CN109562195A

CN109562195A - 用pd-l1结合多肽进行pet成像

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Publication number: CN109562195A
Application number: CN201780046557.0A
Authority: CN
Inventors: P·E·莫林; D·唐纳利; D·利普夫斯基; J·高科梅杰; M·尤雷-孔克尔; D·法布里奇奥; M·C·莱特; D·迪斯奇诺; S·J·博纳克斯; R·A·史密斯; V·拉丰特; D·科恩; D·K·梁
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2016-06-01
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2019-04-02
Also published as: JP7016323B2; US11344639B2; KR20190015376A; WO2017210302A1; US20220347324A1; JP2019525891A; KR102397783B1; US20190184042A1; EP3463486A1

Abstract

本文中提供了与PD‑L1特异性地结合的新型¹⁰Fn3结构域，以及基于所述结构域的用于诊断的成像剂。

Description

用PD-L1结合多肽进行PET成像

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年6月1日提交的美国临时申请No.62/344,258的优先权。将上述申请的内容通过提述并入本文。

背景

程序性死亡配体-1(PD-L1)是PD-1(一种关键的免疫检查点受体，由活化的T和B细胞表达并且介导免疫抑制)的表面糖蛋白配体，其在抗原呈递细胞和人癌症均可发现，通过与PD-1结合下调T细胞活化和细胞因子分泌(Freeman等人，2000；Latchman等人，2001)。抑制PD-L1/PD-1相互作用在临床前模型中可能产生强有力的抗肿瘤活性，破坏这种相互作用的抗体已进入治疗癌症的临床试验(美国专利No.8,008,449和7,943,743；Brahmer等人，2010；Topalian等人，2012b；Brahmer等人，2012；Flies等人，2011；Pardoll，2012；Hamid和Carvajal，2013)。

PET，即正电子发射断层摄影术(Positron Emission Tomography)，是一种非侵入性核医学技术，其可生成体内各种分子过程或与疾病病理学相关的蛋白质的位置的三维图像。这种方法学检测由导入体内的发射正电子的放射性核素(示踪剂)在生物活性分子上间接发射的伽马射线对。PET成像工具具有多种广泛的药物开发用途，并且由于同一种工具既可在临床前又可在临床上使用，具有独特的转化医学优势。实例包括直接可视化靶标的体内饱和；监测正常组织中的摄取以预期毒性或患者与患者之间的变化；量化病变组织；肿瘤转移；监测随时间的药物效力、或随时间的抗性等。

本文中描述了适合用作诊断剂/成像剂，例如用于正电子发射断层摄影术的新型抗PD-L1 Adnectin。

概述

本发明至少部分基于可用作诊断剂/成像剂(例如用于正电子发射断层摄影术)的新型抗人PD-L1 Adnectin的发现，及其对受试者的施用方法。这些药剂可用于例如区分PD-L1表达性细胞与非PD-L1表达性细胞，例如肿瘤细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，和区分PD-L1表达性组织与非PD-L1表达性组织，例如癌组织。

在一个方面，本文中提供了包含纤连蛋白III型第十结构域(¹⁰Fn3)的多肽，其中(a)¹⁰Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，(b)¹⁰Fn3具有选自BC、DE和FG环的至少一个环，所述至少一个环具有相对于人¹⁰Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环序列的改变的氨基酸序列，并且(c)所述多肽与PD-L1特异性地结合。在某些实施方案中，多肽以500mM或更小，例如100mM或更小的K_D与PD-L1结合。

在某些实施方案中，¹⁰Fn3结构域包含BC、DE和FG环，所述环包含以下氨基酸序列：

(1)分别为SEQ ID NO:6、7和8；

(2)分别为SEQ ID NO:21、22和23；

(3)分别为SEQ ID NO:36、37和38；

(4)分别为SEQ ID NO:51、52和53；

(5)分别为SEQ ID NO:66、67和68；

(6)分别为SEQ ID NO:81、82和83；

(7)分别为SEQ ID NO:97、98和99；

(8)分别为SEQ ID NO:113、114和115；

(9)分别为SEQ ID NO:124、125和126；

(10)分别为SEQ ID NO:135、136和137；

(11)分别为SEQ ID NO:146、147和148；

(12)分别为SEQ ID NO:157、158和159；

(13)分别为SEQ ID NO:168、169和170；

(14)分别为SEQ ID NO:179、180和181；

(15)分别为SEQ ID NO:190、191和192；

(16)分别为SEQ ID NO:201、202和203；

(17)分别为SEQ ID NO:212、213和214；

(18)分别为SEQ ID NO:223、224和225；

(19)分别为SEQ ID NO:234、235和236；

(20)分别为SEQ ID NO:245、246和247；

(21)分别为SEQ ID NO:256、257和258；

(22)分别为SEQ ID NO:267、268和269；

(23)分别为SEQ ID NO:278、279和280；

(24)分别为SEQ ID NO:289、290和291；

(25)分别为SEQ ID NO:300、301和302；

(26)分别为SEQ ID NO:311、312和313；

(27)分别为SEQ ID NO:322、323和324；

(28)分别为SEQ ID NO:333、334和335；

(29)分别为SEQ ID NO:344、345和346；

(30)分别为SEQ ID NO:355、356和357；

(31)分别为SEQ ID NO:366、367和368；

(32)分别为SEQ ID NO:377、378和379；

(33)分别为SEQ ID NO:388、389和390；

(34)分别为SEQ ID NO:399、400和401；

(35)分别为SEQ ID NO:410、411和412；

(36)分别为SEQ ID NO:421、422和423；

(37)分别为SEQ ID NO:432、433和434；

(38)分别为SEQ ID NO:443、444和445；

(39)分别为SEQ ID NO:454、455和456；

(40)分别为SEQ ID NO:465、466和467；

(41)分别为SEQ ID NO:476、477和478；

(42)分别为SEQ ID NO:487、488和489；

(43)分别为SEQ ID NO:498、499和500；

(44)分别为SEQ ID NO:509、510和511；

(45)分别为SEQ ID NO:520、521和522；

(46)分别为SEQ ID NO:531、530和531；

(47)分别为SEQ ID NO:542、543和544；

(48)分别为SEQ ID NO:553、554和555；或

(49)分别为SEQ ID NO:564、565和566。

在某些实施方案中，多肽包含与表3中列出的序列，例如SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80、96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222、233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552和563中任一者至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80、96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222、233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552或563的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91、100-107、116-122、127-133、138-144、150-155、160-166、171-177、182-188、193-199、204-210、215-221、227-232、237-243、248-254、259-265、271-276、291-287、292-298、303-309、314-320、325-331、337-342、347-353、358-364、369-375、380-386、391-397、402-408、413-419、424-430、435-441、446-452、457-463、468-474、479-485、490-496、501-507、512-518、523-529、534-540、545-551和556-562。在某些实施方案中，多肽包含与选自下组的氨基酸序列的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91、100-107、116-122、127-133、138-144、150-155、160-166、171-177、182-188、193-199、204-210、215-221、227-232、237-243、248-254、259-265、271-276、291-287、292-298、303-309、314-320、325-331、337-342、347-353、358-364、369-375、380-386、391-397、402-408、413-419、424-430、435-441、446-452、457-463、468-474、479-485、490-496、501-507、512-518、523-529、534-540、545-551和556-562。

在某些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO:574-583的N端前导序列，和/或选自SEQ ID NO:584-618或PmCn的C端尾，其中P是脯氨酸，并且其中m是至少0(例如0、1或2)的整数并且n是至少1(例如1或2)的整数。

在某些实施方案中，多肽包含一种或多种选自下组的药代动力学(PK)模块：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白。在某些实施方案中，PK模块和多肽经由至少一种二硫键、肽键、多肽、聚合糖或聚乙二醇模块连接。在某些实施方案中，PK模块和多肽经由具有选自下组的氨基酸序列的接头连接：SEQ ID NO:629-678。

本文中提供了本文中描述的编码多肽的核酸、以及包含所述核酸的载体和细胞。在某些实施方案中，核酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111。

本文中提供了包含本文中描述的多肽和载体的组合物。例如，本文中描述的组合物包含多肽和载体，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、9-15、20、24-30、35、39-45、50、54-60、65、69-75、80、84-91、96、100-107、112、116-122、123、127-133、134、138-144、145、150-155、156、160-166、167、171-177、178、182-188、189、193-199、200、204-210、211、215-221、222、227-232、233、237-243、244、248-254、255、259-265、266、271-276、277、291-287、288、292-298、299、303-309、310、314-320、321、325-331、332、337-342、343、347-353、354、358-364、365、369-375、376、380-386、387、391-397、398、402-408、409、413-419、420、424-430、431、435-441、442、446-452、453、457-463、464、468-474、475、479-485、486、490-496、497、501-507、508、512-518、519、523-529、530、534-540、541、545-551、552和556-562。

本文中提供了包含本文中公开的多肽的成像剂。在某些实施方案中，成像剂包含这样的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、9-15、20、24-30、35、39-45、50、54-60、65、69-75、80、84-91、96、100-107、112、116-122、123、127-133、134、138-144、145、150-155、156、160-166、167、171-177、178、182-188、189、193-199、200、204-210、211、215-221、222、227-232、233、237-243、244、248-254、255、259-265、266、271-276、277、291-287、288、292-298、299、303-309、310、314-320、321、325-331、332、337-342、343、347-353、354、358-364、365、369-375、376、380-386、387、391-397、398、402-408、409、413-419、420、424-430、431、435-441、442、446-452、453、457-463、464、468-474、475、479-485、486、490-496、497、501-507、508、512-518、519、523-529、530、534-540、541、545-551、552和556-562。

在某些实施方案中，成像剂包含可检测标记物。在某些实施方案中，成像剂包含本文中公开的多肽、螯合剂和可检测标记物。在某些实施方案中，成像剂包含本文中公开的多肽、双功能螯合剂或缀合(BFC)模块和可检测标记物。在某些实施方案中，可检测标记物是含有放射性核素的辅基。在某些实施方案中，可检测标记物可通过正电子发射断层摄影术检出。

在某些实施方案中，螯合剂和/或双功能螯合剂或缀合(BFC)模块选自下组：DFO、DOTA、CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、DBCO、DIBO、BARAC、DIMAC、Oxo-DO3A、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN-TM、DTPA、1B4M-DTPA、CHX-A”-DTPA、TRAP、NOPO、AAZTA、DATA、H₂dedpa、H₄octapa、H₂azapa、H₅decapa、H₆phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA和TRITA。

在某些实施方案中，可检测标记物是放射性核素，例如，

⁶⁴Cu、¹²⁴I、^76/77Br、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁶⁸Ga、¹⁸F、¹¹C、¹²⁵I、¹²⁴I、¹³¹I、¹²³I、¹³¹I、¹²³I、³²Cl、³³Cl、³⁴Cl、⁶⁸Ga、⁷⁴Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁷⁸Br、⁸⁹Zr、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁹⁹Tc或¹⁵³Sm。

在某些实施方案中，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是⁶⁴Cu。在某些实施方案中，成像剂包含抗PD-L1多肽(例如本文中描述的抗PD-L1 Adnectin，例如包含SEQ ID NO:80或96中列出的氨基酸序列的抗PD-L1 Adnectin)、螯合剂NODAGA和放射性核素⁶⁴Cu。

在某些实施方案中，成像剂包含抗PD-L1多肽(例如本文中描述的抗PD-L1Adnectin，例如包含SEQ ID NO:80或96中列出的氨基酸序列的抗PD-L1 Adnectin)、双功能螯合剂或缀合(BFC)模块和包含放射性核素¹⁸F的辅基。在某些实施方案中，成像剂具有以下结构：

或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，成像剂具有以下结构：

在一些实施方案中，BFC是包含反应性基团的环辛炔，所述反应性基团与所述蛋白质上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键。在一些实施方案中，环辛炔选自下组：二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)和二苯并环辛炔(DBCO)。在一些实施方案中，环辛炔是DBCO。

在一些实施方案中，BFC是DBCO-PEG4-NHS-酯、DBCO-磺基-NHS-酯、DBCO-PEG4-酸、DBCO-PEG4-胺或DBCO-PEG4-马来酰亚胺。在一些实施方案中，BFC是DBCO-PEG4-马来酰亚胺。

在某些实施方案中，成像剂具有结构：

其中X是包含以下任一者的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:13、28、43、58、73、88、104、120、131、142、153、164、175、186、197、208、219、230、241、252、263、274、285、296、307、318、329、340、351、362、373、384、395、406、417、428、439、450、461、472、483、494、505、516、527、538、549、560和571。在某些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:88中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:104中列出的氨基酸序列。

本文中提供了试剂盒，其包含本文中描述的抗PD-L1 Adnectin组合物和/或成像剂、和使用说明书。

本文中提供了检测样品中的PD-L1的方法，该方法包括使所述样品与抗PD-L1Adnectin接触，并且检测PD-L1。

本文中提供了检测受试者中的PD-L1阳性细胞的方法，其包括对受试者施用包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂，并且检测所述成像剂，其中检测到的成像剂界定所述PD-L1阳性细胞在受试者中的位置。

本文中提供了检测受试者中的PD-L1表达性肿瘤的方法，其包括对受试者施用包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂，并且检测所述成像剂，其中检测到的成像剂界定所述肿瘤在受试者中的位置。在某些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术检测成像剂。

本文中提供了获得包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂的图像的方法，所述方法包括，

a)对受试者施用所述成像剂；并且

b)通过正电子发射断层摄影术对所述成像剂的分布体内成像。

本文中提供了获得表达PD-L1的组织或细胞的定量图像的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂接触，并且使用正电子发射断层摄影术检测或定量所述表达PD-L1的组织。

本文中提供了用于检测PD-L1表达性肿瘤的方法，其包括对具有PD-L1表达性肿瘤的受试者施用成像有效量的包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂，并且使用正电子发射断层摄影术检测所述肿瘤中的所述成像剂的放射性发射，其中在所述肿瘤中检测到所述放射性发射。

本文中提供了诊断受试者中的PD-L1表达性肿瘤的存在的方法，所述方法包括：

(a)对有此需要的受试者施用包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂；并且

(b)获得所述受试者的至少一部分的放射性图像(radio-image)以检测所述成像剂的存在或缺乏；

其中所述成像剂高于背景的存在和位置指示所述PD-L1表达性肿瘤的存在和位置。

本文中提供了治疗具有癌症的受试者的方法，其包括

(a)对有此需要的受试者施用包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂，并获得受试者的至少一部分的图像以确定一个或多个肿瘤中PD-L1的存在；并且，如果在一个或多个肿瘤中检测到PD-L1，那么，

(b)对受试者施用抗肿瘤治疗，例如抑制PD-1和PD-L1之间相互作用的药剂(PD-1或PD-L1拮抗剂)。

本文中提供了监测受试者中针对PD-L1表达性肿瘤的抗肿瘤治疗的进展的方法，所述方法包括：

(a)在第一时间点对有此需要的受试者施用包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂，并且获得所述受试者的至少一部分的图像以确定所述肿瘤的大小；

(b)对所述受试者施用抗肿瘤治疗；

(c)在一个或多个后续时间点对所述受试者施用所述成像剂，并且在每个时间点获得所述受试者的至少一部分的图像；其中在每个时间点所述肿瘤的尺寸和位置指示所述疾病的进展。

附图简述

图1是本文中所述的例示性抗PD-L1 Adnectin的核心氨基酸序列的示意图。BC、DE和FG环加有下划线。野生型(WT)(SEQ ID NO:2)、ATI-968(SEQ ID NO:5)、ATI-964(SEQ IDNO:20)、ATI-967(SEQ ID NO:65)、A02(SEQ ID NO:80)、E01(SEQ ID NO:96)、ATI-965(SEQID NO:35)和ATI-966(SEQ ID NO:50)。

图2是用于[18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA的化学合成的示意图。分子的E01部分具有SEQ ID NO:104中列出的序列。

图3是证明用⁶⁴Cu-E01抗PD-L1 Adnectin(具有NODAGA螯合剂)区分hPD-L1阳性L2987细胞与hPD-L1阴性HT-29细胞的图。当与过量的冷(未标记)E01 Adnectin共温育时，细胞结合的⁶⁴Cu-E01减少，证实了特异性。

图4A是描绘用NODAGA-⁶⁴Cu-标记的A02抗PD-L1 Adnectin区分双侧异种移植物小鼠中的hPD-L1(+)与hPD-L1(-)肿瘤的PET图像。显示的是总和的0到2小时图像，其显示探针停留区域。明亮的区域是暴露过程中占据率最大的组织。

图4B是描绘hPD-L1(+)[L2987]肿瘤中肿瘤标记的时间过程的图。hPD-L1(+)系统[L2987阻断]中的脉冲追踪实验和hPD-L1(-)[HT29]肿瘤显示了标记的特异性。

图5是描绘携带双侧hPD-L1(+)L2987和hPD-L1(-)HT-29异种移植物的小鼠中¹⁸F标记的A02抗PD-L1 Adnectin放射性示踪剂的组织分布(通过γ计数仪离体测量)的图。

图6是食蟹猴中¹⁸F标记的E01抗PD-L1 Adnectin分布的复合图像。

图7是描绘用与指示浓度的冷A02 Adnectin共温育的0.25nM¹⁸F-DBCO-A02抗PD-L1Adnectin标记的异种移植物和人肺组织的体外放射自显影的图像。

图8描绘了用抗PD-L1 Adnectin标记的异种移植物和人肺肿瘤标本的免疫组织化学图像，用以证明hPD-L1的肿瘤表达。

图9显示了用于合成[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA的反应方案。使用相同的反应方案来标记E01 Adnectin。

图10是用于自动合成[¹⁸F]-FPPEGA的GE TRACERlab FX2 N合成模块的示意图。

图11是用于自动合成[¹⁸F]-FPPEGA的Synthera合成模块(IBA)的示意图。

图12描绘了抗PD-L1 Adnectin的例示性竞争曲线。

发明详述

定义

除非另有定义，本文中使用的所有的技术和科学术语具有与技术人员所通常理解的相同的含义。本文中描述了优选的方法和组合物，但本发明的实践或测试中使用任何类似于或等同于本文所述者的方法和组合物。

“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种为PD-L2)，其在与PD-1结合时下调T细胞活化和细胞因子分泌。如本文中使用的，术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-Ll)，hPD-L1的变体、同工型、和物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-L1序列可以GenBank登录号Q9NZQ7找到。PD-L1也称为CD274、B7-H、B7H1、PDCD1L1和PDCD1LG1。

如本文中使用的，“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何序列，而不论长度、翻译后修饰、或功能。多肽可包括正如在美国专利No.6,559,126中描述的那些天然氨基酸和非天然氨基酸，通过提述将该专利并入本文。也可以多种标准化学方法的任一者修饰多肽(例如，可用保护基修饰氨基酸；羧基端氨基酸可被制成为末端酰胺基团；可用基团修饰氨基端残基，例如，以便增强亲油性；或者，可以化学方式将多肽糖基化或以别的方式修饰以便增加稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可包括另一种结构如环状化合物或其他分子与多肽的附接，并且还可包括含有改变构型的一个或多个氨基酸(即，R或S；或者，L或D)的多肽。本文中描述的肽是源自纤连蛋白的第十个III型结构域的蛋白质，其已被修饰为与人PD-L1特异性地结合并且在本文中称为“抗PD-L1 Adnectin”或“PD-L1 Adnectin”。

如本文中使用的，“多肽链”是指其中其结构域的每一者通过肽键与其他结构域连接的多肽，与非共价相互作用或二硫键相反。

“分离的”多肽是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分为将会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素、和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选实施方案中，所述多肽将被纯化为：(1)正如通过洛瑞法(Lowry Method)确定的按重量计大于95％的多肽，并且最优选地按重量计大于99％、(2)到足以通过使用转杯测序仪获得至少N端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)达到通过利用考马斯亮蓝或优选地银染色在还原或非还原条件下进行的SDS-PAGE的同质性。分离的多肽包括重组细胞内原位的多肽，因为多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而一般而言，将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。

如本文中使用的¹⁰Fn3结构域的“区/区域”是指人¹⁰Fn3结构域的环(AB、BC、CD、DE、EF和FG)、β链(A、B、C、D、E、F和G)、N端(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-7)、或C端(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基93-94)。

“支架区”是指人¹⁰Fn3结构域的任何非环区。支架区包括A、B、C、D、E、F和Gβ链以及N端区(对应于SEQ ID NO:1的残基1-7的氨基酸)和C端区(对应于SEQ ID NO:1的残基93-94的氨基酸，并且任选地包括构成人纤连蛋白中的Fn3结构域的第10和第11个重复之间的天然接头的7个氨基酸)。

本文中的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代)之后候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术人员熟知的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，利用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR^TM)软件。本领域技术人员可以容易地确定测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。例如，如下计算给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表述为给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)：100乘以分数X/Y，其中X为在A与B的序列比对程序ALIGN-2的比对中通过该程序评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y为B中的氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％不等于B与A的氨基酸序列同一性％。

如本文中使用的，术语“Adnectin结合位点”是指与特定Adnectin相互作用或结合的蛋白质(例如，PD-L1)的位点或部分。Adnectin结合位点可以由蛋白质的连续氨基酸或通过三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的Adnectin结合位点通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的Adnectin结合位点通常在用变性溶剂处理时丧失。

可以通过抗体的表位作图的常用标准技术(包括但不限于蛋白酶作图和突变分析)来确定本文所述的抗PD-L1 Adnectin的Adnectin结合位点。或者，可以使用与相同多肽(例如PD-L1)结合的参考Adnectin或抗体(如下文在“交叉竞争性Adnectin和/或与相同Adnectin结合位点结合的Adnectin”部分中进一步描述)，通过竞争测定来确定Adnectin结合位点。如果测试Adnectin和参考分子(例如另一种Adnectin或抗体)竞争，则它们与相同的Adnectin结合位点或足够接近的Adnectin结合位点结合，使得一个分子的结合干扰另一个。Adnectin结合位点由用于鉴定它的方法限定。例如，Adnectin可以与如通过HDX确定的给定结合位点结合；Adnectin可以与如通过结晶学确定的给定结合位点结合；或Adnectin可以与如通过定向突变分析确定的给定结合位点结合。

在与PD-L1结合的Adnectin的语境中，术语“特异性地结合”、“特异性结合”、“选择性结合”、和“选择性地结合”在本文中可互换使用，是指通过本领域中可用的技术测量，Adnectin对PD-L1展现出亲和力，而不与其他不同的多肽显著结合(例如，少于约10％结合)，这样的可用技术例如但不限于，斯卡查德分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE测定)。另外，例如，若某一Adnectin的结合结构域对于PD-L1是特异性的，该术语同样适用。

在与PD-L1结合的Adnectin的语境中，本文中使用的术语“优先结合”是指通过本领域可用的技术测量，本文所述的Adnectin与PD-L1的结合比与其他不同的多肽的结合高至少约20％的情形，其中本领域可用的技术例如但不限于斯卡查德分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE测定)。

术语“交叉反应性”在本文中的Adnectin的语境中，是指与两种以上可显著区分(distinct)的蛋白质结合的Adnectin，这些可显著区分的蛋白质具有相同或非常相似的Adnectin结合位点。

在与PD-L1结合的Adnectin的背景下，如本文中使用的术语“K_D”意指某一特定的Adnectin-蛋白质(例如，PD-L1)相互作用的解离平衡常数或某一Adnectin对于某一蛋白质(例如，PD-L1)的亲和力，使用表面等离子体共振测定或细胞结合测定所测量。如本文中使用的，“期望的K_D”是指对于预期目的足够的Adnectin的K_D。例如，期望的K_D可以指在例如基于细胞的萤光素酶测定的体外测定中引发功能效应所需要的Adnectin的K_D。

在与蛋白质结合的Adnectin的语境中，本文中使用的术语“k_a”意指Adnectin结合成Adnectin/蛋白复合物的结合速率常数。

在与蛋白质结合的Adnectin的语境中，本文中使用的术语“k_d”意指Adnectin从Adnectin/蛋白复合物解离的解离速率常数。

在Adnectin的语境中，本文中使用的术语“IC₅₀”是指Adnectin在体外或体测定中将反应抑制到最大抑制反应的50％的水平(即，最大抑制反应和无处理的反应之间的半程)的浓度。

术语“PK”是“药代动力学”的首字母缩写，其涵盖化合物的被受试者吸收、分布、代谢和消除等的性质。如本文中使用的，“PK调节蛋白”或“PK模块”是指任何这样的蛋白质、肽或模块，当其融合至生物活性分子或与生物活性分子一起施用时，可影响所述生物活性分子的药代动力学性质。PK调节蛋白或PK模块的实例包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合剂(如美国公开号2005/0287153和2007/0003549，PCT公开号WO 2009/083804和WO 2009/133208中公开的)、人血清白蛋白及其变体、转铁蛋白及其变体、Fc或Fc片段及其变体以及糖类(例如，唾液酸)。

蛋白质或化合物的“血清半衰期”是所述多肽的血清浓度在体内降低50％所花费的时间，例如，由于通过天然机制对所述序列或化合物的降解和/或所述序列或化合物的清除或螯合。可以本身已知的任何方式，比如通过药代动力学分析来确定半衰期。适合的技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且可以例如通常涉及下列步骤：适当地对受试者施用适宜剂量的本文所述的氨基酸序列或化合物；以规律间隔从受试者采集血液样品或其他样品；确定所述血液样品中本文所述的氨基酸序列或化合物的水平或浓度；并且根据由此获得的数据(的绘图)计算，直到本文所述的氨基酸序列或化合物的水平或浓度相比于在给药时的初始水平降低50％的时间。例如，参考标准手册，如Kenneth,A.等人，ChemicalStability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists以及Peters等人，Pharmacokinete Analysis:A Practical Approach(1996)。另参见Gibaldi,M.等人，Pharmacokinetics，第2次修订版，Marcel Dekker(1982)。

可以使用t_1/2-α、t_1/2-β、HL_Lambda_z和曲线下面积(AUC)等参数来表示半衰期。

术语“可检测”是指检测高于背景信号的信号的能力。术语“可检测信号”是来源于非侵入性成像技术(例如但不限于正电子发射断层摄影术(PET)等)的信号。可检测信号是可检测的，并且可以与其他可能产生自受试者的背景信号区分。换言之，可检测信号与背景信号之间有可测量的并且统计学显著的差异(例如，统计学显著的差异是足以区分可检测信号和背景的差异，比如可检测信号与背景之间约0.1％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％或更多的差异)。可以使用标准品和/或校准曲线来确定可检测信号和/或背景的相对强度。

包含本文所述的成像剂的组合物的“可检测有效量”定义为这样的量，其足以使用临床上可用的设备产生可接受的图像。本文中提供的成像剂的可检测有效量可以通过多于一次的注射来施用。可检测有效量可依赖于个体的易感性程度、个体的年龄、性别和体重、个体的特异反应等因素而变化。成像组合物的可检测有效量也可以根据所使用的仪器和方法而变化。这些因素的优化完全在本领域技术水平之内。在某些实施方案中，PD-L1成像剂(例如，本文所述的那些)提供的区分因数(即，特定信号对背景信号)为2倍以上(例如3、4、5或更多倍)。

术语“生物正交化学”是指任何这样的化学反应，它可以发生在生命系统内部而不干扰天然的生物化学过程。该术语包括在体外生理pH下，水中或在水的存在下发生的化学反应。视为“生物正交”的反应应当是选择性的，并且避免与起始化合物中发现的其他官能团副反应。另外，反应配偶体之间生成的共价键应当是强的，并且对于生物反应是化学惰性的，而且不应影响期望分子的生物活性。

术语“点击化学”是指用于快速合成新化合物和组合文库的一组可靠且选择性的生物正交反应。点击反应的性质包括模块性(modularity)、范围宽泛性(wideness inscope)、高产率(high yielding)、立体专一性和简单的产品分离(通过非色谱法与惰性副产物分离)，以产生在生理条件下稳定的化合物。在放射化学和放射药物学中，点击化学是一组标记反应的统称，这些标记反应利用选择性和模块性结构单元，通过这些反应，可以进行化学选择性连接，在无催化剂存在下对生物学上相关的化合物进行选择性标记。“点击反应”可以使用铜，也可以是无铜点击反应。

术语“辅基”或“双功能标记试剂”是指含有放射性核素(例如¹⁸F)，能够与肽或蛋白质连接的有机小分子。

术语“螯合剂配体”，在本文中对放射性药物化学使用时，是指将放射性标记的辅基与生物活性靶向分子(例如，肽或蛋白质)共价连接的双功能螯合剂或缀合(BFC)模块(二者在本文中可互换使用)。BFC利用羧酸或活化酯等官能团进行酰胺偶联，利用异硫氰酸进行硫脲偶联，利用马来酰亚胺进行硫醇偶联。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指人。

“癌症”是指以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的一大类种类繁多的疾病。不受调节的细胞分裂和生长(分裂并生长)导致恶性肿瘤的形成，恶性肿瘤侵袭邻近组织，并且还可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远处部位。

“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)及由这些细胞中的任一者或肝脏产生的可溶性大分子(包括Ab、细胞因子和补体)的作用，导致入侵的病原体、病原体感染的细胞或组织、癌性或其他异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常人细胞或组织，被选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或清除出脊椎动物身体。

“免疫调节剂”是指可调节免疫应答的物质、药剂、信号转导途径或其组分。“调节”、“修饰”或“调制”免疫应答是指免疫系统的细胞或这样的细胞的活性的任何改变。这样的调节包括免疫系统的刺激或抑制，其可表现为各种细胞类型的数目的增加或减少、这些细胞的活性的增加或降低、或可在免疫系统内发生的任何其他变化。已经鉴定了抑制性和刺激性免疫调节剂，其中一些在癌症微环境中可具有增强的功能。

术语“免疫治疗”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫应答在内的方法治疗罹患疾病或处于患上或遭受疾病复发风险的受试者。

受试者的“治疗”或“疗法”是指为了逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防与疾病相关的症状的发作、进展、发展、严重性或复发、并发症、病症或生化标记而对受试者进行的或施用活性剂的任何类型的干预或过程。

在抗PD-L1 Adnectin的语境中，如本文中使用的“给药”或“施用”是指将本文所述的PD-L1 Adnectin或基于PD-L1 Adnectin的探针或标记探针(也称为“成像剂”)引入受试者体内。可以使用任何适合的给药途径，比如静脉内、口服、局部、皮下、腹膜内、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻腔，引入到脑脊液或滴注到身体隔室中。

术语“治疗有效量”是指给予受试者治疗益处所必需的药剂的最小剂量，但小于毒性剂量。

如本文中使用的，“有效量”是在必需的剂量和持续时间下，实现期望的结果所需的量。

如本文中使用的，“足够的量”是指足以实现期望的结果的量。

如本文中使用的，“正电子发射断层摄影术”或“PET”是指产生身体中示踪剂位置的三维图像的非侵入性核医学技术。该方法检测由在生物活性分子上的引入身体内的正电子发射放射性核素(示踪剂)间接发射的伽马射线对。PET成像工具具有广泛多种用途并且在临床前和临床上都有助于药物开发。例示性应用包括直接可视化靶标的体内饱和；监测正常组织中的摄取以预期毒性或患者与患者之间的变化；量化病变组织；肿瘤转移；以及监测药物效力随时间的变化、或抗性随时间的变化。

概述

本文提供了与人PD-L1结合并且可与异源分子(如放射性标记物)偶联的多肽。这样的多肽可用于，例如，检测样品或组织，例如受试者中的样品或组织(例如，组织，如选择性表达PD-L1的癌组织)中的PD-L1，例如用于诊断测定法。

本发明基于允许对患者的PD-L1表达全身可视化的非侵入性临床成像剂的开发。在某些实施方案中，对患者进行单日全身“虚拟活组织检查”以监测和定位PD-L1表达水平。利用本文所述的PD-L1成像剂，可以在一日之内提供高对比度的全身虚拟活组织检查。

I.基于纤连蛋白的支架

Fn3是指来自纤连蛋白的III型结构域。Fn3结构域是小的、单体的、可溶的、且稳定的。其缺乏二硫键，因此在还原条件下是稳定的。Fn3的总体结构类似于免疫球蛋白折叠。按照从N端到C端的顺序，Fn3结构域包含：β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；以及β或β样链G。七个反平行β链排列成两个β片层，这些片层形成稳定的核心，同时产生两个由连接β或β样链的环构成的“面”。环AB、CD、和EF位于一个面上(“南极”)，环BC、DE、和FG位于相对的面上(“北极”)。人纤连蛋白中有至少15种不同的Fn3模块，虽然各模块之间的序列同源性较低，但它们在三级结构上都有高度相似性。

本文中描述了包含Fn3域的抗PD-L1 Adnectin，其中一个或多个溶剂可及环(solvent accessible loop)已被随机化或突变。在某些实施方案中，所述Fn3结构域是从人纤连蛋白III型结构域的野生型第十模块(¹⁰Fn3)衍生的Fn3结构域：

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:1)(94个氨基酸；AB、CD和EF环加有下划线；核心¹⁰Fn3结构域以氨基酸9(“E”)开始，以氨基酸94(“T”)结束，对应于一条86个氨基酸的多肽)。核心野生型人¹⁰Fn3结构域在SEQ ID NO:2中列出。

变体和野生型¹⁰Fn3蛋白两者以相同的结构为特征，即，从A到G命名的七条β链结构域序列和连接这七条β链结构域序列的六个环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环、和FG环)。位于最接近N端和C端的β链可采取β样溶液构象。在SEQ ID NO:1中，AB环对应于残基14-17，BC环对应于残基23-31，CD环对应于残基37-47，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基63-67，FG环对应于残基75-87。

因此，在某些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 Adnectin是这样的¹⁰Fn3多肽，其与SEQ ID NO:1中所示的人¹⁰Fn3结构域或其如SEQ ID NO:2所示的核心序列至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同。变异通常大多发生在一个或多个环或一个或多个β链或N-或C端区中。¹⁰Fn3多肽的每一条β或β样链可以主要由与SEQ ID NO:1或2的相应β或β样链序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列组成，前提是这样的变化不破坏该多肽在生理条件下的稳定性。

在某些实施方案中，本发明提供了包含纤连蛋白III型第十(¹⁰Fn3)结构域的抗人PD-L1 Adnectin，其中所述¹⁰Fn3结构域包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG，并且其中选自环BC、DE和FG的至少一个环具有相对于人¹⁰Fn3结构域的相应环序列改变的氨基酸序列。“Adnectin”是经修饰的人¹⁰Fn3结构域，其结合未修饰的人¹⁰Fn3结构域所不结合的靶标。在一些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 Adnectin包含这样的¹⁰Fn3结构域，该¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO:1或2的非环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中选自BC、DE和FG的至少一个环被改变。在某些实施方案中，BC和FG环被改变，在某些实施方案中，BC和DE环被改变，在某些实施方案中，DE和FG环被改变，并且在某些实施方案中，BC、DE和FG环被改变，即，¹⁰Fn3结构域包含非天然存在的环。在某些实施方案中，AB、CD和/或EF环被改变。“被改变”意指相对于模板序列(相应的人纤连蛋白结构域)的一个或多个氨基酸序列改变，包括氨基酸添加、缺失、取代及其组合。改变氨基酸序列可以通过有意的、盲目的或自发的序列变化(通常是核酸编码序列)来实现，并且可通过任何技术发生，例如PCR、易错PCR或化学DNA合成。

在某些实施方案中，选自BC、DE和FG的一个或多个环相对于相应的人纤连蛋白环在长度上可延长或缩短。在一些实施方案中，环的长度可以延长2-25个氨基酸。在一些实施方案中，环的长度可以减少1-11个氨基酸。因此，为了优化抗原结合，不但可以改变¹⁰Fn3的环的序列，还可以改变其长度，以获得抗原结合中最大可能的灵活性和亲和力。

在某些实施方案中，多肽包含这样的Fn3域，其包含与SEQ ID NO:1或2的非环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％相同的非环区氨基酸序列，其中选自BC、DE和FG的至少一个环被改变。在一些实施方案中，改变的BC环具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、最多1、2、3或4个氨基酸缺失、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入，或其组合。

在一些实施方案中，可以取代整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ ID NO:1的氨基酸78-80)中的一个或多个残基，以破坏整联蛋白结合。在一些实施方案中，本文中提供的所述多肽的FG环不含RGD整联蛋白结合位点。在一个实施方案中，所述RGD序列被替换为极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以N端到C端的方向)。在一些实施方案中，所述RGD序列替换为SGE。在一个实施方案中，所述RGD序列替换为RGE。

在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含¹⁰Fn3结构域，所述¹⁰Fn3结构域由以下序列一般性定义：

EVVAA(Z)_aLLISW(Z)_xYRITY(Z)_bFTV(Z)_yATISGL(Z)_cYTITVYA(Z)_zISINYRT(SEQ ID NO:3)

其中，AB环以(Z)_a表示，CD环以(Z)_b表示，EF环以(Z)_c表示，BC环以(Z)_x表示，DE环以(Z)_y表示，FG环以(Z)_z表示。Z表示任何氨基酸，Z后面的下标是表示氨基酸的数目的整数。具体而言，a可以是1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3或1-2个氨基酸；b、c、x、y和z可以各自独立地是2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7个氨基酸。β链的序列在所有7个支架区上相对于SEQ ID NO:1或2中所示的相应氨基酸可以具有0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、从0到1个取代、缺失或添加。在某些实施方案中，β链的序列在所有7个支架区上相对于SEQ ID NO:1或2中所示的相应氨基酸可以具有0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1个保守取代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均发生在核心氨基酸残基之外的残基处。

在某些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 Adnectin是基于¹⁰Fn3支架的，并且由以下序列一般性定义：

EVVAATPTSLLISW(Z)_xYRITYGETGGNSPVQEFTV(Z)_yATISGLKPGVDYTITVYA(Z)_zISINYRT(SEQID NO:4)。

其中BC环以(Z)_x表示，DE环以(Z)_y表示，FG环以(Z)_z表示。Z表示任何氨基酸，Z后面的下标是表示氨基酸的数目的整数。具体而言，x、y和z可各自独立地选自2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸。在优选的实施方案中，x是11个氨基酸，y是6个氨基酸，z是12个氨基酸。β链的序列在所有7个支架区上相对于SEQ ID NO:1或2中所示的相应氨基酸可以具有0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1个取代、缺失或添加。在某些实施方案中，β链的序列在所有7个支架区上相对于SEQID NO:1或2中所示的相应氨基酸可以具有0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1个保守取代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基(例如，在一个或多个环的外面)是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均发生在核心氨基酸残基之外的残基处。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin可包含如SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环中的至少一个被改变。如上文所述的，对应于SEQ ID NO:1的残基23-31、51-56和75-87的氨基酸残基分别定义了BC、DE和FG环。然而，应当理解，实现对于期望靶标(例如PD-L1)具有强亲和力的¹⁰Fn3结合剂并不需要修饰环区中每一个残基。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:21、22和23中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:21、22和23的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:36、37和38中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别以(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:36、37和38的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:51、52和53中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:51、52和53的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:66、67和68中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:66、67和68的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:6、7和8中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别以(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:6、7和8的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:81、82和83中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:81、82和83的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:97、98和99中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:97、98和99的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含在SEQ ID NO:3或4中列出的序列，其中分别如(Z)_x、(Z)_y和(Z)_z表示的BC、DE和FG环包括具有分别为SEQ ID NO:113、114和115；分别为SEQID NO:124、125和126；分别为SEQ ID NO:135、136和137；分别为SEQ ID NO:146、147和148；分别为SEQ ID NO:157、158和159；分别为SEQ ID NO:168、169和170；分别为SEQID NO:179、180和181；分别为SEQ ID NO:190、191和192；分别为SEQ ID NO:201、202和203；分别为SEQ ID NO:212、213和214；分别为SEQ ID NO:223、224和225；分别为SEQ ID NO:234、235和236；分别为SEQ ID NO:245、246和247；分别为SEQ ID NO:256、257和258；分别为SEQ ID NO:267、268和269；分别为SEQ ID NO:278、279和280；分别为SEQ ID NO:289、290和291；分别为SEQ ID NO:300、301和302；分别为SEQ ID NO:311、312和313；分别为SEQ IDNO:322、323和324；分别为SEQ ID NO:333、334和335；分别为SEQ ID NO:344、345和346；分别为SEQ ID NO:355、356和357；分别为SEQ ID NO:366、367和368；分别为SEQID NO:377、378和379；分别为SEQ ID NO:388、389和390；分别为SEQ ID NO:399、400和401；分别为SEQID NO:410、411和412；分别为SEQ ID NO:421、422和423；分别为SEQ ID NO:432、433和434；分别为SEQ ID NO:443、444和445；分别为SEQ ID NO:454、455和456；分别为SEQ ID NO:465、466和467；分别为SEQ ID NO:476、477和478；分别为SEQ ID NO:487、488和489；分别为SEQ ID NO:498、499和500；分别为SEQ ID NO:509、510和511；分别为SEQ ID NO:520、521和522；分别为SEQ ID NO:531、530和531；分别为SEQ ID NO:542、543和544；分别为SEQ IDNO:553、554和555；或分别为SEQ ID NO:564、565和566的氨基酸序列的BC、DE和FG环。这样的抗PD-L1 Adnectin的支架区相对于SEQ ID NO:4的支架氨基酸残基可包含0到20、0到15、0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1个取代、保守取代、缺失或添加。只要抗PD-L1 Adnectin能够以期望的K_D结合PD-L1，就可以进行这样的支架修饰。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin的BC环包含选自下组的氨基酸序列：6、21、36、51、66、81和97。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin的DE环包含选自下组的氨基酸序列：7、22、37、52、67、82和98。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin的FG环包含选自下组的氨基酸序列：8、23、38、53、68、83和99。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含分别与SEQ ID NO:6、21、36、51、66、81和97；7、22、37、52、67、82和98；以及8、23、38、53、68、83和99中任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的BC、DE和FG环氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80、96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222、233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552和563中任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 Adnectin包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80或96的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含与SEQ ID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91、100-107、116-122、127-133、138-144、150-155、160-166、171-177、182-188、193-199、204-210、215-221、227-232、237-243、248-254、259-265、271-276、291-287、292-298、303-309、314-320、325-331、337-342、347-353、358-364、369-375、380-386、391-397、402-408、413-419、424-430、435-441、446-452、457-463、468-474、479-485、490-496、501-507、512-518、523-529、534-540、545-551和556-562中的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 Adnectin包含与SEQ ID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、6975、84-91和100-107中的任一者至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:6、7和8中列出的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:21、22和23中列出的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:36、37和38中列出的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:51、52和53中列出的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:66、67和68中列出的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:81、82和83中列出的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:97、98和99中列出的BC、DE和FG环。

在某些实施方案中，将本文所述的BC、DE和/或FG环氨基酸序列(例如，分别为SEQID NO:6、21、36、51、66、81和97；7、22、37、52、67、82和98；以及8、23、38、53、68、83和99)植入非¹⁰Fn3结构域蛋白质支架中。例如，将一个或多个环氨基酸序列交换或插入到抗体重链或轻链或其片段的一个或多个CDR环中。在一些实施方案中，其中交换或插入有一个或多个氨基酸环序列的蛋白质结构域包括但不限于，共有Fn3结构域(Centocor,US)、锚蛋白重复蛋白(Molecular Partners AG,Zurich Switzerland)、结构域抗体(Domantis,Ltd,Cambridge,MA)、单结构域骆驼科纳米抗体(Ablynx,Belgium)、脂质运载蛋白(例如，抗运载蛋白(anticalin)；Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、Avimers(Amgen,CA)、亲和体(Affibody AG,Sweden)、泛素(例如，affilins；Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)、蛋白表位模拟物(Polyphor Ltd,Allschwil,Switzerland)、螺旋束支架(例如，阿尔法体，Complix,Belgium)、Fyn SH3结构域(Covagen AG,Switzerland)或atrimers(Anaphor,Inc.,CA)。

在某些实施方案中，可以通过相对于野生型人¹⁰Fn3结构域(SEQ ID NO:1或2)的相应区域的氨基酸序列的缺失、取代或插入来修饰本文中提供的多肽的N端和/或C端区的氨基酸序列。¹⁰Fn3结构域通常以SEQ ID NO:1的氨基酸编号1开始。然而，本发明也涵盖具有氨基酸缺失的结构域。还可将额外的序列添加至具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的¹⁰Fn3结构域的N端或C端。例如，在一些实施方案中，N端延伸由选自下组的氨基酸序列组成：M、MG、和G。在某些实施方案中，可将MG序列置于由SEQ ID NO:1定义的¹⁰Fn3的N端。M通常将被切去，在N端留下G。另外，也可将M、G或MG置于任何表3中所示的N端延伸的N端。

在示例性实施方案中，可将具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸长度的替代N端区添加至SEQ ID NO:1或2或表3中列出的任何Adnectin的N端区。示例性的替代N端区包括(由单字母氨基酸代码表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:574)和GVSDVPRDL(SEQ ID NO:575)。其他适合的替代N端区(它们可连接到例如Adnectin核心序列的N端)包括，例如，X_nSDVPRDL(SEQ ID NO:576)、X_nDVPRDL(SEQ ID NO:577)、X_nVPRDL(SEQID NO:578)、X_nPRDL(SEQ ID NO:579)、X_nRDL(SEQ ID NO:580)、X_nDL(SEQ ID NO:581)或X_nL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，当n＝2时，X是Met-Gly。当将Met-Gly序列添加至¹⁰Fn3结构域的N端时，M通常会被切去，在N端留下G。在一些实施方案中，替代的N端区包含氨基酸序列MASTSG(SEQ ID NO:582)。

在示例性实施方案中，可将长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的替代C端区添加至SEQ ID NO:1或2或任何表3中列出的Adnectin的C端区。替代C端区序列的具体实例包括例如这样的多肽，其包含、主要为、或为EIEK(SEQ ID NO:584)、EGSGC(SEQ ID NO:585)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:586)、EIEKPSQ(SEQ ID NO:587)、EIEKP(SEQID NO:588)、EIEKPS(SEQ ID NO:589)、或EIEKPC(SEQ ID NO:590)。在一些实施方案中，替代C端区包含EIDK(SEQ ID NO:591)，并且在特定的实施方案中，替代C端区是EIDKPCQ(SEQID NO:592)或EIDKPSQ(SEQ ID NO:593)。更多适合的替代C端区在SEQ ID NO:594-618中列出。

在某些实施方案中，Adnectin与C端延伸序列连接，所述C端延伸序列包含E和D残基，且长度可为8～50、10～30、10～20、5～10、以及2～4个氨基酸之间。在一些实施方案中，尾序列包括基于ED的接头，其中所述序列包含ED的串联重复。在示例性实施方案中，尾序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4或5个ED重复。在某些实施方案中，基于ED的尾序列还可包含另外的氨基酸残基，例如EI、EID、ES、EC、EGS、和EGC。这样的序列部分地基于已知的Adnectin尾序列，如EIDKPSQ(SEQ ID NO:593)，其中残基D和K已去除。在示例性实施方案中，基于ED的尾在ED重复之前包含E、I或E1残基。

在某些实施方案中，用已知接头序列(例如表3中的SEQ ID NO:629-678)将N或C端延伸序列与抗PD-L1 Adnectin序列连接。在一些实施方案中，可以将序列置于¹⁰Fn3结构域的C端以促进药代动力学模块的附接。例如，可以将含有半胱氨酸的接头如GSGC(SEQ IDNO:638)添加至C端，以促进半胱氨酸残基上的定点聚乙二醇化。

在某些实施方案中，替代C端模块(其可与C端氨基酸RT(即氨基酸94)连接)包含氨基酸P_mX_n，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少为1的整数，n是0或至少为1的整数。在某些实施方案中，替代C端模块包含氨基酸PC。在某些实施方案中，替代C端模块包含氨基酸PI、PC、PID、PIE、PIDK(SEQ ID NO:605)、PIEK(SEQ ID NO:606)、PIDKP(SEQ ID NO:607)、PIEKP(SEQ ID NO:608)、PIDKPS(SEQ ID NO:609)、PIEKPS(SEQ ID NO:610)、PIDKPC(SEQID NO:611)、PIEKPC(SEQ ID NO:612)、PIDKPSQ(SEQ ID NO:613)、PIEKPSQ(SEQ ID NO:614)、PIDKPCQ(SEQ ID NO:615)、PIEKPCQ(SEQ ID NO:616)、PHHHHHH(SEQ ID NO:617)、和PCHHHHHH(SEQ ID NO:618)。在实施例和表3中提供了在C端具有PC的示例性抗PD-L1Adnectin。

在某些实施方案中，本文所述的Adnectin具有6X his尾(SEQ ID NO:619)。

在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含如下所述的¹⁰Fn3结构域以及任选的6X his尾，该¹⁰Fn3结构域既具有替代N端区序列，又具有替代C端区序列。

II.抗PD-L1 Adnectin的生物学特性

本申请提供了这样的Adnectin，它们以10nm、1nM、0.5nM、0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，例如通过SPR(Biacore)所测定的，并且表现出以下特性中的一项或多项：

1.将人PD-L1和人PD-1之间的相互作用抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，例如通过流式细胞术测定的，例如使用人PD-1Fc蛋白和人PD-L1阳性细胞，例如L2987细胞；

2.将人CD80(B7-1)与人PD-L1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，例如在ELISA测定法中或者通过SPR(Biacore)确定；

3.将抗PD-L1抗体12A4(描述于例如美国专利No.7,943,743)与人PD-L1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在ELISA测定法中或者通过SPR(Biacore)确定；和

4.抑制混合淋巴细胞反应(MLR)中的细胞增殖。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin以1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且表现出特性1-4中的每一项。在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin以0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且表现出特性1-4中的每一项。

本文中提供了Adnectin，其包含与本文中所述的抗PD-L1 Adnectin或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以10nM、1nM、0.5nM、0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，例如通过SPR(Biacore)确定，并且表现出以下特性中的一项或多项：

1.将人PD-L1和人PD-1之间的相互作用抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，例如通过流式细胞术测定，例如使用人PD-1Fc蛋白和人PD-L1阳性细胞，如L2987细胞；

3.将抗PD-L1抗体12A4与人PD-L1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，例如在ELISA测定法中或者通过SPR(Biacore)确定；和

4.抑制混合淋巴细胞反应(MLR)中的细胞增殖。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含与本文中所述的抗PD-L1Adnectin或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且表现出特性1-4中的每一项。在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含与本文中所述的抗PD-L1 Adnectin或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且表现出特性1-4中的每一项。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin与本文所描述的特定抗PD-L1 Adnectin竞争(例如，交叉竞争)与PD-L1的结合。这样的竞争性Adnectin可基于其在标准PD-L1结合测定法中竞争性抑制本文所述的Adnectin与PD-L1的结合的能力加以鉴定。例如，可以使用标准ELISA测定法，其中将重组PD-L1蛋白固定在平板上，将其中一个Adnectin荧光标记，并且评估非标记Adnectin竞争掉标记Adnectin的结合的能力。

在某些实施方案中，可进行竞争ELISA形式来确定两种抗PD-L1 Adnectin是否结合PD-L1上重叠的Adnectin结合位点。在一种形式中，将Adnectin#1包被在平板上，然后封闭和洗涤。向这个平板添加单独的PD-L1、或添加与致饱和浓度的Adnectin#2预温育的PD-L1。在一段适当时间的温育之后，洗涤平板并用多克隆抗PD-L1抗体(如生物素化的抗PD-L1多克隆抗体)探测，然后用链霉亲和素-HRP缀合物和标准四甲基联苯胺显影程序进行检测。如果与或未与Adnectin#2预温育OD信号相同，则这两种Adnectin的结合彼此独立，而且它们的Adnectin结合位点不重叠。然而，如果接受PD-L1/Adnectin#2混合物的孔的OD信号低于仅仅接受PD-L1的那些孔，则确认Adnectin#2的结合可阻断Adnectin#1与PD-L1的结合。

或者，通过表面等离子体共振(SPR，例如，BIAcore)进行类似的实验。将Adnectin#1固定在SPR芯片表面上，随后注入单独的PD-L1或与致饱和浓度的Adnectin#2预温育的PD-L1。如果PD-L1/Adnectin#2混合物的结合信号与单独的PD-L1相同或较之更高，则这两种Adnectin的结合彼此独立，并且它们的Adnectin结合位点不重叠。然而，如果对于PD-L1/Adnectin#2混合物的结合信号低于单独的PD-L1的结合信号，则确认Adnectin#2的结合可阻断Adnectin#1与PD-L1的结合。这些实验的特征是使用致饱和浓度的Adnectin#2。如果PD-L1未被Adnectin#2饱和，则以上结论不成立。可以使用类似的实验来确定任何两种PD-L1结合性蛋白质是否与重叠的Adnectin结合位点结合。

上文例示的这两种测定法也可以以相反的顺序进行，其中固定化Adnectin#2，而PD-L1-Adnectin#1添加到平板。或者，可用单克隆抗体和/或可溶性受体-Fc融合蛋白替换Adnectin#1和/或#2。

在某些实施方案中，可使用HTRF夹心测定来确定竞争。

在某些实施方案中，竞争性Adnectin是这样的Adnectin，其与本文所述的特定抗PD-L1 Adnectin结合到PD-L1上的相同Adnectin结合位点。可以使用标准定位技术，如蛋白酶定位、突变分析、HDX-MS(氢氘交换质谱)、X射线结晶学和2维核磁共振来确定Adnectin是否与参考Adnectin结合相同的Adnectin结合位点或表位(参见，例如，Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris编辑(1996))。表位由用于定位表位的方法所限定。例如，在某些实施方案中，PD-L1 Adnectin或抗体与本文所述的PD-L1 Adnectin之一结合相同的表位，如通过HDX-MS确定或通过X射线结晶学确定。

候选竞争性抗PD-L1 Adnectin可将本文所述的抗PD-L1 Adnectin与PD-L1的结合抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％、和/或它们的结合被抗PD-L1Adnectin抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。可使用上文描述的方法确定竞争的％。

本文中提供了Adnectin，其以10nm、1nM、0.5nM、0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，如通过例如SPR(Biacore)测定的，并且表现出以下特性中的一项或多项：

1.将人PD-L1和人PD-1之间的相互作用抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如通过流式细胞术测定，例如使用人PD-1Fc蛋白和人PD-L1阳性细胞，如L2987细胞；

2.将人CD80(B7-1)与人PD-L1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在ELISA测定法或者通过SPR(Biacore)确定；

3.将抗PD-L1抗体12A4与人PD-L1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在ELISA测定法中或者通过SPR(Biacore)确定；4.抑制混合淋巴细胞反应(MLR)中的细胞增殖；和

5.与本文中所述的抗PD-L1抗体竞争与人PD-L1结合。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin以1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且表现出特性1-5中的每一项。在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin以0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且表现出特性1-5中的每一项。

本文中提供了Adnectin，其包含与本文中所述的抗PD-L1 Adnectin或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以10nM、1nM、0.5nM、0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，如例如通过SPR(Biacore)确定的，并且表现出以下特性中的一项或多项：

3.将抗PD-L1抗体12A4与人PD-L1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在ELISA测定法中或者通过SPR(Biacore)确定；

4.抑制混合淋巴细胞反应(MLR)中的细胞增殖；和

5.与本文中所述的抗PD-L1抗体竞争与人PD-L1结合。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含与本文中所述的抗PD-L1 Adnectin或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且表现出特性1-5中的每一项：在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin包含与本文中所述的抗PD-L1 Adnectin或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且表现出特性1-5中的每一项：

III.融合物，包括药代动力学模块

在某些实施方案中，期望抗PD-L1 Adnectin具有短的半衰期，例如当用于PET成像时。在某些实施方案中，抗PD-L1 Adnectin在血液或血清中具有30分钟至3小时、30分钟至120分钟、60分钟至120分钟或80分钟至100分钟的半衰期。在某些实施方案中，PD-L1Adnectin的半衰期类似于与其附接的标记物例如¹⁸F的半衰期。

本文所述的抗PD-L1 Adnectin可以包含药代动力学(PK)模块。可以根据所认为的治疗需要来评估药代动力学的改善。抗PD-L1 Adnectin可以与这样的模块附接，所述模块相对于未修饰的抗PD-L1 Adnectin使人体中的多肽的清除率降低超过两倍、超过三倍、超过四倍、或超过五倍。其他药代动力学改善的量度可能包括血清半衰期，其通常被分为α相和β相。通过添加适当的模块可以显著改善任一个相或两个相。例如，相对于单独的Fn3结构域(或Adnectin)，PK模块可使多肽的血清半衰期增加超过10％、20％、50％、2倍、3倍或5倍。

减慢蛋白质从血液中清除的模块(在本文中称为“PK模块”)包括聚氧化烯模块(例如，聚乙二醇)、糖(例如，唾液酸)和良好耐受的蛋白质模块(例如，Fc和片段及其变体、转铁蛋白或血清白蛋白)。可用于本发明的其他PK模块包括Kontermann等人所述的那些(Current Opinion in Biotechnology 2011；22:868-76)，将其通过提述并入本文。这样的PK模块包括但不限于PAS融合物(即，基于脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸三个氨基酸的重组PEG模拟物)、碳水化合物缀合物(例如，羟乙基淀粉(HES))、糖基化、聚唾液酸缀合物和脂肪酸缀合物。

IV.核酸-蛋白质融合技术

在一方面，本发明提供了包含结合PD-L1的纤连蛋白III型结构域的Adnectin。一种迅速制造和测试具有特异性结合特性的Fn3结构域的方式是Adnexus(Bristol-MyersSquibb R&D公司)的核酸-蛋白质融合技术。本公开利用称作‘PROfusion’的体外表达和标签技术，其采用核酸-蛋白质融合(RNA-和DNA-蛋白质融合)来鉴定对于与蛋白质结合而言重要的新颖的多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质融合技术为使蛋白质与其编码遗传信息共价偶联的技术。关于RNA-蛋白质融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述参见Szostak等人，美国专利号6,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018和6,818,418；Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,1997；94:12297-12302；以及Kurz等人，Molecules,2000；5:1259-64，将所有这些文献通过提述将其并入本文。

V.载体和多核苷酸

本公开中还包括编码任何本文中描述的蛋白质的核酸序列。正如本领域技术人员理解，由于第三碱基简并性，几乎每个氨基酸都可由编码核苷酸序列中的多于一个的三联体密码子表示。另外，微小的碱基对变化可导致所编码的氨基酸序列中的保守取代，但预期不会实质性改变基因产物的生物活性。因此，编码本文所述的蛋白质的核酸序列可以在序列上轻微被修饰而仍然还编码其对应的基因产物。编码本文所述的抗PD-L1 Adnectin及其融合物的某些示例性核酸包括具有在SEQ ID NO:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111中列出的序列的核酸。

还涵盖与SEQ ID NO:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111至少50％，如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同并且编码与PD-L1结合的蛋白质的核酸序列。在一些实施方案中，引入核苷酸取代以便不改变生成的翻译的氨基酸序列。

可以化学合成编码本文所述的各种蛋白质或多肽的任一者的核酸。可以选择密码子使用以便提高细胞中的表达。这样的密码子使用将取决于所选择的细胞类型。已经开发了专门针对大肠杆菌和其他细菌、以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的密码子使用模式。参见，例如，Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2):438-442(2003年1月21日)；Sinclair等人，Protein Expr.Purif.,26(I):96-105(2002年10月)；Connell,N.D.,Curr.Opin.Biotechnol.,12(5):446-449(2001年10月)；Makrides等人，Microbiol.Rev.,60(3):512-538(1996年9月)；和Sharp等人，Yeast,7(7):657-678(1991年10月)。

核酸操作的一般技术描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第二版，Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，或Ausubel,F.等人，Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing andWiley-Interscience,New York(1987)及定期的更新中，将这些文献通过提述并入本文。通常，将编码多肽的DNA与适合的来源于哺乳动物、病毒、或昆虫基因的转录或翻译调控元件可操作连接。这样的调控元件包括转录启动子、任选的控制转录的操作序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。另外，组入在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)、以及帮助识别转化体的选择基因。

本文所述的蛋白质不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽优选是信号序列或具有在成熟蛋白或多肽的N端的特异性切割位点的其他多肽。优选选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(即，由信号肽酶切割)的信号序列。用于在哺乳动物系统中产生多肽的示例性N端前导序列是：METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ IDNO:583)，其在表达后由宿主细胞去除。

对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，用例如选自下组的原核信号序列取代信号序列：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定肠毒素II前导序列。

对于酵母分泌，可将天然信号序列取代为例如酵母转化酶前导序列、a因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导序列、或在美国专利号5,631,144中描述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。这样的前体区的DNA可以以符合阅读框的方式连接于编码蛋白质的DNA。

表达载体和克隆载体两者都包含使所述载体能够在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这个序列是使所述载体能够独立于宿主染色体DNA而复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。这样的用于多种细菌、酵母、和病毒的序列是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适合于酵母，并且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点组分对于哺乳动物表达载体是不需要的(一般可以使用SV40起点，仅仅是因为它含有早期启动子)。

表达载体和克隆载体可包含选择基因，也称为可选择标志物。典型的选择基因编码这样的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素(tracycline)的抗性，(b)补足营养缺陷型缺陷，或(c)提供从复合培养基中不可得的关键养分，例如，编码用于杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。

表达和克隆载体通常含有被宿主生物识别并且与编码本文所述蛋白质(例如基于纤连蛋白的支架蛋白的核酸)可操作连接的启动子。适合于与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子，例如tan启动子。然而，其他已知的细菌启动子也是适合的。用于细菌系统中的启动子还将包含Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其与编码本文所述的蛋白质的DNA可操作连接。真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有的真核基因都具有富AT区，它位于转录起始的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一个序列为CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3′端为AATAAA序列，其可以是将多聚A尾添加到编码序列的3′端的信号。所有这些序列都适宜地插入真核表达载体中。

适合于与酵母宿主一起使用的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶的启动子。

可以例如用获自病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，以及最优选地，猴病毒40(SV40))的基因组的启动子、来自异源哺乳动物的启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热休克启动子等来控制哺乳动物宿主细胞中载体的转录，只要这样的启动子与宿主细胞系统相容即可。

载体中常常插入增强子序列来增加高等真核生物对编码本文所述的蛋白质的DNA的转录。目前已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α甲胎蛋白、和胰岛素)的增强子序列。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点晚期侧(late side)的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子、以及腺病毒增强子。关于真核生物启动子活化的增强元件，还参见Yaniv,Nature,297:17-18(1982)。增强子可以被剪接到载体中肽编码序列的5′或3′一侧，但优选位于启动子的5′一侧的位点。

在真核宿主细胞(例如，酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类、或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还将含有对于终止转录和稳定化mRNA必需的序列。这样的序列通常可从真核生物或病毒DNA的5'非翻译区得到，有时可从3'非翻译区或cDNA得到。这些区域含有这样的核苷酸区段，它们可转录为编码本文所述的蛋白质的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中所公开的表达载体。

重组DNA也可包括任何类型的可用于纯化蛋白质的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括，但不限于，组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。用于细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主的适当克隆与表达载体可见于：Cloning Vectors:ALaboratory Manual,(Elsevier,New York(1985))，将该文献的相关公开内容通过提述并入本文。

使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中，这对于本领域技术人员是显而易见的。将核酸引入宿主细胞中的各种方法是本领域中已知的，包括，但不限于，电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂质体转染；及感染(其中载体为感染剂)。

适合的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。适合的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。优选地，来自酵母属物种的酵母，如酿酒酵母，也可用于产生多肽。还可使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统由Luckow等人(Bio/Technology,6:47(1988))综述。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、C0S-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T、和BHK细胞系。通过培养适合的宿主/载体系统来表达重组蛋白而制备纯化的多肽。对于许多应用，本文所述的许多多肽的小尺寸将使在大肠杆菌中的表达成为优选的表达方法。然后，从培养基或细胞提取物纯化蛋白质。

VI.蛋白质生产

本文中还描述了表达抗PD-L1 Adnectin或其融合多肽的细胞系。可以使用本领域已知的标准技术(如本文所述的那些)来完成产生抗PD-L1 Adnectin的细胞系的建立和分离。

用本文所述的用于产生蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养宿主细胞，所述营养培养基改良为适于诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因。

还可通过在例如原核细胞(例如大肠杆菌)中产生Adnectin以无糖基化形式获得本发明的Adnectin。值得注意的是，当在体外测试时，本文所述的Adectinin的无糖基化形式表现出与糖基化Adnectin相同的亲和力、效力和作用机制。

可在各种培养基中培养用于产生本发明蛋白质的宿主细胞。可商购的培养基，如Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和达尔伯克改良伊格尔培养(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM),Sigma))适合于培养宿主细胞。另外，Ham等人，Meth.Enzymol.,58:44(1979),Barites等人，Anal.Biochem.,102:255(1980),美国专利No.4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、5,122,469、6,048,728、5,672,502或美国专利号RE 30,985中描述的许多培养基可用作宿主细胞的培养基。在需要时，可对任何这些培养基补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)、以及葡萄糖或等效能源。还可包括适当浓度的本领域技术人员已知的任何其他必要的补充剂。诸如温度、PH值等培养条件为先前用于经选择用于表达的宿主细胞的那些条件，且是普通技术人员易于想到的。

还可使用无细胞翻译系统产生本文所述的蛋白质。为了这样的目的，必须修饰编码多肽的核酸，以允许体外转录而产生mRNA并允许mRNA在所用的特定无细胞系统(真核无细胞翻译系统例如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，原核无细胞翻译系统例如细菌无细胞翻译系统)中的无细胞翻译。

也可通过化学合成产生本文所述的蛋白质(例如，通过在Solid Phase PeptideSynthesis，第二版，The Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984))中描述的方法)。蛋白质的修饰也可通过化学合成产生。

可通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化的方法纯化本发明的蛋白质。非限制性实例包括萃取、重结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分布法或这些方法的任何组合。纯化后，可通过本领域已知的多种方法中的任何方法，包括但不限于，过滤和透析，将多肽交换到不同的缓冲液中和/或浓缩。

经纯化的多肽优选为至少85％纯，或优选为至少95％纯，且最优选为至少98％纯。不论纯度的精确数值，多肽的纯度足以用作医药产品。

高通量蛋白质产生(HTPP)

将选定的结合物克隆到PET9d载体中HIS₆标签的上游，转化到大肠杆菌BL21DE3plysS细胞中，以24孔格式接种在含50μg/mL卡那霉素的5ml LB培养基中，在37℃生长过夜。吸出200μl过夜培养物并分配到适当的孔中，制备新鲜的5ml LB培养基(50μg/mL卡那霉素)培养物用于诱导表达。使培养物在37℃生长直到A₆₀₀为0.6-0.9。用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，使培养物在30℃表达6小时，4℃2750g离心10分钟收获培养物。

将细胞沉淀物重悬在450μl的裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄、0.5M NaCl、1x无EDTA的全蛋白酶抑制剂混合物(Complete^TMProtease Inhibitor Cocktail-EDTA free)(Roche)、1mM PMSF、10mM CHAPS、40mM咪唑、1mg/ml溶菌酶、30μg/ml DNA酶、2μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中(24孔格式)，在室温下振摇1-3小时，以裂解细胞沉淀物。澄清裂解物，转移到配备有96孔1.2ml捕捉板(catch plate)的96孔Whatman GF/D Unifilter中正压过滤，以将裂解物重排(re-rack)为96孔格式。将澄清的裂解物转移到已用平衡缓冲液(50mM NaH₂PO₄、0.5M NaCl、40mM咪唑，pH8.0)平衡的96孔镍-钴螯合板中并温育5分钟。借助正压去除未结合的材料。用洗涤缓冲液#1(50mM NaH₂PO₄、0.5M NaCl、5mM CHAPS、40mM咪唑，pH 8.0)以0.3ml/孔洗涤树脂两次。借助正压去除每次的洗涤液。在洗脱之前，用50μl洗脱缓冲液(PBS+20mM EDTA)洗涤每个孔，温育5分钟，借助正压弃去此次洗涤液。向每个孔另外施用100μl洗脱缓冲液以洗脱蛋白质。在室温下温育30分钟后，将板在200g下离心5分钟，将洗脱的蛋白质收集在96孔捕捉板中，其中捕捉板底部在洗脱前添加5μl的0.5M MgCl₂。使用总蛋白质测定，利用野生型¹⁰Fn3结构域作为蛋白质标准品来定量洗脱的蛋白质。

基于纤连蛋白的支架蛋白的不溶性结合剂的中规模表达和纯化

对于不溶性克隆的表达，将克隆及其后随的HIS₆标签克隆到pET9d(EMDBioscience,San Diego,CA)载体中，并在大肠杆菌HMS174细胞中表达。使用20ml接种培养物(从单个平板接种的菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃生长到A₆₀₀为0.6-1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使培养物在30℃生长4小时，>10,000g下4℃离心30分钟收获培养物。-80℃冷冻细胞沉淀。使用均质器(IKA works)在冰上将细胞沉淀重悬于25ml裂解缓冲液(20mM NaH₂P0₄、0.5M NaCl、lx无EDTA的全蛋白酶抑制剂混合物(Complete ProteaseInhibitor Cocktail-EDTA free)(Roche)、ImM PMSF，pH 7.4)中。使用M-l 10S型(Microfluidics)进行高压均质化(>18,000psi)裂解细胞。4℃23,300g离心30分钟分离不溶部分。用20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH 7.4)洗涤从裂解物离心回收的不溶性沉淀。用超声处理将所述沉淀再溶解于6.0M盐酸胍、20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH 7.4)，随后在37度下温育1-2小时。将再溶解的沉淀对0.45μm过滤，上样到用20mM磷酸钠/500M NaCl/6.0M胍(pH7.4)缓冲液平衡的Histrap柱上。上样后，用另外25个CV的相同缓冲液洗涤柱。用20mM磷酸钠/500mM NaCl/6.0M胍-HCl(pH 7.4)中的50mM咪唑洗脱结合的蛋白质。通过针对50mM乙酸钠/150mM NaCl(pH 4.5)进行透析，使纯化的蛋白质再折叠。

基于纤连蛋白的支架蛋白的可溶性结合物的中规模表达和纯化

对于可溶性克隆的表达，将克隆及其后随的HIS₆标签克隆到pET9d(EMDBioscience,San Diego,CA)载体中，在大肠杆菌HMS174细胞中表达。使用20ml接种培养物(从单个平板接种的菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃生长到A₆₀₀为0.6-1.0。用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，使培养物在30℃生长4小时，>10,000g 4℃离心30分钟收获培养物。-80℃下冷冻细胞沉淀。使用均质器(IKA works)在冰上将细胞沉淀重悬于25ml裂解缓冲液(20mM NaH₂P0₂、0.5M NaCl、lx无EDTA的全蛋白酶抑制剂混合物(Complete ProteaseInhibitor Cocktail-EDTA free)(Roche)、ImM PMSF，pH 7.4)中。通过使用M-1 10S型(Microfluidics)进行高压均质化(>18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离可溶部分。经由0.45μm过滤器使上清液澄清。将澄清的裂解物上样到用20mM磷酸钠/500M NaCl(pH 7.4)预平衡的Histrap柱(GE)上。然后用25个柱体积的相同缓冲液、之后20个柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/25mM咪唑(pH7.4)、随后35个柱体积的20mM磷酸钠/500M NaCl/40mM咪唑(pH 7.4)来洗涤柱。用15个柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/500mM咪唑(pH 7.4)洗脱蛋白质，根据A280下的吸光度合并各部分并针对l x PBS、50mM Tris、150mM NaCl(pH 8.5)或50mM NaOAc、150mM NaCl(pH4.5)进行透析。通过在0.22μm过滤去除任何沉淀。

VII.组合物

本发明进一步提供了组合物，如药物组合物和放射性药物组合物，其包含本文所述的抗PD-L1 Adnectin或其融合蛋白，其中所述组合物基本上不含内毒素，或至少含有不超过可接受水平的内毒素，如由适当的监管机构(例如FDA)确定的。

本领域中熟知的用于制造组合物的方法见于例如"Remington:The Science andPractice of Pharmacy"(20th ed.,ed.A.R.Gennaro AR.,2000,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)中。用于肠胃外给药的组合物可例如含有赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇(如聚乙二醇)、植物来源的油类、或氢化萘。可以使用生物相容性、生物可降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物控制化合物的释放。可以使用纳米颗粒组合物(例如生物可降解纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)控制化合物的生物分布。其他潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统、和脂质体。组合物中化合物的浓度视许多因素而变化，包括待给予的药物的剂量、给药途径和组合物的目的(例如预防、治疗、诊断)。

可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在采用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(比如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，比如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，比如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或葡聚糖；螯合剂，比如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，比如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、PLURONIC^TM或聚乙二醇(PEG)。

可以任选地以药学上可接受的盐形式给予本发明的多肽，所述盐比如在制药工业中常用的无毒酸加成盐或金属络合物。酸加成盐的实例包括有机酸，比如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、或三氟乙酸等；聚合酸，比如鞣酸、羧甲基纤维素等；以及无机酸，比如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。在一个实例中，在乙酸钠存在下配制多肽以增加热稳定性。

可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)中。

用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤来实现。在组合物被冻干的情况下，可以在冻干和复原之前或之后使用这种方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。另外，通常将肠胃外组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

一旦配制了药物组合物，其可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。这种制剂可以以即用形式或以施用前需要复原的形式(例如，冻干)储存。

VIII.生物物理学和生物化学表征

可评估本文所述的抗PD-L1 Adnectin与PD-L1例如人PD-L1的结合的平衡常数(例如，解离，K_D)和动力学常数(例如，结合速率常数k_on和解离速率常数k_off)。Adnectin与靶分子结合的K_D通常小于500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM、或100pM，但在k_off足够低或k_on足够高的情况下，更高的K_D值也是可以容许的。

结合亲和力的体外测定法

可使用各种体外测定法鉴定结合并且拮抗PD-L1的抗PD-L1 Adnectin。在某些实施方案中，测定法是高通量测定法，允许同时筛选多种候选Adnectin。

用于确定抗PD-L1 Adnectin的结合亲和力的示例性测定法包括但不限于溶液相法，如动力排除测定(KinExA)(Blake等人，JBC 1996；271:27677-85；Drake等人，AnalBiochem 2004；328:35-43)、采用Biacore系统(Uppsala,Sweden)的表面等离子体共振(SPR)(Welford等人，Opt.Quant.Elect 1991；23:1；Morton和Myszka,Methods inEnzymology 1998；295:268)和均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Newton等人，J BiomolScreen 2008；13:674-82；Patel等人，Assay Drug Dev Technol 2008；6:55-68)。

在某些实施方案中，可在Biacore系统中实时监测生物分子的相互作用，Biacore系统利用SPR来检测玻璃支持物上的薄金膜的表面上的光由于离该表面最多达300nm远处的折射率变化所致的共振角变化。Biacore分析生成结合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数、和亲和常数。使用Biacore表面等离子体共振系统(Biacore,Inc.)评估结合速率常数和解离速率常数，来获得结合亲和力。活化生物传感器芯片，用于共价偶联靶标。然后将靶标稀释并注射到芯片之上，获得以固定化材料的反应单位表示的信号。由于以共振单位(RU)表示的信号与固定材料的质量成比例，这代表在基质上的固定化靶标密度的一定范围。在全局分析中同时拟合结合数据和解离数据，以解析1:1双分子相互作用的净速率表达，从而产生k_on、k_off和R_max(饱和时的最大反应)的最佳拟合值。从SPR测量值计算关于结合的平衡解离常数K_D，表示为k_off/k_on。

在一些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 Adnectin在实施例2中描述的SPR亲和力测定中显示出以500nM或更小、400nM或更小、300nM或更小、200nM或更小、150nM或更小、100nM或更小、90nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、60nM或更小、50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小、15nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、或1nM或更小的K_D与人PD-L1结合。

应当理解，本文中上述测定是示例性的，并且可以使用本领域已知的用于确定蛋白质之间的结合亲和力的任何方法(例如，荧光共振能量转移(FRET)、酶联免疫吸附测定、和竞争性结合测定(例如，放射免疫测定)来评估在本文所述的抗PD-L1 Adnectin的结合亲和力。

IX.用抗PD-L1 Adnectin的体内成像

成像剂

本文所述的抗PD-L1 Adnectin还可用于各种诊断和成像应用。在某些实施方案中，用体内可检测的模块标记抗PD-L1 Adnectin，如此标记的Adnectin可用作，例如，全身成像用的体内成像剂。例如，在一个实施方案中，用于检测受试者中的PD-L1阳性肿瘤的方法包括：对受试者施用与可检测标记物连接的抗PD-L1 Adnectin，并且在适当的时间后检测受试者中的所述标记物。

可以使用抗PD-L1 Adnectin成像剂来诊断与PD-L1的水平增加相关的疾患或疾病，例如，肿瘤选择性过表达PD-L1的癌症。以相似的方式，可以使用抗PD-L1 Adnectin来监测受试者中的PD-L1水平，所述受试者是，例如，正在接受治疗以降低PD-L1水平和/或减少PD-L1阳性细胞(例如，肿瘤细胞或肿瘤浸润淋巴细胞)(TIL))的受试者、或用免疫疗法(例如，PD-1拮抗剂)治疗的受试者。可以使用抗PD-L1 Adnectin成像剂来确定受试者是否可能对需要PD-L1存在的治疗有反应，这样的治疗如免疫疗法，如PD-1或PD-L1拮抗剂治疗。可以使用有或没有修饰的抗PD-L1 Adnectin，并且可以通过共价或非共价附接可检测模块将其标记。

可以使用的可检测模块包括放射性试剂，如：放射性重金属，如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射体，¹⁸F、⁶⁰Cu、⁶¹Cu、⁶²Cu、⁶⁴Cu、¹²⁴I、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁶⁶Ga、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴⁴Sc、⁴⁷Sc、¹¹C、¹¹¹In、^114mIn、¹¹⁴In、¹²⁵I、¹²⁴I、¹³¹I、¹²³I、¹³¹I、¹²³I、³²Cl、³³Cl、³⁴Cl、⁷⁴Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁷⁸Br、⁸⁹Zr、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁹⁹Tc、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹²Pb、²²⁵Ac或¹⁵³Sm。

在某些实施方案中，放射性试剂与Adnectin的一个或多个氨基酸残基缀合。在某些实施方案中，标记的探针中可存在一个或多个，如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个，或更多数目的放射性核素。在某些实施方案中，通过螯合剂将放射性核素直接附接于Adnectin(例如参见美国专利8,808,665)。在某些实施方案中，放射性核素存在于通过双功能螯合剂或缀合(BFC)模块与Adnectin缀合的辅基中。在某些实施方案中，放射性核素螯合剂和/或缀合模块是DFO、DOTA及其衍生物(CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、Oxo-DO3A)、DBCO、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar和衍生物、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN-TM、DTPA、1B4M-DTPA、CHX-A”-DTPA、TRAP(PRP9)、NOPO、AAZTA和衍生物(DATA)、H₂dedpa、H₄octapa、H₂azapa、H₅decapa、H₆phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA和基于TRITA的螯合剂、以及其接近的类似物和衍生物。

在某些实施方案中，放射性核素螯合或缀合(BFC)模块是马来酰胺-NODAGA或马来酰胺-DBCO，其可通过多肽C端附近的半胱氨酸残基与多肽共价附接。在某些实施方案中，通过添加半胱氨酸在其C端修饰抗PD-L1 Adnectin。例如，可将PxCy连接到氨基酸残基NYRT的C端，其中P是脯氨酸，C是半胱氨酸，并且x和y是至少为1的整数。在实施例中列出了在其C端具有氨基酸残基PC的示例性抗PD-L1 Adnectin。马来酰亚胺-NODAGA或马来酰亚胺-DBCO可与半胱氨酸起反应，以分别产生Adnectin-NODAGA或Adnectin-DBCO。

在某些实施方案中，放射性核素螯合剂是DFO，其可例如附接在随机的表面赖氨酸处。

在某些实施方案中，⁶⁴Cu的螯合剂是DOTA、NOTA、EDTA、Df、DTPA或TETA。Price等人在Chem Soc Rev 2014；43:260-90中广泛综述了螯合剂和放射性核素的适当组合。

在某些实施方案中，用PET示踪剂¹⁸F标记抗PD-L1 Adnectin。¹⁸F是一种有吸引力的PET放射性核素，其放射性半衰期1.8小时，提供了一种当日成像(same day imaging)工具，其中该PET放射性核素更好地与Adnectin的生物半衰期相匹配，从而在对患者的放射暴露较小的同时产生优异的图像。可用辅基标记PD-L1 Adnectin，如[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶([¹⁸F]-FFPEGA)，如实施例以及图2和图9中进一步描述的。如实施例中进一步所示，¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin特异性且有效地标记了小鼠中的人PD-L1阳性肿瘤和食蟹猴中的PD-L1阳性肿瘤。在下文和实施例中提供了关于标记方法的具体细节。

在某些实施方案中，PD-L1成像剂是用⁶⁴Cu标记的抗PD-L1 Adnectin，例如如实施例中所述。可用螯合剂比如NODAGA将⁶⁴Cu连接到Adnectin。如实施例中进一步所示，⁶⁴Cu标记的抗PD-L1 Adnectin特异性且有效地标记了小鼠中的人PD-L1阳性肿瘤和食蟹猴中的PD-L1阳性肿瘤。

为了合成在本文中以及在PCT申请PCT/US15/62485和PCT/US15/62502中所述的基于抗PD-L1 Adnectin的成像剂，也可以使用其他的本领域公认的用放射性核素比如⁶⁴Cu和¹⁸F标记多肽的方法。参见，例如US2014/0271467；Gill等人，Nature Protocols 2011；6:1718-25；Berndt等人，Nuclear Medicine and Biology 2007；34:5-15，Inkster等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 2013；23:3920-6，将这些文献的内容通过提述完整并入本文。

在某些实施方案中，PD-L1成像剂包含PEG分子(例如，5KDa PEG、6KDa PEG、7KDaPEG、8KDa PEG、9KDa PEG或10KDa PEG)，从而以小增量增加成像剂的血液PK而增强成像对比度或增加基于抗PD-L1 Adnectin的成像剂的亲合力。

施用和成像

在某些实施方案中，可以使用标记的抗PD-L1 Adnectin将PD-L1阳性细胞或组织(例如，表达PD-L1的肿瘤)成像。例如，将标记的抗PD-L1 Adnectin以足以使标记的Adnectin摄入感兴趣的组织(例如，表达PD-L1的肿瘤)的量施用于受试者。然后使用诸如PET的成像系统对受试者成像，成像的时间量适合于所使用的具体放射性核素。然后通过成像系统检测标记的抗PD-L1 Adnectin结合的表达PD-L1的细胞或组织，例如表达PD-L1的肿瘤。

用PD-L1成像剂的PET成像可用于定性或定量检测PD-L1。PD-L1成像剂可以用作生物标志物，受试者中PD-L1阳性信号的存在或不存在可以指示，例如：受试者将对给定的治疗(例如，癌症治疗)有反应，或者受试者对治疗正在作出反应或无反应。

在某些实施方案中，可以根据时间或治疗对疾病(例如，肿瘤)的进展或消退成像。例如，基于标记的抗PD-L1 Adnectin的检测，可以监测在经历癌症治疗(例如，化学疗法、放射疗法)的受试者中的肿瘤的大小，并且可以实时监测肿瘤消退的程度。也可以在治疗和/或疾病之前和/或期间将PD-L1在一个或多个肿瘤或健康细胞内的分布可视化并且进行监测。

导致成像剂(例如，¹⁸F-Adnectin成像剂、⁶⁴Cu-Adnectin成像剂)摄入感兴趣的细胞或组织(例如，肿瘤)的有效量可取决于各种因素，包括例如，宿主的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；所采用的特异性探针的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的特定组合物联合或同时使用的其他药物的存在；和其他因素。

在某些实施方案中，在对受试施用标记的抗PD-L1 Adnectin之前、期间和之后实现表达PD-L1的组织的成像。

在某些实施方案中，接受PD-L1成像剂的受试者是哺乳动物，例如人、狗、猫、猿、猴、大鼠或小鼠。

在某些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 Adnectin可用于肺、心脏、肾脏、肝脏和皮肤以及其他器官、或与表达PD-L1的这些器官相关的肿瘤的PET成像。

在某些实施方案中，抗PD-L1成像剂提供至少50％、75％、2、3、4、5或更高的对比度。实施例显示所使用的所有抗PD-L1 Adnectin均提供2或更高的PET对比度，并且Adnectin的亲和力并不重要。

当与短半衰期的放射性核素(例如，¹⁸F)一起用于成像(例如，PET)时，优选静脉内施用放射性标记的抗PD-L1 Adnectin，例如快速注射。其他的施用途径也是合适的，取决于所使用的放射性核素的半衰期。

在某些实施方案中，将本文所述的抗PD-L1成像剂用于检测受试者中的PD-L1阳性细胞，方式是对受试者施用本文中公开的抗PD-L1成像剂并检测所述成像剂，检测到的成像剂可界定PD-L1阳性细胞在受试者中的位置。在某些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术检测成像剂。

在某些实施方案中，通过对受试者施用本文中公开的抗PD-L1成像剂并检测所述成像剂，本文所述的抗PD-L1成像剂用于检测受试者中的表达PD-L1的肿瘤，检测到的成像剂限定了所述肿瘤在受试者中的位置。在某些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术检测成像剂。

在某些实施方案中，通过将成像剂施用于受试者并通过正电子发射断层摄影术将所述成像剂的分布进行体内成像而获得本文所述的抗PD-L1成像剂的图像。

本文中公开了获得表达PD-L1的组织或细胞的定量图像的方法，所述方法包括使细胞或组织与本文所述的抗PD-L1成像剂接触，并使用正电子发射断层摄影术检测或定量表达PD-L1的组织。

本文中还公开了检测表达PD-L1的肿瘤的方法，其包括对受试者(例如，患有或疑似患有表达PD-L1的肿瘤的受试者)施用成像有效量的本文所述的抗PD-L1成像剂，并使用正电子发射断层摄影术检测所述成像剂在肿瘤中的放射性发射，其中在肿瘤中检测到放射性发射。

本文中还公开了诊断受试者中表达PD-L1的肿瘤的存在的方法，所述方法包括：

(a)对有此需要的受试者施用本文所述的抗PD-L1成像剂；和

(b)获得所述受试者的至少一部分的放射性图像以检测所述成像剂的存在或缺乏；

其中高于背景的成像剂的存在和位置指示PD-L1或表达PD-L1的肿瘤的存在和位置。

本文中还提供了用于确定患有癌症的受试者是否可能对免疫疗法(例如，用PD-1或PD-L1拮抗剂)有反应的方法，该方法包括(a)对患有癌症的受试者施用例如本文所述的PD-L1成像剂；(b)在步骤(a)之后获得受试者的至少一部分的图像(静态或动态)，并且如果受试者在一个肿瘤或在几个肿瘤中具有的PD-L1水平等于或高于需要用PD-1或PD-L1拮抗剂(例如，OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM)治疗的水平，则用抗肿瘤治疗(例如PD-1或PD-L1拮抗剂，例如OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM)治疗所述受试者。

本文中还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其包括(a)对有此需要的受试者施用包含例如本文所述的PD-L1成像剂的成像剂，并且获得受试者的至少一部分的图像(静态或动态)，以确定PD-L1在一个多个肿瘤中的存在；并且如果受试者在一个肿瘤或在几个肿瘤中具有的PD-L1水平等于或高于需要用PD-1或PD-L1拮抗剂(例如，OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM)治疗的水平，那么，(b)对所述受试者施用抗肿瘤治疗，例如，抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的药剂(PD-1或PD-L1拮抗剂)，例如OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM。本文中还公开了监测针对受试者中的表达PD-L1的肿瘤的抗肿瘤治疗的进展的方法，所述方法包括：

(a)在第一时间点对有此需要的受试者施用本文所述的抗PD-L1成像剂并获得受试者的至少一部分的图像以确定肿瘤的大小；

(b)对受试者施用抗肿瘤治疗；

(c)在一个或多个随后的时间点对受试者施用所述成像剂，并且获得在每个时间点的受试者的至少一部分的图像；

其中在每个时间点的肿瘤的尺寸和位置指示疾病的进展。

PET成像

通常，为了PET成像的目的，期望以单次静脉内输注给接受者提供在约0.1mg至200mg范围内的Adnectin剂量，但视情况需要也可施用更低或更高的剂量。对于典型的成年人来说，期望给接受者提供在每平方米体表面积约0.1mg至10mg蛋白质或肽的范围内的剂量，但视情况需要也可施用更低或更高的剂量。为成像的目的，可以对人受试者施用的蛋白质或肽的剂量的实例是10μg至1000μg、100μg至1000μg、100μg至500μg、200μg至500μg和300μg至400μg，但也可以施用更低或更高的剂量。例如，可以将¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin，例如[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA成像剂以10μg至1000μg、100μg至1000μg、100μg至500μg、200μg至500μg和300μg至400μg范围的量施用于人体，例如以快速注射的方式。在某些实施方案中，将¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin，例如[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA成像剂以约350μg的量施用于人受试者，对于80kg的受试者这相当于约4.4μg/kg。

在某些实施方案中，以每日0.005μg/kg体重至50μg/kg体重之间，例如每日0.02μg/kg体重至10μg/kg之间，例如每日0.1μg/kg体重至10μg/kg体重之间，例如每日1μg/kg体重至10μg/kg体重之间，例如每日2μg/kg体重至6μg/kg体重之间，例如每日4μg/kg体重至5μg/kg体重之间的量施用放射性标记的Adnectin(例如抗PD-L1 Adnectin)。与PET示踪剂相关联的质量为天然同位素(例如用于¹⁸F PET示踪剂的¹⁹F)形式。在某些实施方案中，将¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin(例如[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA成像剂)以每日0.1μg/kg体重至10μg/kg体重之间，例如每日1μg/kg体重至10μg/kg体重之间，例如每日2μg/kg体重至6μg/kg体重之间，例如每日4μg/kg体重至5μg/kg体重之间的量施用于人受试者。

调整剂量方案以提供用于获得摄取放射性标记的Adnectin的组织或细胞的清晰图像的最佳可检测量。配制剂量单位形式的肠胃外组合物是特别有利的，以便易于施用并且剂量一致。如本文中使用的，剂量单位形式是指适合用作将被施用放射性标记的Adnectin的受试者的单位剂量的物理离散单位。本文所述的剂量单位形式的规格决定于并且直接取决于：(a)放射性标记的Adnectin的靶向部分的独特特征：(b)待靶向的组织或细胞；(c)所使用的成像技术的固有限制。

对于放射性标记的Adnectin的施用，使用的剂量将取决于疾病类型、所使用的靶向化合物、受试者的年龄、身体状况和性别、疾病程度、待检查部位等。具体而言，必须充分注意对受试者的暴露剂量。可以对患者施用饱和剂量的放射性标记物(例如¹⁸F或⁶⁴Cu)。例如，¹⁸F标记的Adnectin的放射量范围可以是从3.7兆贝克勒尔(MBq)到3.7千兆贝克勒尔(MBq)、从18MBq到740MBq、从100MBq到500MBq、从100MBq到400MBq、从100MBq到333MBq、从100MBq到250MBq、从150MBq到250MBq、从200MBq到250MBq或从200MBq到225MBq。或者，剂量可通过例如毫居里加以量度。在一些实施方案中，用于成像研究的¹⁸F成像剂的施用量为1至10mCi、3至10mCi、3至8mCi、4至7mCi或5至6mCi。在一些实施方案中，有效量是足以产生1至10mCi、3至10mCi、3至8mCi、4至7mCi或5至6mCi范围内的发射的化合物的量。在某些实施方案中，将¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin，例如[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA成像剂以1至10mCi、3至10mCi、3至8mCi、4至7mCi或5至6mCi的量施用于人受试者。

在某些实施方案中，将¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin，例如[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA成像剂以组合物形式施用，所述组合物包含1％-5％的¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin(例如[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA)以及对应地95％-99％的非放射性标记的Adnectin前体(例如PD-L1Adnectin-4PEG-DBCO)。在某些实施方案中，该比率是2％的¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin，例如[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA，以及98％的非放射性标记的Adnectin前体，例如PD-L1 Adnectin-4PEG-DBCO。该比率可以改变，条件是优选地施用于受试者的蛋白质的总量保持为微剂量，即≤30nM。

本文所述的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以获得针对特定患者、组合物和施用方式有效地实现期望的放射性标记的Adnectin在细胞或组织中的摄取而对患者没有毒性的活性成分量。然而，应当理解，本公开的放射性标记的Adnectin的每日总用量将由主治医师或其他主治专业人员在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的具体有效剂量水平将取决于多种因素，包括例如采用的特定组合物的活性；采用的具体组合物；宿主的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间；施用路径；采用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料；被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前医学史以及医学领域中公知的类似因素。在某些实施方案中，对需要成像的人受试者施用的放射性标记的Adnectin的量将由处方医师确定，剂量通常随放射性核素的发射量变化。

在某些实施方案中，将本文所述的放射性标记的Adnectin配制为确保体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)可排除许多高亲水性化合物。通过例如在脂质体中配制药剂而使它们可以穿过BBB。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性地运输到特定细胞或器官中的由此增强靶向药物递送的模块(例如，参见V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向模块包括叶酸或生物素(例如，参见授予Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)。

示例性PET程序

当对临床患者进行PET成像研究时，可使用以下说明性程序。将静脉导管例如20G两英寸静脉导管插入到对侧尺静脉中用于放射性示踪剂施用。PET示踪剂的施用时间通常与血液中抗PD-L1 Adnectin浓度的最大值(T max)或最小值(T min)的时间一致。

将患者定位在PET相机中，并且通过静脉内导管施用示踪剂量的PET示踪剂，即放射性标记的抗PD-L1 Adnectin，如[18F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA(<20mCi)。在施用PET示踪剂之前，受试者可以饮用一升水以促进循环中未结合的示踪剂从肾脏清除以增强信号背景比和/或排空其膀胱。可以在整个PET扫描中以15个适当的时间间隔采集动脉或静脉血液样品，以便例如分析和定量血浆中未代谢的PET示踪剂的分数。可以采集图像长达120分钟。在注射放射性示踪剂的10分钟之内，以及在成像期结束时，可以获得1ml血样品，用于例如确定任何标记或未标记的抗PD-L1 Adnectin的血浆浓度。

可以使用两种类型的PET程序。一种类型涉及获得示踪剂摄取的单时间点估计值(single time point estimates)或提供区域性示踪剂浓度的空间图的静态成像。对于静态成像，仅测量平均值(例如，标准摄取值，SUV)。第二种类型被称为动态示踪剂成像，可以通过描绘示踪剂摄取的时间和空间模式提供相当多的关于体内生物学的信息。参见，例如Muzi等人，Magn Reson Imaging.2012 30(9):1203–1215。PD-L1 Adnectin成像剂，例如[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA和[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA，可用于静态示踪剂成像或动态示踪剂成像。

为了定量示踪剂摄取，临床医师可以在PET或CT扫描结果上目视识别肿瘤病变并确定这些病变周围的感兴趣区域(ROI)。可以针对体重和注射剂量校正这些ROI中的[¹⁸F]PD-L1摄取，并将其定量为标准摄取值(SUV_最大和SUV_平均)。

通过图像重建获得断层摄影图像。为了确定放射性示踪剂的分布，可以在重建图像上绘制感兴趣区域(ROI)，包括但不限于肺、肝、心、肾、皮肤或其他器官和组织(例如癌组织)。利用这些区域中随时间推移的放射性示踪剂摄取情况来产生在没有任何干预下、或在未标记的抗PD-L1 Adnectin(按照所考察的不同给药范式给予)存在下获得的时间活性曲线(TAC)。数据表示为每单位体积每单位时间的放射性(μci/cc/mCi注射剂量)。

为解剖学参考目的，PET可伴随低剂量或诊断性CT扫描。

IX使用¹⁸F标记的抗PD-L1 adnectin的示例性PET程序

通过用氟化物-18(¹⁸F)标记PD-L1结合剂，可以使用连续[¹⁸F]PD-L1-PET扫描来评估全身分布、药代动力学(PK)和药效学(PD)，并将结果与治疗效果相关联。这可能有助于患者选择，并且将来可能用作对PD1/PD-L1检查点抑制剂反应的(早期)生物标志。

具有¹⁸F标记的成像剂的示例性PET程序如下，具有¹⁸F标记的成像剂例如¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin成像剂(例如，[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPE GA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA)。

在一个实施方案中，该方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对受试者例如人施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描。PET扫描可以是静态PET扫描或动态PET扫描。如果PET扫描是静态PET扫描，则可以在施用PD-L1成像剂之后30-120、30-60或60-120分钟进行PET扫描；如果PET扫描是动态PET扫描，则可以在施用PD-L1成像剂之后1-120、30-120、30-60或60-120分钟例如注射后1、35、70和105分钟进行PET扫描。一次动态PET扫描的总持续时间可为30到120分钟，如30到60分钟，例如30分钟或60分钟，帧长度可变。扫描可以是全身扫描或部分身体扫描，例如单个肿瘤的扫描。例如，动态PET扫描可以是单个肿瘤的扫描，静态PET扫描可以是全身扫描。在某些实施方案中，施用的剂量为约200-225Mbq(即，±10％)或约6mCi(即，±10％)。

在某些实施方案中，受试者是患有癌症的受试者，该方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，其中步骤(a)和(b)在开始癌症治疗之前实施。在某些实施方案中，受试者是患有癌症的受试者，该方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，其中步骤(a)和(b)在至少2个时间点进行，例如，其中一个在开始癌症治疗之前，一个在癌症治疗期间，或者两个时间点都在癌症治疗期间。两个时间点可以相隔例如1-10周(如2-8周，如5-7周，如6周)的时间。在某些实施方案中，步骤(a)和(b)在至少3个、4个、5个或更多个时间点进行，其中连续的时间点相隔例如1-10周(如2-8周，如5-7周，如6周)的时间。

在某些实施方案中，受试者是患有癌症的受试者，且受试者正在接受免疫疗法(例如，PD-1拮抗剂和/或PD-L1拮抗剂)治疗，该方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，其中步骤(a)和(b)在至少个2个、3个、4个或5个时间点进行，例如，其中一个在开始免疫疗法治疗之前，一个在免疫疗法治疗期间，或者两个时间点都在免疫疗法治疗期间。

在某些实施方案中，受试者是患有癌症的受试者，并且受试者正在接受免疫疗法(例如，PD-1拮抗剂和/或PD-L1拮抗剂)治疗，该方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；和(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，其中步骤(a)和(b)在至少个1个、2个、3个、4个或5个时间点进行，例如，其中一个在开始免疫疗法治疗之前，且如果步骤(a)和(b)重复多于一次，则其中一个在免疫疗法治疗期间；或者所有时间点都在免疫疗法治疗期间，并且其中PET扫描的结果为受试者的进一步治疗提供信息。例如，PET扫描的结果可指示受试者的肿瘤尺寸在治疗期间没有减小，这表明治疗可能不成功，应该改变或停止。

或者，在治疗前的第一次扫描可指示受试者在大多数肿瘤中不表达PD-L1，并且用PD-1拮抗剂和/或PD-L1拮抗剂治疗不会成功。因此，本文中提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其包括

(a)对有此需要的受试者施用包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂，并获得受试者的至少一部分的图像(静态或动态)以确定一个或多个肿瘤中PD-L1的存在；并且，如果在一个或多个肿瘤中检测到PD-L1，那么，

(b)对受试者施用抗肿瘤治疗，例如抑制PD-1和PD-L1之间相互作用的药剂(PD-1或PD-L1拮抗剂)，例如OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM。

还提供了预测患有癌症的受试者是否可能对用PD-1或PD-L1拮抗剂治疗有反应的方法，其包括(a)对有此需要的受试者施用包含抗PD-L1 Adnectin的成像剂，并获得受试者的至少一部分的图像(静态或动态)，以确定一个或多个肿瘤中PD-L1的存在；并且，如果在一个或多个肿瘤中检测到PD-L1，那么，受试者可能对用PD-1或PD-L1拮抗剂治疗有反应。

所述方法可以包括当肿瘤标本中至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞是PD-L1阳性时或平均在几个肿瘤中时施用抗肿瘤治疗。在某些实施方案中，除非受试者的肿瘤标本中至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞是PD-L1阳性或者在几种肿瘤的平均线上，否则不给受试者施用抗肿瘤治疗，例如PD-1或PD-L1拮抗剂。在某些实施方案中，如果在一个或多个肿瘤中检测到的PD-L1水平至少等于接受用PD-1或PD-L1拮抗剂治疗剂治疗所必需的PD-L1水平，则施用抗肿瘤治疗。

其中使用步骤(a)和(b)的多于一次重复的方法可以包括：将在第一时间点进行的PET扫描与在第二时间点和/或更晚的时间点进行的PET扫描进行比较。这种比较可以提供患者的疾病演变、患者对治疗的反应、患者的潜在不良反应或其他的信息。

在某些实施方案中，受试者是患有癌症的受试者并且受试者正在接受免疫疗法(例如，PD-1拮抗剂和/或PD-L1拮抗剂)治疗，并且该方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；和(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，其中步骤(a)和(b)在至少个1个、2个、3个、4个或5个时间点进行，例如，其中一个在开始免疫疗法治疗之前，如果有多于一次的步骤(a)和(b)的重复，则其中一个在免疫疗法治疗期间，或者其中所有时间点都在免疫疗法治疗期间，其中所述¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂包含以下项之一：

A02 Adnectin的修饰的环BC、DE和FG(即SEQ ID NO:81、82和83)；或者，其中这些环中的一个相对于A02 Adnectin中的相应环有一个氨基酸缺失、添加或取代的不同；其中这些环中的两个各自相对于A02 Adnectin中的相应环因有一个氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守氨基酸取代)而不同；或者，其中这些环中的三个各自相对于A02 Adnectin中的相应环有一个氨基酸缺失、添加或取代的不同，并且其中Adnectin与人PD-L1特异性地结合，如通过Biacore确定的；

E01 Adnectin的修饰的环BC、DE和FG(即SEQ ID NO:97、98和99)；或者，其中这些环中的一个相对于E01 Adnectin中的相应环有一个氨基酸缺失、添加或取代的不同；其中这些环中的两个各自相对于E01 Adnectin中的相应环有一个氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守氨基酸取代)的不同；或者，其中这些环的三个各自相对于E01 Adnectin中的相应环有一个氨基酸缺失、添加或取代的不同，并且其中Adnectin与人PD-L1特异性地结合，如通过Biacore确定的；

与A02 Adnectin(例如，SEQ ID NO:80和84-91中的任一个)或E01 Adnectin(例如，SEQID NO:96、100-107中的任一个)的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中取代可以是保守取代，并且其中Adnectin与人PD-L1特异性地结合，如通过Biacore确定的；和/或

因有1-10个氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守取代)而不同于A02 Adnectin(包含例如SEQ ID NO:80和84-91中的任一个)或E01 Adnectin(包含例如SEQ ID NO:96、100-107中的任一个)的氨基酸序列的氨基酸序列，其中取代可以是保守取代，并且其中Adnectin与人PD-L1特异性地结合，如通过Biacore确定的。

在某些实施方案中，受试者是患有癌症的受试者，并且受试者正在接受免疫疗法(例如，PD-1拮抗剂和/或PD-L1拮抗剂)治疗，并且该方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；和(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，其中步骤(a)和(b)在至少个1个、2个、3个、4个或5个时间点进行，例如，其中一个在免疫疗法治疗开始之前，如果有多于一次的步骤(a)和(b)的重复，则其中一个在免疫疗法治疗期间，或者其中所有时间点都在免疫疗法治疗期间，其中¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂是[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA，其中A02 Adnectin包含SEQ ID NO:80和84-91中的任一个，或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA，其中E01 Adnectin包含SEQ ID NO:96和100-107中的任一个，并且4PEG-DBCO-FPPEGA的结构是图2或图9中提供的结构。施用于受试者的组合物可以是这样的组合物，其中2％的分子是[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA，且相应地98％的分子是A02-4PEG-DBCO或E01-4PEG-DBCO，并且其中，优选的是，在一次示踪剂施用中将等于或少于30nM的总蛋白施用于受试者。

本文中还提供了用于确定患有癌症的受试者是否可能对免疫疗法(例如，用PD-1或PD-L1拮抗剂)有反应的方法，该方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对患有癌症的受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，并且如果受试者在一个肿瘤或在几个肿瘤中具有的PD-L1水平等于或高于需要用PD-1或PD-L1拮抗剂(例如，OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM)治疗的水平，则所述受试者可能对抗肿瘤治疗(例如PD-1或PD-L1拮抗剂，例如OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM)治疗有反应，其中所述¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂包含以下项之一：

A02 Adnectin的修饰的环BC、DE和FG(即SEQ ID NO:81、82和83)；或者，其中这些环中的一个相对于A02 Adnectin中的相应环因有一个氨基酸缺失、添加或取代而不同；其中这些环中的两个各自相对于A02 Adnectin中的相应环因有一个氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守氨基酸取代)而不同；或者，其中这些环中的三个各自相对于A02 Adnectin中的相应环因有一个氨基酸缺失、添加或取代而不同，并且其中Adnectin与人PD-L1特异性地结合，如通过Biacore确定的；

E01 Adnectin的修饰的环BC、DE和FG(即SEQ ID NO:97、98和99)；或者，其中这些环中的一个相对于E01 Adnectin中的相应环因有一个氨基酸缺失、添加或取代而不同；其中这些环中的两个各自相对于E01 Adnectin中的相应环因有一个氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守氨基酸取代)而不同；或者，其中这些环中的三个各自相对于E01 Adnectin中的相应环因有一个氨基酸缺失、添加或取代而不同，并且其中Adnectin与人PD-L1特异性地结合，如通过Biacore确定的；

本文中提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括(a)以约3-10 mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，并且如果受试者在一个肿瘤或在几个肿瘤中具有的PD-L1水平等于或高于需要用PD-1或PD-L1拮抗剂(例如，OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM)治疗的水平，则对所述受试者施用抗肿瘤治疗，例如PD-1或PD-L1拮抗剂，例如OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM，其中所述¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂包含以下项之一：

本文中提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括(a)以约3-10 mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂，例如¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂；(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，并且如果受试者在一个肿瘤或在几个肿瘤中具有的PD-L1水平等于或高于需要用PD-1或PD-L1拮抗剂(例如，OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM)治疗的水平，则对所述受试者施用抗肿瘤治疗，例如PD-1或PD-L1拮抗剂，对所述受试者施用例如OPDIVO^TM、KEYTRUDA^TM或TECENTRIQ^TM，所述¹⁸F标记的PD-L1 Adnectin成像剂是[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA，其中A02 Adnectin包含SEQ ID NO:80和84-91中的任一个，或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA，其中E01Adnectin包含SEQ ID NO:96和100-107中的任一个，并且4PEG-DBCO-FPPEGA的结构是图2或图9中提供的结构。施用于受试者的组合物可以是这样的组合物，其中2％的分子是[¹⁸F]-A02-4PEG-DBCO-FPPEGA或[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA，并且对应地98％的分子是A02-4PEG-DBCO或E01-4PEG-DBCO，并且其中，优选地在一次示踪剂施用中将等于或少于30nM的总蛋白施用于受试者。

X.用抗PD-L1 Adnectin检测PD-L1

抗PD-L1 Adnectin，如本文所述的那些，除了体内检测PD-L1之外，还可以用来检测样品中的靶分子。一种方法可包括使样品与本文所述的抗PD-L1 Adnectin接触，其中所述接触是在允许抗PD-L1 Adnectin-靶标复合物形成的条件下进行的；并检测所述复合物，由此检测所述样品中的靶标。可使用任何本领域公认的技术进行检测，例如放射线照相术、免疫测定法、荧光检测、质谱法、或表面等离子体共振。样品可来自人或其他哺乳动物。为诊断目的，适当的试剂是包括用于全身成像的放射性同位素的可检测标记物，以及用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记物和其他适合的抗体标签。

可检测标记物可以是当前在体外诊断学领域中使用的任何不同类型，包括颗粒标记物，包括金属溶胶，如胶体金；同位素，如I¹²⁵或Tc⁹⁹，例如与N₂S₂、N₃S或N₄类型的肽螯合剂一起提供；发色团，包括荧光标志物、生物素、发光标志物、磷光标志物等，还有将给定底物转化为可检测标志物的酶标记物，以及在扩增(如通过聚合酶链反应)后显示的多核苷酸标签。然后可通过亲和素或链霉亲和素结合检测生物素化抗体。适合的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等等。例如，标记物可以是酶(碱性磷酸酶)，其可通过测定在转化下列物质之后化学发光的存在或形成而加以检测：1,2二氧杂环丁烷底物，如金刚烷基甲氧基磷氧酰苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.1 3,7}癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)，还有CDP和或本领域技术人员熟知的其他发光底物，例如适合的镧系元素比如铽(III)和铕(III)的螯合物。其他标记物包括在上述成像部分中列出的标记物。检测手段由选定的标记物决定。标记物或其反应产物的观察可利用肉眼(在标记物为颗粒且以适当水平累积的情况下)或使用仪器，如分光光度计、发光计、荧光计等等，来实现，一切都遵循标准实践。

在某些实施方案中，缀合方法产生实质上(或几乎)为非免疫原性的连接，例如肽-(即酰胺-)、硫化物-(位阻)、二硫化物-、腙-及醚连接。这些连接几乎是非免疫原性的，并且在血清内显示合理的稳定性(例如，参见Senter,P.D.,Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；WO 2009/059278；WO 95/17886)。

可采用不同的缀合策略，视模块和Adnectin的生物化学性质而定。在所述模块是具有50至500个氨基酸的天然存在或重组多肽的情况下，在描述蛋白缀合物的合成化学的教科书中有标准程序，本领域技术人员易于遵循这些标准程序(例如参见Hackenberger,C.P.R.和Schwarzer,D.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一个实施方案中，利用马来酰亚胺基模块与Adnectin或模块内的半胱氨酸残基反应。或者，进行与Adnectin的C端的偶联。可进行蛋白质的C端修饰，如例如在Sunbul,M.和Yin,J.,Org.Biomol.Chem.7(2009)3361-3371)中所述。当模块是肽或多肽时，可通过标准遗传融合(任选地用本文中公开的接头)将Adnectin和模块融合。

通常，位点特异性反应和共价偶联的基础是将天然氨基酸转化成具有反应性的氨基酸，且该反应性与其他存在的官能团的反应性是正交的。例如，在稀有的序列背景中的特定半胱氨酸可酶促转化为醛(参见Frese,M.A.和Dierks,T.,ChemBioChem.10(2009)425-427)。还可能通过利用某些酶与给定序列背景中的天然氨基酸的特异性酶的反应性来获得期望的氨基酸修饰(例如参见Taki,M.等人，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier,A.等人，Chem.Biol.15(2008)128-136。蛋白酶催化的C--N键形成描述于Bordusa,F.,Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403。

还可通过末端氨基酸与适当修饰试剂的选择性反应来实现位点特异性反应和共价偶联。可利用N端半胱氨酸与苯腈(benzonitril)的反应性(参见Ren,H.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)来实现位点特异性共价偶联。天然化学连接也可依赖于C端半胱氨酸残基(Taylor,E.Vogel；Imperiali,B,Nucleic Acids andMolecular Biology(2009),22(Protein Engineering),65-96)。EP 1 074 563描述了一种缀合方法，这种方法是基于一段带负电荷的氨基酸内的半胱氨酸反应比位于一段带正电荷的氨基酸中的半胱氨酸的反应快。

所述模块也可以是合成肽或肽模拟物。在化学合成多肽的情况下，在这样的合成期间可掺入具有正交化学反应性的氨基酸(例如，参见de Graaf,A.J.等人，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。由于有许多正交官能团可用且可被引入合成肽中，这样的肽与接头的缀合是标准化学作用。

为了获得单标记的多肽，可通过色谱法以1:1化学计量将缀合物与其他缀合副产物分离。通过使用染料标记的结合对成员和带电荷的接头可以促进这个程序。通过使用这种标记且高度带负电荷的结合对成员，容易将单缀合的多肽与未标记的多肽和携带多于一个接头的多肽分离，因为可以利用电荷和分子量的差异进行分离。可使用荧光染料从未结合组分(如标记的单价结合物)纯化复合物。

XI.合成¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin

通过首先制备¹⁸F放射性标记的辅基，将Adnectin与双功能螯合剂连接，然后将这两种试剂合并，可以合成¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin(参见例如图9)。

¹⁸F放射性标记的辅基

在一个方面，本文中提供了¹⁸F放射性标记的化合物，其包含用于生物正交反应的辅基，所述生物正交反应涉及在耐水条件下选择性进行的叠氮化物和环辛炔之间的1,3-偶极环加成。本文中公开的¹⁸F放射性标记的辅基可溶于100％水溶液中，并且不需要有机相来将辅基与本文中公开的抗PD-L1 Adnectin连接。这个特征是特别有利的，因为不需要将辅基与抗PD-L1 Adnectin连接的有机相，而PD-L1 Adnectin由于降解和聚集问题无法耐受即使少量的有机溶剂。

另外，与脂肪族辅基不同，¹⁸F氟化反应可用UV监测，并且本文所述的¹⁸F放射性标记的辅基不是挥发性的。而且，可使用无铜点击化学(例如，如实施例中所述)将¹⁸F放射性标记的辅基掺入抗PD-L1 Adnectin中，因此可避免在一些生物制剂中观察到的使用铜介导点击化学时的稳定性问题。

在一个方面，本文中提供了与具有以下结构的叠氮化物共价结合的聚乙二醇化¹⁸F-吡啶，

其中x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是2至6的整数。在一些实施方案中，x是3至5的整数。在某些实施方案中，x是4。在某些实施方案中，将¹⁸F在N原子的邻位附接至吡啶。在某些实施方案中，相对于吡啶环上的氮，[O(CH₂)₂]_x模块以1-3构型存在。在某些实施方案中，相对于吡啶环上的氮，[O(CH₂)₂]_x模块以1-2构型存在。在某些实施方案中，相对于吡啶环上的氮，[O(CH₂)₂]_x模块以1-4构型存在。

在某些实施方案中，¹⁸F放射性标记的化合物具有以下结构：

其中x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是2至6的整数。在一些实施方案中，x是3至5的整数。在某些实施方案中，x是4。

其中x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是2至6的整数。在某些实施方案中，x是3至5的整数。在某些实施方案中，x是4。

在某些实施方案中，¹⁸F放射性标记的化合物是[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶(¹⁸F-FPPEGA)并且具有以下结构：

在某些实施方案中，¹⁸F放射性标记的辅基的吡啶环上可含有不干扰氟化反应的另外的基团。在某些实施方案中，吡啶环上的增加包括C_1-6烷基基团，例如甲基、乙基和丙基。

在某些实施方案中，¹⁸F放射性标记的辅基是具有以下结构的稠环系统：

其中"OPEG"是[O(CH₂)₂]_x，并且x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是2至6的整数。在某些实施方案中，x是3至5的整数。在某些实施方案中，x是4。

可使用本文实施例中所述的化学反应产生本文所述的¹⁸F放射性标记的辅基。

本文中还提供了制备与具有以下结构的叠氮化物共价结合的聚乙二醇化¹⁸F-吡啶的方法，

其中x是1至8的整数，所述方法包括以下步骤：

(a)提供具有以下结构的化合物a的溶液：

a

其中x是1至8的整数，并且R是NO₂、Br、F或并且在吡啶环的N原子的邻位；

(b)提供下述者的混合物：¹⁸O水中的¹⁸F、4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷、和弱碱；

c)干燥来自步骤b)的混合物以形成固体；并且

d)使来自步骤a)的溶液与来自步骤c)的固体反应以形成¹⁸F标记的化合物。

在某些实施方案中，所述方法产生具有以下结构b的¹⁸F-吡啶辅基：

(其中¹⁸F在N原子的邻位)，并且包括以下步骤：

a)提供具有以下结构的化合物的溶液

(其中X在N原子的邻位)，其中X是NO₂、Br或

b)提供下述者的混合物：¹⁸O水中的¹⁸F、4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷、弱碱(如K₂CO₃)；

c)干燥来自步骤b)的混合物以形成固体；并且

在某些实施方案中，所述方法进一步包括依照下文所示的方案I产生具有以下结构a的化合物的步骤：

在某些实施方案中，所述方法包括依照以下反应条件从d产生¹⁸F-吡啶辅基[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶(¹⁸F-FPPEGA),e：

1¹⁸F放射性标记的PD-L1 Adnectin

在一些方面，本文中提供了¹⁸F放射性标记的具有以下结构的探针或药剂，

其中蛋白质是PD-L1 Adnectin，并且x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是2至6的整数。在某些实施方案中，x是3至5的整数。在一些实施方案中，x是4。

BFC

可在本文中公开的¹⁸F-放射性标记的组合物中使用的双功能螯合或缀合(BFC)模块是可商购的(例如Sigma Aldrich；Click Chemistry Tools)，或者可以依照公知的化学反应进行合成。

在某些实施方案中，所述BFC选自基于环辛炔的螯合剂(例如DBCO、DIBO)、DFO、DOTA及其衍生物(CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、Oxo-DO3A)、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar和衍生物、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN-TM、DTPA、1B4M-DTPA、CHX-A”-DTPA、TRAP(PRP9)、NOPO、AAZTA和衍生物(DATA)、H₂dedpa、H₄octapa、H₂azapa、H₅decapa、H₆phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA和基于TRITA的螯合剂、以及其接近的类似物和衍生物。Price等人在Chem Soc Rev 2014；43:260-90中广泛描述了螯合剂和放射性核素的适当组合。

在某些实施方案中，BFC是包含反应性基团的环辛炔，所述反应性基团与靶向蛋白或肽上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键。在环辛炔上的反应性基团包括酯、酸、羟基、氨氧基、马来酰亚胺、α-卤代酮和α-卤代乙酰胺。

在某些实施方案中，BFC是环辛炔，是二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)和二苯并环辛炔(DBCO)。在某些实施方案中，环辛炔是DBCO。

在某些实施方案中，环辛炔包含亲水性聚乙二醇(PEG)_y间隔臂，其中y是1至8的整数。在某些实施方案中，y是2至6的整数。在某些实施方案中，y是4或5。

在某些实施方案中，BFC是与伯胺(例如，赖氨酸残基的侧链或氨基硅烷涂覆的表面)特异性地且有效地反应的DBCO-PEG4-NHS-酯或DBCO-磺基-NHS-酯。在某些实施方案中，BFC是具有末端羧酸(-COOH)的DBCO-PEG4-酸，所述末端羧酸在形成稳定酰胺键的活化剂(例如EDC)存在的情况下可与伯胺基或仲胺基团反应。在某些实施方案中，BFC是DBCO-PEG4-胺，其在活化剂(例如EDC或DCC)存在下与羧基反应或与形成稳定酰胺键的活化酯(例如NHS酯)反应。

在某些实施方案中，BFC是DBCO-PEG4-马来酰亚胺，其与半胱氨酸残基上的巯基(例如在多肽的C端或附近的)反应。

在某些实施方案中，通过在其C端添加半胱氨酸来修饰多肽。例如，可将P_mC_n与多肽的C端氨基酸残基连接，其中P是脯氨酸，C是半胱氨酸，m是至少为0的整数，并且n是至少为1的整数。用于进行这样的修饰的方法是本领域熟知的。

在某些实施方案中，¹⁸F放射性标记的探针或药剂具有以下结构a，

其中所述BFC在半胱氨酸残基处与所述蛋白质(例如，抗-PD-L1 Adnectin)缀合。

根据本文所述的程序，使用在适合于体内直接使用的介质(例如盐水)中的生物正交、无金属的点击化学产生本文所述的¹⁸F放射性标记的靶向剂。

XIII.试剂盒和制品

可以将本文所述的抗PD-L1 Adnectin提供在试剂盒中，所述试剂盒为预定量的试剂与在本文所述方法中使用的说明书的包装组合。

例如，在某些实施方案中，提供了含有用于治疗或预防本文所述的疾患或病症或用于本文所述的检测方法的材料的制品。所述制品包括容器和标签。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。所述容器可以容纳用于体内成像的本文所述的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的活性剂是例如如本文所述的抗PD-L1 Adnectin或其衍生物或前体。所述制品可以进一步包括第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，比如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括立足于商业和用户立场所需的其他物品，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装说明书。

在某些实施方案中，试剂盒包含形成¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectinin体内成像剂必需的一种或多种试剂，如[¹⁸F]-PD-L1 Adnectin-4-PEG-DBCO-FPPEGA，如本文中进一步描述的。例如，试剂盒可包括第一小瓶和第二小瓶：第一小瓶包含PD-L1 Adnectin-4-PEG-DBCO，第二小瓶包含[¹⁸F]FPPEGA。试剂盒可包括第一小瓶、第二小瓶和任选的第三小瓶，第一小瓶包含PD-L1 Adnectin-4-PEG-DBCO，第二小瓶包含[¹⁸F]FPPEGA的非放射性标记前体例如4-PEG-甲苯磺酰基-叠氮化物，第三小瓶包含¹⁸F(例如在O¹⁸水中)。试剂盒可进一步包括制造[¹⁸F]-PD-L1 Adnectin-4-PEG-DBCO-FPPEGA所必需的小瓶、溶液和任选的其他试剂。试剂盒可以包含按照实施例中描述的方法完成[¹⁸F]-PD-L1 Adnectin-4-PEG-DBCO-FPPEGA的合成的说明书。

类似地，试剂盒可包含用于形成⁶⁴Cu标记的抗PD-L1 Adnectin必需的试剂，如本文所述的试剂。

XIV.示例性实施方案

1.一种包含纤连蛋白III型第十结构域(¹⁰Fn3)的多肽，其中(a)该¹⁰Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，(b)该¹⁰Fn3的选自BC、DE和FG环的至少一个环具有相对于人¹⁰Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环序列的改变的氨基酸序列，并且(c)所述多肽与PD-L1特异性地结合。

2.实施方案1的多肽，其中所述多肽以500mM或更小的K_D与PD-L1结合。

3.实施方案2的多肽，其中所述多肽以100mM或更小的K_D与PD-L1结合。

4.实施方案1-3中任一项的多肽，其中所述BC、DE和FG环包含以下氨基酸序列：

(a)分别为SEQ ID NO:6、7和8；

(b)分别为SEQ ID NO:21、22和23；

(c)分别为SEQ ID NO:36、37和38；

(d)分别为SEQ ID NO:51、52和53；

(e)分别为SEQ ID NO:66、67和68；

(f)分别为SEQ ID NO:81、82和83；或

(g)分别为SEQ ID NO:97、98和99。

5.实施方案1-4中任一项的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80或96至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

6.实施方案5的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:80至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

7.实施方案5的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:96至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

8.实施方案1-7中任一项的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80或96的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

9.实施方案1-7中任一项的多肽，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91和100-107。

10.实施方案1-7和9中任一项的多肽，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91和100-107。

11.实施方案1-10中任一项的多肽，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:112-121的N末端前导序列、和/或选自SEQ ID NO:122-156的C末端尾。

12.实施方案1-11中任一项的多肽，其中所述多肽包含一个或多个选自下组的药代动力学(PK)模块：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白。

13.实施方案12的多肽，其中所述PK模块和所述多肽经由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合糖或聚乙二醇模块连接。

14.实施方案13的多肽，其中所述PK模块和所述多肽经由具有选自SEQ ID NO:167-216的氨基酸序列的接头连接。

15.编码实施方案1-14中任一项的多肽的核酸。

16.实施方案15的核酸，其中所述核酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111。

17.包含实施方案15的核酸的载体。

18.包含实施方案15的核酸的细胞。

19.一种组合物，其包含实施方案1-14中任一项的多肽和载体。

20.一种成像剂，包含实施方案1-14中任一项的多肽和可检测标记物。

21.实施方案20的成像剂，其中所述可检测标记物可通过正电子发射断层摄影术检测。

22.实施方案20或21的成像剂，其中所述多肽通过选自下组的模块与所述可检测标记物缀合：DFO、DOTA、CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、DBCO、DIBO、BARAC、DIMAC、Oxo-DO3A、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN-TM、DTPA、1B4M-DTPA、CHX-A”-DTPA、TRAP、NOPO、AAZTA、DATA、H₂dedpa、H₄octapa、H₂azapa、H₅decapa、H₆phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA和TRITA。

23.实施方案22的成像剂，其中所述缀合模块是NODAGA。

24.实施方案20-23中任一项的成像剂，其中所述可检测标记物是放射性核素。

25.实施方案24的成像剂，其中所述放射性核素选自下组：⁶⁴Cu、¹²⁴I、^76/77Br、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁶⁸Ga、¹⁸F、¹¹C、¹²⁵I、¹²⁴I、¹³¹I、¹²³I、¹³¹I、¹²³I、³²Cl、³³Cl、³⁴Cl、⁶⁸Ga、⁷⁴Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁷⁸Br、⁸⁹Zr、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁹⁹Tc或¹⁵³Sm。

26.实施方案25的成像剂，其中所述放射性核素是¹⁸F。

27.实施方案25的成像剂，其中所述放射性核素是⁶⁴Cu。

28.实施方案24的成像剂，其中所述螯合剂是NODAGA，并且所述放射性核素是⁶⁴Cu。

29.实施方案24的成像剂，其中所述成像剂包含实施方案6的多肽、所述NODAGA和所述放射性核素⁶⁴Cu。

30.实施方案24的成像剂，其中所述成像剂包含实施方案7的多肽、NODAGA和所述放射性核素⁶⁴Cu。

31.一种成像剂，其包含实施方案1-14中任一项的多肽、¹⁸F放射性标记的辅基和双功能缀合(BFC)模块，其中该成像剂具有以下结构，

其中¹⁸F在N原子的邻位，x是1至8的整数，或其药学上可接受的盐。

32.实施方案31的成像剂，其中1⁸F放射性标记的辅基具有以下结构，

33.实施方案31或32的成像剂，其中[O(CH₂)₂]_x模块相对于吡啶环上的氮以1-3构型存在。

34.实施方案31或32的成像剂，其中[O(CH₂)₂]_x模块相对于吡啶环上的氮以1-2构型存在。

35.实施方案31或32的成像剂，其中[O(CH₂)₂]_x模块相对于吡啶环上的氮以1-4构型存在。

36.实施方案31的成像剂，其中1⁸F放射性标记的辅基具有以下结构，

37.实施方案31至36中任一项的成像剂，其中x是2至6的整数。

38.实施方案37的成像剂，其中x是3至5的整数。

39.实施方案37的成像剂，其中x是4。

40.实施方案31-39中任一项的成像剂，其中[O(CH₂)₂]_x模块相对于吡啶环上的氮以1-3构型存在。

41.实施方案31-40中任一项的成像剂，其中所述吡啶环包含不干扰氟化反应的另外的取代基。

42.实施方案41的成像剂，其中所述吡啶环上的取代基是C_1-6烷基。

43.实施方案42的成像剂，其中所述取代基是甲基、乙基或丙基。

44.实施方案31的成像剂，其中¹⁸F放射性标记的辅基具有以下结构

45.一种成像剂，其包含实施方案1-14中任一项的多肽、¹⁸F放射性标记的辅基和双功能缀合(BFC)模块，其中所述成像剂具有以下结构

其中“OPEG”是指[O(CH₂)₂]_x，并且x是1至8的整数，或其药学上可接受的盐，并且其中“蛋白质”是包含在实施方案1-14中任一项的成像剂中的多肽。

46.实施方案45的成像剂，其中x是2至6的整数，或其药学上可接受的盐。

47.实施方案45的成像剂，其中x是3至5的整数，或其药学上可接受的盐。

48.实施方案45的成像剂，其中x是4，或其药学上可接受的盐。

49.实施方案31至48中任一项的成像剂，其中BFC是包含反应性基团的环辛炔，所述反应性基团与所述蛋白质上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键。

50.实施方案49的成像剂，其中环辛炔选自下组，该组的组成为：二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)和二苯并环辛炔(DBCO)。

51.实施方案50的成像剂，其中环辛炔是DBCO。

52.实施方案31至51中任一项的成像剂，其中BFC进一步包含聚乙二醇(PEG)_y间隔臂，其中y是1至8的整数。

53.实施方案52的成像剂，其中y是2至6的整数。

54.实施方案52的成像剂，其中y是4或5。

55.实施方案52的成像剂，其中BFC是DBCO-PEG4-NHS-酯、DBCO-磺基-NHS-酯、DBCO-PEG4-酸、DBCO-PEG4-胺或DBCO-PEG4-马来酰亚胺。

56.实施方案55的成像剂，其中BFC是DBCO-PEG4-马来酰亚胺。

57.实施方案31的成像剂，其中所述成像剂具有以下结构：

其中X是包含SEQ ID NO:13、28、43、58、73、88和104中任一个的氨基酸序列的多肽。

58.实施方案57的成像剂，其中所述多肽包含在SEQ ID NO:88中列出的氨基酸序列。

59.实施方案57的成像剂，其中所述多肽包含在SEQ ID NO:104中列出的氨基酸序列。

60.一种试剂盒，其包含实施方案1-14和19-59中任一项的多肽、组合物或成像剂，以及使用说明书。

61.一种检测样品中的PD-L1的方法，其包括使样品与实施方案1-14中任一项的多肽接触，并且检测PD-L1。

62.一种检测受试者中的PD-L1阳性细胞的方法，其包括对受试者施用实施方案31-59中任一项的成像剂，并且检测所述成像剂，检测到的成像剂界定所述PD-L1阳性细胞在受试者中的位置。

63.一种检测受试者中的PD-L1表达性肿瘤的方法，其包括对受试者施用实施方案31-59中任一项的成像剂，并且检测所述成像剂，检测到的成像剂界定所述肿瘤在受试者中的位置。

64.实施方案62或63的方法，其中通过正电子发射断层摄影术检测所述成像剂。

65.一种获得实施方案31-59中任一项的成像剂的图像的方法，所述方法包括，

a)对受试者施用所述成像剂；并且

66.一种获得表达PD-L1的组织或细胞的定量图像的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与实施方案31-59中任一项的成像剂接触，并且使用正电子发射断层摄影术检测或定量所述表达PD-L1的组织。

67.一种用于检测PD-L1表达性肿瘤的方法，其包括对具有PD-L1表达性肿瘤的受试者施用成像有效量的实施方案31-59中任一项的成像剂，并且使用正电子发射断层摄影术检测所述肿瘤中的所述成像剂的放射性发射，其中在所述肿瘤中检测到所述放射性发射。

68.一种诊断受试者中的PD-L1表达性肿瘤的存在的方法，所述方法包括：

(a)对有此需要的受试者施用实施方案31-59中任一项的成像剂；和

其中高于背景的成像剂的存在和位置指示疾病的存在和位置。

69.一种监测受试者中针对PD-L1表达性肿瘤的抗肿瘤治疗的进展的方法，所述方法包括：

(a)在第一时间点对有此需要的受试者施用实施方案31-59中任一项的成像剂，并且获得所述受试者的至少一部分的图像以确定所述肿瘤的大小；

(b)对受试者施用抗肿瘤治疗；

(c)在一个或多个随后的时间点对受试者施用所述成像剂，并且获得每个时间点的受试者的至少一部分的图像；

其中在每个时间点的肿瘤的尺寸和位置指示疾病的进展。

题述并入

本文所述的所有文件和参考文献，包括专利文献，例如PCT/US15/62485和PCT/US15/62502以及网站，都在本文件中单独和具体地通过提述并入本文，其程度如同全部或部分地在本文件中写入一样。

现在通过参考以下实施例来描述本发明，这些实施例仅是说明性的，并不旨在限制本发明。虽然已经参照具体实施方案详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对其进行各种改变和修改。

实施例

实施例1：鉴定PD-L1结合性Adnectin

从用人PD-L1蛋白筛选的Adnectin文库中分离抗PD-L1 Adnectin，或从该文库中鉴定的克隆通过PROfusion使其亲和力成熟。在图1和表3中呈现这些Adnectin的全长序列、核心序列、BC、DE和FG环序列以及具有“PC”修饰的C端的变体。

例如，通过使ATI-964 Adnectin亲和力成熟获得高亲和力抗PD-L1 Adnectin，ADX_5322_A02(“A02”)。通过在每个编码环BC、DE或FG中的残基的核苷酸位置处引入少量的非野生型核苷酸将编码ATI-964的基因重新多样化。然后，对于得到的与ATI-964相关的Adnectin序列文库，通过PROfusion(mRNA展示)体外选择高严格条件下与人PD-L1的结合。对完成选择后富集的克隆进行测序，以高通量蛋白生产(HTPP)格式表达，并筛选其结合PD-L1的能力及其单体性(monomericity)分数。对于具有对PD-L1的亲和力和鲁棒的生物物理特性二者的最佳组合的克隆，将其突变为包含C端半胱氨酸，首先具有C端序列NYRTPCH6(鉴定为ADX_5322_A02的形式)，然后具有C端序列NYRTPC。

遵循相同的方法使ATI-967亲和力成熟，产生Adnectin ADX_5417_E01。类似地，通过使ATI_1422_G05亲和力成熟，获得亲和力成熟的ATI_1760_C02、ATI_1760_E01(“E01”)和ATI_1760_F01。

分离另外的抗人PD-L1 Adnectin。其序列在表3中列出。

加his标签的抗PD-L1 Adnectin的表达和纯化

所有DNA构建体都含有N端his标签，随后是TVMV识别序列。将上文描述的抗PD-L1Adnectin的表达质粒(pET-28 NM载体)转化到BL21(DE3)细胞(New England Biolabs)中。使细胞在Overnight Express Autoinduction培养基(Novagen)中在37℃在1L摇瓶中生长6小时，然后在220RPM在20℃生长16小时。通过离心收获细胞并悬浮于pH 7.2的PBS中。将细胞机械裂解，然后通过离心澄清。将可溶积分通过重力进样到Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)上结合，在20mM Tris+10mM咪唑(pH 8.0)中洗涤，然后在20mM Tris+40mM咪唑(pH 8.0)中洗涤，用20mM Tris+400mM咪唑(pH 8.0)洗脱。镍洗脱物中按照Adnectin 1:23倍摩尔过量掺入TVMV蛋白酶。将TVMV-Adnectin洗脱物混合物对20mM Tris(pH 8.0)4℃透析16小时。为了分离TVMV蛋白酶和切下的his标签片段，将样品上样到10mL HisTrap FF柱(GEHealthcare)上，并收集穿透(flow through)级分。

实施例2：PD-L1 Adnectin的生物物理学评估

评估ATI-1420D05、ATI-1420D05、AT1-1421E04和ATI-1422G05、ATI_1760_C02、ATI_1760_E01和ATI_1760_E01的结合特性。

表1：抗PD-L1 Adnectin的结合特性

序列名称	SEQ ID	K<sub>D</sub>(nM)
			ATI-1420B09	2.5
ATI-1420D05		9.5
			AT1-1421E04	5.6

表2中显示了纯化的ATI-964、ATI-967、ATI-968、ADX_5322_A02和ADX_5417_E01Adnectin与人或食蟹猴PD-L1的结合特性，如通过Biacore确定的。通过测量与人PD-L1阳性细胞L2987的结合来确定细胞结合情况。

表2：抗PD-L1 Adnectin的生物物理特性

结合数据指示，亲和力成熟的抗人PD-L1 Adnectin以小于1nM或甚至小于0.1nM的亲和力与人PD-L1结合。图12中显示了示例性抑制曲线。

抗PD-L1 adnectins具有以下附加特征：

-抑制人PD-1与人PD-L1的结合，如通过流式细胞术测量对人PD-1Fc与PD-L1阳性细胞L2987的结合的抑制确定的，并且例如针对Adnectin ATI-964、ATI-965、ATI-966、ATI-967、ATI-968、A02和E01所示；

-抑制人CD80(B7-1)与人PD-L1的结合，如通过ELISA确定。例如，ATI-964以41pM的EC50抑制结合；ATI-965以210pM的EC50抑制结合；ATI-966以28pM的EC50抑制结合；并且ATI-968以56pM的EC50抑制结合；

-抑制抗PD-L1抗体12A4与人PD-L1的结合，如通过ELISA确定。

还在混合淋巴细胞反应(MLR)中测试了抗PD-L1抗体：ATI-964、ATI-965和ATI-968在MLR中有活性，而ATI-966和ATI-967在MLR中无活性。

以下实施例涉及用¹⁸F和⁶⁴Cu标记抗PD-L1 Adnectin。

实施例3：4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯的制备

在乙醇(50mL)中溶解((氧基双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)双(4-甲基苯磺酸)(5g，9.95mmol)和叠氮化钠(0.647g，9.95mmol)的混合物，并且在17个小时的时段内在90℃进行回流反应。使用部分真空除去溶剂，然后上样到40克二氧化硅筒上，并使用快速层析色谱法(IscoCombiFlash-使用线性梯度法进行洗脱，所述线性梯度法在45分钟的时段内从己烷中的10％乙酸乙酯开始，渐增到己烷中的90％乙酸乙酯)。通过TLC检查汇集的级分，并将其合并以给出4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯，为无色油。由于4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯产物的反应性，将此材料“按照原样”使用而不做任何进一步的表征。

实施例4：3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶的制备

在0℃向DMF(10mL)中的氢化钠(0.129g，3.21mmol)的悬浮液逐滴添加DMF(5mL)中的2-氟吡啶-3-醇(0.363g，3.21mmol)的搅拌溶液，然后逐滴添加DMF(5mL)中的4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯(1.00g，2.68mmol)溶液。将悬浮液在0℃保持10分钟，然后置于环境温度1小时，接着在60℃另外加热4小时。在真空中除去溶剂。添加100ml乙酸乙酯，随后用浓缩的盐水溶液进行3次分开的洗涤提取。将有机层经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。使用快速色谱法(IscoCombiFlash-用Hex中的10％-50％EtOAc进行洗脱)纯化粗制材料，生成无色油。分离3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶(702mg，2.233mmol，83％产率)，为透明的油。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.75(dt,J＝4.9,1.6Hz,1H),7.33(ddd,J＝10.0,8.1,1.5Hz,1H),7.10(ddd,J＝7.9,4.9,0.7Hz,1H),4.30-4.16(m,2H),3.95-3.83(m,2H),3.80-3.61(m,10H),3.38(t,J＝5.1Hz,2H)13C NMR(101MHz,氯仿-d)d 142.3,137.7,137.5,123.4,123.4,121.7,121.6,77.3,76.7,70.9,70.7,70.6,70.0,69.4,69.0,50.6 19F NMR(400MHz,氯仿-d)δ-83.55.HRMS(ESI)理论:C13H20FN4O4+m/z 315.464；测得315.1463。

实施例5：3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶的制备

在DMF(7.0mL)中溶解氢化钠(0.121g，3.01mmol)(油中的60％悬浮液)，并且将所得的悬浮液冷却到0℃。缓慢添加DMF(1.5mL)中的2-硝基吡啶-3-醇(0.384g，2.74mmol)溶液，接着逐滴添加DMF(1.5mL)中的4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯(1.023g，2.74mmol)。将悬浮液在0℃保持10分钟，然后置于环境温度2小时，接着在60℃加热持续72小时的时段。用10ml DI水淬灭反应，然后用乙酸乙酯提取(3x 10mL)。将汇集的EtOAc提取物用浓盐水溶液(10mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并在减压下蒸发，给出淡黄色油。通过快速色谱法纯化粗产物。24g二氧化硅筒，25mL/min，从己烷中的10％乙酸乙酯开始，接着在25分钟的时段内经过线性变化为己烷中的50％乙酸乙酯。在此时间后，将梯度保持为该溶剂组成持续10分钟，然后在10分钟的时段内改变为100％乙酸乙酯。在色谱图的30-40分钟部分之间洗脱3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶，并在减压下蒸发汇集的级分，然后在真空下蒸发2小时以给出3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶(687mg，1.973mmol，72.0％产率)，为淡黄色油。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.11(dt,J＝4.9,1.6Hz,1H),7.60(ddd,J＝10.0,8.1,1.5Hz,1H),7.52(ddd,J＝7.9,4.9,0.7Hz,1H),4.30-4.16(m,2H),3.95-3.83(m,2H),3.80-3.61(m,10H),3.38(t,J＝5.1Hz,2H)13C NMR(101MHz,氯仿-d)d 147.3,139.5,128.4,124.4.71.1,70.7,70.6,70.0,69.9,69.3,50.7.HRMS(ESI)理论:C13H20N5O6+m/z342.1408；测得342.1409

实施例6：3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-溴吡啶的合成

在0℃向二甲基甲酰胺(DMF，5mL)中的氢化钠(NaH，25.7mg，0.643mmol)的悬浮液逐滴添加DMF(1mL)中的2-溴吡啶-3-醇(112mg，0.643mmol)的溶液，然后逐滴添加DMF(1mL)中的4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯(200mg，0.536mmol)溶液。将悬浮液在0℃保持10分钟，然后置于环境温度并保持1小时，接着在60℃加热4小时。在完成加热后，在真空中除去粗反应混合物的溶剂。在50mL乙酸乙酯中复原粗反应物，用2x50mL盐水溶液洗涤，有机层经硫酸镁干燥，过滤，并在真空中浓缩。使用反相HPLC纯化粗反应物以给出3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-溴吡啶，TFA(112mg，0.229mmol，42.7％产率)，为淡黄色油。HRMS ESI m/z(M+H),理论C13H20BrN4O4375.0664测得375.0662；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.97(dd,J＝4.6,1.5Hz,1H),7.54(dd,J＝8.2,1.6Hz,1H),7.40(dd,J＝8.1,4.6Hz,1H),4.24(dd,J＝5.3,3.9Hz,2H),3.85-3.78(m,2H),3.68-3.62(m,2H),3.62-3.52(m,8H),3.42-3.34(m,2H)。

实施例7：用于合成三甲基苯铵(trimethylanilium)化合物的方案

实施例8：3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N,N-二甲基吡啶-2-胺的合成

将二甲基亚砜(DMSO，2.5mL)中的3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶(160mg，0.509mmol)、碳酸钾(K₂CO₃，84mg，0.611mmol)和二甲胺(在水中，40％，0.097mL，0.764mmol)的混合物在密封耐压容器中在110℃加热14小时。在完成加热后，在真空中除去粗反应混合物的溶剂。在50mL乙酸乙酯中复原粗反应物，用2x 50mL盐水溶液洗涤，有机层经硫酸镁干燥，过滤，并在真空中浓缩。使用正相色谱法纯化粗反应物，以给出3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N,N-二甲基吡啶-2-胺(140mg，0.413mmol，81％产率)，为无色油。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.86(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H),7.02(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),6.73(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H),4.20-4.07(m,2H),3.98-3.86(m,2H),3.81-3.61(m,9H),3.38(t,J＝5.1Hz,2H),3.13-2.94(m,6H),1.69(s,2H).HRMS(ESI)理论:C15H26N5O4+m/z 340.1980；发现340.1979。

实施例9：3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N,N,N-三甲基吡啶-2-铵的合成

在稳定氮气流下在密封容器中将三氟甲磺酸甲酯(0.065mL，0.589mmol)添加到甲苯(1.5mL)中的3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N,N-二甲基吡啶-2-胺(40mg，0.118mmol)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌持续14个小时的时段。除去溶剂，用2x 10ml醚洗涤所得的残留物，与2x 1ml二氯甲烷共沸干燥，并在高压真空下干燥过夜，从而以定量产率给出3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N,N,N-三甲基吡啶-2-铵，三氟甲磺酸盐，为粘稠的无色油。LCMS m/z 354.33；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.24-8.17(m,1H),7.98(d,J＝8.3Hz,1H),7.75(ddd,J＝8.2,4.6,3.2Hz,1H),4.44(br.s.,2H),3.88(d,J＝3.9Hz,2H),3.69-3.45(m,21H)。

实施例10：用3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N,N,N-三甲基吡啶-2-铵，三氟甲磺酸盐合成[^18F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶

[¹⁸F]-氟化物水溶液(2.0ml，33.3GBq/900mCi)购自West Point PA中的P.E.T.Pharmaceuticals，将其直接转移到Sep-Pak Light QMA[在使用前依次用5ml的0.5M碳酸氢钾、5ml的去离子水和5ml的MeCN将Sep-Pak light QMA筒预处理]。在完成此转移后，通过依次添加碳酸钾(15mg/ml；0.1ml)，接着是碳酸钾(30mg/ml，0.1ml)、4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六烷(15mg，0.04mmol)和1.2ml MeCN的混合物从QMA Sep-Pak释放水性[¹⁸F]氟化物。在90℃和真空在温和的氮气流下蒸发溶剂。重复两次用1ml乙腈部分共沸干燥以产生无水K.2.2.2/K[¹⁸F]F复合物。将3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N,N,N-三甲基吡啶-2-铵，三氟甲磺酸盐(2mg，5.6μmol)溶解在500微升DMSO中，并将其添加至干燥的穴状配体(cryptand)。将此溶液在120℃加热10分钟。在此时间后，用3ml DI水稀释粗反应混合物。然后，使用反相HPLC在下列条件下将粗反应混合物的全部内容物转移、上样和纯化：HPLC柱：Luna C18 250x 10溶剂A：DI水中的0.1％TFA；溶剂B：乙腈中的0.1％TFA，流速4.6ml/分钟，使用等度方法32％B，同时在280nm监测UV。在色谱图的24分钟标记处分离[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶，并且在2分钟的时段内收集。将此产物收集到含有10ml的DI水的100ml烧瓶中，并且将全部内容物转移到Waters产Sep-Pak Vac tC18 6cc 1g sep pack。从该反应分离6.1GBq/164mCi的[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶。使用3ml乙醇将其从sep-pak释放，并且用98℃热源、温和氮气流和真空在15分钟的时段内减少此溶液，直到小瓶中仅剩下一层薄膜为止。将终产物复溶在100％1x PBS缓冲液中，其在此介质中37℃可稳定超过1小时。

通过利用与适当的含有炔类的生物制剂的“点击”叠氮化物-炔反应，可使用[[¹⁸F]]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶产生[¹⁸F]标记的生物产物(例如，¹⁸F标记的抗PD-L1 Adnectin，如下文描述)。

实施例11：使用“点击化学”产生¹⁸F放射性标记的蛋白质

A.4-PEG-甲苯磺酰基-叠氮化物前体的氟化以形成[¹⁸F]-FPPEGA

将¹⁸O水(3ml)中的900mCi活性的¹⁸F(购自IBA Molecular)直接转移到微量小瓶(无QMA)中，其含有4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六烷(2.8mg，7.44μmol)和碳酸钾(1.7mg，0.012mmol)。将另外2.0ml乙腈转移到此粗反应混合物中，将全部混合物共沸干燥。这通过使用98℃油浴蒸发溶液，并且应用温和的N2流和部分真空完成。将溶液的体积减少到约2ml。再添加2ml乙腈，并且在40分钟的时段内重复该过程3次。当将液体的体积减少到小于0.3ml时，添加0.7ml乙腈等分试样，并且通过进一步共沸蒸馏减少溶液，直到体积为约0.1ml。另外添加0.9ml乙腈，并且完成该过程，直到形成白色固体。该过程花费约55分钟。在最终程序期间，在溶液干燥之前从油浴中取出小瓶，将小瓶中的残留物在全真空(无N₂流)下在室温放置20分钟。用于转移和干燥穴状配体混合物的总时间是65分钟。

向干燥的穴状配体混合物添加溶解在500微升DMSO中的3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶(2mg，5.86μmol)，并且在120℃加热此混合物10分钟。在此时间后，用3ml的DI水稀释粗反应混合物，然后将全部内容物转移并且上样到以下HPLC柱和条件上：HPLC柱：Luna C18 250x 10mm；溶剂A：DI水中的0.1％TFA；溶剂B：乙腈中的0.1％TFA；流速4.6ml/min；压力1820PSI；等度方法32％B；UV-280nm。在色谱图的24分钟标记处分离[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶([¹⁸F]-FPPEGA)产物，并且在2分钟的时段内收集。将此产物收集到含有15ml的DI水的100ml烧瓶中，并且将全部内容物转移到Sep PakVac tC18 6cc 1g sep pack。PNWAT036795。使用2.5ml乙醇从Sep Pak释放[¹⁸F]-FPPEGA，并且用98℃N₂和真空在15分钟的时段内减少此溶液直至干燥。将此化合物溶解在0.1ml 1X PBS(磷酸盐缓冲盐水)中。使用Varian HPLCHPLC柱Luna C18(2)4.6x 150mm溶剂A：DI水中的0.1％TFA；溶剂B：乙腈中的0.1％TFA；流速1.0ml/分钟；梯度法0分钟90％A 10％B；15分钟30％A 70％B；17分钟30％A70％B；18分钟90％A 10％B；20分钟90％A 10％B；UV-280nm分析此产物。分离220mCi的[¹⁸F]-FPPEGA。

B.制备E01-4PEG-DBCO

本实施例描述了E01抗PD-L1 Adnectin与PEG4-DBCO的连接。

由于使用马来酰亚胺化学将Adnectin与PEG4-DBCO连接，将E01Adnectin首先通过在其C端添加脯氨酸然后是半胱氨酸加以修饰。在SEQ ID NO:104中提供了这种修饰的E01Adnectin的氨基酸序列。使用半胱氨酸将Adnectin与PEG4-DBCO连接。

将4倍摩尔过量的马来酰亚胺-PEG4-DBCO(Click Chemistry Tools)溶解在DMSO中，并且在1mM TCEP存在的情况下添加到纯化的经修饰的E01 Adnectin。在缀合混合物中的DMSO终浓度不超过5％。将缀合混合物置于室温1小时，之后进行质谱分析。在MS确认缀合后，通过使用在PBS pH 7.2中平衡的HiLoad 26/60 Superdex 75柱(GE Healthcare)的大小排阻色谱法纯化样品。

C.[¹⁸F]-FPPEGA与Adnectin偶联

图2和图9中显示了用于合成[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA的示意图。

将0.2ml的E01-4PEG-DBCO Adnectin溶液的5.4mg/ml溶液(如B部分中所述制备)与1x PBS缓冲液中的200mCi的0.1ml[¹⁸F]-FPPEGA(实施例4)一起温育。通过将粗反应物上下移液几次温和地混合溶液，并在45℃或室温一起温育45分钟。使用SEC柱纯化此粗反应混合物的内容物。在2分钟的时段内在色谱图的37分钟标记处分离Superdex 200 0.5ml/分钟1X PBS缓冲液和[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA产物。

使用PLRPS柱和凝胶电泳在共注射非放射性标准品RP HPLC的情况下经由SEC分析[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA。

用以下参数进行大小排阻色谱(SEC)：

Superdex 200柱；溶剂100％1X PBS缓冲液；0.5ml/分钟280UV；

反相HPLC

柱：PLRPS 8微米1000A 4.6x 250mm

溶剂A：DI水中的0.1％甲酸

溶剂B：乙腈

流速：1ml/分钟

压力：1351PSI

梯度：

0分钟90％A 10％B

30分钟45％A 55％B

32分钟25％A 75％B

36分钟25％A 75％B

50分钟90％A 10％B

分离15mCi[¹⁸F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA，当在45℃进行反应时，其具有通过SEC和RP HPLC计算的>99％的放射化学纯度(RCP)，并且具有0.6mCi/nmol的比活性。当在室温进行反应时，获得5.72mCi。当分别在45℃或室温进行反应时，[¹⁸F]-FPPEGA的比活性在其合成结束后3小时为0.512mCi/nmol，并且RCP为85.7％。通过Nanodrop(见www.nanodrop.com)测量比活性。在SEC和PLRPS两者上将产物与非放射性标准品共洗脱。凝胶电泳证实了与11kDa分子量标准品一致的¹⁸F产物。

¹⁸F放射性标记的E01-4PEG-DBCO可用于多种体外和/或体内成像应用，包括诊断成像、基础研究和放射治疗应用。可能的诊断成像和放射治疗应用的具体实例包括确定PD-L1阳性肿瘤的位置、相对活性和/或量化PD-L1阳性肿瘤、PD-L1阳性肿瘤的放射免疫测定、以及放射自显影以确定哺乳动物或其器官或组织样品中PD-L1阳性肿瘤的分布。

具体而言，¹⁸F放射性标记的E01-4PEG-DBCO可用于人和实验动物的肺、心脏、肾、肝和皮肤和其他器官中的PD-L1阳性肿瘤的正电子发射断层摄影(PET)成像。使用¹⁸F放射性标记的E01-4PEG-DBCO的PET成像可用于获得以下信息：候选PD-L1肿瘤治疗药物的组织占据水平与患者中的临床功效之间的关系；在开始长期临床研究之前，PD-L1肿瘤治疗药物临床试验的剂量选择；结构新型PD-L1肿瘤治疗药物的比较效力；研究PD-L1肿瘤治疗药物在用PD-L1肿瘤治疗药物治疗临床靶标期间对体内转运蛋白亲和力和密度的影响；PD-L1阳性肿瘤在有效和无效治疗期间的密度和分布的变化。

D.制备¹⁸F标记的Adnectin的替代方法

提供了一种略微改变的合成[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶并用其标记Adnectin的方法。

从IBA Molecular购买¹⁸O水(2ml)中的900mCi活性的氟-18并将其输送到遥控合成装置中。将该样品直接转移到微量小瓶中，其含有4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六烷(3.2mg，8.50μmol)和碳酸钾(1.4mg，10.13μmol)。将另外1.5ml乙腈转移到此小瓶中，将全部混合物共沸干燥。然后通过将小瓶置于90℃油浴中并应用温和的N₂气流和部分真空来蒸发该溶液。这通过首先在加热的同时使用部分真空10分钟来完成。将微量小瓶的总容积减少至约2ml。再添加2ml乙腈，并且在40分钟的时段内将这个过程重复3次。当液体体积减少到小于0.3ml时，添加0.7ml的乙腈等分试样，并且通过共沸蒸馏将溶液减少到体积为约0.1ml，另外加入0.9MeCN，直到形成白色固体即完成该过程。在最终程序期间，在溶液干燥之前从油浴中取出小瓶，将小瓶中的残留物在全真空下在室温放置20分钟。将3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶(2mg，5.86μmol)溶解在500微升DMSO中，并加入到干燥的穴状配体中。将此溶液在120℃加热10分钟。此后，将粗反应混合物用3ml DI水稀释。然后，使用反相HPLC并且在下列条件下将粗反应混合物的全部内容物转移、上样和纯化：HPLC柱：Luna C18 250x 10溶剂A：DI水中的0.1％TFA；溶剂B：乙腈中的0.1％TFA，流速4.6ml/分钟，使用等度方法32％B，同时在280nm监测UV。在色谱图的24分钟标记处分离[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶，并且在2分钟的时段内收集。将此产物收集到含有10ml的DI水的100ml烧瓶中，并且将全部内容物转移到Waters产Sep-Pak Vac tC18 6cc 1g sep pack。从该反应分离224mCi的[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶。使用3ml乙醇将其从sep-pak释放，并且用98℃热源、温和氮气流和真空在15分钟的时段内减少此溶液，直到在小瓶中仅剩下薄膜为止。将终产物复溶在100％1x PBS缓冲液中，其在37℃在此介质中可稳定超过1小时。通过利用与适当的含有炔的生物制剂的“点击”叠氮化物-炔反应，使用[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶生成了¹⁸F标记的生物产物。

实施例12：将PD-L1 Adnectin与NODAGA连接以生成NODAGA-PD-L1 Adnectin

本实施例描述了E01和A02抗PD-L1 Adnectin与NODAGA的连接。由于使用马来酰亚胺化学将Adnectin与NODAGA连接，两种Adnectin都在其C端使用了脯氨酸然后是半胱氨酸(如上文对E01所述)。分别在SEQ ID NO:104和88中提供了经修饰的E01和A02 Adnectin的氨基酸序列。使用半胱氨酸将Adnectin与NODAGA连接。对于Adnectin的⁶⁴Cu标记，将50倍摩尔过量的马来酰亚胺-NODAGA(CheMatech)溶解在PBS pH 7.4中，并在1mM TCEP存在下添加到纯化的Adnectin中。在缀合混合物中的DMSO终浓度不超过5％。将缀合混合物置于室温1小时，之后进行质谱分析。在MS确认缀合后，通过使用在PBS pH 7.2中平衡的HiLoad 26/60Superdex 75柱(GE Healthcare)的大小排阻色谱法纯化样品。

实施例13：基于⁶⁴Cu的抗PD-L1 Adnectin探针的合成

⁶⁴Cu-A02-NODAGA的合成_

在环境温度用0.8mL的0.1N乙酸钠(NaOAc)水溶液将0.1N盐酸溶液中的[⁶⁴Cu]-氯化铜(64CuCl2)中和4分钟。将1mL的64Cu/NaOAc溶液添加到A02-NODAGA(30μL，1.6mg/mL)中，并且将粗反应物温和移液以允许混合，接着在环境温度静置30分钟。将粗反应混合物的内容物转移到PD-10脱盐柱，所述脱盐柱在样品上样之前用20mL的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)缓冲液预活化。向柱添加另外的1.5mL的1XPBS，接着是另外的0.8ml 1XPBS溶液，并且弃去这些级分。然后在PD-10柱的1.2mL洗脱液之后收集[⁶⁴Cu]-A02-NODAGA以给出10.79mCi，为期望的产物。使用Agilent PLRP-S HPLC柱，使用反相HPLC系统测量质量控制，大小：250x 4.60mm，8μm，280nm，并且流动相为在蒸馏水和乙腈中的0.1％甲酸。使用梯度法，其中乙腈的百分比在30分钟的时间范围内从10％线性增加到45％。在HPLC色谱图的22分钟标记处将[⁶⁴Cu]-A02-NODAGA与参考标准品共洗脱。使用该方法测得放射化学纯度为96％。同样使用大小排阻色谱法在20分钟标记处将[⁶⁴Cu]-A02-NODAGA与参考物质共洗脱，(SEC)柱：GE Superdex 200GL大小：10x 300mm，280nm。基于纯化样品的分离放射性和Nanodrop蛋白浓度，计算的比活性为956.8mCi/μmol。

⁶⁴Cu-E01-NODAGA的合成程序

将0.1N盐酸溶液(0.25mL中的20mCi)中的[⁶⁴Cu]-氯化铜([⁶⁴Cu]CuCl₂)用1.10mL的0.1N乙酸铵缓冲液调节pH，然后混合并与在1XPBS水溶液中的E01-NODAGA Adnectin(40μL，1.2mg/mL，4.62nmol)在环境温度温育30分钟。温育30分钟后，将反应混合物(约1250μL)转移到PD-10脱盐柱(GE Healthcare Life Science,Sephadex G25 Medium,14.5x 50mm–用40mL的1X PBS平衡)，并且允许样品通过重力并且随着1.1mL的1X PBS完全进入柱。在液体完全通过柱后，通过每样品小瓶用1X PBS以1mL的增量洗脱收集产物。将⁶⁴Cu-E01-NODAGA分离在第二个1ml级分中，并在1ml的1XPBS中测量为9.26mCi。使用配备有UV/vis检测器(λ＝280nm)、posi-ram检测器和Superdex 200 10/300GL大小排阻柱(GE HealthecareLifeScience，孔径13μm)的Agilent HPLC系统，使用分析大小排阻HPLC法分析此样品。流速为0.5mL/min，水性流动相为具有0.02％NaN3的1X PBS，进行等度洗脱60分钟。使用此系统，放射化学纯度为99％，并且将产物与非放射性参考标准品共洗脱。基于3点校准曲线的方程(y＝656978x)计算比活性。将约100μL来自小瓶3的产物溶液注射到Superdex-200大小排阻柱。收集产物峰，并且测定为0.74mCi，产物峰的UV计数为156367单位，并且比活性为3.1mCi/nmol。

实施例14：用抗PD-L1 Adnectin成像剂体外区分PD-L1阳性细胞与PD-L1阴性细胞

在本实验中，对⁶⁴Cu-E01抗PD-L1 Adnectin(使用NODAGA作为螯合剂)测试了其在体外区分hPD-L1阳性细胞和hPD-L1阴性细胞的能力。细胞标记是特异的，如与hPD-L1阴性HT-29细胞相比⁶⁴Cu-E01与hPD-L1阳性L2987细胞的差异结合所证明的那样(细胞相关放射性在hPD-L1阳性L2987细胞中高44.6倍)。当与450nM过量冷(未标记)E01 Adnectin共温育时，细胞结合的⁶⁴Cu-E01的显著减少，进一步证明了特异性(减少99.6％)。当将细胞与450nM的冷(未标记的)非PD-L1结合性Adnectin共温育时，细胞结合的¹⁸F-E01的减少程度最低(9.9％减少，不显著)(图3)。

将1×10⁶个hPD-L1阳性L2987人肺癌细胞或hPD-L1阴性HT-29人结肠直肠腺癌细胞置于5mL培养管中(每种条件n＝3个管)。在PBS+0.5％BSA中以300nCi/200μL的浓度制备⁶⁴Cu-E01 Adnectin溶液。将此溶液的部分用冷(未标记)E01 Adnectin或冷(未标记)非PD-L1结合性Adnectin补充至终浓度450nM。将细胞样品以200xg离心5分钟，然后重悬于200μL适当的⁶⁴Cu-E01 Adnectin溶液中，并在冰上温育1小时。在温育期后，将细胞样品以200xg离心，并且弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1mL PBS+0.5％BSA中，重复洗涤程序，共3次洗涤。最终洗涤后，将细胞再次以200xg离心，并且弃去上清液。然后，通过γ计数仪测量剩余的细胞沉淀的放射性。

总之，这些结果证明了⁶⁴Cu-E01 Adnectin体外区分PD-L1(+)与PD-L1(-)细胞的能力。与450nM未标记的抗PD-L1 E01 Adnectin共温育的样品中细胞相关放射性示踪剂显著减少(而且当与450nM的非PD-L1结合性Adnectin共温育时，仅有统计学上不显著的减少)，进一步证实了特异性。使用不同的Adnectin变体以及¹⁸F作为放射性核素进行了相似的实验，得到了相似的结果。

实施例15：用抗PD-L1 Adnectin成像剂区分PD-L1-阳性肿瘤与PD-L1-阴性肿瘤

对于PET成像，快速的血液清除比清除更慢的蛋白质(如抗体)有优势，因为快速的血液清除可以使从非相关组织中耗尽“背景”探针信号所需要的时间量最小化。在临床上，基于长血液半衰期抗体的PET示踪剂在注射后可能需要等待几天方可采集图像。快速清除性探针使得在注射探针的当日采集高对比度图像成为可能，而且非常重要的是，它们还可用来减少对所研究的动物或检查的患者的总辐射暴露。

在本实验中，测试了如在以上实施例中所述产生的⁶⁴Cu-A01抗PD-L1 Adnectin(使用NODAGA作为螯合剂)区分小鼠中的hPD-L1阳性肿瘤和hPD-L1阴性肿瘤的能力。

通过在小鼠的相对侧皮下导入1×10⁶个hPD-L1(+)L2987人肺癌细胞和1.5×10⁶个hPD-L1(-)HT-29人结肠癌细胞，产生了携带双侧异种移植肿瘤的小鼠。一旦肿瘤达到大约300mm³(细胞植入后大约2-3周)，选择动物进行成像。为了成像，将动物置于用2％异氟烷的麻醉下，并安装尾静脉导管。然后，将小鼠放入具有4只动物容量的定制动物保持器中，使它们在那里在研究过程中保持麻醉。将动物保持器转移至F120^TM扫描仪(SiemensPreclinical Solutions,Knoxville,TN)。该仪器视图的轴向视场为7.6cm。鉴于这种限制，将动物定位，使得扫描区域为从眼的正前方到大致尾部的基部。

为了最终PET图像的衰减校正，首先使用⁵⁷Co点源采集10分钟的透射图像。在透射扫描之后，通过先前安装的尾静脉导管施用放射性示踪剂溶液，并采集2小时的发射图像。注射的放射性示踪剂溶液由约200μCi ⁶⁴Cu-A02(具有NODAGA螯合剂)或补充有3mg/kg终浓度的冷的未标记的A02 Adnectin(基于个体动物体重)的200μCi ⁶⁴Cu-A02组成。在注射前将所有注射剂配制在200μL盐水中。通过直接测量配制剂量，用测量值减去注射器和尾静脉导管中剩余的放射性，来计算精确的注射剂量。

使用最大后验(MAP)算法重建图像，其中使用收集的透射图像进行衰减校正并且对放射性同位素衰变进行校正。在最终图像中，使用ASIPro软件(Siemens PreclinicalSolutions)在肿瘤边界周围绘制感兴趣区域(ROI)。计算每个ROI的时间-活性曲线，以产生在2小时发射图像过程中肿瘤体积内放射性示踪剂的定量视图。为了最终比较，基于每个特定动物的放射性示踪剂注射剂量将各个时间-活性曲线归一化。使用每个时间-活性曲线的最后10分钟(放射性示踪剂注射后1小时50分钟-2小时)，比较各肿瘤的放射性示踪剂摄取。使用此方法，在hPD-L1(+)L2987异种移植物中的放射性示踪剂摄取是在仅接受⁶⁴Cu-A02放射性示踪剂的动物的hPD-L1(-)HT-29异种移植物中所见的3.05倍。在用⁶⁴Cu-A02放射性示踪剂和3mg/kg未标记的A02 Adnectin共注射的动物中，hPD-L1(+)L2987异种移植物中的摄取仅是hPD-L1(-)HT-29异种移植物中所见的摄取的1.04倍(图4A和4B)。

在小鼠中使用1¹⁸F作为放射性核素进行相似的实验，获得了相似结果，使用¹⁸F-A02 Adnectin放射性示踪剂在hPD-L1(+)L2987异种移植物相对于hPD-L1(-)HT-29异种移植物中达到3.53:1的最大放射性示踪剂摄取比值。简言之，用HT-29和L2987细胞双侧皮下植入裸鼠。一旦肿瘤达到大约200-300mm³，就选择动物进行成像。用氧气中的2％异氟烷麻醉小鼠并将其置于Focus 120PET成像系统(Siemens Preclinical Solutions)的成像床上。然后通过尾静脉注射大约150μCi ¹⁸F-A02，并将动物连续成像120分钟。然后使用⁵⁷Co点源采集10分钟的透射图像，将其用作衰减校正。使用3D最大后验算法重建图像，其中使用AsiPro软件(Siemens Preclinical Solutions)进行衰减校正。结果证明，与仅接受放射性示踪剂的小鼠中的hPD-L1(-)HT29异种移植物相比，在hPD-L1(＝)L2987异种移植物中有明显的摄取差异。

对于一些研究，在成像后立即通过颈脱位法处死动物。然后对动物进行尸体剖检，将各组织(血液、心、肺、肝、脾、肾、肌肉、胃、骨、L2987肿瘤和HT-29肿瘤)收集到预先称重的管中。然后，将所有组织再次称重以确定每个组织的重量。然后，使用Perkin-ElmerWizard3γ计数仪直接离体测量每个组织中的放射性。对于所有组织，将每分钟计数(CPM)的测量值相对于各个动物的注射放射性剂量归一化，并校正放射性衰变。然后用这些结果绘图以显示放射性示踪剂的生物分布。图5中显示了针对¹⁸F-A02 Adnectin放射性示踪剂的该分析的实例。这些结果证明，与hPD-L1(-)HT-29异种移植物相比，在hPD-L1(+)L2987异种移植物中放射性示踪剂有明显的摄取差异。此外，唯一具有较高PD-L1摄取的组织是肾，这是符合预期的，因为预期¹⁸F-A02 Adnectin的清除是基于分子的分子量通过肾过滤实现的。

总之，这些结果实现了体内区分hPD-L1(+)与hPD-L1(-)异种移植肿瘤的直接可视化。共注射3mg/kg未标记的抗PD-L1 A02 Adnectin导致hPD-L1(+)肿瘤中放射性示踪剂摄取降低至hPD-L1(-)异种移植物的水平，进一步证明了特异性。这进一步验证了抗PD-L1Adnectin在利用PET成像的PD-L1组织表达可视化中的用处。

当在食蟹猴中实施时，基于抗PD-L1 Adnecin的成像剂也显示了相似的结果。在这些研究中，测试了如以上实施例中所述所产生的¹⁸F-E01抗PD-L1 Adnectin在食蟹猴中产生高对比度图像的能力。本文所述的抗PD-L1 Adnectin对食蟹猴PD-L1维持高亲和力(但对啮齿动物PD-L1具有低亲和力)。此外，由于食蟹猴不像小鼠模型那样包含PD-L1(+)肿瘤，故主要根据图像中测得的背景水平，评估内源PD-L1表达的场景下的成像性能(背景低，使PD-L1(+)组织的高灵敏度检测成为可能)。在这些研究中，所得PET图像的背景水平非常低，主要在肾、脾和膀胱中注意到显著的放射性示踪剂积累。

将具有先前安装的血管通道端口(VAP)的雄性食蟹猴用0.02mg/kg阿托品、5mg/kgTelazol(舒泰)和0.01mg/kg丁丙诺啡(I.M.)肌肉注射(全部吸入一支注射器)麻醉。然后，将静脉注射导管置于头静脉中，用于在成像程序期间输液以维持水分补充。用气管内管-通常为3.0mm对动物插管，并且将其转移至F220^TMPET仪(Siemens PreclinicalSolutions,Knoxville,TN)的成像床。用异氟烷和氧气维持麻醉，并且在成像程序期间以6ml/kg/hr的速率施用静脉注射液(LRS)。由于F220^TM仪视图的轴向视野仅为7.6cm，故采集超过5个不同床位置的图像，创建了动物的从心脏紧邻上方直至大致骨盆的复合图像。

为了最终PET图像的衰减校正，对于每个视场，首先使用⁵⁷Co点源采集10分钟的透射图像。一旦采集了所有床位置的透射图像，通过安装的VAP施用大约1.5mCi(大约0.015mg/kg)的¹⁸F-E01 Adnectin放射性示踪剂。然后对于每个床位置依次采集5分钟持续时间的发射扫描，从大致位于心脏中心的位置1开始并朝向动物的骨盆移动。一旦采集每个位置(1至5)处的图像，将成像床移回到床位置1，并重复该过程。使用这个程序，在成像研究持续期间，对每个床位置采集总共5个不同的图像。

对于收集的透射图像，经放射性同位素衰变校正后，使用带衰减校正的滤过反投影(FBP)算法重建各个图像。然后，将一次通过中从所有5个床位置的获得的图像进行比对产生最终复合图像(即，从来自床位置1到5的每一组序列图像产生单一复合图像)，这些复合图像覆盖了成像研究的全程。目测检查最终图像，从而注意到可见的放射性示踪剂摄取(即脾、肾、膀胱)和背景组织(肌肉)的区域(图6)。¹⁸F-E01 Adnectin的背景积累非常低，在诸如肌肉的背景组织中几乎没有可见的信号。另外，基于mRNA表达，在脾脏中验证了摄取，这被认为是PD-L1(+)。因此，在食蟹猴中的研究证明了在内源PD-L1情况下高灵敏度PD-L1成像的潜力。

总体而言，在啮齿动物和食蟹猴中的PET研究显示，⁶⁴Cu和¹⁸F标记的抗人PD-L1Adnectin提供了用于体内标记PD-L1阳性组织的强力且特异的探针，其具有以高灵敏度检测具有低水平PD-L1表达的组织的潜力。

还用抗PD-L1抗体进行了体内成像实验，并且这种成像剂检测的区域是与用PD-L1成像剂检测相同的区域，因此证实抗PD-L1 Adnectin成像剂成功检测到了体内PD-L1阳性细胞。

实施例16：用[¹⁸F]-E01抗PD-L1 Adnectin进行人和异种移植物组织的体外放射自显影

将人肺肿瘤组织包埋在OCT中，并在2-甲基丁烷中冷却2-5分钟直到冻住。将样品在-80℃度冰箱中储存直到使用。人异种移植组织也包括在测定法中。通过将4×10⁶个hPD-L1(+)L2987细胞和1.5×10⁶个hPD-L1(-)HT-29t细胞皮下引入nu/nu小鼠的相对侧中产生携带双侧异种移植物的小鼠。一旦所得到的异种移植肿瘤达到适当的大小(大约200-300mm³)，将小鼠用2％异氟烷麻醉，并通过颈脱位法处死。将新鲜的肿瘤组织切下，浸入OCT中，并且在2-甲基丁烷中冷却2-5分钟直到冷冻。然后，将组织包裹在箔/袋中，并在-80℃储存直到使用。对于所有组织(人肺肿瘤和异种移植物)，使用低温恒温器切割5μm厚度的切片(收集为2个切片/载玻片)，将其解冻固定在玻璃显微镜载玻片上，并允许风干大约30分钟。

使用以下条件进行分别用0.025nM、0.25nM、2.5nM和25nM的冷(未标记)A02Adnectin和25nM非PD-L1结合性Adnectin的阻断研究。将各个载玻片(每个浓度1个载玻片)置于塑料载玻片盒中，并在Dako无血清蛋白质封闭溶液中预温育30分钟。然后，将载玻片转移到玻璃载玻片温育室中进一步温育。另外，通过用300ml的PBS+0.5％BSA稀释10.6μl初始储备放射性配体溶液(实验时7064nM)产生0.25nM ¹⁸F-A02 Adnectin的储备溶液。从该储备溶液中，向每个温育室中加入40ml。这些室之一仅含有放射性配体缓冲溶液，其被称为总结合部分。其他温育室接受40ml的该储备溶液以及相关浓度的封闭化合物(0.025nM、0.25nM、2.5nM或25nM的未标记的A02 Adnectin或25nM的未标记的非PD-L1结合性Adnectin)。将载玻片在单独的缓冲溶液中在室温下温育1小时以达到最大结合。温育后，从温育溶液中取出来自每个处理组的载玻片，并且置于冰冷的洗涤缓冲液(PBS+0.5％BSA)中3分钟，分4次冲洗。然后，将载玻片在冷空气流下干燥大约30分钟。通过将载玻片置于成像板(BAS-SR3545S)上在室温过夜，将风干的载玻片暴露。使用生物成像分析仪(Fujifilm FluorescentImage Analyzer,FLA-9000)扫描成像板。放射自显影图像的像素大小为100μm。使用Multi-Gauge软件进行图像分析。在所有研究组中，绘制感兴趣区域(ROI)以围绕整个肿瘤组织。根据这些ROI，量化来自组织相关放射性的放射自显影信号。

在人肺肿瘤切片以及人异种移植物切片两者中，使用未标记的A02 Adnectin的4种不同浓度(0.025nM、0.25nM、2.5nM和25nM)，确定了¹⁸F-A02 Adnectin放射性配体与总结合部分相比的表观位移。在添加未标记的A02 Adnectin的所有组织切片中都见到了¹⁸F-A02的剂量依赖性位移，而与总结合相比，25nM非PD-L1结合性Adnectin在所有组织中显示最小的阻断(图7)。

对来自每种组织的系列5μm组织切片进行抗人PD-L1免疫组织化学程序，以验证样品中PD-L1抗原表达的水平(图8)。

总之，这些结果提供了在人肺肿瘤样品以及人异种移植组织中PD-L1的直接可视化。各组织中放射性配体结合水平对应于通过IHC得到的冷冻切片的PD-L1染色强度。另外，用未标记的抗PD-L1 A02 Adnectin对受体的剂量依赖性阻断(以及用未标记的非PD-L1结合性Adnectin时的缺乏阻断)进一步验证了¹⁸F-A02在使用PET成像的PD-L1组织表达可视化中的用处。

实施例17：使用商业GE TRACERlab FX2 N合成单元，按照放射合成通用程序自动化制备[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶

程序：

使用非盒式(non-cassette type)GE TRACERlab FX2 N合成模块进行[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶的自动化合成。在表4中总结了合成单元的设置。将[¹⁸F]-氟化物水溶液(2.0ml，29.6Gbq/800mCi)递送至Sep-Pak LightQMA[在使用前依次用5ml的0.5M碳酸氢钾、5ml的去离子水和5ml的乙腈将Sep-Pak lightQMA筒预处理]。完成此转移后，通过将洗脱混合物(来自“V1”)添加到反应器中从QMA Sep-Pak释放[¹⁸F]氟化物水溶液。在温和氮气流和真空下蒸发溶剂。将前体溶液(来自“V3”)添加到干燥的穴状配体残留物，并且将此反应混合物在120℃加热10分钟。然后，将4ml蒸馏水(来自“V4”)添加到反应器中的粗反应混合物，并且将该混合物经由液体传感器转移到半制备HPLC的5ml样品注射环中，所述液体传感器控制上样结束。将混合物上样到半制备HPLC柱(Luna C18(2).250x10mm,Phenomenex)上。将0.1％三氟乙酸水溶液中的35％乙腈的混合物以每分钟4.6ml的速率冲洗通过柱。将该产物从这个HPLC柱收集到含有15ml蒸馏水的稀释烧瓶中，并将其全部内容物转移到tC18 1克固相萃取筒。用3ml乙醇从这个筒(来自“V14”)释放352mCi(13GBq)的[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶，并可将其用于通过利用与含有炔类的适当的生物制剂的“点击”叠氮化物-炔反应生成¹⁸F标记的生物制品。

表4

实施例18：使用IBA Synthera合成单元按照放射合成通用程序自动化制备[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶

程序：

使用盒式(cassette type)IBA Synthera合成模块和适当组装的积分仪流体处理器试剂盒(integrator fluidic processor kit)进行[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶的自动化合成。积分仪流体处理器(IFP)试剂盒装载有用于该合成的适当前体，并且被概括在表5中。在Varian HPLC单元上进行纯化。通过HPLC单元上的稳定氮气流控制HPLC注射环的填充。表5中总结了两种自动化的设置。将[¹⁸F]-氟化物水溶液(2.0ml，29.6Gbq/800mCi)递送至Sep-Pak Light QMA[在使用前依次用5ml的0.5M碳酸氢钾、5ml的去离子水和5ml的乙腈将Sep-Pak light QMA筒预处理]。完成此转移后，通过将洗脱混合物(来自“V1”)添加到反应器中从QMA Sep-Pak释放[¹⁸F]氟化物水溶液。在温和氮气流和真空下蒸发溶剂。将前体溶液(来自“V2”)添加到干燥的穴状配体残留物，并且将此反应混合物在120℃加热10分钟。然后，将3ml蒸馏水(来自“V4”)添加到反应器中的粗反应混合物，并且将该混合物经由液体传感器转移到半制备HPLC的5ml样品注射环中，所述液体传感器控制上样结束。将混合物上样到半制备HPLC柱(Luna C18(2).250x10mm,Phenomenex)上。将0.1％三氟乙酸水溶液中的35％乙腈的混合物以每分钟4.6ml的速率冲洗通过柱。将该产物从这个HPLC柱收集到含有15ml蒸馏水的稀释烧瓶中，并将其全部内容物转移到tC18 1克固相萃取筒。用3ml乙醇从这个筒释放325mCi(12GBq)的[¹⁸F]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶，并可将其用于通过利用与含有炔类的适当的生物制剂的“点击”叠氮化物-炔反应生成¹⁸F标记的生物制品。

表5

实施例19：基于⁶⁸Ga的抗PD-L1 Adnectin探针的合成

⁶⁸Ga-E01-NODAGA的合成_

用32mg乙酸钠(NaOAc)在环境温度中和0.1N盐酸溶液中的[⁶⁸Ga]-氯化镓4分钟，搅拌所得溶液以确保适当混合整个体积。然后，将此溶液添加到E01-NODAGA(15μL的1.3mg/mL)溶液，并且将粗反应物温和移液以允许混合，接着在环境温度下静置15分钟。将粗反应混合物的内容物转移到PD-10脱盐柱，所述脱盐柱在样品上样之前用20mL的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)缓冲液预活化。向柱添加另外的1.5mL的1XPBS，接着是另外的0.8ml1XPBS溶液，并且弃去这些级分。然后在PD-10柱的1.4mL洗脱液之后收集[⁶⁸Ga]-E01-NODAGA以给出5.78mCi(214MBq)，为期望的产物。使用Agilent PLRP-S HPLC柱，使用反相HPLC系统测量质量控制，大小：250x 4.60mm，8μm，280nm，并且流动相为乙腈和在蒸馏水中的0.1％甲酸。使用梯度法，其中乙腈的百分比在30分钟的时间范围内从10％线性增加到45％。在HPLC色谱图的22分钟标记处将[⁶⁸Ga]-E01-NODAGA与参考标准品共洗脱。使用该方法测得放射化学纯度为98％。同样使用大小排阻色谱法在20分钟标记处将[⁶⁸Ga]-E01-NODAGA与参考物质共洗脱，(SEC)柱：GE Superdex 200GL大小：10x 300mm，280nm。

实施例20：[¹⁹F]-E01抗PD-L1 Adnectin的药代动力学

进行以下实验以比较¹⁹F标记的-E01抗PD-L1 Adnectin和E01-4PEG-DBCO(未标记的抗PD-L1-Adnectin-DBCO前体)在食蟹猴中的药代动力学(n＝3)。这是一项交叉设计研究，各剂量之间有2周的洗脱期。收集血清样品，使用不区分E01-4PEG-DBCO与[¹⁹F]-E01的特异性adnectin结合试剂的LBA、或区分E01-4PEG-DBCO与[¹⁹F]-E01的LC/MS测定法进行分析。

PK参数的示总结于表6中。

表6

	[<sup>19</sup>F]-E01	E01-4PEG-DBCO
			AUC(INF)(μg*h/mL)	4.72±0.79	2.92±0.40
CLTs(mL/min/kg)	4.54±0.81	5.78±0.76
			Vss(L/kg)	0.29±0.05	0.40±0.04
T-HALF(h)	1.69±0.13	1.65±0.13
			MRT(h)	1.05±0.06	1.14±0.05

在对食蟹猴的静脉注射剂量之后，两项研究中[¹⁹F]-E01的CLT都是低的。T-HALF也很短，约为1.7小时。E01-4PEG-DBCO的PK类似于[¹⁹F]-E01的PK。通过LC/MS得到的PK参数也相似。

表3：序列表

等效形式

本领域技术人员将认识到、或能够确定使用不超出常规的实验、本文所述的具体实施方案的许多等效形式。这样的等效形式预期被下列权利要求涵盖。

Claims

1.一种可视化受试者中的PD-L1蛋白的方法，其包括：

(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量对受试者施用PD-L1成像剂；和

(b)在步骤(a)之后约30-120分钟对受试者进行PET扫描。

2.权利要求1的方法，其中PD-L1成像剂的剂量为约6mCi(±10％)。

3.权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)之后约60-100分钟时进行步骤(b)的PET扫描。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述受试者是患有癌症的受试者。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述受试者患有至少一种肿瘤。

6.权利要求4-5中任一项的方法，其用于测定受试者肿瘤中PD-L1蛋白的水平。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其用于确定受试者是否可能对用免疫肿瘤学药剂治疗有反应。

8.权利要求7的方法，其用于确定受试者是否可能对用PD-1或PD-L1拮抗剂(例如，纳武单抗、派姆单抗或阿特珠单抗)治疗有反应，其中，如果在一个或多个肿瘤中的PD-L1水平等于或高于需要用PD-1或PD-L1拮抗剂(例如，纳武单抗、派姆单抗或阿特珠单抗)治疗的PD-L1水平，例如，如果超过5％、25％、50％或更多的肿瘤细胞表达PD-L1，那么受试者可能对用PD-1或PD-L1拮抗剂治疗有反应。

9.权利要求1-6中任一项的方法，其中，如果在一个或多个肿瘤中的PD-L1水平等于或高于需要用PD-1或PD-L1拮抗剂(例如，纳武单抗、派姆单抗或阿特珠单抗)治疗的PD-L1水平，例如，如果超过5％、25％、50％或更多的肿瘤细胞表达PD-L1，那么用PD-1或PD-L1拮抗剂治疗所述受试者。

10.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述受试者正在接受治疗剂治疗。

11.权利要求10的方法，其中所述治疗剂是免疫治疗剂。

12.权利要求11的方法，其中所述免疫治疗剂是PD-1拮抗剂。

13.权利要求12的方法，其中所述PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。

14.权利要求13的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗或阿特珠单抗。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述PD-L1成像剂是与人PD-L1特异性结合的蛋白质，其中所述蛋白质与可检测试剂连接。

16.权利要求15的方法，其中所述PD-L1成像剂是抗PD-L1 Adnectin。

17.权利要求15-16中任一项的方法，其中所述可检测试剂是放射性PET示踪剂。

18.权利要求17的方法，其中所述放射性PET示踪剂是¹⁸F。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述PD-L1成像剂是用¹⁸F标记的抗人PD-L1Adnectin。

20.权利要求10-19中任一项的方法，其中在第一次施用所述治疗剂之前将所述成像剂施用于受试者。

21.权利要求10-19中任一项的方法，其中在施用第一个剂量的所述治疗剂之后将所述成像剂施用于受试者。

22.权利要求21中任一项的方法，其中在施用第一个剂量的所述治疗剂之后1-7天将所述成像剂施用于受试者。

23.权利要求10-22中任一项的方法，其中在施用第一个剂量的治疗剂之前以及在施用第一个剂量的治疗剂之后1-7天将成像剂施用于受试者。

24.权利要求16-23中任一项的方法，其中所述抗人PD-L1 Adnectin包含纤连蛋白III型第十结构域(¹⁰Fn3)，其中(a)该¹⁰Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环；(b)该¹⁰Fn3的选自BC、DE和FG环的至少一个环具有相对于人¹⁰Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环序列改变的氨基酸序列；并且(c)该多肽与人PD-L1特异性结合。

25.权利要求24的方法，其中所述多肽以小于500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM或100pM的K_D与人PD-L1结合。

26.权利要求25的方法，其中所述多肽以1nM或更小的K_D与人PD-L1结合。

27.权利要求24-26中任一项的方法，其中所述BC、DE和FG环包含以下氨基酸序列：

(a)分别为SEQ ID NO:6、7和8；

(b)分别为SEQ ID NO:21、22和23；

(c)分别为SEQ ID NO:36、37和38；

(d)分别为SEQ ID NO:51、52和53；

(e)分别为SEQ ID NO:66、67和68；

(f)分别为SEQ ID NO:81、82和83；或

(g)分别为SEQ ID NO:97、98和99。

28.权利要求24-27中任一项的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80或96至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

29.权利要求28的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:80至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

30.权利要求28的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:96至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

31.权利要求24-30中任一项的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80或96的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

32.权利要求24-30中任一项的方法，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91和100-107。

33.权利要求24-30和32中任一项的方法，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91和100-107。

34.权利要求24-33中任一项的方法，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:112-121的N末端前导序列、和/或选自SEQ ID NO:122-156的C末端尾。

35.权利要求24-34中任一项的方法，其中所述多肽包含一个或多个选自聚乙二醇和唾液酸的药代动力学(PK)模块。

36.权利要求35的方法，其中所述PK模块和所述多肽经由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合糖或聚乙二醇模块连接。

37.权利要求36的方法，其中所述PK模块和所述多肽经由具有选自SEQ ID NO:167-216的氨基酸序列的接头连接。

38.权利要求1-37中任一项的方法，其中所述成像剂包含¹⁸F放射性标记的辅基和双功能缀合(BFC)模块，其中所述成像剂具有以下结构，

39.权利要求38的方法，其中¹⁸F放射性标记的辅基具有以下结构，

40.权利要求38或39的方法，其中[O(CH₂)₂]_x模块相对于吡啶环上的氮以1-3构型存在。

41.权利要求38或39的方法，其中[O(CH₂)₂]_x模块相对于吡啶环上的氮以1-2构型存在。

42.权利要求38或39的方法，其中[O(CH₂)₂]_x模块相对于吡啶环上的氮以1-4构型存在。

43.权利要求38的方法，其中¹⁸F放射性标记的辅基具有以下结构，

44.权利要求38至41中任一项的方法，其中x是2至6的整数。

45.权利要求44的方法，其中x是3至5的整数。

46.权利要求45的方法，其中x是4。

47.权利要求44-46中任一项的方法，其中[O(CH₂)₂]_x模块相对于吡啶环上的氮以1-3构型存在。

48.权利要求38-47中任一项的方法，其中所述吡啶环包含不干扰氟化反应的另外的取代基。

49.权利要求48的方法，其中所述吡啶环上的取代基是C_1-6烷基。

50.权利要求49的方法，其中所述取代基是甲基、乙基或丙基。

51.权利要求38的方法，其中¹⁸F放射性标记的辅基具有以下结构，

52.权利要求38-51中任一项的方法，其中所述成像剂包含¹⁸F放射性标记的辅基和双功能缀合(BFC)模块，其中所述成像剂具有以下结构

其中“OPEG”是[O(CH₂)₂]_x，且x是1至8的整数，或其药学上可接受的盐，并且其中“蛋白质”是包含在权利要求38-51中任一项的成像剂中的多肽。

53.权利要求52的方法，其中x是2至6的整数，或其药学上可接受的盐。

54.权利要求53的方法，其中x是3至5的整数，或其药学上可接受的盐。

55.权利要求54的方法，其中x是4，或其药学上可接受的盐。

56.权利要求38至55中任一项的方法，其中BFC是包含反应性基团的环辛炔，所述反应性基团与所述蛋白质上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键。

57.权利要求56的方法，其中环辛炔选自下组：二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)和二苯并环辛炔(DBCO)。

58.权利要求57的方法，其中所述环辛炔是DBCO。

59.权利要求38至58中任一项的方法，其中BFC进一步包含聚乙二醇(PEG)_y间隔臂，其中y是1至8的整数。

60.权利要求59的方法，其中y是2至6的整数。

61.权利要求60的方法，其中y是4或5。

62.权利要求59-61中任一项的方法，其中BFC是DBCO-PEG4-NHS-酯、DBCO-磺基-NHS-酯、DBCO-PEG4-酸、DBCO-PEG4-胺或DBCO-PEG4-马来酰亚胺。

63.权利要求52-62中任一项的方法，其中所述BFC是DBCO-PEG4-马来酰亚胺。

64.权利要求38的方法，其中所述成像剂具有以下结构：

其中X是包含SEQ ID NO:13、28、43、58、73、88和104中任一氨基酸序列的多肽。

65.权利要求64的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:88中列出的氨基酸序列。

66.权利要求64的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:104中列出的氨基酸序列。