RS59045B1 - Monoklonalna antitela za faktor 15 rasta i diferencijacije (gdf-15) - Google Patents

Description

Opis

OBLAST OVOG PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na nova monoklonalna anti-humani-GDF-15 antitela, farmaceutske kompozicije, komplete i upotrebe i ćelijske linije koje mogu da proizvedu monoklonalna antitela opisana u ovom tekstu. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na nova antitela humanog GDF-15 koji može da inhibira rast kancera.

POZADINA

[0002] Do sada, mnogi kanceri i dalje predstavljaju oblasti nezadovoljenih medicinskih potreba, i zato su potrebna sredstva da se rast kancera efektivnije inhibira kao i da se inhibira rast kancera u širem opsegu kancera.

[0003] Mnogi tipovi kancera su poznati po tome što izražavaju faktore rasta kao što su VEGF, PDGF, TGF-β i GDF-15.

[0004] GDF-15, faktor 15 rasta i diferencijacije, je divergentan član TGF-β superporodice. To je protein koji je unutar ćelije izražen kao prekursor, zatim se obrađuje i vremenom se iz ćelije izlučuje u okolinu. I aktivni, u potpunosti obrađen (zreo) oblik i prekursor GDF-15 se mogu pronaći van ćelija. Prekursor se kovalentno vezuje preko svog COOH-završetka aminokiselinske sekvence za vanćelijsku matricu (Bauskin AR et al., Cancer Research 2005) i tako ostaje sa spoljne strane ćelije. Aktivni, u potpunosti obrađen (zreo) oblik GDF-15 je rastvorljiv i može se naći u krvi. Stoga, obrađeni oblik GDF-15 može potencijalno da deluje na bilo koju ciljanu ćeliju unutar tela koja je povezana sa krvotokom, pod uslovom da potencijalna ciljana ćelija izražava receptor za rastvorljivi ligand GDF-15.

[0005] Tokom trudnoće, GDF-15 je prisutan u posteljici pod fiziološkim uslovima. Međutim, mnogi maligni kanceri (naročito agresivni oblici kancera mozga, melanom, kancer pluća, gastrointestinalni tumori, kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer prostate i kancer dojke (Mimeault M and Batra SK, J. Cell Physiol 2010)) pokazuju povišene nivoe GDF-15 u tumoru kao i u krvi. Slično tome, opisane su veze između visoke ekspresije GDF-15 i hemorezistentnosti (Huang CY et al., Clin. Cancer Res.2009) i između visoke ekspresije GDF-15 i slabe prognoze, pojedinačno (Brown DA et al., Clin. Cancer Res. 2009).

[0006] GDF-15 je izražen kod glioma različitih stepena definisanih od strane WHO kako je procenjeno imunohistohemijom (Roth et al., Clin. Cancer Res.2010). Dalje, Roth et al. čvrsto navode da kratka RNK u obliku ukosnice-eksprimirajući DNK konstrukti koji ciljaju endogeni GDF-15 ili kontrolni konstrukti u SMA560 ćelijama glioma. Kada su koristili ove prethodno određene stabilne ćelijske linije, primetili su da stvaranje tumora kod miševa koji su nosioci GDF-15 nokdaun SMA560 ćelija je odloženo u poređenju sa miševima koji su nosioci kontrolnih konstrukata.

[0007] Fairlie WD et al., Biochemistry.2001 Jan 9; 40(1):65-73, daju opis monoklonalnih antitela humanog GDF-15.

[0008] Patentne prijave WO 2005/099746 i WO 2009/021293 se odnose na anti-humano-GDF-15 antitelo (Mab26) koje može da ima antagonizujuće efekte humanog GDF-15 na gubitak težine indukovan tumorom in vivo kod miševa: U ovim dokumentima, imunokompromitovanim miševima su date ćelije ljudskog tumora (ćelije karcinoma prostate DU145) transfektirane plazmidima koji imaju preterano izražen humani GDF-15. Ćelije tumora koje nose plazmide kojima nedostaje GDF-15 sekvenca je služila kao negativna kontrola. Oni miševi koji su izražavali ksenograft GDF-15 su ispoljili gubitak težine indukovan tumorom (klinički naziv: kaheksija) i anoreksiju. Jedno davanje 1 mg Mab26 iz WO 2005/099746 intraperitonealnim putem je dovelo do potpunog preokreta gubitka težine indukovanog tumorom. WO 2005/099746 i WO 2009/021293 ne daju opise dejstava anti-humanog-GDF-15 antitela na rast tumora.

[0009] Slično tome, Johnen H et al. (Nature Medicine, 2007) su prijavili efekte monoklonalnog antihumanog-GDF-15 antitela na anoreksiju indukovanu kancerom i gubitak težine ali nisu primetili nikakva neželjena dejstva anti-humanog-GDF-15 antitela na veličinu tumora formiranu kancerom, čak i kada je antitelo bilo primenjeno u visokoj dozi od 1 mg, i samim tim antitelo nije inhibiralo rast kancera.

[0010] Prema tome, do sada, u tehnici nije bilo potrebe za sredstvima koja bi efektivno inhibirala rast kancera, kao i za sredstvima koja bi inhibirala rast kancera u širem opsegu kancera.

[0011] Samim tim predmet ovog pronalaska je da obezbedi sredstva koja efektivno inhibiraju rast kancera, i sredstva koja se mogu koristiti da se inhibira rast kancera u širem opsegu kancera.

[0012] U pokušaju da se pronađu nova sredstva koja bi inhibirala rast kancera, pronalazači ovog pronalaska su otkrili da novo monoklonalno antitelo humanog GDF-15 može da inhibira rast kancera humanih ksenograftnih tumora kod miševa.

[0013] Pored toga, i nasuprot terapeutskim antitelima poznatim u nauci, antitelo humanog GDF-15 u skladu sa ovim pronalaskom poseduje konstantu disocijacije ravnoteže od oko 790 pM za rekombinantni GDF-15 čak bez dodatnog sazrevanja afiniteta, što je veći afinitet u poređenju sa najpoznatijim terapeutskim antitelima.

[0014] Stoga, antitelo humanog GDF-15 u skladu sa ovim pronalaskom poseduje superiornija svojstva u poređenju sa antitelima poznatim u tehnici, i posebno je koristan za inhibiranje rasta kancera. Prema tome, ovaj pronalazak je potpun.

KRATAK SASDRŽAJ OVOG PRONALASKA

[0015] Ovaj pronalazak daje rešenja za gore pomenute predmete obezbeđujući monoklonalna antitela, farmaceutske kompozicije, komplete, upotrebe i ćelijske linije koje mogu da proizvedu monoklonalna antitela opisana u ovom tekstu, kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0016] Određenije, pronalazači ovog pronalaska su iznenađujuće pokazali da nova monoklonalna antitela humanog GDF-15 i njihovi antigen-vezujući delovi u skladu sa ovim pronalaskom mogu da inhibiraju rast kancera. Ovo je bilo neočekivano jer ta monoklonalna antitela GDF-15 koja su pre bila poznata u tehnici (WO 2005/099746, WO 2009/021293 i Johnen H et al., Nature Medicine, 2007) su bila poznata po tome da izazivaju preokret u gubitku težine indukovane kancerom (odnosno preokret sekundarnog simptoma indukovanog GDF-15 izraženog kancerom), ali su se pokazala kao neuspešna u inhibiranju rasta kancera.

[0017] Pokazujući da nova monoklonalna antitela humanog GDF-15 u skladu sa ovim pronalaskom mogu da inhibiraju rast kancera, pronalazači ovog pronalaska su takođe iznenađujuće pokazali da antitela ovog pronalaska mogu da ciljaju humani GDF-15 protein putem inhibiranja rasta kancera. Očekuje se da se isti mehanizam rasta kancera može primenjivati na veći broj kancera koji prekomerno izražavaju humani GDF-15 uključujući i dole navedene kancere.

[0018] Stoga, ovaj pronalazak se odnosi na monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15, ili njegov antigen-vezujući deo koji može da se veže za humani GDF-15, kako je definisano zahtevom 1.

[0019] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa ovim pronalaskom.

[0020] Dalje, ovaj pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov antigen-vezujući deo ili farmaceutsku kompoziciju u skladu sa ovim pronalaskom za upotrebu u postupku za lečenje kancera kod nekog sisara, pri čemu taj postupak obuhvata davanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela ili farmaceutske kompozicije pomenutom sisaru.

[0021] Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na komplet koji obuhvata farmaceutsku kompoziciju u skladu sa ovim pronalaskom.

[0022] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na ekspresioni vektor koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa ovim pronalaskom.

[0023] Dalje, ovaj pronalazak se odnosi na ćelijsku liniju koja može da proizvede antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa ovim pronalaskom.

[0024] Stoga, obezbeđivanjem novog monoklonalnog antitela humanog GDF-15, ovaj pronalazak obezbeđuje novi inhibitor rasta kancera koji zadovoljava gore definisane potrebe u tehnici.

KRATAK SADRŽAJ CRTEŽA

[0025]

Fig.1: NKG2D ekspresija na NK ćelijama nakon lečenja sa ili bez GDF-15. Ekspresija ćelijskog zida NKG2D je određena na NK ćelijama nakon lečenja naznačenim citokinima u prisustvu ili odsustvu anti-GDF-15 antitela mAb B1-23. Crtež prikazuje intenzitete specifične fluorescencije određene citometrijom protoka, kvantifikovane relativno nespecifičnom kontrolnom telu.

Fig.2: Akt fosforilacija kod ćelijske linije kancera jajnika SK-OV-3. U cilju kvantifikacije Vestern blot tehnike za ćelijsku liniju SK-OV-3 karcinoma jajnika, odnos fosforilizovanog Akt-a i ukupne količine Akt-a je izračunat i normalizovan do netretirane kontrole.

Fig.3: JNK1/2 Fosforilacija u imunim ćelijama. U cilju kvantifikacije Vester blot tehnike, odnos fosforilizovanog JNK1/2 i ukupne količine JNK je izračunat i normalizovan do netretirane kontrole.

Fig.4:

Anti-tumorsko dejstvo B1-23 in vivo. Miševi Balb/c<nu/nu>goli miševi su korišćeni u ksenograft okruženju sa ćelijskom linijom UACC-257 melanoma. Veličina tumora životinje iz kohorte lečene sa B1-23 (otvoreni kvadrati) je bila značajno smanjena, u poređenju sa PBS kontrolnom grupom (ispunjeni čvrsti krugovi). Značaj je definisan kao p<0.05 kako je ocenjeno Vilkoksonovim testom ranga.

DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA

Ovaj pronalazak je onakav kako je definisan u patentnim zahtevima. Definicije

[0026] Ukoliko u nastavku nije drugačije definisano, izrazi koji se koriste u ovom pronalasku će imati svoje uobičajeno značenje koje je poznato stručnjaku.

[0027] Izraz "antitelo" na način koji se koristi u ovom tekstu se odnosi na bilo koje funkcionalno antitelo koje može specifično da se veže za antigen od interesa, što je generalno i opisano u Poglavlju 7 Paul, W.E. (Ed.).: Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989. Bez određenog ograničenja, izraz "antitelo" obuhvata antitela od bilo koje izvorne vrste, uključujući piliće i sisare kao što su miš, koza, nehumani primati i čovek. Poželjno, antitelo je humanizovano antitelo. Antitelo je poželjno monoklonalno antitelo koje se može pripremiti pomoću postupaka poznatih u tehnici. Izraz "antitelo" obuhvata IgG-1, -2, -3, ili -4, IgE, IgA, IgM, ili IgD izotip antitela. Izraz "antitelo" obuhvata monomerna antitela (kao što su IgD, IgE, IgG) ili oligomerna antitela (kao što je IgA ili IgM). Izraz "antitelo" takođe obuhvata – bez određenih ograničenja - izolovana antitela i modifikovana antitela kao što su antitela nastala genetičkim inženjeringom, npr. himerična antitela.

[0028] Nomenklatura domena antitela prati izraze poznate u tehnici. Svaki monomer antitela obuhvata dva teška lanca i dva laka lanca, generalno poznata u tehnici. Od njih, svaki težak i svaki lak lanac obuhvata varijabilni domen (oznaka VHza težak lanac i VLza lak lanac) koji je važan za vezivanje antigena. Ovi teški i laki varijabilni domeni obuhvataju (redom od N-završetka do C-završetka) regije FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4 (FR, okvirna regija; CDR, regija koja određuje komplementarnost koja je takođe poznata i kao hipervarijabilna regija). Identifikacija i označavanje gore pomenutih regija antitela unutar sekvence antitela je generalno u skladu sa Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.1983), ili Chothia et al. (Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature.1989 Dec 21-28;342(6252):877-83.), ili može biti izvedeno pomoću IMGT/V-QUEST softvera opisanog u Giudicelli et al. (IMGT/V-QUEST, integrisani softverski program za imunoglobulin i receptor T ćelije V-J i analize preraspodele V-D-J. Nucleic Acids Res.2004 Jul 1;32(Web Server issue):W435-40.). Poželjno, gore naznačene regije antitela su identifikovane i označene upotrebom IMGT/V-QUEST softvera.

[0029] "Monoklonalno antitelo" predstavlja antitelo od suštinski homogene populacije antitela, pri čemu su antitela suštinski identična u sekvenci (tj. identična izuzev manje frakcije antitela koja sadrži modifikacije sekvence koje se prirodno javljaju kao što su modifikacije aminokiselina na njihovim N- i C-završecima). Za razliku od poliklonalnih antitela koja sadrže mešavinu različitih antitela usmerenih na brojne epitope, monoklonalna antitela su usmerena na isti epitop i samim tim su izuzetno specifična. Izraz "monoklonalno antitelo" uključuje (ali bez ograničenja) antitela koja su dobijena iz populacije monoklonalnih ćelija dobijenih iz jednog ćelijskog klona, kao što su na primer antitela proizvedena postupkom hibridoma opisanog u Kohler i Milstein (Nature, 1975 Aug 7;256(5517):495-7) ili Harlow and Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988). Monoklonalno antitelo se takođe može dobiti putem drugih prigodnih postupaka, uključujući tehnike prikaza faga kao što su one opisane u Clackson et al. (Nature.1991 Aug 15;352(6336):624-8) ili Marks et al. (J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97). Monoklonalno antitelo može biti antitelo optimizovano za svojstva antigen-vezivanja kao što su smanjene Kd vrednosti, optimizovana asocijacija i kinetika disocijacije postupcima poznatim u tehnici. Na primer, Kd vrednosti mogu biti optimizovane pomoću postupaka prikazivanja uključujući prikaz faga, što dovodi do monoklonalnih antitela zrelog afiniteta. Izraz "monoklonalno antitelo" nije ograničen samo na sekvence antitela vrste određenog porekla ili od vrste jednog jedinog porekla. Samim tim, izraz "monoklonalno antitelo" obuhvata himerna monoklonalna antitela kao što su humanizovana monoklonalna antitela.

[0030] "Humanizovana antitela" su antitela koja sadrže humane sekvence i manji deo nehumanih sekvenci koji dodeljuje specifičnost vezivanja antigenu od interesa (npr. humani GDF-15). Po pravilu, humanizovana antitela se stvaraju zamenjivanjem sekvenci hipervarijabilne regije iz antitela humanog primaoca sekvencama hipervarijabilne regije iz antitela nehumanog donora (npr. antitelo miša, zeca, pacova) koja se vezuje za antigen od interesa (npr. humani GDF-15). U nekim slučajevima, okvirna regija sekvenci antitela primaoca može takođe biti zamenjena odgovarajućim sekvencama antitela donora. Pored sekvenci dobijenih od antitela donora i primaoca, „humanizirano antitelo“ može sadržati ili ne sadržati druge (dodatne ili zamenske) ostatke ili sekvence. Ti drugi ostaci ili sekvence mogu služiti da se dalje unaprede svojstva antitela kao što su svojstva vezivanja (npr. da se smanje Kd vrednosti) i/ili imunogenetska svojstva (npr. da se smanji antigenetičnost kod ljudi). Neograničavajući primeri za postupke dobijanja humanizovanih antitela su poznati u tehnici, npr. iz Riechmann et al. (Nature.1988 Mar 24;332 (6162) : 323-7) ili Jones et al. (Nature.1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5).

[0031] Izraz "humano antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži sekvence varijabilnog i konstantnog domena. Ova definicija obuhvata antitela koja imaju humane sekvence koje su nosioci samo jedne supstitucije aminokiseline ili modifikacije koje mogu da služe za dalje unapređenje svojstava antitela kao što su vezivanje (npr. da se smanje Kd vrednosti) i/ili imunogenetska svojstva (npr. smanjenje antigenetičnosti kod ljudi). Izraz "humano antitelo" isključuje humanizovana antitela gde deo nehumanih sekvenci dodeljuje specifičnost vezivanja antigenu od interesa.

[0032] "Antigen-vezujući deo" antitela onako kako se upotrebljava u ovom tekstu se odnosi na deo antitela koji zadržava sposobnost antitela da se specifično veže za antigen (npr. GDF-15), odnosno "antigen-vezujući deo" se može takmičiti sa antitelom za specifično vezivanje za antigen. "Antigenvezujući deo" može sadržati jedan ili više fragmenata antitela. Bez određenog ograničenja, može se proizvesti bilo kojim prigodnim postupkom poznatim u tehnici, uključujući postupke rekombinantne DNK i pripremu hemijske ili enzimske fragmentacije antitela. Delovi antigen-vezivanja mogu biti Fab fragmenti, F(ab') fragmenti, F(ab')2fragmenti, antitela jednog lanca (scFv), antitela jednog domena, dijatela ili bilo koji drugi deo(delove) antitela koji dozvoljava(dozvoljavaju) zadržavanje vezivanja za antigen.

[0033] "Antitelo" (npr. monoklonalno antitelo) ili "antigen-vezujući deo" može biti izveden ili povezan sa različitim molekulom. Na primer, molekuli koji mogu biti povezani sa antitelom su drugi proteini (npr. druga antitela), molekulsko obeležje (npr. fluorescentni, luminescentni, obojeni ili radioaktivni molekul), farmaceutski i/ili toksični agens. Antitelo ili antigen-vezujući deo može biti direktno povezan (npr. u obliku fuzije između dva proteina), ili preko molekul linkera (npr. bilo kog prigodnog tipa linkera poznatog u tehnici).

[0034] Kako su upotrebljeni u ovom tekstu, izrazi "vezivanje" ili "vezivati" se odnose na specifično vezivanje za antigen od interesa (npr. humani GDF-15). Poželjno, Kd vrednost je manja od 100 nM, poželjnije manja od 50 nM, još poželjnije manja od 10 nM, još poželjnije manja od 5 nM i najpoželjnije manja od 2 nM.

[0035] Izraz "epitop" kako se upotrebljava u ovom tekstu, se odnosi na mali deo antigena koji formira mesto vezivanja za antitelo.

[0036] U kontekstu ovog pronalaska, vezivanje ili kompetitivno vezivanje antitela ili njihovih antigenvezujućih delova za antigen od interesa (npr. humani GDF-15) se meri upotrebom merenja površinske plazmonske rezonance kao referentnim standardnim ogledom, kako je opisano u nastavku teksta.

[0037] Izrazi "KD" ili "KDvrednost" se odnose na konstantu disocijacije ravnoteže kako je poznato u tehnici. U kontekstu ovog pronalaska, ovi izrazi se odnose na konstantu disocijacije ravnoteže antitela u smislu određenog antigena od interesa (npr. humani GDF-15). Konstanta disocijacije ravnoteže je mera sklonosti kompleksa (npr. kompleksa antigen-antitelo) da se reverzibilno disocira na svoje komponente (npr. antigen i antitelo). Za antitela u skladu sa ovim pronalaskom, KDvrednosti (kao što su vrednosti za antigen humani GDF-15) se generalno određuju upotrebom merenja površinske plazmonske rezonance kako je opisano dole ispod.

[0038] Izraz "rast kancera" kako se upotrebljava u ovom tekstu se odnosi na bilo koji rast kancera koji je moguće izmeriti. Za kancere koji formiraju čvrste tumore, "rast kancera" se odnosi na porast veličine tumora koja se može izmeriti tokom vremena. Ukoliko kancer formira samo jedan jedini tumor, "rast kancera" se odnosi samo na povećanje veličine jednog tumora. Ukoliko kancer formira više tumora kao što su metastaze, "rast kancera" se odnosi na porast veličine svih tumora koji se mogu izmeriti. Za čvrste tumore, veličina tumora se može izmeriti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući snimanje magnetnom rezonancom i kompjutersku tomografiju (CT sken).

[0039] Za leukemije koje karakteriše prisustvo kancerogenih ćelija krvnog sistema u krvi, "rast kancera" se odnosi na povećanje broja ćelija kancera koji se može izmeriti po zapremini krvi. Kako bi se takva merenja sprovela, ćelije kancera se mogu identifikovati iz uzoraka krvi upotrebom postupka poznatog u tehnici, uključujući mere ćelijske morfologije, ili postupkom bojenja markera tumorskih ćelija proteina kao što su tumor marker ćelijske površine proteina, npr. bojenjem sa specifičnim antitelima i ćelije raka se mogu prebrojati.

[0040] Izrazi kao što su "inhibiranje rasta kancera" kako što su upotrebljeni u ovom tekstu se odnose na merljivu inhibiciju rasta kancera kod pacijenta koji se leči antitelom. Poželjno, inhibicija je statistički značajna. Inhibicija rasta kancera može biti ocenjena poređenjem rasta kancera u grupi pacijenata koji se leče prema ovom pronalasku sa kontrolnom grupom nelečenih pacijenata, ili poređenjem grupe pacijenata koja prima standardnu terapiju za lečenje kancera poznatu u tehnici kao i terapiju prema ovom pronalasku sa kontrolnom grupom pacijenata koja samo prima standardnu terapiju za lečenje kancera poznatu u tehnici. Takva ispitivanja za procenu inhibicije rasta kancera su dizajnirana u skladu sa prihvaćenim standardima za klinička ispitivanja, npr. duplo-slepa, randomizirana ispitivanja koja imaju dovoljnu statističku moć. Izraz "inhibiranje rasta kancera" obuhvata inhibiciju rasta kancera gde se rast kancera delimično inhibira (odnosno gde je rast kancera kod pacijenta odložen u poređenju sa kontrolnom grupom pacijenata), inhibiciju gde se rast kancera u potpunosti inhibira (odnosno gde je rast kancera kod pacijenta zaustavljen), i inhibiciju gde je rast kancera obrnut (tj. kancer se skuplja).

[0041] "Izolovano antitelo" kako se upotrebljava u ovom tekstu predstavlja antitelo koje je identifikovano i odvojeno od većine komponenata (težinom) njegove izvorne okoline, npr. od komponenata ćelijske kulture hibridoma ili različite ćelijske kulture koja ja korišćena za njegovu proizvodnju (npr. proizvodne ćelije kao što su ćelije CHO koje rekombinantno izražavaju antitelo).

Razdvajanje se izvodi tako da se u dovoljnoj količini uklone komponente koje na drugi način mogu da utiču na pogodnost antitela za željene primene (npr. sa terapeutskom upotrebom anti-humanog GDF-15 antitela u skladu sa ovim pronalaskom). Postupci za pripremu izolovanog antitela su poznati u tehnici i uključuju hromatografiju Proteina A, hromatografiju razmene anjona, hromatografiju razmene katjona, filtraciju koja zadržava virus i ultrafiltraciju. Poželjno, priprema izolovanog antitela je najmanje 70 % čista (mas.), poželjnije najmanje 80 % čista (mas.), još poželjnije najmanje 90 % čista (mas.), još poželjnije najmanje 95 % čista (mas.), i najpoželjnije najmanje 99 % čista (mas.), kako je izmereno upotrebom Lorijeve metode za određivanje proteina.

[0042] "Dijatelo" kako se upotrebljava u ovom tekstu predstavlja mali dvovalentni antigen-vezujući deo antigena koje obuhvata teški lanac povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca na istom polipeptidnom lancu povezanom peptidnim linkerom koji je isuviše kratak da bi sparivanje između dva domena na istom lancu bilo dozvoljeno. Ovo dovodi do sparivanja sa komplementranim domenima drugog lanca u sklopu dimeričnog molekula sa dva mesta za vezivanje. Dijatela mogu biti dvovalentna i monospecifična (kao što su dijatela sa dva mesta za vezivanje antigena za humani GDF-15), ili mogu biti dvovalentana i dvospecifična (npr. dijatela sa dva mesta za vezivanje antigena, jedno koje predstavlja mesto za vezivanje za humani GDF-15, i drugo koje predstavlja mesto za vezivanje za različiti antigen). Detaljan opis dijatela se može pronaći u Holliger P et al. (""Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments." Proc Natl Acad Sci U S A.1993 Jul 15;90(14):6444-8.).

[0043] "Antitelo jednog domena" (koje se takođe naziva i "Nanobody™") kako se upotrebljava u ovom tekstu predstavlja fragment antitela koji se sastoji od jednog monomernog varijabilnog domena antitela. Strukture i postupci za dobijanje antitela jednog domena su poznati u tehnici, npr. iz Holt LJ et al.

("Domain antibodies: proteins for therapy." Trends Biotechnol.2003 Nov;21(11):484-90.), Saerens D et al. ("Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics." Curr Opin Pharmacol.2008 Oct;8(5):600-8. Epub 2008 Aug 22.), i Arbabi Ghahroudi M et al. ("Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies." FEBS Lett.1997 Sep 15;414(3):521-6.).

[0044] Izraz "viši" kako se upotrebljava u ovom tekstu znači da je vrednost (npr. a GDF-15 nivo) u pacijentovom uzorku viša od vrednosti odgovarajućeg kontrolnog uzorka ili grupe kontrolnih uzoraka. Poželjno, razlika je statistički značajna.

[0045] Izraz "povišeni nivoi GDF-15" kako se upotrebljava u ovom tekstu znači da su nivoi GDF-15 kod humanog pacijenta povišeni pre primene antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela ili farmaceutske kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom, u poređenju sa srednjim nivoima GDF-15 u krvi zdravih kontrolnih humanih individua koji predstavljaju referencu.

[0046] Poželjna referenca za srednju vrednost za GDF-15 nivo u krvi kod zdravih kontrolnih humanih individua iznosi < 0.8 ng/ml. Očekivani opseg je između 0.2 ng/ml i 1.2 ng/ml kod zdravih kontrolnih humanih individua (Reference: Tanno T et al.: "Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease." Curr Opin Hematol.2010 May; 17(3): 184-190.).

[0047] Poželjno, nivoi su 1.2-puta viši, poželjnije 1.5-puta viši, još poželjnije 2-puta viši i najpoželjnije 5-puta viši.

[0048] Izraz "pre davanja" kako se upotrebljava u ovom tekstu označava vremenski period neposredno pre davanja antitela, njegovog fragmenta ili farmaceutske kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom. Poželjno, izraz "pre davanja" označava period od 30 dana neposredno pre davanja; najpoželjnije period od jedne nedelje neposredno pre davanja.

[0049] Izrazi "značajan", "značajno", itd. kako se upotrebljavaju u ovom tekstu se odnose na statistički značajnu razliku između vrednosti.

[0050] Izrazi "kancer" i "ćelija kancera" se upotrebljavaju u ovom tekstu u skladu sa njihovim uobičajenim značenjima u tehnici (videti na primer Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: New York 2006.850p.).

[0051] Prema ovom pronalasku, svako javljanje izraza "koji obuhvata " može opciono biti zamenjeno sa izrazom "čine ga".

Postupci i tehnike

[0052] Generalno, ukoliko ovde nije drugačije definisano, postupci koji se koriste u ovom pronalasku (npr. postupci kloniranja ili postupci koji se odnose na antitela) se izvode prema postupcima poznatim u tehnici, npr. postupci opisani u Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual.", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989), Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology." Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992), i Harlow and Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988).

[0053] Vezivanje monoklonalnih anti-humani-GDF-15 antitela u skladu sa ovim pronalaskom je generalno ocenjeno upotrebom merenja površinske plazmonske rezonance pomoću Biorad ProteOn XPR36 sistema i Biorad GLC senzornih čipova kako je opisano za anti-humani GDF-15 mAb-B1-23 u Primeru 1.

[0054] Poravnanja sekvenci u skladu sa ovim pronalaskom se izvode pomoću BLAST algoritma (videti Altschul et al.(1990) "Basic local alignment search tool." Journal of Molecular Biology 215. p.403-410.; Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST i PSI-BLAST: nova generacija programa za pretragu baze podataka proteina. Nucleic Acids Res.25:3389-3402.). Poželjno, sledeći parametri se koriste: maksimalne ciljane sekvence 10; dužina reči 3; BLOSUM 62 matrica; cene praznina: postojanje 11, produžetak 1; podešavanje kondicionog kompozicionog rezultata matrice. Stoga, kada se upotrebljavaju u vezi sa sekvencama, izrazi kao što su "identitet" ili "identičan" odnose se na vrednost identiteta dobijenu upotrebom BLAST algoritma.

[0055] Monoklonalna antitela u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti proizvedena bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući ali bez ograničenja postupke iz Siegel DL ("Recombinant monoclonal antibody technology." Transfus Clin Biol.2002 Jan;9(1):15-22.). U poželjnom izvođenju ovog pronalaska, antitelo u skladu sa ovim pronalaskom se proizvodi ćelijskom linijom hibidroma B1-23 deponovanom u Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142 po Budipeštanskom sporazumu. Depozit je podnet 29. septembra 2011. godine.

[0056] Ćelijska proliferacija se može izmeriti prigodnim postupcima poznatim u tehnici, uključujući (ali bez ograničenja) vizuelnu mikroskopiju, metaboličke oglede kao što su oni koji mere mitohondrijski redoks potencijal (npr. ogled sa MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromidom); bojenje resazurinom koje je takođe poznato i kao Alamar Blue® ogled), bojenje poznatih endogenih biomarkera proliferacije (npr. Ki-67), i postupcima koji mere ćelijsku sintezu DNK (npr. ogledi BrdU i [<3>H]-Timidina ugrađivanja).

[0057] Imunosupresija može biti izmerena prigodnim postupcima poznatim u tehnici, uključujući (ali bez ograničenja) proliferaciju imunih ćelija, izlučivanje citokina, unutarćelijsko bojenje citokina protočnom citometrijom, merenje citokina pomoću qRT-PCR, preusmerenu lizu ciljanih ćelija, dalje oglede citotoksičnosti ili degranulacije, nishodnu regulaciju aktivirajućih receptora imunih ćelija (kao što je NKG2D), ushodnu regulaciju inhibitornih receptora imunih ćelija, formiranje imunološke sinapse, infiltraciju imune ćelije. Za izraz imunosupresija da bi se primenjivao, meri se efekat u najmanje jednom od tih ili nekih drugih prigodnih ogleda. Nedostatak efekta u specifičnom ispitivanju ne znači opšte odsustvo imunosupresije.

[0058] Nivoi humanog GDF-15 mogu biti izmereni bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući merenja nivoa GDF-15 mRNK postupcima uključujući (ali bez ograničenja) kvantitativni PCR (qRT-PCR) u realnom vremenu za humani GDF-15 mRNK upotrebom prajmera specifičnih za humani GDF-15, mRNK in situ hibridizacijom sa sondama specifičnim za humani GDF-15, postupcima dubokog sekvenciranja; i uključujući merenja nivoa GDF-15 proteina postupcima uključujući (ali bez ograničenja) masenu spektrometriju za proteine ili peptide dobijene iz humanog GDF-15, Vestern blot tehniku upotrebom antitela specifičnih za humani GDF-15, protočnu citometriju upotrebom antitela specifičnih za humani GDF-15, strip testove upotrebom antitela specifičnih za humani GDF-15, ili imunocitohemiju upotrebom antitela specifičnih za humani GDF-15. Za takve postupke upotrebom antitela specifičnih za humani GDF-15, anti-humani GDF-15 antitela ovog pronalaska su poželjni, a antitelo ovog pronalaska proizvedeno ćelijskom linijom B1-23 hibridoma deponovano u Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142 je najpoželjnije.

Izvođenja ovog pronalaska

[0059] Kako je gore opisano, pronalazači pokazuju da humani GDF-15 protein može biti ciljan bilo kojim antitelom ovog pronalaska tako da se rast kancera inhibira.

[0060] Ovo je iznenađujući nalaz imajući u vidu da nauka kaže da se samo gubitak težine indukovan kancerom može vratiti anti-GDF-15 antitelima, i da rast kancera ne može biti inhibiran (WO 2005/099746, WO 2009/021293 i Johnen H et al., Nature Medicine, 2007).

[0061] Kada se uzme u obzir ovaj pronalazak, postaje jasno da anti-GDF-15 antitela poznata iz WO 2005/099746, WO 2009/021293 i Johnen H et al., Nature Medicine, 2007 samo inhibiraju jedan od efekata humanog GDF-15 (odnosno gubitak težine indukovan kancerom), ali ne inhibira druge efekte humanog GDF-15 kao što su oni koji se odnose na rast kancera. U smislu ovog pronalaska, jedno moguće objašnjenje za ovo neinhibiranje je da antitela koja su poznata iz gore pomenutih dokumenata mogu samo da utiču na transport humanog GDF-15 preko krv-mozak barijere (formirajući veliki kompleks koji se ne može transportovati preko barijere krv-mozak) ali ne mogu da vezuju humani GDF-15 na način koji čini nemogućim za interakciju sa svojim receptorom (npr. receptorom koji se nalazi na ćelijama izvan mozga).

[0062] Od sledećih svojstava antitela ovog pronalaska se očekuje da doprinesu njihovoj sposobnosti da potpunije inhibiraju efekte humanog GDF-15, uključujući inhibiciju rasta kancera:

Široka specifičnost vezivanja za oblike humanog GDF-15

[0063] Antitela ovog pronalaska mogu da se vežu za zreli rekombinantni humani GDF-15 (predstavljen sa SEQ ID No: 8) i samim tim mogu da se vežu za aktivni, u potpunosti obrađeni (zreli) humani GDF-15.

[0064] Pored toga, izvođenjem eksperimenata bojenja sa mAb-B1-23 antitelom u skladu sa ovim pronalaskom na humanim ćelijama, pronalazači pokazuju da mAb-B1-23 antitelo u skladu sa ovim pronalaskom može da se veže za humani GDF-15 prekursor na humanim ćelijama.

[0065] Stoga, očekuje se da vezivanje i efekti antitela ovog pronalaska (npr. inhibicija rasta kancera) nisu ograničeni na efekte na određenom obliku humanog GDF-15.

Visok afinitet vezivanja

[0066] Antitela i njihovi antigen-vezujući delovi u skladu sa ovim pronalaskom imaju visok afinitet vezivanja, što je demonstrirano mAb-Bl-23 antitelom u skladu sa ovim pronalaskom koji poseduje konstantu disocijacije ravnoteže od oko 790pM za rekombinantni humani GDF-15. Značajno, vrednosti takvog afiniteta su superiorne u odnosu na većinu postojećih terapeutskih antitela, npr. terapeutskog antitela Rituximab koje poseduje konstantu disocijacije ravnoteže od oko 8 nM.

[0067] Visok afinitet vezivanja obezbeđuje da se antitelo humanog GDF-15 u skladu sa ovim pronalaskom stabilno vezuje za humani GDF-15, tako da su efekti humanog GDF-15 uključujući efekte na rast kancera efektivno inhibirani.

Vezivanje za isprekidani ili konformacioni epitop

[0068] Antitela i njihovi antigen-vezujući delovi u skladu sa ovim pronalaskom se vezuju za isprekidani ili konformacioni epitop, kako je demonstrirano u nastavku za mAb-B1-23 antitelo u skladu sa ovim pronalaskom.

[0069] Vezivanje antitela i njihovih antigen-vezujućih delova u skladu sa ovim pronalaskom za isprekidani ili konformacioni GDF-15 epitop može pomoći da se humani GDF-15 održava u specifičnoj konformaciji i samim tim doprinosi efektivnoj inhibiciji efekata humanog GDF-15 uključujući efekte na rast kancera.

[0070] Stoga, ovaj pronalazak se odnosi na sledeća izvođenja:

A) Antitela, vektori i ćelijske linije

[0071] Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15, ili njegov antigen-vezujući deo koji može da se veže za humani GDF-15, pri čemu varijabilni domen teškog lanca obuhvata CDR3 regiju koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 5 ili neku aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu njoj, a gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata CDR3 regiju koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 7 ili neku aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu njoj, kako je definisano zahtevom 1.

[0072] U ovom tekstu je takođe opisano monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu varijabilni domen teškog lanca obuhvata CDR3 regiju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 5 ili neku aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje u najviše jednoj aminokiselini iz aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 5, a gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata CDR3 regiju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 7 ili neku aminokiselinsku sekvencu ili neku aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje u najviše jednoj aminokiselini iz aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 7.

[0073] Opet u drugom izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, varijabilni domen teškog lanca obuhvata regiju koja obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regiju i koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1 ili sekvencu 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu njoj, i varijabilni domen lakog lanca obuhvata regiju koja obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regiju i koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2 ili sekvencu 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu njoj.

[0074] U poželjnom izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, varijabilni domen teškog lanca obuhvata regiju koja obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regiju i koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1 ili sekvencu 95% identičnu njoj, varijabilni domen lakog lanca obuhvata regiju koja obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regiju koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2 ili sekvencu 95% identičnu njoj.

[0075] U poželjnijem izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, varijabilni domen teškog lanca obuhvata regiju koja obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regiju i koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1 ili sekvencu 98% identičnu njoj, i varijabilni domen lakog lanca obuhvata region koji obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regiju i koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2 ili sekvencu 98% identičnu njoj.

[0076] U opet poželjnijem izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, varijabilni domen teškog lanca obuhvata regiju koja obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regiju i koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1, i varijabilni domen lakog lanca obuhvata regiju koja obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regiju i koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2.

[0077] Opis se takođe odnosi na monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu varijabilni domen teškog lanca obuhvata CDR1 regiju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 3 i CDR2 regiju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 4, a gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata CDR1 regiju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 6 i CDR2 regiju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 7. U poželjnom aspektu, antitelo može imati CDR3 sekvence kako je definisano u bilo kom od gore opisanih izvođenja ovog pronalaska.

[0078] Ovaj opis se takođe odnosi i na monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15, ili njegov antigen-vezujući deo, gde to antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može da inhibira rast kancera kod nekog sisara, poželjno humanog pacijenta.

[0079] U skladu sa pasusom iznad, ovaj opis može da se odnosi na antigen-vezujući deo koji može da se veže za humani GDF-15, pri čemu antigen-vezujući deo predstavlja antitelo jednog domena (takođe se naziva i "Nanobody™"). U jednom aspektu, antitelo jednog domena obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 aminokiselinske sekvence svakog od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, i SEQ ID NO: 5. U drugom aspektu, antitelo jednog domena obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 aminokiselinske sekvence svakog od SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, i SEQ ID NO: 7. U poželjnom aspektu, antitelo jednog domena je humanizovano antitelo.

[0080] Poželjno, antitela ovog pronalaska koja mogu da se vežu za humani GDF-15 ili njihov antigenvezujući deo poseduju konstantu disocijacije ravnoteže za humani GDF-15 koja je jednaka ili manja od 100 nM, manja od 20 nM, poželjno manja od 10 nM, poželjnije manja od 5 nM i najpoželjnije između 0.1 nM i 2 nM, pod uslovom da je konstanta disocijacije ravnoteže u skladu sa patentnim zahtevima.

[0081] U ovom tekstu je takođe opisano antitelo koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo koji se vezuje za isti humani GDF-15 epitop kao antitelo za humani GDF-15 koje se može dobiti iz ćelijske linije B1-23 deponovane u Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142. Kako je opisano u ovom tekstu, vezivanje antitela za humani GDF-15 prema ovom pronalasku se ocenjuje merenjima površinske plazmonske rezonance kao referentnim standardnim postupkom, u skladu sa postupcima opisanim u Primeru 1.

Vezivanje za isti epitop na humanom GDF-15 se na sličan način može oceniti eksperimentima kompetitivnog vezivanja površinske plazmonske rezonance antitela za humani GDF-15 koji se može dobiti iz ćelijske linije B1-23 i antitela za koje se očekuje da se veže za isti humani GDF-15 epitop kao antitelo za humani GDF-15 koje se može dobiti iz ćelijske linije B1-23.

[0082] U veoma poželjnom izvođenju ovog pronalaska, antitelo ovog pronalaska predstavlja monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15 koje se može dobiti iz ćelijske linije B1-23 deponovane u Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142 ili njegov antigen-vezujući deo.

[0083] U poželjnom izvođenju ovog pronalaska, antitelo koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa ovim pronalaskom je humanizovano monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo. Za bilo koju datu sekvencu ne-humanog antitela u skladu sa ovim pronalaskom (tj. sekvencu antitela donora), humanizovana monoklonalna anti-humani-GDF-15 antitela ovog pronalaska ili njihovi antigen-vezujući delovi mogu biti generisani u skladu sa tehnikama poznatim u tehnici, kako je gore opisano.

[0084] U veoma poželjnom izvođenju ovog pronalaska, monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo je humanizovano antitelo dobijeno iz monoklonalnog antitela koje može da se veže za humani GDF-15 koji se može dobiti iz ćelijske linije B1-23 deponovane u Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142, ili njegov antigen-vezujući deo, pod uslovom da je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa patentnim zahtevima.

[0085] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15, ili njegov antigen-vezujući deo koji može da se veže za humani GDF-15, pri čemu vezivanje predstavlja vezivanje za konformacioni ili isprekidani epitop na humanom GDF-15 obuhvaćen aminokiselinskim sekvencama iz SEQ ID No: 25 i SEQ ID No: 26, kako je definisano u patentnim zahtevima. U poželjnom aspektu ovog izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo predstavlja antitelo ili njegov antigen-vezujući deo kako je definisano u bilo kom gore navedenom izvođenju ovog pronalaska.

[0086] U drugom izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, antitelo koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo je dijatelo. U jednom aspektu ovog izvođenja, dijatelo je dvovalentno i monospecifično, sa dva identična mesta vezivanja antigena za humani GDF-15. U drugom, alternativnom aspektu ovog izvođenja, dijatelo je dvovalentno i dvospecifično, sa jednim mestom vezivanja antigena koje predstavlja mesto vezivanja za humani GDF-15, i drugim koje predstavlja mesto vezivanja antigena za različiti antigen. Neograničavajući primeri za različit antigen u skladu sa ovim drugim aspektom izvođenja su i) antigeni ćelijske površine koji su izraženi zajedno sa GDF-15 na višim nivoima istog kancera (npr. na višim nivoima u poređenju sa kontrolnim uzorkom istog pacijenta koji je dobijen iz nekancerogenog dela tkiva a koje predstavlja tkivo od kog potiče kancer), i ii) antigeni ćelijske površine imunog sistema koji su poznati kao korisni antigeni za regrutovanje ćelija imunog sistema na mesto tumora.

[0087] U opet drugom izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, antitelo koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo je povezan sa lekom. U neograničavajućim aspektima ovog izvođenja, lek može biti poznat antikancerogeni agens i/ili imunostimulišući molekul. Poznati antikancerogeni agensi obuhvataju alkilišuće agense kao što su cisplatin, karboplatin, oksaliplatin, mehloretamin, ciklofosfamid, hlorambucil, i ifosfamid; anti-metabolite kao što su azatioprin i merkaptopurin; alkaloide kao što su vinka alkaloidi (npr. vinkristin, vinblastin, vinorelbin, i vindesin), taksane (npr. paklitaksel, docetaksel) etopozid i tenipozid; inhibitore topoizomeraza kao što su kamptotekini (npr. irinotekan i topotekan); citotoksični antibiotici kao što su aktinomicin, antraciklini, doksorubicin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin, epirubicin, bleomicin, plikamicin i mitomicin; i radioizotopi. Očekuje se da vezivanje antitela ili njegovih antigen-vezujućih delova ovog pronalaska za antikancerogene agense dovede do jače inhibicije rasta tumora kancera u poređenju sa antitelom bez antikancerogenog agensa, zato što konjugat koji se dobija kao rezultat se akumulira na mestu tumora usled prisustva GDF-15 u tumoru, što dovodi do akumulacije antikancerogenog agensa na mestu tumora i do pojačanih efekata antikancerogenog agensa na tumor.

[0088] U daljem izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, antitelo koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo je modifikovano tagom aminokiseline. Neograničavajući primeri takvih tagova uključuju Polihistidin (His-) tag, FLAG-tag, Hemaglutinin (HA) tag, glikoprotein D (gD) tag, i c-mic tag. Tagovi se mogu koristiti u različite svrhe. Na primer, mogu se koristiti kao pomoć kod prečišćavanja antitela koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo, ili mogu da se koriste za detekciju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela (npr. kada se koristi u dijagnostičkim ogledima). Poželjno, takvi tagovi su prisutni na C-završetku ili N-završetku antitela koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo.

[0089] U ovom pronalasku, antitelo koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo može da inhibira rast kancera kod nekog sisara, poželjno humanog pacijenta.

[0090] U drugom poželjnom izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, humani GDF-15 predstavlja rekombinantni humani GDF-15 sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom sa SEQ ID No: 8.

[0091] U opet drugom poželjnom izvođenju ovog pronalaska u skladu sa gore pomenutim izvođenjima, ovo vezivanje antitela koje može da se veže za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo predstavlja vezivanje za konformacioni ili isprekidani epitop na humanom GDF-15.

[0092] Poželjno, monoklonalna antitela ovog pronalaska koja mogu da se vežu za humani GDF-15 ili njegov antigen-vezujući deo predstavljaju izolovana antitela.

[0093] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na ekspresioni vektor koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa ovim pronalaskom kako je gore definisano.

[0094] Dalje, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ćelijsku liniju koja može da proizvede antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa ovim pronalaskom.

[0095] U jednom izvođenju ovog pronalaska, ćelijska linija može biti izvedena iz bilo koje ćelijske linije koja je poznata u tehnici i koja je pogodna za proizvodnju antitela ili njegovih antigen-vezujućih delova.

[0096] U poželjnom izvođenju ovog pronalaska, ćelijska linija predstavlja ćelijsku liniju B1-23 deponovanu u Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142.

[0097] U drugom poželjnom izvođenju ovog pronalaska, ćelijska linija sadrži ekspresioni vektor u skladu sa ovim pronalaskom kako je gore definisano.

B) Farmaceutske kompozicije

[0098] U daljem izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata bilo koje od antitela ili njihove antigen-vezujuće delove u skladu sa ovim pronalaskom kako je gore definisano.

[0099] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku se pripremaju u skladu sa poznatim standardima za pripremu farmaceutskih kompozicija koje sadrže antitela i njihove delove.

[0100] Na primer, kompozicije se pripremaju tako da se mogu pravilno čuvati i davati, npr. upotrebom farmaceutski prihvatljivih komponenti kao što su nosači, ekscipijensi ili stabilizatori.

[0101] Takve farmaceutski prihvatljive komponente nisu toksične u količinama koje se koriste prilikom davanja farmaceutske kompozicije pacijentu. Farmaceutski prihvatljive komponente koje se dodaju farmaceutskim kompozicijama mogu da zavise od određene namenske upotrebe farmaceutske kompozicije i načina primene.

[0102] Uopšteno, farmaceutski prihvatljive komponente koje se koriste u vezi sa vim pronalaskom se koriste u skladu sa znanjem dostupnim u tehnici, npr. od Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA.

C) Terapeutski postupci i proizvodi koji se upotrebljavaju u ovim postupcima

[0103] Ovaj opis se dalje odnosi na postupak za lečenje kancera kod nekog sisara, pri čemu taj postupak obuhvata davanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela kako je gore definisano, ili farmaceutske kompozicije kako je gore definisano pomenutom sisaru. Kao druga mogućnost, ovaj pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa ovim pronalaskom kako je gore definisano, ili farmaceutsku kompoziciju u skladu sa ovim pronalaskom kako je gore definisano za upotrebu u ovim postupcima. U veoma poželjnom aspektu ovih izvođenja, sisar je humani pacijent.

[0104] Svi postupci za lečenje kancera kako je pomenuto u ovom tekstu isključuju tretiranje gubitka težine indukovanog kancerom u skladu sa WO 2005/099746, WO 2009/021293 i Johnen H et al., Nature Medicine, 2007. Ovo odražava činjenicu da se u skladu sa ovim tehničkim učenjem samo gubitak težine indukovan kancerom može vratiti anti-GDF-15 antitelima, i da rast kancera ne može biti inhibiran.

[0105] Kada se uzme u obzir ovaj pronalazak, postaje jasno da anti-GDF-15 antitela poznata iz WO 2005/099746, WO 2009/021293 i Johnen H et al., Nature Medicine, 2007 samo inhibiraju jedan od efekata humanog GDF-15 (odnosno gubitak težine indukovan kancerom), ali ne inhibiraju druge efekte humanog GDF-15 kao što su oni koji se odnose na rast kancera.

[0106] Inhibicija rasta kancera u skladu sa ovim pronalaskom ne isključuje dodatne ili sekundarne koristi koje se takođe javljaju kod pacijenata. Na primer, dodatna ili sekundarna korist može uticati na gubitak težine indukovan kancerom. Međutim, smatra se da je primarno lečenje za koje se i traži zaštita je ono za inhibiranje rasta kancera, bilo koji sekundarni ili dodatni efekti samo odražavaju opcione, dodatne prednosti lečenja rasta kancera.

[0107] U poželjnom izvođenju ovog pronalaska antitela, njegovih antigen-vezujućih delova ili farmaceutskih kompozicija za upotrebu u gore pomenutim postupcima, humani pacijent ima povišene nivoe GDF-15 u krvi pre davanja. U podgrupi pacijenata sa povišenim nivoima GDF-15 u krvi, od postupaka lečenja naznačenih u ovom tekstu se očekuje da naročito budu efektivni u inhibiranju rasta kancera. U najpoželjnijem aspektu, nivoi GDF-15 predstavljaju proteinske nivoe GDF-15 izmerene upotrebom antitela u skladu sa ovim pronalaskom koje se može dobiti iz ćelijske linije hibridoma B1-23 deponovane u Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142, poželjno izmerene imunohemijom.

[0108] U drugom primeru izvođenja ovih antitela, njihovih antigen-vezujućih delova ili farmaceutskih kompozicija za upotrebu u gore pomenutim postupcima, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo je jedini sastojak koji je farmaceutski aktivan protiv kancera koji se koristi u postupku.

[0109] U alternativnom primeru izvođenja antitela, njihovih antigen-vezujućih delova ili farmaceutskih kompozicija za upotrebu u gore pomenutim postupcima, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo se koristi u kombinaciji sa jednim ili više daljih sastojaka farmaceutski aktivnih protiv kancera. U jednom aspektu ovog izvođenja, jedan ili više daljih sastojaka farmaceutski aktivnih protiv kancera su poznati kao antikancerogeni agensi i/ili imunostimulišući molekuli kako je gore definisano.

[0110] U poželjnom izvođenju ovog pronalaska antitela, njihovih antigen-vezujućih delova ili farmaceutskih kompozicija za upotrebu u gore pomenutim postupcima, kancer je odabran iz grupe koju čine kanceri mozga uključujući gliom, kanceri nervnog sistema, melanom, kancer pluća, kancer usne ili usne duplje, kancer jetre, leukemija, Hodgkin limfom, Ne-hodgkin limfom, kancer bešike, kancer grlića materice, kancer tela materice, kancer testisa, kancer tiroidne žlezde, kancer bubrega, kancer žuči, multipli mijelom, kancer nazofarinksa, kancer larinksa, kancer farinksa, kancer jednjaka, gastrointestinalni tumori uključujući kancer želudca i kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika i kancer dojke, poželjno iz grupe koju čine melanom, kancer prostate, kancer dojke, kanceri mozga uključujući gliom, kolorektalni kancer, kancer želudca, kancer jednjaka i kancer jajnika, a najpoželjnije melanom. U jednom izvođenju ovog pronalaska kancer je odabran iz gore pomenute grupe, koja dalje obuhvata kancer endometrijuma, kao što je endometrijalni karcinom, kancer dojke uključujući podtipove kancera dojke, određenije trostruko negativan kancer dojke i kancer bešike kao što je karcionm urotelijalnih ćelija.

[0111] U drugom poželjnom izvođenju ovog pronalaska antitela, njihovih antigen-vezujućih delova ili farmaceutskih kompozicija za upotrebu u gore pomenutim postupcima, tumor ili tumori nastali od kancera imaju više nivoe humanog GDF-15 pre davanja u poređenju sa kontrolnim uzorkom istog pacijenta koji je dobijen iz nekancerogenog dela tkiva koje predstavlja tkivo porekla kancera, poželjno 1.2-puta više nivoe, poželjnije 1.5-puta više nivoe, još poželjnije 2-puta više nivoe i najpoželjnije 5-puta više nivoe. U podgrupi pacijenata koji imaju više nivoe GDF-15 kod tumora ili više tumora koji nastaju od kancera u poređenju sa gore pomenutim kontrolnim uzorkom, očekuje se da postupci lečenja naznačeni u ovom tekstu budu naročito efektivni u inhibiranju rasta kancera.

[0112] U veoma poželjnom izvođenju ovog pronalaska antitela, njihovih antigen-vezujućih delova ili farmaceutskih kompozicija za upotrebu u gore pomenutim postupcima, postupak obuhvata inhibiranje rasta kancera. U poželjnom aspektu ovog izvođenja, rast kancera je zaustavljen. U poželjnijem aspektu, kancer se skuplja.

[0113] U poželjnom izvođenju ovog pronalaska antitela, njihovih antigen-vezujućih delova ili farmaceutskih kompozicija za upotrebu u gore pomenutim postupcima, postupak obuhvata indukovanje ubijanja ćelija kancera putem NK ćelija i CD8+ T ćelija kod humanog pacijenta. Usled njihove sposobnosti sprečavanja nishodne regulacije posredovane GDF-15 poznatog regulatora imunog nadzora NKG2D, od antitela ili njihovih antigen-vezujućih delova u skladu sa ovim pronalaskom se očekuje da obnove imuni nadzor i da indukuju ubijanje ćelija kancera putem NK ćelija i CD8+ T ćelija, pored pokušaja antitela ili njihovih antigen-vezujućih delova koji su nezavisni od imunog sistema.

D) Kompleti

[0114] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje komplete koji obuhvataju farmaceutske kompozicije ovog pronalaska definisane gore.

[0115] U jednom izvođenju ovog pronalaska, kompleti predstavljaju komplete za upotrebu definisane u patentnom zahtevu 16.

[0116] Ovaj opis takođe obezbeđuje komplet za dijagnostiku koji obuhvata bilo koje od antitela ili njihovih antigen-vezujućih delova u skladu sa ovim pronalaskom.

[0117] Komplet za dijagnostiku se može koristiti da se detektuje da li tumor ili tumori kancera pacijenta nastali od kancera imaju više nivoe humanog GDF-15 u poređenju sa kontrolnim uzorkom istog pacijenta koji je dobijen iz nekancerogenog dela tkiva koja predstavlja tkivo porekla kancera.

[0118] Komplet za dijagnostiku se takođe može koristi da detektuje da li humani pacijent koji ima kancer ima povišene nivoe GDF-15 u krvi.

E) Sekvence

[0119] Aminokiselinske sekvence naznačene u ovoj prijavi su sledeće (redom od N-završetka do C-završetka; predstavljene u jednoslovnom kodu aminokiseline):

SEQ ID No: 1 (Regija varijabilnog domena teškog lanca koji obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regija od polipeptidne sekvence monoklonalnog anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23) :

SEQ ID No: 2 (Regija varijabilnog domena lakog lanca koji obuhvata FR1, CDR1, FR2, CDR2 i FR3 regija od polipeptidne sekvence monoklonalnog anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23):

SEQ ID No: 3 (Regija peptidne sekvence teškog lanca CDR1 monoklonalnog anti-humanog GDF-15 mAb-Bl-23):

GFSLSTSGMG SEQ ID No: 4 (Regija peptidne sekvence teškog lanca CDR2 monoklonalnog anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23):

IYWDDDK SEQ ID No: 5 (Regija peptidne sekvence teškog lanca CDR3 monoklonalnog anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23):

ARSSYGAMDY SEQ ID No: 6 (Regija peptidne sekvence lakog lanca CDR1 monoklonalnog anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23):

QNVGTN

Regija peptidne sekvence lakog lanca CDR2 monoklonalnog anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23

SAS SEQ ID No: 7 (Regija peptidne sekvence lakog lanca CDR3 monoklonalnog anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23):

QQYNNFPYT

SEQ ID No: 8 (rekombinantni zreli humani GDF-15 protein):

SEQ ID No: 9 (humani GDF-15 proteinski prekursor):

SEQ ID No: 10 (humani GDF-15 proteinski prekursor N-završetak i C-završetak GSGS linker):

SEQ ID No: 11 (Flag peptid): DYKDDDDKGG

SEQ ID No: 12 (HA peptid): YPYDVPDYAG

SEQ ID No: 13 (peptid dobijen od GDF-15): ELHLRPQAARGRR

SEQ ID No: 14 (peptid dobijen od GDF-15): LHLRPQAARGRRR

SEQ ID No: 15 (peptid dobijen od GDF-15): HLRPQAARGRRRA

SEQ ID No: 16 (peptid dobijen od GDF-15): LRPQAARGRRRAR

SEQ ID No: 17 (peptid dobijen od GDF-15): RPQAARGRRRARA

SEQ ID No: 18 (peptid dobijen od GDF-15): PQAARGRRRARAR

SEQ ID No: 19 (peptid dobijen od GDF-15): QAARGRRRARARN

SEQ ID No: 20 (peptid dobijen od GDF-15): MHAQIKTSLHRLK

SEQ ID No: 25 (GDF-15 peptid koji obuhvata deo GDF-15 epitopa koji se vezuje za B1-23) :

EVQVTMCIGACPSQFR SEQ ID No: 26 (GDF-15 peptid koji obuhvata deo GDF-15 epitopa koji se vezuje za B1-23) :

TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

[0120] Sekvence nukleinske kiseline naznačene u ovoj prijavi su sledeće (u redosledu od 5' do 3'; predstavljene u skladu sa standardnim kodom nukleinske kiseline):

SEQ ID No: 21 (DNK nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu definisanu u SEQ ID No: 1):

SEQ ID No: 22 (DNK nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu definisanu u SEQ ID No: 2):

SEQ ID No: 23 (DNK nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu definisanu u SEQ ID No: 5):

GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC SEQ ID No: 24 (DNK nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu definisanu u SEQ ID No: 7):

CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG

F) Primeri

[0121] Ovaj pronalazak je ilustrovan sledećim ne ograničavajućim primerima:

Primer 1: Generisanje i karakterizacija GDF-15 antitela Bl-23

[0122] Antitelo Bl-23 je generisano u GDF-15 nokaut miša. Rekombinantni humani GDF-15 (SEQ ID No: 8) se upotrebljava kao imunogen.

[0123] Ćelijska linija hibridoma B1-23 koja stvara mAb-Bl-23 je deponovana u Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142, u skladu sa Budapeštanskim sporazumom.

[0124] Pomoću sistema strip testa dostupnog na tržištu, B1-23 se identifikuje kao IgG2a (kappa lanac) izotip. Koristeći merenja površinske plazmonske rezonance, konstanta disocijacije (Kd) je određena kao što sledi:

Vezivanje monoklonalnog anti-humani-GDF-15 antitela anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23 u skladu sa ovim pronalaskom kako je određeno merenjem površinske plazmonske rezonance pomoću Biorad ProteOn XPR36 sistema i Biorad GLC senzornih čipova:

Za pripremu biosenzora rekombinantni zreli humani GDF-15 protein je imobilisan na ćelijama protoka 1 i 2. Na jednoj protočnoj ćeliji rekombinantni GDF-15 dobijen iz Baculovirus-transfektovanih ćelija insekata (HighFive ćelije insekata) je korišćen a na drugoj rekombinantni protein dobijen iz izražavanja u E. coli. GLC senzorni čip je aktiviran pomoću Sulfo-NHS (N-Hydroksisulfosucinimida) i EDC (1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid hidrohlorida) (Biorad ProteOn Amine Coupling Kit) u skladu sa preporukom proizvođača, senzorna površina je naknadno napunjena proteinima do gustine od oko 600RU (1Ru = 1pg mm<-2>). Ne-reakcione kuplujuće grupe su zatim ugašene perfuzijom sa 1M etanolaminom pH 8.5 i biosenzor je ekvilibrisan perfuzijom čipa sa puferom u radu (10M HEPES, 150mM NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% Tween-20, pH 7.4, označena kao HBS150). Dve protočne ćelije su korišćene kao kontrole, prazna bez kuplovanog proteina i jedna kuplovana sa ne-fiziološkim proteinskim partnerom (humani Interleukin-5), koji je imobilisan pomoću iste hemije kuplovanja i iste gustine spajanja. Za merenje interakcije anti-humani GDF-15 mAb-B1-23 je rastvoren u HBS150 i kao analit je korišćeno šest različitih koncentracija (koncentracija: 0.4, 0.8, 3, 12, 49 i 98 nM). Analit je preliven preko biosenzora pomoću postavke jednokratne kinetike kako bi se izbeglo istovremeno regenerisanje, sva merenja su izvedena na 25°C i pri brzini protoka od 100µl min<-1>. Za obradu efekta ukupne nominalne vrednosti i nespecifično vezivanje za matricu senzora je uklonjeno oduzimanjem SPR podataka prazne protočne ćelije (protočna ćelija 3) od svih drugih SPR podataka. Dobijeni senzogram se analizira pomoću softvera ProteOn Manager verzija 3.0. Za analizu kinetike vezivanja preuzeta je interakcija tipa 1:1 Langmuir. Za konstantu brzine asocijacije vrednost od 5.4±0.06x10<5>M<-1>s<-1>(kon) i za konstantu brzine disocijacije vrednost od 4.3±0.03x10<-4>s<-1>(koff) se mogu odrediti (vrednosti su za interakciju antihumanog GDF-15 mAb-Bl-23 sa GDF-15 dobijenim iz ekspresije ćelije insekta). Konstanta disocijacije ravnoteže se računa pomoću jednačine KD= koff/konkako bi se dobila vrednost od oko 790pM. Vrednosti afiniteta za interakciju od GDF-15 koji je dobijen od ekspresije E. coli i anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23 razlikuju se manje od faktora od 2, konstante brzine za GDF-15 dobijene iz ćelija insekata i E. coli odstupaju za oko 45% i samim tim su u okviru tačnosti SPR merenja i postoji verovatnoća da odražavaju stvarnu razliku u afinitetu. U korišćenim uslovima anti-humani GDF-15 mAb-B1-23 ne pokazuje vezivanje za humani interleukin-5 i samim tim potvrđuje specifičnost podataka o interakciji i anti-humanog GDF-15 mAb-B1-23.

[0125] Aminokiselinska sekvenca iz rekombinantnog humanog GDF-15 (kako je izraženo kod Baculovirus-transfektovanih ćelija insekata) je:

(SEQ ID No: 8)

[0126] Stoga, korišćenjem merenja površinske plazmonske rezonance, konstanta disocijacije (Kd) od 790pM je određena. Kao poređenje: terapeutski upotrebljeno antitelo Rituximab ima značajno niži afinitet (Kd = 8 nM).

Primer 2: Antagonizacija GDF-15 posredovanih efekata sa mAB B1-23

[0127]

a) NKG2D (Natural Killer Group 2D) receptor, koji je izražen na NK ćelijama i CD8+ T ćelijama, je poznat da ima važnu ulogu u imunom nadzoru protiv tumora. Transformisane kao i ćelije zaražene virusom izražavaju ligande, koji se vezuju za NKG2D receptor, i na taj način aktiviraju funkcije citotoksičnog efektora opisanih imunih ćelija. Na taj način se transformisane ćelije mogu detektovati i imuni sistem ih eliminiše. Nakon lečenja imunih ćelija bilo sa rekombinantnim humanim GDF-15 ili GDF-15 ćelijama tumora izlučenim in vitro u roku od 72 sata, nivo ekspresije NKG2D na ćelijskoj površini limfocita je nishodno regulisan (Fig.1). Nakon inkubacije u trajanju od 72 sata imune ćelije su obojene sledećim FACS-antitelima: anti CD3, anti CD56, anti-NKG2D. Koristeći ovu kombinaciju antitela, eksperiment je fokusiran na NK ćelije i ekspresiju njihove NKG2D površine. Nizak NKG2D nivo na imunim ćelijama dovodi do oštećene lize tumora/ciljanih ćelija. Nishodna regulacija NKG2D posredovana GDF-15 je sprečena pomoću mAb B1-23.

Stoga je zaključeno da humani GDF-15 nishodno reguliše ekspresiju NKG2D na površini ćelije limfocita i samim tim nishodno reguliše imuni nadzor protiv tumora. Vezivanjem za humani GDF-15, antitela ovog pronalaska mogu da spreče nishodnu regulaciju NKG2D posredovanu GDF-15 i trebalo bi da mogu da obnove imuni nadzor i da indukuju ubijanje ćelija kancera putem NK ćelija i CD8+ T ćelija.

b) Lečenje ćelijske linije kancera jajnika SK-OV-3 sa rekombinantnim GDF-15 dovodi do fosforilacije AKT. AKT je molekul, koji je deo PI3K-puta i doprinosi aktivaciji proliferacije ćelija. U ovom eksperimentu SK-OV-3 ćelije su lečene sa 10 ng/ml rekombinantnog GDF-15 10 minuta na 37°C, 5% CO2. Prethodna inkubacija u trajanju od 5 minuta 2 µg mAb-B1-23 sa 10 ng/ml GDF-15 na 37°C blokirala je GDF-15 posredovanu AKT-fosforilaciju (Fig.2). Ovo pokazuje neutrališući efekat mAb-B1-23.

c) Lečenje imunih ćelija sa rekombinantnim GDF-15 dovodi do fosforilacije JNK, kinaze, koju aktiviraju ili citotoksini ili se aktivira usled stresa. Antagonizacija 10 ng/ml GDF-15 sa 2 µg mAb-B1-23 (prethodna inkubacija u trajanju od 5 minuta na 37°) blokira GDF-15 posredovanu JNKl/2-fosforilaciju (Fig.3) .

Primer 3: Inhibicija proliferacije ćelija kancera koristeći mAb B1-23

[0128] Podaci dobijeni sa B1-23 pokazuju antiproliferativno dejstvo antitela na ćelije kancera in vitro. Najjače proliferativno dejstvo je primećeno prilikom korišćenja ćelijske linije kancera prostate LnCap, koja proizvodi dosta GDF-15. Metabolički ogled (Alamar Blue test) je pokazao smanjenje proliferacije od 30% nakon 72 sata u prisustvu mAb-B1-23, u poređenju sa kontrolnom grupom, u kojoj antitelo nije primenjeno. Budući da su citotoksični efekti antitela isključeni u različitim ogledima, ovaj efekat pokazuje značajno smanjenu brzinu ćelijske podele nakon blokade GDF-15.

Primer 4: mAb B1-23 inhibira rast tumora in vivo

[0129] U jednoj postavci eksperimentalnog ispitivanja, rast tumora je proučavan kod modela SK-Mel28 ćelije humanog melanoma kod imunodeficijentnih NMRI miševa.7.5 x 10<6>ćelije melanoma su ugrađene pod kožu svakog miša.23. dana nakon inokulacije (tj. tokom faze eksponencijalnog rasta malignoma), mAb B1-23 antitelo je dato prvi put. Nakon ubrizgavanja mAb B1-23 (30 mg/kg telesne mase i.p.), nije dalje primećen rast tumora kod miševa lečenih sa Ab B1-23 nedelju dana, dok su tumori u uzorcima negativne kontrole nastavili da rastu.

[0130] Ovaj primer pokazuje da mAb B1-23 antitelo ovog pronalaska inhibira rast kancera kod miševa koji nose tumore nastalih iz humanih ćelija.

[0131] Budući da ovaj primer koristi ćelije humanog melanoma, anti-humani GDF-15 antitela ovog pronalaska bi takođe trebalo da inhibiraju rast kancera kod humanog pacijenta. Inhibicija rasta kancera bi trebalo da je naročito efektna ukoliko pacijent ima povišene nivoe GDF-15 u krvi pre primene, ili ukoliko tumor ili tumori nastali od kancera imaju više nivoe humanog GDF-15 u poređenju sa kontrolnim uzorkom istog pacijenta koji je dobijen iz nekancerogenog dela tkiva koje predstavlja tkivo porekla kancera. Ovaj primer koristi imunodeficijentne miševe. Stoga se može zaključiti da antitela ovog pronalaska mogu da inhibiraju rast kancera na način koji je nezavisan od inaktnog imunog sistema.

[0132] Pored toga, pokazano je gore u primeru 2 da anti-humani GDF-15 antitela ovog pronalaska mogu da spreče nishodnu regulaciju NKG2D posredovanu GDF-1 i trebalo bi da mogu da indukuju ubijanje ćelija kancera putem NK ćelija i CD8+ T ćelija. Stoga se očekuje da je inhibicija rasta kancera antitelima anti-humanog GDF-15 jača kod pacijenata nego kod imunodeficijentnih miševa, s obzirom da pacijenti ne poseduju imunodeficijencije miševa koji se koriste u primeru.

[0133] U alternativnoj postavci eksperimentalnog ispitivanja, sledeće in vivo ispitivanje je sprovedeno: Kako bi se ocenio anti-tumorski efekat B1-23 in vivo, Balb/c<nu/nu>goli miševi su korišćeni u podešavanju ksenografta sa ćelijskom linijom melanoma UACC-257. Miševi su lečeni ili sa antitelom Bl-23 ili sa PBS. Svaka kohorta koja učestvuje u lečenju ima 10 Balb/c<nu/nu>golih miševa.

[0134] Pre ubrizgavanja, UACC-257 ćelije melanoma su uzgajane na kompletnoj podlozi, isključujući bilo kakvu kontaminaciju. Ćelije se prikupe kada se dostigne konfluencija od 70-80% u posudi ćelijske kulture. Ćelije se zatim operu pomoću PBS i prebroje.1x10<7>vijabilne ćelije su suspendovane u PBS.

[0135] Prvo ubrizgavanje/lečenje je primenjeno na Balb/c<nu/nu>golom mišu starom 6 meseci. Oblast inokulacije miševa se očisti etanolom. UACC 257 ćelije se mešaju i uvlače u špric bez igle, kako bi se izbegao negativan pritisak na ćelije tumora. Ćelijska suspenzija koja sadrži 1x10<7>ćelije u PBS je supkutano ubrizgana (s.c.) sa donje strane kod miševa.

[0136] Intraperitonealna (i.p.) injekcija ili B1-23 (25mg/kg telesne mase) ili iste zapremine PBS je počela neposredno nakon inokulacije ćelije tumora (što je definisano kao dan 1) i davana je dva puta nedeljno. Tumori su izrasli za 48 dana. Prečnici tumora su izmereni kaliperom i tumor zapremine mm3 je izračunat pomoću sledeće formule:

[0137] Rezultati dobijeni iz ispitivanja us prikazani na Fig.4.

[0138] Kako je prikazano na crtežu, veličina tumora kohorte životinja lečenih sa B1-23 je značajno smanjena, u poređenju sa PBS kontrolnom grupom.

Primer 5: mAb B1-23 prepoznaje konformacioni ili isprekidani epitop humanog GDF-15

[0139] Mapiranje epitopa: Monoklonalno antitelo miša GDF-15 protiv 13mer lineranih peptida dobijenih iz GDF-15

Antigen: GDF-15:

[0140] Sekvenca proteina je prevedena u 13mer peptide sa skretanjem jedne aminokiseline. C- i N-završeci su produženi putem neutralnog GSGS linkera kako bi se izbegli skraćeni peptidi (podebljana slova).

Kontrolni peptidi:

[0141] Flag: DYKDDDDKGG (SEQ ID No:13), 78 mrlje; HA: YPYDVPDYAG (SEQ ID No:14), 78 mrlje (kopija svakog niza)

Identifikator čipa peptida:

[0142] 000264_01 (10/90, Ala2Asp linker)

Uslovi bojenja:

[0143] Standardi pufer: PBS, pH 7.4 0.05% Tween 20

Blokirajući pufer: Rockland blokirajući pufer MB-070

Inkubacioni pufer: Standardni pufer sa 10% Rockland blokirajućim puferom MB-070

Primarni uzorak: Monoklonalno antitelo miša GDF-15 (1 µg/µl): bojenje u inkubacionom puferu u trajanju od 16 sati na 4°C pri razblaženju od 1:100 i blagim mućkanjem pri brzini od 500 rpm Sekundarno antitelo: Kozje antitelo protiv miša (H+L) IRDye680, bojenje u inkubacionom puferu pri razblaženju od 1:5000 za 30 minuta na sobnoj temperaturi (RT)

Kontrolna antitela: Monoklonalna anti-HA (12CA5)-LL-Atto 680 (1:1000), monoklonalna anti-FLAG(M2)-FluoProbes752 (1:1000); bojenje u inkubacionom puferu za 1 h na RT

Skener:

[0144] Odyssey Imaging System, LI-COR Biosciences

Podešavanja: pomak: 1mm; rezolucija: 21 µm; intenzitet

zeleno/crveno: 7/7

Rezultati:

[0145] Nakon 30 minuta prethodnog bubrenja u standardnom puferu i 30 minuta u blokirajućem puferu, niz peptida sa 10, 12 i 15mer B7H3-dobijenih linearnih peptida je inkubiran sa sekundarnim kozjim antitelom protiv mišjeg IgG (H+L) IRDye680 samo pri razblaženju od 1:5000 za 1h na sobnoj temperaturi kako bi se analizirale pozadinske interakcije sekundarnog antitela. The PEPperCHIP® je opran 2x1 min sa standardnim puferom, ispran sa destilovanom vodom i osušen u struji vazduha. Očitavanje je urađeno sa Odyssey Imaging System pri rezoluciji od 21 µm i zelenim/crvenim intenzitetima od 7/7: Primetili smo slabu interakciju peptida bogatih argininom (ELHLRPQAARGRR (SEQ ID No:15), LHLRPQAARGRRR (SEQ ID No:16), HLRPQAARGRRRA (SEQ ID No:17), LRPQAARGRRRAR (SEQ ID No:18), RPQAARGRRRARA (SEQ ID No:19), PQAARGRRRARAR (SEQ ID No:20) i QAARGRRRARARN (SEQ ID No:21)) koji su poznati kao česta sredstva za vezivanje, a sa baznim peptidom MHAQIKTSLHRLK (SEQ ID No:22) usled jonskih interakcija sa napunjenom bojom za antitela.

[0146] Nakon prethodnog bubrenja u trajanju od 10 minuta u standardnom puferu, mikroniz peptida se inkubira preko noći na 4 °C sa monoklonalnim antitelom miša GDF-15 pri razblaženju od 1:100. Ponovljeno pranje u standardnom puferu (2x1 min) je praćeno inkubacijom u trajanju od 30 minuta sa sekundarnim antitelom pri razblaženju od 1:5000 na sobnoj temperaturi. Nakon 2x10 sekundi pranja u standarnom puferu i kratkog ispiranja sa destilovanom vodom, PEPperCHIP®je osušen u struji vazduha. Očitavanje je urađeno sa Odyssey Imaging System pri rezoluciji od 21 µm i zelenim/crvenim intenzitetima od 7/7 pre i posle bojenja kontrolnih peptida pomoću anti-HA i anti-FLAG(M2) antitela.

[0147] Pokazano je da nijedan od linearnih 13mer peptida dobijenih iz GDF-15 nije bio u interakciji sa monoklonalnim antitelom miša GDF-15 čak i na previše regulisanim intenzitetima. Bojenje Flag i HA kontrolnih peptida koji uokviruju niz je, međutim, dovelo do dobrih i homogenih intenziteta mrlja. Sažetak:

[0148] Mapiranje epitopa monoklonalnog GDF-15 antitela miša protiv GDF-15 nije otkrilo nikakav linearni epitop sa 13mer peptidima dobijenim iz antigena. U skladu sa ovim nalazom vrlo je verovatno da monoklonalno GDF-15 antitelo miša prepozna konformacioni ili isprekidani epitop niskog afiniteta parcijalnih epitopa. Usled očiglednog odsustva bilo kog GDF-15 signala iznad pozadinskog bojenja samo sekundarnog tela, kvantifikacija intenziteta mrlje sa PepSlide® Analyze i potonja anotacija se izostavljaju.

Primer 6: Strukturna identifikacija epitopa peptidnog liganda isecanjem epitopa masenom spektrometrijom i ekstrakcijom epitopa

[0149] Epitop rekombinantnog humanog GDF-15 koji se vezuje za antitelo Bl-23 je identifikovan putem postupaka isecanja epitopa i ekstrakcije epitopa (Suckau et al. Proc Natl Acad Sci U S A.1990 December; 87(24): 9848-9852.; R.Stefanescu et al., Eur.J.Mass Spectrom.13, 69-75 (2007)).

[0150] Za pripremu kolone antitela, antitelo B1-23 se dodaje NHS-aktiviranoj 6-aminoheksanoičnoj kiselini kuplovanoj sa sefarozom. Antitelo B1-23 kuplovane sefaroze je ubačeno u mikrokolonu od 0.8 ml i oprano sa blokirajućim puferom i puferom za pranje.

Eksperiment ekstrakcije epitopa:

[0151] Rekombinantni humani GDF-15 je digestovan sa tripsinom 2h na 37°C (u rastvoru), što je dovelo do različitih peptida, u skladu sa mestima cepanja tripsina u proteinu. Nakon potpune digestije, peptidi su stavljeni na kolonu afiniteta koja sadrži imobilisano antitelo B1-23. Nevezani kao i potencijalno vezani peptidi GDF-15 su korišćeni za analizu masenom spektrometrijom. Identifikacija peptida pomoću masene spektrometrije nije bila moguća. Ovo je dalje bio pokazatelj da regija vezivanja GDF-15 u imunom kompleksu Bl-23 obuhvata isprekidani ili konformacioni epitop. U slučaju kontinuiranog linearnog epitopa, rastvoreni peptidi bi trebalo da vežu svog partnera za interakciju, ukoliko ne postoji mesto cepanja tripsina u peptidu epitopa. Isprekidani ili konformacioni epitop bi mogao biti potvrđen postupkom isecanja epitopa opisanim u sledećem delu.

Eksperiment isecanja epitopa:

[0152] Imobilisano antitelo B1-23 na koloni afiniteta je zatim inkubirano sa rekombinantnim GDF-15 za 2h. Formirani imuni kompleks na koloni afiniteta je zatim inkubiran sa tripsinom 2 sata na 37°C. Cepanje je dovelo do različitih peptida dobijenih od rekombinantnog GDF-15. Imobilisano antitelo samo po sebi je proteolitički stabilno. Dobijeni peptidi rastvorenog GDF-15 proteina, koji su bili zaštićeni antitelom i samim tim zaštićeni od proteolitičkog cepanja, su eluirani u kiselim uslovima (TFA, pH2), sakupljeni i identifikovani masenom spektrometrijom.

Postupak isecanja epitopa pomoću MS/MS identifikacije koja dovodi do sledećih peptida:

[0153] Pozicija peptida u sekvenci Masa jona/Naelektrisanje

EVQVTMCIGACPSQFR 40-551769.91590.50(3+) (SEQ ID No: 25)

TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 94-1142310,96771:33(3+) (SEQ ID No: 26)

[0154] Deo humanog GDF-15, koji se vezuje za antitelo B1-23, obuhvata isprekidani ili konformacioni epitop. Masenom spektrometrijom su identifikovana 2 peptida u GDF-15 proteinu, koja su odgovorna za stvaranje imunog kompleksa. Ovi peptidi su ograničeni na pozicije 40-55 (EVQVTMCIGACPSQFR) i 94-114 (TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI) u GDF-15 aminokiselinskoj sekvenci. Stoga, ova dva peptida obuhvataju epitop GDF-15 proteina koji se vezuje za antitelo B1-23.

G) Industrijska primenjivost

[0155] Antitela, njihovi antigen-vezujući delovi, farmaceutske kompozicije i kompleti u skladu sa ovim pronalaskom se mogu industrijski proizvoditi i prodavati kao proizvodi za tražene upotrebe (npr. za upotrebu u lečenju kancera), u skladu sa poznatim standardima proizvodnje farmaceutskih proizvoda. S tim u vezi, ovaj pronalazak je industrijski primenjiv.

Reference

[0156]

Arbabi Ghahroudi M et al.: "Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies." FEBS Lett.1997 Sep 15;414(3):521-6.

Ausubel et al.: "Current Protocols in Molecular Biology." Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992.

Bauskin AR et al.: "The propeptide mediates formation of stromal stores of PROMIC-1: role in determining prostate cancer outcome." Cancer Res.2005 Mar 15;65(6):2330-6.

Brown DA et al.: "Macrophage inhibitory cytokine 1: a new prognostic marker in prostate cancer." Clin Cancer Res.2009 Nov 1;15(21) :6658-64.

Chothia C et al.: Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature.1989 Dec 21-28;342(6252):877-83.

Clackson T et al.: "Making antibody fragments using phage display libraries." Nature.1991 Aug 15;352(6336):624-8.

Giudicelli V et al.: IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res.2004 Jul 1;32(Web Server issue):W435-40.

Harlow and Lane: "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988.

Holliger P et al.: ""Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments." Proc Natl Acad Sci U S A.1993 Jul 15;90(14):6444-8.

Holt LJ et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy." Trends Biotechnol.2003 Nov;21(11):484-90.

Huang CY et al.: "Molecular alterations in prostate carcinomas that associate with in vivo exposure to chemotherapy: identification of a cytoprotective mechanism involving growth differentiation factor 15." Clin Cancer Res.2007 Oct 1;13(19):5825-33.

Johnen H et al.: "Tumor-induced anorexia and weight loss are mediated by the TGF-beta superfamily cytokine MIC-1." Nat Med.2007 Nov;13(11):1333-40.

Jones PT et al.: "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse." Nature.1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5.

Kabat et al.: Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.1983.

Kohler G and Milstein C: "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity." Nature.1975 Aug 7;256(5517):495-7.

Marks JD et al.: "By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97.

Mimeault M and Batra SK: "Divergent molecular mechanisms underlying the pleiotropic functions of macrophage inhibitory cytokine-1 in cancer." J Cell Physiol.2010 Sep;224(3) :626-35.

Paul, W.E. (Ed.).: "Fundamental Immunology" 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989.

Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA. Riechmann L et al.: "Reshaping human antibodies for therapy." Nature.1988 Mar 24;332(6162):323-7. Roth P et al.: "GDF-15 contributes to proliferation and immune escape of malignant gliomas." Clin Cancer Res.2010 Aug 1;16(15):3851-9.

Saerens D et al.: "Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics." Curr Opin Pharmacol.2008 Oct;8(5):600-8. Epub 2008 Aug 22.

Sambrook et al.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual.", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989.

Siegel DL: "Recombinant monoclonal antibody technology." Transfus Clin Biol.2002 Jan;9(1):15-22. Stefanescu R. et al., Eur.J.Mass Spectrom.13, 69-75 (2007)

Suckau et al. Proc Natl Acad Sci U S A.1990 December; 87(24): 9848-9852.

Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: New York 2006.850p.

WO 2005/099746

WO 2009/021293

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Monoklonalno antitelo koje može da se veže za humani GDF-15, ili njegov antigen-vezujući deo koji može da se veže za humani GDF-15, gde:

i) varijabilni domen teškog lanca obuhvata CDR3 region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 5 ili neku aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu njoj, a gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata CDR3 region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 7 ili neku aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu njoj, i gde to antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može da inhibira rast kancera kod nekog sisara, ili

ii) vezivanje predstavlja vezivanje za konformacioni ili isprekidani epitop na humanom GDF-15 obuhvaćen aminokiselinskim sekvencama iz SEQ ID No: 25 i SEQ ID No: 26, i gde to antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može da inhibira rast kancera kod nekog sisara.

2. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema zahtevu 1, gde je sisar humani pacijent.

3. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu to antitelo predstavlja antitelo za humani GDF-15 koje se može dobiti iz ćelijske linije B1-23 deponovane u Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142, ili njegov antigen-vezujući deo.

4. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1-3, gde je humani GDF-15 rekombinantni humani GDF-15 sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom sa SEQ ID No: 8.

5. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1-4, gde to antitelo ili njegov antigen-vezujući deo predstavlja antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema zahtevu 1 i), a gde vezivanje predstavlja vezivanje za konformacioni ili isprekidani epitop na humanom GDF-15.

6. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema zahtevu 5, gde to antitelo ili njegov antigen-vezujući deo predstavlja antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema zahtevu 1 i), a gde vezivanje za konformacioni ili isprekidani epitop na humanom GDF-15 predstavlja vezivanje za konformacioni ili isprekidani epitop obuhvaćen aminokiselinskim sekvencama iz SEQ ID No: 25 i SEQ ID No: 26.

7. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde to antitelo ili njegov antigen-vezujući deo poseduje konstantu disocijacije ravnoteže za humani GDF-15 koja je jednaka ili manja od 5 nM kako je izmereno merenjima površinske plazmonske rezonance.

8. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde to antitelo ili njegov antigen-vezujući deo poseduje konstantu disocijacije ravnoteže za humani GDF-15 koja je jednaka ili manja od 2 nM kako je izmereno merenjima površinske plazmonske rezonance.

9. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema zahtevu 7 ili 8, gde je konstanta disocijacije ravnoteže kako je izmereno merenjima površinske plazmonske rezonance u skladu sa Primerom 1.

10. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

11. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10 za upotrebu u postupku za lečenje kancera kod nekog sisara, pri čemu taj postupak obuhvata davanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela ili farmaceutske kompozicije pomenutom sisaru.

12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11 za upotrebu prema zahtevu 11, gde je sisar humani pacijent.

13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 11 do 12 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 11 do 12, gde postupak obuhvata inhibiranje rasta kancera.

14. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 12 do 13 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 12 do 13, gde postupak obuhvata indukovanje ubijanja ćelija kancera putem NK ćelija i CD8+ T ćelija kod humanog pacijenta.

15. Komplet koji obuhvata farmaceutsku kompoziciju prema zahtevu 10.

16. Komplet prema zahtevu 15 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 11 do 14.

17. Ekspresioni vektor koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili njegov antigenvezujući deo prema bilo kom od zahteva 1-9.

18. Ćelijska linija koja može da proizvede antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

19. Ćelijska linija prema zahtevu 18, gde ta ćelijska linija predstavlja ćelijsku liniju B1-23 deponovanu u Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ) pod pristupnim Br. DSM ACC3142.