CN109957026A - 共价多特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有较高的稳定性的新型共价多特异性抗体及其治疗用途，例如，在免疫疗法中的应用。

Description

共价多特异性抗体

技术领域

本发明涉及具有较高的稳定性的新型共价多特异性抗体及其治疗用途，例如，用于免疫疗法。

背景技术

单克隆抗体(mAb)在针对癌症和其他疾病的临床实际应用方面具有广泛的诊断和治疗潜力。无论是以裸抗体的形式还是以与细胞毒性剂(例如，放射性同位素，药物，毒素或前药转化酶)结合的偶联物的形式，单克隆抗体均在癌症免疫疗法中发挥重要作用。这些方法均处于疗效评估过程中，具有不同程度的发展并获得不同程度的临床成功。裸mAb可通过在与癌细胞上过表达的细胞表面蛋白结合之后诱导细胞毒性作用而实现临床反应。已有研究表明，通过经由程序性细胞死亡(凋亡)来控制肿瘤生长或通过诱导抗肿瘤免疫反应来实现这些治疗作用。

由于抗体的特异性靶向并介导效应子功能这一独特性质，自1975年CesarMilstein和Georges J.F.Kohler的单克隆抗体技术的发明以来，已研发出用作针对疾病的靶向免疫疗法的药物的抗体。目前已有超过60个被批准的基于抗体的生物药物，其全球年销售额超过50亿美元。当代抗体药物的成功应用已形成了药物产业并使得公共健康得到了很大改善。除了针对新型靶点的抗体药物的研发之外，最优的联合疗法和创新性的双特异性抗体的研发也有着广阔的前景。

治疗性抗体已在临床应用超过20年。目前，临床使用的抗肿瘤抗体药物包括：美罗华(Rituxan(1997))，赫赛汀(Herceptin(1998))，Mylotarg(2000)，Campath(2001)，Zevalin(2002)，Bexxer(2003)，阿瓦斯汀(Avastin(2004))，爱必妥(Erbitux(2004))，Vectibix(2006)；Arzerra(2009)；Benlysta(2011)；Yervoy(2011)；Adcetris(2011)；Perjeta(2012)；Kadcyla(2013)，Opdivo(2014)，Keytruda(2014)，Tecentriq(2016)。这些抗体主要靶向EGFR，Her2，CD20或VEGF，以及最近发现的PD1或PD-L1。

多功能抗体是基于传统抗体通过复杂的设计和分子工程而构建的，其具有多抗原结合能力。从实际应用方面来说，单个多功能抗体分子所产生的治疗效果与若干个传统抗体的组合所产生的治疗效果相同。然而，多功能抗体的优势远超过了若干个传统抗体的简单叠加。通过新的且独一无二的机理，所选择的多个靶点的同时接合可产生优于传统抗体的有益作用。例如，靶向CD3和CD19的博纳吐单抗(Blinatumomab，CD3xCD19，Amgen)在杀伤表达CD19的肿瘤细胞方面可通过其CD3-识别Fv而有效接合T细胞，其在ALL(急性淋巴性白血病)等适应症上展现出了超越传统抗体的显著疗效。博纳吐单抗已于2014年被美国FDA批准上市用于治疗ALL。

已开发了多种双特异性抗体技术平台，包括：BITE(Bispecific T-cellengaging，Micromet公司研发，2012年micromet公司被Amgen整体收购)、CrossMab(Roche)、DVD-Ig(Abbvie)、TandAb(Affimed)、DART(Dual Antigen Re-Targeting，Macrogenics)、DuoBody(Genmab)等平台。这些平台所采用的构建方法各不相同，也各有其优缺点：BITE平台尽管具有很高的活性但是稳定性较差，易于聚集；CrossMab平台采用复杂的方法进行抗体构建并且需要根据不同母抗体的特性进行突变调整；DVD-Ig抗体的近端Fv无法进行膜蛋白结合，只能进行可溶性抗原结合；TandAb平台产生两条链仅通过VH-VL相互作用(通过在界面处形成疏水核)连接的抗体，虽然抗体在体外具有非常高的活性，但是，它们一旦进入体内由于双链的解离而迅速失活，半衰期短。此外，较高比例的错配也是一些双特异性抗体平台的普遍问题。因此无法采用传统的经典抗体纯化流程，这给抗体的下游工艺开发带来了诸多困难。而且，在大多数情况下，双特异性抗体的构建损害了抗体对单一抗原的二价结合能力，因此在不同程度上降低了抗体对抗原的选择性和亲和力。

双特异性抗体通过化学交联、杂交-杂交瘤或转染瘤，或在两个不同的Fab’的铰链处进行二硫化物的交换而产生。第一种方法生成异源性且难以界定的产品。第二种方法需要对由多种杂交抗体副产物得到的双特异性抗体进行大量纯化，该纯化步骤可能会影响细胞交联活性。二硫化物交换方法实质上仅仅应用于F(ab’)₂并且因此受到单克隆抗体易受到酶消化裂解的影响的限制。而且，因为Fab’彼此几乎没有亲和性，所以，形成Fab’间二硫键需要非常高的蛋白质浓度。二硫化物交换方法已通过使用Ellman试剂进行了改良，以在氧化前采用Fab’中的一个修饰另一个，这样，降低了同源二聚化的发生。然而，即便进行了这样的改良，在高于50％的产率中，异二聚F(ab’)₂也鲜有产生。

然而，不利的安全问题，低反应速度和有限的有效性是目前抗体药物的现状。这些不利因素可能来自于由于抗体的表位来自自身抗原而产生的对正常组织/细胞的非靶效应，免疫效应子细胞的抑制性微环境，未预料到的Fc介导的效应子功能，等等。因此，本领域仍然亟需有效生成高纯度的双特异性抗体的改进方法。

发明内容

一方面，本发明提供工程化抗体，其包含：(i)第一多肽，其包含与第一靶点结合的第一轻链可变结构域(VL1)和与第二靶点结合的第二重链可变结构域(VH2)，其中，VL1与VH2共价连接，以及(ii)第二多肽，其包含与所述第二靶点结合的第二轻链可变结构域(VL2)和与所述第一靶点结合的第一重链可变结构域(VH1)，其中，VL2和VH1共价连接，并且，其中，VL2和VH2共价连接，并且，其中，VL2和VH2均包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体的形成是静电学上不利的。

在一些实施方式中，VL1的C端与VH2的N端共价连接，并且，VL2的C端和VH1的N端共价连接。在一些实施方式中，VL1的N端和VH2的C端共价连接，VL2的N端和VH1的C端共价连接。

在一些实施方式中，VL1通过第一肽连接体与VH2连接，并且，其中，VL2通过第二肽连接体与VH1连接。在一些实施方式中，所述第一肽连接体和所述第二肽连接体分别独立地包含5至9个氨基酸。

在一些实施方式中，VL2和VH2通过二硫键共价连接。在一些实施方式中，VL2的FR和VH2的FR通过二硫键共价连接。

在一些实施方式中，VL2的FR的残基中的至少一个，优选仅仅一个，被带负电荷的氨基酸取代，并且VH2的FR的残基中的至少一个，优选仅仅一个，被带正电荷的氨基酸取代。在一些实施方式中，VL2的FR的残基中的至少一个，优选仅仅一个，被带正电荷的氨基酸取代，并且VH2的FR的残基中的至少一个，优选仅仅一个，被带负电荷的氨基酸取代。在一些实施方式中，带负电荷的氨基酸是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，并且，带正电荷的氨基酸是赖氨酸(K)或精氨酸(R)。

在一些实施方式中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的铰链区。

另一方面，本发明提供工程化抗体，其包含本文提供的抗体的二聚体，并且所述二聚体的每个单元通过铰链区连接。

在一些实施方式中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至Fc区域。在一些实施方式中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至白蛋白或PEG。

又一方面，本发明提供工程化抗体，其包含：(i)第一多肽，其包含与第二靶点结合的第二轻链可变结构域(VL2)和与第一靶点结合的第一重链可变结构域(VH1)，其中，VL2与VH1共价连接；(ii)第二多肽，其包含与所述第一靶点结合的第一轻链可变结构域(VL1)，与所述第二靶点结合的第二重链可变结构域(VH2)，铰链结构域和IgG的CH2-CH3结构域，其中，VL1与VH2共价连接；(iii)第三多肽，其包含结合第三靶点的第三重链可变结构域(VH3)，CH1结构域，含有半胱氨酸的铰链结构域和IgG的CH2-CH3结构域；以及(iv)第四多肽，其包含结合所述第三靶点的第四轻链可变结构域(VL3)和含有半胱氨酸的CL结构域；其中，VL1和VH1结合形成能够结合所述第一靶点的结构域；其中，VL2和VH2结合形成能够结合所述第二靶点的结构域；其中，VL3和VH3结合形成能够结合所述第三靶点的结构域；其中，VL2和VH2通过二硫键共价连接，其中，VL2和VH2独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；其中，CH1和CL通过二硫键共价连接；其中，所述第二多肽链和所述第三多肽链通过铰链结构域和CH3结构域共价连接。

在一些实施方式中，VL2的C端与VH1的N端共价连接，并且VL1的C端与VH2的N端共价连接。

在一些实施方式中，VL2的N端与VH1的C端共价连接，并且VL1的N端与VH2的C端共价连接。

在一些实施方式中，所述第三靶点和所述第一靶点是相同的靶点。在一些实施方式中，所述第三靶点和所述第二靶点是相同的靶点。

在一些实施方式中，所述第二多肽的CH2-CH3结构域和所述第三多肽的CH2-CH3结构域是不同的。在一些实施方式中，通过在每个结构域上采用不同的突变对CH3结构域的界面进行修饰对所述第二多肽和所述第三多肽进行工程化。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Trp取代Thr366，并且另一个CH3结构域包含Ser，Ala和Val分别取代Thr366，Leu368和Tyr407。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Lys取代Asp399和Glu356，并且另一个CH3结构域包含Asp取代Lys392和Lys409。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Lys取代Glu356，Glu357和Asp399，并且，另一个CH3结构域包含Glu，Asp和Glu分别取代Lys370，Lys409和Lys439。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含His和Ala分别取代Ser364和Phe405，并且，另一个CH3结构域包含Thr和Phe分别取代Tyr349和Thr394。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Asp取代Lys370和Lys409，并且，另一个CH3结构域包含Lys取代Glu357和Asp399。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Asp和Glu分别取代Leu351和Leu368，并且，另一个CH3结构域包含Lys取代Leu361和Thr366。

另一方面，本发明提供使用本文提供的抗体治疗有此治疗需求的受治者的方法。

在一些实施方式中，在停止所述治疗之后，所述治疗在个体体内产生持续反应。

在一些实施方式中，连续施用免疫疗法，间接性施用免疫疗法。

在一些实施方式中，所述个体患有结肠直肠癌，黑色素瘤，非小细胞肺癌，卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，恶性血液肿瘤或肾细胞癌。

在一些实施方式中，所述抗体静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、局部给药、口服给药、透皮给药、腹膜内给药、眼眶内给药、通过植入给药、通过吸入给药、鞘内给药、心室内给药或鼻内给药。

在一些实施方式中，本发明的治疗组合或药物组合物还包含有效量的其他治疗剂，例如，抗癌剂。

在一些实施方式中，所述抗癌剂是抗代谢剂、I型和II型拓扑异构酶抑制剂、烷基化剂、微管抑制剂、抗雄激素剂，GNRh调节剂或它们的混合物。

在一些实施方式中，所述其他的治疗剂是化疗剂，其选自：他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，阿那曲唑(anastrozole)，依西美坦(exemestane)，来曲唑(letrozole)，伊马替尼(imatanib)，紫杉醇(paclitaxel)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，洛伐他汀(lovastatin)，含羞草素(minosine)，吉西他滨(gemcitabine)，阿糖胞苷(cytarabine)，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，多西他赛(docetaxel)，戈舍瑞林(goserelin)，长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，诺考达唑(nocodazole)，替尼泊苷(teniposide)，依托泊苷(etoposide)，吉西他滨，埃博霉素(epothilone)，长春瑞滨(vinorelbine)，喜树碱(camptothecin)，柔红霉素(daunorubicin)，放线菌素D(actinomycin D)，米托蒽醌(mitoxantrone)，吖啶(acridine)，阿霉素(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)或去甲氧基柔红霉素(idarubicin)。

另一方面，本发明提供治疗有此治疗需求的受治者体内的疾病病症的方法，所述方法包含将本文提供的治疗组合或药物组合物给药于所述受治者。

在一些实施方式中，所述疾病病症是肿瘤。在一些实施方式中，所述疾病病症包含异常细胞增殖。

在一些实施方式中，所述异常细胞增殖包含癌前病变。在一些实施方式中，异常增殖的细胞是癌细胞。

在一些实施方式中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾细胞癌。

又一方面，本发明提供试剂盒，其包含本文提供的治疗组合并且任选地带有说明书。

附图说明

本发明的新特征在所附的权利要求中具体列出。通过参考下文的具体实施方式部分以及附图将会更好地理解本发明的特征和优势，下文的具体实施方式部分列出了示例性的实施方式，其中应用了本发明的原理，本发明的附图如下：

图1以图解结构的形式显示了两种形式的DICAD。A型：VL1的C端和VH2的N端通过连接体连接形成第一多肽，并且，VL2的C端和VH1的N端通过连接体连接形成第二多肽。B型：VH2的C端和VL1的N端通过连接体连接形成第一多肽，并且，VH1的C端和VL2的N端通过连接体连接形成第二多肽。

图2A至图2C显示了DICAD的元件结构。图2A：用于构建DICAD的抗体可变结构域。图2B：第一多肽和第二多肽的实例。图2C：与二硫键和所引入的带电荷的氨基酸相关的DICAD中四个主要的可变结构域的结构。

图3A至图3E图示显示了带有Fc结构域(A和B)的DICAD的结构以及经典抗体(C)的结构，双价抗体异源二聚体的结构(D)和scDb(单链双价抗体)的结构(E)，其中，使用15个氨基酸的肽将一个链的C端连接至另一个链的N端。

图4A图示显示了A型的TRIAD(三特异性抗体)的结构以及TRIAD(A型)的四个多肽的结构。图4B图示显示了B型TRIAD(三特异性抗体)的结构和TRIAD(B型)的四个多肽的结构。图4C以图解结构的形式显示了两种形式的具有作为N段至C端的序列的TRIAD。A型：第一多肽：VL2，连接体，VH1；第二多肽：VL1，连接体，VH2，铰链区，CH2和CH3；第三多肽：VH3，CH1，铰链区，CH2和CH3；第四多肽：VL3和CL。B型：第一多肽：VH2，连接体，VL1；第二多肽：VH1，连接体，VL2，铰链区，CH2和CH3；第三多肽：VH3，CH1，铰链区，CH2和CH3；第四多肽：VL3和CL。

图5显示了可被改变为二硫键以修饰VH-VL界面处的静电相互作用的氢键的位置。

图6A和图6B显示了通过LDH测量的抗体4，抗体9，抗体25和抗体49对带有Jurkat的Raji的细胞毒性作用。图6A：中空方形：抗体25；实心圆：抗体4；实心方形：抗体9。图6B：实心圆：抗体25；实心方形：抗体49。

图7显示了通过LDH释放分析的由TRIAD抗体50和54介导的Jurkat细胞对Raji细胞的细胞毒性作用。实心圆：抗体#54，实心三角形：抗体#50。

图8显示了用于Raji杀伤分析的门控策略，用于计算剩余的CFSE染色的Raji细胞的绝对数量。

图9A至图9C显示了抗体介导的PBMC，CD4+和CD8+对Raji细胞的细胞毒性作用，其显示为在共孵育4小时(图9A)，20小时(图9B)和40小时(图9C)之后由浓度为0pM、1pM和100pM的抗体#25诱导的经历了细胞凋亡的Raji细胞的百分数。

图10A至图10C显示了抗体介导的PBMC，CD4+和CD8+对Raji细胞的细胞毒性作用，其显示为在共孵育4小时(图10A)，20小时(图10B)和40小时(图10C)之后由浓度为0pM、1pM和100pM的抗体#25诱导的杀伤作用的倍数，对于每个细胞组(PBMC等)而言，不带抗体(浓度＝0)的样品用作对照，因此，倍数＝1。

图11显示了抗体介导的PBMC，CD4+和CD8+对Raji细胞的细胞毒性作用，其显示为共孵育4小时，20小时和40小时之后由浓度为0pM、1pM和100pM的抗体#25诱导的杀伤之后剩余的活Raji细胞的绝对计数。

图12显示了抗体介导的PBMC，CD4+和CD8+对Raji细胞的细胞毒性作用，其显示为共孵育4小时，20小时和40小时之后由浓度为0pM、1pM和100pM的抗体#25诱导的LDH分泌。

图13显示了通过肿瘤体积所测量的抗体对Nod-SCID小鼠体内的Jeko-1异种移植物模型的肿瘤抑制作用。空心圆：载剂，静脉注射，每周两次持续三周；空心三角形(向上)：抗体49，0.5mg/kg静脉注射，每天一次持续10天；空心三角形(向下)：抗体1，0.5mg/kg静脉注射，每周两次持续三周；空心菱形：抗体25，0.5mg/kg静脉注射，每周两次持续三周；实心菱形：抗体50，0.5mg/kg静脉注射，每周两次持续三周；实心方形：抗体54，0.5mg/kg静脉注射，每周两次持续三周。

具体实施方式

本发明的若干方面在下文参考用于举例说明的示例性的应用进行描述。应当理解的是，举例说明了很多具体细节，相互关系和方法以提供对本发明的全面理解。然而，本领域技术人员将会理解的是，本发明可在不采用具体细节中的一个或多个细节的条件下或采用其他方法的条件下实施。本发明不受到举例说明的操作或事件的顺序的限制，因为，一些操作可以不同的顺序进行和/或与其他操作或事件同时进行。

而且，在实施根据本发明的方法时并不需要所有举例说明的操作或事件。

本文使用的术语仅仅意在描述特定实施方式并且无意限定本发明。除非另有明确说明，本文使用的单数形式的“a”，“an”和“the”还意在包括复数形式。此外，术语“包括(including，includes)”，“具有(having，has，with)”或其变体用于具体实施方式中和/或权利要求中，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的情况。

术语“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定数值的可接受的误差范围内，其部分取决于如何测量或确定该数值，即，测量系统的限制。例如，在本领域中，“大约”可意味着每次操作在一个或大于一个标准差范围内。可选地，“大约”可意味着给定值的高达20％的范围，优选地高达10％的范围，更优选地高达5％的范围，以及尤为优选地高达1％的范围。可选地，尤其对于生物系统或过程而已，该术语可意味着在某个数值的某一数量级范围内，优选地5倍范围内，更优选地2倍范围内。在申请文件和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，可假设术语“大约”意味着在特定值的可接受的误差范围内。

I.释义和缩写

除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。总体而言，本文使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室操作规程是本领域熟知的并且在本领域中普遍使用。将标准技术用于核酸和肽的合成。总体上，根据本领域的常规方法和本文中所提供的各种常规参考文献执行技术和操作规程。本文使用的命名法和下文描述的分析化学以及有机化学的实验室操作是本领域熟知的并且在本领域中普遍使用。将标准技术或其改良用于化学合成和化学分析。

虽然本发明的各个特征可在单个实施方式中描述，但是这些特征也可分开提供或以任何合适的组合提供。相反，虽然为了清楚起见可在各个实施方式中描述本发明，但是本发明还可在单个实施方式中实施。

说明书中的“一些实施方式”、“实施方式”、“一种实施方式”或“其他实施方式”是指与包括在至少一些实施方式中的实施方式相关而描述的特定特征、结构或特性，但是无需是本文公开的全部实施方式。

本文使用的范围或数量可表达为“约”特定数值或范围。“约”还包括确切数量。因此，“约5μL”是指“约5μL”并且也是指“5μL”。总体而言，术语“约”包括预计在实验误差范围内的数量。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，是指通过肽键彼此连接的氨基酸残基的线性序列，其包括蛋白质、多肽、寡肽、肽及其片段。所述蛋白质可由天然生成的氨基酸构成和/或由合成的(例如，改良的或非天然生成的)氨基酸构成。因此，本文使用的“氨基酸”或“肽残基”是指天然生成的氨基酸和合成的氨基酸这两者。术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”包括融合蛋白，其包括但不限于：带有异源氨基酸序列的融合蛋白，带有异源和同源前导序列的融合蛋白，带有或不带有N末端蛋氨酸残基的融合蛋白，免疫标记的蛋白，带有可检测的融合搭档的融合蛋白，例如，包括作为融合搭档的荧光蛋白，β-半乳糖苷酶，荧光素酶等的融合蛋白，等等。而且，应当注意的是，在氨基酸残基序列的起始和结束处的虚线表示肽键连接至一个或多个氨基酸残基的其他序列或共价键连接至羧基或羟基末端基团。然而，没有虚线不应当被认为意味着不存在这样的肽键或共价键结合至羧基或羟基，因为这是通常表达氨基酸序列的方式而省略这种虚线。

本文中的“核酸”是指DNA或RNA，或包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的分子。核酸可以是天然生成的多肽或合成的多肽，并且由此包括其中一个或多个核苷酸相对于天然生成的核苷酸进行修饰的天然生成的多肽的类似物。

术语“偶联”和“连接”通常是指化学连接，其是指一个分子与邻近的另一分子连接的共价的或非共价的化学连接。

术语“分离的”是指化合物从本质上带有该化合物的全部组分或一些组分中分离出来。“分离的”也是指在制备(例如，化学合成，重组表达，培养基，等等)过程中化合物从带有该化合物的全部组分或一些组分中分离出来的状态。

术语“纯化的”是指从本质上带有该化合物的组分中分离目标化合物或在制备过程中分离目标化合物并提供该化合物的富集形式。

在本文涉及化合物的上下文中使用的“有效的”或“效力”是指化合物表现出期望的活性的能力。

在涉及诸如肽片段之类的分子的上下文中使用的术语“浓度”是指给定体积中存在的分子的量。在一些实施方式中，分子的浓度以摩尔浓度给出，其中显示出给定体积的溶液中存在的分子的摩尔数。

互换使用的术语“抗原”和“表位”是指由免疫系统的成分(例如，抗体)特异性识别的分子(例如，多肽)的一部分。本文使用的术语“抗原”包括抗原性表位，例如，抗原性表位的抗原片段。

术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，其中，抗体可以是任何感兴趣的类别(例如，IgG，IgM及其亚类)，并且可以是杂交抗体，变异的抗体，F(ab’)₂片段，F(ab)分子，Fv片段，噬菌体上展示的单链可变片段(scFv)，单链抗体，单结构域抗体，双抗体，嵌合抗体，人源化抗体及其片段。在一些实施方式中，抗体的片段可以是功能片段，其表现出母体抗体分子的免疫结合特性。本文描述的抗体可以被例如放射性同位素，产生可检测的产物的酶，荧光蛋白等可检测地标记。感兴趣的是体内成像使用的可检测标记。抗体可进一步偶联至其他实体，例如，细胞毒性分子或其他分子，特异性结合对的成员，等等。

本领域已知典型的抗体结构单元，尤其是当其为全长时，包括四聚物。每个四聚物由两个相同的多肽链对构成，每对多肽链具有一个“轻”链(大约25kD)和一个“重”链(大约50-70kD)。每个链的N末端界定主要对抗原识别产生响应的大约100至110个或更多个氨基酸的可变区域。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。

“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的抗体分子或其片段的一部分。抗原结合位点由N末端可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸残基形成。重链和轻链的可变区域内的三个高度不同的区域被称为“高变区”，其插入被称为“骨架区”或“FR”的更加保守的侧翼区域之间。因此，术语“FR”是指在免疫球蛋白的高变区之间或附近自然发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对应设置以形成抗原结合“表面”。该表面介导靶抗原的识别和结合。每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。CDR主要对抗原表位的结合产生响应。

根据本发明公开的内容的抗体及其片段包含双特异性抗体及其片段。双特异性抗体可能类似于单个抗体(或抗体片段)，但是具有两个不同的抗原结合位点。双特异性抗体可对至少两个不同的表位具有结合特异性。双特异性抗体及其片段还可以是异源抗体的形式。异源抗体是两种或多种抗体，或连接在一起的抗体结合片段(例如，Fab)，每个抗体或其片段具有不同的特异性。

本文还提供抗体偶联物。所述偶联物包括本发明公开的任何抗体以及药剂。所述药剂可选自：治疗剂，造影剂，标记试剂或用于治疗和/或标记目的的试剂。

抗体(或其片段)和特异性抗原(或表位)之间的免疫结合相互作用的强度和亲和性可以相互作用的解离常数(Kn)来表达，其中，较小的Kn代表较高的亲和性。所选择的多肽的免疫结合性质可使用本领域已知的方法进行量化。一种这样的方法包括测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度，其中，那些速度取决于复合物搭档的浓度，相互作用的亲和性和等同地影响两个方向上的速度的几何参数。因此，“结合速率常数(k_on)”和“解离速率常数(k_off)”这两者均通过计算结合和解离的浓度和实际速度确定。Koff/kon的比例能够删除与亲和性不相关的所有参数并且因此等于平衡解离常数KD(参见，Davies等人，Ann.Rev.Biochem.1990，59：439-15 473)。

在涉及表征抗体的上下文中的术语“抗体的特异性结合”或“抗原特异性抗体”是指抗体优先结合不同抗原的混合物中存在的特定抗原的能力。在一些实施方式中，特异性结合相互作用将会区分样品中的理想抗原和不理想抗原(或“靶抗原”和“非靶抗原”)，在一些实施方式中，大于约10倍至100倍或更多倍(例如，高于约1000倍或10,000倍)。在一些实施方式中，当抗体和抗原在抗体抗原复合物中发生特异性结合时，抗体和抗原之间的亲和性由K_D(解离常数)来表征，K_D小于10^-6M，小于10^-7M，小于10^-8M，小于10^-9M，小于10^-10M，小于10^-11M，或小于约10^-12M，或更小。

术语“单克隆抗体”是指具有同源抗体群的抗体组合物。该术语包括整个抗体分子以及Fab分子，F(ab’)₂片段，Fv片段，在噬菌体上展示的单链可变片段(scFv)，包含抗体和非抗体蛋白的抗原结合部分的融合蛋白和表现出母体单克隆抗体分子的免疫结合特性的其他分子。制备和筛选多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域已知的。

术语“衍生物”和“变体”是指任何下述化合物或抗体，但不限于此，所述化合物或抗体具有从本文公开的化合物和抗体衍生得到的结构或序列并且该化合物或抗体的结构/序列充分类似于本文公开的那些结构/序列并且基于该类似性，本领域技术人员可以预见到该化合物或抗体表现出相同或类似的活性并且用作要求保护的和/或所涉及的化合物或抗体，从而也可互换地称为“功能等同物”。获得“衍生物”或“变体”的修饰包括例如，对氨基酸残基中的一个或多个进行添加、删除和/或取代。功能等同物或功能等同物的片段可具有一个或多个保守氨基酸取代。术语“保守氨基酸取代”是指采用具有与原始氨基酸类似的性质的另一氨基酸取代氨基酸。保守氨基酸组是本领域已知的。

保守取代可被引入优选的预先确定的肽或其片段的任何位置。然而，理想的是，引入非保守取代，特别地但不限于在任何一个或多个位置引入非保守取代。例如，形成肽的功能等同片段的非保守取代可在极性、电荷和/或立体位阻方面显著不同，同时保持衍生物或变体片段的功能性。

“序列一致性百分比”通过在比较窗口上将两个最佳对齐的序列进行比较而确定，其中，对于两个序列的最佳比对而言，与参比序列(其不具有添加和删除)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可具有添加或删除(即，空隙)。百分比如下计算：通过确定两个序列中出现的等同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目而得到匹配位置的数目，比较窗口中匹配位置的数目除以总位置数目再乘以100而计算得到序列一致性百分比。

在涉及两个或多个核酸或多肽序列的上下文中的术语“一致的”或百分比“一致性”是指相同的两个或多个序列或亚序列或者具有指定百分比(即，在指定区域(例如，整个多肽序列或多肽序列的单个结构域)中的60％一致性，任选地，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％一致性)的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或亚序列，当在比较窗口上进行最大对应的比较和比对时，“一致的”或百分比“一致性”是使用下述序列比较算法中的一种测量的或通过人工比对和视觉检查所测量的指定区域。这些序列随后称为“基本一致的”。这个定义也涉及测试序列的互补性。任选地，一致性存在于长度为至少约5个至50个核苷酸或多肽序列的区域上，更加优选地，长度为100个至500个或1000个或更多个核苷酸或多肽序列的区域上。

对于序列比较而言，通常一个序列充当被比较的测试序列的参比序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入电脑，随后指定坐标，如果需要的话，指定序列算法程序的参数。可使用默认程序参数或指定可选的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参比序列的百分比序列一致性。

本文使用的“比较窗口”包括涉及选自例如全长序列或20至600个氨基酸或核苷酸，约50至约200个氨基酸或核苷酸，或约100至约150个氨基酸或核苷酸的连续位置数目中的任何一个的片段，其中，在将两个序列进行最佳对齐之后，序列可与相同数目的连续位置的参比序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域已知的。用于比较的序列最佳比对可通过例如Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482(1970))，Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J Mol.Biol.48：443(1970))，Pearson和Lipman的检索类似性方法(Proc.Natl.Acad Sci.USA 85：2444(1988))，计算机实施这些算法(Wisconsin基因学软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)或人工比对和视觉检查(参见，例如，Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(1995增补版))进行。

适用于确定百分比序列一致性和序列类似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其在Altschul等人的文章(Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402，和Altschul等人，(1990)J Mol.Biol.215：403-410)中描述。用于执行BLAST分析的软件公众可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取。

本文可互换使用的“目标细胞”或“靶细胞”是指其中的一个或多个信号传导通道需要被调节的细胞或多个细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞包括但不限于：癌细胞。在一些其他实施方式中，所述靶细胞包括免疫效应子细胞，例如，自然杀伤细胞，T细胞，树突细胞和巨噬细胞。

本文使用的“癌细胞”是指表现出瘤形成细胞表型的细胞，其可通过如下特征中的一个或多个来表征：例如，异常细胞生长，异常细胞增殖，缺乏密度依赖性生长抑制，贴壁不依赖性生长潜能，在免疫缺损的非人类动物模型中促进肿瘤生长和/或发育的能力，和/或细胞转化的任何合适的指示剂。“癌细胞”可与“肿瘤细胞”或“癌性细胞”在本文中互换使用，并且包括实体肿瘤的癌细胞，半实体肿瘤的癌细胞，原发性肿瘤的癌细胞，转移的肿瘤的癌细胞，等等。

在涉及疾病或病症的上下文中使用的“治疗”是指实现至少缓解与折磨个体的病症相关的症状，其中，缓解以其广义使用，是指至少在一定程度上降低与正在治疗的病症(例如，癌症)有关的参数(例如，症状)。这样，治疗还包括如下情形，完全抑制(例如，预防发生)或停止(例如，终止)病理学病症或至少与其相关的症状，这样，宿主不再忍受病症或至少表征病症的症状。因此，治疗包括：(i)预防，即，降低临床症状发生的风险，包括使临床症状不会产生，例如，预防疾病发展至有害状态；(ii)抑制，即，阻止临床症状的发展或进一步发展，例如，减轻或完全抑制活性疾病，例如，降低肿瘤负载，所述降低可包括消除可检测的癌性细胞，或者预防细菌感染引起的疾病，所述预防可包括消除可检测的细菌细胞；和/或(iii)缓解，即，使得临床症状消退。

本文提供的术语组合物的“有效量”是指非致死但足以提供期望的效用的组合物的量。例如，对于在目标细胞(“靶细胞”)中诱发有利反应，例如，调节信号传导通路而言，抗体(活性抗体、有效抗体、有力抗体或功能抗体)的有效量是在信号传导通路的活性水平上引起显著且实质性改变的量，包括当与不使用抗体比较或与对照抗体(惰性抗体、非有效抗体或非功能性抗体)比较时下调和上调信号传导通路。在信号传导通路的活性水平上的改变的测量可通过本领域已知的多种方法进行。在另一实例中，对于在受治者体内诱发有利反应以治疗疾病(例如，癌症)而言，有效量是指降低、消除或减少与疾病有关的症状的量，从而，例如，提供对癌症转移的控制，消除癌细胞，等等。如本领域普通技术人员所理解的，所需的确切量因受治者的不同而发生改变，这取决于受治者的种类、年龄和性别，正在治疗的病症或疾病的严重程度，所使用的特定组合物，该组合物的给药模式，等等。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，合适的有效量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验就可确定。

本文使用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指任何合适的物质，该物质提供用于将目标化合物给药于受治者的药学上可接受的化合物。“药学上可接受的赋形剂”可包括称为药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的添加剂和药学上可接受的载体的物质。

术语“个体”或“受治者”意在包括人类、哺乳动物和其他动物。术语“个体”或“受治者”在本文中互换使用，是指接受本文公开的抗体或其片段的任何哺乳类动物受治者。

一些实施方式的特征在于双特异性抗体，抗原结合片段或其重组蛋白，它们能够调节目标细胞中的一个或多个信号传导通路的活性。一个或多个信号传导通路的调节可导致靶细胞的行为的一些改变，例如，刺激或降低细胞增殖、细胞生长、细胞分化、细胞存活、细胞分泌、细胞的粘附调节和/或细胞的运动性。

本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指保留了本发明的化合物的生物有效性和特性的盐，其可以不是生物学的或其他不理想的。在许多情况下，本发明的化合物能够凭借氨基和/或羧基或其类似基团的存在而形成酸式盐和/或碱式盐(例如，苯酚或异羟肟酸)。药学上可接受的酸加成盐可由无机酸和有机酸形成。可衍生得到盐的无机酸包括例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，等等。可衍生得到盐的有机酸包括例如，乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸，等等。药学上可接受的碱加成盐可由无机碱和有机碱形成。可衍生得到盐的无机碱包括例如，钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐，等等；特别优选的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可衍生得到盐的有机碱包括例如，伯胺，仲胺和季胺，取代的胺(包括天然生成的取代的胺)，环胺，碱性离子交换树脂，等等，具体而言，例如，异丙基胺，三甲基胺，二甲基胺，三乙基胺，三丙基胺和乙醇胺。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从母体化合物，碱性部分或酸性部分合成。通常，这样的盐可通过这些化合物的游离酸形式与按化学式计算的量的合适的碱(例如，氢氧化钠，氢氧化钙，氢氧化镁或氢氧化钾，碳酸钠，碳酸钙，碳酸镁，或碳酸钾，碳酸氢钠，碳酸氢镁，碳酸氢钙，碳酸氢钾)反应制备得到或通过这些化合物的游离碱形式与按化学式计算的量的合适的酸反应制备得到。这些反应通常在水中进行或在有机溶剂中进行或在这两者的混合物中进行。通常，像乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈这样的非水性介质是实际操作中优选的。其他合适的盐的列表可在例如Remington′s PharmaceuticalSciences，第20版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，(1985)中找到，该参考文献通过引用并入本文。

本文使用的术语“药学上可接受的载体/赋形剂”包括本领域普通技术人员已知的任何和全部溶剂、分散介质、包被、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，等这样的材料及其组合(参见，例如，Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Printing Company，1990，第1289-1329页，该参考文献通过引用并入本文)。但是任何与活性成分不相容的常规载体则属于例外，本发明也考虑到了它们在治疗组合物或药物组合物中的应用。

本文使用的术语“受治者”是指动物。优选地，所述动物是哺乳动物。例如，受治者也是指灵长类动物(例如，人类)、牛、羊、马、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠、鱼、鸟，等等。在优选的实施方式中，所述受治者是人类。

本文使用的术语“治疗组合”或“组合”是指一种或多种活性药物物质(即，具有治疗效用的化合物)的组合。典型地，本发明的治疗组合中的每个这样的化合物可存在于包含该化合物和药学上可接受的载体的药物组合物中。作为治疗方案的一部分，本发明的药物组合中的多种化合物可同时给药或分开给药。

II.组合物

总体上，本发明提供基于双抗体技术设计的DICAD(二硫化物和电荷调节的双抗体)平台。通过引入共价键并调节氨基酸以修饰VH-VL界面上的静电电荷，该新的平台能够生成带有两个或多个特异性的多价抗体。在稳定性和药代动力学性质与经典抗体类似的条件下，DICAD可使用传统步骤进行有效表达和纯化。抗体被证明在体内和体外均具有非常高的效力并且具有相对于大多数其他双特异性抗体较长的半衰期。

总体而言，本文提供的抗体具有基于双抗体设计的结构。它们具有位于VH和VL之间的二硫键以及基于它们的静电性质而在所选择的氨基酸上出现的突变。例如，一些双抗体在VL2-VH2上具有突变，该突变也可以位于VL1-VH1上，或这两者上。这两种突变均改善了VH和VL的结合和期望的配对。

在一些实施方式中，同时存在VL1-VH1和VL2-VH2，产物的纯度提高但是产率降低，因此，这可能不是优选的。

在一些实施方式中，带有榫卯(knob-into-hole)结构域的Fc片段被包括在内。

总体上，本文提供的抗体(DICAD)类似于经典抗体。它们更加稳定，具有更长的半衰期并且易于进行下游纯化。

总体而言，本文提供的抗体具有如下优势：(1)保留了二价双特异性抗体的性质：亲和力，亲和性，效力，等等；(2)具有高稳定性且聚集较少；(3)相对于其他双特异性抗体易于表达和纯化；以及(4)具有类似于天然IgG的结构，并因此具有较低的免疫原性。

A.二硫化物和电荷调节双抗体

一方面，本发明提供抗体，例如二硫化物和电荷调节的双抗体(DICAD)。

总体而言，本发明提供工程化抗体，包含：(i)第一多肽，其包含结合第一靶点的第一轻链可变结构域(VL1)和结合第二靶点的第二重链可变结构域(VH2)，以及(ii)第二多肽，其包含结合所述第二靶点的第二轻链可变结构域(VL2)和结合所述第一靶点的第一重链可变结构域(VH1)，其中，VL2和VH1共价连接，并且，其中，VL2和VH2共价连接，并且，VL2和VH2均包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体形式是静电学上不利的。

双抗体

本文提供的抗体与双抗体的其他常见形式相比具有多种优异性质。

双抗体是scFv(单链Fv)异源二聚体结构，其早在1993年由Holliger等人报道(1)。各个链由分别源自不同抗体的Fv的一个VL和一个VH构建，VL和VH通过5个至10个氨基酸的肽连接。连接体肽的较短的长度使各个片段非常接近，在各个片段之间的亲和性的驱动下，scFv二聚化形成55kDa至60kDa的分子，该分子能够同时识别两个抗原。此后，双抗体构建体系被进一步改良和优化，由此产生了双抗体构建体系的核心基本结构和构建方法(2，3)。双抗体已表现出对其靶点具有非常高的亲和性。然而，双抗体结构缺乏片段间的共价结合或Fc区域，这导致分子的稳定性差并且半衰期短，这使得双抗体与合格的工业产品相距甚远。

为了改善双抗体的成药性，朱祯平和他的同事将Fc区域通过铰链添加至双抗体的每个链的C端，随后，使改良的结构进行二聚化，得到双-双抗体(54，5)。与双抗体相比，由于Fc区域的存在，双-双抗体具有显著较长的体内半衰期和简化得多的纯化步骤。该新的结构仍然双价结合至单个抗原并且能够维持源(单特异性)抗体的大部分亲和力和选择性。在药代动力学性质方面，所有制备的双-双抗体更加类似于传统抗体。

但是对于双-双抗体而言，稳定性仍然是个问题，这也是双抗体的问题。一旦进入体内，双-双抗体由于二聚体的解离而快速失去其活性。而且，难以通过常规实验方法(例如，ELISA)确定血清中不理想的副产物的浓度和比例，这给成药性研究笼罩上了阴影。

为了改善双抗体产物的均一性，Kontermann等人开发了scDB(单链双抗体)平台(6，7，8，9)。使用一条由15个氨基酸组成的肽将一个链的C端连接至另一链的N端。这一改变提高了源双抗体的稳定性并且改善了产物的均一性。Tohoku大学的Kumagai等人通过将Fc区域的N端通过铰链结构连接至双抗体肽的C端而进一步改良了scDb体系，从而改善了表达/纯化过程并且提高了产物的体内半衰期。改良的体系很大程度上保留了源抗体的亲和性和选择性，虽然HC臂的远端的亲和性产生不可避免的损失。然而，在这种构建类型下，由于两对VL-VH肽链之间的唯一的连接完全依赖于柔性连接体肽，这会产生分子聚集并导致稳定性较差。而且，这些聚集体通常带有较高的免疫原性并且易于诱导体内ADA(抗药物抗体)，这对制剂带来了巨大的挑战。

二硫化物和电荷调节的双抗体(DCAD)的各种不同的形式

本文提供的抗体可具有各种不同的形式或结构。

在一些实施方式中，VL1的C端与VH2的N端共价连接，VL2的C端与VH1的N端共价连接。

在一些实施方式中，VL1通过第一肽连接体与VH2连接，VL2通过第二肽连接体与VH1连接。

在一些实施方式中，第一多肽从N端至C端具有如下结构：

VL1-第一肽连接体-VH2。

在一些实施方式中，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

VL2-第二肽连接体-VH1。

在一些实施方式中，VL1的N端和VH2的C端共价连接，VL2的N端和VH1的C端共价连接。

在一些实施方式中，所述第一多肽从N端至C端具有如下结构：

VH2-第一肽连接体-VL1。

在一些实施方式中，所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

VH1-第二肽连接体-VL2。

在一些实施方式中，所述第一肽连接体和所述第二肽连接体分别独立地包含1至15个氨基酸，1至20个氨基酸或1至30个氨基酸，并且优选地，包含5至9个氨基酸。

在一些实施方式中，所述连接体具有如下序列：RTVAA(SEQ ID NO.：1)，GGGGS(SEQID NO.：2)，GGSGGS(SEQ ID NO.：3)，GGSGGSGGS(SEQ ID NO.：4)，GGGGSGGGGS(SEQ ID NO.：5)。

二硫键

本文提供的抗体总体上包含连接多肽的共价连接。

在一些实施方式中，VL2和VH2通过二硫键共价连接。

在一些实施方式中，VL2的FR和VH2的FR通过二硫键共价连接。

通过分析抗体的晶体结构发现，半胱氨酸突变可被引入VL-VH界面上的一些相对保守的序列中，从而在VL-VH之间形成二硫键，这样，使VL和VH共价连接。对于scDb和双抗体而言，VH和VL之间共价键的引入显著改善了抗体的稳定性，而对于后者而言，也降低了聚集水平。

最早，通过各个片段的CDR中的半胱氨酸残基之间的共价相互作用将二硫键引入VH-VL界面而构建dsFv(20)。虽然使用这种方法不会影响抗体的活性，但是源抗体的CDR上的详细结构信息需要进行“个性化”设计以避免干扰CDR的抗原-识别/结合能力，这就难以将该方法变为适于各种不同的抗体结构的通用方案。为了确保方法的广泛应用，关键在于仅使保守FR中的选择位点上的氨基酸结合至dsFv的构建中。

表1.二硫键位置的总结

二硫键位置(Kabat编号)	参考文献
		vH44-vL100	[12]
vH105-vL43	[13]
		vH100b-vL49	[14]
vH100-vL50	[14]
		vH101-vL46	[15]

自1993年以来，已发现了用于VH-VL共价键形成的若干配对位点，包括VH44-VL100，VH105-VL43，VH100b-VL49 and VH100-VL150等等(12，13，14，15)。其中，VH44-VL100和VH105-VL43相比其他组合，在表达水平、单体比例、Tm以及亲和力等方面，均有一定优势，因此使用较为广泛。在DICAD的构建过程中，我们也发现VH44-VL100相比其他组合，有明显的优势。

在一些实施方式中，VL1和VH1通过二硫键共价连接，其中，所述二硫键将VL1的FR4连接至VH1的FR2。

在一些实施方式中，VL1的位置100(Kabat)和VH1的位置44(Kabat)被半胱氨酸取代。

在一些实施方式中，VL1和VH1通过二硫键共价连接，其中，所述二硫键将VL1的FR2连接至VH1的FR4。

在一些实施方式中，VL1的位置43(Kabat)和VH1的位置105(Kabat)被半胱氨酸取代。

取代的半胱氨酸形成连接本文提供的抗体的重链和轻链的二硫键。

采用带电荷的氨基酸的取代

另一方面，本文提供的抗体包含具有不同电荷性质的一个或多个氨基酸取代，所述不同电荷性质产生了优异性质。

在一些实施方式中，VL2的FR的残基被带负电荷的氨基酸取代，VH2的FR的残基被带正电荷的氨基酸取代。

在一些实施方式中，VL2的FR的残基被带正电荷的氨基酸取代，VH2的FR的残基被带负电荷的氨基酸取代。

通过引入二硫键在双抗体的两个链之间形成共价相互作用可显著改善产物的均一性和稳定性。我们的早期研究显示二硫键的引入大大提高了单体比例。然而，仍会有部分比例的轻重链之间会以非共价方式结合。单一的共价相互作用不能确保产物的纯度。在此基础上，我们对系统进行了修改并且考虑到了区域静电作用力的影响，从而进一步提高了产物纯度。

在折叠的水溶性多肽中，疏水性氨基酸侧链在结构中聚集在一起，形成隐藏在水中的“疏水核”。同时，亲水性氨基酸侧链位于暴露于溶剂的表面上，在该表面上，亲水性氨基酸侧链与周围的水分子发生相互作用。疏水核和亲水表面驱动水溶性多肽折叠。疏水性氨基酸在多肽表面上的暴露使熵和自由能增加，由此发生去稳定化，反之亦然。类似的疏水相互作用存在于抗体的VH和VL之间，并且所涉及的残基是相对保守的残基：重链的FR中的H37，H45，H47，H89，H91，H104和轻链的FR中的L36，L44，L46，L85，L87，L98。除了分别在H39和L38上的两个谷氨酰胺之间形成的氢键之外，这些氨基酸的侧链聚集并形成疏水核。H39和L38均是相对保守的残基：在人的H39中95％为Q，κVL中有94％为Q(λVL有95％为Q)。通过采用选择的疏水性/亲水性残基取代H39和L38上的谷氨酰胺残基，能够促进期望的VH-VL配对，同时抑制不期望的结合。

Tan等人(16)通过调节VH-VL界面上的氨基酸基于它们的静电性质影响scFv(单链F变体)的稳定性。之后，Igawa等人(21，22)对该方法进行了调整以修饰scDb。为了改善产物的均一性，4个可变区片段中的两对Q39-Q38分别被具有合适的静电电荷的氨基酸取代以促进或抑制某些异构化反应。类似的方法被应用于抗体的Fc臂：修饰CH3界面上的静电性质，促进同源性CH3结构域之间的相互作用(21，22)。Amgen的Gunasekaran等人进一步对该方法进行研究并将其用于抗体的Fab臂的修饰。调节CH1-CL界面上的静电方向并对VH-VL的38-39进行修饰有利于CH1-VH和CL-VL之间的特异性相互作用(23，24)。因此，每条HC能够分别与两条LC发生相互作用并产生可同时结合两个抗原的抗体。

除了插入二硫键之外，本文提供的DICAD还改良了所选择的区域的静电方向，这样使得不期望的非特异性相互作用最小化。该平台改善了分子的药代动力学性质，有助于减轻下游工艺研发过程中的难度，并增加了双特异性抗体的研发成功的几率。

VH的W103和VL的P44均位于疏水核的侧链并彼此邻近。在DICAD的研发过程中也检测了W103-P44之间的静电相互作用并发现其非常优异。

在一些实施方式中，VL1的FR2被带负电荷的氨基酸取代，VH的FR2或FR4被带正电荷的氨基酸取代。

在一些实施方式中，VL1的FR2被带正电荷的氨基酸取代，VH的FR2或FR4被带负电荷的氨基酸取代。

在一些实施方式中，带负电荷的氨基酸是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，带正电荷的氨基酸是赖氨酸(K)或精氨酸(R)。

在一些实施方式中，VL1的FR2在P44被取代，VH1的FR4在W103被取代。

在一些实施方式中，VL1的FR2在Q38被取代，VH1的FR2在Q39被取代。

向抗体中引入带正电荷的氨基酸或带负电荷的氨基酸是本领域已知的。

其他特征

另一方面，本发明提供工程化抗体，其包含本文提供的抗体的二聚体并且所述二聚体的每个单元通过铰链区连接。

在一些实施方式中，第一多肽或第二多肽分别独立地在其C端连接IgG 1，IgG 2，IgG 3或IgG4的铰链区。

在一些实施方式中，第一多肽和第二多肽分别独立地在其C端连接至铰链区和IgG1，IgG 2，IgG 3，IgG4或IgA的CH2-CH3，以形成类似于同源二聚体的经典抗体。

连接抗体分子的Fc和DICAD部分的铰链区实际上是柔性系链，其允许两个DICAD臂独立移动。

在一些实施方式中，所述第一多肽和所述第二多肽分别在其C端独立地连接至Fc区域。

在一些实施方式中，所述第一多肽和所述第二多肽分别在其C端独立地连接至白蛋白或PEG。

在一些实施方式中，PEG的分子量为约1kDa至40kDa。

B.三价抗体

另一方面，本发明提供TRIAD(三特异性调节的双抗体)，采用分子量为约153kDa的抗体进行构建TRIAD的平台，并且TRIAD能够同时识别三个抗原。TRIAD是在DICAD的基础上通过一系列采用榫卯(knobs-in-hole)的技术进行改良而发展起来的。

简言之，含有Fc片段的多肽中的CH3结构域被修饰为“榫”结构，传统抗体的γ-链的CH3结构域被修饰为“卯”结构，随后，这两种结构通过传统抗体中的轻链(LC)共表达：上述步骤结合起来实现了TRIAD抗体的构建。为了进行进一步优化，使用并筛选出多个位点上的点突变，由此确定了TRIAD的结构和构建方法。通过加入第三抗原识别功能结构域，能够实现AAB(2∶1)或ABC(1∶1∶1)(A，B，C分别代表所选择的靶点)形式的靶结合，这产生不同于DICAD的MOA和药代动力学性质。

构建的AAB型由两对靶向抗原A的VH1-VL1和一对靶向抗原B的VH2-VL2构成。CD3抗体和T细胞之间的双共价相互作用诱导T细胞凋亡并且由于细胞因子的大量释放而大大增加了临床CRS风险。因此，为了降低CRS风险，在构建结合T细胞的抗体时通常采用CD3抗体的单价相互作用。其他抗原的双价相互作用使抗体对抗原的亲和力增加并且产生如下两种优势：(1)当单链抗体对抗原具有高亲和性时，抗体能够识别低丰度的抗原；以及(2)当抗体与抗原发生相互作用时，抗体对抗原具有高选择性，即，当单链抗体对抗原具有低亲和性时，抗体仅仅结合高丰度抗原但不结合低丰度抗原。

另一方面，本发明提供工程化抗体，其包含(i)第一多肽，该第一多肽包含结合第二靶点的第二轻链可变结构域(VL2)和结合第一靶点的第一重链可变结构域(VH1)，其中，VL2和VH1共价连接；(ii)第二多肽，该第二多肽包含结合第一靶点的第一轻链可变结构域(VL1)，结合第二靶点的第二重链可变结构域(VH2)，铰链结构域，和IgG的CH2-CH3，其中，VL1和VH2共价连接；(iii)第三多肽，该第三多肽包含结合第三靶点的第三重链可变结构域(VH3)，CH1结构域，含有半胱氨酸的铰链结构域和IgG的CH2-CH3结构域；以及(iv)第四多肽，该第四多肽包含结合所述第三靶点的第四轻链可变结构域(VL3)和含有半胱氨酸的CL结构域；其中，VL1和VH1结合形成能够结合所述第一靶点的结构域，其中，VL2和VH2结合形成能够结合所述第二靶点的结构域；其中，VL3和VH3结合形成能够结合所述第三靶点的结构域；其中，VL2和VH2通过二硫键共价连接；其中，VL2和VH2独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；其中，CH1和CL通过二硫键共价连接，并且，其中，所述第二多肽链和所述第三多肽链通过铰链结构域和CH3结构域共价连接。

在一些实施方式中，VL2的C端与VH1的N端共价连接，VL1的C端与VH2的N端共价连接。

在一些实施方式中，VL2的N端与VH1的C端共价连接，VL1的N端与VH2的C端共价连接。

在一些实施方式中，所述第一多肽是结合所述第一抗原的第一轻链可变结构域(VL1)并且所述第二多肽是结合第二抗原的第二重链可变结构域(VH2)，其中，VL1和VH2通过第一肽连接体连接。

在一些实施方式中，所述第一多肽通过其C端的铰链区连接至Fc区域的N端。铰链区包含来自IgG1，IgG 2，IgG 3，IgG4或IgA的铰链。Fc区域包含IgG1，IgG 2，IgG 3，IgG4或tgA的CH2和CH3。

在一些实施方式中，第三靶点和第一靶点是相同的靶点。

在一些实施方式中，第三靶点和第二靶点是相同的靶点。

在一些实施方式中，第二多肽的CH2-CH3结构域和第三多肽的CH2-CH3结构域是不同的。

在一些实施方式中，所述第二多肽和所述第三多肽通过在每个结构域上采用不同的突变对CH3结构的界面进行修饰而进行工程化。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Trp取代Thr366，并且另一个CH3结构域包含Ser，Ala和Val分别取代Thr366，Leu368，Tyr407。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Lys取代Asp399和Glu356，并且另一个CH3结构域包含Asp取代Lys392和Lys409。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Lys取代Glu356，Glu357和Asp399，并且，另一个CH3结构域包含Glu，Asp和Glu分别取代Lys370，Lys409和Lys439。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含His和Ala分别取代Ser364和Phe405，并且，另一个CH3结构域包含Thr和Phe分别取代Tyr349和Thr394。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Asp取代Lys370和Lys409，并且，另一个CH3结构域包含Lys取代Glu357和Asp399。

在一些实施方式中，CH3结构域中的一个包含Asp和Glu分别取代Leu351和Leu368，并且，另一个CH3结构域包含Lys取代Leu361和Thr366。

榫卯结构(knobs-in-hole)

在一些实施方式中，所述第二多肽和所述第三多肽通过铰链区共价连接并且形成榫卯结构。

榫卯结构也称为“凸起-进入-内腔(protuberance-into-cavity)”策略，其用于设计异源寡聚的第二和第三多肽之间的界面。

总体而言，优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。“凸起”通过采用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代所述第二多肽的界面中的小氨基酸侧链来构建。与凸起的尺寸相同或类似的互补性“内腔”通过用较小的氨基酸(例如，丙氨酸或苏氨酸)取代较大的氨基酸侧链任选地建立在第三多肽的界面上。在定位和尺寸合适的凸起或内腔存在于第二或第三多肽的界面上时，仅需要在邻近的界面上分别设计对应的内腔或凸起。参见美国专利US8,216,805，其公开的内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，所述第三多肽包含通过取代Y407V，T366S，L368A和Y349C而形成的孔。

C.疾病特异性靶点

总体而言，靶点中的一种(例如，第一靶点)是疾病特异性靶点。

本文中的“靶点”是指抗原，例如，肿瘤抗原或细胞特异性生物标志物(例如，蛋白质)或抗原的表位。

所述疾病特异性靶点可以是肿瘤靶点(例如，Her2，Jamnani，F.R.，等人，T cellsexpressing VHH-directed oligoclonal chimeric HER2 antigen receptors：towardstumor-directed oligoclonal T cell therapy.Biochimica et biophysica acta 1840，378-386(2014)，Even-Desrumeaux，K.，Fourquet，P.，Secq，V.，Baty，D.&Chames，P.Single-domain antibodies：a versatile and rich source of binders for breast cancerdiagnostic approaches.Molecular bioSystems 8，2385-2394(2012))，肿瘤抗原(例如，TRK(US 7750122 B2))，或疾病特异性受体(例如，EGFR，参见PCT申请WO2010037838以及Bell，A.，等人，Differential tumor-targeting abilities of three single-domainantibody formats.Cancer letters 289，81-90(2010))。

在一些实施方式中，疾病特异性靶点选自下表2提供的疾病标志物、细胞因子、趋化因子中的一种。

表2.靶点列表

在一些特定的实施方式中，靶点是肿瘤标志物。在一些实施方式中，肿瘤标志物是存在于肿瘤中而不存在于正常器官、组织和/或细胞中的抗原。在一些实施方式中，肿瘤标志物是相对于正常器官、组织和/或细胞更加普遍存在于肿瘤中的抗原。在一些实施方式中，肿瘤标志物是相对于正常细胞更加普遍存在于恶性癌细胞中的抗原。

本文中的“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生的抗原性物质，即，该物质触发宿主体内的免疫反应。体内的正常蛋白质由于自身耐受而不是抗原性的，所述自身耐受是自体反应细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自身抗体产生的B淋巴细胞被从初级淋巴组织(BM)中“中心”剔除并从次级淋巴组织中“周边”剔除(对于T-细胞而言主要是胸腺并且对于B细胞而言主要是脾和淋巴结)的过程。因此，没有暴露于免疫系统的任何蛋白质触发免疫反应。这可包括完全从免疫系统中隔离的正常蛋白质，以极少量正常生成的蛋白质，仅在发育的某些阶段正常生成的蛋白质，或由于突变而进行了结构修饰的蛋白质。

在一些实施方式中，相对于正常组织和/或正常细胞，靶点优先在肿瘤组织和/或肿瘤细胞中表达。

在本发明的一些实施方式中，标志物是肿瘤标志物。所述标志物可以是相对于未分化的细胞以较高的水平在分化的细胞上表达的多肽。例如，Her-2/neu(也称为ErbB-2)是EGF受体家族的成员并且其在与乳腺癌相关的肿瘤细胞表面表达。另一实例是称为F3的肽，其是用于将纳米颗粒定向至核仁素的合适的靶试剂(Porkka等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，99：7444；以及Christian等人，2003，J.Cell Biol.，163：871)。包含纳米颗粒和A10适体(A10适体特异性结合至PSMA)的靶向颗粒已表现出能够将紫杉醇特异性且有效递送至前列腺癌肿瘤。

特异性靶向这些肿瘤靶点的抗体或其他药物特异性地干扰并调节肿瘤细胞的生物行为的信号传导通路，从而直接调节或阻断信号传导通路以抑制肿瘤细胞生长或诱导细胞凋亡。迄今为止，已有数十种靶向药物被批准用于实体肿瘤或血液恶性肿瘤的临床研究和治疗，并且已有多种靶向药物用于血液恶性肿瘤。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原(或肿瘤靶点)选自CD2，CD19，CD20，CD22，CD27，CD33，CD37，CD38，CD40，CD44，CD47，CD52，CD56，CD70，CD79，和CD137。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原(或肿瘤靶点)选自：4-1BB，5T4，AGS-5，AGS-16，血管生成素2，B7.1，B7.2，B7DC，B7H1，B7H2，B7H3，BT-062，BTLA，CAIX，癌胚抗原，CTLA4，Cripto，ED-B，ErbB1，ErbB2，ErbB3，ErbB4，EGFL7，EpCAM，EphA2，EphA3，EphB2，FAP，纤连蛋白，叶酸受体，神经节苷脂GM3，GD2，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)，gp100，gpA33，GPNMB，ICOS，IGF1R，整合素，KIR，LAG-3，路易斯Y抗原，间皮素，c-MET，MN碳酸酐酶IX，MUC1，MUC16，粘连蛋白-4，NKGD2，NOTCH，OX40，OX40L，PD-1，PDL1，PSCA，PSMA，RANKL，ROR1，ROR2，SLC44A4，Syndecan-1，TACI，TAG-72，腱生蛋白，TIM3，TRAILR1，TRAILR2，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3及其变体。肿瘤抗原的变体包括本领域已知的和/或天然生成的各种突变或polympormism。

在一些实施方式中，疾病特异性靶点选自在癌细胞中过表达的抗原，包括：细胞间粘合分子1(ICAM-1)，肝配蛋白A型受体2(EphA2)，肝配蛋白A型受体3(EphA3)，肝配蛋白A型受体4(EphA4)或活化的白细胞粘合分子(ALCAM)。

在一些实施方式中，疾病特异性靶点选自：癌症相关或肿瘤相关导向抗原，包括：CD30，CD33，PSMA，间皮素，CD44，CD73，CD38，粘蛋白1细胞表面相关(MUC1)，粘蛋白2寡聚粘液凝胶形成(MUC2)和MUC16(CA-125)。

在一些实施方式中，疾病特异性靶点选自：CD30，CD33，癌胚抗原(CEA)，间皮素，组织蛋白酶G，CD44，CD73，CD38，Muc1，Muc2，Muc16，黑色素瘤的优先表达抗原(PRAME)，CD52，EpCAM，CEA，gpA33，粘蛋白，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，碳酸酐酶IX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂，路易斯-Y，未成熟层粘连蛋白受体，BING-4，钙活化的氯化物通道2(CaCC)，gp100，滑膜肉瘤X断点2(SSX-2)，或SAP-I。

在一些实施方式中，疾病特异性靶点选自：CD30，CD33，癌胚抗原(CEA)，间皮素，组织蛋白酶G，CD44，CD73，CD38，Muc1，Muc16，黑色素瘤的优先表达抗原(PRAME)，CD52，EpCAM，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，碳酸酐酶IX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂或路易斯-Y，ICAM-1，EphA2，或ALCAM。

D.免疫调节性功能靶点

总体而言，抗原中的一种(例如，第二抗原)是免疫调节性功能靶点，其与疾病靶点相关。

免疫调节性功能靶点可以是监测受体(例如，PD-L1(PCT申请WO2017020801-PAMPH-866和Zhang，F等人，Structural basis of a novel PD-L1 nanobody for immunecheckpoint blockade.Cell discovery 3，17004(2017).8)或者调节性细胞因子受体，等等)。

在一些实施方式中，免疫调节性功能靶点选自表2提供的受体中的一种。

在一些实施方式中，免疫调节性功能靶点涉及NK细胞活化或抑制通路，并且选自：CD16，CD38，NKG2D，NKG2A，NKp46或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。

在一些实施方式中，免疫调节性功能靶点涉及监测抑制性通路(该通路在T细胞中可以是活性的)，并且选自：PD1，CTLA4和Tim3。

本发明的单一结构域与靶点特异性结合。

本文中的“靶点”或“标志物”是指能够特异性结合至特定靶向治疗剂的任何实体(例如，Her2/Neu)。在一些实施方式中，靶点与一个或多个特定细胞或组织类型特异性相关。在一些实施方式中，靶点与一种或多种特定疾病状态特异性相关。在一些实施方式中，靶点与一种或多种特定发育阶段特异性相关。例如，细胞类型特异性标志物在该细胞类型中的表达水平通常是参比细胞群中的表达水平的2倍。在一些实施方式中，细胞类型特异性标志物的水平是参比细胞群中的平均表达水平的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、或至少1,000倍。细胞类型特异性标志物的检测或测量可使目标细胞类型或多个目标细胞类型与许多、大多数或所有其他的细胞类型相区别。在一些实施方式中，靶点可包含本文描述的蛋白质、糖类、脂质和/或核酸。

本文中的“特异性结合”或“优先结合”是指两个结合搭档之间(例如，靶向部分及其结合搭档之间)的结合对于两个结合搭档具有选择性并且可与不理想非特异性相互作用相区别。例如，抗原结合部分结合特异性抗原性决定簇的能力可通过酶联免疫吸附分析(ELISA)或本领域技术人员熟知的其他技术(例如，表面等离子共振技术(在BIAcore仪器上进行分析))(Liljeblad等人，Glyco J 17，323-329(2000))，以及传统结合分析(Heeley，Endocr Res 28，217-229(2002))来测量。术语“抗-[抗原]抗体”和“结合[抗原]的抗体”是指能够以足够的亲和性结合各个抗原的抗体，这样，所述抗体在靶向抗原方面用作诊断试剂和/或治疗试剂。在一些实施方式中，抗-[抗原]抗体与非相关蛋白的结合程度小于通过例如放射免疫测定法(RIA)所测量的抗体与抗原的结合程度的10％。

在一些实施方式中，与抗原结合的抗原结合具有＜100μM，＜10μM，＜1μM，＜100nM，＜10nM，＜1nM，＜0.1nM，＜0.01nM，或＜0.001nM的解离常数(例如，10^-4M或更小，例如，10^-4M至10^-12M，例如，10^-9M至10^-13M)，并且，优选地解离常数为10^-4M至10^-6M。

E.抗体和功能片段

在一些实施方式中，靶向治疗剂包含抗体或其功能片段。

本文中的“免疫球蛋白”或“抗体”是指全长(即，天然生成的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，类似于抗体片段。在本发明要求保护的主题的范围内，抗体或抗体片段可以是偶联的或衍生的。这样的抗体包括IgG1，lgG2a，IgG3，IgG4(和IgG4亚型)，以及IgA同种型。

本文中的术语“抗体”以最广义使用并且包含各种不同的抗体结构，包括但不限于：单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要这些抗体表现出期望的抗原结合活性并且包含Fc区域或与免疫球蛋白的Fc区域等同的区域。本文中互换使用的术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”是指如下抗体，其具有与天然抗体结构基本类似的结构或具有包含本文定义的Fc区域的重链。

本文中的“天然抗体”是指具有不同结构的天然生成的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是大约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，由二硫键连接的两个等同的轻链和两个等同的重链构成。从N端至C端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)，其也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，随后使恒定轻结构域(CL)，也称为轻链恒定区。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以分为两种类型(称为κ和λ)中的一种。

本文中的“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，所述分子包含结合抗原的完整抗体的一部分，所述抗原与完整抗体结合。抗体片段的实例包括但不限于：Fv，Fab，Fab′，Fab′-SH，F(ab′)2，双价抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如，scFv)，单结构域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。关于一些抗体片段的综述请参见，Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)。关于scFv片段的综述请参见例如，Pliickthun，in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)；以及WO93/16185；和美国专利US5,571,894和US5,587,458。关于含有挽救受体结合表位残基且具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，请参见美国专利US5,869,046。双价抗体为可为二价的或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。请参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90，6444-6448(1993)。三价抗体和四价抗体也在Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)中描述。单结构域抗体为含有抗体的所有或一部分重链可变结构域或者含有抗体的所有或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在一些实施方式中，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如，美国专利No.6,248,516 B1)。抗体片段可通过各种不同的技术制备，所述技术包括但不限于：如本文描述的，完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)生成。

本文中的“抗原结合结构域”是指包含与抗原的全部或一部分特异性结合且互补的区域的抗体的一部分。抗原结合结构域可通过例如，一个或一个以上抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供。具体而言，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

本文中的“可变区”或“可变结构域”是指涉及使抗体与抗原结合的抗体重链结构域或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中，每一结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第六版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以带来抗原结合特异性。

本文中的“高变区”或“HVR”是指序列高度可变和/或形成结构限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域的各个区域。一般而言，天然四链抗体包含六个HVR，三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或涉及抗原识别。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区(CDR)”并且与形成抗原结合区的可变区部分有关的这些术语在本文中互换使用。该特定区域已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)和Chothia等人，J Mol Biol196：901-917(1987)描述，其中，当彼此比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，关于抗体的CDR或其变体的任何定义的应用意在本文定义的和本文使用的术语的范围内。包含特定CDR的确切的残基数目随CDR的序列和尺寸的不同而不同。在给出抗体的可变区氨基酸序列的条件下，本领域技术人员可常规确定哪些残基包含特定CDR。

本发明的抗体可为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体融合蛋白。

本文中的“嵌合抗体”是指包含抗体重链和轻链这两者的可变结构域的重组蛋白质，所述可变结构域包括来源于一个物种的抗体(优选地为啮齿动物抗体，更优选地为鼠科动物抗体)的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。对于兽医应用而言，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其它物种的恒定结构域，所述其它物种例如，类人类灵长类动物、猫或狗。

本文中的“人源化抗体”是指如下重组蛋白：在该重组蛋白中，来自于一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域转移至人重链可变结构域和人轻链可变结构域中。抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。在一些实施方式中，人源化抗体的框架区的特定残基，尤其是接触或靠近CDR序列的那些特定残基，可被修饰，例如可被来自于原始啮齿动物、类人类灵长类动物的相应残基或其他抗体代替。

本文中的“人抗体”是指例如从转基因小鼠中获得的抗体，所述转基因小鼠已被“改造”为响应抗原刺激生成特定的人抗体。在该技术中，人重链基因座和人轻链基因座的元件被引入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系包含内源性重链基因座和轻链基因座的靶向断裂。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可用于生成分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人，NatureGenet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 368：856(1994)，Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)描述。完全人抗体还可通过基因转染法或染色体转染法以及噬菌体展示技术来构建，所有这些方法为本领域已知的。请参见例如，McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)，其中描述了通过来自于未免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系体外生成人抗体及其片段。在该技术中，抗体可变结构域基因框内克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性质的选择还导致对编码表现出那些性质的抗体的基因的选择。通过该方式，噬菌体模仿B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式进行，关于噬菌体展示的综述请参见例如，Johnson和Chiswell，Current Opinion inStructural Biology 3：5564-571(1993)。人抗体还可通过体外活化B细胞产生。请参见美国专利US5,567,610和US5,229,275，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。

本文中的“抗体融合蛋白”是指通过重组产生的抗原结合分子，其中，连接相同或不同的天然抗体、具有相同或不同特异性的单链抗体或抗体片段中的两个或两个以上。融合蛋白包含至少一个特异性结合位点。融合蛋白的化合价表示融合蛋白具有的与抗原或表位结合的结合臂或结合位点的总数，即，单价的、二价的、三价的或多价的。多价的抗体融合蛋白是指该抗体融合蛋白可利用多种与抗原结合的相互作用，因此增加与抗原或不同抗原结合的亲合力。特异性表示抗体融合蛋白能够与多少种不同类型的抗原或表位结合，即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天然抗体(例如，IgG)为二价的，因为其具有两个结合臂，但是其为单特异性的，因为其结合一种类型的抗原或表位。单特异性多价融合蛋白具有一个以上用于相同抗原或表位的结合位点。例如，单特异性双价抗体为具有两个与相同的抗原反应的结合位点的融合蛋白。融合蛋白可包含不同抗体成分的多价或多特异性组合或同一抗体成分的多个拷贝。融合蛋白还可包含治疗剂。

本文中的“靶点”或“标志物”是指能够特异性结合特定的靶向部分的任何实体。在一些实施方式中，靶点与一个或一个以上特定的细胞或组织类型特别相关。在一些实施方式中，靶点与一种或一种以上特定的疾病状态特别相关。在一些实施方式中，靶点与一种或一种以上特定的发育阶段特别相关。例如，细胞类型特异性标志物在该细胞类型中的表达水平通常是其在参比细胞群中的表达水平的至少两倍。在一些实施方式中，细胞类型特异性标志物的水平是其在参比细胞群中的平均表达水平的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或者至少1,000倍。细胞类型特异性标志物的检测或测量可将一种目标细胞类型或多种目标细胞类型与许多其他细胞类型、大多数其他细胞类型或所有其他细胞类型区别开。在一些实施方式中，靶点可包含本文所描述的蛋白质、糖类、脂质和/或核酸。

如果一种物质与核酸靶向部分特异性结合，那么该物质可被认为是为了本文所述的目的而“被靶向的”。在一些实施方式中，核酸靶向部分在严格条件下与靶点特异性结合。如果靶向部分与靶点特异性结合，那么含有靶向部分的本发明的复合物或化合物被认为是“靶向的”，从而将整个复合物或化合物组合物递送至特定的器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室。

在一些实施方式中，根据本发明的抗体包含特异性结合与器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室相关的一个或多个靶点(例如，抗原)的单结构域抗体或片段。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与特定器官或器官系统有关的靶点的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含特异性结合一个或一个以上细胞内靶点(例如，细胞器、细胞内蛋白质)的核靶向部分。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与病态的器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室有关的靶点的靶向部分。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与特定细胞类型(例如，内皮细胞、癌细胞、恶性肿瘤细胞、前列腺癌细胞，等等)有关的靶点的靶向部分。

在一些实施方式中，根据本发明的抗体包含与对一种或多种特定组织类型(例如，肝脏组织和前列腺组织)具有特异性的靶点结合的结构域抗体或片段。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或一种以上特定细胞类型(例如，T细胞和B细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或一种以上特定疾病状态(例如，肿瘤细胞和健康细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或一种以上特定发育阶段(例如，干细胞和分化的细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。

在一些实施方式中，靶点可为标志物，所述标志物仅仅或主要与一种或几种细胞类型、一种或几种疾病和/或一种或几种发育阶段有关。细胞类型特异性标志物在该细胞类型中的表达水平通常是其在参比细胞群中的表达水平的至少两倍，例如，所述参比细胞群可由含有几乎等量的来自多种(例如，5-10种，或者更多)不同的组织或器官的细胞的混合物构成。在一些实施方式中，细胞类型特异性标志物的表达水平是其在参比细胞群中的平均表达水平的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。细胞类型特异性标志物的检测或测量可将一种目标细胞类型或多种目标细胞类型与许多其他细胞类型、大多数其他细胞类型或所有其他细胞类型区别开。

在一些实施方式中，靶点包含蛋白质、糖类、脂质和/或核酸。在一些实施方式中，靶点包含蛋白质和/或其特征部分，例如，肿瘤标志物、整联蛋白、细胞表面受体、跨膜蛋白、细胞间蛋白、离子通道、膜转运蛋白、酶、抗体、嵌合蛋白、糖蛋白，等等。在一些实施方式中，靶点包含糖类和/或其特征部分，例如，糖蛋白，糖(例如，单糖、二糖、多糖)、多糖包被(即，大多数真核细胞的外表面上富集糖类的外周区域)，等等。在一些实施方式中，靶点包含脂质和/或其特征部分，例如，油、脂肪酸、甘油酯、激素、类固醇(例如，胆固醇、胆汁酸)、维生素(例如，维生素E)、磷脂、神经鞘脂、脂蛋白，等等。在一些实施方式中，靶点包含核酸和/或其特征部分，例如，DNA核酸、RNA核酸、修饰的DNA核酸、修饰的RNA核酸、包括DNA、RNA、修饰的DNA和修饰的RNA的任何组合在内的核酸。

本领域已知多种标志物。典型的标志物包括细胞表面蛋白质，例如，受体。示例性的受体包括但不限于：转铁蛋白受体、LDL受体、生长因子受体(例如，表皮生长因子受体家族成员(例如，EGFR、Her2、Her3、Her4))或血管内皮生长因子受体、细胞因子受体、细胞粘附分子、整联蛋白、选择素和CD分子。所述标志物可为仅仅存在于或大量存在于恶性肿瘤细胞上的分子，例如，肿瘤抗原。

在一些实施方式中，与非肿瘤细胞相比，结合结构域特异性或优先结合肿瘤细胞。

靶向部分与肿瘤细胞的结合可使用本领域已知的分析方法测量。

在一些实施方式中，肿瘤细胞是癌细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或中枢神经性系统癌症细胞。

在一些实施方式中，与非肿瘤抗原相比，结合结构域能够特异性或优先结合肿瘤抗原。

在一些特点实施方式中，靶点是肿瘤标志物。在一些实施方式中，肿瘤标志物是存在于肿瘤中而不存在于正常器官、组织和/或细胞中的抗原。在一些实施方式中，肿瘤标志物是相对于在正常器官、组织和/或细胞中在肿瘤中更加普遍的抗原。在一些实施方式中，肿瘤标志物是相对于在正常细胞中在恶性癌症细胞中更加普遍的抗原。

在一些实施方式中，靶向部分包含叶酸或其衍生物。

近年来，关于叶酸的研究取得了很大进步。叶酸为一种细胞分裂必需的小分子维生素。肿瘤细胞分裂异常，叶酸盐受体(FR)在肿瘤细胞表面高表达以捕获足以支持细胞分裂的叶酸。

数据显示FR在肿瘤细胞中的表达是其在正常细胞中的表达的20倍至200倍。FR在各种不同的恶性肿瘤中的表达率为：在卵巢癌中为82％，在非小细胞肺癌中为66％，在肾癌中为64％，在结肠癌中为34％，在乳腺癌中为29％(Xia W，Low PS.Late-targetedtherapies for cancer.J Med Chem.2010；14；53(19)：6811-24)。FA的表达率和上皮肿瘤浸润和转移的恶性程度正相关。FA通过FR介导的内吞作用进入细胞，并且FA通过其羧基基团与进入细胞的药物形成FA复合物。在酸性(pH值为5)条件下，FR从FA中分离出来，并且FA将药物释放进入细胞质。

临床上，此系统可用于递送选择性攻击肿瘤细胞的药物。叶酸具有小分子量，不具有免疫原性且具有高稳定性，并且叶酸的合成并不昂贵。更重要的是，药物和载体之间的化学偶联简单，因此，使用FA作为靶向分子构建药物递送系统用于癌症治疗已成为研究热点。目前，临床实验中的EC145(FA化疗药物偶联化合物)可有效攻击癌细胞(Pribble P和Edelman MJ.EC145：a novel targeted agent for adenocarcinoma of the lung.ExpertOpin.Investig.Drugs(2012)21：755-761)。

在一些实施方式中，靶向部分包含细胞外结构域(ECD)或PD-1，PDL-1，CTLA4，CD47，BTLA，KIR，TIM3，4-1BB和LAG3的可溶形式，全长的部分表面配体双调蛋白，β动物纤维素，EGF，肝配蛋白，上皮细胞有丝分裂蛋白抗体(Epigen)，上皮调节蛋白，IGF，神经调节蛋白，TGF，TRAIL或VEGF。

在一些实施方式中，所述靶向部分包含Fab、Fab’、F(ab’)2、单结构域抗体、T和Ab二聚体、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微小抗体、双价抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双价抗体、κ(λ)body、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或者含有一个或一个以上CDR的抗体类似物。

在一些实施方式中，靶向部分为抗体或抗体片段，该靶向部分基于其对抗原的特异性进行选择，所述抗原在目标靶细胞或靶位点上表达。已识别出多种不同的肿瘤特异性抗原或其他疾病特异性抗原，并且那些抗原的抗体已用于或计划用于治疗这些肿瘤或其他疾病。本领域已知的抗体可用于本发明的化合物，尤其用于治疗与靶抗原有关的疾病。可被本发明的抗体-连接体-药物偶联物靶定的目标抗原(及其相关疾病)的实例包括：CD2，CD19，CD20，CD22，CD27，CD33，CD37，CD38，CD40，CD44，CD47，CD52，CD56，CD70，CD79，CD137，4-1BB，5T4，AGS-5，AGS-16，血管生成素2，B7.1，B7.2，B7DC，B7H1，B7H2，B7H3，BT-062，BTLA，CAIX，癌胚抗原，CTLA4，Cripto，ED-B，ErbB1，ErbB2，ErbB3，ErbB4，EGFL7，EpCAM，EphA2，EphA3，EphB2，FAP，纤连蛋白，叶酸盐受体，神经节苷酯GM3，GD2，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)，gp100，gpA33，GPNMB，ICOS，IGF 1R，整联蛋白αv，整联蛋白αvβ，KIR，LAG-3，Lewis Y，间皮素，c-MET，MN碳酸酐酶IX，MUC1，MUC16，粘连蛋白-4，NKGD2，NOTCH，OX40，OX40L，PD-1，PDL1，PSCA，PSMA，RANKL，ROR1，ROR2，SLC44A4，多配体蛋白聚糖-1，TACI，TAG-72，腱生蛋白，TIM3，TRAILR1，TRAILR2，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3。

F.抗体的制备

抗体的所有形式均基于IgG抗体的重链和轻链，其可使用本领域已知的方法制备，所述方法通常包括如下步骤：构建重链基因和轻链基因的表达盒，将两个基因共转染至合适的细胞系统以生成重组抗体并制备稳定的且高产率的细胞克隆，细胞发酵生成cGMP最终抗体产物。

III.药物制剂和给药

本发明进一步涉及包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体的药物制剂。

本文所述的化合物以及药学上可接受的载体(例如，加成盐或其水合物)可使用多种给药途径或给药模式递送至患者。合适的给药途径包括但不限于：吸入给药，透皮给药，口服给药，直肠给药，透过黏膜给药，肠内给药和肠胃外给药(包括肌肉内给药，皮下给药和静脉给药)。优选地，包括作为靶向部分的抗体或抗体片段的本发明的化合物肠胃外给药，更优选地，静脉给药。

本文使用的术语“给药”意在包括将化合物直接和间接地递送至其期望的作用位点的所有方式。

本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或其水合物可单独给药，与本发明的其他化合物联合给药，和/或与其他治疗剂以混合剂的形式联合给药。当然，可与本发明的化合物联合给药的治疗剂的选择可部分取决于正在治疗的病症。

例如，当给药于患有由依赖自诱导物的微生物引起的疾病的患者时，本发明的化合物可以含有用于治疗疼痛、感染和与疾病有关的其他症状或副作用的药剂的混合剂的形式给药。这些药剂包括例如，止痛药，抗生素，等等。

当给药于进行癌症治疗的患者时，化合物可以含有抗癌剂和/或补充增效剂的混合剂的形式给药。该化合物还可以含有治疗放疗的副作用的药剂(例如，止吐剂，辐射保护剂，等等)的混合剂的形式给药。

可与本发明的化合物联合给药的补充增效剂包括，例如，三环类抗抑郁药(例如，丙咪嗪(imipramine)、地昔帕明(desipramine)、阿米替林(amitriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、曲米帕明(trimipramine)、多塞平(doxepin)、去甲替林(nortriptyline)、普罗替林(protriptyline)、阿莫沙平(amoxapine)和马普替林(maprotiline))，非三环类抗抑郁药(例如，舍曲林(sertraline)、曲唑酮(trazodone)和西酞普兰(citalopram))，Ca²⁺拮抗剂(例如，维拉帕米(verapamil)、硝苯地平(nifedipine)、尼群地平(nitrendipine)和卡罗维林(caroverine))，两性霉素，三苯乙醇类似物(例如，它莫昔芬(tamoxifen))，抗心律失常药物(例如，奎尼丁(quinidine))，抗高血压药物(例如，利血平(reserpine))，硫醇消耗物(例如，丁硫氨酸和亚砜亚胺)以及甲酰四氢叶酸钙。

本发明的活性化合物以其自身的形式给药或者以药物组合物的形式给药，在所述药物组合物中，所述活性化合物与一种或一种以上药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合。根据本发明使用的药物组合物通常使用一种或一种以上生理学可接受的载体以常规方式配制，所述生理学可接受的载体包含赋形剂和佐剂，所述生理学可接受的载体有利于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。

对于透过粘膜给药而言，在剂型中使用适于待穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂通常为本领域已知的。

对于口服给药而言，化合物易于通过将活性化合物与本领域已知的药学上可接受的载体结合配制。这些载体能够使本发明的化合物配制成由待治疗的患者口服的片剂、药丸、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆状物和悬浮液。口服的药物制剂可通过如下方式获得：将固体赋形剂与活性剂化合物混合，任选地研磨得到的混合物，并对颗粒混合物进行加工，如果想要得到片剂或糖衣片芯的话，需要在该过程之前加入合适的佐剂。具体而言，合适的赋形剂为填充剂(例如，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇的糖)，纤维素制剂(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧乙基纤维素钠)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可加入崩解剂，例如，交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。

向糖衣片芯提供合适的包衣。为了实现这个目的，可使用浓缩的糖溶液，该溶液可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加至片剂或糖衣药丸包衣中，用于识别或表征不同的活性化合物剂量组合。

可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推合式胶囊和由明胶和增塑剂(例如，丙三醇或山梨糖醇)制成的软的密封的胶囊。推合式胶囊可含有与诸如乳糖之类的填充剂、诸如淀粉之类的粘合剂和/或诸如滑石粉或硬脂酸镁之类的润滑剂和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解于或悬浮于合适的液体中，例如，脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可加入稳定剂。用于口服给药的所有剂型的剂量应当适于这种给药方式。

对于口腔给药而言，组合物可以通过常规方式配制的片剂或含片的形式给药。

对于吸入给药而言，根据本发明使用的化合物便于通过使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以由加压包或喷雾器提供的喷雾的形式递送。在使用加压喷雾的情况下，剂量单位可通过提供递送计量的量的阀来确定。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如，明胶胶囊和药筒)可被配制为含有化合物和合适粉末基体(例如，乳糖或淀粉)的粉末混合物的剂型。

化合物可被配制为通过注射(例如，快速注射或连续输注)方式肠胃外给药的剂型。注射为本发明的组合物的优选的给药方法。用于注射的剂型可以带有添加的防腐剂的单位剂量形式提供，例如，以安瓶或多剂量容器的形式提供。组合物可采用诸如油性载体或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液之类的形式并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂之类的调配剂(formulatory)，并且可加入例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。

用于肠胃外给药的药物剂型包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的悬浮液可制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可包含如下物质：该物质增加悬浮液的粘度，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或药剂，该稳定剂或药剂增加化合物的溶解度，从而制备高度浓缩的溶液。对于注射而言，本发明的药剂可被配制成水性溶液，优选地配制成生理相容性缓冲液(例如，Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)。

可选地，活性成分可为使用前溶解于合适的载体中的粉末形式，所述合适的载体例如，无菌无热原水。

化合物还可被配制成直肠用组合物，例如，栓剂或保留灌肠剂型，例如含有常规栓剂基体(例如可可油或其他甘油酯)。

除了前述剂型之外，化合物还可被配制成长效制剂。这种长期起效的剂型可通过植入或经皮递送(例如，皮下递送或肌肉内递送)、肌肉内注射或透皮贴剂给药。因此，例如，化合物可通过合适的聚合材料或疏水性材料(例如，可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制或可将化合物配制成微溶衍生物，例如，配制成微溶的盐。

药物组合物还可包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇之类的聚合物。

优选的药物组合物为配制成注射剂型的组合物，例如，静脉注射剂型，并且该优选的药物组合物包含基于总的100％重量的药物组合物的约0.01％重量至约100％重量的本发明的化合物。药物配体结合物可为抗体-细胞毒素结合物，其中，选择靶向特定癌症的抗体。

在一些实施方式中，本发明的药物组合物还包含其他治疗剂。

在一些实施方式中，所述其他治疗剂为抗癌剂。

在一些实施方式中，其他抗癌剂选自：抗代谢药物、拓扑异构酶I和拓扑异构酶II的抑制剂、烷基化剂、微管抑制剂、抗雄性激素剂、GNRh调节剂或者它们的混合物。

在一些实施方式中，所述其他治疗剂为化疗剂。

本文中的“化疗剂”是指在治疗癌症中有用的化学化合物。实例包括但不限于：吉西他滨(Gemcitabine)，伊立替康(Irinotecan)，阿霉素(Doxorubicin)，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，阿糖胞苷(Cytosine arabinoside，“Ara-C”)，环磷酰胺(Cyclophosphamide)，塞替派(Thiotepa)，白消安(Busulfan)，细胞毒素，紫杉酚，甲氨蝶呤(Methotrexate)，顺铂(Cisplatin)，美法仑(Melphalan)，长春碱(Vinblastine)和卡铂(Carboplatin)。

在一些实施方式中，第二化疗剂选自：他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，阿那曲唑(anastrozole)，依西美坦(exemestane)，来曲唑(letrozole)，伊马替尼(imatanib)，紫杉醇(paclitaxel)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，洛伐他汀(lovastatin)，含羞草素(minosine)，吉西他滨(gemcitabine)，阿糖胞苷(cytarabine)，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，多西他赛(docetaxel)，戈舍瑞林(goserelin)，长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，诺考达唑(nocodazole)，替尼泊苷(teniposide)，依托泊苷(etoposide)，吉西他滨，埃博霉素(epothilone)，长春瑞滨(vinorelbine)，喜树碱(camptothecin)，柔红霉素(daunorubicin)，放线菌素D(actinomycin D)，米托蒽醌(mitoxantrone)，吖啶(acridine)，阿霉素(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)或去甲氧基柔红霉素(idarubicin)。

IV.试剂盒

另一方面，本发明提供含有本文提供的治疗组合和使用该治疗组合的说明书的试剂盒。所述试剂盒还包括容器，以及任选地，一个或多个小瓶，测试试管，烧瓶，瓶子或注射器。试剂盒的其他形式对于本领域技术人员而言是显而易见的并且在本发明的范围内。

V.医疗用途

另一方面，本发明提供用于治疗受治者体内的疾病的方法，所述受治者需要此治疗的，所述方法包括：将包含治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的治疗组合或药物组合物给药于所述受治者。

除了上述组合物和构建体之外，本发明还提供多种本发明的组合的应用。本发明的组合的应用包括：杀伤肿瘤细胞或癌细胞，抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖或复制，治疗癌症，治疗癌前病症，预防肿瘤细胞或癌细胞的繁殖，预防癌症，预防表达自体免疫抗体的细胞的繁殖。这些应用包括将有效量的本发明的化合物给药于有此需要的动物(例如，哺乳动物或人类)。

本发明的组合可用于治疗受治者(例如人类)体内的疾病(例如癌症，自身免疫性疾病)。本文提供用于治疗肿瘤的组合和应用，其包括向受治者提供药学上可接受的形式的组合物以及药学上有效量的本发明的组合物。

本文中的“癌症”是指人体内的病理状态，其特征为不受控制的细胞增殖。实例包括但不限于：癌症、淋巴瘤、母细胞瘤和白血病。癌症的更加具体的实例包括但不限于：肺(小细胞和非小细胞)癌、乳腺癌、前列腺癌、类癌性癌症、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性髓细胞白血病(AML)和慢性髓细胞白血病(CML)。

本文中的“抑制”或“治疗”是指降低、治疗性和预防性治疗，其中，目的是降低或预防指定的病理性失调或病症。在一个实施例中，给药本发明的化合物之后，癌症患者可经历肿瘤尺寸减小。“治疗”包括(1)抑制患有或表现出疾病的病理或症状的受治者体内的疾病；(2)缓解患有或表现出疾病的病理或症状的受治者体内的疾病；和/或(3)影响患有或表现出疾病的病理或症状的受治者或患者体内的疾病的任何可测量的降低。本发明的化合物在一定程度上可防止癌细胞生长和/或杀死癌细胞，在该程度上的本发明的化合物可为抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。

本文中的“治疗有效量”是指有效“治疗”受治者或哺乳动物体内的失调的本文提供的化合物的量。在治疗癌症的情况下，治疗有效量的药物可降低癌细胞的数目，使肿瘤尺寸减小，抑制癌细胞浸润进入外周器官，抑制肿瘤转移，抑制肿瘤生长至某一程度，和/或一定程度地减轻与癌症相关的症状中的一种或一种以上。

与一种或多种其他治疗剂“联合”给药包括同时给药和以任何顺序连续给药。本文使用的术语“药物组合”是指通过混合活性成分或组合活性成分得到的产品，并且包括活性成分的固定组合和非固定组合这两者。术语“固定组合”是指活性成分(例如通式(I)的化合物)和联合药剂以单个实体或剂量同时给药于患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如通式(I)的化合物)和联合药剂作为分开的实体同时或按顺序(没有特定的时间限制)给药于患者，这种给药方式向患者体内提供治疗有效量的活性成分。后者还用于混合剂治疗，例如，给药三种或三种以上活性成分。

在一些实施方式中，所述疾病是肿瘤或癌症。在一些实施方式中，所述癌症或肿瘤选自：胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、脑癌/CNS、头颈癌、喉癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、尤文氏肉瘤、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、毛细胞白血病、口咽癌、食管癌、喉癌、肾癌或淋巴瘤。

在一些实施方式中，所述疾病包括异常细胞增殖，例如，癌前病变。

本发明在治疗癌症以及抑制动物体内的肿瘤细胞或癌细胞方面特别有用。癌症或癌前病症包括肿瘤、转移或特征为不受控的细胞生长的任何疾病或失调，它们可通过给药本发明的药物-配体复合物进行治疗或预防。化合物将活化部分递送至肿瘤细胞或癌细胞。在一些实施方式中，靶向部分特异性结合癌细胞相关抗原或肿瘤细胞相关抗原或者与癌细胞相关抗原或肿瘤细胞相关抗原相关。由于活性部分与配体接近，在内在化之后，活性部分可通过例如受体介导的内吞作用被吸收进入肿瘤细胞或癌细胞内部。抗原可连接至肿瘤细胞或癌细胞或者可以是与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。一旦活性部分进入细胞内部，连接体被肿瘤细胞相关蛋白酶或癌细胞相关蛋白酶水解或酶解，从而释放活性部分。所释放的活性部分随后自由扩散并诱导或提高免疫细胞或肿瘤细胞的免疫活性。在可选的实施方式中，活性部分从化合物肿瘤微环境中解离，随后药物渗透细胞。

可被本发明的化合物靶定的癌前病症的代表性实例包括：化生、增生、发育异常、结肠直肠息肉、光化性角化病、光化性唇炎、人乳头瘤病毒、黏膜白斑病、扁平苔藓和鲍温病。

可被本发明的化合物靶定的癌症或肿瘤的代表性实例包括：肺癌、结肠癌、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、CNS癌症、肾癌、胰腺癌、胃癌、口癌、鼻癌、子宫颈癌和白血病。对于本领域普通技术人员而言明显的是，可对在化合物中使用的靶向部分进行选择，这样，该靶向部分使活性部分靶定待由药物治疗的肿瘤组织(即，选择对肿瘤特异性抗原具有特异性的靶向部分)。这样的靶向部分的实例是本领域已知的，例如包括：用于治疗乳腺癌的抗-Her2抗体，用于治疗淋巴瘤的抗-CD20抗体，用于治疗前列腺癌的抗-PSMA抗体和用于治疗淋巴瘤(包括非霍奇金氏淋巴瘤)的抗-CD30抗体。

在一些实施方式中，异常增殖的细胞是癌细胞。

在一些实施方式中，癌症选自：乳腺癌，结肠直肠癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，滤泡性淋巴瘤，胃癌，恶性胶质瘤，头颈癌，肝细胞癌，肺癌，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和肾细胞癌。

在一些实施方式中，本发明提供用于杀伤细胞的化合物。所述化合物以足以杀伤所述细胞的量施用于细胞。在示例性的实施方式中，所述化合物给药于带有所述细胞的受治者。在进一步的示例性的实施方式中，所述给药用于减慢或停止包括细胞(例如，所述细胞可以是肿瘤细胞)在内的肿瘤的生长。对于阻止生长的给药而言，细胞的生长速度应当比给药前细胞的生长速度小至少10％。优选地，生长速度减慢至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或完全停止生长。

此外，本发明提供用作药物的本发明的化合物或药物组合物。本发明还提供用于杀伤、抑制或延缓肿瘤细胞或癌细胞的增殖的化合物或药物组合物。

有效剂量

适用于本发明的药物组合物包括包含治疗有效量的活性成分的组合物，所述治疗有效量即为有效实现期望目的的量。对特定应用有效的实际量将(尤其)取决于治疗中的病症。有效量的确定恰好在本领域技术人员的能力范围内(尤其是根据本文具体公开的内容)。

对于本文所述的任何化合物而言，治疗有效量可最先通过细胞培养检测法确定。目标血药浓度为能够抑制细胞生长或分裂的活性化合物的浓度。在优选的实施方式中，细胞活性的至少25％被抑制。能够诱导至少约30％、50％、75％或甚至90％或者更高的细胞活性抑制的活性化合物的目标血药浓度为目前优选的。可监测患者体内的细胞活性抑制的百分数，从而评估所达到的血药浓度的适当性，并且可上调或下调剂量以实现期望的抑制百分数。

如本领域已知的，用于人体的治疗有效量还可通过动物模型来确定。例如，用于人体的剂量可被配制成实现已在动物体内发现的有效循环浓度。如上所述，人体内的剂量可通过监测细胞抑制和上调或下调剂量来调节。

治疗有效剂量还可通过已知的表现出类似药理学活性的化合物的人体数据来确定。所使用的剂量可基于与已知化合物比较的所给药的化合物的相对生物利用度和效力来调节。

基于上述方法和本领域熟知的其他方法为实现人体内的最大效力对剂量进行调节恰好在本领域普通技术人员的能力范围内。

在局部给药的情况下，所给药的化合物的全身循环浓度不是特别重要。在这种情况下，给药化合物以达到在局部区域有效实现期望的结果的浓度。

本文公开的特定抗体的治疗有效量还可作为与免疫治疗剂的组合的成分给药，以单一混合物的形式给药或分开给药。在一些实施方式中，治疗有效量是消除或减小患者肿瘤负担的量或者是预防或降低转移的细胞的增殖的量。剂量可取决于多种参数，包括肿瘤本身的性质、患者的历史、患者的情况、可能共同使用的其他溶瘤药剂以及给药方法。给药方法包括注射(例如，肠胃外注射、皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射，等等)，对于注射而言，抗体被配制在无毒的药学上可接受的载体中，所述载体例如水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白、不挥发的油、油酸乙酯或脂质体。典型的剂量可以是约0.01mg/kg至约20mg/kg，例如约0.1mg/kg至约10mg/kg。其他有效给药方法和有效剂量可通过常规实验确定并且在本发明的范围内。

当将药剂用于联合治疗时，所给药的药剂(本文公开的)的治疗有效量可随所期望的效果以及待治疗的受治者而发生改变。例如，所述受治者可以静脉内的方式接受至少0.01mg/kg(例如，1mg/kg至20mg/kg，2.5mg/kg至10mg/kg，或3.75mg/kg至5mg/kg)的每种抗体药剂。剂量可以分开的若干剂的形式(例如，每天2剂、3剂或4剂)给药，或者可以单一剂量给药。

在联合给药的方法中，药剂可与在本发明中使用的抗体同时给药，或者药剂可在本发明中使用的抗体的给药之前或之后给药。

对于其他给药模式而言，剂量和间隔可分开调节，从而提供对于治疗中的特定临床适应症有效的给药的化合物的血药浓度。例如，在一种实施方式中，根据本发明的化合物可以相对高的浓度每天多次给药。可选地，更加理想的是，以最小有效浓度给药本发明的化合物并且使用较低频率的给药方案。这会提供与个体的疾病的严重程度相称的治疗方案。

使用本文的教导可安排有效的治疗方案，而不导致较大的毒性，并且还完全有效地治疗特定患者表现出的临床症状。这种安排应当包括通过考虑多种因素仔细选择活性化合物，所述多种因素例如，化合物效力、相对生物利用度、患者体重、存在的不良副作用及其严重性、优选的给药模式和所选择的药剂的毒性特征。

虽然本文描述并显示了本发明的优选的实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是举例说明。本领域技术人员可对这些实施方式作出多种改变、修改和替换，而不背离本发明。应当理解的是，本文所述的本发明的可选实施方式可用于实践本发明。通过所附的权利要求来限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也被所附的权利要求涵盖。

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[25]US20140154254A1

实施例

本发明进一步通过下文的实施例来举例说明，但不限于此。下文的实施例部分举例说明了本发明的化合物的制备。

实施例1

抗体的构建

在构建DICAD的过程中，分子CD19xCD13，CD3和CD19的Fv序列如下所示：

CD3：UCHT1。Zhu Z，Carter P.Identification of heavy chain residues in ahumanized anti-CD3 antibody important for efficient antigen binding and Tcell activation.J Immunol.1995 Aug 15；155(4)：1903-10。该参考文献通过引用并入本文。

VH：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.：6)

VL：

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CD19：HD37。美国专利US7,112,324B1，其通过引用并入本文。

VH：

QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.：8)

VL：

DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.：9)

分子按如下构建：

肽链1：CD19VL-连接体-CD3VH-铰链-CH2-CH3；

肽链2：CD3VL-连接体-CD19VH；

如下表3所列，在VH和VL结构域的FR中的指定位点(Kabat)引入点突变。具体而言，对于每个实例而言(#01-#62)，横线之上为肽链1，横线之下为肽链2。

表3

在进行合成之前，使用OptimumGene对密码子的序列进行优化。首先在pUC57载体中构建目标基因，随后再亚克隆至pTGE5载体中。通过Maxiprep制备DNA用于转染。培养CHO3E7细胞并将其以0.3x10⁶个细胞/ml的浓度进行传代。当细胞密度达到1.8-2.5x10⁶个细胞/ml时进行转染。首先，分别将300μl DNA重链和轻链添加至50ml Freestyle CHO培养基中并轻摇混合。随后加入3mg PEI转染试剂并轻摇混合3分钟以上。将混合物在37℃下静置7分钟，随后将其加至450ml细胞悬浮液中，得到总体积500ml。24小时后，将25ml TN1母液(浓度200g/L)加至混合物中。转染后第1天、第3天和第5天分别取1ml悬浮液进行检测。每个样品取50μl进行细胞计数，剩余样品在3000rpm条件下离心处理5分钟，随后将上清液留于-20℃。第6天，收获培养物并且在5500rpm条件下离心处理30分钟。分离上清液、通过0.22μm过滤器过滤并进一步纯化蛋白质。层析柱：5ml Monofinity A树脂(GenScript，批号L00433)层析柱；平衡缓冲液A：20mM PB，150mM NaCl，pH7.2；洗涤缓冲液B：50mM柠檬酸，pH3.5；中和缓冲液C：1M Tris-HCl，pH9.0；流速：2ml/min；梯度：100％梯度洗脱。分离之后，将0.155ml中和缓冲液C加至各个1ml组分中。收集的蛋白质溶液在4℃下PBS(pH7.2)中进行透析持续16小时。

使用上述方法，组合序列HD37和UCHT1构建抗体#1。使用抗体#1作为模型体系，在构建过程中在VH-VL界面上进行不同方式的修饰并且检测了这些修饰对抗体的性质和活性的影响。修饰方法包括：在VH和VL的FR上进行半胱氨酸突变以形成二硫键(VL43-VH105，VL100-VH44)，在VH和VL的FR上分别进行A-W的突变以形成KIH结构(榫卯结构，VL87-VH45)；在VH和VL的FR上采用配对的电荷对氨基酸进行突变以在VL和VH(VL38-VH39，VL44-VH103)之间建立静电相互作用。

分子工程设计如下：在VH-VL界面上引入二硫键(#4)，带电荷的残基对(#7)和KIH(#2)；在VH-VL的界面上分别结合KIH的突变和二硫键(#3)，KIH和配对的带电荷的残基(#11，#12，#26，等等)，以及配对的带电荷的残基和二硫键(#43，#38，#9，#25，等等)；以及在VH-VL的界面上同时引入KIH突变，二硫键和配对的带电荷的残基(#39，等等)。对上述实施例的设计进行筛选，得到具有最高稳定性和纯度的产品。

为了进一步确定二硫键和配对的带电荷的残基的突变位点特异性，构建并检测了更多的分子，包括突变为KIH或配对的带电荷的残基的43(L)-105(H)和100(L)-44(H)，以及突变为二硫键或KIH的38(L)-39(H)。

SDS-Page：通过SDS-PAGE对样品进行分析，随后进行考马斯亮蓝染色。

CD19xCD3双特异性抗体的母体抗体：HD37(#21，抗CD-19)和UCHT1(#20，抗-CD3)同时表达并用作对照。

非还原性的SDS-PAGE显示了未引入任何突变的#1呈现100KD条带和25KD条带。当引入KIH(#2)或配对的带电荷的残基(#7)时，结果仍然相同。然而，当引入二硫键(#3)时，出现了155KD的条带，这说明肽链1和肽链2之间发生共价相互作用；25KD的条带的共存说明仍然存在非共价相互作用。另一方面，配对的带电荷的残基和KIH的突变组合(#11，#12，#26，等等)未能改变#1抗体的性质。二硫键和KIH突变的组合产生与单独的KIH或配对的带电荷的残基类似的作用。当使用配对的带电荷的残基和二硫键的突变组合(#9，#25，#43)时，在非还原性SDS-PAGE中仅出现高纯度的155KD条带，未见非共价相互作用。在还原性和非还原性条件下，抗体#9和#25均显示出与母体抗体#20和#21类似的纯度和分子量。进一步的修饰(例如引入更多的配对的带电荷的残基或KIH)并未改善纯度，相反，这些修饰导致抗体表达水平的降低。作为连接体的5-氨基酸片段RTVAA或9-氨基酸片段(G₂S)₃未对产物的纯度产生显著影响，然而，连接体区域影响了抗体的表达水平。

在将二硫键引入一对VL-VH的界面的条件下，将二硫键进一步引入第二对VL-VH的界面导致在产物中形成大量聚合物，无论对第二对VL-VH是否进行其他修饰。在将二硫键和配对的带电荷的残基引入一对VL-VH的界面的条件下，将配对的带电荷的残基进一步引入第二对VL-VH的界面能够改善产物的纯度，但产物的表达水平会有一定程度的下降。

综上，通过DICAD进行分子构建的优选方法是：通过配对的带电荷的残基促进一对VL和VH与二硫键在FR界面上的共价连接，并且使用5-9个氨基酸的肽链连接VL1和VH2区域以及VL2和VH1区域。

实施例2

稳定性：测试了12个样品的稳定性。2℃至8℃下的稳定性：样品于5℃±3℃下放置10天并且分别在第0天和第10天取样检测。25℃下的稳定性：样品于25℃±2℃下放置10天并且分别在第0天和第10天取样检测。参见表4。

表4

受治者	第0天	2-8℃/10天	25℃/10天
				SEC-HPLC	√	√	√
IEC	√	√	√
				SDS-N	√	√	√
SDS-R	√	X	X
				DSC	X	X	X
cIEF	√	X	X

A.2℃至8℃下的稳定性

SDS-PAGE检测结果：使用GS-200扫描仪对考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶进行扫描拍照，并使用Image Lab5.2.1对照片进行分析，计算蛋白纯度。结果在表5中予以总结。

表5.由非还原性SDS-PAGE检测结果计算的蛋白纯度

SEC-HPLC(尺寸排阻-高效液相色谱)检测结果

由SEC-HPLC检测结果计算得到的蛋白纯度列于表6。

表6

IEC检测结果列于表7。

25℃下的稳定件

SDS-PAGE的检测结果列于表8。

表8.由非还原性SDS-PAGE检测结果计算的蛋白纯度

SEC-HPLC检测结果在表9中予以总结。

表9.由SEC-HPLC检测结果计算的蛋白纯度

如下所描述的，采用SEC方法分析12个样品的稳定性。在15℃、10000rpm条件下对样品进行离心处理5分钟。除去上清液并进行分析。SEC参数为：

流动相A：100mM PBS pH6.7；

流动相B：超纯水；

流速：0.35ml/分钟；

波长：280nm；

柱温：室温；

样品分析时间：20分钟；

进样量：20μg。

表10.由SEC-HPLC检测结果计算的蛋白纯度

注：*第10天首次对样品进行检测，其在4℃下放置6天并再次进行检测。

SEC-HPLC检测结果(稳定性)。12个样品在2℃至8℃或25℃下放置10天并且没有观察到蛋白纯度发生显著变化(显著性：＞1％)。样品#7进行复检；随着放置时间和温度的增加纯度增加/聚集体含量降低，这说明温度有助于聚集体的解聚。在非还原性SDS-PAGE中观察到样品#3、#7、#11的25KD的轻链条带(含量约占20％-30％)，但在SEC-HPLC中未能观察到上述轻链条带，这说明该轻链可能与全长分子结合，在SDS-PAGE处理过程中才被解离。

CEX-HPLC(阳离子交换-高效液相色谱)

在15℃、10000rpm条件下对样品进行离心处理5分钟。除去上清液并进行分析。CEX-HPLC参数为：

流动相A：20mM MES，20mM NaCl pH5.6；

流动相B：20mM MES，300mM NaCl pH5.6；

梯度范围：20％至60％；

流速：1.0ml/分钟；

波长：280nm；

柱温：室温；

样品分析时间：110分钟；

进样量：20μL。

样品于2℃至8℃或25℃放置10天，随后对样品进行处理和检测。在两种条件下，样品#3、#7、#9、#20、#21和#25显示出酸性变体比例增加且碱性变体比例减小，并且温度对该变化的影响不明显。2℃至8℃条件下，样品#11显示出酸性变体增加且碱性变体减少，而在25℃下没有观察到显著变化。样品#25显示出酸性变体和碱性变体均略有增加，并且主峰比例下降。样品#44显示出在两种条件下酸性变体减少且碱性变体增加。在任一条件下，均未观察到样品#38、#39、#40和#43发生显著变化。

IEC检测结果在表11中显示。

表11.IEC检测结果

cIEF：样品在100mM Tris溶液中进行置换，随后如所描述的进行检测。简言之，负载试剂：200μL 3M Urea-cIEF凝胶，12μL两性电解质溶液，20μL阴极缓冲液，2.0μL阳极缓冲液，pI标志物标准品(pI 10.0，9.5，5.5，4.1)各2.0μL，混合。向上述混合物中加入脱盐的样品并再次完全混合，随后上样。检测结果采用32karat分析并显示于表12。

表12.pI标志物

#	pI标志物
		1	10.0
2	9.5
		3	5.5
4	4.1

cIEF检测结果如表13所示。

表13.cIEF检测结果

实施例3

差式扫描量热分析(DSC)检测结果

差式扫描量热分析(DSC)的检测结果示于表14。

表14

实施例4

亲和性

基于人CD-19结合分析的亲和性动力学研究

人CD19结合在Biacore平台上之后，测定一系列样品抗体的SPR(表面等离子共振)信号。由实验结果计算K_a，K_d和K_D，并将其用于评估抗体与人CD19的亲和性。作为配体的CD19分子被捕获于偶联有抗-histine抗体的芯片上。还分别对#20抗-CD3抗体UCHT1和#21抗CD19抗体HD37进行了检测。检测结果示于图7和表15。

表15

基于人CD3-结合分析的亲和件动力学研究

人CD3结合在Biacore平台上之后，测定一系列样品抗体的SPR(表面等离子共振)信号。由实验结果计算K_a，K_d和K_D，并将其用于评估抗体与人CD3的亲和性。作为配体的CD3分子被捕获于偶联有抗-histine抗体的芯片上。随后将五个不同浓度的样品抗体注入系统进行分析。

表16

细胞杀伤分析

使用Jurkat作为效应细胞，分析对靶细胞(Raji细胞)的抗体介导的杀伤作用。操作规程如下描述。

准备效应细胞：Jurkat细胞的传代密度为2x10⁵个细胞/mL，并传代生长4天后开始用于实验。将适当量的细胞悬浮液转移至50ml离心管中并在室温、200g条件下离心处理5分钟。将细胞重悬于细胞培养基中并检测细胞密度和细胞存活率。用细胞培养基调节细胞密度为2x10⁶个活细胞/mL，随后将100μL/孔的细胞悬浮液加至平底96孔板中。效应细胞和靶细胞的比例(E/T)为10∶1，用于实验。

准备靶细胞：Raji细胞的传代密度为2x10⁵个细胞/mL，并在传代生长4天后开始用于实验。将适当量的细胞悬浮液转移至50ml离心管中并在室温、200g条件下离心处理5分钟。将细胞重悬于细胞培养基中并检测细胞密度和细胞存活率。用细胞培养基调节细胞密度为2x10⁵个活细胞/mL，随后将100μL/孔的细胞悬浮液加至其中已存在Raji细胞的平底96孔板中。

抗体的准备：在细胞培养基中稀释样品抗体#4、#9、#25和#49的母液，起始浓度为10ng/ml。以1∶3的比例进一步稀释样品，共稀释10次(10个浓度)，并将10μL/孔的工作溶液分别加至平底96孔板(提前加入了Jurkat细胞和Raji细胞)中。特别设计了样品#49以便更好地和博纳吐单抗进行比较。以BITE结构为基础，构建了以连接体连接HD37和UCHT1的Fv区域(VLCD19-VHCD19-VHCD3-VLCD3)，所述连接体与博纳吐单抗中的相同。由此，样品#49的分子量为54kDa，而其余样品的分子量均为156kDa。

将带有抗体、靶细胞和效应细胞的平底96孔板放置于37℃、5％CO2的孵育器中孵育24小时，随后收集每个孔的上清液并采用ELISA对LDH进行检测。

样品#4、#9、#25和#49的EC50为0.06ng/ml至0.16ng/ml，换算为6.54X10^-10M，9.95X10^-10M，6.00X10^-10M，1.25X10^-9M。样品显示出类似的杀伤作用，这说明带有DICAD结构的抗体与带有BITE结构的抗体在杀伤作用方面类似或优于带有BITE结构的抗体。

体内药效

在Jeko-1/NCG Mixeno模型中测试抗体的体内抗肿瘤作用。在最开始(第0天)，将悬浮于100μL 1∶1 PBS/凝胶的5x10⁶的Jeko-1细胞接种于动物右侧背部皮下。接种后3天(第3天)，将1x10⁷/0.1ml PBMC注射至动物腹腔。当肿瘤的平均体积达到100mm³时，给药样品抗体。对三种抗体(#1@0.5mg/kg，#025@0.5mg/kg，#49@0.5mg/kg)以及一个对照组(pH6.0PBS)进行测试，6个动物/组。所有样品通过尾静脉进行注射给药。#1，#25和载剂每周给药两次，连续给药3周，而#49每天给药持续10天。基于相对肿瘤抑制(TGIRTV)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。图7。

实施例5

DICAD抗体#25介导的Raji细胞杀伤

使用淋巴细胞作为效应细胞，分析针对靶细胞(Raji细胞)的抗体介导的杀伤作用。操作规程描述如下。

准备效应细胞：通过密度梯度离心从血液中新鲜分离PBMC。使用Stemcell分离试剂盒从PBMC中进一步分别分离CD4+T细胞和CD8+T细胞。将PBMC，CD4+T细胞和CD8+T细胞分别重悬于细胞培养基中并且检测细胞密度和细胞存活率。细胞培养基用于将细胞密度调节至6X10⁶个活细胞/mL，随后将50μL/孔的细胞悬浮液加至平底96孔板中。效应细胞与靶细胞的比例(E/T)为20∶1，用于实验。细胞培养基：悬浮有10％HI-FBS和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640(GincoTM，批号：11875093)。

准备靶细胞：Raji细胞的传代密度为2x10⁵个细胞/mL，并在传代生长4天后开始用于实验。将适当量的细胞悬浮液转移至50ml离心管中并在室温、200g条件下离心处理5分钟。对于流式分析而言，用PBS中的1μM的CSFE在暗处对细胞进行染色20分钟并用PBS+5％HI-PBS洗涤两次。将细胞重悬于细胞培养基中并检测细胞密度和细胞存活率。用细胞培养基调节细胞密度为3x10⁵个活细胞/mL，随后将50μL/孔的细胞悬浮液加至平底96孔板中。

抗体的准备：在细胞培养基中将样品抗体#25的母液稀释至不同浓度。将50μL细胞培养基或稀释的溶液加至指示的孔中以得到最终浓度0pM，1pM或100pM。

带有抗体、靶细胞和效应细胞的平底96孔板(总体积150μL/孔)放置在37℃、5％CO₂的孵育器中。在4小时、20小时和40小时取样进行检测。简言之，对于LDH分析而言，在350g条件下对样品进行离心处理持续5分钟并收集每个孔中的上清液，通过ELISA分析LDH。对于流式分析而言，在上述离心之后，将细胞重悬并用PI染色。向每个孔中加入10μL计数珠，随后通过流式细胞仪对样品进行分析。

抗体#25显示出以时间依赖的方式和剂量依赖的方式产生对所有三种类型的细胞(例如，PBMC，CD4+和CD8+)均具有显著的Raji杀伤作用。CD8+T细胞表现出最显著的细胞死亡(图A&B)。在LDH分析中，杀伤作用看起来在接近40个小时时降低。这可能是由于当持续培养时，与抗体不相关的细胞死亡(噪音)增加并且影响分析的准确性。图11和图12。

抗体构建

在构建TRIAD分子的过程中，CD19xCD3，CD3和CD19的Fv序列如下：

CD3：UCHT10

VH(VH3)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.：6)

VL(VL3)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.：7)

CD19：HD370

VH(VH19)：

QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.：8)

VL(VL19)：

DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.：9)

如下表17所述的那样构建分子。

表17

抗体#50的Fab末端识别第二抗原(与由VL2-VH2识别相同)。抗体#54的Fab末端识别第一抗原(与由VL1-VH1识别相同)。在进行合成之前，使用OptimumGene对密码子的序列进行优化。首先在pUC57载体中构建目标基因，随后再亚克隆至pTGE5载体中。通过Maxiprep制备DNA用于转染。培养CHO3E7细胞并将其以0.3x10⁶个细胞/ml的浓度进行传代。当细胞密度达到1.8-2.5x10⁶个细胞/ml时进行转染。首先，分别将300μl DNA重链和轻链添加至50mlFreestyle CHO培养基中并轻摇混合。随后加入3mg PEI转染试剂并轻摇混合3分钟以上。将混合物在37℃下静置7分钟，随后将其加至450ml细胞悬浮液中，得到总体积500ml。24小时后，将25ml TN1(母液浓度200g/L)加至混合物中。转然后第1天、第3天和第5天分别取1ml悬浮液进行检测。取50μl样品进行细胞计数，剩余样品在3000rpm条件下离心处理5分钟，随后将上清液留于-20℃。第6天，收获培养物并且在5500rpm条件下离心处理30分钟。分离上清液、通过0.22μm过滤器过滤并进一步纯化蛋白质。层析柱：5ml Monofinity A树脂(GenScript，批号L00433)层析柱；平衡缓冲液A：20mM PB，150mM NaCl，pH7.2；洗涤缓冲液B：50mM柠檬酸，pH3.5；中和缓冲液C：1M Tris-HCl，pH9.0；流速：2ml/min；梯度：100％梯度洗脱。分离之后，将0.155ml中和缓冲液C加至各个1ml组分中。收集的蛋白质溶液在4℃下PBS(pH7.2)中进行透析持续16小时。

SDS-Page和Western印迹

通过SDS-PAGE对上述样品进行分析，随后进行Western印迹分析。SDS-PAGE结果显示在蛋白质A纯化之后在样品#50和#54中出现少量聚集。样品进一步通过SEC纯化并评估其性质或活性。

纯度分析

样品#50和#54进行SEC纯化并且分析其纯度分别为99.14％和99.24％。

稳定性

测试了12个样品(3，7，9，11，20，21，25，38，39，40，43，44)的稳定性。2℃-8℃的稳定性：样品置于5℃±3℃下持续10天并在第0天和第10天分别进行检测。25℃的稳定性：样品置于25℃±2℃下持续10天并在第0天和第10天分别进行检测。

SDS-PAGE检测结果：使用GS-200扫描仪扫描考马斯亮兰染色的SDS-PAGE凝胶并使用Image Lab 5.2.1进行分析以计算蛋白质纯度。SDS-PAGE结果显示在25℃下放置10天之后#54的纯度降低7.4％，并且观察到蛋白质解离的条带，而#50在任一条件下放置10天之后纯度没有明显改变。表18。

表18.由非还原性SDS-PAGE检测结果计算得到的蛋白质纯度

SEC-HPLC(尺寸排阻-高效液相色谱)检测结果。SEC-HPLC检测结果显示在2℃-8℃下放置10天之后，#50的纯度略微降低(Δ＜3％)，而#54的纯度略微提高(Δ＜2％)，在25℃下放置10天之后，#50的纯度略微降低(Δ＜4％)，而#54的纯度显示出略微提高(Δ＜2％)。表19。

表19：由SEC-HPLC检测结果计算的蛋白质纯度

CEX-HPLC(阳离子交换-高效液相色谱)。CEX-HPLC基于分子的表面净电荷，使用对正电荷具有亲和性的带负电荷的离子交换树脂分离分子。在缓冲液中透析样品，随后在10000rpm，15℃下进行离心处理。除去上清液并进行分析。

CEX-HPLC参数：

流动相A：20mM MES，20mM NaCl pH5.6；

流动相B：20mM MES，300mM NaCl pH5.6；

梯度范围：20％至60％；

流速：1.0ml/分钟；

波长：280nm；

柱温：室温；

样品分析时间：110分钟；

进样量：20μL。

表20.IEC检测结果

#50在2℃-8℃下放置10天，IEC结果显示酸区频率提高(Δ＝10.23％)，主峰区频率(Δ＝3.59％)和碱区频率(Δ＝6.63％)降低。在25℃下放置10天之后，样品的IEC检测结果显示酸区频率增加(Δ＝10.03％)，主峰区频率略微降低(Δ＝0.69％)，碱区频率降低(Δ＝9.34％)。

#54在2℃-8℃下放置10天，IEC结果显示酸区频率略微提高(Δ＝0.51％)，主峰区频率(Δ＝0.88％)和碱区频率(Δ＝1.39％)略微降低。在25℃下放置10天之后，样品的IEC检测结果显示酸区频率略微增加(Δ＝1.11％)，主峰区频率略微降低(Δ＝1.96％)，碱区频率降低(Δ＝2.87％)。

cIEF。在如上所述进行检测之前，将样品在100mM Tris中进行透析。简言之，负载试剂：200μL 3M Urea-cIEF凝胶，12μL两性电解质溶液，20μL阴极缓冲液，2.0μL阳极缓冲液，pI标志物标准品(pI 10.0，9.5，5.5，4.1)各2.0μL，混合。向上述混合物中加入脱盐的样品并再次完全混合，随后上样。检测结果采用32karat分析。

表21.cIEF检测结果

样品	pI值	主峰(修正面积)/％
			#50	7.14	34.37
#54#	7.11	45.47

亲和性：基于人CD19-结合分析进行亲和性动力学研究。人CD19结合在Biacore平台上之后，测定一系列样品抗体的SPR(表面等离子共振)信号。由实验结果计算K_a，K_d和K_D，并将其用于评估抗体与人CD19的亲和性。作为配体的CD19分子被捕获于偶联有抗-histine抗体的芯片上。将5个不同浓度的样品抗体注入系统进行分析。

表22

细胞杀伤分析

使用Jurkat作为效应细胞，分析针对靶细胞(Raji细胞)的抗体介导的杀伤作用。操作规程如下。

准备效应细胞：Jurkat细胞的传代密度为2x10⁵个细胞/mL，并传代生长4天后开始用于实验。将适当量的细胞悬浮液转移至50ml离心管中并在室温、200g条件下离心处理5分钟。将细胞重悬于细胞培养基中并检测细胞密度和细胞存活率。用细胞培养基调节细胞密度为2x10⁶个活细胞/mL，随后将100μL/孔的细胞悬浮液加至平底96孔板中。效应细胞和靶细胞的比例(E/T)为10∶1，用于实验。

准备靶细胞：Raji细胞的传代密度为2x10⁵个细胞/mL，并在传代生长4天后开始用于实验。将适当量的细胞悬浮液转移至50ml离心管中并在室温、200g条件下离心处理5分钟。将细胞重悬于细胞培养基中并检测细胞密度和细胞存活率。用细胞培养基调节细胞密度为2x10⁵个活细胞/mL，随后将100μL/孔的细胞悬浮液加至其中已存在Raji细胞的平底96孔板中。

抗体的准备：在细胞培养基中稀释样品抗体#50和#54的母液，起始浓度为10ng/ml。以1∶3的比例进一步稀释样品，共稀释10次(10个浓度)，并将10μL/孔的工作溶液分别加至平底96孔板(提前加入了Jurkat细胞和Raji细胞)中。

将带有抗体、靶细胞和效应细胞的平底96孔板放置于37℃、5％CO²的孵育器中孵育24小时，随后收集每个孔的上清液并采用ELISA对LDH进行检测。分析结果显示#50和#54的EC50分别为0.3164ng/ml和0.1769ng/ml。两种三特异性抗体对靶细胞具有类似的杀伤作用。

体内药效

在Jeko-1/NCG Mixeno模型中测试抗体的体内抗肿瘤作用。在最开始(第0天)，将悬浮于100μL 1∶1 PBS/凝胶的5x10⁶个Jeko-1细胞接种于动物右侧背部皮下。接种后3天(第3天)，将1x10⁷/0.1ml PBMC注射至动物腹腔。当肿瘤的平均体积达到100mm³时，给药样品抗体。对五种抗体(#1@0.5mg/kg，#25@0.5mg/kg，#50@0.5mg/kg，#54@0.5mg/kg，和#49@0.5mg/kg(作为对照))以及一个对照组(pH 6.0PBS)进行测试，6个动物/组。在实验中所检测的所有抗体是在不同平台上构建的CD3xCD19抗体，其中，#1是双-双抗体，#25是DICAD，#49是BITE，#50和#54是TRIAD(抗体#50的Fab末端识别第二抗原(与由VL2-VH2识别的相同)，抗体#54的Fab末端识别第一抗原(与由VL1-VH1识别的相同))。所有样品通过尾静脉进行静脉注射给药。所有抗体和载剂每周给药两次，连续给药3周，而#49(对照)每天给药持续10天。基于相对肿瘤抑制(TGIRTV)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。

相对肿瘤生长抑制率TGIRTV(％)：TGIRTV＝1-TRTV/CRTV(％)。TRTV/CRTV(％)是相对肿瘤生长速率，即，在某一时间点，接受治疗组的肿瘤体积与接受PBS的对照组的肿瘤体积之间的比值。TRTV和CRTV分别是某一时间点治疗组和对照组的肿瘤体积(TV)。

接种后34天结束实验。所有治疗(抗体)组显示出对肿瘤生长的显著抑制。#50具有92％的TGIRTV(％)，其相对于所检测的所有其他分子(包括在DICAD上构建的#25)具有明显优势。

Claims (27)

1.一种工程化抗体，其包括：

(i)第一多肽，其包含结合第一靶点的第一轻链可变结构域(VL1)和结合第二靶点的第二重链可变结构域(VH2)，其中，所述VL1与所述VH2共价连接；以及

(ii)第二多肽，其包含结合所述第二靶点的第二轻链可变结构域(VL2)和结合所述第一靶点的第一重链可变结构域(VH1)，其中，所述VL2与所述VH1共价连接；并且

其中，所述VL2和所述VH2共价连接，并且

其中，VL2和VH2分别包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体的形成是静电学上不利的。

2.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL1的C端和所述VH2的N端共价连接，所述VL2的C端和所述VH1的N端共价连接。

3.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL1的N端和所述VH2的C端共价连接，所述VL2的N端和所述VH1的C端共价连接。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，所述VL1和所述VH2通过第一肽链连接体连接，并且，其中，所述VL2和所述VH1通过第二肽链连接体连接。

5.如权利要求4所述的抗体，其中，所述第一肽链连接体和所述第二肽链连接体分别独立地包含5至9个氨基酸。

6.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL2和所述VH2通过二硫键共价连接。

7.如权利要求6所述的抗体，其中，所述VL2的FR和所述VH2的FR通过所述二硫键共价连接。

8.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL2的FR被带负电荷的氨基酸取代，所述VH2的FR被带正电荷的氨基酸取代。

9.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL2的FR被带正电荷的氨基酸取代，所述VH2的FR被带负电荷的氨基酸取代。

10.如权利要求8或9所述的抗体，其中，所述带负电荷的氨基酸是天门冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，所述带正电荷的氨基酸是赖氨酸(K)或精氨酸(R)。

11.如权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的铰链区。

12.一种工程化抗体，其包含权利要求11所述的抗体的二聚体，其中，所述二聚体的每个单元通过铰链区连接。

13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至Fc区域。

14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中，所述第一多肽和所述第二多肽分别独立地在其C端连接至白蛋白或PEG。

15.一种工程化抗体，其包含：

(i)第一多肽，其包含结合第二靶点的第二轻链可变结构域(VL2)和结合第一靶点的第一重链可变结构域(VH1)，其中，所述VL2与所述VH1共价连接；

(ii)第二多肽，其包含结合所述第一靶点的第一轻链可变结构域(VL1)，结合所述第二靶点的第二重链可变结构域(VH2)以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，所述VL1与所述VH2共价连接；

(iii)第三多肽，其包含结合第三靶点的第三重链可变结构域(VH3)，CH1结构域，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域；以及

(iv)第四多肽，其包含结合所述第三靶点的第四轻链可变结构域(VL3)和包含半胱氨酸的CL结构域；

其中，所述VL1和VH1结合形成能够结合所述第一靶点的结构域；

其中，所述VL2和VH2结合形成能够结合所述第二靶点的结构域；

其中，所述VL3和VH3结合形成能够结合所述第三靶点的结构域；

其中，所述VL2和VH2通过二硫键共价连接；

其中，所述VL2和所述VH2独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；

其中，所述CH1和所述CL通过二硫键共价连接；并且

其中，所述第二多肽链和所述第三多肽链通过所述铰链结构域和所述CH3结构域共价连接。

16.如权利要求15所述的抗体，其中，所述VL2的C端和所述VH1的N端共价连接并且所述VL1的C端和所述VH2的N端共价连接。

17.如权利要求15所述的抗体，其中，所述VL2的N端和所述VH1的C端共价连接并且所述VL1的N端和所述VH2的C端共价连接。

18.如权利要求15所述的抗体，其中，所述第三靶点和所述第一靶点是相同的靶点。

19.如权利要求15所述的抗体，其中，所述第三靶点和所述第二靶点是相同的靶点。

20.如权利要求15所述的抗体，其中，所述第二多肽的CH2-CH3结构域和所述第三多肽的CH2-CH3结构域是不同的。

21.如权利要求15所述的抗体，其中，所述第二多肽和所述第三多肽是通过在每个结构域上采用不同的突变对CH3结构域的界面进行修饰而进行工程化。

22.如权利要求21所述的抗体，其中，所述CH3结构域中的一个包含Trp取代Thr366，另一个CH3结构域包含Ser，Ala和Val分别取代Thr366，Leu368，Tyr407。

23.如权利要求21所述的抗体，其中，所述CH3结构域中的一个包含Lys取代Asp399和Glu356，另一个CH3结构域包含Asp取代Lys392和Lys409。

24.如权利要求21所述的抗体，其中，所述CH3结构域中的一个包含Lys取代Glu356，Glu357和Asp399，另一个CH3结构域包含Glu，Asp和Glu分别取代Lys370，Lys409和Lys439。

25.如权利要求21所述的抗体，其中，所述CH3结构域中的一个包含His和Ala分别取代Ser364和Phe405，另一个CH3结构域包含Thr和Phe分别取代Tyr349和Thr394。

26.如权利要求21所述的抗体，其中，所述CH3结构域中的一个包含Asp取代Lys370和Lys409，另一个CH3结构域包含Lys取代Glu357和Asp399。

27.如权利要求21所述的抗体，其中，所述CH3结构域中的一个包含Asp和Glu分别取代Leu351和Leu368，另一个CH3结构域包含Lys取代Leu361和Thr366。