2-二甲基-1-丁醇(4.0g，39mmol)溶解在二氯甲烷(136ml)中，并加入氧化铝(7.98g，78mmol，2当量)和氯铬酸吡啶(pyridiniumchlorochromate)(16.88g，78mmol，2当量)。将混合物在RT搅拌1h并然后通过硅胶层过滤。将滤液谨慎浓缩，并在大气压下蒸馏所述残余物(沸点：102℃(990毫巴))。收率：2.97g(理论的75％)。

GC-MS(方法17)：R_t＝2.21min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝99.9(5)[M]⁺；

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.83(t，3H)，1.03(s，6H)，1.51(q，2H)，9.42(s，1H)。

实施例17A

(2Z)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4，4-二甲基己-2-烯酸甲酯

将来自实施例16A的化合物(2.55g，25.46mmol)和{[(苄氧基)羰基]氨基}(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(8.43g，25.46mmol)溶解在50ml的THF中并冷却至0℃。逐滴加入N，N，N`，N`-四甲基胍，并且然后将所述混合物首先在0℃搅拌15min并然后在RT搅拌5天。将约20g的硅胶加入到所述混合物，将其浓缩并色谱分离(凝胶Biotage 40M，ZIF-SIM，环己烷/乙酸乙酯87∶13)。收率：1.20g(理论的13％)。

HPLC(方法9)：R_t＝3.71min。

MS(DCI)：m/z(％)＝323.3(100)[M+NH₄]。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝0.83(m，3H)，1.13(s，6H)，1.49(q，2H)，3.75(br s，3H)，5.72(br s，1H)，6.58(br s，1H)，5.12(s，2H)，7.36(m，5H)。

实施例18A

N-[(苄氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酸甲酯

将来自实施例17A的化合物(1.2g，粗产物，3.26mmol)溶解在乙醇p.a.(60ml)中。利用针，将氩气通过约5min，并且然后加入(+)-1，2-双[(2R，5R)-二乙基phospholano]苯(环辛二烯)铑(I)三氟化物(28mg，0.04mmol，0.012当量)并在超声波浴中溶解。在3巴的氢压力和RT下将氢化进行24h。将混合物浓缩并色谱分离(硅胶Biotage 25M，环己烷/乙酸乙酯9∶1)。收率：920mg(理论的92％)。

HPLC(方法9)：R_t＝4.96min。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.76min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝308(25)[M+H]⁺。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝0.80(t，3H)，0.86(s，6H)，1.29(q，2H)，1.41(dd，1H)，1.73(dd，1H)，3.72(s，3H)，4.40(m，1H)，5.02(d，1H)，5.11(m，2H)，7.35(m，5H)。

实施例19A

N-[(苄氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酸

将来自实施例18A的化合物(915mg，2.98mmol)溶解在THF(12ml)中。将所述溶液冷却至0℃并然后加入在水中的3.7ml(7.4mmol，2.5当量)的2M一水合氢氧化锂溶液并剧烈搅拌1h。然后逐滴加入柠檬酸(1M)直到所述反应是酸性的，并用乙酸乙酯萃取所述混合物。将有机萃取液经过硫酸钠干燥，浓缩并色谱分离(方法16)。收率：434mg(理论的50％)。

HPLC(方法9)：R_t＝4.54min。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.44min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝294(20)[M+H]⁺。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)：δ＝0.80(t，3H)，0.83(s，6H)，1.21(q，2H)，1.53(dd，1H)，1.60(dd，1H)，3.99(m，1H)，5.02(s，2H)，7.35(m，5H)，7.58(d，2H)，12.52(br s，1H)。

实施例20A

N-[(苄氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯

将来自实施例19A的化合物(430mg，1.47mmol)和来自实施例12A的化合物(809mg，1.47mmol，1当量)在0℃溶解在DMF(5ml)中并然后加入4-甲基吗啉(644μl，5.86mmol，4当量)和HATU(836mg，2.20mmol，1.5当量)。将所述混合物在RT搅拌三小时。加入乙酸乙酯，并用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤。将水相用乙酸乙酯萃取一次，并然后将合并的有机相用1M柠檬酸水溶液洗涤并再次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将所述残余物色谱分离(方法16)。收率：496mg(理论的74％)。

HPLC(方法9)：R_t＝3.94min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.85min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝456(100)[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz，d₆-DMSO)：δ＝0.80(m，9H)，1.10(m，3H)，1.30(dd，1H)，2.91(dd，1H)，3.12(dd，1H)，3.30(s，3H)，4.02(m，1H)，4.51(m，1H)，5.01(d，1H)，5.06(d，1H)，7.22(dd，1H)，7.30(m，5H)，7.63(m，1H)，8.40(m，2H)。

实施例21A

N-[(苯氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸

将来自实施例20A的化合物(490mg，1.08mmol)溶解在THF(5ml)中。将溶液冷却至0℃并然后加入1.35ml(2.7mmol，2.5当量)在水中的2M一水合氢氧化锂溶液并剧烈搅拌1h。然后将柠檬酸(在水中1M)逐滴加入直到所述反应是酸性的，并用乙酸乙酯萃取所述混合物。将有机萃取液经过硫酸钠干燥并浓缩。收率：484mg(quant.)。

HPLC(方法9)：R_t＝3.76min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.88min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝442(100)[M+H]⁺。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)：δ＝0.70(m，9H)，1.14(m，3H)，1.30(dd，1H)，2.64(d，1H)，2.75(d，1H)，2.89(dd，1H)，3.11(dd，1H)，4.03(m，1H)，4.45(m，1H)，4.98(d，1H)，5.05(d，1H)，7.22(dd，1H)，7.30(m，5H)，7.61(m，1H)，8.40(m，2H)。

实施例22A

N-[(苄氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶杆菌素三氟乙酸盐

将来自实施例2A的化合物(0.28g，0.22mmol)和来自实施例21A的化合物(148mg，0.33mmol，1.5当量)溶解在DMF(4ml)中并冷却至0℃。然后首先加入0.47ml(0.44mmol，2当量)在DMF中的1M的N-甲基吗啉的溶液。紧接其后加入HATU(141mg，0.37mmol，1.7当量)并在0℃搅拌混合物15min。然后逐滴加入另外0.44ml(0.47mmol，2当量)的在DMF中的1M 4-甲基吗啉的溶液。然后将所述混合物在RT搅拌过夜。在SephadexLH 20上纯化所述混合物(方法3，流动相：甲醇)。将粗产物用制备的HPLC纯化(方法13)。收率：149mg(理论的43％)。

HPLC(方法9)：R_t＝3.93min。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.13min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝737.4(100)[M+2H]²⁺，1473(2)[M+H]⁺。

例举性实施方案

实施例1

3-叔-丁基-D-丙氨酰-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶杆菌素双三氟乙酸盐

在RT将三氟乙酸(150ml)缓慢逐滴加入到来自实施例8A的化合物(10.3g，1.0当量，4.48mmol，粗产物)在二氯甲烷中的溶液(150ml)。将反应混合物在RT搅拌(10min)，通过HPLC(方法9)观察到完全转化。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并用制备的HPLC(方法11)纯化，由此获得3.48g(理论的48％)产物。

HPLC/UV-Vis(方法8)：R_t＝4.03min。

HPLC/UV-Vis(方法9)：R_t＝3.64min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.69min；MS(ESIpos.)：m/z(％)＝697(100)[M+2H]²⁺，1393(5)[M+H]⁺；MS(ESIneg.)：m/z(％)＝695(100)[M-2H]^2-，1391(20)[M-H]^-。

¹⁹F-NMR(400MHz，d₅-吡啶)：δ＝-67(Ar-CF₃)，-74(CF₃COOH)，-132(1，4-二溴-四氟苯作为参照)。TFA含量：14.3重量％。

HR-MS(方法1)：C₆₂H₉₆N₁₆O₁₇F₃[M+H]⁺计算值1393.7091，实测的1393.7119。

实施例2

3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶杆菌素三氟乙酸盐

将来自实施例15A的化合物(9.12g，4.93mmol，粗产物)吸收在二氯甲烷中的三氟乙酸(65ml；30％溶液)中。将混合物在RT搅拌20min。将溶剂蒸馏出。将残余物在油泵真空下干燥并然后用色谱分离纯化(方法14)。收率：5.54g(理论的67％)。

HPLC(方法9)：R_t＝3.32min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.41min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝671.7(100)[M+2H]²⁺。

HR-TOF-MS(方法1)：C₆₀H₉₇N₁₆O₁₇Si[M+H]⁺计算值1341.6987，实测的1341.7019。

¹H-NMR(500MHz，d₅-吡啶)：δ＝-0.172(s，9H)，0.611(d，J＝6.9Hz，3H)，0.881(d，J＝7.9Hz，3H)，0.948(d，J＝6.3Hz，3H)，0.954-0.997(m，6H)，1.135(d，J＝6.0Hz，3H)，1.208(m，2H)，1.361(d，J＝5.4Hz，3H)，1.439(m，1H)，1.497(m，1H)，1.953(m，2H)，2.04(m，1H)，2.154(m，3H)，2.372(m，3H)，3.111(m，1H)，3.266(m，1H)，3.563(d，J＝14.95Hz，1H)，3.726(dd，J＝12.2，14.95Hz，1H)，3.840(d，J＝9.6Hz，1H)，3.960(m，1H)，4.152(m，1H)，4.198(m，1H)，4.278(m，1H)，4.382(m，1H)，4.488(m，1H)，4.565(dd，J＝9.5，9.6Hz，1H)，4.628(m，1H)，4.630(m，1H)，4.779(d，J＝12.2Hz，1H)，5.069(m，1H)，5.159(dd，J＝9.3Hz，1H)，5.264(m，1H)，5.362(s，1H)，5.98(d，J＝9.9Hz，1H)，6.351(dd，J＝8.5Hz，J＝8.7Hz，1H)，7.169(m，1H)，7.246(m，1H)，7.382(d，J＝9.9Hz，1H)，7.512(m，2H)，7.583-7.614(m，2H)，7.728(m，2H)，7.90(d，J＝8.7Hz，1H)，8.126(m，3H)，8.341(m，1H)，8.576(d，J＝3.6Hz，1H)，8.695(m，2H)，8.793(m，1H)，9.139(br s，1H)，9.715(m，1H)，10.957(br s，1H)，11.268(br s，1H).

¹³C-NMR(126MHz，d₅-吡啶)：δ＝-1.8，11.08，15.84，18.8，18.8，19.79，20.89，20.93，21.65，23.38，24.78，26.57，26.88，28.80，31.04，34.06，36.84，40.95，41.25，44.38，50.94，52.82，55.99，56.10，56.74，58.40，59.10，60.34，60.72，62.33，62.55，70.72，72.06，75.58，75.65，123.66，128.25，128.95，129.80，132.39，136.77，137.18，149.17，158.11，162.15，162.41，162.70，162.96，169.01，169.69，170.21，172.57，173.27，173.44，173.66，174.07，174.36，175.34，175.56。

¹⁹F-NMR(400MHz，d₅-吡啶)：δ＝-74(CF₃COOH)，-132(1，4-二溴四氟苯作为参照)。TFA含量：19.3重量％。

通过单晶X-射线结构分析证实所述结构。

实施例3

3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶杆菌素三甲磺酸盐

将3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三-三氟乙酸盐(447mg，0.27mmol)溶解在22ml的水中。加入甲磺酸(70％)。将混合物剧烈搅拌并然后冷冻干燥。将冻干物吸收在水(3.4ml)中，并加入70％的甲磺酸钠溶液(0.9ml)。将所述混合物在RT搅拌10min。然后用离心除去产物。获得472mg的粗产物。

将从数个批次合并的粗产物(总共1053mg，0.63mmol)悬浮在水(5ml)中并在RT搅拌4天。重复离心，并将获得的固体真空干燥。获得575mg(理论的55％)产物。

HPLC(方法9)：R_t＝3.30min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.49min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝671.8(100)[M+2H]²⁺，1342.1(5)[M+H]⁺。

¹H-NMR(500MHz，d₅-吡啶)：δ＝-0.170(s，9H)，0.702(d，J＝6.3Hz，3H)，0.867(d，J＝6.1Hz，3H)，0.972(d，J＝6.2Hz，3H)，0.966-1.069(m，9H)，1.186(d，J＝6.5Hz，3H)，1.315(m，2H)，1.448-1.501(m，6H)，2.010(m，1H)，2.084(m，3H)，2.180-2.365(m，4H)，2.540(m，1H)，3.082(s，9H)，3.166(m，1H)，3.325(m，1H)，3.623(d，J＝14.05Hz，1H)，3.865(dd，J＝13.7，14.05Hz，1H)，3.967-3.986(m，2H)，4.257(m，1H)，4.339(m，2H)，4.410(m，1H)，4.566(m，1H)，4.591-4.686(m，2H)，4.75(d，1H，J＝12.1Hz，1H)，4.859(m，1H)，5.086(m，1H)，5.229(m，1H)，5.348(m，1H)，5.375(s，1H)6.02(d，J＝10.0Hz，1H)，6.403(m，1H)，7.068(d，J＝9.8Hz，1H)，7.222(m，3H)，7.544(m，3H)，7.625(m，1H)，7.681(m，1H)，7.830(d，J＝7.6Hz，1H)，7.921(d，J＝9.35Hz，1H)，8.071(m，2H)，8.188(br s，1H)，8.285(br s，1H)，8.420(d，J＝8.4Hz，1H)，8.614(d，J＝4.0Hz，1H)，8.701(m，1H)，8.874(br s，1H)，10.175(m，1H)，10.279(m，1H)，10.941(br s，1H)。

¹⁹F-NMR(吡啶，400MHz，方法24)：δ-74.0(s，TFA，0.20)，-132.0(s，1，4-二溴四氟苯，1000.0)，TFA＝0.02重量％。

备选方法：将32g的Dowex 1X8-400(HCl形式)装填到柱(35mm直径)中。将约60ml的1M氢氧化钠溶液接着是60ml的HPLC水放到所述柱上。接着用60ml的1M甲磺酸老化并随后用近似100ml水洗涤直到洗出液具有中性反应。(Macherey & Nagel Tritest)。然后将2.00g(1.19mmol)的3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三(三氟乙酸盐)(实施例2)溶解在90ml水中，并装载所述溶液并缓慢洗脱。将所述柱用约20ml水洗涤。将含有产物的洗出液合并并进行微滤(孔径大小0.20μm)和冷冻干燥。将所述柱再老化并再生。从2000mg(1.19mmol)的实施例2获得1.79g(1.10mmol，理论的92％)的实施例3。

实施例4

4，4-二甲基-D-正亮氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三(三氟乙酸盐)

将来自实施例22A的化合物(149mg，0.09mmol)溶解在甲醇/含有0.05％三氟乙酸(10ml)中。加入活性炭上的钯(10％；20mg)并然后用大气压的氢并在RT下总共进行氢化2.5h。将粗产物过滤除去所述晶体，并将滤液浓缩。将残余物用色谱分离(方法13)纯化。收率：68mg(理论的46％)。

HPLC(方法9)：R_t＝3.29min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.49min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝671.0(100)[M+2H]²⁺，1340(5)[M+H]⁺。

HR-TOF-MS(方法1)：C₆₂H₉₈N₁₆O₁₇[M+H]⁺计算值1339.7369，实测的1339.7368。

实施例5(比较例)

3-叔-丁基-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三(三氟乙酸盐)

实施例6

(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三-盐酸盐

将32g的Dowex 1X8-400(HCl形式)装填到柱(35mm直径)中。将约60ml的1M氢氧化钠溶液接着是60ml的HPLC水放到所述柱上。接着用60ml的1M盐酸老化并随后用近似100ml水洗涤直到洗出液具有中性反应。(Macherey & Nagel Tritest)。然后将2.00g(1.19mmol)的3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三(三氟乙酸盐)(实施例2)溶解在90ml水中，并装载所述溶液并缓慢洗脱。将所述柱用约20ml水洗涤。将含有产物的洗出液合并并进行微滤(孔径大小0.20μm)和冷冻干燥。将所述柱再老化并再生。从2000mg(1.19mmol)的实施例2获得1.54g(1.06mmol，理论的89％)的实施例6。

HPLC(方法9)：R_t＝3.30min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.47min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝671.5(100)[M+2H]²⁺，1341.4(20)，[M+H]⁺。

离子色谱(方法25)：Cl^-(calc.)＝7.43％，Cl^-实测的＝7.1％；TFA(实测的)＜0.1％。

¹H-NMR(500MHz，d₅-吡啶)δ＝-0.170(s，9H)，0.580(d，J＝6.3Hz，3H)，0.772(d，J＝5.7Hz，3H)，0.920(d，J＝5.8Hz，3H)，0.974-0.985(m，6H)，1.147(d，J＝6.4Hz，3H)，1.250-1.358(m，2H)，1.411(d，J＝5.7Hz，3H)，1.468(m，1H)，1.604(m，1H)，1.959-2.049(m，3H)，2.154-2.228(m，3H)，2.380(m，3H)，2.935(m，1H)，3.120(m，1H)，3.300(m，1H)，3.607(d，J＝14.9Hz，1H)，3.762(dd，J＝14.7Hz，1H)，3.882(d，J＝9.1Hz，1H)，3.938(m，1H)，4.204(m，1H)，4.253(m，1H)，4.389(m，1H)，4.465(m，1H)，4.589-4.661(m，4H)，4.806(d，J＝12.1Hz，1H)，5.027(m，1H)，5.202(dd，J＝9.4Hz，1H)，5.289(m，1H)，5.390(s，1H)，6.000(d，J＝9.5Hz，1H)，6.394(dd，J＝9.0Hz，1H)，7.173(m，2H)，7.428(m，1H)，7.54(d，J＝7.0Hz，1H)，7.664-7.973(m，3H)，7.767(d，J＝8.6，1H)，7.918-7.973(m，3H)，8.038(br s，2H)，8.098(br s，1H)，8.185(br s，1H)，8.253(d，J＝8.6Hz，1H)，8.582(m，1H)，8.684(d，J＝9.8Hz，1H)，8.741(br s，1H)，8.782(m，1H)，9.928(br s，1H)，10.272(d，J＝8.3Hz，1H)，10.886(br s，1H)，11.135(br s，1H)。

¹⁹F-NMR(吡啶，400MHz，方法24)：TFA＜检测限。

实施例7

(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三-L-乳酸盐

将32g的Dowex 1X8-400(HCl形式)装填到柱(35mm直径)中。将约60ml的1M氢氧化钠溶液接着是60ml的HPLC水放到所述柱上。接着用60ml的1M乳酸老化(conditioning)并随后用近似100ml水洗涤直到洗出液具有中性反应。(Macherey & Nagel Tritest)。然后将2.00g(1.19mmol)的3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三(三氟乙酸盐)(实施例2)溶解在90ml水中，并装载所述溶液并缓慢洗脱。将所述柱用约20ml水洗涤。将含有产物的洗出液合并并进行微滤(孔径大小0.20μm)和冷冻干燥。将所述柱再老化并再生。从2000mg(1.19mmol)的实施例2获得1903mg(1.18mmol，理论的99％)的实施例7。

HPLC(方法9)：R_t＝3.29min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.38min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝671.7(100)[M+2H]²⁺，1341.8(20)，[M+H]⁺。

¹H-NMR(500MHz，d₅-吡啶)：δ＝-0.170(s，9H)，0.754(d，J＝6.3Hz，3H)，0.836(d，J＝6.1Hz，3H)，0.922(d，J＝6.2Hz，3H)，0.922-0.957(m，6H)，1.054(d，J＝6.4Hz，3H)，1.190(m，2H)，1.416(d，J＝5.8Hz，3H)，1.439-1.662(m，4H)，1.529(d，J＝7.0Hz，3H)，1.598(d，J＝6.5Hz，3H)，1.669(d，J＝6.9Hz，3H)，1.923-2.280(m，9H)，3.057(m，1H)，3.266(m，1H)，3.564(d，J＝14.5Hz，1H)，3.761(dd，J＝13.7Hz，1H)，3.840(m，1H)，4.049(m，1H)，4.109(m，1H)，4.164(m，1H)，4.202(m，1H)，4.410(m，1H)，4.484(m，1H)，4.616(dd，J＝6.7，13.6Hz，1H)，4.656(m，1H)，4.669(dd，J＝7.0，13.9Hz，1H)，4.780(d，J＝13.0Hz，1H)，4.921(m，1H)，5.144(dd，J＝9.6Hz，1H)，5.281(m，1H)，5.363-5.426(m，3H)5.362(s，1H)，5.989(d，J＝9.8Hz，1H)，6.323(m，1H)，7.122(m，1H)，7.180(m，1H)，7.381(m，1H)，7.596(m，1H)，7.671-7.925(m，6H)，8.036(br s，1H)，8.208(m，3H)，8.412(m，1H)，8.551(d，J＝3.6Hz，1H)，8.714(m，2H)，8.794(m，1H)，10.298(br s，1H)，10.938(br s，1H)。

¹⁹F-NMR(吡啶，400MHz，方法24)：TFA＜检测限。

实施例8

(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素三-D-酒石酸盐

离子交换剂的老化：将5g的DOWEX 1X8 400(HCl盐)用1M氢氧化钠溶液洗涤直到洗出液具有碱性反应。接着用2柱体积的水洗涤并然后用1M的D-酒石酸洗涤直到洗出液具有酸性反应。接着用水洗涤直到洗出液是中性的(Macherey & Nagel Tritest)。

然后将100mg(59μmol)的实施例2溶解在10ml的水中并装载到所述柱上。随后用数个部分的约10ml的水进行洗涤。前体仅很少溶解并且部分保留在所述柱上。将含有产物的洗出液级分合并并冷冻干燥。获得57mg(31μmol，理论的52％)产物。¹H-NMR光谱积分指示(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素：D-酒石酸的化学计量为1∶3。

HPLC(方法9)：R_t＝3.29min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.37min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝671.7(100)[M+2H]²⁺，1341.9(20)，[M+H]⁺。

¹H-NMR(500MHz，d₅-吡啶)：δ＝-0.172(s，9H)，0.597(d，J＝6.3Hz，3H)，0.776(d，J＝5.7Hz，3H)，0.924(d，J＝5.8Hz，3H)，0.954-0.997(m，6H)，1.173(d，J＝5.7Hz，3H)，1.303(m，2H)，1.434(d，J＝5.7Hz，3H)，1.468(m，1H)，1.632(m，1H)，1.972(m，2H)，2.051(1H，m)，2.174(m，3H)，2.402(m，3H)，3.129(m，1H)，3.305(m，1H)，3.602(d，J＝15.2Hz，1H)，3.799(dd，J＝14.6Hz，1H)，3.893(d，J＝12.3Hz，1H)，3.967(m，1H)，4.228(m，1H)，4.276(m，1H)，4.409(m，1H)，4.468(m，1H)，4.578-4.669(m，4H)，4.791(d，J_α，β＝11.5Hz，1H)，5.044(m，1H)，5.226(dd，J＝9.4Hz，1H)，5.190(m，1H)，5.362(s，1H)，5.417(s，6H)，5.997(d，J＝9.7Hz，1H)，6.403(dd，J＝8.9Hz，1H)，7.182(m，1H)，7.551-8.210(m，13H)，8.589(d，J＝3.6Hz，1H)，8.711(d，J＝10.0Hz，1H)，8.782(m，2H)，9.902(br s，1H)，10.358(m，1H)，10.882(br s，1H)，11.093(br s，1H)。

实施例9

(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素

将结合聚合物的碳酸氢盐PL-HCO₃(Polymer Labs，容量1.8mmol/g)装填到柱上。将396mg(相当于12当量的碳酸氢盐)的树脂用于反应100mg(59μmol)的实施例2的化合物。将树脂用吡啶洗涤。然后将吡啶(0.75ml)中的实施例2(100mg，59μmol)的溶液放到所述柱上并缓慢洗脱。首先用另外的吡啶(2ml)并然后用水(约2ml)洗涤所述柱。合并全部洗出液并在油泵真空下无热量输入的情况下浓缩。将玻璃态的残余物溶解在数滴水并立即冷冻。获得作为无色无定形粉末的标题化合物。

HPLC(方法9)：R_t＝3.30min。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.49min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝671.8(100)[M+2H]²⁺，1341.9(10)，[M+H]⁺，MS(ESIneg)：m/z(％)＝669.9(100)[M-2H]^2-，1340.0(100)M-H]^-。

¹⁹F-NMR(吡啶，400MHz，方法24)：TFA 2.9％。

实施例10

(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素甲磺酸盐三氟乙酸盐

可以在RT通过将实施例3从掺TFA的水中再结晶(所述溶液的缓慢蒸发)获得作为结晶物质的标题化合物。

LC-MS(方法6)：R_t＝1.41min，MS(ESIpos.)：m/z(％)＝671.9(100)[M+2H]²⁺，1342.1(10)，[M+H]⁺，MS(ESIneg)：m/z(％)＝669.9(100)[M-2H]^2-，1340.1(80)M-H]^-。

HR-TOF-MS(方法1)：C₆₀H₉₇N₁₆O₁₇Si[M+H]⁺计算值1341.6982，实测的1341.7006。

通过单晶X-射线结构分析证实所述结构和盐的形式。

B.生理活性的评价

可以在下列测定中显示本发明化合物的体外活性：

最低抑制浓度(MIC)的测定：

根据NCCLS准则在液体稀释试验中测定MIC。将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)133、屎肠球菌(E.faecalis)27159、粪肠球菌(E.faecium)4147和肺炎链球菌(S.pneumoniae)G9a的过夜培养物在1∶2的稀释系列中与所述的测试物质温育。用Isosensitest培养基(Difco，Irvine/USA)中每ml细胞数为10⁵微生物进行MIC测定，除肺炎链球菌在含有10％牛血清的BHI肉汤(Difco，Irvine/USA)中以每ml细胞数为10⁶微生物以外。将所述培养在37℃温育18-24小时，肺炎链球菌在10％CO₂的存在下。

将不再有可见的细菌生长发生的每种情况中的最低物质浓度定义为MIC。MIC的值以μg/ml报道。

在表A中显示了本发明化合物的典型体外活性数据和f_u数据：

表A

实施例号	MIC金黄色葡萄球菌133(S.aureus 133)[μg/ml]	MIC肺炎链球菌(S.pneumoniae)G9a[μg/ml]	MIC粪肠球菌(E.faecium)L4001[μg/ml]	MIC屎肠球菌(E.faecalis)ICB 27159[μg/ml]	f_u(大鼠)[％]
实施例号	MIC金黄色葡萄球菌133(S.aureus 133)[μg/ml]	MIC肺炎链球菌(S.pneumoniae)G9a[μg/ml]	MIC粪肠球菌(E.faecium)L4001[μg/ml]	MIC屎肠球菌(E.faecalis)ICB 27159[μg/ml]	f_u(大鼠)[％]	2	0.125	0.125	1	0.5	12.3
3	0.5	0.125	1	0.5	--	2	0.125	0.125	1	0.5	12.3
3	0.5	0.125	1	0.5	--	4	0.25	0.125	--	1	6.1
5	0.5	0.5	1	1	8.6	4	0.25	0.125	--	1	6.1
5	0.5	0.5	1	1	8.6	6	＜0.063	＜0.063	--	1	--
7	0.063	0.125	--	1	--	6	＜0.063	＜0.063	--	1	--
7	0.063	0.125	--	1	--	8	0.25	0.125	--	2	--
1A	0.5	0.063	0.5	0.5	0.67	8	0.25	0.125	--	2	--

可以在下列动物模型中显示本发明化合物对于细菌感染治疗的适合性：

用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)133的全身感染：

将金黄色葡萄球菌(S.aureus)133的细胞在BHI肉汤(Oxoid，New York/USA)中过夜生长。将过夜的培养物在新鲜BHI肉汤中1∶100稀释并温育3小时。将当时在对数生长期中的细胞离心出并用缓冲的生理盐水洗涤两次。然后将盐水中的细胞悬浮液光度测定地调节到50单位的消光(extinction)。在稀释步骤(1∶15)后，将所述悬浮液与10％粘蛋白溶液1∶1混合。腹膜内给药0.25ml/20g小鼠的该感染溶液(相当于1×10⁶微生物/小鼠)。在感染后30分钟在腹膜内或静脉内发生治疗。将雌性CFW1小鼠用于感染实验。在6天的时期内记录所述动物的存活率。

可以在下列动物模型中显示本发明化合物关于肾耐受性的性质：

用于确定肾中毒作用的小鼠模型：

在多次具体剂量给药后，通过小鼠肾的组织病理学检查来分析九酯肽类的肾中毒副作用。为此，用溶解在水溶液中或加入Solutol的物质，每天或者静脉内(i.v.)或者腹膜内(i.p.)处理5-6个动物。通过肾的苏木精和曙红(H&E)染色的石蜡切片的光学显微镜评价来确定肾中毒的作用。任选进行一种‘高碘酸Schiff’(PAS)反应用于糖蛋白的更好目测。对于每一个动物，将肾中毒的作用半定量地限定为管形嗜碱粒细胞增多(basophila)和退化/再生发生的严重程度(严重程度：0＝无效；1＝最小作用；2＝轻度作用；3＝中度作用；4＝急性损伤)。管形退化/再生和发病率(影响的动物的数目)的平均严重程度是对于每一动物组或衍生物计算的。同样列出了超出此程度的肾改变，诸如管形膨胀和坏死还有坏死材料的累积。

用于确定肾中毒效果的大鼠模型：

在多个具体剂量给药后，通过大鼠肾的组织病理学检查九酯肽类的肾中毒副作用。为此，用溶解在盐水或Ringer’s乳酸盐溶液中的物质每天静脉内(i.v.)处理5个动物。通过肾的苏木精和曙红(H&E)染色的石蜡切片的光学显微镜评价确定肾中毒的效果。任选进行一种‘高碘酸Schiff’(PAS)反应用于糖蛋白的更好目测。对于每一个动物，将肾中毒的效果半定量限定为管形嗜碱粒细胞增多和退化/再生发生的严重程度(严重程度：0＝无效；1＝最小效果；2＝轻度效果；3＝中度效果；4＝急性损害)。管形退化/再生和发病率(影响的动物的数目)的平均严重程度是对于每一动物组或衍生物计算的。同样列出了超出此程度的肾改变，诸如管形膨胀和坏死还有坏死材料的积累。

经由Transil确定自由级分的原理：

这里描述的用于确定测试物质的自由级分(f_u)的方法分成2部分：

a)通过将所述测试物质温育在Transil^缓冲液(pH 7.4)分散体中并随后测定在所述分散体中和在缓冲液上清液中的浓度确定Transil^/缓冲液分配比(MA_缓冲液)。

b)通过将所述测试物质温育在Transil^血浆分散体中并随后测定在所述分散体中和在血浆中的浓度确定Transil^/血浆分配比(MA_血浆)。

所述两个分配比的商得到f_u。

在物质是高度蛋白质-结合的情况下，通常用等渗压的磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释所述血浆并然后用Transil^悬浮。以类似于f_u的测定进行该稀释的蛋白质溶液中的f_u′(稀释的血浆中的自由级分)的测定。由f_u′和稀释因子计算未稀释血浆中的自由级分。

关于该方法，也可以比较：Schuhmacher，Joachim；Kohlsdorfer，Christian；Buehner，Klaus；Brandenburger，Tim；Kruk，Renate，“High-throughputdetermination of the free fraction of drugs strongly bound to plasmaproteins.“Journal of Pharmaceutical Sciences 2004，93，816-830。

在Transil^和缓冲液之间的分配之后测定测试物质的膜亲和性(MA_缓冲液)：

全部温育在适合的玻璃容器中进行，例如玻璃小瓶、磨口连接的试管。总体积通常是0.5-5ml，并且Transil^体积是10-100μl。如果期望所述膜亲和性高，则可以将Transil^分散体用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释达到20倍，例如用Dulbecco’s PBS。将pH 7.4的磷酸盐缓冲液提供在温育容器中，并且在充分混合后吸入Transil^。例如以200ng/ml，n＝6的浓度吸入所述测试物质。有机溶剂的比例应当是≤2％。即，将所述混合物在室温下在小型振荡器上以大约45°的角度，以大约400rpm温育30min。通过取至少一个等分部分，例如，100μl，测定100％值，并且将残留的混合物在约1800g离心约10min。从每个样品取至少2个等分部分(例如100μl)的上清液用于浓度测定。

未稀释的或稀释血浆中MA_血浆的测定：

总温育体积和加入Transil^的体积取决于期望的自由级分。总体积通常是0.5-1ml，并且Transil^体积是10-100μl。如果所述自由级分非常低，则将要研究物种的血浆用等渗的缓冲溶液pH 7.4稀释例如10-400倍，并然后加入Transil^。随后步骤如上关于测定MA_缓冲液值所述。

经由超滤测定自由级分的原理：

通过半透膜过滤要研究物种的血浆。测量滤液中物质的浓度，并且从那里计算自由级分f_U。使用来自Millipore/Amicon的Centrifree微分配系统。超滤膜具有排阻大小为30 000Da。将浓度约为1μg/ml的所述物质掺入1ml血浆。溶剂的比例应当是＜2％。在室温下温育30分钟后，将所述血浆移液到超滤系统中并在1800g离心10分钟。测量超滤液中物质的浓度(C_u，未结合的物质浓度)和离心前血浆中物质浓度(C；总物质浓度)。通过公式f_u(％)＝C_u/C*100计算自由级分。

C.药物组合物的例举性实施方案

本发明的化合物可以以下列方式转化成药物制剂：

片剂：

组成：

100mg实施例1的化合物，50mg乳糖(一水合物)，50mg玉米淀粉(天然的)，10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(BASF，Ludwigshafen，德国)和2mg硬脂酸镁。

片剂重量212mg。直径8mm，曲率半径12mm。

制备：

将活性成分、乳糖和淀粉的混合物用水中的5％PVP溶液(m/m)造粒。将所述粒剂干燥然后与硬脂酸镁混合5分钟。将该混合物用常规压片机挤压(参见上面用于片剂的形式)。用于压缩的压缩力指标是15kN。

可以口服给药的混悬剂：

组成：

1000mg实施例1的化合物，1000mg乙醇(96％)，400mg的Rhodigel(来自FMC的黄原胶，宾夕法尼亚，USA)和99g水。

10ml的口服混悬剂对应于100mg本发明化合物的单一剂量。

制备：

将Rhodigel悬浮在乙醇中，并将所述活性化合物加入到所述悬浮液。搅拌的同时加入水。将所述混合物搅拌约6h直到Rhodigel的溶胀是完全的。

可以静脉内给药的溶液剂：

组成：

100-200mg实施例1的化合物，15g聚乙二醇400和250g注射用水。

制备：

在搅拌下将实施例1的化合物和聚乙二醇400溶解在水中。通过过滤(孔径0.22μm)将所述溶液消毒并在无菌条件之下分配到热灭菌的输液瓶中。将后者用输注塞和卷曲帽封闭。

Claims

1.下式的化合物，

其中

R¹表示氢，并且

R²表示2，2-二甲基丁-1-基、2-乙基-2-甲基丁-1-基、2，2-二乙基丁-1-基、2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，

或

R¹表示三氟甲基，并且

R²表示2，2-二甲基丙-1-基、2，2-二甲基丁-1-基、2-乙基-2-甲基丁-1-基、2，2-二乙基丁-1-基、2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，

或它的盐、它的溶剂合物或它的盐的溶剂合物中的一种。

2.根据权利要求1的化合物，其特征在于

R¹表示氢，并且

R²表示2，2-二甲基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，

或

R¹表示三氟甲基，并且

R²表示2，2-二甲基丙-1-基、2，2-二甲基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基。

3.根据权利要求1的化合物，其特征在于

R¹表示氢，并且

R²表示2，2-二甲基丁-1-基、2-乙基-2-甲基丁-1-基、2，2-二乙基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基。

4.根据权利要求1的化合物，其具有下列结构

3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脱(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶杆菌素，

或它的盐、它的溶剂合物或它的盐的溶剂合物中的一种。

5.制备根据权利要求1的式(I)化合物的方法，其特征在于将下式的化合物

与下式的化合物反应，

其中

R¹和R²具有权利要求1中指出的含义，并且

X¹表示卤素，优选溴、氯或氟，或者羟基。

6.用于治疗和/或预防疾病的根据权利要求1至4任一项的化合物。

7.根据权利要求1至4任一项的化合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求1至4任一项的化合物在制备用于治疗和/或预防细菌感染的药物中的应用。

9.药物，其含有与惰性的、非毒性的药用赋形剂组合的根据权利要求1至4任一项的化合物。

10.根据权利要求9的药物，其用于治疗和/或预防细菌感染。

11.用于在人和动物中控制细菌感染的方法，其中施用抗菌有效量的根据权利要求1至4任一项的至少一种化合物、根据权利要求9的药物或根据权利要求7或8获得的药物。