CN108926707A

CN108926707A - Pf4的抗rsv应用

Info

Publication number: CN108926707A
Application number: CN201710384729.7A
Authority: CN
Inventors: 王健伟; 任丽丽; 韩子泊
Original assignee: National Institute of Pathogen Biology CAMS and PUMC
Current assignee: National Institute of Pathogen Biology CAMS and PUMC
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2037-05-26
Also published as: CN108926707B

Abstract

PF4的抗RSV应用，本发明公开了血小板因子4能通过抑制宿主体内呼吸道合胞病毒复制减轻病毒感染症状，是有效的抗呼吸道合胞病毒感染干预措施。本发明提供了血小板因子4在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途，还提供了适于所述药物的给药途径、剂型以及所述药物与其他药物的联合用药等；此外还提供了用血小板因子4抑制体外细胞中的呼吸道合胞病毒的非治疗目的的方法。

Description

PF4的抗RSV应用

技术领域

本发明涉及呼吸道合胞病毒，特别是可用于该病毒所致疾病和/或症状的预防和/或治疗的抗病毒干预措施。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)属于副粘病毒科肺病毒亚科肺病毒属，为有包膜单链负链RNA病毒，基因组共编码11种病毒蛋白，从3'至5'端依次为非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)、核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、小疏水蛋白(SH)、糖蛋白(G)、融合蛋白(F)、M2ORF1/ORF2蛋白(M2-1/M2-2)和大蛋白(L)。RSV呈世界性分布，仅有一个血清型，可根据抗原反应性分为A、B两个亚组，A亚组在全球多数地区处于优势流行(Griffiths C,Drews S J,Marchant D J.Respiratory Syncytial Virus:Infection,Detection,and New Options for Prevention and Treatment[J].ClinMicrobiol Rev,2017,30(1):277-319)。RSV经呼吸道传播，是导致幼儿急性下呼吸道感染的最重要的病原体(Hall C B,Weinberg G A,Iwane M K,et al.The burden ofrespiratory syncytial virus infection in young children[J].N Engl J Med,2009,360(6):588-98)，可导致包括毛细支气管炎和肺炎在内的严重下呼吸道疾病。研究显示，因呼吸道疾病住院治疗的婴幼儿中，毛细支气管炎病例中RSV检出率可达43％，肺炎病例中检出率为25％(Kim H W,Arrobio J O,Brandt C D,et al.Epidemiology of respiratorysyncytial virus infection in Washington,D.C.I.Importance of the virus indifferent respiratory tract disease syndromes and temporal distribution ofinfection[J].Am J Epidemiol,1973,98(3):216-225)。儿童是RSV的主要易感人群，至2周岁时超过95％的儿童已感染过RSV。相比于其他常见呼吸道病毒，如流感病毒和副流感病毒，RSV更易引发下呼吸道感染(Fisher R G,Gruber W C,Edwards K M,et al.Twentyyears of outpatient respiratory syncytial virus infection:a framework forvaccine efficacy trials[J].Pediatrics,1997,99(2):E7)，而急性下呼吸道感染是世界范围内导致儿童死亡的主要原因之一(Nair H,Nokes D J,Gessner B D,et al.Globalburden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytialvirus in young children:a systematic review and meta-analysis[J].Lancet,2010,375(9725):1545-1555)。一项荟萃分析显示，2005年全球约有6.6～19.9万5岁以下儿童死于RSV感染及相关并发症，其中99％发生在发展中国家(Nair H,Nokes D J,Gessner B D,et al.Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratorysyncytial virus in young children:a systematic review and meta-analysis[J].Lancet,2010,375(9725):1545-1555)；另有研究报导2010年全球死于RSV感染的5岁以下儿童人数为23.4万，全年龄组死亡人数为25.35万(Lozano R,Naghavi M,Foreman K,etal.Global and regional mortality from 235causes of death for 20age groups in1990and 2010:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study2010[J].Lancet,2012,380(9859):2095-128)。除儿童外，RSV也常感染老人及免疫力低下人群。

尽管RSV在世界范围内威胁人类健康，但目前针对RSV感染的预防和治疗措施却非常有限。但截止目前为止，尚无已上市的商品化疫苗可用于RSV的主动预防。近年RSV F蛋白特异性单抗(帕利珠)已商业化并用于高危人群的被动免疫，但是由于费用昂贵和抗性毒株的出现(Adams O,Bonzel L,Kovacevic A,et al.Palivizumab-resistant humanrespiratory syncytial virus infection in infancy[J].Clin Infect Dis,2010,51(2):185-188)，导致其临床应用受限。此外，对RSV疾病负担的研究显示，大部分患儿在感染RSV前完全健康，提示现有的针对高危人群的被动免疫策略在减轻疾病负担方面作用有限(Hall C B,Weinberg G A,Iwane M K,et al.The burden of respiratory syncytialvirus infection in young children[J].N Engl J Med,2009,360(6):588-598)。目前尚无高效的抗病毒药物可用于治疗RSV感染，临床上对于RSV感染的治疗主要以支持治疗为主，其他可用的治疗药物如利巴韦林、支气管扩张剂和糖皮质激素等，其有效性均缺乏可靠的循证医学证据；在研的RSV抗病毒药物尚无任何一种进入三期临床试验。

血小板因子4(Platelet Factor 4，PF4)属于CXC趋化因子家族，又被称为CXCL4，是一种多功能的分泌型细胞因子。成熟的人PF4蛋白质包含70个氨基酸，单体分子量7.8kDa，在UniProtKB数据库中的登录号为P02776(http://www.uniprot.org/uniprot/P02776，PLF4_HUMAN，第32位谷氨酸-第101位丝氨酸)。PF4的生理功能包括促进凝血与创伤愈合、调节造血功能、免疫调节、抗血管新生等多种生理功能(Vandercappellen J,VanDamme J,Struyf S.The role of the CXC chemokines platelet factor-4(CXCL4/PF-4)and its variant(CXCL4L1/PF-4var)in inflammation,angiogenesis and cancer[J].Cytokine Growth Factor Rev,2011,22(1):1-18)。已有研究者将其用于肿瘤、移植排斥反应和造血功能障碍的治疗，并在动物模型中获得了较好的效果。目前对PF4抗病毒功能的研究很少。

发明内容

发明人发现，血小板因子4可以抑制呼吸道合胞病毒复制，可作为有效的抗呼吸道合胞病毒感染的干预措施。

在体外实验中，发明人利用重组人血小板因子4处理人喉癌细胞(HEp-2细胞)，呼吸道合胞病毒感染细胞后使用免疫荧光和蛋白质印记(western blot)进行检测，发现呼吸道合胞病毒复制受到抑制，且呼吸道合胞病毒感染率与血小板因子4浓度呈半对数负相关。在体内实验中，发明人利用呼吸道合胞病毒小鼠感染模型对血小板因子4抗呼吸道合胞病毒的功能进行验证，发现经鼻给予血小板因子4能显著降低肺部呼吸道合胞病毒载量，减轻肺部病理损伤，下调呼吸道内白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等炎性细胞因子的水平。这些发现表明，血小板因子4能通过抑制宿主体内病毒复制减轻呼吸道合胞病毒感染症状，是有效的抗呼吸道合胞病毒感染干预措施。

本发明提供了血小板因子4在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途。此外，本发明还提供了适于所述药物的给药途径、剂型以及所述药物与其他药物的联合用药等。

本发明还提供了用血小板因子4抑制体外细胞中的呼吸道合胞病毒的非治疗目的的方法。

附图说明

图1重组PF4蛋白抑制RSV复制

使用0、125、250、500、1000、2000nM重组PF4处理HEp-2细胞4h，RSV感染后24h：a.免疫荧光检测细胞RSV感染率(图中椭圆形的浅灰色小点示DAPI染色的细胞核，不规则形的浅灰色斑块示被RSV感染的细胞，可见细胞的RSV感染率随着PF4浓度的增加而降低)；b.分析PF4浓度与细胞RSV感染率的相关性(半对数负相关，R²＝0.92)；c.蛋白质印记检测细胞内RSV N蛋白、G蛋白表达量。

图2经鼻给予PF4降低小鼠RSV感染后肺部病毒载量

将SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠分为3组，RSV组和RSV+PF4组小鼠分别滴鼻给予DPBS或1.8μg PF4，6h后滴鼻接种1×10⁶PFU RSV A2，此时对照组小鼠滴鼻接种DPBS；感染后4d处死小鼠，取生物材料进行检测。a.RT-PCR检测肺组织RSV N基因拷贝数。RSV+PF4组小鼠肺部RSV N基因拷贝数显著低于RSV组(p＝0.046)。b.小鼠肺部RSV免疫组织化学(山羊抗RSV抗体标记RSV，经辣根过氧化物酶标记二抗结合，显色后呈褐色)，可见RSV+PF4组小鼠肺组织中RSV信号的分布密度和信号强度明显低于RSV组。

图3经鼻给予PF4减轻小鼠RSV感染后肺部炎症

将SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠分为3组，RSV组和RSV+PF4组小鼠分别滴鼻给予DPBS或1.8μg PF4，6h后滴鼻接种1×10⁶PFU RSV A2，此时对照组小鼠滴鼻接种DPBS；感染后4d处死小鼠，取生物材料进行检测。a.小鼠肺部病理改变(肺组织切片HE染色)。未感染RSV的对照组小鼠肺泡间隔狭窄、结构清晰；RSV组小鼠肺泡间隔严重增宽，部分肺泡结构已难以分辨，支气管周出现大量炎性细胞浸润(实心三角标出)，局部可见淋巴细胞渗出(空心三角标出)；RSV+PF4组小鼠肺泡间隔轻度增宽，肺泡结构较为完整，支气管周部分位置可见少量炎性细胞浸润(实心三角标出)，未见淋巴细胞渗出。b.小鼠BALF中炎性细胞因子检测。RSV+PF4组小鼠BALF中IL-6和MCP-1浓度低于RSV组。

序列表说明

SEQ ID NO:1示出了人血小板因子4的蛋白质序列；

SEQ ID NO:2示出了用于检测RSV N的正向引物的序列；

SEQ ID NO:3示出了用于检测RSV N的反向引物的序列；

SEQ ID NO:4示出了用于检测RSV N的荧光探针的序列。

具体实施方式

本发明的第一个方面提供了血小板因子4在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述血小板因子4是从哺乳动物血小板中纯化的天然血小板因子4。

在一个优选的实施方案中，所述血小板因子4是从人血小板中纯化的天然人血小板因子4。

可通过本领域已知的方法纯化人血小板因子4，例如可参见Handin,et al.,J.Biol.Chem.,251:4273-4282(1976)；或可商购获得纯化的人血小板因子4，例如可商购自美国的Sigma公司。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述血小板因子4是重组血小板因子4。

在一个优选的实施方案中，所述血小板因子4是重组人血小板因子4。

Deuel,TF等人于1977年公开了人血小板因子4的氨基酸序列(Deuel,TF et al."Amino acid sequence of human platelet factor 4"Proc.Natl.Acad.Sci.USABiochemistry,74(6),2256-2258,1977)。此后，科学家们陆续鉴定并测得不同来源的血小板因子4的序列。

人血小板因子4的蛋白质序列如SEQ ID NO:1所示(EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATLKNGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES)。本领域技术人员可根据已知的方法克隆、表达及分离重组人血小板因子4，例如可参见Myers etal.,Protein Ex.Purif.,2:136-143(1991)；或可商购获得重组人血小板因子4，例如可商购自中国的上海吉泰依科赛科技有限公司(ExCell Bio)。

本领域技术人员能够理解，除人血小板因子4外，本发明还涵盖其他哺乳动物的天然血小板因子4或重组血小板因子4。

本领域技术人员知晓，对于结构和功能已知的蛋白质，可通过改变氨基酸序列来构建保留原功能或使原功能提高或降低的蛋白质。因此，本发明还涵盖血小板因子4的变体在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途，所述变体相对于血小板因子4在抗呼吸道合胞病毒方面显示出相同、升高或降低的作用。例如，可通过以下方法构建抗呼吸道合胞病毒的血小板因子4变体：获得现有技术中已知的血小板因子4变体(如PCT国际公开WO 94/07524所记载的)、或通过随机突变或定点突变(例如将血小板因子4的氨基酸序列上的一个或多个特定氨基酸的密码子替换为编码不同氨基酸的序列)获得血小板因子4的变体，然后检测所获得的变体是否具有抗呼吸道合胞病毒的作用，检测方法可参见本文实施例1-3中所述的方法。

预期本发明涵盖的血小板因子4的变体可获得自一个或多个保守氨基酸的替换，只要该替换所产生的血小板因子4变体仍然具有抗呼吸道合胞病毒的作用。在本文中，保守氨基酸的替换是指同类氨基酸之间的替换。氨基酸可分为以下类型：碱性、疏水性、酸性、极性、酰胺。如果将一个或多个氨基酸替换为与其属于同一类的氨基酸，并且该替换产生的血小板因子4变体仍然具有抗呼吸道合胞病毒的作用，则该替换产生的血小板因子4变体落入本发明的范围内。表1举例说明了属于同一类氨基酸的实例：

表1

此外，本发明还涵盖血小板因子4的多肽片段、或血小板因子4的变体的多肽片段，所述多肽片段是血小板因子4的一部分或血小板因子4变体的一部分，并且相对于血小板因子4在抗呼吸道合胞病毒方面显示出相同、升高或降低的作用。例如，可通过以下方法构建具有抗呼吸道合胞病毒作用的多肽片段：获得现有技术中已知的血小板因子4或其变体的多肽片段(如Maione et al.,Science,247:77-79(1990)所记载的)、或通过蛋白质降解(化学法、酶法)获得血小板因子4或其变体的多肽片段，然后检测所获得的多肽片段是否具有抗呼吸道合胞病毒的作用，检测方法可参见本文实施例1-3中所述的方法。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述药物用于在哺乳动物或人中预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述药物用于在呼吸道合胞病毒的高风险感染者中预防呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状，其中所述呼吸道合胞病毒的高风险感染者包括：60岁以上的老人、5岁以下的儿童、早产婴儿、患有慢性肺病的婴儿、患有先天性心脏病的婴儿、患有免疫缺陷病的婴儿、患过充血性心力衰竭的成年人、患过慢性阻塞性肺病的成年人、患过肺炎的成年人、患过哮喘的成年人、接受造血干细胞的患者、接受肺移植的患者、白血病患者。

在本文中，“预防”是指减少受试者患上疾病的风险或者延迟受试者患病或延迟症状出现时间的预防性干预。

在本文中，“治疗”是指改善受试者的疾病或症状的发展状态的治疗性干预，包括使受试者的疾病或症状消退，减缓受试者疾病或症状的进程，减轻受试者疾病或症状的严重程度，或减少导致疾病或症状的细胞、生理或生物化学病因或机理。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述疾病包括急性上呼吸道感染、急性下呼吸道感染、毛细支气管炎、肺炎、气管支气管炎、中耳炎。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述症状包括鼻塞、流鼻涕、咳嗽、哮喘、打喷嚏、啰音、37.3-38.3℃低烧、食欲不振、发绀、呼吸急促、呼吸困难、窒息、支气管炎、肺炎。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

在本发明中，“药学上可接受的辅料”包括所有适于在制药中应用的溶剂、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、杀细菌剂、杀真菌剂及其他本领域已知的辅料。这些辅料应相对无毒和无害，任何由辅料引起的副作用都不会削弱活性成分的有益作用。

血小板因子4可以经任何途径给药，例如，合适的给药途径包括呼吸道、肠胃外(例如静脉内、皮内或皮下)、口服、局部、经眼、经口、经鼻、舌下、经粘膜或直肠给药。

本领域技术人员能够根据所期望的给药途径选择合适的辅料，将血小板因子4配制为合适的剂型，例如可参见Remington's Pharmaceutical Sciences,E.W.Martin,MackPublishing,Easton,PA,19^th Edition (1995)；A.R.Gennaro,Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins,21st Edition,2005；和L.V.Allen,Jr.et al.,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,8th Edition,Philadelphia,PA:Lippincott,Williams&Wilkins,2004。

对于血小板因子4，合适的剂型包括：注射用的无菌水溶液、分散剂，用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末，片剂，丸剂，锭剂，乳剂，胶囊剂，软膏剂，凝胶，透皮贴剂，吸入剂，滴鼻剂，栓剂以及速释、缓释及定时释放的剂型。

在一个优选的实施方案中，将血小板因子4配制为经口或经鼻给药的干粉吸入剂、喷雾剂或气雾剂。

所述干粉吸入剂可由单一的血小板因子4配制，或可包含对于吸入来说可接受的载体。载体的实例包括但不限于：无机盐，例如氯化钠或碳酸钙；有机盐，例如酒石酸钠或乳酸钙；有机化合物，例如尿素；单糖，例如乳糖、阿拉伯糖或右旋糖；二糖，例如麦芽糖或蔗糖；多糖，例如淀粉和葡聚糖。

除载体外，所述干粉吸入剂还可包含的其它成分包括但不限于赋形剂(例如滑石、乳糖)，调味剂(例如糖精)，抗静电剂(例如泊洛沙姆)；还可包含其它药物成分，如支气管扩张剂(例如异丙托溴铵、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇)。

可通过专用的粉末吸入装置递送所述干粉吸入剂。可将干粉吸入剂填充于硬胶囊或泡罩包装内，胶囊或泡罩被吸入器或吹入器裂开或钻开，使得在经口或经鼻吸气时吸入干粉吸入剂。

所述喷雾剂可以是溶液、悬浮液、乳液、凝胶、微球、脂质体等形式。喷雾剂可包含的成分包括但不限于溶剂(例如乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油)，表面活性剂(例如吐温类、卵磷脂)，活性保护剂(例如人血清白蛋白、氨基酸、多元醇、环糊精、卵磷脂)，渗透压调节剂(例如人血清白蛋白、氯化钠、甘露醇、葡萄糖)，防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲醇、苯酚、甲酚、尼泊金酯)，吸附抑制剂(例如人血清白蛋白、表面活性剂如吐温类)，pH稳定调节剂(例如杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、磷酸盐缓冲液、枸缘酸盐缓冲液、抗坏血酸缓冲液)；还可包含其它药物成分，如支气管扩张剂(例如异丙托溴铵、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇)。

可将所述喷雾剂填充于专用的装置(例如喷射雾化器、超声雾化器和振动筛雾化器)中，使用时借助手动泵的压力、高压气体或超声振动等使喷雾剂以雾状物释出，实现经口或经鼻给药。

所述气雾剂可以是溶液、悬浮液、乳液、凝胶、微球、脂质体等形式。除可任选地包含上述用于喷雾剂的成分外，气雾剂还包含合适的推进剂。推进剂的实例包括但不限于：氟碳化物或含氢的氯氟碳化物或它们的混合物，尤其是氢氟烷，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，尤其是1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1,2,3,3,3-七氟正丙烷或它们的混合物；合适的气体，例如二氧化碳。

可将所述气雾剂装在具有特制阀门系统的耐压严封容器(例如加压定量吸入器)中，借助推进剂的压力使吸入剂以雾状物喷入口或鼻内。

在一个优选的实施方案中，将血小板因子4配制为经鼻给药的滴鼻剂。

所述滴鼻剂可以是溶液、悬浮液、乳液、凝胶、微球、脂质体等形式。优选使用合适的缓冲液(例如杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、枸缘酸盐缓冲液、抗坏血酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液)或生理盐水来制备所述滴鼻剂。此外，滴鼻剂还可包含的其它成分包括但不限于防腐剂(例如苯扎氯铵、氯丁醇、硫柳汞、苯基醋酸汞、苯基硝酸汞)，表面活性剂(例如吐温80、卵磷脂)，张力调节剂(例如氯化钠、氯化钾、甘露醇、甘油)，抗氧化剂(例如偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯)，吸收促进剂(例如环糊精、牛磺酸二氢梭链孢酸盐)，螯合剂(例如依地酸二钠)；还可包含其它药物成分，如支气管扩张剂(例如异丙托溴铵、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇)。

可将所述滴鼻剂装入常规的滴剂瓶中，通过挤压滴剂瓶将滴鼻剂滴入鼻内，或可通过鼻泵给予滴鼻剂。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述药物与其他药物联合给药。

所述联合不引起不可接受的副作用。

在一个优选的实施方案中，所述其他药物包括其他对肺病毒亚科病毒感染、特别是呼吸道合胞病毒感染有活性的药物。

在一个更优选的实施方案中，所述其他药物包括：利巴韦林、帕丽珠单抗、莫维珠单抗、RSV-IGIV、MEDI-557、RSV604、MDT-637、BMS-433771、ALN-RSV01、ALX-0171以及他们的混合物。

在一个优选的实施方案中，所述其他药物包括其他常用于治疗呼吸道症状和呼吸道感染后遗症的药物。

在一个更优选的实施方案中，所述其他药物包括支气管扩张剂和糖皮质激素。

可与本发明所述药物联合给药的支气管扩张剂包括β2-肾上腺素受体激动剂支气管扩张剂例如福莫特罗、沙丁胺醇或沙美特罗，抗胆碱能剂例如毒蕈碱性受体(特别是M3亚型)的拮抗剂，l-{4-羟基-l-[3,3,3-三-(4-氟-苯基)-丙酰]-吡咯烷-2-羰基}-吡咯烷-2-羧酸(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-酰胺，3-[3-(2-二乙基氨基-乙酰氧基)-2-苯基-丙酰氧基]-8-异丙基-8-甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷(异丙托铵-N,N-甘氨酸二乙酯)，1-环己基-3,4-二氢-1H-异喹啉-2-羧酸1-氮杂-双环[2.2.2]辛-3-基酯(索利那新)；2-羟甲基-4-甲烷亚硫酰基-2-苯基-丁酸1-氮杂-双环[2.2.2]辛-3-基酯(瑞伐托酯)，2-{1-[2-(2,3-二氢-苯并呋喃-5-基)-乙基]-吡咯烷-3-基}-2,2-二苯基-乙酰胺(达非那新)，4-环己亚胺-1-基-2,2-二苯基-丁酰胺(布卓(Buzepide))，7-[3-(2-二乙基氨基-乙酰氧基)-2-苯基-丙酰氧基]-9-乙基-9-甲基-3-氧杂-9-氮阳离子-三环[3.3.1.02,4]壬烧(甲溴氧托鞍-N,N-甘氨酸二乙酯)，7-[2-(2-二乙基氨基-乙酰氧基)-2,2-二-硫代苯-2-基-乙酰氧基]-9,9-二甲基-3-氧杂-9-氮阳离子-三环[3.3.1.02,4]壬烷(托溴铵-N,N-甘氨酸二乙酯)，二甲基氨基-乙酸2-(3-二异丙基氨基-1-苯基-丙基)-4-甲基-苯基酯(托特罗定-N,N-甘氨酸二甲酯)，3-[4,4-双-(4-氟-苯基)-2-氧代-咪唑烷-1-基]-1-甲基-1-(2-氧代-2-吡啶-2-基-乙基)-吡咯烷鎓，1-[1-(3-氟-苄基)-哌啶-4-基]-4,4-双-(4-氟-苯基)-咪唑烷-2-酮，1-环辛基-3-(3-甲氧基-1-氮杂-双环[2.2.2]辛-3-基)-l-苯基-丙-2-炔-l-醇，3-[2-(2-二乙基氨基-乙酰氧基)-2,2-二-硫代苯-2-基-乙酰氧基]-l-(3-苯氧基-丙基)-1-氮阳离子-双环[2.2.2]辛烷(阿地溴铵-N,N-甘氨酸二乙酯)或(2-二乙基氨基-乙酰氧基)-二-硫代苯-2-基-乙酸1-甲基-l-(2-苯氧基-乙基)-哌啶-4-基酯。

可与本发明所述药物联合给药的糖皮质激素类药物包括地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟米龙、醋酸氟米龙、氯替泼诺、氯替泼诺碳酸乙酯、氢化可的松、泼尼松龙、氟氢可的松、曲安西龙、曲安奈德、倍他米松、倍氯米松二丙酸酯、甲泼尼龙、氟新诺龙、氟新诺龙丙酮、氟尼缩松、氟可丁-21-丁基化物、氟米松、氟米松新戊酸酯、布地奈德、卤倍他索丙酸酯、糠酸莫米松、丙酸氟替卡松、环索奈德，或他们的药学上可接受的盐。

此外，还可与本发明所述的药物联合给药的药物有通过抗炎级联机制起作用的抗炎信号转导调控剂，如磷酸二酯酶抑制剂(例如，PDE-4、PDE-5或PDE-7特异性抑制剂)、转录因子抑制剂(例如，通过IKK抑制阻断NFκB)或激酶抑制剂(例如，阻断P38MAP、JNK、PI3K、EGFR、Syk)，具体地，这类调控剂包括:5-(2,4-二氟-苯氧基)-1-异丁基-1H-吲唑-6-羧酸(2-二甲基氨基-乙基)-酰胺(P38MAP激酶抑制剂ARRY-797)、3-环丙基甲氧基-N-(3,5-二氯-吡啶-4-基)-4-二氟甲氧基-苯甲酰胺(PDE-4抑制剂罗氟斯特)、4-[2-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-苯基-乙基]-吡啶(PDE-4抑制剂CDP-840)、N-(3,5-二氯-4-吡啶基)-4-(二氟甲氧基)-8-[(甲基磺酰)氨基]-1-二苯并呋喃甲酰胺(PDE-4抑制剂Oglemilast)、N-(3,5-二氯-吡啶-4-基)-2-[l-(4-氟苄基)-5-羟基-1H-吲哚-3-基]-2-氧代-乙酰胺(PDE-4抑制剂AWD 12-281)、8-甲氧基-2-三氟甲基-喹啉-5-羧酸(3,5-二氯-1-氧-吡啶-4-基)-酰胺(PDE-4抑制剂Sch351591)、4-[5-(4-氟苯基)-2-(4-甲烷亚硫酰基-苯基)-1H-咪唑-4-基]-吡啶(P38抑制剂SB-203850)、4-[4-(4-氟-苯基)-1-(3-苯基-丙基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基]-丁-3-炔-1-醇(P38抑制剂RWJ-67657)、4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基-苯基)-环己烷羧酸2-二乙基氨基-乙酯(西洛司特的2-二乙基-乙基酯前药，PDE-4抑制剂)；(3-氯-4-氟苯基)-[7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺(吉非替尼，EGFR抑制剂)；和4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(伊马替尼，EGFR抑制剂)。

此外，还可与本发明所述的药物联合给药的药物有用于治疗呼吸道感染和症状的粘液溶解剂、祛痰剂等，例如氨溴索、愈创木酚甘油醚。

此外，还可与本发明所述的药物联合给药的药物有用于改善肺病患者的小气道的即时和长期清除的雾化高渗盐水，例如约3％的雾化高渗盐水。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述联合给药可以同时给药或相继给药。

本发明所述药物单独给药或与其他药物联合给药时所需的给药剂量、给药顺序和给药次数可以由本领域技术人员通过常规的治疗试验来确定。

预期本发明所述药物与其他药物联合给药可产生“协同效应”，即当联合给药时获得的功效大于各自单独给药时获得的功效之和。

本发明的第二个方面提供了用血小板因子4抑制体外细胞中的呼吸道合胞病毒的非治疗目的的方法，所述方法包括：在呼吸道合胞病毒与细胞接触之前和/或之后，使血小板因子4与细胞接触；优选地，血小板因子4的浓度为5-5000nM；更优选地，血小板因子4的浓度为125-2000nM。

在本文中，所述抑制包括抑制呼吸道合胞病毒的感染或复制。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述细胞是人的细胞。

在一个优选的实施方案中，所述细胞是人喉癌细胞HEp-2。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验方法的，按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook,et al.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。

实施例1.PF4抑制RSV在HEp-2细胞中的感染与复制

1.1实验方案

接种HEp-2细胞(购自ATCC，编号：ATCC CCL-23，细胞浓度1.8×10⁵个/ml)于96孔和24孔细胞板，置于37℃下5％CO₂培养16h，使用溶解于Opti-MEM培养基(Gibco公司产品，货号：31985-070)浓度为0、125、250、500、1000、2000nM的重组人PF4蛋白(ExCell Bio公司，货号：CB055-492)处理HEp-2细胞，置于37℃下5％CO₂孵育2h后以MOI(multiplicity ofinfection，感染复数)＝1(96孔板)或2(24孔板)的RSV A2株病毒(购自ATCC，编号：ATCCVR-1540)与PF4混合物继续孵育2h，混合液中PF4终浓度同前；更换为维持液(含2％胎牛血清和1％青链霉素的Opti-MEM培养基，其中胎牛血清购自Hyclone公司，货号：SH30396.03；青链霉素购自Gibco公司，货号：15140-122；Opti-MEM培养基购自Gibco公司，货号：31985-070)后继续培养至感染后24h。

1.2RSV感染率检测

96孔板吸去培养基，PBS洗板1次，4％多聚甲醛固定细胞，PBS洗板1次，1:1000稀释的DAPI染料(Invitrogen公司产品，货号：D1306)染核30min，PBS洗板1次，穿膜缓冲液(含0.5％Triton X-100的PBS)处理15min，PBS洗板2～3次，封闭缓冲液(含5％牛血清白蛋白的PBS)处理90min，1:1000稀释的小鼠抗RSV N蛋白抗体(Merck Millipore公司产品，货号：MAB858-3)处理2h后4℃静置过夜。PBS洗板3～5次，1:500稀释的Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG抗体(中杉金桥生物技术公司产品，货号：ZF-0512)处理1h，PBST洗板4～5次，PBS洗板1～2次。Operetta高内涵显微成像设备(PerkinElmer公司)扫描细胞图像，被RSV感染的细胞会发出绿色荧光信号。在图1a中，DAPI染色的细胞核显示为椭圆形的浅灰色小点，被RSV感染的细胞显示为不规则形的浅灰色斑块。从图1a可看出，随着PF4浓度的增加，被RSV感染的细胞逐渐减少。用配套的计算机软件分析细胞图像，通过细胞核DAPI信号识别细胞位置，并计算各细胞的绿色荧光信号强度，高于背景信号1倍以上的为RSV阳性细胞。计算细胞RSV感染率：感染率＝RSV阳性细胞数/细胞总数×100％，结果如图1b所示，随着PF4浓度的增加，细胞的RSV感染率逐渐下降，并与PF4浓度的对数呈线性负相关(R²＝0.92)。

1.3RSV蛋白表达检测

24孔板弃去培养基，DPBS(Gibco公司产品，货号：14190-144)洗板1次，加入1×被动裂解液(Promega公司产品，货号：E194A)，置于摇床上室温裂解细胞30～45min。收集液体，10000g 4℃离心10min，各样品分别取适当体积的上清，使其总蛋白质含量均为50μg；加入1/5体积的6×SDS加样缓冲液(含300mM Tris-HCl(pH 6.8)、600mM二硫苏糖醇、12％SDS、0.6％溴酚蓝和60％甘油的超纯水溶液)，混匀后沸水浴5～10min使蛋白变性，进行电泳(SDS-PAGE)。冰浴下80V恒压转膜2h，将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素薄膜(Pall公司产品，货号：S80209)，将膜置于5％脱脂牛奶中，封闭2h。使用1:2000稀释的小鼠抗RSV N蛋白抗体(Abcam公司产品，货号：ab94806)和1:500稀释的小鼠抗RSV G蛋白抗体(Abcam公司产品，货号：ab94966)4℃孵育过夜，PBST洗膜，以IRDye 800标记山羊抗小鼠IgG抗体(Li-Cor公司产品，货号：926-32210)避光孵育30min，PBST洗膜。用GAPDH作内参，以1:10000稀释的兔抗GAPDH抗体(Sigma-Aldrich公司产品，货号：G9545)避光孵育1h，PBST洗膜，再以IRDye680标记山羊抗兔IgG抗体(Li-Cor公司产品，货号：925-68021)避光孵育30min，PBST洗膜。去离子水洗膜后，使用Odyssey近红外成像系统(Li-Cor公司)扫描成像。结果如图1c所示，随着PF4浓度的增加，细胞内RSV N蛋白、G蛋白表达量逐渐下降，两者存在剂量反应关系。

实施例2.PF4降低小鼠体内RSV感染后的肺部病毒载量与肺部炎症水平

2.1实验方案

SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠(北京华阜康生物科技有限公司)经检疫合格后进入BSL-2级环境饲养，每笼4～6只，食物与饮水供应充足；实验开始前小鼠需饲养3d以上，使其充分适应环境。将小鼠随机分为3组，RSV+PF4组8只小鼠，RSV组8只小鼠，对照组5只小鼠。RSV+PF4组和RSV组小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠125μl/只，待小鼠麻醉后，RSV+PF4组每只小鼠滴鼻给予溶解于DPBS的重组人PF4蛋白1.8μg(约0.1mg PF4/kg体重)，溶液体积18μl；RSV组每只小鼠滴鼻给予18μl DPBS。6h后所有小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠125μl/只，待小鼠麻醉后，RSV+PF4组和RSV组每只小鼠滴鼻接种1×10⁶PFU RSV A2株病毒，接种时使用DPBS稀释至20μl；对照组每只小鼠滴鼻给予20μl DPBS。所有小鼠继续饲养，感染后4d，颈椎脱臼法处死小鼠，部分小鼠取肺，固定于4％多聚甲醛，用于病理切片检测(RSV+PF4组3只，RSV组3只，对照组2只)；其余小鼠制备支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavagefluid，BALF)，然后取肺保存于-80℃，用于制备肺组织匀浆。

2.2PF4处理降低小鼠RSV感染后肺部病毒载量

取小鼠肺部组织块，加入500μl 4℃预冷的DPBS，于冰上研磨，制备匀浆。取100μl匀浆，加入1ml TRIzol(Invitrogen公司产品，货号：15596-026)，室温裂解细胞5min，提取肺组织匀浆中总RNA，测定核酸浓度。取100ng肺组织总RNA作为检测样品，10倍系列稀释的RSV N基因RNA标准品作为标准曲线，使用AgPath-ID^TM一步法RT-PCR检测试剂盒(Ambion公司产品，货号：AM1005)检测RSV N基因拷贝数。根据试剂盒的说明书进行逆转录反应和PCR反应，其中用于检测RSV N的引物和荧光探针如下：

正向引物：

5'-AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA-3'，序列如SEQ ID NO:2所示；

反向引物：

5'-TTCTGCACATCATAATTAGGAGTRTCAAT-3'，序列如SEQ ID NO:3所示；

荧光探针：

5'ROX-AATACACCATCCAACGGAGCACAGGAGA-3'BHQ2，序列如SEQ ID NO:4所示。

扩增过程中的荧光信号检测、Ct值的计算以及实验数据的存储和分析均由CFX96^TM荧光定量PCR检测系统(BIO-RAD公司)及自带软件完成。计算RSV N基因的拷贝数。结果如图2a所示，RSV+PF4组小鼠每100ng肺部总RNA中RSV N基因拷贝数(2.27×10⁶±1.05×10⁶)低于RSV组(6.62×10⁶±2.01×10⁶)，差异具有统计学意义(p＝0.046)；表明PF4处理能够显著降低感染后宿主肺部的病毒载量。

固定于4％多聚甲醛的小鼠肺脏采用石蜡包埋法制备组织切片。使用山羊抗RSV抗体(Abcam公司产品，货号：ab20745)和辣根过氧化物酶标记二抗(Invitrogen公司产品，货号：81-1620)通过免疫组织化学检测RSV在肺组织中的分布情况，以80i正置显微镜(Nikon公司)进行观察和拍照。结果如图2b所示，RSV组小鼠肺部组织中可见大量RSV信号，RSV+PF4组小鼠肺组织中RSV信号的分布密度和信号强度与RSV组相比均明显降低，表明PF4处理使小鼠感染RSV后在肺部组织细胞中进行复制的RSV减少。

2.3PF4处理降低小鼠RSV感染后肺部炎症水平

固定于4％多聚甲醛的小鼠肺脏采用石蜡包埋法制备组织切片。通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色检测小鼠肺组织的病理改变，以显微镜进行观察和拍照。结果如图3a所示，未感染RSV的对照组小鼠肺泡间隔狭窄、结构清晰；RSV组小鼠肺泡间隔严重增宽，部分肺泡结构已难以分辨，支气管周出现大量炎性细胞浸润，局部可见淋巴细胞渗出；RSV+PF4组小鼠肺泡间隔轻度增宽，肺泡结构较为完整，支气管周部分位置可见少量炎性细胞浸润，未见淋巴细胞渗出。以上结果表明PF4处理能够显著减轻小鼠RSV感染后病毒性肺炎样肺部病理改变。

使用小鼠IL-6ELISA检测试剂盒(ExCell Bio公司产品，货号：EM004-96)检测小鼠BALF中重要炎性细胞因子白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)的浓度。使用BD^TM CBA小鼠炎症检测试剂盒(BD Biosciences公司产品，货号：101310)检测小鼠BALF中重要炎性细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的浓度。结果如图3b所示，RSV+PF4组小鼠BALF中IL-6浓度(8.2±1.0pg/ml)低于RSV组小鼠(12.5±2.3pg/ml)，表明PF4处理能够显著降低小鼠RSV感染后炎性细胞因子IL-6的呼吸道内水平；RSV+PF4组小鼠BALF中MCP-1浓度(0.51±0.24pg/ml)低于RSV组小鼠(1.78±0.69pg/ml)，表明PF4处理能够降低小鼠RSV感染后炎性细胞因子MCP-1的呼吸道内水平。

上述结果表明PF4处理能够减轻小鼠RSV感染后的肺部炎症水平。

以上实施例为示例性实施例，不应理解为对本发明的限制。本领域技术人员能够认识到，在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的范围之内。

序列表

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> PF4的抗RSV应用

<130> CP1170281/CB

<160> 4

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 70

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr

1 5 10 15

Ser Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala

20 25 30

Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly

35 40 45

Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile

50 55 60

Lys Lys Leu Leu Glu Ser

65 70

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agatcaactt ctgtcatcca gcaa 24

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttctgcacat cataattagg agtrtcaat 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatacaccat ccaacggagc acaggaga 28

Claims

1.血小板因子4在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述血小板因子4是天然血小板因子4，优选地，所述血小板因子4是天然人血小板因子4；或者，所述血小板因子4是重组血小板因子4；优选地，所述血小板因子4是重组人血小板因子4。

3.权利要求1-2的用途，其中所述药物用于在哺乳动物或人中预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状。

4.权利要求1-3的用途，其中所述药物用于在呼吸道合胞病毒的高风险感染者中预防呼吸道合胞病毒感染所致疾病和/或症状，其中所述呼吸道合胞病毒的高风险感染者包括：60岁以上的老人、5岁以下的儿童、早产婴儿、患有慢性肺病的婴儿、患有先天性心脏病的婴儿、患有免疫缺陷病的婴儿、患过充血性心力衰竭的成年人、患过慢性阻塞性肺病的成年人、患过肺炎的成年人、患过哮喘的成年人、接受造血干细胞的患者、接受肺移植的患者、白血病患者。

5.权利要求1-4的用途，其中所述疾病包括急性上呼吸道感染、急性下呼吸道感染、毛细支气管炎、肺炎、气管支气管炎、中耳炎。

6.权利要求1-5的用途，其中所述症状包括鼻塞、流鼻涕、咳嗽、哮喘、打喷嚏、啰音、37.3-38.3℃低烧、食欲不振、发绀、呼吸急促、呼吸困难、窒息、支气管炎、肺炎。

7.权利要求1-6的用途，其中将血小板因子4配制为经口或经鼻给药的干粉吸入剂、喷雾剂或气雾剂；或者，将血小板因子4配制为经鼻给药的滴鼻剂。

8.权利要求1-7的用途，其中所述药物与其他药物联合给药；优选地，所述其他药物包括利巴韦林、帕丽珠单抗、莫维珠单抗、RSV-IGIV、MEDI-557、A-60444、MDT-637、BMS-433771、ALN-RSV01、ALX-0171以及他们的混合物；支气管扩张剂和糖皮质激素。

9.用血小板因子4抑制体外细胞中的呼吸道合胞病毒的非治疗目的的方法，所述方法包括：在呼吸道合胞病毒与细胞接触之前和/或之后，使血小板因子4与细胞接触；优选地，血小板因子4的浓度为5-5000nM；更优选地，血小板因子4的浓度为125-2000nM。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞是人的细胞，优选地，所述细胞是人喉癌细胞HEp-2。