[go: up one dir, main page]

CN108358800A - 用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法 - Google Patents

用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108358800A
CN108358800A CN201810198137.0A CN201810198137A CN108358800A CN 108358800 A CN108358800 A CN 108358800A CN 201810198137 A CN201810198137 A CN 201810198137A CN 108358800 A CN108358800 A CN 108358800A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
cell
culture medium
organic solution
aqueous culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810198137.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108358800B (zh
Inventor
H-G.亨内曼
S.沙费尔
M.韦泽尔
T.哈斯
J.吉伦
K.贝泽
S.哈夫凯姆艾尔
M.波埃特厄尔
F.厄尔哈特
M.席贝尔胡特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Degussa GmbH filed Critical Evonik Degussa GmbH
Publication of CN108358800A publication Critical patent/CN108358800A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108358800B publication Critical patent/CN108358800B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/99—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with other acceptors (1.3.99)
    • C12Y103/99003—Acyl-CoA dehydrogenase (1.3.99.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本申请涉及用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法。其包括以下步骤：提供含代谢活性细胞的水性培养基；使水性培养基与疏水性有机溶液接触；从水性培养基中分离疏水性有机溶液，其中与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的ß‑氧化反应的酶。本发明还涉及一种代谢活性细胞用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的用途，与其野生型相比，所述细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的ß‑氧化反应的酶，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadL和FadE及其变体，更优选FadE变体或其变体。

Description

用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法
本申请是申请日为2012年12月21日的中国专利申请201210599411.8“用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法”的分案申请。
技术领域
本申请涉及用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法，其包括以下步骤：提供含代谢活性细胞的水性培养基；使水性培养基与疏水性有机溶液接触；从水性培养基中分离疏水性有机溶液，其中与其野生型相比，所述细胞具有催化脂肪酸的β-氧化反应的至少一种酶降低了活性。此外，本发明涉及代谢活性细胞用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的用途，与其野生型相比，所述细胞的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶具有降低的活性，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadL和FadE及其变体，更优选FadE变体。
背景技术
由替代石化燃料的再生原料出发制备精细化工产品的方法的根本问题在于要将一旦得到的通常首先存在于大量的水相之中的产物转移入疏水性有机相中。一方面，为了能够实现中间产物或最终产物的浓缩以及为了能够实现可能地在后续反应步骤中在有机溶液中的合成处理，另一方面，为了通过去除所希望的产物来提高在水相中的反应的产率，或者尤其是当产物的存在由于对生产菌株的毒性或者对相关生物催化剂的抑制而通过该产品不利地影响反应进展时，首先在技术上有意义的范畴内实现该反应，这种转移是必要的。将通常以低浓度存在的产物由大量的水相中直接加热浓缩是不合适的。
传统以石油中所含烃类起始制成的工业上有大量需求的这样的产品的例子是12-氨基月桂酸(ALS)或其甲酯(ALSME)。在生产例如用于生产基于尼龙的管道系统的聚合物时，ALS是一种重要的起始产物。传统上，以石化原料起始，在具有低产率的过程中经由月桂内酰胺制备ALS，月桂内酰胺通过以下步骤来合成：将丁二烯三聚化，随后氢化形成环十二烷，接着氧化成环十二酮，与羟胺进行反应，并随后进行贝克曼重排。在WO2009/077461中描述了一种用于生物技术制备ALS或ALSME的大有前景的新路线。可以使用如在EP11154707中所述的一种液体离子交换剂，在两相体系中进行基于该路线的生物技术方法。
通过萃取将一种产物从水相加工进入到疏水性有机相中的前提条件首先是：该产物具有足够的倾向，在包括不可相互混合的水性亲水相和有机疏水相的两相系统中进入到有机相中，这决定性地取决于各化合物的物理化学特性。具有高比例末被取代的烃的化合物或者仅由未被取代的烃构成的化合物主要富集在疏水相之中，而具有高比例极性基团如含杂原子的官能团的化合物且非常特别是具有电荷的化合物主要或者实际上仅仅存在于水相之中，这使得转移到有机相中变得困难。
通常借助于分配系数，例如根据能斯特方程来描述平衡调节之后化合物在所述两相系统中的分配
α＝C相1/C相2。
一种特殊的分配系数是Kow也称作P-值，该系数表征了辛醇相与水相之间化合物的分配平衡：
Kow＝P＝C辛醇/C水
从疏水相处理产物的另一个前提条件在于，分配已经达到了通过上述方程描述的平衡状态或者至少足够接近于平衡状态。平衡的调节尤其通过两个相之间接触面的大小来确定，在生物技术方法中，这通常是非限制性的因素，因为通过由于维持高的代谢活性细胞密度总归必要的措施诸如水性培养基与疏水性有机溶液的通气和充分搅拌，已增加了接触面。
但在能够有效处理这样一种反应混合物之前，将两相分离是必要的，在所述混合物中所述疏水性有机溶液主要存在于胶束或者其它亚区室之中。将纯水与纯有机疏水性溶剂混合时，如果经常自动形成两个相而无其它协助的情况下，那么由于多种可能的相互作用，将不太容易从复杂的水性培养基中分离出有机疏水性溶液，并且在没有技术支持的情况下，例如通过离心分离会持续数时甚至数天。
对于通过生物技术工艺大规模生产工业需求的化学化合物而言，在开发和应用用于节约资源而快速地生产和处理如ALS的化合物的方法时，在此背景下，相分离的过程是很重要的一个因素。如果在大型反应器中必须从大体积的水相中提取总是溶解于疏水性有机溶液中的产物并且随后对其进行处理，那么除了本来的与生产相关参数诸如底物的类型和数量、培养基的温度和氧含量之外，也要优化疏水性溶液的分离，以便节约资源并且使得整个过程尽可能环保。尤其要提及的是，许多大规模使用的疏水性有机溶剂至少在较长时间接触的情况下对生物技术应用的生物有毒性作用，且在这种背景下为保护生物技术使用的菌株，和为防止细胞溶解时释放的不希望的副产物污染甚至分解目标产物，希望缩短水性培养基中的生物与溶剂之间的接触时间。
发明内容
因此，本发明以下述目的为基础，即提供用于在两相体系中以生物技术生产的产品的改进的制备和生产方法，所述两相体系包括含代谢活性细胞的水性培养基和疏水性有机溶液。该目的尤其是要在给定的时间窗口之内在过程的快速性和/或从水性培养基分离出疏水性有机溶液的程度方面更好分离出疏水性有机溶液和萃取溶于其中的以生物技术生产的产品。
本发明基于的另一个目在于提供可用于生物技术的细胞，所述细胞对源自疏水性溶液的对这样的细胞的毒性具有高耐受性。
此外，本发明基于下述目的，即提供用于制备疏水性化合物的生物技术方法以及适用于该方法的细胞，在所述方法中降低了耗氧量。
通过本申请的主题并且尤其也通过所附的独立权利要求的主题达成了所述这些目的和另外的目的，其中由从属权利要求得出实施方式。
在第一方面中通过包括以下步骤的方法达成了作为本发明的基础的目的
a)提供包含代谢活性细胞的水性培养基，
b)使该水性培养基与疏水性有机溶液接触，
c)从水性培养基中分离疏水性有机溶液，
其中，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶。
在第一方面的第一实施方式中，所述催化脂肪酸的β-氧化反应的酶是选自下述的酶：FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体，优选是FadE或其变体。
在第一方面的第二实施方式中涉及一种方法，其中所述有机溶液包含至少一种选自下列的溶剂：其在室温下为液态的取代和未被取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。
在第一方面的第三实施方式中涉及一种方法，其中所述有机溶液包含具有多于12个碳原子的脂肪酸或其酯，优选油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。
在第一方面的第四实施方式中，所述细胞具有重组的烷烃羟化酶。
在第二方面中，通过使用代谢活性细胞用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液从而达成了作为本发明的基础的目的，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体，更优选FadE。
在第三方面中通过使用敲除催化脂肪酸的β-氧化反应的酶作为代谢活性细胞的基因组成部分用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液从而达成了作为本发明的基础的目的，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体，还更优选FadE变体或其变体。
在第四方面中通过一种细胞从而达成了作为本发明的基础的目的，与其野生型相比，所述细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶，其进一步包含重组的单加氧酶，更优选包含烷烃羟化酶。
在第四方面的第一实施方式中，所述目的通过一种细胞得以达成，其中所述催化脂肪酸的β-氧化反应的酶是选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体的酶，更优选是FadE变体或其变体。
在第五方面中通过反应混合物从而达成了作为本发明的基础的目的，所述反应混合物包含具有代谢活性细胞的水溶液和疏水性有机溶液，其中，与其野生型相比，所述细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶。
在第五方面的第一实施方式中，通过一种反应混合物达成了所述目的，其中，所述催化脂肪酸的β-氧化反应的酶是选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体的酶，更优选是FadE变体或其变体。
在第五方面的第二实施方式中，通过一种反应混合物达成了所述目的，其中，所述疏水性有机溶液包含选自下列的至少一种溶剂：在室温下为液态的取代和未被取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。
在第五方面的第三实施方式中，通过一种反应混合物达成了所述目的，其中，所述疏水性有机溶液包含具有多于12个碳原子的脂肪酸或其酯，优选油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。
在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中所述代谢活性细胞是具有重组的烷烃羟化酶和转氨酶，此外优选选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和内酰胺水解酶的至少一种酶的细胞。
在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中所述细胞是低级真核细胞或者是原核细胞，优选是大肠杆菌。
在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中所述细胞是重组的细胞。
在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中，所述疏水性有机溶液构成疏水性有机溶液和水性培养基的总体积的至少5％，优选至少20％。
在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中，在接触时，所述水性培养基的pH值在5～9，更优选在6～8之间。
本发明的发明者已发现，如果与其野生型相比，代谢活性细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶，则能令人惊奇地从含所述代谢活性细胞的水性培养基中分离出疏水性有机溶液。
此外，本发明的发明者惊奇地发现，在生物技术方法中，在可比较的目标产物的生产效率下，与其野生型相比，具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶的代谢活性细胞具有较小的耗氧量和较高的产物产率与耗氧量之比。
并未意在绑定于任何一种理论，本发明人推测，至少一种催化β-氧化反应的酶的活性降低导致水性培养基中作为去垢剂起作用的不明代谢物的浓度降低，从而一方面在培养细胞时在搅动培养基的条件下疏水性溶液和位于水性培养基中对溶剂敏感的代谢活性细胞之间的接触面减小，这导致细胞的溶剂应激减少，且另一方面在断开搅拌装置之后促进形成分离相。
可将根据本发明的教导用于改进所有生物技术方法，所述生物技术方法包括使用代谢活性细胞制备诸如精细化学品之类的产物，该代谢活性细胞的培养在水性培养基中进行和使用疏水性有机溶液处理该产物。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“代谢活性细胞”理解为具有代谢活性的活细胞，优选以活性形式表达或更优选过表达与令人感兴趣的产物的生物技术制备相关的酶的细胞。所述细胞可以是一种包括古生菌(Archaea)的原核生物，或者是真核生物，在原核生物的情况中优选选自下述属：假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和埃希氏菌属(Escherichia)。在一种还更优选的实施方式中，所述细胞是细菌细胞，还更优选是革兰氏阴性细菌细胞，最优选是大肠杆菌。在另一种优选的实施方式中，涉及真核细胞，更优选是真菌细胞，还更优选是酵母细胞，最优选是酵母菌(Saccharomyces)或者假丝酵母(Candida)、毕赤酵母(Pichia)，尤其是热带假丝酵母(Candida tropicalis)。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“低级真核生物”理解为在其存在的所有阶段中为单细胞的真核生物，与之相反的是高级真核生物，其生命的大部分以具有包含分化细胞的组织的多细胞生物的形式渡过。在具体的实施方式中，术语“细胞”与本发明中的术语“微生物”同义并且可交换使用。此外，所述细胞可以是分离的细胞或者多种细胞的混合物。
本领域技术人员已知大量适合于维持或者培养细胞，尤其是在生物技术上有重要意义的细胞的水性培养基。其中同样包括完全培养基如LB-培养基、基本培养基如M9-培养基以及选择性培养基，例如含高盐浓度的并因此使得只有嗜盐或者至少耐盐的生物体才能生长的那些。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“水性培养基”理解为基于水的反应培养基，该培养基就其所有相关因素而言，尤其是pH-值、盐含量和温度，具有如此性质，以至于其维持或者促进包含于其中的细胞优选微生物的生活力，并且水性培养基和疏水性有机相均以液体形式存在。可以在微生物和分子生物学教科书中获悉各种在生物技术上有重要意义的细胞的温度要求，例如Fuchs/Schlegl，2008。在一种优选的实施方式中，在接触时，所述水性培养基的pH-值在4～9之间，更优选在4.5～8.5之间，最优选在6.5～7.5之间。在另一种优选的实施方式中，所述温度在0～45℃之间，更优选在15～40℃之间，最优选在20～37℃之间。
本领域技术人员已知许多可使用的溶剂，以制备疏水性有机溶液。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“疏水性的”理解为，在液体状态下，在液体水相存在下，形成单独的与水相清楚划清界限的液相的一种液体的特性。后者可以是连续的液相或者是乳状液。在另一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“疏水性的”理解为基本上不溶于水的化合物的特性。最后，在另一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，如此理解该术语，使得这样称谓的化合物具有其常用对数大于0，优选大于0.5，还更优选大于1且最优选大于2的P-值(J.Sangstar，Octanol-Water Partition Coefficients：Fundamentals and Physical Chemistry，卷2 Wiley Series in Solution Chemistry，John Wiley&Sons，Chichester，1997)。优选的有机溶剂包括，但并非局限于，选自下列的溶剂：在室温下为液态的取代和未被取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。所述疏水性有机溶剂也可以是包含多于一种的疏水性有机溶剂的混合物。
脂肪酸的β-氧化是一种很普遍的代谢途径，其完全一样地允许原核生物和真核生物氧化脂肪酸并且使得其中所含的化学能可用于代谢(Fujita等人，2007)。就广义而言，该氧化开始于将脂肪酸吸收到细胞之中，在大肠杆菌的情况中，通过引导脂肪酸通过革兰氏阴性细菌细胞的外膜和内膜的转运蛋白FadL(Black，1991)和将CoA酯形式的脂肪酸释放到胞质溶胶之中的FadD基因产物(Black等人，1992)。如果条件需要，在这里首先将脂肪酸在CoA脂肪酸酯的β-位置通过酰基辅酶A-脱氢酶，在大肠杆菌的情况中则通过FadE(Campbell和Cronan，2002)氧化。或者也可以借助于2，4-二烯酰辅酶A-还原酶，在大肠杆菌的情况中则借助于FadH，由双不饱和脂肪酸通过还原反应形成类似的分子。随后，多功能酶催化形成仲醇的水合作用及其随后的生成酮的氧化，所述多功能酶是烯酰辅酶A-水合酶/3-羟基酰基辅酶A-脱氢酶，在大肠杆菌的情况中则为FadB。在最后一步中，3-酮酯酰辅酶A-硫解酶，在大肠杆菌的情况中则为FadA，催化酮酯酰辅酶A的裂解，从而释放出乙酰辅酶A和与起始分子相比缩短了两个碳原子的CoA-酯。如果还不是乙酰辅酶A，则可以将后者重新送入到β-氧化循环之中，并且将其氧化缩短。FadR也参与调节脂肪酸的β-氧化，FadR是Fad操纵子的调节子，其包含降解脂肪酸所需的基因，FadR没有催化β-氧化反应。在一种优选的实施方式中，将术语“催化脂肪酸的β-氧化反应的酶”理解为直接与脂肪酸底物或者与在降解成乙酰辅酶A的途径中由此产生的分子相互作用的任何一种酶，优选将所述产生的分子识别为底物，并且催化其在该降解途径中更接近于乙酰辅酶A的代谢产物的转化，优选包括实现了将脂肪酸吸收到细胞之中的脂肪酸输入蛋白(Importer)。按照上述定义，例如酰基辅酶A-脱氢酶就属于这些酶，因为其与脂肪酸辅酶A-酯相互作用并且催化其生成烯酰辅酶A的转化，在β-氧化的代谢途径上烯酰辅酶A比脂肪酸辅酶A-酯更接近于乙酰辅酶A。在一种特别优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“催化脂肪酸的β-氧化反应的酶”理解为选自大肠杆菌的基因产物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE和/或其变体或者得自其它生物的同源物的任何一种酶。大肠杆菌的基因产物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE及其变体以及大量其它生物技术可使用的生物体的同源物及其核酸-和多肽序列描述于现有技术中，例如登录号为AP009048.1的FadA，登录号为BAE77457.1的FadB，登录号为BAA15609.1的FadD，登录号为BAA77891.2的FadE以及登录号为BAA16205.1的FadL。
本发明的教导并非只能使用这里所述的生物大分子的确切氨基酸序列或核酸序列来实施或应用于这里所述的生物大分子的确切氨基酸序列或核酸序列上，例如通过敲除编码催化β-氧化反应的酶的基因，而是也可以使用这类大分子的变体来实施或应用于这类大分子的变体上，所述变体可以通过删除、加成或取代一个或多于一个氨基酸或核酸来获得。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，术语核酸序列或氨基酸序列的“变体”，在下文中与术语“同源体”含义相同并且可以互换，表示就相应的最初的野生型核酸序列或氨基酸序列而言具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99％或更高百分值的同源性(这里与同一性同义使用)的另一种核酸序列或氨基酸序列，其中优选删除或取代那些与形成催化活性中心的氨基酸或者对于结构和折叠而言必要的氨基酸不同的氨基酸，或者仅仅保守取代后者，例如谷氨酸替代天冬氨酸，或者亮氨酸替代缬氨酸。现有技术描述了可使用的算法来计算两个序列的同源性程度，例如Arthur Lesk(2008)，Introduction tobioinformatics，3rdedition。在本发明的另一种更优选的实施方式中，氨基酸序列或核酸序列的变体优选除了具有上述序列同源性之外，还基本上具有与野生型分子或最初的分子相同的酶的活性。例如，一种作为蛋白酶的酶活性多肽的变体具有与该多肽酶相同或者基本上相同的蛋白水解活性，也就是催化肽键水解的能力。在一种具体的实施方式中，术语“基本上相同的酶活性”表示就野生型多肽的底物而言的活性，其明显高于本底活性，并且/或者比就相同底物而言的野生型多肽具有的KM-值和/或者k催化-值相差小于3个，更优选2个，还更优选一个数量级。在另一种优选的实施方式中，所述核酸序列或氨基酸序列的“变体”包含该核酸序列或氨基酸序列的至少一个活性部分/或者片段。在另一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，术语“活性部分”表示具有小于氨基酸序列全长的长度或者编码小于氨基酸序列全长的长度的氨基酸序列或核酸序列，其中所述具有长度小于野生型氨基酸序列的氨基酸序列或者经编码的氨基酸序列基本上具有与野生型多肽或其变体相同的酶活性，例如作为脂肪酸输入蛋白、作为烯酰辅酶A-水合酶或FadE，或者作为乙酰辅酶A-酰基转移酶或FadB。在一种具体的实施方式中，术语核酸的“变体”包括核酸、其互补链，优选在严格条件下结合在野生型核酸上。对于本领域技术人员而言杂交反应的严格性可容易地确定，且通常取决于探针长度、洗涤时的温度和盐浓度。一般来说较长的探针需要较高的温度用于杂交，相反对于较短的探针则较低的温度即可。一般来说是否发生杂交取决于变性DNA融合在其周围存在的互补链上的能力，更确切地说在低于熔融温度的情况下。Ausubel等人于1995年比较详细地描述了杂交反应的严格性和相应的条件。借助于杂交用于鉴别DNA序列的说明，本领域技术人员尤其可参阅手册Boehringer Mannheim GmbH公司(Mannheim，德国，1993)的手册“The DIG System Users Guide for FilterHybridization”以及Liebl等人的文章(International Journal of SystematicBacteriology 41：255-260(1991))。在一种优选的实施方式中，所述杂交在严格的条件下进行，这意味着仅在探针和靶序列(即用探针处理过的多核苷酸)至少70％相同时，才形成杂交物。已知，通过改变缓冲液组成、温度和盐的浓度影响或确定包括洗涤步骤在内的杂交严格性。通常，杂交反应在比洗涤步骤严格性相对低的条件下进行(Hybaid HybridisationGuide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。例如在大约50℃～68℃温度下可以将一种相当于5xSSC缓冲液的缓冲液用于杂交反应。在此也可以用具有与探针序列的同一性少于70％的多核苷酸杂交探针。这样的杂交物较不稳定，并被在严格条件下的洗涤去除。这可例如通过降低盐浓度到2x SSC和任选地随后到0.5x SSC来实现(The DIG System User′sGuide for Filter Hybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，德国，1995)，其中以如下递增的优选顺序调节温度：大约50℃～68℃，大约52℃～68℃，大约54℃～68℃，大约56℃～68℃，大约58℃～68℃，大约60℃～68℃，大约62℃～68℃，大约64℃～68℃，大约66℃～68℃。优选大约64℃～68℃或者大约66℃～68℃的温度范围。任选可以将盐的浓度降低到相当于0.2x SSC或者0.1x SSC的浓度。通过以大约1～2℃的步距将杂交温度从50℃逐步提高到68℃，可例如以如下递增的优选顺序分离出多核苷酸片段，所述片段与所用核酸分子序列的同一性至少为70％或者至少80％或者至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或者至少99％。另外的用于杂交的说明是以所谓的试剂盒形式市购可得的(例如Roche Diagnostics GmbH公司德国曼海姆的DIG Easy Hyb，目录号1603558)。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，术语核酸的“变体”包括在遗传密码的简并度范畴内编码与最初的核酸相同的氨基酸序列或者该氨基酸序列的变体的任意核酸序列。
随着现代遗传学、微生物学和分子生物学方法的发展，提供了很多可用来常规测定和影响存在于活细胞中的酶的活性的工具给本领域技术人员。为了确定以悬浮液、颗粒形式存在或者能够以经过处理的形式从细胞培养中除去的酶的活性，可以使用酶标准测试法并评价，如同教科书(例如Comish-Bowden，1995)中所述的一样。现有技术公开了许多专门适合于测定催化脂肪酸的β-氧化反应的酶的活性的测试方法，例如在Kameda&Nunn(1981)、Marrakchi等人(2003)、Lobo等人(2001)和Xu等人(2011)中。在现有技术中，例如在Maniatis等人(1989)中或者在Fuchs&Schlegl(2007)中，也描述了通常可用于降低细胞中酶的活性的方法，例如通过暴露在放射性辐射下使得细胞非定向突变，随后富集或者筛选突变体；通过定向引入点突变或者通过敲除整合在细胞中染色体的用于编码活性酶的基因。在Fad-基因产物的特殊情况下，转录阴抑物例如FadR的过度表达(Fujita等人，2007)也有助于降低活性。也可以基于RNA-干扰(Tuschl，2001)或者使用特异性抑制剂来降低活性。在一种优选的实施方式中，表述“其中与其野生型相比，所述细胞具有降低了活性的酶”，如在此所使用的一般，表示相对于野生型细胞中相同的酶的活性，在经修饰的细胞中酶的活性降低。在一种优选的实施方式中，相对的活性的减少以如下递增的优选顺序为：5、10、20、40、50、75、90、95、99％或更高百分比。在一种特别优选的实施方式中，相对于背景不再检测出酶的活性。
在根据本发明的方法的第二步骤中，水性培养基与疏水性有机溶液接触。在本发明的一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，术语“接触”表示水性培养基与有机溶液直接接触，而无中间插入的水性培养基和/或者疏水性有机溶液无法逾越的机械屏障，例如无机膜。例如可将水性培养基引入发酵罐中，并且将有机溶液加入到同一个发酵罐中的培养基之中，使得两种液体可以混合。在一种优选的实施方式中，至少部分在搅动、通入气体或者采取适合于增大两相接触面积的类似措施下进行接触。
在第二步骤之后，从水性培养基中分离出疏水性有机溶液。由于该系统固有的形成两相的能力，这对于本领域技术人员米说是易于进行的过程，其可简单地通过静置容器且随后滗析其中一相来进行。或者可使用分液漏斗。在沸点差别足够大的情况中，也存在通过施加负压抽出在较低温度下沸腾的相的可能性，该相通常是有机相。可以使用如氢化钙、无水氯化钙、硅胶、无水硫酸钠、氢氧化钠等无机干燥剂去除残留在有机相中的少量水。
可以使用常见的疏水性有机溶剂进行根据本发明的方法，所述溶剂包括在室温下为液态的取代和未被取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。本身并非液体的疏水性有机溶剂也适合，只要它是作为一个整体的为液态的溶剂混合物的一部分。在此可任选考虑，很多溶剂对代谢活性细胞或多或少有毒性作用。如果细胞至少应当暂时保持其代谢活性，那么就应使用毒性作用适度或者根本没有毒性作用的疏水性有机溶剂的浓度。在一种特别优选的实施方式中，所述溶剂是具有至少八个碳原子、优选至少十二个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸，例如月桂酸、油酸或芥酸或者其甲酯。在另一种优选的实施方式中，所述溶剂是式为CH3-(CH2)x-COOH的脂肪酸，式中x可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或者更多。在另一种优选的实施方式中，涉及具有双键的不饱和脂肪酸，尤其优选在位置9具有一个双键，特别优选油酸。在另一种特别优选的实施方式中，所述溶剂是己酸。
应如此安排疏水性有机溶液的体积，使得有机相可容易地被分离出来，且在一种优选的实施方式中，有机相构成水性培养基和疏水性有机溶液的总体积的2～98％，优选5～95％，还更优选为10～40％，最优选为20～30％。
通常选择能够制备特别需要的产物的细胞作为代谢活性细胞。特别有利的是，为此使用重组的细胞。在一种优选的实施方式中，将术语“重组”如在此一般理解为，被称为重组体、引入到“重组细胞”之中的核酸分子并非是取自自然、而是使用分子生物学或者化学合成方法制备的核酸分子，或者被称为重组体的细胞包括重组核酸分子或者由其编码的多肽。用于制备重组核酸分子和细胞的常规分子生物学方法描述在现有技术中，例如在Sambrook等人(1989)或者Schlegl&Fuchs(2007)中。
此外，如果所述细胞具有或者，特别优选过度表达，生成产物或者产物的前体或中间体的酶，则是特别有利的。这可通过将包含编码所述酶的核酸分子的载体通过转换或诸如此类的引入细胞之中，或者将对酶进行编码的核酸分子掺入细胞的基因组成，例如染色体之中来实现。对于许多生物技术上重要的细胞种类例如大肠杆菌来说，可用于表达或者过表达核酸分子的合适的方法和载体是已知的，例如pET或pGEX型的载体，以及适合于其表达的细胞(Moffatt&Studier(1986)，Rosenberg等人(1987)和Studier等人(1990)。
如果使用代谢活性细胞，以代谢疏水性有机溶剂，或者使用疏水性有机溶剂作为底物来催化化学反应，则特别适用根据本发明的方法。所述酶包括烷烃羟化酶。
在一种特别优选的实施方式中，如用于此的“烷烃羟化酶”是催化将烷烃氧化成醇、醛/酮和/或氧化成羧酸、优选主要氧化成醇的酶。在现有技术中已描述了大量烷烃羟化酶，例如在Grant等人(2011)或者Koch等人(2009)中。在一种特别优选的实施方式中，所述烷烃羟化酶是“alkB型的烷烃羟化酶”。AlkB是得自恶臭假单胞菌的AlkBGT体系的一种氧化还原酶，其因其羟化酶活性而众所周知。这取决于两种另外的多肽，AlkG和AlkT。AlkT被表征为FAD依赖性红素氧还蛋白还原酶，其将电子从NADH转移到AlkG上。AlkG是一种红素氧还原蛋白，一种含铁的氧化还原蛋白，可用作AlkB的直接电子供体。在一种优选的实施方式中，如在此使用的术语“alkB型烷烃羟化酶”被理解为膜结合的烷烃羟化酶。在另一种优选的实施方式中，将同一术语“alkB型烷烃羟化酶”理解为多肽，所述多肽具有递增优选的至少75、80、85、90、92、94、96、98或者99％的与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Gpo1(数据库代码：CAB54050.1，该代码以及本文中使用的所有其它数据库代码均源自于2011年11月9日发布的NCBI的基因库蛋白质数据库)的AlkB的序列的序列同源性。这里所使用的术语“序列”可以涉及多肽的氨基酸序列和/或者对其进行编码的核酸序列。
可以首先使用该方法氧化并随后胺化脂肪酸或其酯。例如国际专利申请WO2009/077461中所述的一种酶系统就适合于此。在该情况下，所述代谢活性细胞是具有重组烷烃羟化酶和转氨酶的细胞，除此之外，优选选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和内酰胺水解酶的至少一种酶。在一种优选的实施方式中，将在此使用的术语“醇脱氢酶”理解为将醛或酮氧化成相应伯醇或仲醇的酶。实例包括真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)(ACB78191.1)、乳酸短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(YP_795183.1)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefiri)(ACF95832.1)的醇脱氢酶，得自马肝的，异氧硝化-好氧反硝化菌(Paracoccuspantotrophus)(ACB78182.1)和矢野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)(EU427523.1)的醇脱氢酶及其各自的变体。在一种优选的实施方式中，将在此所使用的术语“转氨酶”理解为催化α-氨基从供体分子优选氨基酸转移到受体分子优选α-酮羧酸的酶。例如可以使用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ATCC12472(数据库代码NP_901695)的转氨酶。在一种优选的实施方式中，将在此使用的“丙氨酸脱氢酶”理解为催化在消耗水和NAD+的条件下L-丙氨酸转化成丙酮酸、氨和NADH的酶。例如可以使用源自枯草杆菌(Bacillussubtilis)(数据库代码L20916)、豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(数据库代码CP001622)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolytikus)(数据库代码AF070716)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(数据库代码X63069)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)(数据库代码AB013821)的丙氨酸脱氢酶。
本发明不仅涉及根据本发明的方法，也涉及敲除催化脂肪酸的β-氧化反应的酶作为代谢活性细胞的基因组成部分，用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的用途，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL，更优选FadE。如果在任意一种方法中存在将疏水性有机溶液从包含代谢活性细胞的水性培养基中分离的必要性，则根据本发明，使用敲除了至少一种催化脂肪酸的β-氧化反应的酶，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL，更优选FadE，来替代没有相应的脂肪酸代谢修饰的代谢活性细胞，即与其野生型相比，催化脂肪酸的β-氧化反应的酶的活性没有改变或甚至提高的细胞，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL，更优选FadE。
无论是否要使用所述代谢活性细胞来制备脂肪酸或者其衍生物或者可以经由β-氧化代谢途径降解的其它分子，均可使用这种Fad基因的敲除。
在一种优选的实施方式中，在此所使用的术语“敲除”可理解为，与其野生型细胞相比，减少基因或者其基因产物的转录和/或转译，例如通过删除基因的一部分或者整个基因，通过在适当的位点插入终止密码子，通过去除启动子的必要部分，或者通过去除核糖体结合位点。
在一种最优选的实施方式中，根据本发明的方法包括步骤：a)提供含代谢活性细胞的水性培养基；b)使所述水性培养基与疏水性有机溶液接触和c)从所述水性培养基中分离出疏术性有机溶液，其中与其野生型相比，所述细胞具有降低的FadE变体或其变体的活性，所述代谢活性细胞是大肠杆菌的重组菌株，该菌株具有重组的烷烃羟化酶，优选源自恶臭假单胞菌的AlkBGT或其变体，以及重组的转氨酶，并且所述疏水性有机溶剂包括得自月桂酸或己酸或其甲酯与一种不饱和脂肪酸的混合物，所述不饱和脂肪酸优选油酸或芥酸，最优选油酸，其中优选油酸或芥酸与月桂酸或己酸或其甲酯的比例为20∶80～80∶20，优选20∶80～40∶60。
在一种最优选的实施方式中，根据本发明的方法是用于制备ω-氨基羧酸的方法，包括步骤：a)提供含代谢活性细胞的水性培养基；b)使所述水性培养基与疏水性有机溶液接触；c)从所述水性培养基中分离出疏水性有机溶液，其中，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶，其中所述细胞优选是大肠杆菌，且所述催化脂肪酸的β-氧化反应的酶是FadE，并且除此之外所述还通过基因技术改变了所述的细胞，使其能够生成比其野生型更多的ω-氨基羧酸，由此优选，其具有包含烷烃羟化酶，优选源自恶臭假单胞菌的AlkBGT，任选醇脱氢酶和ω-转氨酶的重组酶体系。在另一种最优选的实施方式中，本发明涉及一种细胞，其中，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶，其中所述细胞优选是大肠杆菌，且所述催化脂肪酸的β-氧化反应的酶是FadE，并且除此之外所述还通过基因技术改变了所述的细胞，使其能够生成比其野生型更多的ω-氨基羧酸，由此优选，其具有包含烷烃羟化酶，优选源自恶臭假单胞菌的AlkBGT，任选醇脱氢酶和ω-转氨酶的重组酶体系。
以下将通过附图和非限制性实施例来阐述本发明，可以从这些附图和示例中获得本发明的其它特征、实施方式、方面和优点。
附图说明
附图1展示了在制备ALSME时使用ΔFadE-突变体W3110 ΔFadE[alkB-alaD-TA](以下也称作“ΔFadE”)(左侧)以及和除了缺少ΔFadE-缺失之外相同的菌株W3110[alkB-alaD-TA](以下也称作野生型(“WT”)(右侧)在相分离时的区别。箭头所指为十分钟之后在突变体的情况中有机相和水相明显的分离，相反，在使用另一菌株时，相同时间之后还是不能辨识相分离。
附图2展示了与附图1相同的实验，除了降发酵后的反应介质装入离心管中。
附图3展示了在与附图1中相同的实验中两种菌株的以OTR(oxygen transferrate/氧传递速率)形式的氧输入量和以CTR(carbon dioxide transfer rate/二氧化碳传递速率)形式的二氧化碳排出量，。
附图4展示了在与附图1中相同的实验中在培养基中随时间变化的ALSME的浓度。
附图5展示了如实施例2中所述的月桂酸甲酯(LSME)的反应中各种产物的浓度，即氨基月桂酸(ALS)、氨基月桂酸甲酯(ALSME)、ω-羧基月桂酸(DDS)、ω-羧基月桂酸甲酯(DDSME)、ω-羟基月桂酸(HLS)、ω-羟基月桂酸甲酯(HLSME)和ω-氧代月桂酸(OLS)。作为菌株研究ΔFadE-(附图5a)、野生型(W3110)(附图5b)、ΔFadL-(附图5c)以及具有ΔFadE和ΔFadL的菌株(附图5d)。
附图6展示了实施例2中所述试验的OTR-曲线(附图6a)和CTR-曲线(附图6b)。
附图7展示了在实施例2中观察到的在使用ΔFadE-、野生型(W3110)-、ΔFadL-和ΔFadE/ΔFadL-菌株制备ALSME时在相分离时的区别。箭头所指为十分钟之后在突变体的情况中有机相和水相明显的分离，相反，在使用野生型菌株时，相同时间之后还是不能辨识相分离。
具体实施方式
实施例1：以生物技术制备氨基月桂酸甲酯时使用ΔFadE-突变体加速分离水相与疏水相
使用菌株W3110 ΔFadE[alkB-alaD-TA]和W3110[alkB-alaD-TA]在DASGIP的8联平行发酵体系中将月桂酸甲酯生物转化为氨基月桂酸甲酯。如WO2009077461中所述，W3110[alkB-alaD-TA]是大肠杆菌W3110的一种菌株，包括一种基于pBR322的具有氧化-和转氨化体系的质粒，所述氧化-和转氨化体系包括氧化还原酶AlkB、丙氨酸脱氢酶和转氨酶。除了缺失编码FadE的基因，W3110 ΔFadE[alkB-alaD-TA]与后一种菌株相同，并因此该菌株没有酰基辅酶A-脱氢酶活性。
使用1升反应器进行发酵。借助于两点校准法，用pH4.0和pH7.0的标准溶液校准pH探针。将300mL饮用水注入反应器中，在121℃温度下高压灭菌20分钟，以保证无菌。接着使pO2-探针在DASGIP体系上过夜(至少6小时)极化。次日早晨在净化工作台下移出水，并代之以含有100mg/L氨苄西林的300mL高细胞密度培养基。随后用单点校准法(搅拌器：400rpm/供气：10sL/h空气)校准pO2-探针，并且借助于就地清洗法对进料段、修正剂段和诱导剂段进行清洗。为此用70％乙醇、接着使用1MNaOH、然后使用灭菌去离子水冲洗软管，最后灌入各自的培养基。
将生产ALS和ALSME的大肠杆菌菌株首先由各自的低温培养物在含有100mg/L氨苄西林的LB培养基中(25mL在100mL三角烧瓶中)，在37℃温度和200rpm下过夜培养大约18小时。接着将每2mL培养物用100mg/L氨苄西林接种在高细胞密度培养基中(葡萄糖15g/L(30mL/L单独高温高压灭菌的500g/L母液，含有1％MgSO4*7H2O和2.2％NH4Cl)，(NＨ４)2SO41.76g/L，K2HPO419.08g/L，KH2PO412.5g/L，酵母萃取物6.66g/L，二水合柠檬酸三钠2.24g/L，单独高温高压灭菌的1％的母液的柠檬酸铁铵溶液17mL/L，单独高温高压灭菌的母液(HCl(37％)36.50g/L，MnCl2*4H2O 1.91g/L，ZnSO4*7H2O 1.87g/L，乙二胺四乙酸二水合物0.84g/L，H3BO30.30g/L，Na2MoO4*2H2O 0.25g/L，CaCl2*2H2O 4.70g/L，FeSO4*7H2O17.80g/L，CuCl2*2H2O 0.15g/L))的微量元素溶液5mL/L(每菌株25mL置于100mL三角烧瓶中)，然后在37℃/200rpm下继续培养5.5小时。
在W3110 ΔFadE[alkB-alaD-TA]的情况中，在600nm下的培养液的光密度测定为6.9，在W3110[alkB-alaD-TA]的情况中为7.4。为了对光密度为0.1的反应器接种，在5mL注射器中各抽取4.0mL或4.4mL(ΔFadE)(在无菌条件下)，并且借助于插管经由用70％乙醇覆盖的隔膜对反应器进行接种。
使用以下标准程序：
文字(Script)
触发器激活(Trigger scharf) 31％DO(1/60h)
IPTG诱导 进料开始后2小时
进料触发器 50％DO
进料速率 3[mL/h]
可将所进行的实验分为两个阶段，培养和随后的生物转化阶段，在培养时细胞应达到一定的光密度，在生物转化阶段，在加入底物之后，月桂酸甲酯应被表达中形成的酶转变成氨基月桂酸酯。单方面地用氨(12.5％)将pH-值调节到pH6.8。在培养和生物转化过程中通过搅拌器转速和供气速率将培养液中溶解的氧(DO，dissolved oxygen，溶解的氧)调节到30％。作为分批进料进行发酵，通过PO峰值触发进料开始，5g/Lh葡萄糖进料速率(500g/L葡萄糖，含有1％MgSO4*7H2O和2.2％NH4Cl)。随进料开始，温度也从之前的37℃下降到30℃。进料开始之后2小时通过自动加入IPTG(1mM)诱导转氨酶的表达。开始进料之后10小时通过手动加入DCPK(0.025％v/v)诱导alk基因。在生物转化开始之前测定培养液的光密度。
进料开始之后14小时开始生物转化阶段。为此将150mL月桂酸甲酯和离子交换剂油酸(工业级90％)的混合物分批加入到发酵液之中。为了给转氨酶提供氨基供体，在生物转化开始之前半小时将5mL 3M硫酸铵溶液加入到发酵液之中。从反应釜中取出2mL发酵液用于取样，并将其中一部分在丙酮-HCl-混合物(c(HCl)＝0.1mol/L)中稀释为1/20并萃取。在生物转化开始后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、7.5小时、10.5小时、19.5小时和21小时时从所有反应器中取样。发酵过程中通过分析DASGIP系统上的废气分析测定氧的转化率(OTR＝氧转化率)和碳的转化率(CTR＝碳转化率)。在生物转化开始之后21小时结束发酵。关闭搅拌器、充气、温度调节和pH-调节，并且使反应釜静止5～10分钟。
结果：
在生物转化阶段期间，在W3110 ΔFadE[alkB-alaD-TA]的情况中，在形成可比较的，甚至略为升高的产物ALSME的同时，耗氧量比在W3110[alkB-alaD-TA]的情况中小(参见附图3和4)。
10分钟之后，在含有菌株W3110 ΔFadE[alkB-alaD-TA]的反应釜中观察到比例为大约40％上相、大约60％下相的明显的相分离。在这两个相之间存在一层薄的中间相。从下相和上相将样品灌注到15mL离心管之中，然后在5500xg下离心分离10分钟。随后证实，在具有下相的试管中有大约95％水相和生物质。在具有上相的管子中可看出上相由60％以上有机成分构成。在含有菌株W3110 W3110[alkB-alaD-TA]的反应釜中，在10分钟之后存在一种均匀的乳状液，并且在另外20分钟之后也没有显现出相分离。
实施例2：以生物技术制备氨基月桂酸甲酯时使用ΔFadL-突变体以及ΔFadE ΔFadL-突变体加速分离水相与疏水相
类似于实施例1，使用以下菌株作为对照进行进一步的实验
W3110 ΔfadL[alkB-alaD-TA]和
W3110 ΔfadE ΔfadL[alkB-alaD-TA]以及
W3110 ΔfadE[alkB-alaD-TA]和
W3110[alkB-alaD-TA]。
再次使用DASGIP8联平行发酵体系，采用与实施例1所述完全一样的方案和参数。
在通过加入月桂酸甲酯/油酸混合物开始生物转化之后，在1.25、2.5、3.5、20.5、22.5和23.5小时后取样，并且按照上述方法进行处理。结果均已汇总在附图5、6和7之中。
24小时之后，中止生物转化，结束pH-调节、温度调节和DO-调节，并使反应器静止5～10分钟。
与上述实验中一样，这里也可以在短时间之后观察到水相与有机相的明显分离，只要切断Fad基因中的至少一个。在使用野生型作为生物催化剂的情况中，即没有删除Fad基因中的任一个，则不能看到相分离(参见附图7)。
同样也显现出，与野生型相比，具有至少一个Fad缺失的菌株降低了耗氧量(参见附图6a)。
参考文献：
WO2009077461：制备ω-氨基酸或其内酰胺的重组细胞
J Sangster，Octanol-Water Partition Coefficients：Fundamentals andPhysical Chemistry，卷2，Wiley Series in Solution Chemistry，John Wiley&Sons，Chichester，1997
F M Ausubel(1995)，Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons，Inc.
A M Lesk(2008)，Introduction to Bioinformatics，第3版
Y Fujira，H Matsuoka和K Hirooka(2007)Mol.Microbiology 66(4)，829-839
P N Black(1991)J.Bacteriol.173，435-442
P N Black，C C DiRusso，A K Metzger和T L Heimert(1992)J.Biol.Chem.267，25513-25520
J.W Campbell&J E Cronan(200)J.Bacteriol.184，3759-3764
A Cornish-Bowden(1995)，Fundamentals of Enzyme Kinetics，Portland PressLimited，1995
S Lobo，G Florova和K A Reynolds(2001)Biochemistry 40(39)，11955-64
X Yu，T Liu，F Zhu和C Khosla(2011)PNAS，electronic publication beforeprinting
K Kameda&WD Nunn(1981)J.Biol.Chem.256，5702-5707
Hi Marrakchi，W E DeWolf，C Quinn，J West，B J Polizzi，C Y So等人(2003)Biochem.J.370，1055-1062
Sambrook/Fritsch/Maniatis(1989)：Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版
Fuchs/Schlegel(2007)Allgemeine Mikrobiologie，2008，Georg Thieme Verlag
B A Moffatt和F W Studier(1986)J.Mol.Biol.189，113-130
A H Rosenberg，B N Lade，D Chui，S Lin，J J Dunn和F W Studier(1987)Gene56，125-135
F W Studier，A H Rosenberg，J J Dunn和J W Dubendorff(1990)Meth.Enzymol.185，60-89
C Grant，J M Woodley，F Baganz(2011)Enzyme and Microbial Technology，480-486
D J Koch，M M Chen，J B van Beilen和F H Arnold(2009)Appl.andEnv.Microbiology，337-344
T Tuschl(2001)ChemBioChem 2：239-145

Claims (27)

1.用于改进疏水性有机溶液从水性培养基的分离的方法，其包括以下步骤：
a) 提供含代谢活性细胞的水性培养基，
b) 使水性培养基与疏水性有机溶液接触，
c) 从水性培养基中分离出疏水性有机溶液，
其中，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶，并且所述细胞是低级真核细胞或者原核细胞，并且所述细胞含有重组的烷烃羟化酶，并且所述烷烃羟化酶是alkB型的烷烃羟化酶，
所述有机溶液包含至少一种选自下列的溶剂：在室温下为液态的取代和未取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶是选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL或其变体的酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶是FadE或其变体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机溶液包含具有多于12个碳原子的脂肪酸或其酯。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述有机溶液包含油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。
6.代谢活性细胞的用途，所述细胞用于从含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液，与其野生型相比，该细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶，所述细胞是低级真核细胞或者原核细胞，并且所述细胞含有重组的烷烃羟化酶，并且所述烷烃羟化酶是alkB型的烷烃羟化酶。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶是选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体的酶。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶是FadE。
9.敲除催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶的用途，其作为用于从含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的代谢活性细胞的基因组成的部分，所述细胞是低级真核细胞或者原核细胞，并且所述细胞含有重组的烷烃羟化酶，并且所述烷烃羟化酶是alkB型的烷烃羟化酶。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶是选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体的酶。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述催化脂肪酸的ß-氧化反应的酶是FadE。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述代谢活性细胞还包含转氨酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述代谢活性细胞还包含选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和内酰胺水解酶的至少一种酶。
14.根据权利要求6～11中任一项所述的用途，其中所述代谢活性细胞还包含转氨酶。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述代谢活性细胞还包含选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和内酰胺水解酶的至少一种酶。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌。
17.根据权利要求6～11中任一项所述的用途，其中所述细胞是大肠杆菌。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是重组细胞。
19.根据权利要求6～11中任一项所述的用途，其中所述细胞是重组细胞。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述疏水性有机溶液构成疏水性有机溶液和水性培养基的总体积的至少5％。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述疏水性有机溶液构成疏水性有机溶液和水性培养基的总体积的至少20％。
22.根据权利要求6～11中任一项所述的用途，其中所述疏水性有机溶液构成疏水性有机溶液和水性培养基的总体积的至少5％。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述疏水性有机溶液构成疏水性有机溶液和水性培养基的总体积的至少20％。
24.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在接触时，所述水性培养基的pH值在5～9之间。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，在接触时，所述水性培养基的pH值在6～8之间。
26.根据权利要求6～11中任一项所述的用途，其中，在接触时，所述水性培养基的pH值在5～9之间。
27.根据权利要求26所述的用途，其中，在接触时，所述水性培养基的pH值在6～8之间。
CN201810198137.0A 2011-12-22 2012-12-21 用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法 Active CN108358800B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11195221.4 2011-12-22
EP11195221.4A EP2607490A1 (de) 2011-12-22 2011-12-22 Verfahren zur verbesserten Abtrennung einer hydrophoben organischen Lösung von einem wässrigen Kulturmedium
CN2012105994118A CN103254089A (zh) 2011-12-22 2012-12-21 用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012105994118A Division CN103254089A (zh) 2011-12-22 2012-12-21 用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108358800A true CN108358800A (zh) 2018-08-03
CN108358800B CN108358800B (zh) 2023-02-17

Family

ID=47351527

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012105994118A Pending CN103254089A (zh) 2011-12-22 2012-12-21 用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法
CN201810198137.0A Active CN108358800B (zh) 2011-12-22 2012-12-21 用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012105994118A Pending CN103254089A (zh) 2011-12-22 2012-12-21 用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9249435B2 (zh)
EP (3) EP2607490A1 (zh)
JP (1) JP6312117B2 (zh)
KR (1) KR102000317B1 (zh)
CN (2) CN103254089A (zh)
BR (1) BR112014015202B1 (zh)
CA (1) CA2799883C (zh)
ES (1) ES2688295T3 (zh)
MX (1) MX339910B (zh)
SG (1) SG11201403495QA (zh)
WO (1) WO2013092547A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114174309A (zh) * 2019-07-29 2022-03-11 赢创运营有限公司 从水性培养基中萃取碳酸、脂族酸、酯和醇的方法

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
UA112980C2 (uk) 2011-02-16 2016-11-25 Евонік Дегусса Гмбх Рідкі катіоніти
CN103459398B (zh) 2011-04-12 2016-06-15 赢创德固赛有限公司 借助含有氮氧自由基的催化剂制造羰基化合物的可连续运行的方法
EP2540170A1 (de) 2011-06-29 2013-01-02 Evonik Degussa GmbH Dermatologisch wirksamer Hefeextrakt
CA2842000A1 (en) 2011-07-20 2013-01-24 Evonik Degussa Gmbh Oxidation and amination of primary alcohols
EP2602328A1 (de) 2011-12-05 2013-06-12 Evonik Industries AG Verfahren zur Oxidation von Alkanen unter Verwendung einer AlkB Alkan 1-Monooxygenase
EP2607479A1 (en) 2011-12-22 2013-06-26 Evonik Industries AG Biotechnological production of alcohols and derivatives thereof
EP2631298A1 (en) 2012-02-22 2013-08-28 Evonik Industries AG Biotechnological method for producing butanol and butyric acid
EP2639308A1 (de) 2012-03-12 2013-09-18 Evonik Industries AG Enzymatische omega-Oxidation und -Aminierung von Fettsäuren
EP2647696A1 (de) 2012-04-02 2013-10-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur aeroben Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung
DE102012207921A1 (de) 2012-05-11 2013-11-14 Evonik Industries Ag Mehrstufiges Syntheseverfahren mit Synthesegas
EP2700448A1 (de) 2012-08-21 2014-02-26 Evonik Industries AG Verzweigte Fettsäuren als flüssige Kationenaustauscher
ES2531144T3 (es) 2012-09-07 2015-03-11 Evonik Industries Ag Composiciones curables a base de resinas epoxídicas sin alcohol bencílico
EP2730655A1 (de) 2012-11-12 2014-05-14 Evonik Industries AG Verfahren zur Umsetzung eines Carbonsäureesters unter Verwendung BioH-defizienter Zellen
EP2746397A1 (de) 2012-12-21 2014-06-25 Evonik Industries AG Herstellung von Omega-Aminofettsäuren
EP2746400A1 (de) 2012-12-21 2014-06-25 Evonik Industries AG Herstellung von Aminen und Diaminen aus einer Carbonsäure oder Dicarbonsäure oder eines Monoesters davon
EP2759598A1 (de) 2013-01-24 2014-07-30 Evonik Industries AG Verfahren zur Herstellung von alpha, omega-Alkandiol
EP2944697A1 (en) 2014-05-13 2015-11-18 Evonik Degussa GmbH Method of producing nylon
US11174496B2 (en) 2015-12-17 2021-11-16 Evonik Operations Gmbh Genetically modified acetogenic cell
EP3336180A1 (en) 2016-07-04 2018-06-20 Evonik Degussa GmbH Mutant alkb gene
US11124813B2 (en) 2016-07-27 2021-09-21 Evonik Operations Gmbh N-acetyl homoserine
EP4003947B1 (en) 2019-07-29 2025-09-03 Evonik Operations GmbH Extraction of aliphatic alcohols

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010021711A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of mixed fatty esters

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6245214B1 (en) 1998-09-18 2001-06-12 Alliedsignal Inc. Electro-catalytic oxidation (ECO) device to remove CO from reformate for fuel cell application
DE10054347A1 (de) 2000-11-02 2002-05-08 Degussa Verfahren zur katalytischen Hydrierung organischer Verbindungen und Trägerkatalysatoren hierfür
DE10142621A1 (de) 2001-08-31 2003-03-20 Degussa Aufarbeitung der Ammoximationsprodukte von Ketonen durch Flüssig-Flüssig-Extraktion in einem ternären Lösemittelsystem
DE10142620A1 (de) 2001-08-31 2003-03-20 Degussa Ammoximation von Ketonen und Aufarbeitung durch Pervaporation/Dampfpermeation
DE50213288D1 (de) 2002-05-31 2009-04-02 Evonik Degussa Gmbh Geträgerter Rutheniumkatalysator und Verfahren zur Hydrierung eines aromatischen Amins in Gegenwart dieses Katalysators
DE10231119A1 (de) 2002-07-10 2004-02-05 Degussa Ag Verfahren zur Selektivitätserhöhung der Hydrierung von 4,4'-Diaminodiphenylmethan zu 4,4'-Diaminodicyclohexylmethan in Gegenwart eines N-Alkyl-4,4'-Diaminodiphenylmethans
DE10247495A1 (de) 2002-10-11 2004-04-22 Degussa Ag Verfahren zur Epoxidierung cyclischer Alkene
EP1424332A1 (en) 2002-11-26 2004-06-02 Degussa AG Process for the purification of crude propene oxide
US6878836B2 (en) 2003-06-18 2005-04-12 Degussa Ag Process for the epoxidation of propene
DE102006017760A1 (de) 2006-03-24 2007-09-27 Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren
EP2024501B1 (en) 2006-05-11 2016-11-16 Evonik Degussa GmbH Improved production of sphingoid bases using genetically engineered microbial strains
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
DE102007021199B4 (de) 2006-07-17 2016-02-11 Evonik Degussa Gmbh Zusammensetzungen aus organischem Polymer als Matrix und anorganischen Partikeln als Füllstoff, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung und damit hergestellte Formkörper
DE102007027006A1 (de) 2007-06-08 2008-12-11 Evonik Degussa Gmbh Mikrobiologische Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3-Hydroxypropionaldehyd
DE102007052463A1 (de) 2007-11-02 2009-05-07 Evonik Degussa Gmbh Fermentative Gewinnung von Aceton aus erneuerbaren Rohstoffen mittels neuen Stoffwechselweges
DE102007060705A1 (de) 2007-12-17 2009-06-18 Evonik Degussa Gmbh ω-Aminocarbonsäuren oder ihre Lactame, herstellende, rekombinante Zellen
EP2241621B1 (en) * 2007-12-28 2012-08-15 Ikeda Food Research Co. Ltd. Modified glucose dehydrogenase gene
DE102008002090A1 (de) 2008-05-30 2009-12-03 Evonik Degussa Gmbh Ungesättigte Dicarbonsäuren aus ungesättigten cyclischen Kohlenwasserstoffen und Acrylsäure mittels Metathese, deren Verwendung als Monomere für Polyamide, Polyester, Polyurethane sowie weitere Umsetzung zu DIolen und Diaminen
DE102008002715A1 (de) 2008-06-27 2009-12-31 Evonik Röhm Gmbh 2-Hydroxyisobuttersäure produzierende rekombinante Zelle
DE102008040193A1 (de) 2008-07-04 2010-01-07 Evonik Röhm Gmbh Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren
DE102008040415A1 (de) 2008-07-15 2010-01-21 Evonik Röhm Gmbh Thermisches Salzspalten von Ammoniumcarboxylaten
DE102009000592A1 (de) 2009-02-04 2010-08-05 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aminogruppen tragenden, multizyklischen Ringsystemen
DE102009000661A1 (de) 2009-02-06 2010-08-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von 2,6-Dioxabicyclo-(3.3.0)-octan-4,8-dion[1S,5S]
DE102009000662A1 (de) 2009-02-06 2010-08-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aldehyden und Ketonen aus primären und sekundären Alkoholen
DE102009009580A1 (de) 2009-02-19 2010-08-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung freier Säuren aus ihren Salzen
DE102009002371A1 (de) 2009-04-15 2010-10-21 Evonik Goldschmidt Gmbh Verfahren zur Herstellung von geruchlosen Polyetheralkoholen mittels DMC-Katalysatoren und deren Verwendung in kosmetischen und/oder dermatologischen Zubereitungen
CA2759273C (en) * 2009-04-27 2018-01-09 Ls9, Inc. Production of fatty acid esters
DE102009002811A1 (de) 2009-05-05 2010-11-11 Evonik Degussa Gmbh Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Aldehyden
DE102009046626A1 (de) 2009-11-11 2011-05-12 Evonik Degussa Gmbh Candida tropicalis Zellen und deren Verwendung
DE102009046910A1 (de) 2009-11-20 2011-05-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Aufarbeitung eines Laurinlactam enthaltenen Stoffstroms für die Rückgewinnung aller enthaltene Wertstoffkomponenten durch Kombination von Kristallisation mit nachgeschalteter Destillation
AU2010335313C1 (en) 2009-12-23 2015-07-02 Evonik Operations Gmbh Sweetener and method for the production thereof
DE102010015807A1 (de) 2010-04-20 2011-10-20 Evonik Degussa Gmbh Biokatalytisches Oxidationsverfahren mit alkL-Genprodukt
DE102010023749A1 (de) 2010-06-14 2011-12-15 Evonik Degussa Gmbh Zelle und Verfahren zur Herstellung von Resveratrol
WO2011157573A2 (de) 2010-06-14 2011-12-22 Evonik Röhm Gmbh Ein enzym zur herstellung von methylmalonatsemialdehyd
DE102010026196A1 (de) 2010-06-25 2011-12-29 Evonik Degussa Gmbh Synthese von omega-Aminocarbonsäuren und deren Estern aus ungesättigten Fettsäurederivaten
UA112980C2 (uk) 2011-02-16 2016-11-25 Евонік Дегусса Гмбх Рідкі катіоніти
DE102011015150A1 (de) 2011-03-25 2012-09-27 Evonik Degussa Gmbh Syntese von alpha, omega-Dicarbonsäuren und deren Estern aus ungesättigten Fettsäurederivaten
CN103459398B (zh) 2011-04-12 2016-06-15 赢创德固赛有限公司 借助含有氮氧自由基的催化剂制造羰基化合物的可连续运行的方法
EP2557176A1 (en) 2011-06-15 2013-02-13 Evonik Degussa GmbH Enzymatic amination
CA2842000A1 (en) 2011-07-20 2013-01-24 Evonik Degussa Gmbh Oxidation and amination of primary alcohols
BR112014002732A8 (pt) 2011-08-05 2017-06-20 Evonik Degussa Gmbh oxidação e aminação de álcoois secundários
DE102011110945A1 (de) 2011-08-15 2013-02-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von organischen Verbindungen mit alkIL-Genprodukt
DE102011110946A1 (de) 2011-08-15 2016-01-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von omegafunktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen
EP2730655A1 (de) 2012-11-12 2014-05-14 Evonik Industries AG Verfahren zur Umsetzung eines Carbonsäureesters unter Verwendung BioH-defizienter Zellen
EP2746397A1 (de) 2012-12-21 2014-06-25 Evonik Industries AG Herstellung von Omega-Aminofettsäuren
DE102013203470A1 (de) 2013-03-01 2014-09-04 Evonik Industries Ag Verfahren zur Herstellung von Ketonen aus Epoxiden

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010021711A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of mixed fatty esters

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERIC J.STEEN 等: "Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass", 《NATURE》 *
XUEFENG LU 等: "De novo Biosynthesis of Biodiesel by Escherichia coli in Optimized Fed-Batch Cultivation", 《PLOS ONE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114174309A (zh) * 2019-07-29 2022-03-11 赢创运营有限公司 从水性培养基中萃取碳酸、脂族酸、酯和醇的方法

Also Published As

Publication number Publication date
MX2012015064A (es) 2013-10-16
EP2607490A1 (de) 2013-06-26
EP2607491A1 (de) 2013-06-26
CA2799883C (en) 2020-09-22
BR112014015202A8 (pt) 2017-06-13
KR20140111653A (ko) 2014-09-19
BR112014015202B1 (pt) 2021-11-03
US9249435B2 (en) 2016-02-02
EP2794898A1 (de) 2014-10-29
KR102000317B1 (ko) 2019-07-15
JP6312117B2 (ja) 2018-04-18
CN103254089A (zh) 2013-08-21
EP2794898B1 (de) 2018-08-01
ES2688295T3 (es) 2018-10-31
MX339910B (es) 2016-06-15
CA2799883A1 (en) 2013-06-22
CN108358800B (zh) 2023-02-17
JP2013132295A (ja) 2013-07-08
BR112014015202A2 (pt) 2017-06-13
US20130164797A1 (en) 2013-06-27
SG11201403495QA (en) 2014-09-26
WO2013092547A1 (de) 2013-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108358800A (zh) 用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法
JP6898365B2 (ja) 組換え微生物およびその使用方法
US11421254B2 (en) Biotechnological production of alcohols and derivatives thereof
CN103881933B (zh) ω-氨基脂肪酸的生产
CN103361389B (zh) 丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的好氧生产方法
AU2006317058A1 (en) Malic acid production in recombinant yeast
AU2021225189A1 (en) Increasing lipid production in oleaginous yeast
EP2788494A1 (de) Biotechnologische herstellung von 3-hydroxyisobuttersäure
CN112126610A (zh) 一种用于生产羟基酪醇的工程菌
EP2357222A1 (en) Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells
CN109072264A (zh) 不饱和氨基酸
CN111471634A (zh) 遗传改造枯草芽孢杆菌的方法及其获得的菌株和应用
HK1259258B (zh) 用於从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法
CN116783281A (zh) 用于制备酰胺化合物的方法和组合物
HK1259258A1 (zh) 用於从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法
HK1188438A (zh) 用於从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法
CN113383073A (zh) 二羧酸合成相关酶及使用其生产二羧酸的方法
CN112779199A (zh) 一种表达亚磷酸盐脱氢酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
HK1206784B (zh) 丙氨酸的好氧生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1259258

Country of ref document: HK

CB02 Change of applicant information

Address after: Essen, Germany

Applicant after: Evonik Operations Ltd.

Address before: Essen, Germany

Applicant before: EVONIK DEGUSSA GmbH

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant