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CN101616911A - 具有单个氨基酸的化学连接物及其偶联物 - Google Patents

具有单个氨基酸的化学连接物及其偶联物 Download PDF

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CN101616911A CN200880005895A CN200880005895A CN101616911A CN 101616911 A CN101616911 A CN 101616911A CN 200880005895 A CN200880005895 A CN 200880005895A CN 200880005895 A CN200880005895 A CN 200880005895A CN 101616911 A CN101616911 A CN 101616911A
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CN
China
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compound
alkyl
group
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CN200880005895A
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English (en)
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L·陈
S·冈沃
V·古尔拉维斯
N·龙伯格
Q·张
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ER Squibb and Sons LLC
Original Assignee
Medarex LLC
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Abstract

本发明提供的药物－配体偶联物是强力的细胞毒素并且包括在药物与配体之间的一个连接物，其中该连接物具有一个单一的氨基酸。本发明还针对含有该药物－配体偶联物的组合物以及使用它们的治疗方法。

Description

具有单个氨基酸的化学连接物及其偶联物
相关申请的交互引用
本申请请求2007年2月21日提交的美国临时专利申请号60/891,028号的优先权，特此要求它们在35U.S.C.§119之下的权益，并且其披露内容通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明提供附接至药物以及配体、并且可在活体内切割的具有单个氨基酸的连接物。该连接物可用于形成本发明的细胞毒素的药物前体以及偶联物，连同其他诊断部分与治疗部分。
发明背景
许多治疗剂(特别是那些在癌症化学治疗中尤其有效的治疗剂)在活体内经常表现出急性毒性，特别是骨髓毒性以及黏膜毒性连同慢性心脏毒性以及神经毒性。这种高毒性可限制其应用。令人希望的是发展出更多并且更安全的特异性治疗剂(特别是抗肿瘤剂)以达到抗肿瘤细胞的更高的功效并且减小这些产品的副作用(毒性、破坏非肿瘤细胞等)的数目以及严重度。一些现存治疗剂的另一个困难是它们在血浆中的稳定性小于最佳。添加官能团来稳定这些化合物导致活性的显著降低。因此，识别一些方式来稳定化合物同时维持可接受的治疗活性水平，这是令人希望的。
数十年来，对于更加具有选择性的细胞毒剂的研究一直是极为活跃的，限制剂量的毒性(即细胞毒素对正常组织产生的非希望的活性)是癌症治疗失败的主要原因之一。例如，CC-1065以及多卡霉素类(duocarmycins)已知是极为强力的细胞毒素。
Upjohn公司首次在1981年从泽耳链霉菌(Streptomyceszelensis)中分离了CC-1065(Hanka et al.，J.Antibiot.31：1211(1978)；Martin et al.，J.Antibiot.33：902(1980)；Martin etal.，J.Antibiot.34：1119(1981))并且发现CC-1065在体外和在实验动物中都具有有效的抗肿瘤与杀菌活性(Li et al.，Cancer Res.42：999(1982))。CC-1065在小沟内与双链B-DNA相结合(Swenson etal.，Cancer Res.42：2821(1982))，其中序列优先为5′-d(A/GNTTA)-3′以及5′-d(AAAAA)-3′，并利用其在分子中呈现的CPI左旋(left-hand)单位对3’腺嘌呤的N3位置进行烷基化(Hurleyet al.，Science 226：843(1984))。尽管CC-1065具有有效的广泛的抗癌活性，但因为CC-1065在实验动物引起了迟发性死亡，所以它不能被用于人类。
CC-1065以及多卡霉素的许多同系物以及衍生物在本领域是已知的。已对许多化合物的结构、合成以及特性的研究进行综述。参见，例如，Boger et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：1438(1996)；以及Boger et al.，Chem.Rev.97：787(1997)。
Kyowa Hakko Kogya Co.，Ltd.的一个团队已经制备了许多CC-1065衍生物。参见，例如，美国专利号5,101,038；5,641,780；5,187,186；5,070,092；5,703,080；5,070,092；5,641,780；5,101,038；以及5,084,468；以及已公开的PCT申请WO 96/10405以及已公开的欧洲申请0537575A1。
Upjohn Company(Pharmacia Upjohn)已经在积极制备CC-1065的衍生物。参见，例如，美国专利号5,739,350；4,978,757、5,332,837、以及4,912,227。
研究也已集中于处在药物前体形式的新治疗剂的开发，药物前体形式是能够在体内通过其结构的某种化学的或酶的修饰而被转变成药物(活性治疗化合物)的化合物。用于降低毒性的目的，这种转变优选地局限于作用部位或靶标组织结构域，而非循环系统或非靶标组织。然而，即使药物前体也有问题，如由于在药物前体到达病人体内所希望的部位之前存在着分解药物前体或激活药物前体的酶，导致许多药物前体特征为在血液中以及血清中的低稳定性。
必治妥梅尔施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)已经说明了特定溶酶体酶可切割的抗肿瘤药物偶联物。参见，例如美国专利号6,214,345。这个专利提供了一个氨基苄基氧羰基。
西雅图基因公司(Seattle Genetics)已公布了多项申请，美国专利申请2003/0096743以及美国专利申请2003/0130189，它们说明了在药物递送剂中的对氨基苄醚类。在这些申请中说明的连接物限于氨基苄醚组合物。
其他团体也说明了连接物。例如参见de Groot et al.，J.Med.Chem.42，5277(1999)；de Groot et al.J.Org.Chem.43，3093(2000)；de Groot et al.，J.Med.Chem.66，8815，(2001)；WO02/083180；Carl et al.，J.Med.Chem.Lett.24，479，(1981)；Dubowchik et al.，Bioorg&Med.Chem.Lett.8，3347(1998)。这些连接物包括氨基苄醚间隔物、延长的电子级联以及环化间隔物系统、环化消除间隔物，例如w-氨基氨基羰基以及对氨基苄基氧羰基连接物。
细胞毒素药物的稳定性，包括活体内稳定性仍是一个有待着手解决的重大议题。此外，多种化合物的毒性使其较为无用，所以需要可降低药物毒性的组合物，如形成可切割的药物前体。因此，尽管有本领域的进展，仍然需要开发用于哺乳动物以及特别为人类的治疗的改良的治疗剂，更确切地为细胞毒素，该细胞毒素相对于具有相似结构的已知化合物表现出作用的高特异性、降低的毒性、以及改善的血液中的稳定性。本发明应对了这些需要。
发明概要
本发明涉及药物-配体偶联物，其中该药物与配体通过一个连接物相连接。这些偶联物是强力的细胞毒素，能够以活性形式被选择性递送至有关的作用部位，然后被切割来释放活性药物。
一个实施方案是具有以下化学式的一种化合物
Figure A20088000589500141
其中
L1为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂烷基；
m是一个整数0、1、2、3、4、5、或6；
AA1是独立地选自下组的一个氨基酸，该组的构成为：天然氨基酸类和非天然α氨基酸类；
L2为取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；
L3为取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基；
o是0或1；
L4是一个连接物成员；
p是0或1；
X4是选自下组的一个成员，该组的构成为受保护的反应性官能团、不受保护的反应性官能团、可检测的标记、以及靶向剂；并且
D包括一种结构：
Figure A20088000589500142
其中环状体系A是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基；
E以及G是独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、杂原子、以及单键中的一员，或E与G相接合来形成一个环状体系，该环状体系选自取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂芳基、以及取代和未取代的杂环烷基；
X是选自O、S以及NR23中的一员；
R23是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、或酰基；
R3为OR11，
其中R11是H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12、或SiR12R13R14，
其中R12、R13以及R14是独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、以及取代和未取代的芳基中的一员，其中R12以及R13与它们所附联的氮原子或碳原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系；
R4、R4’、R5、以及R5’是独立地选自下组的成员，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、SO3、SO2R15、NR15R16、NR16C(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，或者R4、R4’、R5以及R5’的任何相邻的一对与它们所附联的碳原子一起相接合以形成一个具有4至6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系；
其中
n是1至20的整数；
R15以及R16独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂芳基、取代和未取代的杂环烷基、以及取代和未取代的肽基，其中R15以及R16与它们所附联的氮原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系；
R6是一个单键，该单键存在或不存在，并且当其存在时，R6与R7相接合以形成一个环丙基的环；并且
R7是所述环丙基的环中与R6相接合的CH2-X1或CH2-，其中
X1为离去基团，
其中R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15、或R16中的至少一个连接D至化合物的其余部分；
或其药学上可接受的盐。
任何这些化合物可用作、或用来形成药物-配体偶联物。
在又另一个方面，本发明是关于药学配制品。这种配制品典型包含本发明的偶联化合物以及药学上可接受的载体。
在又另一个方面，本发明涉及使用本发明的偶联化合物的方法。例如，本发明提供一种杀细胞的方法，其中本发明的偶联化合物以足够杀死该细胞的量给予该细胞。在一个优选的实施方案中，该细胞为肿瘤细胞。在另一个实施方案中，本发明提供一种在哺乳动物受试者体内使肿瘤的生长延迟或停止的方法，其中本发明的偶联化合物是以足够使肿瘤生长延迟或停止的量给予该受试者。
从以下详细说明部分的综述本发明的其他方面、优点以及目的将是清楚的。
附图简要说明
参照以下各图来说明本发明的非限制性且非排他性实施方案。在附图中，(除非另外指明)类似的参考号是指各图中类似的部分。
为了更好理解本发明，将参照以下详细说明部分结合附图研读作说明，附图中：
图1至图9是活体内研究中平均肿瘤体积、肿瘤体积中位数、以及％体重变化中位数分别相对于给药后天数的曲线图。
本发明的详细说明
缩写
“Ala”表示丙氨酸。
“Boc”表示叔丁氧羰基。
“CPI”表示环丙吡咯并吲哚。
“Cbz”表示苄氧羰基。
“DCM”表示二氯甲烷。
“DDQ”表示2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌。
“DIPEA”表示二异丙基乙胺。
“DMDA”表示N，N’-二甲基伸乙基二胺。
“RBF”表示圆底瓶。
“DMF”表示N，B-二甲基甲酰胺。
“HATU”表示N-[[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-1-基]亚甲基]-N-甲基六氟磷酸甲铵N-氧化物。
符号“E”表示一个用酶可切割的基团。
“EDCI”表示1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。
“FMOC”表示9-芴甲氧羰基。
“HOAt”表示7-氮杂-1-羟基苯并三唑。
“Leu”表示亮氨酸。
“PABA”表示对氨基苯甲酸。
“PEG”表示聚乙二醇。
“PMB”表示对甲氧苄基。
“TBAF”表示氟化四丁基铵。
“TBSO”表示叔丁基二甲基硅烷基醚。
“TEA”表示三乙胺。
“TFA”表示三氟乙酸。
“EDC”表示(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)。
“TBTU”表示(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲鎓)。
“HOBT”表示N-羟基苯并三唑。
符号“Q”表示治疗剂、诊断剂、或可检测的标记。
定义
除非另外限定，此处所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员所通常理解的相同意义。总体而言，此处所使用的命名法以及以下说明的细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学以及杂交中的实验室程序都是本领域所熟知并且常用的程序。使用标准技术进行核酸合成以及肽合成。总体上，酶促反应以及纯化步骤是根据制造商的说明书来进行的。技术以及程序总体上是根据本领域的常规方法以及本文件全文所提供的不同的一般性参考文献来进行(总体上参见，Sambrook et al.MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，该文献通过引用结合在此)，将它们提供用于贯穿本文件全文。此处所使用的命名以及以下说明的分析化学以及有机合成的实验室程序为本领域所熟知并且常用的程序。标准技术或其修改用于化学合成以及化学分析。
术语“治疗剂”旨在表示一种化合物，当该化合物以一种治疗上有效的量存在时，可对哺乳动物产生一种所希望的治疗效果。用于治疗癌症，希望该治疗剂也能够进入靶标细胞。
术语“细胞毒素”旨在表示一种治疗剂，该治疗剂对癌细胞具有所希望的细胞毒性的效应。细胞毒性一词表示该药剂可中止细胞的生长或杀死细胞。示例性的细胞毒素包括(通过举例而不限于)考布他汀、多卡霉素、CC-1065抗肿瘤抗生素、蒽环类以及相关化合物。其他细胞毒素包括真菌毒素、蓖麻毒蛋白及其类似物、刺孢霉素、阿霉素(doxirubicin)以及美登素衍生物。
“药物前体”以及“药物偶联物”二词在此处互换使用。二术语皆是指一种化合物，该化合物当仍然呈偶联形式时对细胞相对无害，但通过位于靶标细胞内部或靶标细胞附近的条件(例如酶)可被选择性降解成为药理学的活性形式。
术语“标记物”旨在表示在肿瘤或其他医疗病情的表征中有用的一种化合物，例如可用于诊断、肿瘤的进展及由肿瘤细胞所分泌的各项因子的测定的化合物。标记物被视为“诊断剂”的一个子集。
与酶的切割结合所使用的术语“可选择的”是指连接物部分的切割速率高于具有随机氨基酸序列的肽的切割速率。
术语“靶向基团”及“靶向剂”旨在表示一个部分，该部分(1)可导引它所附联的实体(例如治疗剂或标记物)至靶标细胞，例如导引至特定类型的肿瘤细胞或(2)优选地在靶标组织(例如肿瘤)被激活。靶定基或靶向剂可以是小分子，旨在包括非肽类及肽类二者。靶定基也可以是大分子，包括糖类、凝集素、受体、受体的配体、蛋白质(如BSA、抗体等)。在本发明的一个优选的实施方案中，靶向基团是抗体或抗体片段，更优选地是单克隆抗体或单克隆抗体片段。
术语“自消间隔物”指一个双官能的化学部分，该化学部分可共价连接两个化学部分到一个正常稳定的三联分子中。如果键合至第一部分的键被切割，则该自消间隔物可自发从第二部分分离。
术语“可检测的标记”旨在表示具有可检测的物理特性或化学特性的一个部分。
术语“可切割的基团”旨在表示在活体内不稳定的部分。优选地“可切割的基团”允许从偶联物的其余部分切割标记物或治疗剂而让该标记物或治疗剂激活。就运作上的定义而言，连接物优选在活体内由生物环境进行切割。这种切割可由任何方法来进行而没有限制，例如酶法、还原法、pH法等。优选地，可切割的基团被选择以使得激活发生在所希望的作用部位，该希望的作用部位可位于或接近于靶标细胞(例如癌细胞)或组织的位置，如在治疗剂作用部位或标记物活性部位。此类切割可以是酶促法的，并且示例性经酶可切割的基团包括天然氨基酸或以天然氨基酸为端基的肽序列，并且这些基团在它们的羧基端被附联至该连接物。虽然切割速率提升的程度对本发明并非关键性的，但可切割连接物的优选实例是其中至少约10％的可切割基团在给药后的24小时内在血流中进行切割，最优选是至少约35％。
术语“配体”表示与受体、底物、抗原决定簇、或靶细胞或靶组织上的其他结合部位进行特异性结合或反应性关联或复合的任何分子。配体的实例包括抗体及其片段(例如单克隆抗体或其片段)、酶(例如纤维蛋白溶酶)、生物反应调节剂(例如白介素、干扰素、红细胞生成素、或集落刺激因子)、肽激素、及其抗原结合片段。
术语“环化反应”当用来表示连接物或其任何部分的环化时，指示该连接物环化成为一个环，并开始药物-配体复合物的分离。环化率可于非原位测定，并且当至少形成90％、95％、或100％产物时反应完成。
术语“多肽”、“肽”、以及“蛋白”在本文中可以互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语应用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，连同应用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。这些术语也涵盖术语“抗体”。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸以及合成氨基酸，连同以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物以及氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是遗传密码所编码的氨基酸，连同后来经过修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸(O-phosphoserine)。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即一个α碳，该α碳结合至一个氢、一个羧基、一个氨基、以及一个R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基硫鎓。这些类似物具有经修饰的R基(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但仍然保持有与天然氨基酸相同的基本化学结构。一种可以使用的氨基酸具体是瓜氨酸，它是精氨酸的前体，并且参与肝脏中尿素的形成。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然氨基酸的方式发挥功能的化学化合物。术语“非天然氨基酸”旨在表示以上所说明的20种天然氨基酸的“D”立体化学形式。进一步须了解术语非天然氨基酸包括天然氨基酸的同系物以及天然氨基酸的合成修饰的形式。合成修饰的形式包括但不限于具有至多2个碳原子缩短或延长的亚烷基链的氨基酸、包含可任选地取代的芳基基团的氨基酸、以及包含卤化基团(优选的为卤化烷基和芳基)的氨基酸。当附联至本发明的连接物或偶联物时，氨基酸是呈“氨基酸支链”形式，此处氨基酸的羧酸基已是用酮基(C(O))替换。因此，例如丙氨酸支链为-C(O)-CH(NH2)-CH3等。
氨基酸和肽由封端基团保护。封闭基团是保护氨基酸或肽的N-端避免发生不希望的反应的一个原子或一个化学部分，并可在药物-配体偶联物的合成过程中使用。整个合成期间封端基团须维持附联至N-端，而在药物偶联物合成完成后，由化学或其他条件可选择性地将其移除。适合用于N-端保护作用的封端基团在肽化学领域是众所周知的。封端基团的实例包括但不限于氢、D-氨基酸、以及苄氧羰基(Cbz)氯化物。
“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及呈单链或双链形式的聚合物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物、或经修饰的主链残基、或连接的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的、以及非天然存在的，具有类似于参考核苷酸的相似结合特性，并且是以类似于参考核苷酸的方式代谢。这些类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯类、氨基磷酸酯类、甲基磷酸酯类、手性-甲基磷酸酯类、2-O-甲基核糖核苷酸类、肽-核酸(PNA)。
除非另外指出，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子的替换)以及互补序列，连同明确表明的序列。确切地说，简并密码子的替换可通过产生序列来达成，在该序列中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置是用混合碱基和/或脱氧肌苷的残基进行替换，(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸是与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸、以及多核苷酸互换使用。
符号
Figure A20088000589500211
不论是用作一个键或显示为垂直于一个键时均表明一个点，在该点处所展示的部分(moiety)被附联至该分子的其余部分、固相支撑体等。
术语“烷基”其本身或作为另一个取代基的一部分(除非另行说明)表示具有所示碳原子数(即C1-C10表示1至10个碳原子)的一个直链或支链、或环烃基、或它们的组合，它可以是完全饱和的、单不饱和的、或多不饱和的，并且可包括二价基团以及多价基团。饱和烃基的实例包括但不限于以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，以及(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或叁键的基团。不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级的同系物和异构体。除非另外指出，否则该术语“烷基”也意在包括那些在以下详细定义的烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基的烷基定名为“同源烷基”(homoalkyl)。
术语“亚烷基”其本身或作为另一个取代基的一部分表示衍生自烷的二价基团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括那些以下描述为“杂亚烷基”的基团。典型地，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子，其中具有10个或更少的碳原子的那些基团在本发明中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是一般具有八个或更少的碳原子的较短的链烷基或亚烷基基团。
术语“杂烷基”其本身或与另一个术语的组合(除非另行说明)表示由所说明的数目的碳原子以及至少一个杂原子组成的一个稳定的直链或支链、或环烃基、或它们的组合，该杂原子是选自下组，其构成为O、N、Si、以及S，并且其中氮原子、碳原子以及硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、S、以及Si可在杂烷基基团的任何内部位置或在烷基基团附联至分子其余部分的位置被替代。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多2个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3以及-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”其本身或作为另一个取代基的一部分，表示一个衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基基团，杂原子也可占据链末端的任一端或两端(例如亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。术语“杂烷基”以及“杂亚烷基”涵盖聚(乙二醇)及其衍生物(参见例如，Shearwater Polymers Catalog，2001)。再者，对于亚烷基以及杂亚烷基连接基团，书写连接基团的化学式的方向并不表示连接基团的方向。例如化学式-C(O)2R’-表示-C(O)2R’-以及-R’C(O)2-。
与术语“烷基”或“杂烷基”组合使用的术语“低级”是指具有1到6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺酰基”、以及“烷硫基”或(硫烷氧基)都是以它们的常规意义使用，涉及那些分别通过氧原子、氨基基团、SO2基团或硫原子而附联至分子其余部分的烷基。术语“芳基磺酰基”表示通过SO2基团而附联至分子其余部分的芳基，“氢硫基”一词表示SH基团。
总体上，“酰基取代基”也是选自以上给出的基团。如此处所使用，术语“酰基取代基”表示附联于羰基碳并满足其化合价的基团，该羰基碳直接或间接地附联于本发明的化合物的多环核上。
术语“环烷基”以及“杂环烷基”其本身或与其他术语组合(除非另行说明)分别独立地表示取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“杂烷基”的环型形式。此外，至于杂环烷基，杂原子可占据杂环附联至分子其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、以及类似基团。环状结构的杂原子以及碳原子可任选地被氧化。
术语“卤”或“卤素”其本身或作为另一个取代基的一部分(除非另行说明)表示一个氟、氯、溴或碘原子。此外，例如“卤烷基”意在包括单卤烷基以及多卤烷基。术语例如“卤(C1-C4)烷基”意在包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基、以及类似基团。
术语“芳基”(除非另行说明)表示取代或未取代的多不饱和的芳香族烃取代基，它可以是单环或多环(优选的为1环至3环)，这些环稠合在一起或以共价键相连接。术语“杂芳基”涉及含有1至4个杂原子的芳基基团(或芳香环)，这些杂原子选自N、O以及S，其中氮原子、碳原子以及硫原子可任选地被氧化，并且氮原子可任选地被季铵化。杂芳基基团可通过杂原子而附联于分子的其余部分。芳基以及杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、以及6-喹啉基。以上提到的每一个芳基以及杂芳基环状体系的取代基选自以下说明的可接受的取代基的组。“芳基”以及“杂芳基”还涵盖环状体系，其中一个或多个非芳香族环状体系被稠合、或者以其他方式结合至芳基或杂芳基体系上。
简言之，术语“芳基”当用来与其他术语组合(例如芳氧基、芳硫代基、芳烷基)时，包括如以上所定义的芳基环以及杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意在包括那些基团，其中一个芳基基团附联于一个烷基基团(例如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基、以及类似物)，该烷基基团包括这样的烷基基团，其中一个碳原子(例如，亚甲基基团)已被(例如)一个氧原子(如苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基、以及类似物)替换。
以上给出的术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”)各自均包括指定基团的取代形式以及未取代形式。以下提供每个类型基团的优选取代基。
烷基以及杂烷基基团(包括那些经常提到的基团，如亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、以及杂环烯基)的取代基一般分别称为“烷基取代基”以及“杂烷基取代基”，可以是选自下组的一种或多种基团，但不限于：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2，其数目是在0至(2m’+1)的范围，其中m’为这种基团中的碳原子总数。R’、R”、R”’以及R””各自优选的独立地表示氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如由1至3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基基团，或芳烷基基团。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时这些R基团各自均被独立地选为R’、R”、R’”以及R””基团。当R’以及R”附联于同一个氮原子时，它们可与氮原子组合来形成5-元、6-元或7-元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基以及4-吗啉基。由以上取代基的讨论，本领域的技术人员须了解术语“烷基”意在包括这样一些基团，这些基团包括的碳原子与氢基团以外的基团结合，这些基团例如是卤烷基(例如-CF3以及-CH2CF3)以及酰基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3、以及类似基团)。
类似对烷基基团所说明的取代基，芳基取代基以及杂芳基取代基通常分别被称为“芳基取代基”以及“杂芳基取代基”，并且是可变化的并选自例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，其数目是由0至芳香族环状体系的开放价数(open valence)总数的范围；并且其中R’、R”、R”’、以及R””优选的是独立地选自氢、(C1-C8)烷基以及杂烷基、未取代的芳基以及杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基、以及(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，(例如)，当这些基团中多于一个基团存在时这些R基团各自均被独立地选为R’、R”、R’”以及R””基团。
芳基环或杂芳基环的相邻原子上的芳基取代基中的两个可任选地被具有化学式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基所替换，其中T以及U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或一个单键，并且q为0至3的整数。可替代地，在芳基环或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被具有化学式-A-(CH2)r-B-的取代基所替换，其中A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，以及r为1至4的整数。如此所形成的新环的单键中之一可任选地用双键替换。可替代地，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被具有化学式-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-的取代基替换，此处s以及d独立地为0至3的整数，并且X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”以及R”’优选的是独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
如此处所使用，术语“二磷酸酯”包括但不限于含有两个磷酸基团的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括但不限于含有三个磷酸基团的磷酸的酯。例如具有二磷酸酯或三磷酸酯的特定药物包括：
Figure A20088000589500261
Figure A20088000589500271
如此处所使用，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、以及硅(Si)。
符号“R”为通用缩写，代表选自以下各项的一个取代基：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环基的基团。
如此处所使用的术语“药学上可接受的载体”表示一种参与携带或运输化学剂的药学上可接受的材料、组合物、或运载体(vehicle)，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或装胶囊的材料。药学上可接受的载体(carrier)包括药学上可接受的盐类，其中术语“药学上可接受的盐类”包括活性化合物的盐类，依据此处所述化合物中出现的特定取代基而定，该盐类可使用相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物含有相对酸性的官能度时，碱加成盐可通过将中性形式的此类化合物与足量的所希望的碱，净接触或于适当惰性溶剂内接触获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机胺、或镁盐、或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能度时，酸加成盐可通过将中性形式的此类化合物与足量所希望的酸，净接触或于适当惰性溶剂内接触获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自以下无机酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸、或亚磷酸等；连同包括衍生自以下相对无毒的有机酸的盐类，例如乙酸、丙酸、异丁酸、顺丁烯二酸、丙二酸、苯甲酸、丁二酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。也包括氨基酸的盐类(例如精氨酸盐(arginate)等)以及有机酸的盐类(例如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等)(参见例如，Berge et al.，“Pharmaceutical Salts”，Journal ofPharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些特定的化合物含有允许该化合物被转成碱加成盐或酸加成盐的碱性官能度以及酸性官能度二者。
该化合物的中性形式优选是通过盐与碱或与酸接触，以常规的方式分离亲代化合物而再生。该化合物的亲代形式在某些物理特性(例如在极性溶剂中的溶解度)上与各种盐形式不同，但在其他特性上这些盐与用于本发明的目的的化合物的亲代形式是等效的。
除了盐形式之外，本发明提供呈药物前体形式的化合物。此处所述的化合物的药物前体是在生理条件下容易进行化学变化来提供本发明的化合物的那些化合物。此外，在活体外环境下，由化学方法或生物化学方法，可将药物前体转成本发明的化合物。例如，当药物前体置于经皮贴片贮器内部时使用适宜的酶或化学试剂可将药物前体缓慢转成本发明的化合物。
本发明的某些化合物能够以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。总体上，溶剂化形式等效于非溶剂化形式并且被涵盖在本发明的范围之内。本发明的某些化合物可以多结晶的形式或非晶相的形式存在。大体上全部物理形式对本发明的所希望的用途来说都是等效的并且旨在涵盖在本发明的范围之内。
本发明的某些化合物具有非对称碳原子(光学中心)或双键；消旋体、非对映异构体、几何异构体以及个别异构体均涵盖在本发明的范围之内。
本发明的化合物还可以在组成此类化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可以用放射性同位素例如氚(3H)、碘-125(125I)、或碳-14(14C)进行标记。本发明的化合物的全部同位素的变化，无论是放射性还是非放射性的，旨在都涵盖在本发明的范围之内。
术语“附联部分”或“用来附联一个靶向基团的部分”是指允许靶向基团附联至连接物的一个部分。典型的附联基团以举例说明的方式包括但不限于烷基、氨基烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、羟基烷基、烷基-顺丁烯二酰亚胺、烷基-N-羟基丁二酰亚胺、聚(乙二醇)-顺丁烯二酰亚胺以及聚(乙二醇)-N-羟基丁二酰亚胺，它们全部都可进一步被取代。连接物也可具有实际上附接至该靶向基团的附联部分。
如此处所使用，术语“离去基团”是指在反应中由底物所切割的底物的一部分。
如此处所指的术语“抗体”包括完整抗体或其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包含至少两个重(H)链以及两个轻(L)链的一种糖蛋白或其抗原结合部分，其中两条重链以及两条轻链通过双硫键互相连接。每一种重链都是由一个重链可变区(VH)以及一个重链恒定区所组成。重链恒定区是由三个结构域CH1、CH2以及CH3所组成，并且可以是μ、δ、γ、α或ε同同种型。每一种轻链都是由一个轻链可变区(VL)以及一个轻链恒定区所组成。轻链恒定区由一个结构域CL所组成，该结构域可以是κ或λ同种型。VH区以及VL区能够进一步划分为高度可变区，定名为互补决定区(CDR)，其间分散有更保守的、定名为框架区(FR)的多个区域。每个VH以及VL均是由三个CDR以及四个FR按照以下顺序由氨基端排列至羧基端所构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链可变区以及轻链可变区含有一个可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。
如此处所使用，术语抗体的“抗体片段”或“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保持与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。涵盖于术语抗体的“抗体片段”或“抗原结合部分”之内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL以及CH1结构域所组成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH以及CH1结构域所组成的Fd片段；(iv)由抗体的一个单臂的VL以及VH结构域所组成的Fv片段，(v)由VH结构域所组成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL以及VH是由独立的基因所编码的，但是可以使用重组方法通过一个合成连接物将它们连接起来，使它们形成一个单一蛋白链，其中VL区与VH区配对来形成一价分子(称作为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；以及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”之内。这些抗体片段是使用本领域的普通技术人员已知的常规技术获得，并且对这些片段采用与完整抗体相同的方式进行有用性筛选。
如此处所使用，术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物显示了对某一特定表位的单一结合特异性以及亲和力。
可以使用本领域已知的任何一种技术用于单克隆抗体或多克隆抗体的制备，可使用(参见例如Kohler&Milstein，Nature256：495-497(1975)；Kozbor et al.，Immunology Today 4：72(1983)；Cole et al.，pp.77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
多克隆抗体的生产方法为本领域的普通技术人员所已知。近交品系的小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔子使用标准佐剂(例如弗氏佐剂)及标准免疫接种方案用蛋白质进行免疫接种。动物对免疫原制品的免疫反应是通过采集测试血液并通过测定对β亚单元的反应性的效价来进行监测。当获得对免疫原的适当高抗体效价时，从动物采血，并制备抗血清。若有所需可针对血清进行进一步分级分离来富集对该蛋白具有反应性的抗体。
可通过多种本领域的普通技术人员熟知的方法获得单克隆抗体。简言之，将来自用所希望的抗原进行免疫接种的动物的脾细胞通常是通过与骨髓瘤细胞融合而被永生化(参见Kohler&Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976))。可替代的永生化方法包括使用爱泼斯坦-巴尔病毒、癌基因、或逆转录病毒、或其他本领域众所周知的方法来转化。
在一个优选的实施方案中，抗体为嵌合型抗体或人源化抗体。本发明的嵌合型抗体或人源化抗体可基于鼠类单克隆抗体的序列来制备。编码重链以及轻链免疫球蛋白的DNA可从感兴趣的鼠类融合瘤获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程处理，来含有非鼠类(例如人)的免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合型抗体，使用本领域已知方法可将鼠类可变区连接至人恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为产生人源化抗体，可使用本领域已知方法将鼠类CDR区插入至人类构架中(参见例如Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
在另一个优选的实施方案中，抗体为人类抗体。这种人类抗体可通过免疫接种转基因或转染色体小鼠而产生，其中内生性小鼠免疫球蛋白基因已被失活，并且外源性人免疫球蛋白基因已被导入。此类小鼠为本领域所已知(参见例如Lonberg以及Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；以及5,770,429；Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584以及6,162,963；以及Ishida等人的PCT公开文件WO02/43478)。也可使用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备人类抗体。此类用于分离人类抗体的噬菌体展示方法在本领域内也是已知的(参见例如Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；以及5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908以及5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108以及6,172,197；以及美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；Griffiths等人的6,582,915以及6,593,081)。
如此处所使用，“固相支撑体”表示一种材料，该材料基本上不溶于所选用的溶剂系统，或容易地(例如通过沉淀)从选定的溶剂系统(它可溶于其中)分离。对实施本发明有用的固相支撑体包括被激活或可激活来允许选定的种类结合至固相支撑体的基团。固相支撑体也可以是本发明的个别化合物或多于一种化合物结合至其上的基质，例如芯片、晶片或孔。
如此处所使用，“反应性官能团”一词是指以下基团，包括但不限于烯烃类、炔类、醇类、酚类、醚类、氧化物类、卤化物类、醛类、酮类、羧酸类、酯类、酰胺类、氰酸酯类、异氰酸酯类、硫氰酸酯类、异硫氰酸酯类、胺类、肼类、腙类、酰肼类、重氮类(diazo)、重氮基(diazonium)、硝基、腈类、硫醇类、硫化物类、二硫化物类、亚砜类、砜类、磺酸类、亚磺酸类、缩醛类、缩酮类、酸酐类、硫酸酯类、次磺酸类、异腈类、脒类、酰亚胺类、亚氨酸酯类、硝酮类、羟胺类、肟类、氧肟酸类、硫羟肟酸类、丙二烯类、原酸酯类、亚硫酸酯类、烯胺类、炔胺类、脲类、假脲类、氨基脲类、碳二亚胺类、氨基甲酸酯类、亚胺类、叠氮化物类、偶氮化合物、氧化亚氮化合物、以及亚硝基化合物。反应性官能团也包括用来制备生物偶联物的那些反应性官能团，例如N-羟基丁二酰亚胺酯类、顺丁烯二酰亚胺类等(参见例如Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic press，SanDiego，1996)。这些官能团各自的生产方法为本领域众所周知，它们针对特定目的的应用或改变是在本领域的普通技术人员的能力之内(参见例如Sandler and Karo，eds.ORGANIC FUNCTIONAL GROUPPREPARATIONS，Academic Press，San Diego，1989)。反应性官能团可受保护或不受保护。
本发明的化合物可制备成单一异构体(例如对映异构体、顺-反异构体、位置异构体、非对映异构体)，或制备成异构体的混合物。在一个优选的实施方案中，化合物被制备成基本上单一异构体。制备基本上同分异构纯的化合物的方法为本领域所已知。例如富含对映异构体的混合物以及纯对映异构化合物可通过使用对映异构纯的合成中间产物与一些反应相组合来制备，这些反应留下手性中心的立体化学不变或导致其完全反转。可替代地，终产物或合成途径沿线的各个中间产物可被分解为单一立体异构体。反转或留下不变的特定立构中心的技术以及立体异构体混合物的解析技术为本领域众所周知，并且针对特定情况选择适当的方法是在本领域的普通技术人员的能力之内。总体上参见Furniss et al.(eds.)，VOGEL’S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICALORGANIC CHEMISTRY 5TH ED.，Longman Scientific and Technical Ltd.，Essex，1991，pp.809-816；and Heller，Acc.Chem.Res.23：128(1990)。
连接物
本发明提供药物-配体偶联物，此处药物是通过氨基酸连接物而连接至配体，在此处描绘为(L4)pF(L1)m。除了附联至药物的连接物之外，本发明还提供适合附联至基本上任何分子种类的可切割的连接物臂。本发明的连接物臂方面在此处是就其附联至治疗部分而举例说明。但本领域的普通技术人员显然易知，连接物可附联至多个不同种类，包括但不限于诊断剂、分析剂、活质分子、靶向剂、可检测的标记、以及类似物。
在药物-配体偶联物中的肽基以及其他连接物的使用是说明于美国临时专利申请系列号60/295,196；60/295,259；60/295,342；60/304,908；60/572,667；60/661,174；60/669,871；60/720,499；60/730,804；60/735,657；60/882,461；以及60/991,300以及美国专利申请系列号10/160,972；10/161,234；11/134,685；11/134,826；以及11/398,854以及美国专利号6,989,452以及PCT专利申请号PCT/US2006/37793、PCT/US2006/60050、PCT/US2006/60711、以及PCT/SU2007/89100，它们全部通过引用结合在此。
在一个方面，本发明是涉及用于将靶向基团附联至治疗剂以及标记物的连接物。在另一方面，本发明提供了可对化合物提供稳定性，降低活体内毒性或以其他方式有利于化合物的药物代谢动力学、生物利用率和/或药效学等方面的连接物。通常优选的是在此类实施方案中，一旦药物被输送至其作用部位，连接物即被切割，释放出活性药物。如此在本发明的一个实施方案中，本发明的连接物是无痕迹的，这样一旦从治疗剂或标记物上移除(例如在激活期间移除)不会留下连接物存在的痕迹。
在本发明的另一个实施方案中，连接物的特征为可在靶标细胞内部或附近的部位被切割，例如在治疗作用部位或标记物活性部位被切割。这种切割本质上可以是酶的作用。此项特征可辅助减少治疗剂或标记物的系统性激活，降低毒性以及系统性副作用。在其他实施方案中，对pH敏感的连接物可通过pH的改变来切割。
在连接物中包括单个氨基酸的本发明的化合物的一个出人意料的方面是这些化合物具有的活性类似于或超越了具有肽基组分的连接物。因为单个氨基酸与肽相反并非必需是一种酶的底物，人们将预期相当低的活性。
这些连接物也有助于在循环中稳定治疗剂或标记物，防止其降解。这一特性提供了重要的有利因素，因为这种稳定性导致所附联的试剂或标记物的循环半衰期延长。该连接物还可用于减弱所附联的试剂或标记物的活性，使得该偶联物在循环时相对为良性，而在所希望的作用位点激活后具有所希望的效应，例如具有细胞毒性。对于治疗剂偶联物而言，连接物的这一特点用于改善该药剂的治疗指数。
稳定基团被优选地选择出来，来限制由可能存在于血液或者非靶标组织中的酶产生的治疗剂或标记物的清除及代谢，并且进一步选择这些稳定基团，来限制该药剂或者标记物运输进入细胞。这些稳定基团用于阻止该药剂或者标记物的降解，并且也可能在提供该试剂或标记物的其他物理特性中发挥作用。稳定基团也可能在贮藏中以经配制或未经配制的形式改善药剂或标记物的稳定性
Figure A20088000589500341
理想情况下，稳定基团对于稳定一种治疗剂或标记物是有用的，条件是该稳定基团所起的作用是在通过将一种治疗剂或标记物在人类血液中于37℃贮藏2小时而进行测试时保护了该治疗剂或标记物免于降解、并且导致了在给定的测定条件下由存在于人类血液中的酶对该治疗剂或标记物的少于20％，优选的少于10％，更优选的少于5％、以及甚至更优选的少于2％的切割。
本发明还涉及包含这些连接物的偶联物。更特别地，本发明涉及药物前体，这些药物前体可用于治疗疾病，特别是癌症化疗。具体而言，使用在此说明的连接物提供了多种药物前体，这些药物前体相对于相似结构的药物前体而言，展示出高的作用特异性、降低的毒性、以及改善的稳定性。
在此说明的本发明的连接物可位于细胞毒素偶联物内的多种位置。
因此，提供了一种连接物，该连接物可包含多种基团中的任何基团作为其链的一部分，相对于缺乏此类基团的构建物而言，这些基团在活体内(例如，在血流中)切割的速率会增强
Figure A20088000589500351
还提供了连接物臂与治疗剂以及诊断试剂的偶联物。这些连接物对于形成治疗剂的药物前体的类似物是有用的，并且对可逆地将治疗剂或诊断试剂连接至靶向剂、可检测的标记、或固相支撑体是有用的。连接物可被结合进入包括本发明的细胞毒素的复合物中。
一个或多个自消性连接基团L1被任选地导入细胞毒素与靶向剂之间。这些连接物基团还可能被说明为间隔基团，并且包含至少两个反应性官能团。典型地，间隔基团的一个化学官能度键合至该治疗剂(例如细胞毒素)的化学官能度上，而间隔基团的其他化学官能度被用于键合至靶向剂或者可切割的连接物的化学官能度上。间隔基团的化学官能度的实例包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮基、以及巯基基团。
该自消连接物由L1代表，一般是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂烷基。在一个实施方案中，该烷基或芳基基团可能包含1至20个碳原子。它们还可能包含一个聚乙二醇部分。
示例性间隔基团包括，例如6-氨基己醇、6-巯基己醇、10-羟基癸酸、甘氨酸以及其他氨基酸、1，6-己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、半胱胺(2-氨基乙烷硫醇)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、3-马来酰亚胺基苯甲酸、苯酞、α-取代的苯酞、羰基基团、缩醛胺酯、核酸、肽、以及类似物。
该间隔物可以用于引导另外的分子量以及化学官能度进入该细胞毒素-靶向剂复合物。通常，另外的质量以及官能度将影响该复合物的血清半衰期以及其他特性。因此，通过仔细挑选间隔基团，可以制得血清半衰期在一定范围内的细胞毒素复合物。
位于与药物部分直接相邻的位置的一个或多个间隔物也表示为(L1)m，其中m是选自0、1、2、3、4、5、以及6的一个整数。当多个L1间隔物存在时，可使用相同或不同的间隔物。L1可以是任何自消基团。
L4是一个连接物部分，利用包含该部分或改变该偶联物的水解速率的连接物，它优选地赋予偶联物增大的溶解性或减小的聚集特性。L4连接物并非必须是自消亡的。在一个实施方案中，L4部分是取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基、或未取代的杂烷基，这些基团中的任一种可能是直链、支链、或环状的。这些取代基可能是例如低级(C1-C6)烷基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、或者二烷基氨基。在一些实施方案中，L4包括非环状部分。在另一个实施方案中，L4包括带正电或负电的氨基酸聚合物，如聚赖氨酸或聚精氨酸。L4可包括例如聚乙二醇部分的聚合物。另外，L4连接物可以包括，例如一个多聚体成分以及一个小分子化学部分。
在一个优选的实施方案中，L4包括一个聚乙二醇(PEG)部分。L4的PEG部分可以是长度为1到50个单元。优选地，PEG含有1到12个重复单元，更优选3到12个重复单元，更优选2到6个重复单元，或甚至更优选3到5个重复单元，并且最优选4个重复单元。L4可仅仅含有PEG部分，或也可包括其他的取代或未取代的烷基或杂烷基。将PEG作为L4部分的一部分进行组合可以用于提高复合物的水溶性。另外，该PEG部分在药物与抗体偶联时降低了聚集度。
如以上所讨论，本发明的连接物可用通式：(L4)p-F-(L1)m表示，其中F表示包括氨基酸的连接物部分。在一个实施方案中，该F部分包括一个或多个任选的附加自消连接物L2以及一个羰基基团。在另一个实施方案中，该F部分包括一个氨基基团以及一个或多个任选的间隔基团L3。
因此，在一个实施方案中，包含该连接物的偶联物包括化学式1的结构：
Figure A20088000589500371
在这个实施方案中，L1为如以上所说明的自消性连接物，并且L4为如以上所说明的优选的提供较高溶解度、或降低聚集性、或改变水解速率的一个部分。L2代表一个或多个自消性连接物。此外，m为0、1、2、3、4、5或6；并且o以及p独立地是0或1。AA1代表天然氨基酸或非天然α-氨基酸。
在以上化学式1的本发明的连接物中，AA1在其氨基端是直接连接至L4，或当L4不存在时，直接连接至X4基团(即靶向剂、可检测的标记、受保护的反应性官能团或不受保护的反应性官能团)。
在另一个实施方案中，包含连接物的偶联物包含化学式2的以下一个结构：
Figure A20088000589500372
在这个实施方案中，L4是一个部分，该部分优选地赋予增加的溶解性、或减少的聚集特性，或改变水解速率，如以上所述；L3是一个间隔基团，该间隔基团包括一个伯胺或仲胺或一个羧基官能团，并且L3的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键或者L3的羧基与D的侧胺基官能团形成酰胺键；并且o和p独立地为0或1。AA1代表天然氨基酸或非天然α-氨基酸。在这个实施方案中，L1不存在(即通式中的m为0)。
自消性连接物L 2
自消连接物L2是一个双官能化学部分，它能将两个间隔的化学部分共价连接成通常稳定的三联分子，通过酶切割的方法从该三联分子释放所述间隔的化学部分中的一个；并且在所述酶切割之后，从该分子的其余部分中自发切割而释放所述间隔的化学部分中的另一个。根据本发明，自消间隔物在其一端与氨基酸AA1共价连接，而在其另一端与药物部分的化学反应位点共价连接，药物部分的衍生作用抑制药理活性，以便将氨基酸AA1与药物部分间隔开并且共价连接在一起成为一个三联分子，该三联分子在靶酶不存在的情况下是稳定的并且无药理活性，但在将间隔物部分与氨基酸AA1共价连接的键处可被酶切割，从而影响氨基酸AA1从该三联分子释放。反过来，这种酶切割能激活间隔物部分的自消性质，并引发对将间隔物部分共价连接至药物部分的键的自发切割，由此影响药理活性形式的药物的释放。
自消连接物L2可以是任何自消基团。L2优选是取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代和未取代的杂芳基。
一个特别优选的自消间隔物L2可以由下化学式3表示：
Figure A20088000589500381
氨基苄基基团的芳环可被一个或多个“K”基团取代。“K”基团是芳香环上的取代物，它替换原本附联于为部分环结构的四个未取代的碳之一的氢。“K”基团可能是一个单一原子，如卤素，或可能是多原子的基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基、以及氰基。每一个K均是独立地选自下组，该组的构成为：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21、以及OR21，其中R21和R22是独立地选自下组，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基。示例性K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、以及甲基。对于“Ka”，a是0、1、2、3或4的一个整数。在一个优选的实施方案中，a是0。
以上所显示的结构的醚氧原子与一个羰基基团相连。从NR24官能度进入芳环的线表示胺官能度可能被键合至5个碳的任何一个，这5个碳形成环、并且未被CH2-O-基团取代。优选地，X的NR24官能度在相对于CH2-O-基团的对位与芳环共价结合。R24是选自下组的一员，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。在一个具体的实施方案中，R24是H。
在一个实施方案中，本发明提供以上化学式(1)的一种连接物，其中F包含以下结构：
Figure A20088000589500391
其中，R24是选自下组，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。每一个K均是独立地选自下组的成员，该组的构成为：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21、以及OR21，其中R21和R22是独立地选自下组，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基，并且a是一个整数0、1、2、3、或4。
在另一个实施方案中，以上化学式(1)的连接物包含一个具有以下结构的-F-(L1)m-：
Figure A20088000589500401
其中每个R24是独立地选自下组的一员，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。
在某些实施方案中，自消性间隔物L2包括
Figure A20088000589500402
其中R17、R18以及R19各自是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，并且w为0至4的整数。在某些实施方案中，R17以及R18独立地是H或烷基(优选的是未取代的C1-4烷基)。优选地，R17以及R18是C1-4烷基，例如甲基或乙基。在某些实施方案中，w为0。
在某些实施方案中，L2包括
间隔物基团L 3
间隔基团L3的特征在于它包括伯胺或仲胺或羧基官能团，并且L3基团的胺基与D的侧羧基官能团形成一个酰胺键，或者L3的羧基与D的侧胺基官能团形成一个酰胺键。L3可选自下组，该组的构成为：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基。在一个优选的实施方案中，L3包括一个芳香族基团。更优选地，L3包括苯一个甲酸基团、苯胺基团、或吲哚基团。用作-L3-NH-间隔物的结构的非限制性实例包括以下结构：
Figure A20088000589500411
其中Z是选自O、S和NR23的成员，并且其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的一员。
切割本发明的包含L3的连接物时，L3部分仍然附联在药物D上。因此，选择L3部分，使得它附联到D的存在不会显著地改变D的活性。在另一个实施方案中，药物D的一部分本身起L3间隔物的功能。例如，在一个实施方案中，药物D是多卡霉素的衍生物，其中该药物的一部分起L3间隔物的作用。此类实施方案的非限制性实例包括那些实例，其中NH2-(L3)-D具有选自下组的一个结构，该组的构成为：
Figure A20088000589500421
其中Z是选自O、S以及NR23中的一员，其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基中的一员；并且其中在各个结构上的NH2基团与AA1进行反应而形成-AA1-NH-。
氨基酸AA 1
基团AA1代表一个单一氨基酸并且可以是天然氨基酸或非天然α-氨基酸。氨基酸可呈L构型或D构型。氨基酸可基于其适合由特定分子(例如肿瘤特异性蛋白酶)作选择性切割的适宜性来选择。
不希望受任何从抗体切割毒素的特异机制所限，相信至少某些本发明的化合物由组织蛋白酶B切割。还考虑了在适当环境中切割或释出本发明的毒素的机制并且含括在本发明中。在一个实施方案中，是基于连接物被溶酶体蛋白酶切割的能力来选择氨基酸AA1，溶酶体蛋白酶的非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L以及S。在某些实施方案中，包含氨基酸AA1的连接物可在体外由组织蛋白酶B切割，这可使用本领域已知的体外蛋白酶切割测定来测试。
在某些实施方案中，包含氨基酸AA1的连接物在体外实质上并未由组织蛋白酶B切割(例如，在24小时内无实质上的切割)，但在活体内仍可切割来产生活性药物。
在另一个实施方案中，是基于连接物被肿瘤相关的蛋白酶切割的能力来选择氨基酸AA1，该种蛋白酶是例如在胞外出现于肿瘤细胞附近的蛋白酶，其非限制性实例包括甲拌磷寡肽酶(TOP)以及CD10。连接物被TOP或CD10切割的能力可使用本领域已知的体外蛋白酶切割测定进行测试。
在一个实施方案中，该氨基酸是选自下组，其构成为：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。在另一个实施方案中，氨基酸是选自下组，其构成为：Cit、Glu、Lys、以及Ser。
蛋白酶与癌症转移有关。蛋白酶尿激酶合成的增加在许多癌症中与转移能力的增加相关。尿激酶将纤溶酶原激活为纤溶酶，它在细胞外间隙中广泛存在，并且其激活作用导致细胞外基质中的蛋白降解，由此转移性肿瘤细胞侵入。纤溶酶也可以激活胶原酶，因此促进在围绕毛细管以及淋巴系统的基底膜中胶原的降解，由此允许肿瘤细胞侵入到靶组织中(Dano，et al.Adv.Cancer.Res.，44：139(1985))。因此，利用由尿激酶切割的连接物是在本发明的范围之内。
本发明也提供了对类胰蛋白酶切割敏感的连接物的用途。人类的肥大细胞表达至少四种不同的类胰蛋白酶，被指定为α、βI、βII、以及βIII。这些酶不被血浆蛋白酶抑制剂控制，并且仅在体外切割一些生理学的底物。丝氨酸蛋白酶的类胰蛋白酶家族与涉及肥大细胞的多种过敏性疾病以及炎症有关，因为在患有这些病症的患者的体液里发现了类胰蛋白酶水平升高。然而，仍需要对类胰蛋白酶在疾病的病理生理学中的确切作用进行描绘。类胰蛋白酶的生物学功能的范围以及相应的生理学结果基本上由它们的底物的特异性限定。
类胰蛋白酶是前-尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化子(uPA)的有效的激活剂，uPA是与肿瘤转移以及侵入有关的蛋白酶的酶原形式。纤维溶酶原级联反应的激活，导致细胞外基质的破损而产生细胞溢出物及迁移，可能是在Pro-Arg-Phe-Lys的P4-P1序列(SEQ.ID NO：1)上的尿激酶原纤维溶酶激活物的类胰蛋白酶活化子的一个功能(Stack，etal.，Journal of Biological Chemistry 269(13)：9416-9419(1994))。血管活性肠肽(一种神经肽，与血管渗透性的调控有关)也被类胰蛋白酶切割，主要在Thr-Arg-Leu-Arg(SEQ.ID NO：2)序列上(Tam，et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.3：27-32(1990))。G-蛋白偶合受体PAR-2可在Ser-Lys-Gly-Arg(SEQ.ID NO：3)序列上被切割并被类胰蛋白酶激活，以促进成纤维细胞的增殖，然而凝血酶激活受体PRA-1在Pro-Asn-As p-Lys(SEQ.ID NO：4)序列上被类胰蛋白酶失活(Molino et al.，Journal of Biological Chemistry272(7)：4043-4049(1997))。综合在一起，这一证据提示类蛋白激酶作为疾病导致的结果在组织重塑中起核心作用。这与在几个肥大细胞介导的病症中观察到的深刻变化一致。慢性哮喘以及其他的长期的呼吸道疾病的特点是下面的组织(underlying tissue)的纤维化以及增厚，这可能是类胰蛋白酶激活其生理学靶的结果。类似地，一系列报道已经表明血管生成与多种癌症中的肥大细胞密度、类胰蛋白酶活性、以及不良的预后有关(Coussens et al.，Genes and Development13(11)：1382-97(1999))；Takanami et al.，Cancer 88(12)：2686-92(2000)；Toth-Jakatics et al.，Human Pathology 31(8)：955-960(2000)；Ribatti et al.，International Journal of Cancer 85(2)：171-5(2000))。
本发明的药物-配体偶联物可任选地包含两个或更多个连接物。例如，一个连接物可用来将药物连接至配体而第二连接物可将诊断剂附联至该复合物。额外的连接物的其他用途包括将分析剂、活质分子、靶向剂以及可检测的标记连接至药物-配体复合物。多个连接物可相同或不同。
同样在本发明的范围之内的是本发明的多种化合物，它们是多聚的或多价的种类(species)，包括例如一些种类，如本发明的化合物或其反应性类似物的二聚体、三聚体、四聚体、或更高的同系物。多聚以及多价的种类可由本发明的一个单一种类或多于一个种类装配而成。例如，二聚体构建物可以是“同源二聚体”或者“异源二聚体”。此外，多聚和多价的构建物(例如聚赖氨酸、右旋糖酐、羟乙基淀粉、以及类似物)也是在本发明的范围内，在这些构建物中本发明的化合物或其反应性类似物附联至寡聚体或多聚体的构架上。该构架优选是多官能的(即，具有一批用于附联本发明的化合物的反应性位点)。此外，该构架可用本发明的单一种类或本发明的多于一个的种类进行衍生。
此外，本发明包括多种化合物，相对于没有被相似地官能化的类似的化合物而言，这些化合物被官能化以产生具有增强了的水溶性的化合物。因此，在此给出的取代基中的任何取代基可被类似的具有增强了的水溶性的基团替换。例如，用二醇或具有季铵、羟基胺或类似的更具有水溶性部分的胺替换一个羟基基团，这也在本发明的范围内。在一个优选的实施方案中，通过用增强亲本化合物水溶性的部分对在此给出的化合物的离子通道的活性没有重要作用的位点进行取代，赋予了附加的水溶性。增强有机化合物水溶性的方法在本领域中是已知的。此类方法包括，但不局限于，用永久带电的部分，例如季铵、或在生理学上相关的pH条件下带电的基团(例如羧酸、胺)使一个有机核官能化。其他方法包括向有机核添加包含羟基或胺的基团，例如醇、多元醇、聚醚、以及类似物。代表性的例子包括但不局限于，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(乙二醇)以及聚(丙二醇)。这些化合物的适宜的官能化的化学品以及方案在本领域中是已知的。参见，例如，Dunn，R.L.，et al.，Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACSSymposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
药物
在此处表示为“D”的药物可在本发明中提供为药物-配体偶联物的一部分，其中该药物通过一种连接物而连接至配体。药物必须具有希望的生物活性，并包含一种反应性官能团以便连接至配体。希望的生物活性包括体诊断、治疗、减轻、处理或预防动物体内(如人)的疾病。因此只要具有所需的反应性官能团，术语“药物”是指在官方美国药典、官方美国顺势疗法药典或官方国家处方集或其任何补充中识别为药物的化学品。示例性药物陈述于医师参考手册(PDR)及美国食品药物管理局(FDA)所维持的橙皮书中。随着新药持续地被发现与开发，本发明提供了使得这些新药也并入本发明的药物-配体复合物中的可能性。
优选的官能团包括伯胺或仲胺、羟基、巯基、羧基、醛及酮。更优选的官能团包括羟基、伯胺或仲胺、巯基、以及羧酸官能团。甚至更优选的官能团包括羟基、伯胺和仲胺以及羧酸官能团。药物必须具有至少一个，但可具有2、3、4、5、6或更多个反应性官能团。此外，自消间隔物L1可并入至药物的反应性官能团与连接物之间。
药物-配体偶联物对于通常目的(相应的药物是有效的)来说是有效的，但因其将药物运送至特别有益的希望的细胞的能力(对于至少一些配体来说是固有的)而具有优异疗效。
示例性药物包括蛋白质、肽、及包含连接至配体的官能团的小分子药物。更确切地说，这些药物包括(例如)酶抑制剂，如二氢叶酸还原酶抑制剂、胸甘酸合酶抑制剂、DNA插层剂、DNA切割剂、拓朴异构酶抑制剂、蒽环类抗生素家族药物、长春胺药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒性核苷、蝶啶家族药物、伸二炔(diynene)类、鬼臼毒素、分化诱导剂及紫杉酚类。
本发明优选的药物包括在癌症治疗中有用的细胞毒类药物及其他具有希望的生物活性的小分子、蛋白质或多肽，如毒素。药物可选择在肿瘤细胞通过偶联至肿瘤特异性配体而被激活。这些肿瘤特异性药物-配体偶联物具有来自于配体的特异性的肿瘤特异性。其实例是药物-配体偶联物，药物-配体偶联物是对肿瘤特异性酶的高度选择性底物，其中这些酶以充足的量存在于肿瘤附近以便在肿瘤附近产生细胞毒性水平的游离态药物。这些肿瘤特异性药物-配体复合物的一个优点是它们对人血清中的伺机性蛋白是稳定的。药物-配体复合物的另一个优点是比相对应的游离态药物的毒性低；此外，因特异性增高将导致较高百分比的复合物存在于肿瘤部位，故复合物的特异性允许相对于游离态药物使用更低的总浓度。
细胞毒素
在本发明中有用的细胞毒类药物例如包括多卡霉素类及CC-1065、以及及它们的类似物，包括多卡霉素的基于CBI(1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)的类似物，基于MCBI(7-甲氧基-1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)的类似物，以及CCBI(7-氰基-1，2，9，9a-四氢环丙烷[c]苯并[e]吲哚-4-酮)的类似物及CC-1065，阿霉素及阿霉素偶联物(如吗啉代-阿霉素及氰基吗啉代-阿霉素)、多拉司他汀类(如多拉司他汀-10、考布他汀、刺孢霉素、美登素、美登素类似物、DM-1、欧瑞抑制素(auristatin)E、欧瑞抑制素EB(AEB)、欧瑞抑制素EFP(AEFP)、一甲基欧瑞抑制素E(MMAE)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)、管溶解素类(tubulysins)、戴索拉左(disorazole)、埃博霉素(epothilones)、紫杉醇、多西他赛、SN-38、拓扑替康、根霉素、棘霉素、秋水仙碱、长春碱、长春地辛、雌莫司汀、西马多丁、伊鲁色洛冰(eleutherobin)、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、阿糖胞苷、美法仑、洛诺生、异长春碱、放线菌素、柔红霉素及柔红霉素偶联物、丝裂霉素C、丝裂霉素A、洋红霉素、丝裂霉素、太利苏霉素)，鬼臼毒素及鬼臼毒素衍生物(如依托泊苷或磷酸依托泊苷、长春新碱、紫杉酚、多西他赛、视黄酸、丁酸、N8-乙酰基亚精胺、喜树碱及它们的类似物)。其他已知药物也可经改性来提供偶联至此处所述连接物的一个官能团。这种种化学修饰为本领域所已知。
优选的用于本发明的细胞毒素包括：多卡霉素类、CC-1065及其基于CCBI的类似物及基于MCBI的类似物、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、多拉司他汀-10、考布他汀、刺孢霉素、美登素、DM-1、欧瑞抑制素E、AEB、AEFP、MMAE、管溶解素A、戴索拉左、埃博霉素A及埃博霉素B。
本发明的特别优选的细胞毒素是强力活性的多卡霉素衍生物及CC-1065。亲代药剂是格外强力的抗肿瘤抗生素，可通过DNA的可逆的空间电子控制序列选择性烷化来衍生其生物功效(Boger et al.J.Org.Chem.55：4499(1990)；Boger et al.J.Am.Chem.Soc.112：8961(1990)；Boger et al.，J.Am.Chem.Soc.113：6645(1991)；Bogeret al.J.Am.Chem.Soc.115：9872(1993)；Boger et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.2：759(1992))。在最初揭示多卡霉素类之后，有全面性研究致力于阐明多卡霉素类的DNA烷化选择性及其结构起源。
本发明的一个特别优选的方面提供了一种细胞毒素化合物，该化合物具有根据以下化学式4的一个结构：
Figure A20088000589500481
其中，环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基中的一员。示例性的环状体系包括苯基以及吡咯。
符号E和G独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、一个杂原子、一个单键，或者E和G可任选地相接合以形成一个环状体系，该系统选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。
符号X表示选自O、S以及NR23中的一员。R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的一员。
符号R3表示选自(＝O)、SR11、NHR11以及OR11中的一员，其中R11是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、二磷酸酯类、三磷酸酯类、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12或SiR12R13R14。符号R12、R13、以及R14独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R12和R13与它们所附联的氮原子或碳原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系。
R4、R4’、R5以及R5’是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、SO3、SO2R15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2的成员，其中，n是从1到20的一个整数，或者R4、R4’、R5及R5’的任何相邻的一对与它们所附着的碳原子一起相接合以形成一个具有4至6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系。R15和R16独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附联的氮原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系。一个示例性的结构是苯胺。
R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的至少一个用来将药物结合至如此处所述的本发明的连接物，例如将药物连接至L1(若存在时)、或连接至F。
在一个实施方案中，R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的至少一个带有适合用于偶联该化合物的一个反应基团。在另一个示例性实施方案中，R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16独立地选自H、取代的烷基以及取代的杂烷基，并且在烷基或杂烷基部分的自由末端具有一个反应性官能团。R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15以及R16中的一个或多个可偶联至其他的种类上，例如靶向剂、可检测的标记、固相支撑体等。
R6是一个单键，该单键存在或不存在。当R6存在时，R6和R7相接合以形成一个环丙基的环。R7是CH2-X1或-CH2-。当R7是-CH2-时，它是环丙烷环的一个组成部分。符号X1表示离去基团如卤素，例如Cl、Br或F。以不会违反化学价原则的方式解释R6和R7的组合。
X1可以是任何离去基团。有用的离去基团包括但不限于卤素、叠氮化物、磺酸酯类(如烷基磺酰基、芳基磺酰基)、氧鎓离子、高氯酸烷基酯、铵基烷基磺酸酯、烷基氟代磺酸酯以及氟化化合物(如三氟甲磺酸盐、全氟丁基甲磺酸盐、三氟乙磺酸盐)以及类似物。作为离去基团有用的具体的卤素是F、Cl以及Br。对于特定的反应条件组合来说适当的这些以及其他离去基团的选择是在本领域的普通技术人员的能力之内(参见，例如，March J，Advanced Organic Chemistry，2nd Edition，John Wiley and Sons，1992；Sandler SR，Karo W，OrganicFunctional Group Preparations，2nd Edition，Academic Press，Inc.，1983；以及Wade LG，Compendium of Organic Synthetic Methods，JohnWiley and Sons，1980)。
六元环中的曲线表明该环可具有一个或多个不饱和度，并且它可以是芳香的。因此，环结构(如以下所给出)、以及相关结构在化学式(5)的范围内：
在某些实施方案中，R4、R4’、R5以及R5’中的至少一个将所述药物连接至L1(若存在时)、或连接至F。
在一个实施方案中，R11包括一个部分X5，该X5不会自我环化并且将药物连接至L1(若存在时)、或连接至F。X5部分优选的可使用酶切割，并且当切割后产生活性药物。作为一个实例，R11可具有以下结构(右侧是偶合至该药物的其余部分)：
Figure A20088000589500511
在一个示例性实施方案中，具有化学式(4)的环状体系A是一个取代或未取代的苯基环。环状体系A可被在此限定部分中给出的一个或多个芳基基团取代基所取代。在一些实施方案中，该苯基环被CN或甲氧基部分所取代。
在另一个示例性实施方案中，本发明提供一种具有根据化学式6的结构的化合物：
Figure A20088000589500512
在这个实施方案中，取代基R3、R4、R4’、R5、R5’、R6、R7以及X的身份，连同对于特定的实施方案的优选项，基本上如同以上对于化学式4所做的说明所述。符号Z是独立选自O、S和NR23的成员。符号R23表示选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。对每个R23进行独立地选择。符号R1代表H、取代或未取代的低级烷基，或C(O)R8或CO2R8。R8是选自取代的烷基、未取代的烷基、NR9R10、NR9NHR10以及OR9中的一员。R9和R10独立地选自H、取代或未取代的烷基、以及取代或未取代的杂烷基。R2是H、或取代或未取代的低级烷基。通常优选的是当R2是取代的烷基时，它不同于全氟烷基，例如CF3。在一个实施方案中，R2是一个取代的烷基，其中该取代物不是卤素。在另一个实施方案中，R2是一个未取代的烷基。
在某些实施方案中，R1是一个酯部分，例如CO2CH3。在某些实施方案中，R2是一个低级的烷基基团，它可以是取代或未取代的。一个目前优选的低级烷基基团是CH3。在某些优选的实施方案中，R1是CO2CH3并且R2是CH3。
在某些实施方案中，R4、R4’、R5、以及R5’是独立地选自H、卤素、NH2、OMe、O(CH2)2N(R29)2、以及NO2的成员。每个R29均独立地是H或低级烷基(例如甲基)。
在某些实施方案中，对药物进行选择，使离去基团X1是选自下组的成员，该组的构成为卤素、烷基磺酰基、芳基磺酰基、以及叠氮化物。在某些实施方案中，X1是F、Cl、或Br。
在某些实施方案中，Z是O或NH。在某些实施方案中，X是O。
在又另一个示例性实施方案中，本发明提供了具有根据化学式7或8的结构的化合物：
Figure A20088000589500521
具有化学式4的多卡霉素类似物的另一个优选的结构是这样一个结构，其中环状体系A是一个未取代的或取代的苯基环。当环状体系A是吡咯时，在以上说明的具有化学式4的结构的药物分子上的优选的取代基也是当环状体系A是未取代的或取代的苯基环时优选的取代基。
例如，在一个优选的实施方案中，药物(D)包含化学式(9)的结构：
Figure A20088000589500531
在这个结构中，R3、R6、R7、X是如以上对化学式4所述。此外，Z是选自O、S以及NR23中的一员，其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基中的一员；
R1是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R8或CO2R8，其中R8是选自NR9R10以及OR9中的一员，其中R9以及R10是独立地选自H、取代或未取代的烷基以及取代或未取代的杂烷基中的成员；
R1’是H、取代或未取代的低级烷基、或C(O)R8，其中R8是选自NR9R10以及OR9中的一员，其中R9以及R10是独立地选自H、取代或未取代的烷基以及取代或未取代的杂烷基中的成员；
R2是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基、或氰基、或烷氧基；以及R2’是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基。
R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15或R16中的至少一个将药物连接至L1(若存在时)、或连接至F。
药物(D)的另一个实施方案包含一个结构(13)，此处R4与R4’已经接合而形成一个杂环烷基：
Figure A20088000589500532
在这个结构中，R3、R5、R5’、R6、R7、X是如以上对化学式4所述。此外，Z是选自O、S以及NR23中的一员，其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基中的一员；
R32是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，其中n是1至20的整数。R15以及R16独立地代表H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15以及R16与它们所附联的氮原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系。
R5、R5’、R11、R12、R13、R15、R16或R32中的至少一个将药物连接至L1(若存在时)、或连接至F。在至少某些实施方案中，R32将药物连接至L1(若存在时)、或连接至F。
这个化合物的一个优选的实施方案是：
Figure A20088000589500541
R1是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R8、或CO2R8，其中R8是选自NR9R10以及OR9中的一员，其中R9以及R10是独立地选自H、取代或未取代的烷基以及取代或未取代的杂烷基中的成员；
R1’是H、取代或未取代的低级烷基、或C(O)R8，其中R8是选自NR9R10以及OR9中的一员，其中R9以及R10是独立地选自H、取代或未取代的烷基、以及取代或未取代的杂烷基中的成员；
R2是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基、或氰基、或烷氧基；以及R2’是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基。
又一个实施方案具有以下化学式：
Figure A20088000589500551
在这个结构中，A、R6、R7、X、R4、R4’、R5以及R5’是如以上对化学式4所述。此外，Z是选自O、S以及NR23中的一员，其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基中的一员；
R33是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，其中n是1至20的整数。R15以及R16独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15以及R16与它们所附联的氮原子一起可任选地相接合来形成一个具有4至6元的、可任选地含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系。R33将该药物连接至L1(若存在时)、或连接至F。
优选地，A是取代或未取代的苯基或取代或未取代的吡咯。另外，此处说明的用于R11的取代基的任何选择也可应用于R33。
配体
X4代表选自下组的一个配体，该组的构成为：受保护的反应性官能团、不受保护的反应性官能团、可检测的标记、以及靶向剂。优选的配体是靶向剂，例如抗体及其片段。
在某些实施方案中，基团X4可被描述为选自R29、COOR29、C(O)NR29以及C(O)NNR29中的一员，其中R29是选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的杂芳基中的一员。在又另一个示例性实施方案中，R29是选自以下各项中的一员：H；OH；NHNH2；
Figure A20088000589500561
其中R30代表取代或未取代的烷基，该烷基以一个反应性官能团封端；取代或未取代的杂芳基，该杂芳基以一个官能团封端。以上结构可以充当反应保护基团，这些反应保护基团可以与(例如)靶向剂(如抗体)的一个氨基酸的侧链进行反应，由此使该靶向剂连接至该连接物-药物部分上。
靶向剂
本发明的连接物臂及细胞毒素可连接至靶向剂，该靶向剂选择性递送一个有效负载至身体的细胞、器官或区域。示例性的靶向剂类，如各种抗体(例如嵌合型抗体、人源化抗体及人抗体)、用于受体的配体、凝集素类、糖类、抗体类等等在本领域内是已知的并且是有用的而对实施本发明没有限制。其他一些靶向剂包括一类化合物，这些化合物不包括特定的分子辨识基序，而包括大分子类，如聚(乙二醇)、多糖、聚氨基酸等，它们增加细胞毒素的分子量。额外的分子量影响细胞毒素的药物代谢动力学，例如血清半衰期。
在一个具体实施方案中，本发明提供具有靶向剂的细胞毒素、连接物或细胞毒素-连接物偶联物，该靶向剂是活质分子，例如抗体、受体、肽、凝集素、糖、核酸或它们的一个组合。
可用于实施本发明的活质分子可衍生自任何来源。活质分子可从天然来源分离，或可通过合成方法产生。蛋白质可以是天然蛋白质或突变蛋白质。可通过本领域的普通技术人员已知的化学诱变、位点定向诱变、或其他诱导突变的手段执行突变。可用于实施本发明的蛋白质包括(例如)酶、抗原、抗体、以及受体。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，但最优选为单克隆抗体。肽及核酸可分离自天然来源，或可以是全部合成或部分合成来源。
在一个优选的实施方案中，靶向剂是一种抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段是基于它对于在所感兴趣的靶细胞或靶位点上表达的抗原的特异性来进行选择。已经识别广泛的多种肿瘤特异性抗原或其他疾病特异性抗原，并且这些抗原的抗体已被使用或已经提出用于治疗此类肿瘤或其他疾病。本领域已知的抗体可用于本发明的偶联物，特别用于治疗靶抗原相关联的疾病。本发明的抗体-连接物-药物偶联物可锁定目标的靶抗原(及其相关疾病)的非限制性实例包括：Her2(乳癌)、CD20(淋巴瘤)、EGFR(实体瘤)、CD22(淋巴瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤)、CD52(慢性淋巴细胞白血病)、CD33(急性骨髓性白血病)、CD4(淋巴瘤、自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎)、CD30(淋巴瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤)、Muc18(黑素瘤)、整联蛋白类(实体瘤)、PSMA(前列腺癌、良性前列腺增生)、CEA(结肠直肠癌)、CD11a(牛皮癣)、CD80(牛皮癣)、CD23(气喘)、CD40L(免疫性血小板减少性紫癜)、CTLA4(T细胞淋巴瘤)、以及BLys(自身免疫疾病，包括系统性红斑狼疮)。
在这些实施方案中，其中识别部分为蛋白质或抗体的，蛋白质可被系至表面或自我组装单层(SAM)组件，或蛋白质通过蛋白质表面上可用的任一个反应性肽残基而通过一个间隔物连接。在一个优选的实施方案中，反应基团为胺或羧酸根。在特别优选的实施方案中，反应基团是赖氨酸残基的ε-胺基团。此外，这些分子可通过非特异性相互作用(例如化学吸附、物理吸附)而吸附至基质或SAM表面。
属于抗体的识别部分可用来识别分析物，分析物为蛋白质，肽，核酸，糖类或小分子(例如药物、除草剂、杀虫剂)，工业用化学品、以及战争试剂。对特定分子提引出抗体的方法为本领域普通技术人员所熟知。参见例如美国专利号5,147,786；5,334,528；5,686,237；以及5,573,922。将抗体附联至表面的方法也是领域已知的。参见例如Delamarche et al.Langmuir 12：1944-1946(1996)。
靶向剂可通过任一种可用的反应基团附联至本发明的连接物。例如，肽可通过胺、羧基、巯基或羟基基团而附联。这样一种基团可驻在肽末端或驻在肽链内部的一个位置。核酸可通过碱基上的反应基团(例如环外胺)或糖部分上可用的羟基(例如3’-羟基或5’-羟基)而附联。肽及核酸链可进一步在一个或多个部位衍生来允许适当反应基团附联至链上。参见例如Chrisey et al.Nucleic Acids Res.24：3031-3039(1996)。
当肽或核酸为全部合成分子或部分合成分子时，反应基团或经过遮蔽的反应基团可在合成过程结合入其中。多种适合结合于肽及核酸二者的反应基团的衍生单体为本领域普通技术人员所已知。参见例如THE PEPTIDES：ANALYSIS，SYNTHESIS，BIOLOGY，Vol.2：“Special Methodsin Peptide Synthesis，”Gross，E.and Melenhofer，J.，Eds.，Academic Press，New York(1980)。许多有用的单体是可商购的(Bachem、Sigma等)。然后这种经遮蔽的基团在合成后被解除遮蔽，此时变成可供与本发明化合物的组分反应。
示例性核酸靶向剂包括适体、反义化合物、以及形成三螺旋的核酸。典型地，糖残基的羟基、来自于碱残基的氨基、或核苷酸的磷酸氧被用作所需的化学官能度，来将基于核苷酸的靶向剂偶合至细胞毒素。然而，本领域普通技术人员将容易地理解其他“非天然”反应官能度可通过常规技术附加至核酸。例如，糖残基的羟基可使用本领域所熟知的技术而转换成为巯基或氨基。
适体(或核酸抗体)是可与特定的分子标靶结合的单链或双链DNA或单链RNA分子。通常，适体是通过与血液中循环的标靶汇集物结合，通过抑制分子标靶(例如蛋白质)的作用来发挥功能。适体具有化学官能度，并因此可如此处所述而共价键合至细胞毒素。
虽然广泛的多种分子标靶可与适体形成非共价关联，但为特异性关联，包括小分子药物、代谢产物、辅因子、毒素、基于糖的药物、基于核苷酸的药物、糖蛋白、以及类似物，但通常分子标靶将包含蛋白质或肽，包括血清蛋白、激肽、类二十烷酸类、细胞表面分子等。适体的实例包括吉里(Gilead’s)抗凝血酶抑制剂GS 522、以及其衍生物(Gilead Science，Foster City，Calif.)。还参见Macaya etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3745-9(1993)；Bock et al.Nature(London)355：564-566(1992)and Wang et al.Biochem.32：1899-904(1993)。
给定活质分子的特定适体可使用本领域已知的技术识别。参见例如Toole等人(1992)PCT公开号WO 92/14843；Tuerk及Gold(1991)PCT公开号WO 91/19813；Weintraub及Hutchinson(1992)PCT公开号92/05285；及Ellington and Szostak，Nature 346：818(1990)。简言之，这些技术典型地涉及分子标靶与寡核苷酸的随机混合物的复合。将适体-分子标靶复合物从未经复合的寡核苷酸分离。将适体从分离的复合物中回收及扩增。这种循环被重复进行来识别出对分子标靶具有最高亲和力的这些适体分子。
对于由于基因的不适当表达所导致的疾病，特异性预防或减少此类基因的表达代表着理想的治疗。原则上，通过与mRNA中可接近的一个序列、或前mRNA加工所必需的转录本内部的一个序列、或基因本身内部的一个序列互补的单链脱氧核苷酸或核糖脱氧核苷酸的杂交，可抑制、减少、或关闭特定基因产物的产生。这种基因控制模式通称为反义抑制或反基因抑制。通过偶联至烷化剂的核酸(例如本发明的烷化剂的核酸)可赋予额外疗效。
反义化合物是一些核酸，这些核酸被设计用来结合并使之失去功能、或防止负责生成特定蛋白质的mRNA的产生。反义化合物包括反义RNA或反义DNA、单链或双链寡核苷酸或它们的类似物，它们可特异地杂交至个别mRNA种类，并防止该mRNA种类的转录和/或RNA加工，和/或防止所编码的多肽的翻译，并由此执行个别编码多肽量的减少。Ching et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10006-10010(1989)；Broder et al.Ann.Int.Med.113：604-618(1990)；Loreauet al.FEBS Letters 274：53-56(1990)；Holcenberg等人的WO91/11535；WO91/09865；WO91/04753；WO90/13641；WO 91/13080，WO 91/06629，以及EP 386563)。由于其优异的标靶敏感度、以及选择性，反义寡核苷酸可用于将治疗剂(例如本发明的细胞毒素)递送至期望的分子标靶。
其他文献已经报道，核酸可通过三股螺旋的形成而结合至双螺旋DNA，并抑制转录和/或DNA合成。三股螺旋化合物(也称作为三股药物)是寡核苷酸，该寡核苷酸结合至双链DNA序列并意在选择性抑制致病基因的转录，致病基因例如是病毒基因(如HIV病毒及单纯疱疹病毒)、以及致癌基因，即三股螺旋化合物停止细胞核的蛋白质的产生。这些药物可直接结合至细胞基因组中的双链DNA来形成三股螺旋，并阻止细胞制造靶蛋白质。参见例如PCT公开文件号WO 92/10590、WO 92/09705、WO 91/06626、以及美国专利号5,176,996。因此，本发明的细胞毒素也可与形成三股螺旋的核酸序列相偶联。
核酸(例如反义化合物、以及三股螺旋药物)的位点特异性不会显著受到磷酸二酯键的修饰、或受到寡核苷酸末端的化学修饰的显著影响。结果，这些核酸可经过化学修饰；提升总的结合稳定性，提高对化学分解的稳定性，提高寡核苷酸转运入细胞内部的速率，并对分子给予化学反应性。组成反义治疗中有用的各种核酸的总体办法已由van der Krol et al.，Biotechniques 6：958-976(1988)and Steinet al.Cancer Res.48：2659-2668(1988)综述。因此，在一个示例性实施方案中，本发明的细胞毒素是通过磷酸二酯键的修饰而与核酸相偶联。
此外，本发明的适体、反义化合物、以及载有细胞毒素的三股螺旋药物也包括核苷酸置换、添加、缺失或转座，只要保有与相关靶序列特异性杂交或结合作为寡核苷酸的功能特性即可。例如，一些实施方案采用硫代磷酸酯类似物，它们比其天然存在的磷酸二酯相似物，对被核酸酶分解更具有抵抗力，因此预期在活体内将有更高持久性与更大强度(参见例如Campbell et al.，J.Biochem.Biophys.Methods20：259-267(1990))。寡核苷酸的氨基磷酸酯衍生物也已知可结合至互补的多核苷酸，有额外适应共价附联配体种类的能力，并适合用于本发明方法。参见例如Froehler et al.，Nucleic Acids Res.16(11)：4831(1988)。
在某些实施方案中，适体、反义化合物、以及三股螺旋药物将包含O-甲基核糖核苷酸(EP公告号360609)。也可使用嵌合型寡核苷酸(Dagle et al.，Nucleic Acids Res.18：4751(1990))。为了一些应用，反义寡核苷酸、以及三股螺旋可包括聚酰胺核酸(Nielsenet al.，Science 254：1497(1991)以及PCT公开号WO 90/15065)或其他阳离子衍生物(Letsinger et al.，J.Am.Chem.Soc.110：4470-4471(1988))。其他应用可利用寡核苷酸，其中磷酸二酯键中的一个或多个已经被电子等排基团(例如长2-4个原子的核苷酸间键，如PCT公开号WO 92/05186及91/06556所述)取代，或被甲酰缩醛基(formacetal)取代(Matteucci et al.，J.Am.Chem.Soc.113：7767-7768(1991))或被酰胺基取代(Nielsen et al.，Science 254：1497-1500(1991))。
此外，核苷酸类似物(例如其中糖或碱经过化学修饰)可在本发明中采用。嘌呤类、以及嘧啶类的“类似的”形式是本领域通常已知的那些形式，其中多种被用作化学治疗剂。示例性的但未穷尽的名单包括4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基奎辛(mannosylqueosine)、5’-甲氧羰基甲尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、伟伯妥索辛(wybutoxosine)、假尿嘧啶、奎辛(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、假尿嘧啶、奎辛、2-硫胞嘧啶、及2，6-二氨基嘌呤。此外，常规碱基为卤化碱基。此外，碱基上的2’-呋喃糖位置可具有未带电的庞大基团取代。未带电的庞大基团的实例包括支链烷基、糖、以及支链糖。
末端修饰也提供有用程序来将细胞毒素偶联至核酸，修饰细胞类型特异性、药物代谢动力学、核通透性、以及寡核苷酸药剂的绝对细胞摄取速率。例如，在5’端与3’端包括反应基团的一系列取代包括反应基团是已知的，允许细胞毒素的共价附联。参见例如OLIGODEOXYNUCLEOTIDES：ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION，(1989)Cohen，Ed.，CRC Press；PROSPECTS FOR ANTISENSE NUCLEIC ACID THERAPEUTICS FOR CANCER AND AIDS，(1991)，Wickstrom，Ed.，Wiley-Liss；GENEREGULATION：BIOLOGY OF ANTISENSE RNA AND DNA，(1992)Erickson andIzant，Eds.，Raven Press；以及ANTISENSE RNA AND DNA，(1992)，Murray，Ed.，Wiley-Liss。有关反义化合物的总体方法可参见ANTISENSE RNA ANDDNA，(1988)，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
可检测的标记
与本发明的化合物结合使用的特定的标记或可检测的基团以及本发明的方法，只要它不显著干扰本发明的化合物的活性或使用，通常不是本发明的关键方面。可检测的基团可以是任何具有可检测的物理或化学特性的物质。此类可检测的标记在免疫测定的领域中已得到很好的发展，并且通常，在此类方法中有用的大部分任何标记都能被应用至本发明中。因此，标记是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组分。本发明中有用的标记包括磁珠(例如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、碱性玫瑰精等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及其他在ELISA中常用的酶)、以及比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。
根据本领域熟知的方法，标记可直接或间接偶合到本发明的化合物上。如以上所指，可使用多种标记，标记的选择取决于所需的灵敏度、与化合物的结合的容易程度、稳定性需求、可用的仪器操作、以及可支配的供应物。
当本发明的化合物与可检测的标记相偶联时，该标记优选是选自下组的一个成员，该组的构成为：放射性同位素、荧光试剂、荧光试剂前体、生色团、酶类、以及它们的组合。将各种基团结合到抗体的方法在本领域是熟知的。例如，经常被偶联到抗体的可检测的标记是一种酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、以及葡萄糖氧化酶。
非放射性标记常常是通过间接手段附联的。通常，配体分子(例如生物素)被共价地结合到该偶联物的一个成分上。然后该配体与另一个分子(如抗生蛋白链菌素)结合，该分子是固有地可检测的或者与信号系统(如可检测的酶、荧光化合物、或化学发光化合物)共价结合。
本发明的偶联物的成分还可以直接偶联到产生信号的化合物上，例如通过与酶或荧光团相偶联。作为标记的所感兴趣的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶以及糖苷酶、或氧化酶(oxidotase)，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、碱性玫瑰精及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素、以及2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。对于可以使用的各种标记或信号产生体系的评述，参见美国专利号4,391,904。
检测标记的方法是本领域普通技术人员熟知的。因此，例如，当该标记是一种放射性标记时，检测方法包括闪烁计数器或如在放射自显影法中的照相胶片的使用。当该标记是荧光标记时，可通过用适当光波长激发荧光染料并检测产生的荧光可对其进行检测。可通过照相胶片、通过使用电子探测器(例如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管、以及其类似物)，可对该荧光进行视觉上的检测。类似地，可通过提供酶的适当底物并检测产生的反应产物来对酶标记进行检测。最后，可通过观察与该标记相关的颜色对简单的比色标记进行简单地检测。因此，在各种试纸条测定(dipstick assay)中，所偶联的金经常显示成粉红色，而各种结合的珠显示出珠的颜色。
荧光标记是目前优选的，因为它们具有操作上需要的预防措施少、并适合高通量显像技术(光学分析包括在包含计算机的集成系统中用于分析的图像的数字化)的优点。优选的标记典型地具有以下的一项或多项特征：高灵敏度、高稳定性、低背景、低环境敏感性、以及标记的高特异性。许多荧光标记可从以下公司商购获得：SIGMA化学公司(Saint Louis，MO)、Molecular Probes(Eugene，OR)、R&D systems(Minneapolis，MN)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，NJ)、CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)、Glen Research，Inc.、GIBCO BRL Life Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika(FlukaChemie AG，Buchs，Switzerland)、以及Applied Biosystems(FosterCity，CA)、连同许多技术人员已知的其他的商业来源。此外，本领域的普通技术人员知道如何选择合适的荧光团用于特定的应用中，并且如果商业上不容易获得，则能够从头合成必需的荧光团或对可商购的荧光化合物进行合成地修饰以达到希望的荧光标记。
除了小分子荧光团外，自然发生的荧光蛋白以及此类蛋白的经工程处理的类似物在本发明中也是有用的。此类蛋白包括(例如)刺胞动物的绿色荧光蛋白(Ward et al.，Photochem.Photobiol.35：803-808(1982)；Levine et al.，Comp.Biochem.Physiol.，72B：77-85(1982))、来自费氏弧菌菌株的黄色荧光蛋白(Baldwin etal.，Biochemistry 29：5509-15(1990))、来自共生甲藻属甲藻(dinoflagellate Symbiodinium sp.)的多甲藻黄素-叶绿素(Morriset al.，Plant Molecular Biology 24：673：77(1994))、来自海底蓝细菌如蓝藻的藻胆蛋白，例如藻红蛋白和藻蓝蛋白(Wilbanks et al.，J.Biol.Chem.268：1226-35(1993))，及类似物。
通常，在细胞毒素与靶向(或其他)试剂的间形成连接(并且任选是间隔基团)之前，这些化学官能度中的至少一个会被激活。本领域的普通技术人员将理解，使用许多种标准方法和条件可以激活化学官能度，包括羟基、氨基以及羧基基团。例如，可以通过用碳酰氯处理形成相应的氯甲酸盐或用对硝基苯氯甲酸盐处理形成相应的碳酸盐来激活细胞毒素或靶试剂的羟基。
在一个示例性实施方案中，本发明利用包括一个羧基官能度的靶向剂。羧基可通过(例如)转变为相应的酰基卤化物或活性酯而被激活。这个反应可在如March，supra pp.388-89中所阐述的各种条件下进行。在一个示例性实施方案中，通过含羧基的基团与草酰氯进行反应来制备酰基卤化物。被激活的试剂与细胞毒素或细胞毒素-连接物臂结合体进行反应，以形成本发明的偶联物。本领域的普通技术人员将理解使用含羧基的靶向剂仅仅是说明性的，并且具有许多其他官能团的试剂可偶联到本发明的连接物上。
反应性官能团
为了说明的清晰，下面的讨论集中在本发明的细胞毒素对靶试剂的结合上。焦点例证本发明的一个实施方案，从这个实施方案，本领域的普通技术人员很容易推断出其他的实施方案。集中讨论单一的实施方案并不意味着对本发明的限制。
本发明的示例性化合物包含一个反应性官能团，该官能团通常位于取代或未取代的烷基或杂烷基链上，使它们易附联于其他种类上。该反应性官能团的一个有利位置是该链的末端位置。
在操作本发明时有用的反应基团和反应种类通常是那些在生物结合化学领域所熟知的反应基团和反应种类。反应性官能团可以是受保护的或未受保护的，并且该官能团的受保护的本性可以通过有机合成领域已知的方法进行改变。用反应性细胞毒素类似物可获得的目前偏爱的反应种类是那些在相对温和的条件下进行的反应种类。这些反应种类包括担不限于亲核取代(例如，胺以及醇与酰基卤化物、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)以及碳-碳以及碳-杂原子多重键的加成(例如，迈克尔反应、狄尔斯-阿尔德反应)。这些以及其他有用的反应讨论于例如March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley&Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATETECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney et al.，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
示例性反应类型包括羧基及其不同的衍生物的反应，羧基衍生物包括但不限于N-羟基丁二酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑(N-hydroxybenztriazole)酯、酰基卤、酰基咪唑、硫代酸酯、对硝基苯基酯、烷基、链烯基、炔基以及芳香酯。羟基基团可被转变为酯、醚、醛等。通过与例如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子进行反应，卤烷基基团可被转变为新的种类。二烯亲合物(例如马来酰亚胺)基团参与狄尔斯-阿尔德反应。醛基或酮基基团可被转变为亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过例如Grignard加成反应或烷基锂加成反应这样的机制完成这些转变。磺酰基卤化物容易与胺进行反应，例如形成磺酰胺。胺或巯基基团被(例如)酰化、烷基化或氧化。使用环加成作用、酰化作用、迈克尔加成等，可将烯转变为一系列新的种类。环氧化物容易与胺以及羟基化合物进行反应。
本领域的普通技术人员将容易理解，这些连接中有许多可通过多种方法并使用多种条件产生。对酯的制备，见例如，March supra at1157；对于硫代酸酯，见March，supra at 362-363，491，720-722，829，941，and 1172；对于碳酸酯，见March，supra at 346-347；对于氨基甲酸酯，见March，supra at 1156-57；对于酰胺，见Marchsupra at 1152；对于脲及硫脲，见March supra at 1174；对于缩醛以及缩酮，见Greene et al.supra 178-210和March supra at 1146；对于酰氧基烷基衍生物，见PRODRUGS：TOPICAL AND OCULAR DRUG DELIVERY，K.B.Sloan，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1992；对于烯醇酯，见March supra at 1160；对于N-亚磺亚酰胺(N-sulfonylimidates)，见例如Bundgaard et al.，J.Med.Chem.，31：2066(1988)；对于酸酐，见March supra at 355-56，636-37，990-91，and 1154；对于N-酰胺，见March supra at 379；对于N-曼尼希碱，见March supra at 800-02，and 828；对于羟甲基酮酯，见Petracek et al.Annals NY Acad.Sci.，507：353-54(1987)；对于二硫化物，见March supra at 1160；以及对于磷酸酯及膦酰胺酯的制备。
反应性官能团可以未被保护并被选择，这样它们不参与或干涉反应。可替代地，反应性官能团可通过保护基团的存在受到保护而不参与反应。本领域的普通技术人员将领会怎样保护特定官能团不干扰已选择的一组反应条件。对于有用的保护基的例子，参见Greene et al.，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley&Sons，New York，1991。
典型地，使用标准的化学技术将靶向剂通过它们各自的化学官能度被共价连接至细胞毒素上。任选地，连接物或试剂通过一个或多个间隔基团与该试剂进行偶合。当组合使用时，间隔基团可以是等效的或不同的。
通常，在细胞毒素与反应性官能团(并且任选地是间隔基团)之间形成连接之前，化学官能团中的至少一个将被激活。本领域的普通技术人员将理解，使用许多种标准方法和条件可以激活化学官能度，包括羟基、氨基以及羧基基团。在一个示例性实施方案中，本发明包含了一个作为反应性官能团的羧基官能度。羧基可以如此处以上说明被激活。
偶联物的实例
本发明的连接物可用于包含多卡霉素或CBI类似物作为细胞毒剂的偶联物中。本发明的偶联物的实例的进一步细节说明如下。除非另外指出，否则如以上有关细胞毒素以及连接物的相关章节中对取代基进行定义。
适当偶联物的一个实例是一种以下化学式的化合物
Figure A20088000589500681
其中
L1是一种自消性连接物；
m是一个整数0、1、2、3、4、5、或6；
F是包含以下结构的连接物：
Figure A20088000589500682
其中
AA1是选自下组的一个氨基酸，该组的构成为：天然氨基酸以及非天然α-氨基酸；
L2是自消性连接物；
o是0或1；
L4是一个连接物成员；
p是0或1；
X4是选自下组的一员，该组的构成为：受保护的反应性官能团、不受保护的反应性官能团、可检测的标记、以及靶向剂；并且
D包含一个结构：
其中环状体系A是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基的基团；
E以及G是独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、杂原子、以及单键中的成员，或E与G相接合来形成一个环状体系，该环状体系选自取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂芳基以及取代和未取代的杂环烷基；
X是选自O、S以及NR23中的一员；
R23是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、或酰基；
R3是OR11，
其中R11是选自下组的一员，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12、或SiR12R13R14，
其中R12、R13以及R14是独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、以及取代和未取代的芳基中的成员，其中R12以及R13与它们所附联的氮原子或碳原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系；
R4、R4’、R5、以及R5’是独立地选自下组的成员，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、SO3、SO2R15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，或者R4、R4’、R5以及R5’的任何相邻的一对与它们所附联的碳原子一起相接合以形成一个具有4至6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系；
其中
n是1至20的整数；
R15以及R16独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂芳基、取代和未取代的杂环烷基、以及取代和未取代的肽基，其中R15以及R16与它们所附联的氮原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系；
R6是一个单键，该单键存在或不存在，并且当其存在时，R6与R7相接合以形成一个环丙基的环；并且
R7是所述环丙基的环中与R6相接合的CH2-X1或-CH2-，其中
X1是离去基团，
其中R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15、或R16中的至少一个将所述的药物连接至L1(若存在时)、或连接至F；
或其药学上可接受的盐。
另一个实施方案是以下化学式的一种化合物
Figure A20088000589500701
其中
L1是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂烷基；
m是一个整数0、1、2、3、4、5、或6；
AA1是选自下组的一个氨基酸，该组的构成为：天然氨基酸以及非天然α-氨基酸；
L2是取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；
L3是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基；
o是0或1；
L4是一个连接物成员；
p是0或1；
X4是选自下组的一员，该组的构成为：受保护的反应性官能团、不受保护的反应性官能团、可检测的标记、以及靶向剂；并且
D包括一种结构：
Figure A20088000589500711
其中环状体系A是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基；
E以及G是独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、杂原子、以及单键中的一员，或E与G相接合来形成一个环状体系，该环状体系选自取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂芳基、以及取代和未取代的杂环烷基；
X是选自O、S以及NR23中的一员；
R23是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、或酰基；
R3是OR11，
其中R11是H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12、或SiR12R13R14，
其中R12、R13以及R14是独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、以及取代和未取代的芳基中的成员，其中R12以及R13与它们所附联的氮原子或碳原子一起可任选地相接合来形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的一个取代或未取代的杂环烷基环状体系；
R4、R4’、R5、以及R5’是独立地选自下组的成员，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、SO3、SO2R15、NR15R16、NR16C(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，或者R4、R4’、R5以及R5’的任何相邻的一对与它们所附联的碳原子一起相接合以形成一个具有4至6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系；
其中
n是1至20的整数；
R15以及R16独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂芳基、取代和未取代的杂环烷基、以及取代和未取代的肽基，其中R15以及R16与它们所附联的氮原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系；
R6是一个单键，该单键可存在或不存在，并且当其存在时，R6与R7相接合以形成一个环丙基的环；并且
R7是所述环丙基的环中与R6相接合的CH2-X1或-CH2-，其中
X1是离去基团，
其中R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15、或R16中的至少一个将D连接至化合物的其余部分；
或其药学上可接受的盐。
适合用作是偶联物的化合物的确切的实例包括
Figure A20088000589500721
Figure A20088000589500731
Figure A20088000589500741
其中X1是Cl或Br。在某些优选的实施方案中，X1是Cl。
药物配方与给药
在另一个优选的实施方案中，本发明提供一种包括本发明化合物及药学上可接受的载体的药物配方。
此处所述化合物包括药学上可接受的载体(如加成盐类或其水合物)，可使用多种途径或多种给药模式递送给病人。适宜的给药途径包括但不限于吸入、经皮、口服、直肠、经黏膜、经肠道、及肠胃外给药，包括肌内注射、皮下注射、以及静脉内注射。优选地，本发明的偶联物系经肠胃给药，更优选地经静脉内给药。
如此处所使用，“给药”或“给药方式”等词意图涵盖直接或间接递送化合物至其预期作用部位的全部手段。
此处所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或水合物可单独给药或组合本发明的其他化合物给药，和/或与其他治疗剂组合成混合液给药。当然，可与本发明的化合物共同给药的治疗剂的选择将部分取决于处理的病情。
例如，当对患有由依赖自体诱导剂的有机体引发的疾病状态的病人给药时，本发明化合物可以包含药剂的混合液给药，该药剂用来治疗与该疾病常见相关联的疼痛、感染、以及其他症状和副作用的药剂的。此类药剂包括止痛剂、抗生素等。
当对接受癌症治疗的病人给药时，化合物可在包含抗癌剂和/或补充增强剂的混合液中给药。化合物也可在包含治疗放射性治疗的副作用的药剂的混合液中给药，该药剂例如止吐剂、辐射保护剂等。
可与本发明化合物共同给药的补充增强剂包括(例如)三环抗抑郁剂(丙米嗪、去甲丙咪嗪、阿米替林、氯米帕明、曲米帕明、多塞平、去甲替林、普罗替林、氯氧平、马普替林)；非三环抗抑郁药(舍曲林、曲唑酮、及西塔洛潘(citalopram))；Ca+2拮抗剂(例如维拉帕米、硝苯地平、尼群地平、及卡罗维林)；两性霉素；曲帕拉醇类似物(例如它莫西芬)；抗心律不齐药(例如奎尼丁)；抗高血压药(例如利血平)；硫醇排空剂(例如布席欧宁(buthionine)、以及舒服希敏(sulfoximine))；及亚叶酸钙。
本发明的活性化合物可本身给药，或以药物组合物的形式给药，其中该活性化合物混合一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。根据本发明使用的药物组合物典型地是以常规方式配制，使用一种或多种包含赋形剂及助剂的生理上可接受的载体，该载体促进将活性化合物加工成为制剂，该制剂可供药用。适当配方是取决于所选择的给药方式的途径。
对于经黏膜的给药方式，在配方中使用了适合欲穿透的障壁的穿透剂。此类渗透剂通常在本领域是已知的。
对于口服给药方式，可容易地通过将活性化合物与本领域所熟知的药学上可接受的载体相组合来配制化合物。此类载体使得本发明化合物能够配制成为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液剂、凝胶剂、糖浆、料浆、悬浮液等，供待治疗的病人口服食用。供口服用的药物制剂可通过固体赋形剂获得，任选地将所得的混合物磨碎，并加工颗粒混合物(如果希望的话，可在添加合适的助剂后)，从而得到片剂或糖锭剂核心。适当赋形剂特别地是填充剂，例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如果希望，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或它的盐，例如海藻酸钠。
糖锭剂核心用合适的涂层提供。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，该糖溶液可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液，以及合适的多种有机溶剂或多种溶剂混合物。可将染料或颜料添加到片剂或糖锭剂的涂层以用于识别或标明活性化合物剂量的不同组合。
可用于口服的药物制剂包括由明胶制成的插接式胶囊(push-fitcapsule)以及由明胶和一种增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封式软胶囊。插接式胶囊可包含与一种填料(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)，和/或润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及，任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，该活性化合物可溶解或悬浮于合适的液体中(如脂肪油、液体石蜡，或液体聚乙二醇)。此外，可添加稳定剂。所有用于口服给药方式的制剂应当是处于适合于这种给药方式的剂量中。
对于口腔含化给药方式，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
对于通过吸入给药，根据本发明所使用的化合物可方便地使用适宜的推进剂(例如二氯二氟乙烷、三氯氟甲烷、克立氟烷、二氧化碳、或其他适宜气体)从加压包装或雾化器以气雾剂喷雾的形式递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供一阀以递送经过计量的量来决定。所制成的供在吸入器或吹入器使用的的胶囊和药筒(例如明胶的)被配制成包含化合物与适当粉末基(例如乳糖或淀粉)的粉状混合物。
可配制化合物用于通过注射进行肠胃外给药，例如通过大剂量注射或通过连续输注。注射是本发明组合物的一种优选的给药方法。注射用的配制品可呈现在单位剂型中，单位剂型例如包装于安瓿剂或包装于多剂量容器中。组合物可采取油性或水性载体中悬浮液、溶液或乳液形式，并可含有配方剂，例如可添加悬浮剂、稳定剂和/或分散剂，例如交联聚乙烯基吡咯酮、琼脂或海藻酸或例如海藻酸的盐。
肠胃外给药方式用的药物配制品包括呈水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，可将活性化合物的悬浮液制备成适当油性注射悬浮液。适宜的亲脂溶剂或亲脂载体包括脂肪油类(例如芝麻油)、或合成脂肪酸酯类(例如油酸乙酯或甘油三酯类)、或脂质体。水性注射悬浮液剂可包含提高悬浮液的黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可包含适宜的稳定剂或试剂，它们可提高化合物的溶解度，允许制备高度浓缩溶液。用于注射，本发明药剂可在水性溶液中配制，优选地在生理上可相容的缓冲液中配制，例如汉克氏溶液、林格氏溶液、或生理食盐水缓冲液。
可替代地，活性成分可呈粉末形式供在使用前用适宜运载体(例如无菌无热原水)配制。
化合物也可配制成直肠用组合物，例如栓剂或灌肠剂，例如包含常规栓剂基例如可可缓冲液或其他甘油酯类。
除了先前说明的配制品之外，化合物还可配制成长效制剂。此类长时间作用的配制品可通过植入或通过经皮递送(例如皮下递送或肌内递送)、肌内注射或经皮贴片给药。因此，例如，化合物可使用适宜聚合物料或疏水性材料(例如，接受的油中的乳液剂)或离子交换树脂、或呈极微溶性衍生物(例如极微溶性盐)配制。
药物组合物也可包含适宜的固相或凝胶相载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉类、纤维素衍生物、明胶、以及聚合物(例如聚乙二醇)。
优选的药物组合物是配制供注射用的组合物，例如静脉内注射，并基于总的药物组合物的100％重量，包括约0.01％到约100％按重量计的药物偶联物。药物偶联物可以是抗体-细胞毒素-偶联物，其中已经选择该抗体来靶向特定癌症。
文库
在本发明范围内也包含细胞毒素、细胞毒素-连接物以及本发明的细胞毒素与连接物的药剂-连接物偶联物的文库。文库的实例包括至少10种化合物，更优选的至少100种化合物，甚至更优选的至少1000种化合物，以及又更优选的至少100,000种化合物。文库是以方便查询具体特性的形式，例如查询细胞毒性、连接物由酶或其他切割剂切割。示例性的形式包括芯片格式、微阵列、以及类似物。
平行合成或组合合成的主要目的是生成多样化分子的一个文库，这些分子全部共享一个共同的特征，该共同特征在本文说明中称作为支架。通过在支架分子的可变部分(part)各自取代不同部分(moiety)，在文库中可探测的空间的量生长。理论及现代药物化学提倡一种概念，占据的空间作为决定一种给定化合物作为针对一种给定生物靶标的效力的关键因素。通过产生一个多样的分子文库(该文库探索大量百分比的靶向空间)，大大增加了发展高度有效导向化合物的机率。
平行合成通常是在固相支撑体例如聚合物树脂上进行。支架或其他适宜的中间体可通过化学连接物可切割地被系到树脂。进行反应来修饰支架同时反应被系到颗粒。反应物和/或反应条件的变化产生结构的多样性，这是各个文库的特点。
“小”分子(具有分子量200至1000的非寡聚物)的平行合成在1990年的前罕见尝试进行合成。参见例如Camps.et al.，Annaksde Quimica，70：848(1990)。最近Ellmann披露了11种苯并二氮类似物连同一些前列腺素及β-转模拟物(beta-turn mimetic)的固相支撑的并列(也称作为“组合的”)合成。这些披露举例说明于美国专利号5,288,514。小分子的平行合成的另一项相关披露可在美国专利号5,324,483中找到。这项专利披露在十六个不同支架中各自平行合成4至40种化合物。Chen等人也在聚合物支撑体上使用多步骤方法，应用有机合成策略来发展的非肽文库。(Chen et al.，J.Am.Chem.Soc.，116：2661-2662(1994))。
一旦制备了独特化合物的文库，可使用自动诱导剂文库作为起点并使用此处所述方法来制备免疫偶联物或抗体的文库。
试剂盒
在另一方面，本发明提供包含一种或多种本发明化合物或组合物以及该化合物或组合物的使用指南的试剂盒。在一个示例性实施方案中，本发明提供将本发明的连接物偶联至另一个分子的试剂盒。试剂盒包括连接物及将连接物附联至特定官能团的指南。试剂盒还可以或可替代地包括细胞毒类药物、靶向剂、可检测的标记、以及药物盐类或药物缓冲液中的一种或多种。试剂盒还包括一个容器及任选地一种或多种小瓶、试管、烧瓶、瓶子、或注射器。试剂盒的其他形式对本领域的普通技术人员将是明白的并且是在本发明的范围之内。
纯化
在另一个示例性实施方案中，本发明提供一种分离本发明的配体-细胞毒素的分子靶标的方法，该分子靶标是结合至配体X4。该方法优选的包括将靶标的细胞制剂与固定的化合物接触，由此形成受体与固定的化合物之间的一种复合物。
本发明的细胞毒素可通过任何领域了解的手段被固定在亲和支撑体上。可替代地，细胞毒素可使用本发明的连接物中的一种或多种来固定。
在又另一个具体实施方案中，本发明提供一种亲和纯化基体。
本发明的靶标分离方法典型是利用一项或多项亲和层析技术。亲和层析术允许利用对某些所支载的化学结构式有高度选择性的辨识位置，来有效分离各种化合物，例如活质分子或生物聚合物。文献有大量的关于亲和层析术主题的文章、专著及书籍，包括亲和层析术支撑体、交联成员、配体及其制备及其使用的文章。这些参考文献例如包括：Ostrove，Methods Enzymol.182：357-71(1990)；Ferment，Bioeng.70：199-209(1990).Huang et al.，J.Chromatogr.492：431-69(1989)；“Purification of enzymes by heparin-Sepharoseaffinity chromatography，”J.Chromatogr.，184：335-45(1980)；Farooqi，Enzyme Eng.，4：441-2(1978)；Nishikawa，Chem.Technol.，5(9)：564-71(1975)；Guilford et al.，in，PRACT.HIGHPERFORM.LIQ.CHROMATOGR.，Simpson(ed.)，193-206(1976)；Nishikawa，Proc.Int.Workshop Technol.Protein Sep.Improv.Blood Plasma Fractionation，Sandberg(ed.)，422-35；(1977)“Affinity chromatography of enzymes，”Affinity Chromatogr.，Proc.Int.Symp.25-38，(1977)(Pub.1978)；以及AFFINITY CHROMATOGRAPHY：APRACTICAL APPROACH，Dean et al.(ed.)，IRL PressLimited，Oxford，England(1985)。本领域的普通技术人员利用本发明材料发展特殊亲和层析术方法有大量指南。
在本发明的方法中，可使用多种化学结构式的亲和层析术介质来作为支撑体。例如，琼脂糖凝胶及交联琼脂糖凝胶由于其亲水性，让其相对不含非特异性结合故也可用作为支撑体材料。其他有用的支撑体例如包括具有经过控制孔隙的玻璃(CPG)珠粒、纤维素颗粒、聚丙烯酰胺、凝胶珠粒及由葡聚糖及表氯醇所制造的西法戴斯(SephadexTM)凝胶珠粒。
药物偶联物的使用方法
除了以上说明的组合物及构建物之外，本发明也提供可利用本发明化合物及偶联物实施的多种方法。使用本发明的药物-配体偶联物的方法包括：杀死或抑制肿瘤细胞或癌细胞的生长或复制；治疗癌症；治疗前期癌症；杀死或抑制可表现自体免疫抗体的细胞的生长或复制；治疗自身免疫疾病；治疗传染病；预防肿瘤细胞或癌细胞的增生；预防癌症；预防可表现自体免疫抗体的细胞繁殖；预防自身免疫疾病；及预防传染病。这些使用方法包含对有需要的动物例如哺乳动物或人类，施予有效量的药物-配体偶联物。在某些实施方案中，酶可分开给药，这样酶变成与肿瘤或靶标细胞相关联。
本发明的药物-配体偶联物复合物例如可用于治疗例如动物体的癌症、自身免疫疾病及传染病。通过对个体以药学上可接受的方式提供肿瘤治疗用组合物及方法，是通过以药学上有效量的本发明组合物对个体以药学上可接受的方式提供该组合物。
本发明特别可用于治疗动物体的癌症，以及用于抑制肿瘤细胞或癌细胞的增生。癌症或癌前病变包括但不限于肿瘤、肿瘤转移或以未经控制的细胞生长为特征的任何疾病或病症可通过给药本发明的药物-配体复合物来治疗或预防。该复合物递送药物至肿瘤细胞或癌细胞。
在使用药物-配体复合物的一个实例中，配体特异性结合或关联癌细胞相关的抗原或肿瘤细胞相关的抗原。由于药物与配体的紧密接合，药物可通过受体所媒介的吞噬作用而被吞噬入肿瘤细胞或癌细胞内部。抗原可附联至肿瘤细胞或癌细胞，或抗原可以是与肿瘤细胞或癌细胞结合的胞外基质蛋白质。一旦偶联物在细胞内部，连接物被肿瘤细胞或癌细胞相关的蛋白酶切割，由此释放药物。释放出的药物可自由扩散并且诱导细胞毒活性。在另一个实施方案中，药物是从肿瘤细胞或癌细胞外侧的药物-配体复合物切割，随后药物穿透该细胞。
配体可结合至(例如)肿瘤细胞或癌细胞、在肿瘤细胞或癌细胞表面上的肿瘤细胞或癌细胞的抗原、或属于肿瘤细胞或癌细胞相关胞外基质蛋白质的肿瘤细胞或癌细胞的抗原。配体可对特定肿瘤细胞类型或癌细胞类型设计。因此，通过配体的选择可改变可有效治疗的肿瘤类别或癌症类别。
可由偶联物靶向的癌前病变的代表性实例包括但不限于：组织转化、超常增生、发育异常、结肠直肠息肉、光化性角化症、光化性唇炎、人乳头瘤病毒、粘膜白斑病、扁平苔藓及博温氏病。
可由偶联物靶向的癌症或肿瘤的代表性实例包括但不限于：肺癌、结肠癌、前列腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、睪丸癌、中枢神经系统癌、肾细胞癌(renal cancer)、肾癌、胰腺癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、子宫颈癌、及白血病。用于偶联物中的特定配体或可切割的底物可选择让其将该药物靶向于欲使用该药物进行治疗的肿瘤组织，这对于本领域的普通技术人员是容易明白的。
在一个实施方案中，本发明提供一种杀死细胞的方法。该方法包括对该细胞施予足够杀死该细胞的量的本发明化合物。在一个示例性实施方案中，对有该细胞受试者施予该化合物。在又一个示例性实施方案中，该给药是用来延缓或中止包括该细胞(例如细胞可以是肿瘤细胞)的肿瘤的生长。用于延缓生长的给药，细胞生长速率须比给药前的生长速率至少低10％。优选的，生长速率须延缓至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或完全停止。
有效剂量
适合用于本发明的药物组合物包括其中含有治疗有效量，即可有效达成其所希望的目的的量的活性成分的组合物。对特定应用的实际有效量将依据待治疗的病症决定。有效量的确定是在本领域的那些技术人员的能力范围之内，特别是鉴于在此处的详细披露。
对此处所述的任何化合物，治疗有效量初步可由细胞培养测定来确定。目标血浆浓度为可抑制细胞生长或细胞分裂的活性化合物的浓度。在优选的实施方案中，细胞活性为至少抑制25％。目前以可诱导抑制细胞活性至少约50％、75％、或甚至90％或以上的活性化合物的目标血浆浓度是优选的。病人体内细胞活性的抑制百分比可经监测来评估所达成的血浆药物浓度的适宜性，剂量可向上或向下调整来达成期望的抑制百分比。
如本领域所熟知，供人体使用的治疗有效量也可由动物模型确定。例如，供人类使用剂量可经配制来达成在动物体内有效的循环浓度。人体剂量可通过监测细胞抑制作用并且如以上说明上下调整剂量来进行调整。
治疗有效剂量还可以从已知具有类似的药理活性的化合物用于人体的数据来确定。应用剂量可基于给药化合物比较已知化合物的相对生物利用率及强度进行调整。
基于以上说明的方法及本领域的普通技术人员所熟知的其他方法，调整剂量来在人体达成最大功效，是在本领域的普通技术人员的能力范围之内。
在局部给药的情况下，给药化合物的系统循环浓度并无特殊重要性。在此类情况下，化合物经给药来以便在局部区域达到可有效获得预期结果的浓度。
为用于与细胞增殖异常有关的疾病预防和/或治疗，所给化合物的循环浓度优选为大约0.001μM到20μM，其中优选大约0.01μM到5μM。
此处说明的化合物的患者口服给药方式的剂量典型地是从大约1mg/天到大约10,000mg/天的范围内，更典型地从大约10mg/天到大约1,000mg/天，并且最典型地从大约50mg/天到大约500mg/天。按照患者体重所述，典型的剂量是从大约0.01到大约150mg/kg/天的范围内，更典型地从大约0.1到大约15mg/kg/天，并且最典型地从大约1到大约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
在至少一些实施方案中，患者的延缓或抑制肿瘤生长的剂量可以是1μmol/kg/天或者更少。例如，患者的剂量可以是0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15、0.1、0.05、0.03、0.01、或者0.005μmol/kg/天或者更少(按照药物的摩尔量)的药物或药物偶联物，如抗体-药物偶联物。优选地，药物或药物偶联物当在至少5天时间内以日剂量给药时，延缓肿瘤的生长。在至少一些实施方案中，该肿瘤为SCID小鼠体内的人的类型的肿瘤。作为一个例子，SICD小鼠可以是CB17.SCID小鼠(可从Taconic，Germantown，NY获得)。
至于其他给药模式，剂量及间隔可个别调整来获得对待治疗的临床适应症是有效的给药化合物的血浆水平。例如，在一个实施方案中，根据本发明的化合物可以相对高浓度每天给药多次。可替代地，更希望的是以最低有效浓度并且使用较不频繁的给药方案来施予本发明化合物。因此将提供识别个别疾病严重程度的治疗方案。
利用此处所提供的教导，可计划有效的治疗方案，该方案不会造成实质毒性，但又可完全有效治疗由特定病人所表现的临床症状。这项计划应通过考虑以下因素来仔细选择活性化合物，这些因素例如化合物强度、相对生物利用率、病人体重、是否存在有副作用及副作用严重程度、所选药剂的优选的给药模式、及毒性性质。
本发明的化合物、组合物及方法将通过以下实例进一步展示。提供这些实例是为了展示但并不限制本申请所请求的发明。
实例
材料和方法
在以下实例中(除非另外说明)温度是以摄氏度数(℃)给出；操作是在室温或环境温度(典型在约18-25℃的范围)进行；溶剂的蒸发是使用旋转蒸发器在减压下(典型为4.5-30mmHg)、浴温达到60℃进行；反应过程典型是通过TLC追踪，并且提供反应时间仅用于说明；熔点是未校正的；产物显示了满意的1H-NMR资料和/或微分析资料；提供产量仅用于举例说明；也使用以下常规缩写：mp(熔点)、L(升)、mL(毫升)、mmol(毫摩尔)、g(克)、mg(毫克)、min(分钟)、LC-MS(液相色谱-质谱)、以及h(小时)。
在Varian Mercury 300MHz光谱仪上测量1H-NMR光谱，并与所设计的结构符合一致。化学移位是以距四甲基硅烷低磁场的每百万份的份数(ppm)报告。在Perkin Elmer Sciex API 365质谱仪上记录电喷射质谱数据。由罗博森微里特实验室(Robertson MicrolitLaboratories，Madison，NJ)进行元素分析。用于快速层析法的硅胶是E.Merck等级(230-400筛目)。在HP 1100或Varian ProStar 210仪器上进行反相分析HPLC，HP 1100或Varian ProStar 210仪器带有Phenomenex Luna 5μm C-18(2)150mmx4.6mm柱或VarianMicrosorb-MV 0.1μm C-18150mmx4.6mm柱。使用1mL/min流速，使用0％至50％缓冲液B梯度经15分钟，或10％至100％缓冲液B梯度经10分钟，通过UV在254nm处检测。缓冲液A，20mM甲酸铵+20％乙腈或0.1％乙腈中的三氟乙酸；缓冲液B，20mM甲酸铵+80％乙腈或0.1％水性三氟乙酸。在Varian ProStar 215仪器上进行反相制备性HPLC，该仪器带有Waters Delta Pak 15μm C-18 300mmx7.8mm柱。
实例1
Figure A20088000589500851
化合物1的合成：
向在DMF(50mL)中的2-溴乙基胺溴化物(5g，24.4毫摩尔)的溶液内添加二异丙基乙胺(8.5mL，48.8毫摩尔)及氯甲酸苄酯(3.48mL，24.4毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌2小时。反应混合物经浓缩，并将残余物在硅胶上用乙酸乙酯/己烷(3/7)梯度通过快速层析法纯化以给出呈一种油的化合物1(4g，64％)。1H NMR(CDCl3)δ3.54(bs，2H)，3.61(bs，2H)，5.12(s，2H)，7.36(m，5H)。
化合物2的合成：
向化合物1(3.34g，12.99毫摩尔)和在DMF(50mL)中的缬氨酸叔丁基酯(3.27g，15.59毫摩尔)的一种溶液内添加碳酸钾(5.39g，38.97毫摩尔)和碘化钾(2.59g，15.59毫摩尔)。如此获得的混合物在100℃下搅拌过夜。反应混合物经浓缩，并将残余物在硅胶上用乙酸乙酯/己烷(2/8)梯度通过快速层析法纯化以给出呈一种油的化合物2(3.12g，69％)。1H NMR(CDCl3)δ0.92(m，6H)，1.46(s，9H)，1.86(m，1H)，2.53(m，1H)，2.80(m，2H)，3.18(m，1H)，3.31(m，1H)，5.10(s，2H)，5.25(bs，1H)，7.36(m，5H)；LC-MS(ESI)296(M+H-叔丁基+)，352(M+H+)。
化合物3的合成：
将化合物2(3.4g，9.72毫摩尔)和在甲醇(30mL)中的钯炭(200mg)的一种溶液在室温置于氢气大气压下。如此获得的混合物在室温下搅拌2小时。将钯过滤，并反应混合物浓缩至干燥以给出呈一种油的化合物3(2.1g，98％)。1H NMR(CD3OD)δ0.94(m，6H)，1.47(s，9H)，1.63(bs，2H)，1.90(m，1H)，2.47(m，1H)，2.73(m，2H)。
化合物4的合成：
在0℃向在二氯甲烷(30mL)中的化合物3(2.1g，9.72毫摩尔)的溶液内添加FmocOSu(N-(9-芴基甲氧羰基氧基)丁二酰亚胺(3.28g，9.72毫摩尔)。如此所得的混合物在0℃搅拌2小时。将混合物浓缩至干燥，然后将残余物在硅胶上通过快速层析法用100％二氯甲烷纯化，接着用在二氯甲烷中的0.5％甲醇，及最后用在二氯甲烷中的1％甲醇作为梯度以给出呈无色油的化合物4(2.55g，60％)。1H-NMR(CDCl3)δ1.03(d，3H)，1.14(d，3H)，1.52(s，9H)，2.28(m，1H)，3.14(m，2H)，3.46(m，2H)，3.89(d，1H)，4.24(m，1H)，4.44(m，2H)，7.29(m，2H)，7.40(m，2H)，7.64(m，2H)，7.80(d，2H)；LC-MS(ESI)383(M+H-tbutyl+)，440(M+H+)，462(M+Na+)，478(M+K+)。
化合物5的合成：
向在四氢呋喃-水(3/1，8mL)中的化合物4(177mg，0.4毫摩尔)的一种溶液内通入HCl气体5分钟。将反应混合物在37℃搅拌过夜，然后将混合物浓缩至干燥以给出呈固体的化合物5(168mg，98％)，该化合物未经进一步纯化即用于下一步骤。1H-NMR(CDCl3)δ1.04(d，3H)，1.14(d，3H)，2.32(m，1H)，3.18(m，2H)，3.46(m，2H)，3.95(d，1H)，4.22(m，1H)，4.42(m，2H)，7.29(m，2H)，7.39(m，2H)，7.64(m，2H)，7.79(d，2H)；LC-MS(ESI)383(M+H+)，405(M+Na+)。
化合物6的合成：
向在THF(15mL)中的N-甲基-1，2-苯二胺(2mL，17.6毫摩尔)的一种溶液内添加二-叔丁基重碳酸酯(3.32g，15.2毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂除去，并将残余物在硅胶上用己烷中的30％乙酸乙酯作为梯度通过快速层析法纯化以给出呈无色油的化合物6(1.12g，32％)。1H NMR(CDCl3)δ1.46(b s，9H)，3.15(s，3H)，3.73(bs，2H)，6.75(d，2H)，7.06(m，2H)。
化合物7的合成：
在0℃向在二氯甲烷(30mL)中的化合物6(777mg，3.05毫摩尔)的一种溶液内添加2-硝基苯磺酰氯(811mg，3.66毫摩尔)及二异丙基乙胺(796μL，4.57毫摩尔)。如此所得的混合物在室温搅拌过夜。将溶剂除去，并将残余物在硅胶上用10％己烷中的乙酸乙酯作为梯度通过快速层析法纯化以给出呈黄色固体的化合物7(1.17g，94％)。1H NMR(CDCl3)δ1.49(bs，9H)，2.47及2.61(2bs，3H)，7.O 5(bd，1H)，7.27(m，2H)，7.56-7.92(m，5H)。
化合物8的合成：
向在DMF(50mL)中的化合物7(326mg，0.8毫摩尔)内添加碳酸钾(164mg，1.19毫摩尔)及甲基碘(148μL，2.39毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂除去，并将残余物在硅胶上用10％己烷中的乙酸乙酯作为梯度通过快速层析法纯化以给出呈黄色固体的化合物8(370mg，65％)。1H NMR(CD3OD)δ1.35及1.52(2s，9H)，3.16及3.21(2s，3H)，3.26及3.29(2s，3H)，6.93(d，1H)，7.20(m，1H)，7.6(m，2H)，7.68-7.80(m，4H)；LC-MS(ESI)444(M+Na+)，460(M+K+)。
化合物9的合成：
在室温下向在二氯甲烷(5mL)中的化合物8(355mg，0.85毫摩尔)的一种溶液内添加三氟乙酸(5mL)。将反应混合物搅拌30分钟，然后分配于乙酸乙酯(100mL)以及饱和碳酸氢钠铵(200mL)之间。将有机层用盐水(100mL)洗涤，在Na2SO4上进行干燥并进行浓缩以给出呈白色固体(270mg，98％)的游离胺(化合物9)。1H NMR(CDCl3)δ2.68(s，3H)，3.30(s，3H)，6.56(m，2H)，6.88(m，1H)，7.20(m，1H)，7.48(m，1H)，7.57(m，1H)，7.65(m，2H)。
化合物10的合成：
在0℃向在二氯甲烷(10mL)中的化合物9(270mg，0.84毫摩尔)的一种溶液内添加2N的在甲苯中的碳酰氯(440μL，2.5毫摩尔)。将混合物搅拌30分钟，并浓缩至干燥以给出呈白色固体的化合物10(297，92％)，该化合物未经进一步纯化即用于下一步骤。1H NMR(CDCl3)δ3.25及3.30(2s，3H)，3.34及3.44(2s，3H)，6.98(m，1H)，7.25-7.40(m，2H)，7.45(m，1H)，7.55-7.80(m，4H)；LC-MS(ESI)384(M+H+)，407(M+Na+)，422(M+K+)。
化合物11的合成：
向在含10％DMF的THF溶液(3mL)中的化合物10(120mg，0.31毫摩尔)的一种溶液内添加Boc-Cit-PABOH((S)-叔丁基-1-(4-(羟甲基)苯氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷(ureidopentan)-2-基氨基甲酸酯(238mg，0.62毫摩尔)、N，N-二甲基氨基吡啶(76mg，0.62毫摩尔)、以及二异丙基乙胺(55μL，0.31毫摩尔)。如此获得的混合物在65℃下搅拌10天。将溶剂除去，并将残余物在硅胶上用二氯甲烷中的5％甲醇为梯度通过快速层析法纯化以给出呈固体的化合物11(90mg，40％)。1H NMR(CD3OD)δ1.43(bs，9H)，1.56-1.70(m，3H)，1.79(m，1H)，3.06-3.27(m，8H)，4.17(2m，1H)，5.04and5.17(2b s，2H)，6.89and 6.95(2d，1H)，7.15-7.26(m，2H)，7.37-7.72(m，8H)，7.80(m，1H)；LC-MS(ESI)729(M+H+)，751(M+Na+)，767(M+K+)。
化合物12的合成：
向在DMF(2mL)中的化合物11(84mg，0.11毫摩尔)的一种溶液内添加碳酸钾(48mg，0.33毫摩尔)以及苯硫酚(60μL，0.55毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌2小时。将溶剂除去，并将残余物在硅胶上用二氯甲烷中的5％甲醇为梯度通过快速层析法纯化以给出呈一种固体的化合物12(55mg，87％)。1H NMR(CD3OD)δ1.44(bs，9H)，1.56-1.70(m，3H)，1.78(m，1H)，2.76(b s，3H)，3.05-3.20(m，5H)，4.17(bs，1H)，4.99(bs，2H)，6.62(m，2H)，6.93(m，1H)，7.15(m，2H)，7.40-7.60(m，3H)；LC-MS(ESI)，566(M+Na+)，581(M+K+)。
化合物13的合成：
向在二氯甲烷(3mL)中的化合物12(65mg，0.12毫摩尔)的一种溶液内添加2N甲苯中的碳酰氯(180μL，0.36毫摩尔)。如此获得的混合物在0℃下搅拌1小时。然后将混合物浓缩至干燥以给出一种油(72mg，100％)，该油未经进一步纯化即用于下一步骤。
向这种油(72mg，0.12毫摩尔)在二氯甲烷(1mL)中含有5％N-甲基吡咯烷酮的溶液内添加化合物18(参见以下实例2)(25mg，0.06毫摩尔)及N，N-二甲基氨基吡啶(22mg，0.18毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物13(15mg，35％)。1H NMR(CD3OD)δ1.42(bs，9H)，1.45-1.80(m，4H)，2.97(bs，6H)，3.10-3.36(m，7H)，3.57(bs，3H)，3.98(bs，1H)，4.10-4.35(m，4H)，4.50-4.75(m，3H)，5.15(bs，2H)，7.16-7.95(m，16H)，8.2(d，1H)；LC-MS(ESI)，1034(M+H+)，1056(M+Na+)，1073(M+K+)。
化合物14的合成：
在室温下向在二氯甲烷(0.5mL)中的化合物13(13mg，0.011毫摩尔)的一种溶液内添加三氟乙酸(0.5mL)。如此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。然后将混合物浓缩至干燥以给出一种油，该油未经进一步纯化即用于下一步骤。
向在二氯甲烷(0.5mL)中的TFA盐化胺的一种溶液内添加化合物5(5mg，0.012毫摩尔)、苯并三唑-1-基-氧代-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟磷酸盐(BOP)(6mg，0.013毫摩尔)及二异丙基乙胺(8μL，0.044毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物14(9mg，50％)。1H NMR(CD3OD)δ1.03及1.10(2m，6H)，1.60(m，2H)，1.80(m，2H)，2.20(m，1H)，2.99(s，6H)，3.04-3.50(m，11H)，3.60(bs，3H)，3.8(bs，1H)，4.00(bs，1H)，4.20-4.45(m，6H)，4.50-4.75(m，4H)，5.15(bs，2H)，7.20-7.70(m，22H)，7.77(d，2H)，7.90(bs，2H)；LC-MS(ESI)，1300(M+H+)。
化合物15的合成：
在室温下向在DMF(0.5mL)中的化合物14(9mg，0.006毫摩尔)的一种溶液内添加哌啶(6μL，0.06毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。然后将混合物浓缩至干燥以给出一种油，该油未经进一步纯化即用于下一步骤。
向在含10％DMF的二氯甲烷的溶液(1mL)中的含该油的一种溶液内添加N-(y-maleimidobutyrloxy}丁二酰亚胺酯(GMBS)(3.5mg，0.012毫摩尔)及二异丙基乙胺(2μL，0.012毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物15(6.5mg，75％)。1H NMR(CD3OD)δ1.04-1.13(m，6H)，1.65(m，2H)，1.75(m，1H)，1.90(m，3H)，2.23(m，3H)，2.98and 3.01(2s，6H)，3.05-3.25(m，6H)，3.60(m，2H)，3.45-3.55(m，6H)，3.64(t，2H)，3.80(m，2H)，4.05(m，1H)，4.35(b s，1H)，4.41(m，2H)，4.55(m，2H)，4.80(m，1H)，5.15(bs，2H)，6.78(s，2H)，7.22(dd，2H)，7.35-7.65(m，11H)，7.90-8.00(m，3H)，7.77(d，2H)，7.90(bs，2H)；LC-MS(ESI)，1243(M+H+)。
实例2
Figure A20088000589500911
Figure A20088000589500921
化合物16的合成：
在室温下向在DMF(45mL)中的Fmoc-Cit-PABOH(2g，3.98毫摩尔)的一种溶液内添加哌啶(5mL)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将混合物浓缩至干燥，然后残余物在硅胶上通过快速层析法纯化，使用100％二氯甲烷，接着是在二氯甲烷中的10％甲醇及最后是在二氯甲烷中的30％甲醇为梯度以给出呈无色油的H-Cit-PABOH(1g，90％)。
向在DMF(4mL)中的H-Cit-PABOH(80mg，0.28毫摩尔)的一种溶液内添加化合物5(100mg，0.24毫摩尔)(见实例1制备)，HATU(100mg，0.26毫摩尔)及二异丙基乙胺(125μL，0.84毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物16(119mg，66％)。1H NMR(CD3OD)δ1.03-1.11(2d，6H)，1.58(m，2H)，1.77(m，1H)，1.88(m，1H)，2.23(m，1H)，3.05-3.20(m，4H)，3.44(m，2H)，3.83(d，1H)，4.21(m，1H)，4.39(m，2H)，4.54(b s，2H)，4.60(m，1H)，7.30(m，4H)，7.37(m，2H)，7.51(m，2H)，7.62(m，2H)，7.77(m，2H)，8.80(d，1H)，10.05(s，1H)；LC-MS(ESI)，646(M+H+)，668(M+Na+)，684(M+K+)。
化合物17的合成：
向在含10％NMP的二氯甲烷(4mL)的化合物16(190mg，0.25毫摩尔)的一种溶液内添加二异丙基乙胺(131μL，0.75毫摩尔)，N，N-二甲基氨基吡啶(15mg，0.12毫摩尔)及4-硝基苯基氯甲酸酯(101mg，0.5毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物17(151mg，65％)。(CD3OD)δ1.04-1.11(2d，6H)，1.59(m，2H)，1.79(m，1H)，1.89(m，1H)，2.24(m，1H)，3.05-3.20(m，4H)，3.44(m，2H)，3.83(d，1H)，4.20(m，1H)，4.39(m，2H)，4.60(m，1H)，5.22(bs，1H)，7.29(m，2H)，7.39(m，4H)，7.60(m，4H)，7.75(d，2H)，8.81(d，1H)，10.05(s，1H)；LC-MS(ESI)，811(M+H+)，833(M+Na+)，848(M+K+)。
化合物19的合成：
在0℃向在含40％THF的二氯甲烷(8mL)中的化合物18(50mg，0.11毫摩尔)的一种溶液内添加4-硝基苯基氯甲酸酯(87mg，0.43毫摩尔)及三乙胺(88μL，0.64毫摩尔)。如此获得的混合物让其温热至室温并搅拌过夜。将溶剂蒸发，在醚中将残余物通过沉淀而分离，接着过滤以给出呈黄色固体的PNPC-18(60mg，90％)。
向在二氯甲烷(5mL)中的PNPC-18(60mg，0.095毫摩尔)的一种溶液内添加化合物boc哌嗪(71mg，0.38毫摩尔)及三乙胺(53μL，0.38毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物18(77mg，90％)。LC-MS(ESI)，678(M+H+)，700(M+Na+)，716(M+K+)。
化合物20的合成：
在室温下向在二氯甲烷(0.5mL)中的化合物19(28mg，0.035毫摩尔)的一种溶液内添加三氟乙酸(0.5mL)。如此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。然后将混合物浓缩至干燥以给出一种油，该油未经进一步纯化即用于下一步骤。
向在DMF(1mL)中的该油的一种溶液内添加化合物17(28mg，0.035毫摩尔)及二异丙基乙胺(18μL，0.105毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物20(36mg，70％)。1H NMR(CD3OD)δ1.03-1.10(2d，6H)，1.58(m，2H)，1.77(m，1H)，1.87(m，1H)，2.23(m，1H)，2.97(bs，6H)，3.05-3.20(m，4H)，3.30-3.85(m，14H)，3.97(m，1H)，4.19-4.41(m，6H)，4.60(m，2H)，4.69(m，1H)，5.11(bs，2H)，7.16(dd，1H)，7.27-7.38(m，7H)，7.45(m，1H)，7.51-7.63(m，7H)，7.76(d，2H)，7.85(d，2H)，8.24(bs，1H)，8.79(d，1H)，10.00(s，1H)；LC-MS(ESI)，1248(M+H+)。
化合物21的合成：
在室温下向在DMF(1mL)中的化合物20(36mg，0.024毫摩尔)的一种溶液内添加哌啶(12μL，0.12毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。然后将混合物浓缩至干燥以给出一种油，该油未经进一步纯化即用于下一步骤。
向在含10％DMF的二氯甲烷(1mL)中的该油的一种溶液内添加MAL-PEG4-NH酯(19mg，0.037毫摩尔)及二异丙基乙胺(8.5μL，0.048毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物21(25mg，62％)。1H NMR(CD3OD)δ1.06-1.12(2d，6H)，1.59(m，2H)，1.78(m，1H)，1.89(m，1H)，2.24(m，1H)，2.44(t，2H)，2.50(t，2H)，2.99(bs，6H)，3.05-3.20(m，4H)，3.46-3.85(m，34H)，3.99(m，1H)，4.25(m，1H)，4.35(m，2H)，4.59-4.73(m，3H)，5.13(b s，2H)，6.79(s，2H)，7.18(dd，1H)，7.31(d，1H)，7.36(m，2H)，7.47(m，1H)，7.58(m，5H)，7.89(m，2H)，8.24(bs，1H)，8.79(d，1H)；LC-MS(ESI)，1423(M+H+)。
化合物22的合成：
在室温下向在DMF(1mL)中的化合物20(26mg，0.017毫摩尔)的一种溶液内添加哌啶(9μL，0.088毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。然后将混合物浓缩至干燥以给出一种油，该油未经进一步纯化即用于下一步骤。
向含10％DMF的二氯甲烷(1mL)中的该油的一种溶液内添加GMBS(7.5mg，0.025毫摩尔)及二异丙基乙胺(6μL，0.034毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物22(13mg，52％)。δ1.07-1.13(2d，6H)，1.60(m，2H)，1.78(m，1H)，1.90(m，3H)，2.24(m，3H)，3.00(bs，6H)，3.05-3.24(m，4H)，3.42-3.74(m，16H)，3.78-3.90(m，4H)，4.00(m，1H)，4.34(m，1H)，4.39(m，2H)，4.60(m，1H)，4.80(m，2H)，5.14(bs，2H)，6.81(s，2H)，7.22(dd，1H)，7.37(m，3H)，7.50(m，1H)，7.60(m，5H)，7.92(m，2H)，8.24(bs，1H)，8.79(d，1H)，10.05(s，1H)；LC-MS(ESI)，1191(M+H+)。
实例3
Figure A20088000589500951
Figure A20088000589500961
化合物23的合成：
将乙基-5-硝基吲哚-2-羧酸酯(2g，8.5毫摩尔)和在含50％甲醇的二氯甲烷(100mL)中的钯炭(200mg)的一种溶液在室温置于氢气大气压下。如此获得的混合物在室温下搅拌2小时。将钯过滤，并反应混合物浓缩至干燥以给出呈无色油的化合物23(1.68g，97％)。1H NMR(CD3OD)δ1.38(t，3H)，4.34(q，2H)，6.86(dd，1H)，6.95(d，1H)，6.98(d，1H)，7.25(d，1H)。
化合物24的合成：
向在二氯甲烷(5mL)中的化合物23(300mg，1.47毫摩尔)的一种溶液内添加Boc2O(385mg，1.76毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩，并将残余物在硅胶上用己烷中的10％乙酸乙酯作为梯度通过快速层析法纯化以给出呈白色固体的化合物24(272mg，61％)。1H NMR(CD3OD)δ1.39(t，3H)，1.52(s，9H)，4.37(q，2H)，7.07(s，1H)，7.23(dd，1H)，7.34(d，1H)，7.68(bs，1H)。
化合物25的合成：
向在乙醇(3mL)中的化合物24(100mg，0.33毫摩尔)的一种溶液内添加溶于水(1mL)中的LiOH溶液(12mg，0.49毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下50℃搅拌2小时。将反应混合物浓缩至干燥，产生一种油。将残余物溶解于水中，并用10％HCl使之酸化到pH3，随后用EtOAc萃取。将有机溶液通过Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干燥以给出呈无色油的化合物25(85mg，92％)。1H NMR(CD3OD)δ1.51(s，9H)，7.07(d，1H)，7.23(dd，1H)，7.33(d，1H)，7.68(bs，1H)。
化合物26的合成：
在室温向在含30％DMF的二氯甲烷的溶液(3mL)中所含Fmoc-Cit-OH(206mg，0.52毫摩尔)的一种溶液内添加EDC(120mg，0.62毫摩尔)、HOBt(84mg，0.62毫摩尔)及4-氨基苯甲酸叔丁酯(120mg，0.62毫摩尔)。将如此所得的混合物搅拌10分钟，然后添加氯化铜(84mg，0.62毫摩尔)到混合物中。将该混合物搅拌过夜。将混合物浓缩至干燥，然后将残余物在硅胶上用二氯甲烷中的5％甲醇为梯度通过快速层析法纯化以给出呈无色油的化合物26(184mg，62％)。1H NMR(CD3OD)δ1.53-1.58(m，2H)，1.57(s，9H)，1.71(m，1H)，1.82(m，1H)，3.08(m，1H)，3.19(m，1H)，4.21(m，1H)，4.28(m，1H)，4.38(m，2H)，7.28-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.56-7.86(m，5H)，7.89(m，2H)；LC-MS(ESI)，573(M+H+)，595(M+Na+)，611(M+K+)。
化合物27的合成：
在室温下向在DMF(18mL)中的化合物26(1g，1.75毫摩尔)的一种溶液内添加哌啶(2mL)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将混合物浓缩至干燥，然后残余物通过快速层析法纯化，使用100％二氯甲烷，接着是在二氯甲烷中的5％甲醇及最后是在二氯甲烷中的20％甲醇为梯度以给出无色的油(561mg，92％)。
在室温下向在DMF(10mL)中的该油的一种溶液(561mg，1.6毫摩尔)内添加二异丙基乙胺(679μL，3.9毫摩尔)、化合物5(509mg，1.3毫摩尔)(参见实例1制备)及HATU(494mg，1.3毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌3小时。将混合物浓缩至干燥，然后将残余物在硅胶上用二氯甲烷中的5％甲醇为梯度通过快速层析法纯化以给出呈无色油的化合物27(691mg，65％)。1H NMR(CD3OD)δ1.36(dd，6H)，1.58-1.62(m，2H)，1.6(s，9H)，1.71(m，1H)，1.82(m，1H)，2.00(m，1H)，2.65(m，2H)，3.2-3.3(m，4H)，3.70(m，1H)，4.21(m，1H)，4.28(m，2H)，4.38(m，2H)，4.60(m，1H)，7.28-7.39(m，4H)，7.60-7.70(m，4H)，7.8(d，2H)，7.89(d，2H)；LC-MS(ESI)，716(M+H+)，737(M+Na+)，753(M+K+)。
化合物28的合成：
在室温下向在DMF(9mL)中的化合物27(300mg，0.45毫摩尔)的一种溶液内添加哌啶(1mL)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。然后将混合物浓缩至干燥以给出一种油，将该油临时存放于醚(20mL)中。将该材料过滤，得到一种白色固体(186mg，84％)。
向在二氯甲烷(1mL)中的游离胺(32mg，0.065毫摩尔)的溶液内添加MAL-PEG4-NH酯(50mg，0.097毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌4小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物28(47mg，95％)。1H NMR(CD3OD)δ1.10及1.15(2d，6H)，1.58-1.62(m，2H)，1.6(s，9H)，1.75(m，1H)，1.90(m，1H)，2.25(m，1H)，2.45(t，2H)，2.5(t，2H)，3.10-3.25(m，4H)，3.30(m，2H)，3.45-3.65(m，16H)，3.75(m，4H)，3.85(d，1H)，4.65(m，1H)，6.80(s，2H)，7.67(d，2H)，7.90(d，2H)，8.80(d，1H)，10.20(s，1H)；LC-MS(ESI)，891(M+H+)，913(M+Na+)，929(M+K+)。
化合物29的合成：
在室温下向在二氯甲烷(0.5mL)中的化合物28(47mg，0.062毫摩尔)的一种溶液内添加三氟乙酸(0.5mL)。如此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。然后将混合物浓缩至干燥以给出呈一种油的化合物29，该油未经进一步纯化即用于下一步骤(40mg，92％)。1H NMR(CD3OD)δ1.10and 1.15(2d，6H)，1.60(m，2H)，1.80(m，1H)，1.90(m，1H)，2.25(m，1H)，2.45(t，2H)，2.5(t，2H)，3.10-3.25(m，4H)，3.30(m，2H)，3.45-3.65(m，16H)，3.75(m，4H)，3.85(d，1H)，4.65(m，1H)，6.80(s，2H)，7.67(d，2H)，7.95(d，2H)，8.80(d，1H)；LC-MS(ESI)，836(M+H+)，858(M+Na+)，874(M+K+)。
化合物31的合成：
在室温下向在EtOAc(2mL)中的30(100mg，0.2毫摩尔)的一种溶液内添加浓缩的HBr的EtOAc(3mL)溶液。1小时后完成Boc脱保护。将沉淀出的材料过滤(定量的产量)。然后将TFA盐化胺溶解于DMF(3mL)。向此溶液内添加化合物25(55mg，0.2毫摩尔)、二异丙基乙胺(173μL，1毫摩尔)及HATU(79mg，0.2毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌3小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈白色固体的化合物31(86mg，57％)。1H NMR(CD3OD)δ1.54(s，9H)，2.91(s，3H)，3.10-3.60(m，8H)，3.72(m，1H)，3.97(m，1H)，4.30-4.60(m，3H)，6.94(bs，1H)，7.05(m，1H)，7.12(d，1H)，7.45(m，2H)，7.68(d，1H)，7.75(b s，1H)，7.86(d，1H)，8.23(bs，1H)；LC-MS(ESI)，562(M+H-100+)，606(M+H-56+)，662(M+H+)，685(M+Na+)，701(M+K+)。
化合物32的合成：
在室温下向在二氯甲烷(0.5mL)中的化合物31(30mg，0.039毫摩尔)的一种溶液内添加茴香醚(100μL)及三氟乙酸(0.4mL)。如此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。然后将该混合物浓缩至干燥以给出一种油，该油未经进一步纯化即用于下一步骤。
向该油的DMF溶液(1mL)内添加化合物29(36mg，0.039毫摩尔)、二异丙基乙胺(40μL，0.23毫摩尔)、以及HATU(15mg，0.039毫摩尔)。如此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发，并将残余物通过半制备性HPLC纯化以给出呈一种油的化合物32(36mg，60％)。1H NMR(CD3OD)δ1.09 and 1.15(2d，6H)，1.62(m，2H)，1.81(m，1H)，1.93(m，1H)，2.27(m，1H)，2.45(t，2H)，2.51(t，2H)，2.98(s，.3H)，3.13-3.25(m，4H)，3.47-3.62(m，24H)，3.76(m，4H)，3.82(m，1H)，3.85(d，1H)，4.20(m，1H)，4.55-4.70(m，4H)，6.79(s，2H)，7.06(s，1H)，7.36(bs，1H)，7.43-7.54(m，2H)，7.72-7.81(m，3H)，7.91(m，3H)，8.05(s，1H)，8.25(bs，1H)，8.82(d，1H)，10.25(s，1H)；LC-MS(ESI)，691(M+2H+)/2，1381(M+H+)，1419(M+K+)。
实例4
化合物3的合成：
在0℃将溴乙酰氯2(240μL，2.86毫摩尔)逐滴添加至2-氨基乙基氨基甲酸苄酯1(500mg，2.6毫摩尔)及10mL二氯甲烷中的TEA(800μL，5.7毫摩尔)的一种溶液内。让反应混合物搅拌2小时，并将温度逐渐升高至室温。将溶剂蒸发，接着进行水的后续处理以及用乙酸乙酯萃取。将有机层用10％柠檬酸、水、以及饱和碳酸氢钠、以及盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥以给出化合物3(260mg，32％产率)MS：M+1＝315.3.H1NMR(CDCL3)：7.37ppm(5H)，5.11ppm(2H)，3.83ppm(2H)，3.40ppm(4H)。
Figure A20088000589501011
化合物6的合成：
在9mLDCM/DMF(2∶1)的混合物中将1.5克Fmoc-Citruline 5(0.0038摩尔)、0.88克4-氨基苯甲酸叔丁酯4(0.0045摩尔)、0.6克HOBt(0.0045摩尔)、0.68克EDC(0.0043摩尔)及催化量的氯化铜搅拌过夜。去除溶剂，并将产物通过硅胶急骤柱层析法使用DCM中的5-10％MeOH进行纯化以给出化合物6(1.54g，71％产率)。MS：M+1＝573.9。
Figure A20088000589501012
化合物8的合成
化合物6(300mg，0.66毫摩尔)中的Fmoc保护基的脱保护是使用在DMF中的5％吡啶在20分钟时间内进行的。将溶剂蒸发，并将粗产物固体使用二乙醚漂洗以给出230mg化合物7(99％产率)。MS：M+1＝352。
将230mg化合物7(0.65毫摩尔)与在DMF中及DCM中的Fmoc-缬氨酸333mg(0.98毫摩尔)以及188mg EDC(0.98毫摩尔)进行反应，在硅胶上用在DCM中的5-10％MeOH纯化后以给出240mg化合物8(55％产率)。MS：M+1＝673。
化合物10的合成
500mg化合物8(0.75毫摩尔)使用吡啶在DMF中脱保护获得化合物9，在去除溶剂后将该化合物用二乙醚漂洗。未经进一步纯化的化合物9与235mg化合物3(0.75毫摩尔)在125mg KI(0.75毫摩尔)及313μL三乙胺存在下在40℃反应2小时。将粗反应混合物浓缩，并通过反相HPLC纯化获得300mg化合物10，55.8％产率。MS：M[+1]＝685。
化合物11的合成
用HCL-EA将化合物10(300mg)脱保护3小时。将溶剂蒸发，并将产物在高度真空下干燥以给出化合物11。MS：M[+1]＝628。H1 NMR(DMSO)：10.45ppm(1H)，8.8ppm(1H)，8.5(1H)，7.88ppm(2H)，7.75ppm(2H)，7.3ppm(5H)，6.1(1H)，5.5(2H)，4.99(2H)，4.5ppm(1H)，3.7-3.4(3H)，3.2-2.9(5H)，2.16(1H)，1.45(2H).1.1(3H)，0.92ppm(3H)。
Figure A20088000589501031
化合物14的合成
将溶于含4N HBr的EtOAc(5mL)中的化合物12(42mg，0.09毫摩尔)的一种溶液在25℃搅拌45分钟。将溶剂去除，并在高度真空下进一步干燥4小时。向在DMF(2mL)中的残余物内添加5-(氨基-叔丁基-丁氧基羰基)-茚酮-2-羧酸(39.2mg，0.14毫摩尔)及BOP(71mg，0.16毫摩尔)，接着添加DIPEA(83μL，0.48毫摩尔)。将反应混合物在25℃搅拌20分钟并使之通过硅胶短的管柱。溶剂经去除，并将粗产物在硅胶上用己烷中的20％EtOAc层析洗脱以给出化合物14(49mg，88％)。1HNMR DMSO-d6)δ11.63(s，1H)，9.18(br s，1H)，8.19(d，1H，J＝8.4Hz)，8.09(br s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.4Hz)，7.79(br s，1H)，7.53-7.58(m，3H)，7.39-7.43(m，3H)，7.28-7.35(m，3H)，7.11(s，1H)，5.29(s，2H)，4.80(t，1H，11.2Hz)，4.54(dd，1H，8.8Hz)，4.31(m，1H)，3.92(dd，1H，J＝10.2Hz)，3.82(dd，1H，J＝10.7Hz)，1.47(s，9H)。
Figure A20088000589501032
化合物15的合成
化合物14(49mg，0.08毫摩尔)及在MeOH/CH2Cl2(1/2，10mL)中的10％Pd-C(35mg)的一个混合物在真空下除气40s。所得混合物置于氢气气氛下，并在25℃下搅拌7小时。反应混合物经西莱特(Celite)过滤(MeOH/CH2Cl2洗涤)。将溶剂在真空中去除。在硅胶上用DCM中的2％MeOH洗脱的层析法获得化合物15(40.6mg，97％)。1NMR DMSO-d6)δ11.59(s，1H)，10.43(s，1H)，9.18(br s，1H)，8.09(d，1H，J＝8.2Hz)，7.93(br s，1H)，7.81(d，1H，J＝8.2Hz)，7.78(br s，1H)，7.49(t，1H，J＝8.4Hz)，7.27-7.35(m，3H)，7.08(s，1H)，4.80(t，1H，11.2Hz)，4.54(dd，1H，8.8Hz)，4.31(m，1H)，3.92(dd，1H，J＝10.2Hz)，3.82(dd，1H，J＝10.7Hz)，1.47(s，9H)。
Figure A20088000589501041
化合物16的合成
将化合物15(36mg，0.07毫摩尔)、4-甲基-1-哌嗪碳酰氯盐酸盐(20mg，0.10毫摩尔)、丙烯醇(0.1mL)及CH2Cl2(7mL)中的无水吡啶(63μml)的溶液混合物在室温下搅拌16小时。未去除溶剂，并将粗产物在硅胶上层析，用CH2Cl2中的2％-10％MeOH洗脱以给出化合物16(32.4mg，73％)。1NMR DMSO-d6)δ11.59(s，1H)，9.18(brs，1H)，8.09(d，1H，J＝8.2Hz)，7.93(br s，1H)，7.81(d，1H，J＝8.2Hz)，7.78(br s，1H)，7.49(t，1H，J＝8.4Hz)，7.27-7.35(m，3H)，7.08(s，1H)，4.80(t，1H，11.2Hz)，4.54(dd，1H，8.8Hz)，4.31(m，1H)，3.92(dd，1H，J＝10.2Hz)，3.82(dd，1H，J＝10.7Hz)，3.77(br s，2H)，3.47(br s，2H)，3.37(br s，2H)，2.63(s，3H)，2.38(br s，2H)，1.47(s，9H)。
化合物17的合成
将溶于含4N HBr的EtOAc(4mL)中的化合物16(32mg，0.05毫摩尔)的一种溶液在25℃搅拌45分钟。将溶剂去除，并在高度真空下进一步干燥4小时。向在DMF(2mL)中的残余物内添加化合物11(48.2mg，0.07毫摩尔)及苯并三唑-1-基-氧代-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟磷酸盐(BOP)(34.5mg，0.08毫摩尔)，接着添加DI PEA(68uL)，并将反应混合物在25℃搅拌25min。在真空下去除溶剂，并将产物通过Prep HPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，以10ml/min(在水/乙腈中的0.01％TFA)的以下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟以给出化合物17(42.1mg，64％)。MS：C58H67BrN12O10(M+H)m/z的计算值1171.43，实测值1172.40。
Figure A20088000589501052
化合物18的合成
向溶于MeOH(5mL)中的化合物17(33.6mg，0.025毫摩尔)的一种溶液内添加10％Pd-C(28mg)，并且混合物用N2除气。反应混合物用H2冲洗，然后在H2气氛下搅拌。在反应完成时(40min)，将反应混合物过滤并浓缩以给出化合物18(31.5mg，96％)。MS：C50H61BrN12O8(M+H)m/z的计算值1037.39，实测值1038.20。
Figure A20088000589501061
化合物19的合成
向在DMF(2mL)中的化合物18(31.5mg，0.024毫摩尔)的一种溶液内添加DCM(0.5mL)中的Mal-PEG4-NHS酯(42mg，0.08毫摩尔)。反应混合物在25℃搅拌1小时。将终产物通过制Prep HPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10ml/min(在水/乙腈中的0.01％TFA)用以下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟以给出化合物19(29.7mg，77％)。MS：C68H87BrN14O16(M+H)m/z的计算值1435.56，实测值1437.00。
实例5
化合物2的合成：向吲哚-4-羧醛(indole-4-carboxaldehyde)(1,583mg，4毫摩尔)及无水甲醇(20mL)中的叠氮乙酸甲酯(460mg，40毫摩尔)的一种溶液内在-25℃(干冰/CCl4)在N2下逐滴添加溶于甲醇中的甲醇钠(6.9mL25％NaOMe，32毫摩尔)。将反应混合物温热至0℃并搅拌3.5小时。反应混合物倒入水(120mL)中，并用EtOAc(2x60mL)萃取。将组合的萃取物用饱和水性NaCl(60mL)洗涤并干燥(MgSO4)。将溶剂在真空下去除以给出化合物2(890mg，91％)。1HNMR(CDCl3)δ8.28(br s，1H)，8.06(d，1H，J＝7.6Hz)，7.45(s，1H)，7.42(d，1H，J＝7.6Hz)，7.30(t，1H，J＝3.2Hz)，7.26(s，1H)，6.73(br s，1H)，3.96(s，3H)。
Figure A20088000589501071
化合物3的合成：将无水二甲苯(100mL)中的2-叠氮基-3-(1H-吲哚-4-基)丙烯酸甲酯(2,890mg，3.68毫摩尔)的悬浮液在N2下回流1小时。在真空下去除溶剂，并使残余物通过硅胶柱(30％EtOAc-己烷)以给出3(663mg，85％)。1HNMR(CDCl3)δ8.97(br s，1H)，8.36(br s，1H)，7.47(d，1H，J＝2Hz)，7.40(d，1H，J＝9.2Hz)，7.26(t，1H，J＝2.8Hz)，7.22(d，1H，J＝9.2Hz)，6.82(t，1H，J＝2.4Hz)，3.95(s，3H)。
Figure A20088000589501072
化合物4的合成：在氮气下在15℃向甲基吡咯并[3，2-e]吲哚-2-羧酸甲酯(3,663mg，3.1毫摩尔)的冰醋酸溶液(9mL)内添加氰基硼氢化钠(600mg，9.5毫摩尔)，并将反应混合物搅拌2.5小时(13-18℃)。将反应混合物倒入水(60mL)内，通过小心添加固体碳酸钠调整至pH 8-9。用EtOAc(3x60mL)萃取水性混合物，并将组合萃取物干燥(MgSO4)。将溶剂在真空中去除。快速层析法(硅胶，20％EtOAc-己烷)获得化合物4(562mg，84％)。1HNMR(CDCl3)δ8.85(br s，1H)，7.15(d，1H，J＝8.4Hz)，7.04(s，1H)，6.89(d，1H，J＝8.4Hz)，3.94(s，3H)，3.68(t，2H，J＝8.4Hz)，3.24(t，2H，J＝8.4Hz)。
化合物5的合成：将无水THF(8mL)中的1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸甲酯(4,450mg，1.42毫摩尔)的一种溶液在25℃在N2下用二-叔丁基-重碳酸酯(621g，2.8毫摩尔)进行处理。将反应混合物搅拌16h，然后在真空下去除溶剂。快速层析法(硅胶，30％EtOAc-己烷)产生化合物5(551mg，84％)。1HNMR(CDCl3)δ8.78(br s，1H)，7.26(s，1H)，7.25(d，1H，J＝8.5Hz)，7.07(s，1H)，4.12(br s，2H)，3.94(s，3H)，3.27(t，2H，J＝8.8Hz)，1.57(s，9H)。
Figure A20088000589501082
化合物6的合成：将LiOH水溶液(2.2mL4.0M溶液，8.7毫摩尔)添加至含3-(叔-丁氧羟基)-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸甲酯(5,551mg，1.74毫摩尔)的60mLTHF/MeOH/H2O(3∶2∶1)的浆料中，将反应混合物在25℃搅拌14小时。反应混合物用水(30mL)稀释，然后用2N HCl调整pH至4，产生一种白色沉淀。通过过滤收集固体，并用水(10mL)洗涤。在高度真空下干燥固体获得化合物6(524mg，99％)。1HNMR(DMSO-d6)δ12.93(br s，1H)，11.69(s，1H)，7.80(br s，1H)，7.20(d，1H，J＝8.8Hz)，6.91(s，1H)，3.96(t，2H，J＝8.8Hz)，3.18(t，2H，J＝8.8Hz)，1.48(s，9H)。
Figure A20088000589501091
化合物9的合成：将在4N HBr中的化合物7(48mg，0.1毫摩尔)的EtOAc的一种溶液(5mL)在25℃在氮气下搅拌45分钟。将溶剂去除，并在高度真空下进一步干燥4小时。向残余物内添加3-(叔-丁氧羟基)-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(6，36.24mg，0.12mmol)。将EDC(22.9mg，0.12毫摩尔)的DMF(3mL)溶液加入并且将反应混合物在25℃搅拌6小时。去除溶剂。将粗产物在硅胶上层析，用CH2Cl2中的3％-10％MeOH洗脱以给出化合物9(26mg，40％)。1HNMR(DMSO-d6)δ11.69(s，1H)，8.17(s，1H)，8.01(d，1H，J＝8.4Hz)，7.81(d，2H，J＝8.8Hz)，7.59(t，1H，J＝7.6Hz)，7.49(t，1H，J＝7.6Hz)，7.29(d，1H，J＝9.2Hz)，7.07(s，1H)，4.87(t，1H，10Hz)，4.54(d，1H，8.8Hz)，4.43(br s，1H)，3.89-4.03(m，4H)，3.76(br s，2H)，3.46(br s，2H).3.26(m，2H)，2.46(brs，2H)，2.38(br s，2H)，2.24(s，3H)，1.49(s，9H)。
Figure A20088000589501092
化合物10的合成：将在4N HBr中的化合物9(26mg，0.04毫摩尔)的EtOAc(5mL)的一种溶液在25℃在氮气下搅拌45分钟。去除溶剂，并进一步在真空下干燥14小时以给出化合物10(27.7mg，98％)。1HNMR(DMSO-d6)δ12.09(s，1H)，8.25(s，1H)，8.03(d，1H，J＝8.4Hz)，7.92(d，1H，J＝8.8Hz)，7.63(t，1H，J＝7.6Hz)，7.49-7.55(m，2H)，7.34(d，1H，J＝8.8Hz)，7.32(s，1H)，4.91(t，1H，10.8Hz)，4.54(d，1H，10.8Hz)，4.47(br s，1H)，3.84-3.99(m，4H)，3.27-3.50(m，10H)，2.88(s，3H)。
化合物12的合成：将化合物11(20mg，0.05mmol)及MeOH/CH2Cl2(1/2，10mL)中的10％Pd-C(15mg)的一种溶液在真空下除气40s。所得混合物置于氢气气氛下，并在25℃下搅拌7小时。反应混合物经西莱特(Celite)过滤(CH2Cl2洗涤)。将溶剂在真空中去除。在硅胶上用EtOAc/Hex(2/8)洗脱的层析获得化合物12(15.4mg，98％)。1NMR(DMSO-d6)δ10.36(s，1H)，8.04(d，1H，J＝8.2Hz)，7.72(d，1H，J＝8.2Hz)，7.61(br s，1H)，7.45(t，1H，J＝8.4Hz)，7.261(t，1H，J＝8.4Hz)，4.06(m，4H)，3.73(br  s，1H)，1.52(s，9H)。
化合物13的合成：将溶于含4N HCl的EtOAc(3mL)中的化合物12(14mg，0.04mmol)的溶液在25℃在氮气下搅30-45min。将溶剂去除，并在高度真空下进一步干燥14小时。向残余物内添加3-(叔-丁氧羟基)-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(6，15.1mg，0.05mmol)。添加溶于DMF(2ml)中的EDC(9.6mg，0.05mmol)的溶液，反应混合物在25℃搅拌15小时。去除溶剂。将粗产物在硅胶上层析，用CH2Cl2中的3％-10％MeOH洗脱以给出化合物13(18.6mg，86％)。1HNMR(CDCl3)δ9.45(s，1H)，8.31(s，1H)，8.29(d，1H，J＝8.4Hz)，8.02(s，2H)，7.63(d，1H，J＝8.4Hz)，7.54(t，1H，J＝6.8Hz)，7.43(t，1H，J＝6.8Hz)，7.29(d，1H，J＝8.0Hz)，6.89(s，1H)，4.75(d，1H，10.8Hz)，4.64(t，1H，8.8Hz)，4.12(brs，2H)，4.03(t，1H，J＝8.8Hz)，3.93(dd，1H，J＝11.2Hz)，3.42(t，1H，J＝10.8Hz)，3.22-3.31(m，2H)，1.61(s，9H)。
化合物14的合成：向在DMF(3mL)中的化合物13(19mg，0.04毫摩尔)的一种溶液内在0℃-5℃添加甲氧钠(0.5M溶于MeOH中，79μL，0.04毫摩尔)及搅拌5分钟。向反应混合物中加水(20mL)，并用EtOAc(2x10mL)萃取水性混合物。对组合萃取物进行干燥(MgSO4)。在真空中去除溶剂，并将粗产物在硅胶上用CH2Cl2中的10％MeOH层析洗脱以给出化合物14(15.3mg，87％)。1NMR(CDCl3)δ9.24(br s，1H)，8.25(dd，1H，J＝9.2，1.6Hz)，8.02(s，1H)，7.54(t t，1H，J＝7.6，1.6Hz)，7.43(tt，1H，J＝7.6，1.6Hz)，7.28(d，1H，J＝9.2Hz)，7.20(s，1H)，6.94(d，1H，J＝7.6Hz)，6.88(s，1H)，4.49(m，2H)，4.12(br s，2H)，3.26(m，2H)，2.92(m，1H)，1.76(dd，2H，J＝7.6Hz)，1.61(s，9H)。
化合物15的合成：溶于含4N HBr的EtOAc(3mL)的化合物14(6.4mg，0.013mmol)的溶液在25℃在氮气下搅拌30min。在真空中去除溶剂，并进一步在真空下干燥14小时以给出15(7.1mg，99％)。1HNMR(DMSO-d6)δ12.16(s，1H)，10.45(s，1H)，8.11(d，1H，J＝8.4Hz)，7.94(br s，1H)，7.83(d，1H，J＝8.0Hz)，7.51(m，2H)，7.34(m，2H)，7.27(s，1H)，4.81(t，1H，10.8Hz)，4.48(d，1H，10.8Hz)，4.28(br s，1H)，3.77-3.91(m，4H)，3.41-3.48(m，2H)。
Figure A20088000589501121
化合物16的合成：将化合物10(0.033毫摩尔，2HBr盐)与在2.5mL DMF中的实例3的化合物29(45mg，0.054毫摩尔)在HATU(20mg，0.054毫摩尔)及TEA(15-20μL)的存在下反应50分钟。将溶剂蒸发，并将粗产物通过反相HPLC纯化以给出10mg化合物16(21％产率)。MS：1405.6、1427.8及1444.6。
Figure A20088000589501122
化合物19的合成：将化合物10(25mg，0.033毫摩尔，2HBr盐)与2.5mL DMF中的实例5的化合物D(21.5mg，0.043毫摩尔)在HATU(16.5mg，0.0433毫摩尔)及TEA(10-15μL)的存在下进行反应45分钟。将溶剂蒸发，并将粗产物通过反相HPLC纯化以给出25mg化合物17(71％产率)。MS：1067.0。化合物17(0.0187毫摩尔)用DMF(3mL)中的5％吡啶进行脱保护45分钟。溶剂经蒸发去除，残余物用二乙醚洗涤获得化合物18(MS：845.2)。向溶于3mL DMF的0.00935毫摩尔化合物18的一种溶液内添加溶于DCM 1mL的Mal-dPEG4-NHS酯(10mg，0.019毫摩尔)，接着添加TEA(5μL)。30分钟后将溶剂蒸发，并将粗产物通过反相HPLC纯化以给出5.2mg的化合物19(MS：1243.2、1266.8以及1281.2)。
实例6
Figure A20088000589501131
化合物3的合成：向在DMF(2mL)中的化合物1(18.2mg，0.03mmol)内加入化合物2(16mg，0.036mmol)以及HATU(14mg，0.036mmol)，接着添加DIPEA(19μl)，将反应混合物在25℃搅拌7小时。在真空下去除溶剂，产物由Prep HPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物3(15.8mg，53％)。MS：C59H58ClN7O9(M+H)m/z的计算值1044.4，实测值1045。
化合物4的合成：将在DMF(2mL)中的化合物3(15mg，0.014mmol)的一种溶液用在DMF(2mL)中的5％哌啶进行处理。将反应混合物在25℃搅拌5分钟。终产物由Prep HPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物4(11.2mg，95％)。MS：C44H48ClN7O7(M+H)m/z的计算值822.33，实测值822.6。
化合物6的合成：将在DMF(2mL)中的化合物4(11.2mg，0.014mmol)的一种溶液添加至在DCM(0.5mL)中的化合物5(5.5mg，0.018mmol)。将反应混合物在25℃搅拌1小时。终产物由Prep HPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物19(13mg，94％)。MS：C54H59ClN8O10(M+H)m/z的计算值1015.4，实测值1016.0。
化合物7的合成：将在TFA/DCM(1/1，2mL)中的化合物6(13mg，0.013mmol)的一种溶液搅拌15分钟。在真空下去除溶剂，产物由PrepHPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物7(12mg，97％)。MS：C50H51ClN8O10(M+H)m/z的计算值959.34，实测值960。
实例7
Figure A20088000589501151
化合物3的合成：化合物1(47mg，0.06mmol)，化合物2(40mg，0.078mmol)以及BOP(34.5mg，0.078mmol)的DMF(3mL)溶液用DIPEA(68μl)处理。将反应混合物在25℃搅拌30分钟。去除溶剂，进一步在高度真空下干燥4小时。在真空下去除溶剂，粗产物由PrepHPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物3(56mg，85％)。MS：C56H54BrN9O8(M+H)m/z的计算值1060.33，实测值1060.44。
化合物4的合成：将在DMF(2mL)中的化合物3(22mg，0.02mmol)的一种溶液用在DMF(2mL)中的5％哌啶进行处理。将反应混合物在25℃搅拌5分钟。终产物由Prep HPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物4(16.2mg，93％)。MS：C41H44BrN9O6(M+H)m/z的计算值838.26，实测值839.2。
化合物6的合成：在DMF(2mL)中的化合物4(16mg，0.015mmol)以及化合物5(6.2mg，0.02mmol)的一种溶液用DIPEA(10μl)处理。将反应混合物在25℃搅拌1小时。终产物由Prep HPLC(SymmetrPrepC18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物6(13mg，75％)。MS：C51H55BrN10O9(M+H)m/z的计算值1031.33，实测值1031.6。
实例8
Figure A20088000589501161
a EDC，HOBt，CuCl2，5％DMF的CH2Cl240-60％bTFA，CH2Cl298％c Boc2O，DMF 70％d HATU，化合物A，DMF，DIEA 57-66％e哌啶，DMF98％f 20％DMF的CH2Cl2，DIEA，6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯60-79％
化合物1的合成：向Fmoc-Lys(Boc)-OH(500mg，1.07mmol)的5％DMF的THF(21mL)溶液内在室温下添加EDC(245mg，1.28mmol)、HOBt(173mg，1.28mmol)以及4-氨基苯甲酸叔丁酯(247mg，1.28mmol)。如此所得混合物搅拌10分钟，然后将氯化铜(172mg，1.28mmol)添加至混合物。将混合物搅拌过夜。将混合物浓缩至干燥，然后残余物在硅胶由快速层析法纯化，以5％甲醇的二氯甲烷洗脱，以给出呈无色油的化合物1(286mg，42％)。1H NMR(CD3OD)δ1.38(s，9H)，1.45-1.54(m，4H)，1.58(s，9H)，1.80(m，2H)，3.05(t，2H)，4.22(m，2H)，4.38(d，2H)，7.30(m，2H)，7.38(m，2H)，7.68(m，4H)，7.78(d，2H)，7.90(d，2H)；LC-MS(ES+)，544(M+H-Boc)+，667(M+Na)+。
化合物2的合成：对于一般的EDC偶合程序参见化合物1的制备。Fmoc-Leu-OH(500mg，1.42mmol)与4-氨基苯甲酸叔丁酯(328mg，1.70mmol)的偶合给出335mg 2(44％)。1H NMR(CD3OD)δ0.95(t，6H)，1.58(s，9H)，1.55-1.80(m，3H)，4.22(m，1H)，4.28(m，1H)，4.40(m，2H)，7.35(m，4H)，7.65(m，4H)，7.78(d，2H)，7.90(d，2H)。
化合物3的合成：对于一般的EDC偶合程序参见化合物1的制备。Fmoc-Cit-OH(206mg，0.52mmol)与4-氨基苯甲酸叔丁酯(120mg，0.62mmol)的偶合给出184mg 3(62％)。1H NMR(CD3OD)δ1.53-1.58(m，2H)，1.57(s，9H)，1.71(m，1H)，1.82(m，1H)，3.08(m，1H)，3.19(m，1H)，4.21(m，1H)，4.28(m，1H)，4.38(m，2H)，7.28-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.56-7.86(m，5H)，7.89(m，2H)；LC-MS(ES+)，573(M+H)+，595(M+Na)+，611(M+K)+。
化合物4的合成：向在二氯甲烷(4mL)中的化合物1(280mg，0.44mmol)的一种溶液内添加TFA(2mL)。将所得溶液搅拌20分钟。在真空下蒸发去除溶剂。残余物(260mg，98％)未经进一步纯化即用于下一步骤。1H NMR(CD3OD)δ1.45-1.80(m，5H)，1.88(m，1H)，2.09(t，2H)，4.25(m，2H)，4.45(m，2H)，7.30(m，2H)，7.38(m，2H)，7.68(m，4H)，7.80(d，2H)，7.98(d，2H)。
化合物5的合成：向在DMF(5mL)中的化合物4(214mg，0.44mmol)的一种溶液内在室温添加二异丙基乙胺(153μl，0.88mmol)，Boc2O(144mg，0.66mmol)。将混合物搅拌过夜。溶剂经蒸发去除，残余物由半制备性HPLC纯化，以给出化合物5，呈白色固体(181mg，70％)。1H NMR(CD3OD)δ1.40(s，9H)，1.45-1.50(m，4H)，1.80(m，2H)，3.03(t，2H)，4.21(m，2H)，4.40(d，2H)，7.35(m，4H)，7.65(m，4H)，7.68(d，2H)，7.95(d，2H)；LC-MS(ES+)489(M+H-Boc)+，610(M+Na)+。
化合物6的合成：对于叔丁酯的脱保护程序参见化合物4的制备。化合物2(15mg，0.028mmol)的脱保护给出13mg化合物6(98％)。残余物未经进一步纯化即用于下一步骤。LC-MS(ES+)495(M+H)+。
化合物7的合成：对于叔丁酯的脱保护程序参见化合物4的制备。化合物3(20mg，0.035mmol)的脱保护给出17mg化合物7(98％)。残余物未经进一步纯化即用于下一步骤。
化合物8的合成：在室温向在DMF(1mL)中的化合物A(化合物A是以类似于实例4中对化合物16所述的方式合成)(24mg，0.032mmol)的一种溶液内添加化合物5(19mg，0.032mmol)、二异丙基乙胺(28μl，0.16mmol)以及HATU(12mg，0.032mmol)。如此所得混合物搅拌2小时。蒸发去除溶剂，残余物由半制备性HPLC纯化，以给出标题化合物，呈白色固体(25mg，66％)。1H NMR(CD3OD)δ1.40(s，9H)，1.45-1.50(m，4H)，1.80(m，2H)，2.93(s，3H)，3.03(t，2H)，3.10-3.60(m，8H)，3.85(d，1H)，4.05(m，1H)，4.21(m，2H)，4.40(m，4H)，4.52(m，1H)，6.95(s，1H)，7.27-7.50(m，8H)，7.63-7.77(m，7H)，7.84(m，3H)，7.99(s，1H)，8.25(bs，1H)；LC-MS(ES+)1088(M+H)+。
化合物9的合成：对于HATU偶合程序参见化合物8的制备。化合物6(13mg，0.027mmol)与化合物25(20mg，0.027mmol)的偶合给出17mg化合物9(57％)。1H NMR(CD3OD)δ0.86(m，6H)，1.45-1.70(m，3H)，2.78(s，3H)，3.05-3.50(m，8H)，3.70(d，1H)，3.80(m，1H)，4.07(m，1H)，4.20-4.40(m，6H)，6.76(s，1H)，7.13-7.30(m，8H)，7.51-7.72(m，10H)，7.86(s，1H)，8.15(bs，1H)；LC-MS(ES+)973(M+H)+。
化合物10的合成：对于HATU偶合程序参见化合物8的制备。化合物7(27mg，0.053mmol)与化合物25(39mg，0.053mmol)的偶合给出36mg化合物10(60％)。
化合物11的合成：向在DMF(1mL)中的化合物8(25mg，0.02mmol)的一种溶液内添加哌啶(10μl，0.1mmol)。将所得溶液搅拌1小时。在真空下蒸发去除溶剂。残余物在醚中崩解并过滤(18mg，98％)。化合物未经进一步纯化即供使用。LC-MS(ES+)866(M+H)+，888(M+Na)+。
化合物12的合成：对于一般的Fmoc脱保护程序参见化合物11的制备。化合物9(17mg，0.016mmol)的脱保护给出14mg化合物12(98％)。残余物未经进一步纯化即用于下一步骤。
化合物13的合成：对于一般的Fmoc脱保护程序参见化合物11的制备。化合物10(36mg，0.036mmol)的脱保护给出28mg化合物13(98％)。残余物未经进一步纯化即用于下一步骤。
化合物14的合成：向化合物11(18mg，0.021mmol)的20％DMF的二氯甲烷(1mL)一种溶液内在室温添加二异丙基乙胺(11μl，0.63mmol)以及6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(10mg，0.031mmol)。如此所得混合物搅拌2小时。溶剂经蒸发去除，残余物由半制备性HPLC纯化，以给出化合物14，呈白色固体(19mg，79％)。1H NMR(CD3OD)δ1.32(m，2H)，1.42(s，9H)，1.45-1.80(m，8H)，1.78(m，1H)，1.85(m，1H)，2.28(t，2H)，2.96(s，3H)，3.05(t，3H)，3.35-3.70(bs，8H)，3.47(t，2H)，3.60(m，1H)，3.90(m，1H)，4.05(m，1H)，4.44(m，2H)，4.55(m，1H)，6.76(s，2H)，6.96(s，1H)，7.31(bs，2H)，7.42(m，1H)，7.46(m，1H)，7.71(m，3H)，7.86(m，3H)，7.99(s，1H)，8.25(bs，1H)；LC-MS(ES+)1059(M+H)+，1082(M+Na)+。
化合物15的合成：向在二氯甲烷(0.8mL)中的化合物14(19mg，0.08mmol)的一种溶液内添加TFA(0.2mL)。将所得溶液搅拌20分钟。溶剂经蒸发去除并冻干，以给出化合物15，呈白色固体(17mg，90％)。1H NMR(CD3OD)δ1.34(m，2H)，1.45-1.80(m，9H)，1.95(m，1H)，2.29(t，2H)，2.96(t，3H)，3.00(s，3H)，3.35-3.70(b s，8H)，3.48(t，2H)，3.75(m，1H)，3.98(dd，1H)，4.20(m，1H)，4.50(m，1H)，4.69(m，2H)，6.78(s，2H)，7.12(s，1H)，7.42(bs，2H)，7.48(m，1H)，7.57(m，1H)，7.73(m，2H)，7.87-7.95(m，4H)，8.05(s，1H)，8.25(bs，1H)；LC-MS(ES+)959(M+H)+，982(M+Na)+。
化合物16的合成：对于6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯偶合程序参见化合物14的制备。化合物12(11mg，0.015mmol)与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(7mg，0.022mmol)的偶合给出10mg化合物16(66％)。1H NMR(CD3OD)δ0.97(d，3H)，1.01(d，3H)，1.31(m，2H)，1.56-1.75(m，7H)，2.28(t，2H)，2.97(s，3H)，3.35-3.55(m，8H)，3.47(t，2H)，3.62(m，1H)，3.90(m，1H)，4.06(m，1H)，4.51(m，1H)，4.55(m，2H)，6.76(s，2H)，6.99(s，1H)，7.33(bs，2H)，7.42(m，1H)，7.49(m，1H)，7.69(d，2H)，7.75(m，1H)，7.86(m，3H)，8.00(s，1H)，8.25(bs，1H)；LC-MS(ES+)944(M+H)+，966(M+Na)+。
化合物17的合成：对于6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的偶合程序参见化合物14的制备。化合物13(28mg，0.035mmol)与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(16mg，0.053mmol)的偶合给出24mg化合物17(60％)。1H NMR(CD3OD)δ1.34(m，2H)，1.55-1.68(m，6H)，1.68-190(m，2H)，2.29(t，2H)，3.00(s，3H)，3.12-3.30(m，2H)，3.35-3.70(bs，8H)，3.48(t，2H)，3.70(m，1H)，3.96(dd，1H)，4.20(m，1H)，4.50(m，1H)，4.65(m，2H)，6.78(s，2H)，7.08(s，1H)，7.41(bs，2H)，7.47(m，1H)，7.56(m，1H)，7.73(d，2H)，7.86(d，4H)，7.90(d，2H)，8.03(s，1H)，8.25(bs，1H)；LC-MS(ES+)988(M+H)+，1010(M+Na)+。
实例9
Figure A20088000589501211
化合物3的合成：向在DMF(2mL)中的化合物1(50mg，0.079mmol)内加入化合物2(49mg，0.085mmol)以及HATU(33mg，0.086mmol)，接着添加DIPEA(45μl)，将反应混合物在室温下搅拌4小时。在真空下去除溶剂，产物由Prep HPLC(SymmetrPrep C18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物3(47mg，60％)。MS：(M+H)+1003。
化合物5的合成：将在DMF(2mL)中的化合物3(15mg，0.014mmol)的一种溶液用在DMF(2mL)中的5％哌啶进行处理，将反应混合物在25℃搅拌10分钟。粗产物用乙醚沉淀，未经进一步纯化即用于下一步骤。粗产物溶解于DMF(3mL)，接着添加化合物4(25mg，0.025mmol)的DMF(2mL)以及DIEA(20μl)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。添加TFA至反应混合物，将反应混合物在室温下搅拌45分钟，如由分析型HPLC所指示，给出化合物5。粗产物由Prep HPLC(SymmetrPrepC18，7μm，19x150mm柱)纯化，在10mL/分钟(在水/乙腈中的0.01％TFA)使用下述梯度洗脱：10％乙腈5分钟，10％至50％乙腈15分钟，维持50％乙腈5分钟，50％至100％乙腈5分钟洗脱，以给出化合物5(3mg，94％)。MS：(MH)+889。
实例10
Figure A20088000589501221
化合物1的合成：将1.5g(3.77mmol)Fmoc-瓜氨酸溶解于圆底瓶内的3mL DMF中，在其中添加0.87g(4.5mmol)EDC，0.61g(4.5mmol)HOBt。然后添加6mLDCM，接着添加0.88g(4.5mmol)4-氨基苯甲酸叔丁酯以及催化剂量的氯化铜。让反应混合物搅拌过夜。溶剂经蒸发去除，粗产物在硅胶上用在DCM中的5％至10％甲醇进行纯化，以给出2g化合物1，92％产率。M+1＝574。
Figure A20088000589501222
化合物7的合成：210mg(0.63mmol)化合物2用HBr-乙酸乙酯溶液处理30分钟。蒸发去除溶剂，将所得的盐3在高度真空下干燥。0.63mmol以上制备的3与210mg(0.69mmol)化合物4在10mL DMF中，在133mg(0.69mmol)EDC存在下反应2小时。蒸发去除溶剂，粗产物以硅胶纯化。给出160mg化合物5(47.6％产率)。M+1＝518。
将40mg(0.27mmol)化合物5与160mg(0.81mmol)可商购获得的4-甲基哌嗪碳酰氯盐酸盐在17mLDCM(含1.7mL丙烯醇以及214μl吡啶)中反应过夜。蒸发去除溶剂，粗产物化合物以硅胶纯化，使用5％MeOH/DCM作为洗脱液，以给出70mg(40％产率)化合物6。M+1＝645。
将35mg(0.054mmol)化合物6用5mL 1∶2 TFA-DCM处理5分钟。蒸发去除溶剂，所得盐7在高度真空下干燥过夜。M+1＝544并用于下一步骤。
Figure A20088000589501231
化合物8的合成：将66mg(0.11mmol)化合物1通过与3mL1∶2TFA∶DCM搅拌20分钟来转成化合物8。蒸发去除溶剂并且将该酸在高度真空下干燥。M+1＝517.8，M+Na＝540。
Figure A20088000589501241
化合物10的合成：将0.065mmol化合物8以及44.7mg(0.065mmol)BOP作为2mL无水DMF中的一种溶液添加至含0.054mmol化合物7(MED-2477)的烧瓶内。然后添加DIPEA(93μL，0.54mmo l)并且搅拌1小时。蒸发去除溶剂，粗产物混合物由反相制备性HPLC纯化。在纯化后给出48mg化合物9(作为其TFA盐，77％产率)。M+1＝1043。16mg(0.015mmol)化合物9用1mL的5％哌啶的DMF溶液处理10分钟。蒸发去除溶剂，固体残余物用己烷类以及乙醚洗涤。产物10在高度真空下干燥。M+1＝821。
Figure A20088000589501251
化合物11的合成：将0.015mmol以上制备的化合物10与11mg(0.035mmol)可商购获得的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯在1.5mL无水DMF以及10μL DIPEA中进行反应1小时。蒸发去除溶剂，粗产物由反相HPLC纯化，以给出10.7mg化合物11(作为其TFA盐，63％产率)。M+1＝1014。
实例11：药物-连接物分子与抗体的偶联
用于氨基酸以及肽连接物：本实例说明了将本发明的药物-偶联物分子(视需要包括其他基团，如间隔物、反应性官能团等)偶联至作为靶向剂的抗体X4的反应条件及方法。这些条件及方法仅是示例性而非限制性的。将药物-连接物分子偶联至抗体的其他办法在本领域中是已知的。
此处所述的偶联方法是基于将游离的硫醇基团引入至抗体，这种引入是通过抗体的赖氨酸与2-亚氨基硫烷的反应，接着通过药物连接物分子与活性马来酰亚胺基的反应而进行的。最初待偶联的抗体经缓冲液交换入包含50mM NaCl、2mM DTPA、pH 8.0的0.1M磷酸盐缓冲液pH 8.0内并浓缩至5-10mg/ml。通过向抗体添加2-亚氨基硫烷来实现硫醇化。待添加的2-亚氨基硫烷的量是在初步实验中确定，并因各种抗体而异。在初步实验中，增加量的2-亚氨基硫烷的滴定添加至抗体，紧接着在室温下与抗体孵育1小时，使用Sephadex G-25柱将抗体脱盐进入50mM HEPES缓冲液pH 6.0，并通过与二硫基二吡啶(DTDP)的反应来快速测定导入的硫醇基团数目。硫醇基团与DTDP反应，导致释放出硫吡啶，在324nm对硫吡啶进行检测。使用蛋白质浓度为0.5-1.0mg/ml的样本。在280nm处的吸光度用来准确测定样本中的蛋白质浓度，然后每份样本的等分部分(0.9mL)与0.1mL DTDP(乙醇中的5mM备料溶液)在室温下孵育10分钟。单独缓冲液加DTDP的空白样本也一起培养。经10分钟后，测量324nm的吸光度，并使用硫吡啶的消光系数19800M-1来对所存在的硫醇数目进行定量。
典型地，每个抗体含三个硫醇基团的硫醇化水平是所希望的。例如，使用一种特定抗体，通过添加15倍摩尔过量2-亚胺基硫烷，接着在室温下孵育1小时可达成此项目的。因此，将待偶联的抗体与2-亚胺基硫烷以希望的摩尔比进行孵育，然后脱盐进入偶联缓冲液(包含5mM甘氨酸的50mM HEPES缓冲液pH 6.0、0.5％聚乙烯吡咯酮(10k)及2mM DTPA)。将硫醇化材料维持在冰上，同时如以上所说明对所引入的硫醇数目进行定量。
证实所引入的硫醇数目后，以每个硫醇3倍摩尔过量，添加包含活性顺丁烯二酰亚胺基团的药物-连接物分子。偶联反应是在偶联缓冲液内进行，偶联缓冲液还含有终浓度为5％DMSO(或一种适合的可替代的溶剂)。通常，将药物-连接物母液溶解于100％二甲亚砜中。为了添加至抗体，将母液直接添加至硫醇化抗体，该抗体经过充分添加DMSO来调整终浓度至10％；或将母液在包含终浓度10％的DMSO的偶联缓冲液中进行预稀释，接着添加至等体积的硫醇化抗体。
偶联反应用搅拌在室温下孵育2小时。孵育后，将反应混合物离心并通过0.2微米过滤器进行过滤。使用多种方法通过层析法实现偶联物的纯化。可使用尺寸排阻层析法在Sephacryl S200柱上对偶联物进行纯化，柱子用含5mM甘氨酸、50mM NaCl及0.5％聚乙烯吡咯酮(10k)的50mM HEPES缓冲液pH 7.2进行预平衡。以线性流速28cm/h进行层析法。收集、汇集并浓缩包含偶联物的馏分。可替代地，可通过离子交换层析实现纯化。条件随抗体而变化，并且在每种情况下需要被优化。例如，抗体-药物偶联物反应混合物应用于SP-Sepharose柱，该柱用50mM HEPES、5mM甘氨酸、0.5％聚乙烯吡咯酮(10k)、pH 5.5进行预平衡。使用平衡缓冲液(pH 5.5)中0-1M NaCl的一个梯度将抗体偶联物洗脱。将包含偶联物的相关馏分汇集并对配方缓冲液进行透析(使用包含5mM甘氨酸、100mM NaCl及0.5％聚乙烯吡咯酮(10k)的50mM HEPES缓冲液pH 7.2)。
实例12：活体内研究
使用标准的实验室程序在体外对786-O(ATCC登记号CRL-1932)细胞进行扩增。在每只6-8周龄的雄性CB17.SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)右侧经皮下植入0.2ml含250万786-O的PBS/基质胶(Matrigel)(1∶1)。植入后每周两次对小鼠称重，并使用电子测径器来测量肿瘤的三维。肿瘤体积计算为高x宽x长。将具有平均为200mm3肿瘤的小鼠随机分配入各个处理组。第0天用PBS载体、毒素-偶联的同种型对照抗体、或毒素-偶联的抗-CD70HuMAb 2H5对小鼠经腹膜内给药。每个组包括8只小鼠。
研究以下毒素：
Figure A20088000589501281
化合物A
化合物B
化合物C
化合物D
化合物E
Figure A20088000589501291
化合物F
Figure A20088000589501292
化合物G
表1是基于毒素(化合物A-G)的微摩尔数各给药组的概述。
表1.研究概述
  剂量(毒素微摩尔，Ab mg/kg)
  1   运载体IP SD   匹配0.03体积
  2   CD70.10.1 IP SD   0.03
  3-4   CD70.1-Cmpd A IP SD   0.03，0.005
  5-6   CD70.1-Cmpd B IP SD   0.03，0.005
  7-8   CD70.1-Cmpd C IP SD   0.03，0.005
  9-10   CD70.1-Cmpd D IP SD   0.03，0.005
  11-12   CD70.1-Cmpd E IP SD   0.03，0.005
  13-14   CD70.1-Cmpd F IP SD   0.03，0.005
  15-16   CD70.1-Cmpd G IP SD   0.03，0.005
图1、图2、图5以及图6显示肿瘤体积平均数相对于给药后天数，图3、图4、图7以及图8显示肿瘤体积中位数(0.03μmol-图1、图3、图5以及图7；0.005μmol-图2、图4、图6以及图8)相对于给药后天数。图9显示0.03μmol以及0.0005μmol两种剂量的体重变化百分比中位数相对于给药后天数。基于0.03μmol剂量实验，疗效显然是以如下顺序递减：化合物E＞化合物F＞化合物A＞化合物C，化合物D＞化合物B＞化合物G。
实例13：组织蛋白酶B介导的单个氨基酸连接物的切割
一组具单个氨基酸的化合物，彼此在氨基酸组成方面不同，但其他方面具有类似结构，测定该组化合物的组织蛋白酶B活性。测试以下化合物：化合物A、B、C、D、E、以及F。组织蛋白酶B介导的产物的出现是通过应用RP-HPLC进行监测，药物产物以其在340nm的吸光度来定量。化合物与组织蛋白酶B一起孵育不同的时间长度，而其近似的半衰期(t1/2)是报告于以下表2。所测试的化合物中，只有化合物A以及化合物D被组织蛋白酶B切割。
表2：组织蛋白酶B介导带有单个氨基酸可切割连接物的化合物的切割
  化合物   组织蛋白酶B切割   近似的底物半衰期
  化合物A   是   24小时
  化合物B   否
  化合物C   否
  化合物D   否
  化合物E   是   4小时
  化合物F   否
组织蛋白酶B的酶测定法：牛脾脏的组织蛋白酶B(Sigma，产品代码C-6286)的储备溶液是通过将冻干固体(6mg，56％蛋白)溶解于25mM乙酸钠/1mM EDTA pH 5.0缓冲液(10mL)中进行制备。通过将储备溶液50(μl)与30mM DTT/15mM EDTA所组成的激活缓冲液(100μl)混合，接着在室温下孵育15分钟来完成酶的激活。激活的组织蛋白酶B在使用前，用25mM乙酸钠/1mM EDTA pH 5.0的溶液进行1∶1稀释。为了测定药物的释放，将经半胱氨酸修饰的化合物(4μl 2.5mM的DMSO中的溶液)以及激活的组织蛋白酶B(10μl，3.6U/mL)添加至25mM乙酸钠/1mM EDTA pH 5.0缓冲液(86μl)。将样品在37℃孵育经历适当时间点，并且使用甲醇(100μl)中止。
将化合物样品(40μl)应用于Waters 2795HPLC系统，该系统装配有反相柱(Waters Nova-pak C18，3.9x150mm柱，产品代码WAT 086344)。样品的层析是使用双移动相系统完成，该系统包含水/0.1％TFA(A缓冲液)以及乙腈/0.1％TFA(B缓冲液)，在1.0mL/分钟经20分钟时间以10-100％B缓冲液进行梯度洗脱。化合物是通过它们在340nm的吸光度(A340)进行检测。
本说明书中所提及或所指的各个专利申请、专利、公开文本及其他公开的文件均以全文通过引用结合在此，就像通过引用将单独的每一项专利申请、专利、公开文本及其他公开的文件都专门结合在此一样。
虽然已经对本发明参照其特定的实施方案进行了说明，但本领域的普通技术人员应该理解，无须背离本发明的精髓及范围以及随附的权利要求即可进行多项改变并可进行等效物代换。此外，可做多项变更来调整特殊的情况、材料、物质组成、方法、方法步骤或步骤，使之适合本发明的目的、精髓及范围。全部此类变更意在涵盖于在此所附的权利要求的范围之内。
序列表
<110>Medarex，Inc.
     Chen，Liang
     Gangwar，Sanjeev
     Guerlavais，Vincent
     Lonberg，Nils
     Zhang，Qian
<120>具有单个氨基酸的化学连接物及其偶联物
<130>2205829-WO0
<150>60/891,028
<151>2007-02-21
<160>4
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>1
Pro Arg Phe Lys
  1
<210>2
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>2
Thr Arg Leu Arg
  1
<210>3
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>3
Ser Lys Gly Arg
  1
<210>4
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>4
Pro Asn Asp Lys
  1

Claims (20)

1.一种具有以下化学式的化合物
其中
L1为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂烷基；
m是一个整数0、1、2、3、4、5、或6；
AA1是选自下组的一种氨基酸，该组的构成为：天然的氨基酸类以及非天然的α氨基酸类；
L2为取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；
L3为取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基；
o是0或1；
L4是一个连接物成员；
p是0或1；
X4是选自下组的一个成员，该组的构成为：受保护的反应性官能团、不受保护的反应性官能团、可检测的标记、以及靶向剂；并且
D包括一种结构：
Figure A2008800058950002C2
其中，该环状体系A是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基；
E和G是独立地选自以下各项的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、一个杂原子、以及一个单键，或者E和G相接合以形成一个环状体系，该环状体系选自：取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；
X是选自O、S以及NR23中的一员；
R23是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、或酰基；
R3是OR11，
其中R11是H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12、或SiR12R13R14，
其中R12、R13以及R14是独立地选自以下各项的成员：H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、以及取代和未取代的芳基中，其中R12和R13与它们所附联的氮原子或碳原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系；
R4、R4’、R5以及R5’是独立地选自下组的成员，该组的构成为：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、SO3、SO2R15、NR15R16、NR16C(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、以及O(CH2)nN(CH3)2，或者R4、R4’、R5以及R5’中的任何相邻的一对与它们所附联的碳原子一起相接合以形成一个具有4至6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系；
其中
n是1至20的整数；
R15和R16独立地选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的杂烷基、取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂芳基、取代和未取代的杂环烷基、以及取代和未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附联的氮原子一起可任选地相接合以形成一个具有4至6元的、可任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的杂环烷基环状体系；
R6是一个单键，该单键存在或不存在，并且当其存在时，R6与R7相接合以形成一个环丙基的环；并且
R7是所述环丙基的环中与R6相接合的CH2-X1或-CH2-，其中
X1为一个离去基团，
其中R4、R4’、R5、R5’、R11、R12、R13、R15、或R16中的至少一个将D连接至化合物的剩余部分上；
或其药学上可接受的一种盐。
2.如权利要求1所述的化合物，其中D具有以下结构：
Figure A2008800058950004C1
其中
Z是选自O、S以及NR23中的一员；
其中
R23是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、或酰基；
R1是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R8或CO2R8，其中R8为取代的烷基、未取代的烷基、NR9R10、NR9NHR10、或OR9
其中R9以及R10是独立地选自以下各项的成员：H、取代和未取代的烷基、以及取代和未取代的杂烷基；并且
R2是H、取代的烷基或未取代的低级烷基。
3.如权利要求1所述的化合物，其中D具有以下结构：
Figure A2008800058950005C1
其中
Z是选自O、S以及NR23中的一员
其中
R23是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、或酰基；
R1是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R8或CO2R8，其中R8是选自NR9R10以及OR9中的一员；
其中
R9和R10是独立地选自以下各项的成员：H、取代和未取代的烷基、以及取代和未取代的杂烷基；
R1’是H、取代或未取代的低级烷基、或C(O)R8，其中R8是选自NR9R10以及OR9中的一员；
其中
R9和R10是独立地选自以下各项的成员：H、取代和未取代的烷基、以及取代和未取代的杂烷基；
R2是H、取代或未取代的低级烷基、未取代的杂烷基、氰基或烷氧基；并且
R2’是H、取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中D为
其中
Z是选自O、S、以及NR23中的一员；
其中
R23是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、或酰基；
R32是选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NR16C(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16、或O(CH2)nN(CH3)2，其中n为从1至20的整数，并且
R5、R5’、R11、R12、R13、R15、R16、或R32中的至少一个将D连接至该化合物的其余部分上。
5.如权利要求4所述的化合物，其中D为：
Figure A2008800058950006C2
R1是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R8、或CO2R8，其中R8是选自NR9R10以及OR9中的一员；
其中
R9以及R10是独立地选自以下各项的成员：H、取代和未取代的烷基、以及取代和未取代的杂烷基；
R1’是H、取代或未取代的低级烷基、或C(O)R8，其中R8是选自NR9R10以及OR9中的一员，
其中
R9以及R10是独立地选自以下各项的成员：H、取代和未取代的烷基、以及取代和未取代的杂烷基；
R2是H、取代或未取代的低级烷基、未取代的杂烷基、氰基或烷氧基；以及
R2’是H、取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基。
6.如权利要求1至5中任何一项所述的化合物，其中AA1是选自下组，该组的构成为：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。
7.如权利要求6所述的化合物，其中AA1是选自下组，该组的构成为：Cit、Glu、Lys、以及Ser。
8.如权利要求1至7中任何一项所述的化合物，其中R4、R4’、R5、R5’、R15或R16中的至少一个将D连接至该化合物的其余部分上。
9.如权利要求1至8中任何一项所述的化合物，其中m不是0，并且L1是自消性连接物。
10.如权利要求1至9中任何一项所述的化合物，其中L2是存在的并且是自消性连接物。
11.如权利要求1至8中任何一项所述的化合物，其中L3是存在的并且-L3-NH-是选自
Figure A2008800058950008C1
其中
Z是选自O、S以及NR23中的一员；
其中
R23是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、或酰基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中-L3-NH-是
13.如权利要求1所述的化合物，其中该化合物是选自
Figure A2008800058950009C1
其中X1为Cl或Br。
14.如权利要求13所述的化合物，其中X1是Cl。
15.如权利要求1至12中任何一项所述的化合物，其中X4是一种靶向剂。
16.如权利要求15所述的化合物，其中X4是一种抗体。
17.一种药学配制品，包括如权利要求1至16中任何一项所述的化合物以及一种药学上可接受的载体。
18.一种杀死细胞的方法，所述方法包括对所述细胞给予足以杀死所述细胞的量的如权利要求1至16中任何一项所述的化合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中该细胞是一种肿瘤细胞。
20.一种在哺乳动物受试者体内延迟或停止肿瘤的生长的方法，该方法包括对所述受试者给予足以延迟或停止该生长的量的如权利要求1至16中任何一项所述的化合物。
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