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CN109069871A - 用于治疗癌症的新抗体 - Google Patents

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CN109069871A
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antibody
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chain variable
emp2
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马杜里·韦德拉
乔纳森·布朗
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University of California San Diego UCSD
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Abstract

本文提供了新抗‑EMP2抗体，其可用于治疗和诊断表达或过表达EMP2的癌症。在一个方面，本文提供了一种分离的结合上皮膜蛋白2(EMP2)的抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述重链可变区包括三个重链互补决定区(HCDR)，且所述轻链可变区包括三个轻链可变区(LCDR)。在某些实施方案中，HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。

Description

用于治疗癌症的新抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月4日提交的美国临时申请号62/263,561在美国法典第35篇第119(e)条下的权益，其通过引用整体并入本文用于所有目的。
政府权利
本发明在国立卫生研究院颁布的CA163971下在政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及抗-EMP2抗体、它们的药物组合物和在过表达EMP2的癌症(诸如三重阴性的乳腺癌和子宫内膜癌)的检测和治疗中使用它们的方法。
背景技术
上皮膜蛋白-2(EMP2)是四分子交联体(tetraspan)蛋白的生长停止特异性的-3/周围髓磷脂蛋白-22(GAS3/PMP22)家族的一个成员。其它四-跨膜家族(连接蛋白和四次穿膜蛋白)在间隙连接、细胞-细胞识别过程和细胞内运输中起作用。关于GAS3/PMP22家族所知甚少。可得到的信息主要涉及它们在不同疾病中的潜在作用。例如，已经发现原型GAS3家族成员PMP22中的突变会造成神经变性疾病(即，Dejerrine Sottas综合征和CharcotMarie Tooth综合征)。EMP2还已经涉入B细胞肿瘤进展和应激诱导的细胞凋亡。
EMP2以高水平在肺、眼和泌尿生殖道的上皮细胞中表达。象几种四分子交联体蛋白(CD9、CD81、PMP22)一样，鼠成纤维细胞中的EMP2定位至脂筏结构域。EMP2控制某些整联蛋白、GPI-连接的蛋白和I类MHC分子的细胞表面运输和功能，并相反地调节窖蛋白表达。参见，Claas等人，J Biol Chem 276：7974-84(2001)；Hasse等人，J Neurosci Res 69：227-32(2002)；Wadehra等人，Exp Mol Pathol 74：106-12(2003)；Wadehra等人，Mol Biol Cell15：2073-2083(2004)；Wadehra等人，J Biol Chem 277：41094-41100(2002)；和Wadehra等人，Clin Immunol 107：129-136(2003)。
子宫内膜癌(EC)是最常见的妇科恶性肿瘤.在美国，由EC引起的死亡率已经在最近二十年中翻倍，目前女性在她的一生中具有大约3％的发生EC的机会(Silverberg等人，World Health Organization Classification of Tumors：Tumors of the Breast andFemale Genital Tract，Lyon：IARC Press，第221-57页(2003)；Sorosky JI，ObstetGynecol 111：436-47(2008))。基于组织学、临床行为和流行病学，将EC分类成两个主要亚群。最常见的I型与雌激素优势和恶化前子宫内膜增生有关(Hecht等人，J Clin Oncol 24：4783-91(2006)；Sherman，Mod Pathol 13：295-308(2000))。II型由非-激素风险因素介导，且经常具有伴有侵袭性临床进程的高级或高危组织学(Hecht等人，J Clin Oncol 24：4783-91(2006))。EC的发生率通常随着年龄增加，75-80％的新病例发生在绝经后女性中(Creasman，Semin Oncol 24：S1-140-S1-50(1997))。
一种有前途的生物标志物似乎是EMP2。EMP2表达与EMP2瘤形成有关(Wadehra等人，Cancer 107：90-8(2006))。在子宫内膜癌中，EMP2是具有差临床结果的肿瘤的独立预后指标。与EMP2阴性的肿瘤相比，EMP2阳性的肿瘤具有显著更大的子宫肌层侵袭力、更高的临床状态、复发的或持久的疾病(在外科手术切除以后)和更早的死亡。由于EMP2表达独立于其它已知的生物标志物诸如雌激素受体和黄体酮受体(Wadehra等人，Cancer 107：90-8(2006))，EMP2代表对当前激素或化学疗法无应答的患者的一种独特生物标志物。此外，EMP2表达水平与增殖期子宫内膜的逐渐增加的恶化前潜力正相关。也就是说，存在子宫内膜EMP2表达的渐变，在正常的增殖的或静止的绝经前子宫内膜中存在最小表达，且在具有混乱的增殖期子宫内膜、子宫内膜增生和子宫内膜癌的患者中的表达逐渐增加。
乳腺癌仍然是在全世界女性中最常见的恶性肿瘤。乳腺癌是一种异质疾病，其表现出宽范围的临床行为、进展和组织学(Tavassoli F，Devilee P，编.(2003)WHOClassification of Tumors.Pathology&Genetics：Tumors of the breast and femalegenital organs.Lyon(France)：IARC Pres)。乳腺癌是衬在乳房组织管和叶中的细胞的异常生长，且如下分类：所述癌症是否开始于管或叶，所述细胞是否已经通过管或叶侵入(生长或扩散)，和所述细胞在显微镜下看起来的样子(组织组织学)。不罕见的是，单个乳腺肿瘤具有侵袭性癌和原位癌的混合物。
乳腺癌的分子分类已经鉴别出特定亚型，经常称作“固有的”亚型，其具有临床和生物学暗示，包括固有的腔亚型、固有的富含HER2的亚型(也被称作HER2+或ER-/HER2+亚型)和固有的基础样乳腺癌(BLBC)亚型(Perou等人.2000)。固有亚型的鉴别通常已经通过方法的组合完成，所述方法包括(1)组织病理学检测，(2)雌激素受体(ER)，黄体酮受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达状态和(3)特征细胞标志物的检测。
基础样乳腺癌(BLBC)(其表达正常乳腺中的基础上皮细胞特有的基因)占所有乳腺癌的多达15％-25％(Kreike等人.2007)，并且与所有乳腺癌类型的最差预后有关。BLBC低表达雌激素受体(ER-)、黄体酮受体(PR-)和人表皮生长因子受体2(HER2-)，并且包括60％至90％的所谓的“三重阴性的”(ER-/PR-/HER2-)乳腺癌。尽管大多数基础样乳腺癌经常基于ER、PR和HER2的表达状态而被称作三重阴性的，但是并非所有的基础样乳腺癌都是三重阴性的。
EMP2在三重阴性的乳腺癌中过表达。EMP2是一种属于生长停止特异性的-3(GAS3)家族的四分子交联体蛋白。在功能上，EMP2与整联蛋白avβ3和粘着斑激酶(FAK)的定位和活性有关并调节所述定位和活性。EMP2(SEQ ID NO：1)以高水平在肺、眼和泌尿生殖道的上皮细胞中表达。象几种四分子交联体蛋白(CD9、CD81、PMP22)一样，鼠成纤维细胞中的EMP2定位至脂筏结构域。EMP2控制某些整联蛋白、GPI-连接的蛋白和I类MHC分子的细胞表面运输和功能，并相反地调节窖蛋白表达。参见Claas等人，J Biol Chem 276：7974-84(2001)；Hasse等人，J Neurosci Res 69：227-32(2002)；Wadehra等人，Exp Mol Pathol 74：106-12(2003)；Wadehra等人，Mol Biol Cell 15：2073-2083(2004)；Wadehra等人，J Biol Chem277：41094-41100(2002)；和Wadehra等人，Clin Immunol 107：129-136(2003)。
SEQ ID NO：1(ACCESSION P54851)MLVLLAFIIA FHITSAALLF IATVDNAWWVGDEFFADVWR ICTNNTNCTV INDSFQEYST LQAVQATMIL STILCCIAFF IFVLQLFRLK QGERFVLTSIIQLMSCLCVM IAASIYTDRR EDIHDKNAKF YPVTREGSYG YSYILAWVAF ACTFISGMMY LILRKRK
EMP2似乎通过促进分子从高尔基后胞内体隔室向适当质膜位置的转移而调节不同蛋白和糖脂的运输。具体地，认为EMP2会促进选择的分子向富含糖脂的脂筏微结构域(GEM)中的适当运输(Wadehra等人，Mol Biol Cell 15：2073-83(2004))。GEM是富含胆固醇的微结构域，其经常与伴侣蛋白、接受体和蛋白复合物(它们对于有效的信号转导而言是重要的)结合(Leitinger等人，J Cell Sci 115：963-72(2002)；Moffett等人，J Biol Chem275：2191-8(2000))。此外，GEM参与蛋白从高尔基体向质膜的正确分选(Abrami等人，JBiol Chem276：30729-36(2001)；Galbiati等人，Cell 106：403-11(2001)；Gruenberg等人，Curr Opin Cell Biol 7：552-63(1995))。在这方面，EMP2表达水平的调节或它在质膜上的位置会改变几类分子的表面组成，所述分子包括整联蛋白、粘着斑激酶、I类主要组织相容性分子和其它免疫球蛋白超家族成员诸如CD54和GPI-连接的蛋白(Wadehra等人，Dev Biol287：336-45(2005)；Wadehra等人，Clinical Immunology 107：129-36(2003)；Morales等人，Invest Opthalmol Vis Sci(2008))。
EMP2表达与EMP2瘤形成有关(Wadehra等人，Cancer 107：90-8(2006)).例如，在子宫内膜癌中，EMP2是具有差临床结果的肿瘤的独立预后指标。与EMP2阴性的肿瘤相比，EMP2阳性的肿瘤具有显著更大的子宫肌层侵袭力、更高的临床状态、复发的或持久的疾病(在外科手术切除以后)和更早的死亡。
以前已经证实，EMP2可以在表达或过表达EMP2的癌症(诸如三重阴性的乳腺癌和子宫内膜癌)的治疗中用作靶标。如以上所讨论的，对可用于预防、治疗和调节这样的EMP2表达癌症的其它新方法和组合物仍然存在大需求。因此，本文提供了用于满足这些和其它需要的新组合物和方法。
发明内容
本文提供了可用于治疗和诊断表达或过表达EMP2的癌症的新抗-EMP2抗体。
在一个方面，本文提供了一种分离的结合上皮膜蛋白2(EMP2)的抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述重链可变区包括三个重链互补决定区(HcDR)，且所述轻链可变区包括三个轻链可变区(LCDR)。在某些实施方案中，HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。
在某些实施方案中，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3具有90％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有90％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链包含根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链包含根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链包含根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链包含根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在示例性实施方案中，所述抗体是单克隆抗体、人源化的单克隆抗体、人抗体、双体、微体(minibody)或三抗体(triabody)、嵌合抗体或重组抗体。在某些实施方案中，所述抗体呈scFv、微体、双体或三抗体形式。在某些实施方案中，主题抗体缀合至细胞毒性剂或标记。
在另一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包括本文提供的主题抗体中的任一种和生理上可接受的载体。
在另一个方面，本文提供了一种治疗患者中的癌症或降低其复发率的方法。所述方法包括给所述患者施用有效量的包含重链可变区和轻链可变区的抗-EMP2抗体。所述重链可变区包括三个重链互补决定区(HCDR)，且所述轻链可变区包括三个轻链可变区(LCDR)。在示例性实施方案中，HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ IDNO：15，且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16.
在某些实施方案中，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3具有90％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有90％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链包含根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链包含根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链包含根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链包含根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述方法包括在施用步骤之前检测患者中的癌症干细胞的步骤，所述癌症干细胞表达EMP2和一种或多种选自CD44、CD133ABCG2和ALDH的标志物。
在主题方法的某些实施方案中，所述抗体还包括生理学上可接受的载体或药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，所述方法包括给所述患者施用有效量的至少一种另外的抗癌剂。在示例性实施方案中，所述至少一种另外的抗癌剂选自基于铂的化疗药物、紫杉烷、酪氨酸激酶抑制剂、抗-EGFR抗体、抗-ErbB2抗体和它们的组合。
在某些实施方案中，所述至少一种另外的抗癌剂包含VEGF抑制剂。在某些实施方案中，所述VEGF抑制剂包含抗-VEGF抗体。在某些实施方案中，所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。
在某些实施方案中，所述至少一种另外的抗癌剂包括EGFR抑制剂。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂包含抗-EGFR抗体。在某些实施方案中，所述抗-EGFR抗体包含西妥昔单抗。在示例性实施方案中，所述抗-EGFR抗体选自马妥珠单抗、帕木单抗和尼妥珠单抗。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是EGFR信号传递的小分子抑制剂。在某些实施方案中，所述EGFR信号传递的小分子抑制剂选自吉非替尼、拉帕替尼、卡纽替尼、培利替尼、厄洛替尼HCL、PKI-166、PD158780和AG 1478。
在主题方法的某些实施方案中，给所述抗体缀合效应部分。在某些实施方案中，所述效应部分是毒性剂。在某些实施方案中，所述毒性剂是诸如蓖麻蛋白。
在主题方法的某些实施方案中，所述治疗包括阻断所述癌症的侵袭力。
在某些实施方案中，将主题抗体用在针对癌症的疫苗疗法中。在某些实施方案中，所述患者是人或哺乳动物。
在主题方法的某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在主题方法的某些实施方案中，所述癌症是选自脑癌、结肠癌、黑素瘤、白血病(例如，AML)、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌的癌症。
在主题方法的某些实施方案中，所述方法包括陪伴诊断。在某些实施方案中，所述陪伴诊断包括抗-EMP2抗体。
在另一个方面，本文提供了一种检测癌症干细胞的方法，所述方法包括：得到从具有或疑似具有癌症的人衍生出的生物样品；和检测EMP2的表达。在某些实施方案中，所述方法还包括检测一种或多种选自CD44、CD133、ABCG2和ALDH的标志物的表达。
在某些实施方案中，使用包括重链可变区和轻链可变区的抗-EMP2抗体执行所述检测。所述重链可变区包括三个重链互补决定区(HCDR)，且其中所述轻链可变区包括三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。
在所述检测方法的某些实施方案中，所述人具有或疑似具有癌症。在特定实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在示例性实施方案中，所述人具有或疑似具有三重阴性的乳腺癌。在其它实施方案中，所述人具有或疑似具有子宫内膜癌。
附图说明
图1包括的图显示了抗-EMP2IgG1抗体在SUM149细胞上的滴定。左，通过使用流式细胞计量术测量它的结合，在SUM149细胞上试验PG-101的重新配制。右，为了证实结合的特异性和敏感性，将利妥昔单抗用作阴性对照。
图2包括的图显示了与MDA-MB-468细胞结合的PG-101和变体。将PG-101(在制剂之前)与重新配制的PG-101、变体1和变体2进行了对比。
图3包括的图描绘了被设计成试验PG-101的重新配制的稳定性的实验。左图使用流式细胞计量术测量SUM149细胞上的PG-101的结合亲和力。右图显示了冷冻和融化以后PG-101的结合。
图4包括的图显示，抗-EMP2变体1仍然以提高的亲和力结合EMP2。使用SUM149和流式细胞计量术确定与EMP2结合的PG-101和变体1。
图5包括的图显示了PG-101相对于变体1的诱导细胞死亡的能力。左，通过使用流式细胞计量术定量膜联蛋白V/碘化丙啶染色，测量细胞死亡。右，使用锥虫蓝排除计数温育5天以后的总细胞数目。
图6的图显示了在第二个独立实验中PG-101相对于变体1的诱导细胞死亡的能力。通过使用流式细胞计量术定量膜联蛋白V/碘化丙啶染色，测量细胞死亡。
图7的图显示了在第三个独立实验中PG-101相对于变体1在MDA-MB-468细胞中诱导细胞死亡的能力。左，通过使用流式细胞计量术定量膜联蛋白V/碘化丙啶染色，确定细胞死亡。将细胞与50μg/ml对照IgG、PG-101或变体1一起温育5天。右，使用锥虫蓝排除计数细胞数目。
图8包括的两个图显示了在两个独立实验中抗-EMP2抗体的减小ALDH活性(癌症干细胞的一种量度)的能力。
图9描绘的第三个独立研究显示了主题抗-EMP2抗体的减小MDA-MB-468中的ALDH活性的能力。流式细胞计量术原始结果呈现在左侧，并以图形显示在右侧。
图10和11显示了使用乳腺球形成测定来确定主题抗-EMP2抗体的抑制癌症干细胞的能力。图10显示了将对照IgG、PG-101或变体1与BT474细胞一起温育2周的温育后细胞的原始图像。图11显示了一式三份孔中的乳腺球的计数。*，使用Student氏t检验，p＜0.05。
图12显示了PG-101的可变轻链CDR3中的脱酰胺化位点的计算机算法预测。
图13显示了胰蛋白酶切割实验的总结，该实验用于鉴别潜在的PG-101脱酰胺化位点是否对切割敏感。为了证实序列敏感性，将PG-101使用胰蛋白酶切割，并然后进行质谱法.质谱法证实CDR3中的预测位点对切割是敏感的。
图14提供了PG101和变体1(现在称作“PG-201”)在子宫内膜癌模型中减小体内肿瘤负载的能力的总结。
图15提供了变体1(“PG-201”)在乳腺癌细胞模型中减小体内肿瘤负载的能力的总结。
图16表明，PG-101中的CDR3脱氨位点阻止它作为抗体药物缀合物的用途。
具体实施方式
前言
以前已经证实，发现用抗-EMP2双体处理人子宫内膜腺癌细胞系会在体外诱导显著的细胞死亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割。参见，例如，美国专利公开号20100272732。这些应答与细胞的EMP2表达相关，且被黄体酮(其在生理学上诱导EMP2表达)增强。在体内，用抗-EMP2双体处理HEC-1A细胞系的皮下人异种移植物会抑制肿瘤生长，并诱导显著的异种移植细胞死亡。以前还已经报道，EMP2的靶向可以在治疗乳腺癌中提供治疗策略。参见，例如，美国专利公开号20100272732，通过引用整体并入。因此，本文提供了新抗-EMP2抗体、它们的药物组合物和使用这样的新抗-EMP2抗体治疗和诊断癌症(诸如子宫内膜癌和乳腺癌)的方法。本文提供的抗体表现出与现有抗-EMP2抗体相比增加的对EMP2的第二个细胞外环的结合亲和力，同时表现出与这样的现有抗-EMP2抗体相比至少类似的稳定性。
因此，在它的第一方面，本文提供了新抗-EMP2抗体和治疗癌症(例如，子宫内膜癌和乳腺癌)的方法。在另一个方面，本发明提供了抗-EMP2抗体的组合物和检测这样的癌症(例如，三重阴性的乳腺癌和子宫内膜癌)的方法。在另一个方面，本发明提供了抗-EMP2抗体的组合物和与一种或多种另外疗法共同施用的方法。在另一个方面，本发明提供了陪伴诊断方法和用于与本文描述的方法和抗体一起使用的产品。
抗体
在本发明中使用的抗体可以呈许多形式，诸如传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。在某些实施方案中，所述抗体是包括重链可变结构域和轻链可变结构域的抗-EMP2抗体.在某些实施方案中，所述重链可变结构域包括本文描述的重链可变结构域中的任一种，且所述轻链可变结构域包括本文描述的轻链可变结构域中的任一种。在某些实施方案中，所述抗-EMP2抗体包括重链和轻链，其中所述重链是本文描述的任意重链，且所述轻链是本文描述的任意轻链。
传统抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由两个相同的多肽链对组成，每个对具有一个“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一个“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。将人轻链分类为κ和λ轻链。将重链分类为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括、但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括、但不限于，IgM1和IgM2。因而，本文中使用的“同种型”是指通过它们的恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE.应当理解，治疗性抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合体。
每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。在可变区中，为重链和轻链的每个V结构域聚集三个环以形成抗原结合位点。每个环被称作互补性决定区(在下文中被称作“CDR”)，在其中氨基酸序列的变异是最显著的。“可变”表示这样的事实：所述可变区的某些区段在抗体之间存在广泛的序列差异。在可变区内的变异性没有均匀地分布。相反，V区域由15-30个氨基酸的相对不变的段(被称作框架区(FR))组成，所述段被各自为9-15个氨基酸长或更长的极端变异性的更短区域(称作“高变区”)隔开。
每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR组成，从氨基端至羧基端以下述次序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
所述高变区通常包括以下氨基酸残基：在轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)，和在重链可变区中的约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)附近；Kabat等人，SEQUENCES OFPROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，和/或形成高变环的那些残基(例如在轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)，以及在重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。在下面描述本发明的具体CDR。
贯穿本说明书，当表示可变结构域中的残基(大约，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，出处同上(1991))。
所述CDR促成抗体的抗原结合(或更具体地，表位结合)位点的形成。“表位”表示这样的决定簇：其与被称作互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用。表位是分子(诸如氨基酸或糖侧链)的群集，且经常具有特定结构特征、以及特定电荷特征。单个抗原可具有不止一个表位。例如，如本文中所述的，所述抗体结合EMP2的假定第二细胞外结构域中的表位。
所述表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫优势组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，诸如被特定抗原结合肽有效地阻断的氨基酸残基；换而言之，所述氨基酸残基是在特定抗原结合肽的足迹内。
在某些实施方案中，所述表位衍生自SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：2是EDIHDKNAKFYPVTREGSYG且代表来自人EMP2的第二个细胞外环的20-聚体多肽序列。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，在重链中存在几个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中是指具有独特三级结构的免疫球蛋白区域。在本发明中感兴趣的是重链结构域，包括恒定重链(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的背景下，IgG同种型各自具有三个CH区域。因此，在IgG的背景下，“CH”结构域如下：“CH1”表示根据EU索引(如在Kabat中)的位置118-220。“CH2”表示根据EU索引(如在Kabat中)的位置237-340，且“CH3”表示根据EU索引(如在Kabat中)的位置341-447。
重链的另一类Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中是指包含抗体的第一个和第二个恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，所述IgG CH1结构域终止于EU位置220，且所述IgG CH2结构域开始于残基EU位置237。因而，对于IgG，在本文中将抗体铰链定义为包括位置221(在IgG1中的D221)至236(在IgG1中的G236)，其中所述编号是根据EU索引(如在Kabat中).在某些实施方案中，例如在Fc区的背景下，包括较低铰链，所述“较低铰链”通常表示位置226或230。
在本发明中感兴趣的是Fc区。本文中使用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”是指这样的多肽：其包含抗体的恒定区(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域)，和在某些情况下，铰链的部分。因而，Fc表示IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和在这些结构域的N-端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及在Cγ1(Cγ1)和Cγ2(Cγ2)之间的较低铰链区。尽管Fc区的边界可以变化，经常将人IgG重链Fc区定义为包括残基C226或P230至它的羧基端，其中所述编号是根据EU索引(如在Kabat中)。在某些实施方案中，如在下面更充分地描述的，对Fc区做出氨基酸修饰，例如以改变与一种或多种FeγR受体或与FeRn受体的结合。
在某些实施方案中，所述抗体是全长的。“全长抗体”在本文中是指构成抗体的天然生物形式的结构，包括可变区和恒定区，包括一种或多种本文所述的修饰。
可替换地，所述抗体可以是多种结构，包括、但不限于，抗体片段、单克隆抗体、双特异性抗体、微体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中被称作“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合体(有时被称作“抗体缀合物”)和各自每种的片段。仍然存在的结构
在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段。具体抗体片段包括、但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单个可变结构域组成的dAb片段(Ward等人，1989，Nature 341：544-546，整个通过引用并入)，(v)分离的CDR区域，(vi)F(ab′)2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(seFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许所述两个结构域结合以形成抗原结合位点(Bird等人，1988，Science 242：423-426，Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883，整个通过引用并入)，(viii)双特异性的单链Fv(WO 03/11161，特此通过引用并入)，和(ix)“双体”或“三体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson等人，2000，Methods Enzymol.326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448，都整个通过引用并入)。
在某些实施方案中，所述抗体可以是来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人源化抗体。也就是说，在本发明中，所述CDR集合可以与除了本文序列特别描述的那些以外的框架区和恒定区一起使用。
一般而言，“嵌合抗体”和“人源化抗体”表示组合来自超过一个物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统地包含来自小鼠(或大鼠，在某些情况下)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”通常表示已经具有与在人抗体中发现的序列交换的可变结构域框架区的非人抗体。通常，在人源化抗体中，整个抗体(除了CDR以外)由人起源的多核苷酸编码，或与这样的抗体相同(除了在它的CDR内以外)。将CDR(其一些或全部由起源于非人生物体的核酸编码)移植进人抗体可变区的β-折叠框架中以产生抗体，其特异性由移植的CDR决定。这样的抗体的制备描述在，例如，WO 92/11018，Jones，1986，Nature 321：522-525，Verhoeyen等人，1988，Science 239：1534-1536，都整个通过引用并入。经常需要选择的受体框架残基向对应供体残基的“回复突变”来获得在最初的移植构建体中丧失的亲和力(US5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US6054297；US 6407213，都整个通过引用并入)。所述人源化抗体最佳地也将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常人免疫球蛋白的至少一部分，且因而通常将包含人Fc区。还可以使用具有遗传工程改造的免疫系统的小鼠制备人源化抗体。Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654，整个通过引用并入。许多用于人源化和改造非人抗体的技术和方法是本领域众所周知的(参见Tsurushita和Vasquez，2004，Humanization ofMonoclonal Antibodies，Molecular Biology of B Cells，533-545，Elsevier Science(USA)，和其中引用的参考文献，都整个通过引用并入)。人源化方法包括、但不限于在以下文献中描述的方法：Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988；Nature332：323-329；Verhoeyen等人，1988，Science，239：1534-1536；Queen等人，1989，Proc NatlAcad Sci，USA86：10029-33；He等人，1998，J.Immunol.160：1029-1035；Carter等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-9，Presta等人，1997，Cancer Res.57(20)：4593-9；Gorman等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4181-4185；O’Connor等人，1998，ProteinEng 11：321-8，都整个通过引用并入。人源化或降低非人抗体可变区的免疫原性的其它方法可以包括重修表面方法，如例如在Roguska等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：969-973中所述，整个通过引用并入。在一个实施方案中，所述亲本抗体已经经过亲和力成熟，如在本领域中已知的。可以采用基于结构的方法来人源化和亲和力成熟，例如如在USSN11/004,590中所述。可以采用基于选择的方法来将抗体可变区人源化和/或亲和力成熟，包括、但不限于在以下文献中描述的方法：Wu等人，1999，J.Mol.Biol.294：151-162；Baea等人，1997，J.Biol.Chem.272(16)：10678-10684；Rosok等人，1996，J.Biol.Chem.271(37)：22611-22618；Rader等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：8910-8915；Krauss等人，2003，Protein Engineering 16(10)：753-759，都整个通过引用并入。其它人源化方法可以包括移植CDR的仅部分，包括、但不限于在以下文献中描述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人，2002，J.Immunol.169：1119-1125；De Pascalis等人，2002，J.Immunol.169：3076-3084，都整个通过引用并入。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以是多特异性抗体，和特别是双特异性抗体。这些是结合两种(或更多种)不同抗原或相同抗原上的不同表位的抗体。
在某些实施方案中，所述抗体是双体。
在一个实施方案中，所述抗体是微体(minibody)。微体是包含与CH3结构域连接的scFv的最小化抗体-样蛋白。Hu等人，1996，Cancer Res.56：3055-3061，整个通过引用并入。在某些情况下，可以将scFv连接至Fc区，且可以包括一些或整个铰链区。
本文描述的抗体可以是分离的或重组的。“分离的抗体”表示基本上不含有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，分离的特异性地结合EMP2的抗体基本上不含有特异性地结合除了EMP2以外的抗原的抗体。
但是，分离的特异性地结合人EMP2或鼠EMP2的表位、异形体或变体的抗体具有与其它有关抗原(例如来自其它物种，诸如EMP2物种同系物)的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含有其它细胞物质和/或化学物质。
抗-EMP2可变区序列(用于编码主链上的蛋白，包括天然抗体、片段抗体或合成主链)可以亲密地结合EMP-2。通过该结合，这些蛋白可以用于EMP2检测和阻断EMP2功能。这些可变区序列在天然抗体主链上或作为scFv、三抗体(triabody)、双体或微体(minibody)(被放射性核素标记)的表达在携带EMP-2的细胞的体内检测中是特别有用的。在这些主链或天然抗体主链上的表达有利于在体内阻断EMP-2的功能和/或杀死携带EMP-2的细胞(例如，妇科肿瘤)。
本发明的抗-EMP2抗体特异性地结合EMP2配体(例如SEQ ID NO：1和2的人和鼠EMP2蛋白)。
例如，对抗原或表位具有至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、可替换地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大的KD的抗体，可以表现出特定抗原或表位的特异性结合，其中KD表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性地结合抗原的抗体将具有比对照分子对所述抗原或表位大20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍的KD。
并且，例如，对抗原或表位具有比对照对所述表位大至少20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍的KA或Ka的抗体可以表现出对特定抗原或表位的特异性结合，其中KA或Ka表示特定抗体-抗原相互作用的结合速率。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，如下所示：
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRGRKSAGIDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO3).PG-101重链可变区结构域。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSGWTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO：4).PG-101变体1轻链可变区结构域。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNLWTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO：5).PG-101变体2轻链可变区结构域。
如本文中所述的，这样的抗-EMP2抗体是与已知的抗-EMP2抗体相比有利地表现出增加的表位(SEQ ID NO：2)结合的变体抗-EMP2抗体。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：4具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有如在SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如在SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链与根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性，所述轻链与根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链具有根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRGRKSAGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVVVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLySKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：6).PG-101重链。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSGWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：7).PG-101变体1轻链。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：5具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有如在SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链与根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性，所述轻链与根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链具有根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNLWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：8).PG-101变体2轻链。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：9具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有如在SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如在SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNGWTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO：9).PG-101亲本轻链可变区结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链与根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性，所述轻链与根据SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多序列同一性。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链具有根据SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNGWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：10).PG-101亲本轻链。
在某些实施方案中，所述抗-EMP2包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括根据SEQ ID NO：11的HCDR1、根据SEQ ID NO：12的HCDR2、根据SEQ IDNO：13的HCDR3，所述轻链可变结构域包括根据SEQ ID NO：14的LCDR1、根据SEQ ID NO：15的LCDR2和根据SEQ ID NO：16的LCDR3，如下所述。如在本文提供的研究中所示，具有这样的CDR的抗-EMP2抗体有利地表现出增加的与EMP2的结合以及至少与已知的抗-EMP2抗体可比较的稳定性。
可变重链CDR1：SYAMH(SEQ ID NO：11)
可变重链CDR2：VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：12)
可变重链CDR3：DRRGRKSAGIDY(SEQ ID NO：13)
可变轻链CDR1：QASQDISNYLN(SEQ ID NO：14)
可变轻链CDR2：AASSLQS(SEQ ID NO：15)
可变轻链CDR3：LQDYSGWT(SEQ ID NO：16)
本发明还提供了变体抗体。也就是说，可以对本发明的抗体做出许多修饰，包括、但不限于，在CDR中的氨基酸修饰(亲和力成熟)、在Fc区中的氨基酸修饰、糖基化变体、其它类型的共价修饰等。本文提供的主题抗体的CDR如下：
“变体”在本文中是指这样的多肽序列：其与亲本多肽的序列相差至少一个氨基酸修饰。氨基酸修饰可以包括置换、插入和缺失，前者在许多情况下是优选的。
一般而言，变体可以包括任意数目的修饰，只要蛋白的功能仍然存在，如本文中所述的。也就是说，在用本文描述的重链或轻链可变区产生的氨基酸变体的情况下，例如，所述抗体仍然特异性地结合人和/或鼠EMP2。类似地，如果用Fc区产生氨基酸变体，例如，变体抗体应当维持对于所述抗体的特定应用或适应症而言要求的受体结合功能。
但是，一般而言，通常利用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换，因为目标经常是用最小数目的修饰改变功能。在某些情况下，存在1-5个修饰，在许多实施方案中也使用1-2、1-3和1-4个。
应当指出，氨基酸修饰的数目可以是在功能结构域内：例如，可能合乎需要的是，在野生型或经工程改造的蛋白的Fc区中具有1-5个修饰，以及在Fv区域中具有1-5个修饰，例如。变体多肽序列优选地与亲本序列具有至少约80％、85％、90％、95％或多达98或99％同一性。应当指出，取决于序列的大小，同一性百分比将取决于氨基酸的数目。
“氨基酸置换”或“置换”在本文中是指用另一个氨基酸替换亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸。例如，置换S100A表示这样的变体多肽：其中在位置100处的丝氨酸被丙氨酸替换。本文中使用的“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列的特定位置处添加氨基酸。本文中使用的“氨基酸删除”或“删除”是指在亲本多肽序列的特定位置处的氨基酸的除去。
“变体Fc区”在本文中是指与野生型Fc序列相差至少一个氨基酸修饰的Fc序列。Fc变体可以表示Fc多肽本身、包含Fc变体多肽的组合物或所述氨基酸序列。
可以进行亲和力成熟以使抗体对抗原的结合亲和力与“亲本”抗体相比增加至少约10％至50-100-150％或更多，或1-5倍。优选的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。通过已知的方法生产亲和力成熟的抗体。参见，例如，Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783，其描述了通过重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)结构域改组实现的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述在例如：Barbas，等人.1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，J.Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；和Hawkins等人，1992，J.Mol.Biol.226：889-896。
可替换地，可以在本发明的抗体的一个或多个CDR中做出氨基酸修饰，其为“沉默的”，例如不会显著地改变抗体对抗原的亲和力。这些可以为了许多原因做出，包括优化表达(正如可以对编码本发明的抗体的核酸做出的)。
因而，在本发明的CDR和抗体的定义内包括变体CDR和抗体；也就是说，本发明的抗体可以包括在本文描述的主题抗体的一个或多个CDR(SEQ ID NO：11至16)中的氨基酸修饰。另外，如下所述，氨基酸修饰还可以独立地和任选地在CDR以外的任何区域(包括框架区和恒定区)中做出。
在某些实施方案中，本文提供的抗-EMP2抗体由变体Fc结构域组成。如本领域已知的，抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，从而赋予许多重要的功能能力(被称作效应子功能)。这些Fc受体包括、但不限于：(在人类中)FcγRI(CD64)，包括异形体FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括异形体FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括异形体FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158，与抗体依赖性的细胞细胞毒性(ADCC)相关)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)、FcRn(新生儿受体)、C1q(在补体依赖性的细胞毒性(CDC)中涉及的补体蛋白)和FcRn(在血清半衰期中涉及的新生儿受体)。可以在一个或多个位置做出合适的修饰，如例如在以下文献中一般地描述的：美国专利申请11/841,654和其中引用的参考文献，US 2004/013210，US 2005/0054832，US 2006/0024298，US2006/0121032，US 2006/0235208，US 2007/0148170，USSN 12/341,769，美国专利号6,737,056，美国专利号7,670,600，美国专利号6,086,875，它们都明确地通过引用整体并入，且特别是对于增加与Fc受体的结合的特定氨基酸置换。
除了上述修饰以外，可以做出其它修饰。例如，通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥，可以将所述分子稳定化(Reiter等人，1996，Nature Biotech.14：1239-1245，整个通过引用并入)。另外，如下所述可以做出抗体的多种共价修饰。
在本发明范围内包括抗体的共价修饰，且通常，但不总是，在翻译后完成。例如，通过使抗体的特定氨基酸残基与有机衍生化试剂(其能够与选择的侧链或N-或C-末端残基反应)反应，将抗体的几类共价修饰引入所述分子中。
最常见地使半胱氨酰基残基与α-卤代乙酸盐(和对应的胺)诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以产生羧甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰基残基也可以通过与以下物质反应而衍生化：溴三氟丙酮，α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸，氯乙酰基磷酸酯，N-烷基马来酰亚胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，对-氯汞基苯甲酸酯，2-氯汞基-4-硝基苯酚，或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑等。
另外，在半胱氨酸处的修饰在抗体-药物缀合物(ADC)应用中是特别有用的，如在下面进一步描述的。在某些实施方案中，可以将抗体的恒定区工程改造成含有一个或多个特别“巯基反应性的”半胱氨酸，从而允许所述药物部分的更特异性的和受控的放置。参见例如美国专利号7,521,541，通过引用整体并入本文。
组氨酰基残基通过在pH 5.5-7.0与二乙基焦碳酸酯反应而衍生化，因为该试剂对组氨酰基侧链是相对特异性的。对-溴苯酰基溴也是有用的；所述反应优选地在pH 6.0在0.1M二甲基胂酸钠中进行。
赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酸酐反应。这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰基残基的电荷的作用。用于衍生化含有α-氨基的残基的其它合适试剂包括亚氨酸酯诸如甲基吡啶亚氨酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊烷二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸酯的反应。
通过与一种或几种常规试剂反应来修饰精氨酰基残基，它们包括苯基乙二醛、2，3-丁烷二酮、1，2-环己烷二酮和茚三酮。因为胍官能团的高pKa，精氨酸残基的衍生化要求所述反应在碱性条件下执行。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。
可以做出酪氨酰基残基的具体修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮鎓化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰基残基中。最常见的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来分别形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。使用125I或13u将酪氨酰基残基碘化以制备用于用在放射免疫测定中的经标记的蛋白，上述的氯胺T方法是合适的。
通过与碳二亚胺(R′-N＝C＝N--R′)反应来选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)，其中R和R′任选地是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，通过与铵离子反应，将天冬氨酰基和谷氨酰基残基转化成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
除了下述方法以外，双功能试剂衍生化可用于将抗体交联至不溶于水的支持基质或表面用于用在多种方法中。常用的交联剂包括，例如，1，1-双(重氮基乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮基水杨酸的酯)、同双功能的亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚胺基酯诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))和双功能的马来酰亚胺(诸如二-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷)。衍生化试剂诸如甲基-3-[(对-叠氮基苯基)二硫代]丙酰亚氨酸酯(propioimidate)产生可光活化的中间体，其能够在有光存在下形成交联。可替换地，将反应性的不溶于水的基质诸如cynomolgusogen bromide-活化的碳水化合物和在美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440(都整个通过引用并入)中描述的反应性基质用于蛋白固定化。
经常将谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别去酰胺化成对应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。可替换地，在弱酸性条件下将这些残基去酰胺化。这些残基的任一种形式落在本发明范围内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86页[1983]，整个通过引用并入)、N-端胺的乙酰化、和任何C-端羧基基团的酰胺化。
另外，本领域技术人员会明白，可以将标记(包括荧光标记、酶标记、磁标记、放射性标记等)添加至所述抗体(以及本发明的其它组合物)。
另一类共价修饰是糖基化的改变。在另一个实施方案中，可以将本文中公开的抗体修饰成包括一个或多个经工程改造的糖型。本文中使用的“经工程改造的糖型”是指与所述抗体共价地连接的碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组合物在化学上不同于亲本抗体。经工程改造的糖型可以用于多种目的，包括、但不限于增强或减小效应子功能。经工程改造的糖型的一种优选形式是岩藻糖基化，其已经被证实与ADCC功能的增加相关，据推测通过与FcγRIIIa受体的更紧密结合.在该背景下，“去岩藻糖基化”是指，在宿主细胞中产生的大多数抗体基本上不含有岩藻糖，例如90-95-98％的产生的抗体不具有可察觉的岩藻糖作为抗体的碳水化合物部分的组分(通常连接在Fc区中的N297)。在功能上定义，去岩藻糖基化的抗体通常表现出至少50％或更高的对FcγRIIIa受体的亲和力。
通过本领域已知的多种方法可以制备经工程改造的糖型(等人，1999，NatBiotechnol 17：176-180；Davies等人，2001，Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等人，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等人，2003，J Biol Chem 278：3466-3473；US 6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1，都整个通过引用并入；( technology[Biowa，Inc.，Princeton，NJ]；糖基化工程技术[Glycart Biotechnology AG，瑞士)。这些技术中的许多是基于控制与Fc区共价地连接的岩藻糖基化寡糖和/或二等分寡糖的水平，例如通过在不同的生物或细胞系中表达IgG，工程改造或以其它方式(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞，通过调节在糖基化途径中涉及的酶(例如FUT8[α1，6-岩藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III[GnTIII])，或通过在已经表达IgG以后修饰碳水化合物。例如，Seattle Genetics的“糖工程改造的抗体”或“SEA技术”通过添加经修饰的糖而起作用，所述糖在生产过程中抑制岩藻糖基化；参见例如20090317869，特此通过引用整体并入。经工程改造的糖型通常表示不同的碳水化合物或寡糖；因而，抗体可以包括经工程改造的糖型。
可替换地，经工程改造的糖型可以表示包含不同的碳水化合物或寡糖的IgG变体。如本领域已知的，糖基化模式可以取决于蛋白的序列(例如，下面讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或在其中生产蛋白的宿主细胞或生物。在下面讨论了特定表达系统。
多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的表示碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物部分向天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因而，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在会建立潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化表示糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸(最常见地，丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
通过改变氨基酸序列使得它含有上述三肽序列中的一个或多个(对于N-连接的糖基化位点)，方便地完成糖基化位点向抗体的添加。所述改变也可以如下完成：向起始序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)。方便起见，优选地通过DNA水平的变化来改变抗体氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码靶多肽的DNA，使得产生将翻译成期望的氨基酸的密码子。
增加抗体上的碳水化合物部分的数目的另一种方式是通过将糖苷与蛋白化学或酶促偶联。这些操作是有利的，因为它们不要求在具有糖基化能力(对于N-和O-连接的糖基化)的宿主细胞中生产蛋白。取决于使用的偶联模式，可以将糖连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基基团，(c)游离巯基诸如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述在WO 87/05330以及Aplin和Wriston，1981，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页，二者整个通过引用并入.
存在于开始抗体上的碳水化合物部分的除去(例如在翻译后)可以化学地或酶促地完成。化学去糖基化要求将蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或等同的化合物。该处理导致除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)以外的大部分或所有的糖的切割，而剩下完整的多肽。化学去糖基化描述在Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和Edge等人，1981，Anal.Biochem.118：131，二者整个通过引用并入。多肽上的碳水化合物部分的酶切割可以使用多种内切-和外切-糖苷酶实现，如Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138：350所述，整个通过引用并入。在潜在糖基化位点处的糖基化可以通过使用化合物衣霉素阻止，如Duskin等人，1982，J.Biol.Chem.257：3105所述，整个通过引用并入。衣霉素会阻断蛋白-N-糖苷键的形成。
抗体的另一类共价修饰包含以在下述文献中阐述的方式将抗体连接至各种非蛋白性聚合物，包括、但不限于，各种多元醇诸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯：例如，来自Nektar Therapeutics的2005-2006PEG Catalog(可得自Nektar网站)，美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337，都整个通过引用并入。另外，如本领域已知的，可以在抗体内的不同位置做出氨基酸置换，以促进聚合物诸如PEG的添加。参见例如，美国公开号2005/0114037A1，整个通过引用并入。
在某些情况下，将竞争性结合测定的一种或多种组分标记。
还可能是这样的情况：就超过一种EMP2表位和/或EMP2的部分而言，竞争可以存在于抗-EMP2抗体之间，例如在其中EMP2的特定区域的抗体结合性质被保留在其片段中的背景下，诸如在较好呈递的(Well-presented)直链表位位于不同试验片段或构象表位(其存在于足够大的EMP2片段中以及EMP2中)中的情况下。
评估竞争通常包括使用本发明的抗体、EMP2(人或鼠或二者)和试验分子评价相对抑制性结合.试验分子可以包括任何分子，包括其它抗体、小分子、肽等。将所述化合物以足以产生对比的量混合，所述对比会传递关于目标分子相对于其它存在的分子的选择性和/或特异性的信息。
可以改变本发明的试验化合物、EMP2和抗体的量。例如，对于ELISA评估，需要约5-50μg(例如，约10-50μg、约20-50μg、约5-20μg、约10-20μg等)的抗-EMP2抗体和/或EMP2靶标来评估是否存在竞争。条件还应当适合于结合。通常，生理或接近生理条件(例如，约20-40℃的温度，pH约7-8等)适合于抗-EMP2：EMP2结合.
经常通过由ELISA和/或FACS分析所确定的大于约5％的显著更大的相对抑制来标记竞争。可能合乎需要的是，将更高的相对抑制阈值设定为在特定背景下是合适竞争水平的标准/决定因素(例如，在将竞争分析用于选择或筛选新抗体的情况下，所述新抗体被设计成具有阻断另一种肽或分子(例如，EMP2的天然结合配偶体或天然存在的抗-EMP2抗体(与EMP2的结合的预期功能)。
在某些实施方案中，本发明的抗-EMP2抗体特异性地结合EMP2中的一个或多个残基或区域，但是也不会与其它蛋白(其具有与EMP2的同源性)交叉反应.
通常，交叉反应性的缺乏是指，当在合适的测定条件下使用足够量的分子通过ELISA和/或FACS分析评估时，所述分子之间小于约5％的相对竞争性抑制。
公开的抗体可以用于阻断配体-受体相互作用或抑制受体组分相互作用。本发明的抗-EMP2抗体可以是“阻断性的”或“中和性的”。“中和抗体”意图表示这样的抗体：其与EMP2的结合导致EMP2的生物活性(例如它与配体相互作用的能力、酶活性和/或信号传递能力)的抑制。通过本领域已知的几种标准体外或体内测定中的一种或多种，可以评估EMP2的生物活性的抑制。
“抑制结合”或“阻断结合”(例如当提及EMP2结合配偶体与EMP2的结合的抑制/阻断时)包括部分的和完全的抑制/阻断。EMP2结合配偶体与EMP2的结合的抑制/阻断可以减小或改变当在没有抑制或阻断的情况下EMP2结合配偶体结合EMP2时发生的细胞信号传递的正常水平或类型。抑制和阻断也意图包括，与没有接触抗-EMP2抗体的配体相比，当接触抗-EMP2抗体时EMP2结合配偶体与EMP2的结合亲和力的任何可测量的减小，例如使EMP2结合配偶体与EMP2的结合阻断至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
本发明还提供了生产公开的抗-EMP2抗体的方法。这些方法包括培养宿主细胞，其含有分离的编码本发明的抗体的核酸。本领域技术人员会明白，这可以以多种方式实现，取决于抗体的性质。在某些实施方案中，在本发明的抗体是全长传统抗体(例如，重链可变区和轻链可变区)的情况下，在使得抗体被生产且可以被分离的条件下。
一般而言，提供了核酸，其编码本发明的抗体(参见，例如，SEQ ID NO：21至24)。这样的多核苷酸编码重链和轻链各自的可变区和恒定区，尽管根据本文描述的组合物本发明也预见到其它组合。本发明也预见到从公开的多核苷酸衍生出的寡核苷酸片段和与这些多核苷酸互补的核酸序列。
所述多核苷酸可以呈RNA或DNA的形式。呈DNA、cDNA、基因组DNA、核酸类似物和合成DNA的形式的多核苷酸是在本发明范围内。所述DNA可以是双链的或单链的，且如果是单链的，可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。编码多肽的编码序列可以与本文提供的编码序列相同，或可以是不同的编码序列，所述序列由于遗传密码的冗余或简并性而编码与本文提供的DNA相同的多肽。
在某些实施方案中，将编码本发明的抗体的核酸掺入表达载体中，所述表达载体可以是在染色体外或被设计成整合进它所引入的宿主细胞的基因组中。表达载体可以含有任何数目的适当调节序列(包括、但不限于，转录和翻译控制序列、启动子、核糖体结合位点、增强子、复制起点等)或其它组分(选择基因等)，它们都可操作地连接，如本领域众所周知的。在某些情况下，使用两个核酸，且分别置于不同的表达载体中(例如重链在第一个表达载体中，轻链在第二个表达载体中)，或可替换地它们可以置于相同的表达载体中。本领域技术人员将理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以取决于诸如宿主细胞的选择、期望的蛋白的表达水平等因素.
一般而言，使用适合于选择的宿主细胞的任何方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)可以将所述核酸和/或表达引入合适的宿主细胞中以建立重组宿主细胞，使得所述核酸分子可操作地连接至一个或多个表达控制元件(例如，在载体中，在通过细胞中的过程建立的构建体中，整合进宿主细胞基因组中)。可以将得到的重组宿主细胞维持在适合于表达的条件下(例如在有诱导物存在下，在合适的非人动物中，在补充了适当的盐、生长因子、抗生素、营养补剂等的合适培养基中)，由此生产编码的多肽.在某些情况下，在一种细胞中生产重链，且在另一种细胞中生产轻链。
可作为表达宿主得到的哺乳动物细胞系是本领域已知的，且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA得到的永生化的细胞系，包括、但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK 293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和许多其它细胞系。非哺乳动物细胞(包括、但不限于细菌、酵母、昆虫和植物)也可以用于表达重组抗体。在某些实施方案中，可以在转基因动物(诸如奶牛或鸡)中生产所述抗体。
本文提供的抗-EMP2抗体还可以包括与其连接的标记或可检测的部分。“标记”或“可检测的部分”是通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其它物理方式可检测的组合物。例如，有用的标记包括32p、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在ELISA中常用的)、生物素、地高辛配基或半抗原和蛋白，其可以成为可检测的，例如，通过将放射性标记掺入所述肽中，或用于检测可与所述肽特异性地反应的抗体。
组合物
当用于药用目的时，通常将本文提供的抗-EMP2抗体配制在合适的缓冲液中，所述缓冲液可以是任何药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水或磷酸钠/硫酸钠、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和普通技术人员已知的其它缓冲液，诸如Good等人，Biochemistry 5：467(1966)描述的那些。所述组合物可以另外包括稳定剂、增强剂或其它药学上可接受的载体或媒介物。药学上可接受的载体可以含有生理上可接受的化合物，所述化合物起作用，例如，以稳定本发明的核酸或多肽和任何伴随的载体。生理上可接受的化合物可以包括，例如，碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白或其它稳定剂或赋形剂。其它生理上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，它们对于阻止微生物的生长或作用而言可以是特别有用的。多种防腐剂是众所周知的，且包括，例如，苯酚和抗坏血酸。载体、稳定剂或佐剂的例子可以参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)。
根据本发明的药物组合物包含治疗有效量的主题抗-EMP2抗体和药学上可接受的载体。“治疗有效剂量或量”在本文中是指产生施用它的目的效果(例如，癌症的治疗或预防)的剂量。确切的剂量和制剂将取决于治疗的目的，并且将是本领域技术人员使用已知技术可确定的(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Gennaro，Editor(2003)，和Pickar，Dosage Calculations(1999))。如果是盐的话，将EMP2衣原体属(Chlamydia)抑制剂配制为“药学上可接受的盐”。
“药学上可接受的盐”意在包括活性化合物的盐，其根据施用途径用相对无毒的酸或碱制备。当本发明的抑制剂含有相对酸性的官能团时，通过使这类化合物的中性形式接触足量的所需碱(净的或在合适的惰性溶剂中)，可以获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的例子包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐、或镁盐或类似盐.当本发明化合物包含相对碱性的官能团时，通过使这类化合物的中性形式接触足量的所需酸(净的或在合适的惰性溶剂中)，可以获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的例子包括从无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等衍生出的那些，以及从相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等衍生出的盐。还包括诸如精氨酸等氨基酸的盐和诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等有机酸的盐(参见，例如，Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977))。本发明的某些具体化合物含有碱性和酸性官能团，所述官能团允许将所述化合物转化成碱或酸加成盐。
通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物，可以再生所述化合物的中性形式.所述化合物的母体形式在某些物理性能(诸如在极性溶剂中的溶解度)方面不同于各种盐形式，但是在其它方面所述盐等同于用于本发明的目的的化合物的母体形式。
除了盐形式以外，本发明提供了处于前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理条件下容易地经历化学变化以提供本发明的化合物的那些化合物。另外，通过在离体环境中的化学或生化方法，可以将前药转化成本发明的化合物。例如，当与合适的酶或化学试剂一起置于透皮贴剂蓄池中时，可以将前药缓慢地转化成本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以以未溶剂合形式以及溶剂合形式(包括水合形式)存在。一般而言，所述溶剂合形式等同于未溶剂合形式，且意图被包括在本发明范围内。本发明的某些化合物可以以多晶形或无定形形式存在。一般而言，所有物理形式对于本发明预见到的用途而言是等效的，且意图在本发明范围内。
除了生物聚合物诸如核酸和多肽以外，本发明的某些化合物具有不对称的碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映异构体、几何异构体和各种异构体都意图被包括在本发明范围内。在优选的实施方案中，其中所述化合物包含氨基酸或核酸，所述氨基酸和核酸各自是占优势的天然存在的生物对映异构体。
用于施用的组合物通常包含溶解在药学上可接受的载体(优选水性载体)中的如本文中所述的药剂。可以使用多种水性载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，且通常不合有不希望的物质。通过常规的众所周知的灭菌技术，可以将这些组合物灭菌。所述组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性剂的浓度可以宽泛地变化，且根据选择的特定施用模式和患者的需要主要基于流体体积、粘度、体重等来选择。
用于用在本发明中的合适制剂参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第20版，Gennaro编(2003)，其通过引用并入本文。此外，关于药物递送的方法的简要综述，参见，Langer，Science 249：1527-1533(1990)，其通过引用并入本文。以本领域技术人员已知的方式，即，借助于常规混合、溶解、粒化、糖衣丸制造、磨细、乳化、包囊、包封或低压冻干方法，可以制备本文描述的药物组合物。下述方法和赋形剂仅仅是示例性的，并且绝不是限制性的。
就注射而言，可以将本文提供的抗-EMP2抗体配制在水溶液中，优选生理学上相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。对于透粘膜施用，在所述制剂中使用适合要透过的屏障的穿透剂。这样的穿透剂在本领域内是公知的。
就口服施用而言，通过与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合，可以容易地配制本文提供的抗-EMP2抗体。这样的载体使所述化合物能够被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、乳剂、亲脂的和亲水的混悬液、液体、凝胶、糖浆剂、浆、混悬液等，供要治疗的患者口服摄入。可以如下得到用于口服的药物制剂：将所述化合物与固体赋形剂混合，任选地碾磨所得的混合物，加工颗粒的混合物，在加入合适的助剂(如果需要的话)以后，得到片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂具体地是，填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备物，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐诸如海藻酸钠。
可以给糖衣丸芯提供合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣丸包衣中加入染料或颜料，用于鉴别或者表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物制剂包括：由明胶制成的推入-配合式胶囊剂以及由明胶和塑化剂(诸如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊剂。所述推入-配合式胶囊剂可以含有与下列成分混合的活性成分：填充剂，例如乳糖；粘合剂，例如淀粉；和/或润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁；和任选的稳定剂。在软胶囊剂中，可以将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。用于口服施用的所有制剂应当呈适合于这样的施用的剂量。
在某些实施方案中，用于静脉内施用的药物组合物可以提供约0.1-100mg/患者/天。可以使用0.1直到约100mg/患者/天的剂量。实质上更高的剂量在局部施用中是可能的。用于制备胃肠外施用的组合物的实际方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，并且更详细地描述在诸如以下出版物中：Remington：The Science and Practice of Pharmacy，2005年第21版，Lippincott Williams&Wilkins，Publishers.
可以以多种剂型和量施用所述药物组合物，取决于施用方法。例如，适合用于口服施用的单位剂型包括、但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊剂和锭剂。应当认识到，当口服地施用时，应当保护抗体免于消化。这通常如下实现：将所述分子与组合物形成复合物以使它们耐受酸性和酶促水解，或将所述分子包装在适当抗性载体(诸如脂质体或保护屏障)中。保护药剂免于消化的方式是本领域众所周知的。
通过将具有期望纯度的抗-EMP2抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，可以制备药物制剂.这样的制剂可以是低压冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度是对接受者无毒的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、防腐剂、低分子量多肽；蛋白，诸如血清白蛋白或明胶，或亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；和氨基酸、单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；和离子型和非离子型表面活性剂(例如，聚山梨酯)；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂。可以在0.5-200mg/ml之间或10-50mg/ml之间的浓度配制所述抗体。
可以施用含有主题抗-EMP2抗体的组合物用于治疗性或预防性处理。在治疗用途中，以“治疗有效剂量”将组合物施用给患者。根据要求的和患者耐受的剂量和频率，可以施用所述组合物的单次或多次施用。为了本发明的目的，“患者”或“受试者”包括人类和其它动物，特别是哺乳动物。因而，所述方法适用于人疗法和兽医应用。在优选的实施方案中，所述患者是哺乳动物，优选灵长类动物，且在最优选的实施方案中，所述患者是人。
所述药物组合物可以包含另外的活性剂，包括下述任意一种或多种：镇痛药、抗炎药、抗生素、抗微生物剂、润滑剂、避孕药、杀精子剂、局部麻醉药和止痒药。
本文中使用的术语“载体”表示通常惰性的物质，其用作要在体内或在体外应用于生物系统的活性剂的稀释剂或媒介物。(例如，药物诸如治疗剂)。该术语也包括给所述组合物赋予粘合性质的通常惰性的物质。
在某些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其在细胞或生物水平包含EMP2抑制剂和生理上可接受的载体。通常，生理上可接受的载体以液体、固体或半固体形式存在。液体载体的例子包括生理盐水、磷酸盐缓冲液、正常缓冲盐水(135-150mM NaCl)、水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、用于提供增强的稳定性的糖蛋白(例如，白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)等。固体或半固体载体的例子包括甘露醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糊精、乳糖、右旋糖、蔗糖、葡萄糖、肌醇、粉末糖、糖蜜、淀粉、纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、瓜尔胶、黄蓍胶、海藻酸盐、鹿角菜提取物、潘瓦尔胶、印度胶、伊莎贝果壳的粘液、落叶松阿拉伯半聚乳糖、明胶、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚丙烯酸(例如，聚羧乙烯)、硅酸钙、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、高岭土、氯化钠、聚乙二醇和它们的组合。由于生理上可接受的载体部分地取决于正在施用的特定组合物以及用于施用所述组合物的特定方法，存在本发明的药物组合物的多种合适制剂(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1989)。所述载体和组合物优选地是无菌的。
本文提供的组合物可以通过常规的众所周知的灭菌技术灭菌，或可以在无菌条件下生产。可以将水溶液包装使用或在无菌条件下过滤和低压冻干，所述低压冻干的制品在施用之前与无菌水溶液组合。所述组合物可以含有需要的药学上或生理上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、润湿剂等，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和三乙醇胺油酸酯。
适合用于口服施用的制剂可以包含：(a)液体溶液，诸如悬浮于稀释剂(例如，水、盐水或PEG 400)中的有效量的包装的基于铂的药物；(b)胶囊剂、药囊或片剂，各自含有预定量的基于铂的药物，作为液体、固体、颗粒或明胶；(c)在适当的液体中的混悬液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可以包括下述的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂、染料、崩解剂和药学上适合的载体。
治疗的方法
在另一个方面，本文提供了通过给受试者施用有效量的本文描述的主题抗-EMP2抗体中的任一种或包括主题抗-EMP2抗体的免疫缀合物来治疗癌症(例如，侵袭性癌症或转移)、阻止表达EMP-2的癌症的进展、或降低受试者中的癌症率的方法。在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者。在某些实施方案中，所述受试者是人。在示例性实施方案中，所述受试者是至少20岁、25岁、30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或100岁。
本文中使用的“癌症”表示人癌症和癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括实体瘤和淋巴样癌、肾癌、乳癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、脑癌、头和颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、食管癌和肝癌、淋巴瘤，包括非霍奇金和霍奇金淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。“泌尿生殖器癌”表示人泌尿道和生殖器组织的癌，所述组织包括、但不限于肾、膀胱、泌尿道、尿道、前列腺、阴茎、睾丸、外阴、阴道、宫颈和卵巢组织。在本文中要检测、诊断或治疗的癌症表达或过表达EMP2。过表达EMP2的癌症包括、但不限于子宫内膜癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌和骨髓瘤。
在某些实施方案中，本文提供的方法用于治疗疗法抗性的癌症。“疗法抗性的”癌症、肿瘤细胞和肿瘤表示已经变成对细胞凋亡介导的(例如，通过死亡受体细胞信号传递，例如，Fas配体受体、TRAIL受体、TNF-R1、化疗药物、辐射)和非细胞凋亡介导的(例如，有毒药物、化学物质)癌症疗法(包括化学疗法、激素疗法、放射疗法和免疫疗法)中的任一种或两种抗性的或难治的癌症。本发明预见到两种类型的治疗。
在某些实施方案中，本文提供的主题方法用于治疗过表达EMP2的癌症。“过表达”表示组织中EMP2的RNA或蛋白表达显著地高于对照组织样品中的该RNA或蛋白表达。在一个实施方案中，所述组织样品是自体的。与来自不太可能发展成转移的患者的癌组织或正常(即，非癌)组织样品相比，与侵袭力、转移、激素非依赖性(例如，雄激素非依赖性)、或对治疗的不应性或增加的它们的可能性有关的癌性试验组织样品通常具有高至少2倍的EMP2mRNA或蛋白的表达，经常高多达3、4、5、8、10或更多倍的EMP2蛋白表达。当观察大约类似地加载了试验和对照样品的凝胶的带时，这样的差异可以是容易明白的。表达增加的量的EMP2的前列腺癌更可能变成侵袭性的、转移的或发展成治疗难治的癌症。不同的截止值对于EMP2过表达是恰当的，因为原发肿瘤中的EMP2阳性细胞的小百分比可能鉴别具有复发和转移高危的肿瘤。术语“过表达”或“过度表达”可互换地表示，与相同类型的正常细胞相比，在可检测地更大的水平转录或翻译基因，经常在癌细胞中。因此，过表达表示蛋白和RNA的过表达(由于增加的转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、改变的稳定性和改变的蛋白降解)，以及由改变的蛋白运输模式(增加的核定位)引起的局部过表达，和增强的功能活性，例如，如在增加的底物酶水解中。过表达还可以是与相同类型的非癌细胞相比高50％、60％、70％、80％、90％或更多(2倍、3倍、4倍)。所述过表达可以是基于视觉上可检测的或可计量的差异，所述差异使用检测EMP2蛋白或核酸的免疫组织化学方法观察到。术语“过表达EMP2的癌症”和“与EMP2的过表达有关的癌症”可互换地表示根据以上定义过表达EMP2的癌细胞或组织。
在某些实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用免疫缀合物。所述免疫缀合物可以包括与治疗剂连接的主题抗-EMP2抗体或片段。在某些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂。所述细胞毒性剂可以选自蓖麻蛋白、蓖麻蛋白A-链、多柔比星、柔红霉素、泰素、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、思豆毒蛋白(arbrin)A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白、白树毒素丝林霉素、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、curicin、巴豆毒蛋白、卡奇霉素、肥皂草抑制剂、美坦辛类和糖皮质激素蓖麻蛋白。所述治疗剂可以是放射性同位素。所述治疗性同位素可以选自212Bi、131I、111In、90Y和186Re。
在以上实施方案中的任一个中，进一步可以施用化疗药物和/或辐射疗法。在某些实施方案中，所述患者也接受激素拮抗剂疗法。患者与抗体或抗体片段的接触，可以是通过将所述抗体静脉内地、腹膜内地、肌肉内地、肿瘤内地或真皮内地施用给所述患者。
在某些实施方案中，所述免疫缀合物包括是小分子的细胞毒性剂。毒素诸如美坦辛、美坦辛类、皂草素、白树毒素、蓖麻蛋白或卡奇霉素和它们的类似物或衍生物也是合适的。可以与抗-EMP2抗体缀合的其它细胞毒性剂包括BCNU、链佐星、长春新碱和5-氟尿嘧啶。还可以使用酶活性的毒素及其片段。可以将放射效应物部分以已知的方式掺入缀合物中(例如，双功能接头、融合蛋白)。也可以将本发明的抗体缀合至效应部分，所述效应部分是将前药转化成有活性的化学治疗剂的酶。参见，WO 88/07378；美国专利号4,975,278；和美国专利号6,949,245。所述抗体或免疫缀合物可以任选地连接至非蛋白聚合物(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)。
使用本领域众所周知的方法(参见，美国专利号6,949,245)，可以制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，使用多种双功能的蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如二(对-叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(诸如二-(对-重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲代亚苯基(tolyene)2，6-二异氰酸酯)和二-活性的氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)，可以制备缀合物。例如，如在Vitetta等人.Science 238：1098(1987)中所述，可以制备蓖麻蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的一种示例性螯合剂。参见WO94/11026。所述接头可以是“可切割的接头”，其促进细胞毒性药物在细胞中的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人.Cancer Research 52：127-131(1992))。
在其它实施方案中，与其它癌症疗法(例如，根治性前列腺切除术)、辐射疗法(外线束或近距离放射疗法)、激素疗法或化学疗法结合实现本文提供的方法。根治性前列腺切除术涉及整个前列腺和一些周围组织的除去。当认为癌症尚未扩散超出该组织时，通常使用该治疗。辐射疗法通常用于治疗仍然局限于前列腺或已经扩散至附近组织的前列腺癌。如果疾病是更晚期的，可以使用辐射来减小肿瘤的大小。激素疗法经常用于这样的患者：其前列腺癌已经扩散超出前列腺或已经复发。激素疗法的目的是降低雄性激素(雄激素)的水平并由此造成前列腺癌收缩或更缓慢地生长。
用于体内施用的抗体组合物
通过以低压冻干制剂或水溶液的形式将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编[1980])混合，制备本文提供的主题抗-EMP2抗体的制剂用于贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对接受者而言是无毒的，且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
所述制剂还可以提供另外的活性化合物，包括化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和抗激素剂。也可以将活性成分制备为持续释放制剂(例如，固体疏水聚合物(例如，聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚丙交酯)的半透性基质)。也可以将所述抗体和免疫缀合物包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊剂)中或在大乳剂中。
可以施用所述组合物用于治疗性或预防性处理。在治疗用途中，将组合物以“治疗有效剂量”施用给遭受疾病(例如，癌症)的患者。对于该应用有效的量将取决于疾病的严重程度和患者的健康的一般状态。根据要求的和患者耐受的剂量和频率，可以施用所述组合物的单次或多次施用。为了本发明的目的，“患者”或“受试者”包括人类和其它动物，特别是哺乳动物。因而，所述方法适用于人疗法和兽医应用。在优选的实施方案中，所述患者是哺乳动物，优选灵长类动物，且在最优选的实施方案中，所述患者是人。其它已知的癌症治疗可以与本发明的方法组合使用.例如，根据本发明使用的组合物也可以用于靶向细胞或使细胞对其它癌症治疗剂(诸如5FU、长春碱、放线菌素D、顺铂、甲氨蝶呤等)敏感。
组合施用预见到使用分开的制剂或单一药物制剂的共同施用和任一种次序的连续施用，其中优选地存在两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物活性的时间段。
鉴别出的间接地或直接地调节EMP2的表达和/或功能的分子和化合物可以用于治疗各自过表达EMP2的癌症。这些调节剂可以单独施用，或与常规化学疗法、放射疗法或免疫疗法以及当前开发的治疗剂组合地共同施用.
本文中的制剂还可以含有对于正在治疗的特定适应症而言必要的超过一种活性化合物，优选地具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些.例如，可能合乎需要的是，提供具有其它特异性的抗体。可替换地，或另外，所述组合物可以包含细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/或小分子拮抗剂。这样的分子适当地以对于预期目的而言有效的量存在于组合中。
也可以将所述活性成分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊剂)中或在大乳剂中。这样的技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980)。
要用于体内施用的制剂应当是无菌的，或几乎无菌的。这通过穿过无菌过滤膜过滤容易地实现。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的亚乙基-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸能够释放分子超过100天，某些水凝胶释放蛋白更短的时间段。
当被包囊的抗体在体内长时间停留时，它们可能由于在37℃暴露于水分而变性或聚集，从而导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。可以根据涉及的机制设计用于稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换实现的分子间S--S键形成，通过修饰巯基残基、从酸性溶液低压冻干、控制含水量、使用适当的添加剂和开发特定聚合物基质组合物，可以实现稳定化。
施用模态
根据已知方法，诸如作为推注的静脉内施用或通过在一段时间中的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径，将本发明的抗体和化学治疗剂施用给受试者。在某些方面，将本发明的抗体和化学治疗剂施用给具有癌症的受试者.在某些方面，将本发明的抗体和化学治疗剂施用给具有乳腺癌的受试者。在某些方面，将本发明的抗体和化学治疗剂施用给具有三重阴性的乳腺癌的受试者。所述抗体的静脉内或皮下施用是优选的。
治疗方式
在本发明的方法中，使用疗法来提供关于疾病或病症的阳性治疗应答。“阳性治疗应答”意指疾病或病症的改善，和/或与疾病或病症有关的症状的改善。例如，阳性治疗应答应当表示疾病的以下改善中的一种或多种：(1)赘生性细胞的数目的减少；(2)赘生性细胞死亡的增加；(3)赘生性细胞存活的抑制；(5)肿瘤生长的抑制(即，减慢至某种程度，优选停止)；(6)增加的患者存活率；和(7)与疾病或病症有关的一种或多种症状的某种缓解。
通过对该疾病或病症特异性的标准化应答标准，可以确定任何给定的疾病或病症中的阳性治疗应答。使用筛选技术诸如磁共振成像(MRI)扫描、x-放射摄影成像、电算断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查术和肿瘤活组织检查取样，可以针对肿瘤形态学(即，总肿瘤负荷、肿瘤大小等)的变化来评估肿瘤应答。
除了这些阳性治疗应答以外，接受疗法的受试者可能经历与疾病有关的症状的改善的有益效果。
在根据本发明的方法治疗以后，这样的应答可以持续至少4-8周，或有时6-8周。可替换地，可以将疾病的改善归类为部分应答。“部分应答”意指在没有新病灶存在下所有可测量的肿瘤负荷(即，存在于受试者中的恶性细胞的数目，或测量的肿瘤块的大小或异常的单克隆蛋白的数量)的至少约50％减少，其可以持续4-8周或6-8周。
根据本发明的治疗包括“治疗有效量”的使用的药物。“治疗有效量”表示，在必要的剂量并持续必要的时间段，有效地实现期望的治疗结果的量。
治疗有效量可以随诸如以下因素变化：疾病状态，个体的年龄、性别和重量，和药物在个体中引起期望的应答的能力。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何有毒或有害作用被治疗有益效果超过的量。
通过它的稳定疾病进展的能力也可以测量用于肿瘤治疗的“治疗有效量”。可以在动物模型系统(其预测在人肿瘤中的效力)中评价化合物的抑制癌症的能力。
可替换地，通过在熟练的从业人员已知的体外测定中检查化合物的抑制细胞生长或诱导细胞凋亡的能力，可以评价组合物的这种性质。治疗有效量的治疗性化合物可以减小肿瘤大小，或在其它方面改善受试者的症状。本领域普通技术人员能够基于诸如以下因素确定这样的量：受试者的大小，受试者的症状的严重程度，和选择的特定组合物或施用途径。
对剂量方案进行调节以提供最佳的所需应答(例如，治疗应答)。例如，可施用单次大剂量递送，可随时间施用几个分份剂量，或可根据治疗形势的急迫性所指示而按比例降低或提高所述剂量。可以以容易施用和剂量均匀的剂量单位形式配制胃肠外组合物。本文中使用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合作为单位计量用于待治疗的受试者；每个单位含有与所需药用载体相结合的预定量的活性化合物，所述预定量经计算会产生期望的治疗效果。
本发明的剂量单位形式的规范取决于且直接地依赖于：(a)活性化合物的独有特征以及要实现的特定治疗效果，和(b)配制这样的活性化合物以治疗个体的敏感性的技术上的固有限制。
在本发明中使用的抗-EMP2抗体的有效剂量和剂量方案依赖于要治疗的疾病或病症，且可以由本领域技术人员确定。
在本发明中使用的抗-EMP2抗体的治疗有效量的一种示例性的非限制性范围是约0.1-100mg/kg，诸如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，诸如约0.1-10mg/kg，例如约0.5、约诸如0.3、约1或约3mg/kg。在另一个实施方案中，以1mg/kg或更多的剂量施用抗体，诸如1-20mg/kg的剂量，例如5-20mg/kg的剂量，例如8mg/kg的剂量。
具有本领域的普通技术的医学专业人员可以容易地确定和规定要求的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以在比为了达到期望的治疗效果所需的水平更低的水平开始在药物组合物中采用的药物的剂量，并逐渐增加剂量直到实现期望的作用.
在一个实施方案中，通过以10-500mg/kg诸如200-400mg/kg的每周剂量输注来施用抗-EMP2抗体。可以重复这样的施用，例如，1-8次，诸如3-5次。通过在2-24小时诸如2-12小时的时间段内的连续输注，可以执行所述施用。
在一个实施方案中，如果需要的话，可以通过在长时间段(诸如超过24小时)中缓慢连续输注来施用抗-EMP2抗体以减小副作用，包括毒性。
在一个实施方案中，以250mg至2000mg(例如300mg、500mg、700mg、1000mg、1500mg或2000mg)的每周剂量施用抗-EMP2抗体至多8次，诸如4-6次。通过在2-24小时(诸如2-12小时)的时间段中的连续输注，可以执行所述施用。在必要时可以重复这样的方案一次或多次，例如，在6个月或12个月以后。通过在施用后如下测量血液中本发明的化合物的量可以确定或调节剂量：例如，取出生物样品，并使用靶向抗-EMP2抗体的抗原结合区域的抗-独特型抗体。
在另一个实施方案中，每周1次施用抗-EMP2抗体持续2-12周，诸如3-10周，诸如4-8周。
在一个实施方案中，通过维持疗法施用抗-EMP2抗体，例如，每周1次持续6个月或更多的时间段。
在一个实施方案中，通过特定方案施用抗-EMP2抗体，所述特定方案包括抗-EMP2抗体的一次输注，随后是与放射性同位素缀合的抗-EMP2抗体的一次输注。可以重复所述方案，例如，在7-9天以后。
作为非限制性实施例，根据本发明的治疗可以提供为每天约0.1-100mg/kg(诸如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg)的量的抗体的日剂量，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或可替换地，在治疗开始以后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或它们的任意组合，其中使用每24、12、8、6、4或2小时的单剂量或分份剂量，或它们的任意组合。
组合治疗
在某些实施方案中，所述抗-EMP2抗体分子与一种或多种另外的治疗剂(例如化学治疗剂)组合使用。损伤DNA的化学治疗剂的非限制性例子包括拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康、托泊替康、喜树碱及其类似物或代谢物和多柔比星)；拓扑异构酶II抑制剂(例如，依托泊苷、替尼泊苷和柔红霉素)；烷化剂(例如，美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、塞替派、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链佐星、氨烯咪胺、甲氨蝶呤、丝裂霉素C和环磷酰胺)；DNA嵌入剂(例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂)；DNA嵌入剂和自由基产生剂诸如博来霉素；和核苷模拟物(例如，5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、氟达拉滨、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和羟基脲)。
破坏细胞复制的化学治疗剂包括：紫杉醇、多西他赛和有关的类似物；长春新碱、长春碱和有关的类似物；沙利度胺、来那度胺和有关的类似物(例如，CC-5013和CC-4047)；蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼和吉非替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)；NF-κB抑制剂，包括IκB激酶的抑制剂；结合在癌症中过表达的蛋白的抗体和已知在癌症中上调、过表达或活化的蛋白或酶(其抑制下调细胞复制)的其它抑制剂。
在某些实施方案中，本发明的抗体可以在本文描述的或熟练的技术人员在此时或随后已知的任何化学治疗剂治疗之前、同时或之后使用。
本文描述的方法的效力
在本发明的某些方面，通过降低的肿瘤特异性的标志物的血清浓度、增加的总存活时间、减小的肿瘤大小、癌症减轻、减小的转移标志物应答和减小的化学疗法不利效应，测量抗-EMP2疗法的效力。
在本发明的某些方面，用陪伴诊断方法和产品测量效力。陪伴诊断测量可以在抗-EMP2治疗之前、过程中或之后进行。
陪伴诊断
在本发明的第二方面的一个实施方案中，将执行诊断或预后测定以确定患者的癌症是否特征在于EMP2的过表达。预见到用于确定这样的扩增/过表达的不同测定，且包括免疫组织化学、FISH和脱落抗原测定、DNA印迹法或PCR技术。此外，使用体内诊断测定，例如通过施用结合待测分子且用可检测标记物(例如放射性同位素)标记的分子(诸如抗体)并在外部扫描患者进行所述标记物的定位，可以评价EMP2过表达或扩增。在某些实施方案中，要治疗的癌症尚不是侵袭性的，但是过表达EMP2。
在其它实施方案中，本公开内容涉及陪伴诊断方法和产品。在一个实施方案中，所述陪伴诊断方法和产品可以用于监测乳腺癌、特别是三重阴性的乳腺癌的治疗，如本文中所述。在某些实施方案中，所述陪伴诊断方法和产品包括分子测定以测量蛋白、基因或特定基因突变的水平。这样的测量可以用于，例如，预测抗-EMP2疗法是否将有利于特定个体，预测抗-EMP2疗法的有效剂量，监测抗-EMP2疗法，调节抗-EMP2疗法，给个体定制抗-EMP2疗法，和跟踪癌症进展和减轻。
在某些实施方案中，所述陪伴诊断可以用于监测组合治疗。
在某些实施方案中，所述陪伴诊断可以包括本文描述的抗-EMP2抗体。
在某些实施方案中，所述陪伴诊断可以在抗-EMP2疗法之前、过程中或之后使用。
制成品
在其它实施方案中，提供了制成品，其含有可用于治疗上述障碍的物质。所述制成品包含容器和标签。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。所述容器容纳可有效地治疗所述病症的组合物，且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶子)。所述组合物中的活性剂是抗体。在容器表面上或伴随容器的标签指示，所述组合物用于治疗所选病症。所述制成品还可以包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户观点看合乎需要的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明书的包装说明书。
现在参考下述实施例描述本发明。这些实施例仅仅为了例证目的而提供，且本发明决不应当解释为限于这些实施例，而是应当解释为包括由于本文提供的教导变得明显的任意和所有变体。
尽管为了描述的目的本文已经描述了本发明的特定实施方案，但是本领域技术人员将理解，可以做出细节的众多变化而不脱离在所附权利要求中描述的发明。
实施例
实施例1：主题抗-EMP2抗体的构建
计算机算法预测PG-101的轻链CDR3中的潜在脱酰胺化位点。(图12)。为了证实序列敏感性(liability)，将PG-101使用胰蛋白酶切割，并然后进行质谱法。质谱证实，可变轻链CDR3中的预测位点是对切割敏感的。(图13)
构建了抗-EMP2抗体PG-101(被称作PG-101亲本)的两种变体(被称作“变体1”和“变体2”)来消除PG-101的可变轻链CDR3中的脱酰胺化位点。
将PG-101亲本、PG-101变体1和PG-101变体2抗体克隆进高表达哺乳动物载体系统中，并在HEK293细胞中完成三个小规模(0.03升)奖励(premium)短暂生产运行。通过蛋白A纯化来纯化抗体，并得到4.58mg PG-101亲本、3.18mg PG-101变体1和5.10mg PG-101变体2。
PG-101亲本、PG-101变体1和PG-101变体2抗体的重链和轻链的氨基酸序列显示在下面，各自的可变区具有灰色阴影：
PG-101亲本HC-hIgG1：
PG-101亲本LC-hκ：
PG-101LC变体1-hκ：
PG-101LC变体2-hκ：
下面描绘了每个重链和轻链的核苷酸序列：
PG-101亲本HC-hIgG1：
PG-101亲本LC-hκ：
PG-101LC变体1-hκ：
PG-101LC变体2-hκ：
实施例2：PG-101抗体和变体的结合特征
试验了PG-101抗体和变体的结合特征。首先，使用流式细胞计量术试验了抗-EMP2IgG1抗体在SUM149细胞上的滴定(图1，左)。使用非线性回归分析在2.6确定KD。为了证实结合的特异性和敏感性，将利妥昔单抗用作阴性对照(图1，右)。接着，试验了PG-101和变体与MDA-MB-468细胞的结合(图2)。将PG-101(在配制之前)与重新配制的PG-101、变体1和变体2对比。变体2没有达到饱和，且缓冲液改良改善了亲本抗体与EMP2的结合亲和力。
还试验了重新配制的PG-101的稳定性。(图3)。具体地，使用流式细胞计量术试验了重新配制的PG-101在SUM149细胞上的结合亲和力(图3，左)。使用非线性回归分析在2.6确定KD。另外，试验了在冷冻和融化以后PG-101在SUM149细胞上的结合。如在图3中所示，没有观察到新鲜制备的抗体(左侧)和冻融样品(右侧)之间的差异。
进行了抗-EMP2变体1和PG-101对EMP2的结合亲和力的对比.如在图4中所示，抗-EMP2变体1保持以提高的亲和力结合EMP2。使用SUM149和流式细胞计量术确定PG-101和变体1与EMP2的结合。变体1保持以提高的亲和力结合EMP2。使用流式细胞计量术确定两种抗体的结合SUM149细胞上的EMP2的能力。亲本抗体的KD是2.6μg/ml非线性回归分析，与变体1的结合存在大于2倍增加。
实施例3：PG-101相对于变体抗-EMP2抗体的体外功能活性
在三个独立实验中确定了PG-101和变体1的诱导细胞死亡的能力(图5-7)。简而言之，将MDA-MB-468细胞与不同浓度的抗-EMP2抗体一起温育5天。通过使用流式细胞计量术定量膜联蛋白V/碘化丙啶染色，测量细胞死亡(图5，左)。使用锥虫蓝排除计数温育5天以后的总细胞数目(图5，右)。使用不同浓度的抗-EMP2抗体和对照进行图5和6中的两个独立实验，而使用50μg/ml抗体和对照进行图7中的实验5天。如在这些图中所示，PG-101和变体1都能够诱导细胞死亡。
为了确定主题抗-EMP2抗体的抑制癌症干细胞的能力，将MDA-MB-468细胞与不同浓度的PG-101和变体1一起温育，并在三个独立实验中评估ALDH活性(图8和9)。在图8中，将MDA-MB-468细胞与不同浓度的PG-101和变体1一起温育。两种试剂显著地降低了ALDH活性(癌症干细胞的一种量度)。在图9中，MDA-MB-468细胞的24小时处理表明ALDH活性的下降。流式细胞计量术原始结果呈现在左侧，并以图形显示在右侧。
还使用乳腺球形成测定评估了主题抗-EMP2抗体的抑制癌症干细胞的能力(图10和11)。乳腺球形成是癌症干细胞的另一种标志。简而言之，将对照IgG、PG-101或变体1与BT474细胞一起温育2周。图10显示了温育后细胞的原始图像。图11显示了一式三份孔的乳腺球的计数。*，使用Student氏t检验，p＜0.05。如在这些研究中所示，PG-101和变体1能够减少乳腺球形成，变体1能够比PG-101更多地减少乳腺球形成。
实施例4：PG-101相对于变体抗-EMP2抗体的体内功能活性
确定了PG101和变体1(现在称作PG-201)的降低体内肿瘤负载的能力(图14和15).简而言之，在Ba1b/c裸动物中建立HEC1a子宫内膜癌异种移植物。当肿瘤接近100mm3时，将它们用10mg/kg(腹膜内，每周2次)的媒介物对照、PG-101或PG-201治疗。如在图14中所示，PG-101和PG-201都显著地减少肿瘤负载。
如在图15中所示，PG-201也在乳腺癌的鼠模型中有效地减少肿瘤负载。将4T1细胞植入Ba1b/c小鼠的乳房脂肪垫中。将小鼠每周2次用10mg/kg的PG-201或盐水治疗。如在图13中所示，与盐水对照相比，PG201减少肿瘤负载。
实施例5：PG-201可用作抗体药物缀合物
为了评估PG-101和PG-201是否可用作药物缀合物，将PG-101和PG-201还原以暴露链间二硫键，并然后使用硫接头重新桥连(图16)。然后使用点击化学将硫接头连接至DBCO-MMAE(单甲基耳他汀E)以产生抗体药物缀合物。成功的重新桥连的抗体仅表现出～160kD(天然)(PG-201，图16，右)。PG-101一致地表现出天然抗体中的轻链片段(图16，左)，从而提示抗体药物缀合物的稳定性的缺乏。
尽管为了清楚理解的目的已经通过具体说明和实施例对前述发明进行了比较详细的描述，但是本领域普通技术人员考虑到本发明的教导会容易地明白，可以对其做出某些变化和改进，而不偏离所附权利要求书的精神或范围。

Claims (43)

1.一种分离的结合上皮膜蛋白2(EMP2)的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR)，且其中所述轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。
2.一种分离的结合上皮膜蛋白2(EMP2)的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：3具有90％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有90％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含根据SEQID NO：6的氨基酸序列，所述轻链包含根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
5.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含根据SEQID NO：6的氨基酸序列，所述轻链包含根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、人源化的单克隆抗体、人抗体、双体、微体或三抗体、嵌合抗体或重组抗体。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体呈scFv、微体、双体或三抗体形式。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合至细胞毒性剂或标记。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1-9中的抗体中的任一种和生理上可接受的载体。
11.一种治疗患者中的癌症或降低其复发率的方法，所述方法包括：
给所述患者施用有效量的包含重链可变区和轻链可变区的抗-EMP2抗体，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR)，且其中所述轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO：3具有90％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有90％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链包含根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链包含根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述方法包括在施用步骤之前检测患者中的癌症干细胞的步骤，所述癌症干细胞表达EMP2和一种或多种选自CD44、CD133ABCG2和ALDH的标志物。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述抗体还包含生理学上可接受的载体或药学上可接受的载体。
19.根据权利要求11-18中任一项所述的方法，所述方法还包括给所述患者施用有效量的至少一种另外的抗癌剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种另外的抗癌剂选自：基于铂的化疗药物、紫杉烷、酪氨酸激酶抑制剂、抗-EGFR抗体、抗-ErbB2抗体和它们的组合。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种另外的抗癌剂包含EGFR抑制剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述EGFR抑制剂包含抗-EGFR抗体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体包含西妥昔单抗。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体选自马妥珠单抗、帕木单抗和尼妥珠单抗。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是EGFR信号传递的小分子抑制剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述EGFR信号传递的小分子抑制剂选自吉非替尼、拉帕替尼、卡纽替尼、培利替尼、厄洛替尼HCL、PKI-166、PD158780和AG 1478。
27.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种另外的抗癌剂包含VEGF抑制剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述VEGF抑制剂包含抗-VEGF抗体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。
30.根据权利要求12-29中任一项所述的方法，其中给所述抗体缀合效应部分。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述效应部分是毒性剂。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述毒性剂是诸如蓖麻蛋白。
33.根据权利要求11-32中任一项所述的方法，其中所述治疗包括阻断所述癌症的侵袭力。
34.根据权利要求11-33中任一项所述的方法，其中所述抗体用在所述癌症的疫苗疗法中。
35.根据权利要求11-34中任一项所述的方法，其中所述患者是人或哺乳动物。
36.根据权利要求11-35中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
37.根据权利要求11-35中任一项所述的方法，其中所述癌症是选自脑癌、结肠癌、黑素瘤、白血病(例如，AML)、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌的癌症。
38.根据权利要求11-37中任一项所述的方法，所述方法还包括陪伴诊断。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述陪伴诊断包含抗-EMP2抗体。
40.一种检测癌症干细胞的方法，所述方法包括：
得到从具有或疑似具有癌症的人衍生出的生物样品；和
检测EMP2和一种或多种选自CD44、CD133、ABCG2和ALDH的标志物的表达，
其中使用包含重链可变区和轻链可变区的抗-EMP2抗体执行所述检测，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR)，且其中所述轻链可变区包含三个轻链可变区(LCDR)，其中：HCDR1的序列是SEQ ID NO：11，HCDR2的序列是SEQ ID NO：12，HCDR3的序列是SEQ ID NO：13，LCDR1的序列是SEQ ID NO：14，LCDR2的序列是SEQ ID NO：15，且LCDR3的序列是SEQ ID NO：16。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述人具有或疑似具有乳腺癌。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述人具有或疑似具有三重阴性的乳腺癌。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述人具有或疑似具有子宫内膜癌。
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