MX2012015064A - Proceso para la separacion mejorada de una solucion organica hidrofobica de un medio de cultivo acuoso. - Google Patents

Abstract

La presente invención es concerniente con un proceso para la separación mejorada de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso, que comprende las etapas de: provisión de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa, contacto el medio de cultivo acuoso con una solución orgánica hidrofóbica, separación de la solución orgánica hidrofóbica del medio de cultivo acuoso, la célula tiene actividad disminuida, en comparación con su tipo silvestre, por lo menos una enzima que cataliza una de las reacciones de la beta-oxidación de ácidos grasos. La invención es concerniente además con el uso de una célula metabólicamente activa que tiene actividad disminuida, en comparación con su tipo silvestre, de una enzima que cataliza una de las reacciones de la beta-oxidación de ácidos grasos, preferiblemente de una enzima seleccionada del grupo que comprende FadA, FadB, FadO, FadL y FadE, también como variantes de las mismas, más preferiblemente FadE o una variante de la misma, para la separación mejorada de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso que comprende la célula metabólicamente activa.

Description

PROCESO PARA LA SEPARACIÓN MEJORADA DE UNA SOLUCIÓN ORGÁNICA HIDROFÓBICA DE UN MEDIO DE CULTIVO ACUOSO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente solicitud es concerniente con un proceso para la separación mejorada de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso que comprende las etapas de provisión de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa, poner en contacto el medio de cultivo acuoso con una solución orgánica hidrofóbica, separación de la solución orgánica hidrofóbica del medio de cultivo acuoso, la célula teniendo una actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre, por lo menos una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos. La invención es concerniente además con el uso de una célula metabólicamente activa que tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre, de una enzima que cataliza una de las reacciones de ß-oxidación de ácidos grasos, preferiblemente de una enzima seleccionada del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadL y FadE también como variantes de las mismas, más preferiblemente FadE para la separación mejorada de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso que comprende la célula metabólicamente activa.

Un problema fundamental en procesos para la producción de químicos finos que inician de materias primas renovables en lugar de combustibles fósiles consiste en convertir el producto una vez obtenido que esta comúnmente presente al inicio en una fase acuosa de gran volumen a una fase orgánica hidrofóbica. Esta conversión es necesaria por una parte para concentrar un producto intermedio terminado o producto final y opcionalmente hacer posible el procesamiento sintético en las siguientes etapas en reacción orgánica y por otra parte para mejorar el rendimiento de reacción en la fase acuosa por la remoción del producto deseado o en primer lugar para hacer posible el curso de la reacción en un contexto técnicamente significativo, en particular cuando la presencia del producto actúa desventajosamente en el avance de la reacción a cuenta de la toxicidad a la cepa de producción o una inhibición de un biocatalizador relevante por el producto. La concentración térmica directa del producto, frecuentemente presente en bajas concentraciones, de la solución acuosa de volumen grande en general no es rápida.

Un ejemplo de tal producto fuertemente demandado en la industria, que es producido convencionalmente partiendo de hidrocarburos contenidos en el petróleo es acido 2-aminoláurico (ALA) o su éster de metilo (ALAME) . ALA es un producto de partida importante en la producción de polímeros, por ejemplo, para la producción de sistema de tubería a base de nylon. Convencionalmente, ALA es producido en bajo rendimiento partiendo de materias primas fósiles en un proceso vía laurolactama, que es sintetizada mediante trimerización de butadieno, subsecuente hidrogenación con formación de ciclododecano, subsecuente oxidación a ciclododecanona, reacción con hidroxilamina y re arreglo de Beckmann subsecuente. Una nueva ruta promisoria a la producción biotecnología de ALA o ALA E es descrita en WO 009/077461. El proceso biotecnológico en el cual esta ruta está basado se puede llevar a cabo en un sistema de dos fases usando un intercambiador de ion líquido, como se describe en EP 11154707.

El laboreo de un producto de una fase acuosa por medio de una extracción a una fase orgánica hidrofóbica requiere en primer lugar que este producto tenga una tendencia apropiada para entrar a la fase orgánica en un sistema de .dos fases que comprende una fase hidrofílica acuosa y una fase hidrofóbica orgánica que no se mezcla, que depende significativamente de las propiedades fisicoquímicas del compuesto respectivo. Mientras que los compuestos con un alto contenido de o que consisten exclusivamente de hidrocarburos sin sustituir enriquecen principalmente la fase hidrofóbica, compuestos con un alto contenido de grupos polares tales como funcionalidades que contienen heteroátomo y muy en particular compuestos con cargas son principalmente o virtualmente de manera exclusiva presentes en la fase acuosa, lo que complica la transferencia a una fase orgánica.

La división de un compuesto en el sistema de dos fases mencionado después del ajuste del equilibrio es frecuentemente descrita con la ayuda de coeficientes partición, por ejemplo de acuerdo con la ecuación de Nernst Un coeficiente de partición especial es Ko ¡, también descrito como el valor de P que caracteriza el equilibrio de partición de un compuesto entre un octanol y una fase acuosa: "¦ow— — ^octanol/ agua Un pre-requisito adicional para el laboreo del producto de la fase hidrofóbica consiste en que la partición haya alcanzado el estado de equilibrio que es descrito por las ecuaciones mencionadas anteriormente o por lo menos se aproxime suficientemente. El ajuste del equilibrio es determinado, ínter alia, por el tamaño del área de contacto entre ambas fases, un factor que es en general no limitante en el caso de procesos biotecnológicos, puesto que el área de contacto ya es incrementada por medidas tales como aireación y la agitación completa del medio de cultivo acuoso y la solución orgánica hidrofóbica, que son necesarias de cualquier manera debido al mantenimiento de altas densidades de células metabólicámente activas.

Antes de tal mezcla de reacción, en la cual la solución orgánica hidrofóbica esta principalmente presente en micelas u otros sub-compartimientos, puede ser trabajada eficientemente, sin embargo, la separación de las dos fases es necesaria. Si la formación de dos fases frecuentemente toman lugar espontáneamente y si ningún acción adicional sobre la mezcla de agua pura con un solvente hidrofóbico orgánico puro, la separación de una solución hidrofóbica orgánica de un medio de cultivo acuoso completo es menos simple a cuenta de las muchas interacciones posible y sin el soporte técnico, por ejemplo mediante centrifugación, puede durar varias horas o aun días.

Para la producción a gran escala de compuestos químicos demandados industrialmente por medio de procesos biotecnológicos, el proceso de separación de fase es un factor de considerable importancia contra este antecedente en desarrollo de aplicación de procesos para el ahorro de recursos y producción rápida y laboreo de compuestos tal como ALA. Si el producto regularmente tiene que ser removido disuelto en una solución orgánica hidrofóbica de una fase acuosa de gran volumen en un reactor grande y subsecuentemente procesado, además de los parámetros relevantes a la producción real tal como tipo y cantidad de sustratos, temperatura y contenido de oxigeno del medio, la separación de la solución hidrofóbica tiene también que se optimizada para ahorrar recursos y para hacer a todo el proceso tan compatible ambientalmente como sea posible. No como mínimo, se mencionara que numerosos solventes orgánicos hidrofóbicos usados a gran escala tienen una acción toxica sobre organismos usados biotecnológicamente, por lo menos en el contacto relativamente largo y también es deseable contra estos antecedentes acortar el contacto entre el organismo el medio de cultivo acuoso y solventes para la protección de las cepas usadas biotecnológicamente e impedir que productos secundarios indeseables liberados durante la lisis de las células contaminen o aun descompongan el producto objetivo.

La presente invención esta por consiguiente basada en el objeto de hacer disponible un proceso para la preparación mejorada y producción de productos producidos biotecnológicamente en un sistema bifásico que comprende un medio de cultivo acuoso utilizando una célula metabólicamente activa y una solución orgánica hidrofóbica. En particular, el objeto es mejorar la separación de la solución orgánica hidrofóbica y la extracción de un producto biotecnológicamente producido soluble en el mismo con respecto a la rapidez del proceso y/o extensión de la separación de la solución orgánica hidrofóbica de medio de cultivo acuoso en una ventana de tiempo dada.

Un objeto adicional en el cual la presente invención está basada consiste en hacer disponible una célula usable biotecnológicamente con alta resistencia contra las toxicidad a tal célula que emana de soluciones hidrofóbicas .

La presente invención está basada además en el objeto de hacer disponible un proceso biotecnológico para la producción de compuestos hidrofóbicos en el cual el consumo de oxigeno es reducido y una célula apropiada para este propósito.

Este y otros objetos son obtenidos por la materia de la presente solicitud y en particular también por la materia de las reivindicaciones independientes adjuntas, modalidades que resultan de las reivindicaciones dependientes.

El objeto en el cual la invención está basada es obtenido en un primer aspecto por un proceso que comprende las etapas de: a) provisión de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa, b) poner en contacto el medio de cultivo acuoso con una solución orgánica hidrofóbica, c) separación de la solución orgánica hidrofóbica del medio de cultivo acuoso, la célula tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre, por lo menos de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos.

En una primera modalidad del primer aspecto, la enzima que cataliza una de las reacciones de ß-oxidación de ácidos grasos es una enzima del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL, también como variantes de las mismas, preferiblemente FadE o una variante de la misma.

En una segunda modalidad del primer aspecto, se describe un proceso, la solución orgánica comprende por lo menos un solvente del grupo que comprende alcanos, cicloalcanos, cicloalcanos, arilos, ácidos grasos, esteres de ácidos grasos, alcoholes, heterocicloalcanos , heterocicloalquenos y heteroarilos líquidos sustituidos y sin sustituir a temperatura ambiente.

En una tercera modalidad del primer aspecto, la invención es concerniente con un proceso, la solución orgánica comprende un ácido graso que tiene más de 12 átomos de carbono o un éster del mismo, preferiblemente ácido oleico, ácido erúcico o metil éster de ácido laurido.

En una cuarta modalidad del primer aspecto, la célula contiene una alcano hidroxilasa recombinante .

El objeto en el cual la invención está basada es obtenido en un segundo aspecto mediante el uso de una célula metabólicamente activa que tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre de una enzima que cataliza una de las regiones de la ß-oxidación de ácidos grasos, preferiblemente de una enzima seleccionada del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL también como variantes de los mismos, más preferiblemente FadE para mejorar la separación de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso que comprende la célula metabólicamente activa.

El objeto en el cual la invención está basada es obtenido en un tercer aspecto por el uso de un knock out de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos, preferiblemente una enzima seleccionada del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL, también como variantes de las mismas, aun más preferiblemente FadE o una variante de la misma, como parte de la composición genética de una célula metabólicamente activa para mejorar la separación de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso que comprende la célula metabólicamente activa.

El objeto en el cual la invención está basada es obtenido de un cuarto aspecto por una célula que tiene actividad disminuida, en comparación con su tipo silvestre de una enzima que cataliza una de las regiones de la ß-oxidación de ácidos grasos, que comprende además una monoxigenasa recombinante, más preferiblemente un alcano hidroxilasa.

En una primera modalidad del cuarto aspecto, el objeto es obtenido por una célula, la enzima que cataliza una de las regiones de la ß-oxidación de ácidos grasos es una enzima del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL también como variantes de las mismas, más preferiblemente FadE o una variante de la misma.

El objeto en el cual la invención está basada es obtenido de un quinto aspecto por una mezcla de reacción que comprende una solución acuosa que contiene una célula metabólicamente activa y una solución orgánica hidrofóbica, la célula tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos.

En una primera modalidad del quinto aspecto, el objeto es obtenido por una mezcla de reacción, la enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos es una enzima del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL, también como variantes de las mismas, más preferiblemente FadE o una variante de la misma.

En una segunda modalidad del quinto aspecto, el objeto es obtenido por mezcla de reacción, la solución orgánica hidrofóbica que comprende por lo menos un solvente del grupo que comprende alcanos, cicloalcanos, cicloalcanos, arilos, ácidos grasos, esteres de ácidos grasos, alcoholes, heterocicloalcanos , heterocicloalquenos y heteroarilos líquidos sustituidos y sin sustituir a temperatura ambiente.

En una tercera modalidad del quinto aspecto, el objeto es obtenido por una mezcla de reacción, la solución orgánica hidrofóbica que comprende un ácido graso que tiene más de 12 átomos de carbono o un éster del mismo, preferiblemente ácido oleico, ácido erúcico o metil éster de ácido láurico.

En una modalidad adicional del primero, segundo, tercero, cuarto o quinto aspecto, el objeto es obtenido por un proceso, un uso o una mezcla de reacción, la célula metabólicamente activa es una célula que contiene una alcano hidroxilasa recombinante y una transaminasa, preferiblemente además por lo menos una enzima del grupo que comprende alcohol deshidrogenasa, alanina deshidrogenasa y lactama hidrolasa .

En una modalidad adicional del primer, segundo, tercero, cuarto o quinto aspecto, el objeto es obtenido por un proceso un uso o mezcla de reacción, la célula es una célula procariontica inferior, preferiblemente E. coli.

En una modalidad adicional del primero, segundo, tercero, cuarto o quinto aspecto, el objeto es obtenido por un proceso, un uso o una mezcla de reacción, la célula es una célula recombinante.

En una modalidad adicional, del primero, segundo, tercero, cuarto o quinto aspecto, el objeto es obtenido por un proceso, un uso o una mezcla de reacción, la solución orgánica hidrofóbica que compone por lo menos 5, preferiblemente por lo menos 20 por ciento del volumen total de solución orgánica hidrofóbica del medio de cultivo acuoso.

En una modalidad del primero, segundo, tercero, cuarto o quinto aspecto, el objeto es obtenido por un proceso, un uso o mezcla de reacción, el pH del medio de cultivo acuoso al tiempo de contacto es de entre 5 y 9, más preferiblemente 6 y 8.

Los inventores de la presente invención han descubierto que una solución orgánica hidrofóbica puede sorprendentemente ser separada de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa y la célula metabólicamente activa tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre, por lo menos de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos.

Además, los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que una célula metabólicamente activa que tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre, por lo menos de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos tiene una demanda de oxigeno más baja y una proporción más alta de rendimiento de productos al consumo de oxigeno en un proceso biotecnológico con capacidad de producción comparable con respecto al producto objetivo.

Sin desear estar limitados a alguna teoría, los inventores sospechan que la actividad disminuida de por lo menos una de las enzimas que catalizan una de las reacciones de la ß-oxidación conduce a la concentración de metabolitos hasta ahora no identificados, que actúan como detergentes, siendo disminuidos en el medio de cultivo acuoso, de tal manera que por una parte del área de contacto entre la solución hidrofóbica y las células metabólicamente activas solvente-sensibles encontradas en el medio de cultivo acuoso es disminuido en el cultivo de células con agitación del medio. Lo que conduce a una reducción de la tensión del solvente para las células y por otra parte la formación de fases separadas es removida del aparato de agitación.

Las enseñanzas de acuerdo con la invención pueden ser usadas para mejorar todos los procesos biotecnológicos que comprenden la producción de productos tales como químicos finos, utilizando una célula metabólicamente activa, el cultivo de la misma en un medio acuoso y el laboreo del producto utilizando una solución orgánica hidrofóbica. En una modalidad preferida, el término "célula metabólicamente activa" como se usa en la presente se entiende que significa una célula viviente con actividad metabólica, preferiblemente una célula que expresa o más preferiblemente sobre expresa una enzima relevante para la producción biotecnológica del producto de interés en forma activa. La célula puede ser un procarionte incluyendo arquea o un eucarionte, en el caso de un procarionte preferiblemente del grupo de géneros que comprenden Pseudomonas, Corynebacterium y Escherichia. En una modalidad aún más preferida, la célula es una célula bacteriana, aun más preferiblemente una célula bacteriana gram-negativa, más preferiblemente E. coli. En una modalidad preferida adicional, es una célula eucariontica . Mas preferiblemente una célula fungal, aún más preferiblemente una célula de levadura, más preferiblemente Saccharomyces o Candida, Pichia en particular Candida tropicalis. En una modalidad preferida, el término "eucarionte inferior", como se usa en la presente, significa un eucarionte que es unicelular en todas las fases de su existencia, en contraste con eucariontes superiores, que pasan la mayor parte de su vida en forma de un organismo multicelular con tejidos que comprenden células diferenciadas. El término "célula" es usado en una modalidad particular como sinónimo y de manera intercambiable con el término "microorganismo" en esta solicitud. Además, la célula puede ser una célula aislada o una mezcla de células diferentes.

Numerosos medios de cultivo acuosos son conocidos para la persona experimentada en el arte que son apropiados para el mantenimiento o cultivo de células, en particular células biotecnológicamente importantes. Entre estos están medios igualmente completos tales como medio LB, medio mínimos tal como medio M9 también como medios selectivos, por ejemplo, aquellos que contienen una alta concentración de sal y por consiguiente solo hacen posible el cultivo de organismos halofílicos o por lo menos organismos halotolerantes . En una modalidad preferida, el término "medio de cultivo acuoso" como se usa en la presente, se entiende que significa un medio de reacción a base de agua, que con respecto a todos los factores relevantes, en particular pH, contenido de sal y temperatura, es constituido de tal manera que mantiene o promueve la viabilidad de células contenidas en el mismo, preferiblemente microorganismos y tanto medio de cultivo acuoso como fase orgánica hidrofóbica están presentes en forma liquida. Las demandas de temperatura de varias células biotecnológicamente importantes pueden ser inferidas de libros de texto microbiológicos y biológicos moleculares, por ejemplo Fuchs/Schlegl, 2008. En una modalidad preferida, el pH del medio de cultivo acuoso al tiempo de contacto es de entre 4 y 9,· más preferiblemente entre 4.5 y 8.5, más preferiblemente entre 6.5 y 7.5. En una modalidad preferida, adicional, la temperatura es de entre 0 y 45°C, más preferiblemente entre 15 y 40°C, más preferiblemente entre 20 y 37°C.

Numerosos solventes que pueden ser usados para preparar una solución orgánica hidrofóbica son conocidos para la persona experimentada en el arte. En una modalidad preferida, el término "hidrofóbico" como se usa en la presente, se entiende que significa la propiedad de un liquido de formar en el estado liquido, en presencia de una fase acuosa liquida, una fase liquida separada delineada claramente de la fase acuosa. La ultima puede ser una fase liquida coherente o una emulsión. En una modalidad preferida adicional, el término "hidrofóbico" como se usa en la presente, se entiende que significa la propiedad de un compuesto de esencialmente n o disolverse en agua. Finalmente, se entiende que el termino significa en una modalidad preferida adicional, como se usa en la presente, que un compuesto designado de este tipo tiene un valor P (J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficientes : Fundamentáis and Physical Chemistry, Vol. 2 de Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997), el logaritmo decimal del cual es mayor de 0, preferiblemente mayor de 0.5, aun más preferiblemente mayor de 1 y más preferiblemente mayor de 2. Solventes orgánicos preferidos comprenden pero no están restringidos a solventes del grupo que comprende alcanos sustituidos y sin sustituir, cicloalcanos , cicloalquenos, arilos, ácidos grasos, esteres de ácido graso, alcoholes, heterocicloalcanos, heterocicloalquenos y heteroarilos líquidos a temperatura ambiente. La solución orgánica hidrofóbica puede también ser una mezcla que comprende más de un solvente orgánico hidrofóbico.

La ß-oxidación de ácidos grasos es una ruta metabólica extendida que permite igualmente que organismos procarionticos y eucarionticos oxiden ácidos grasos y hagan la energía contenida en los mismos disponible al metabolismo (Fujita et al., 2007). En un sentido más amplio, comienza con la absorción de un ácido graso a la célula, en el caso de E. coli por el transportador FadL (Black, 1991) que lo encausa a través de la membrana externa e interna de la célula bacteriana gram-negativa y el producto genético FadD (Black et al., 1992) que libera el ácido graso en forma del éster de CoA al citosol. Ahí el ácido graso, si las condiciones lo necesitan, es primero oxidado en la posición ß del éster de ácido graso de CoA por una acil-CoA deshidrogenasa, en el caso de E. coli FadE (Campbell y Cronan, 2002) . Una molécula similar puede alternativamente ser formada de un ácido graso doblemente insaturado mediante reducción por medio de una 2, 4-dienoil-CoA reductasa, con E. coli FadH. Una enzima multifuncional, enoil-CoA hidratasa/3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa con FadB de E. coli cataliza subsecuentemente la hidratación con formación del alcohol secundario y su oxidación subsecuente a la cetona. En la última etapa, una 3-cetoacil-CoA tiolasa, en el caso de FadA de E. coli cataliza la escisión de la cetoacil-CoA con el resultado de que acetil-CoA y un éster de CoA del ácido graso más corto por dos átomos de carbono en comparación con la molécula de partida son liberados. Si no es a si mismo acetil-CoA, el ultimo puede otra vez ser alimentado al ciclo de ß-oxidación y acortado con oxidación. FadR, un regulador del operón de Fad, esta también involucrado en la regulación de la ß-oxidación de ácidos grasos, que comprende los genes necesarios para la degradación de ácidos grasos, sin FadR que cataliza la reacción de la ß-oxidación. En una modalidad preferida, el término "enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos" se entiende que significa cualquier enzima que interactúa directamente con el sustrato de ácido graso o una molécula resultante del mismo en la ruta al acetil-CoA, preferiblemente lo reconoce como sustrato y cataliza su conversión a un producto metabólico que yace más cercano al acetil-CoA en esta ruta de degradación, preferiblemente incluyendo el importador de ácido graso, que efectúa la absorción del ácido graso a la célula. Por ejemplo, la acil-CoA deshidrogenasa cuenta entre estas enzimas de acuerdo con la definición precedente puesto que interactúa con el éster de ácido graso de CoA y cataliza su conversión al enoil-CoA que cae más cercano al acetil-CoA que el éster de ácido graso de CoA en la ruta metabólica de la ß-oxidación. En una modalidad particularmente preferida, el término "enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos", como se usa en la presente se entiende que significa cualquier enzima del grupo que comprende los productos genéticos FadA, FadB, FadD, FadL y FadE de E. coli y/o sus variantes homólogos de otros organismos. Los productos genéticos FadA, FadB, FadD, FadL y FadE de E. coli también como variantes y homólogos de otros numerosos organismos utilizables biotecnológicamente y sus secuencias de ácido nucleico y polipéptidos son descritos en el arte previo, por ejemplo FadA bajo el número de acceso AP009048.1, FadB bajo el número de acceso BAE77457.1, FadD bajo el número de acceso BAA15609.1, FadE bajo el número de acceso BAA77891.2 y FadL bajo el número de acceso BAA16205.1.

Las enseñanzas de la presente invención no pueden solo ser llevadas a cabo o aplicadas utilizando las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos exactas de las macromoléculas biológicas descritas en la presente, por ejemplo mediante knock-out de un gen que codifica una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación, sino también con el uso de variantes de tales macromoléculas que pueden ser obtenidas mediante cancelación, adición o sustitución de uno o más amino ácidos o ácidos nucleicos. En una modalidad preferida, el término "variante" denota una secuencia de ácido nucleico o secuencia de amino ácidos usados a continuación como sinónimos intercambiablemente con el término "homologo" como se usa en la presente, otras secuencias de ácidos nucleicos o amino ácidos, que con respecto a la secuencia de ácido nucleico o amino ácidos tipo silvestre original correspondiente tiene homología, usado como sinónimo en la presente con identidad de 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% o más por ciento, preferiblemente otros de los amino ácidos que forman el centro catalíticamente activo o amino ácidos esenciales para la estructura o plegado siendo cancelados o sustituidos o los últimos solo siendo sustituidos conservadoramente, por ejemplo un glutamato en lugar de un aspartato o una leucina en lugar de una valina.

El arte previo describe algoritmos que pueden ser usados para calcular la extensión de homología de dos secuencias, por ejemplo Arthur Les (2008), Introduction to bioinforraatics , 3a. Edición. En una modalidad más preferida adicional de la presente invención, la variante de una secuencia de amino acido o ácidos nucleicos, de preferencia adicionalmente a la homología de secuencia mencionada anteriormente, tiene esencialmente la misma actividad enzimática de la molécula tipo silvestre o de la molécula original. Por ejemplo, una variante de un polipéptido enzimáticamente activo como una proteasa tiene la misma o esencialmente la misma actividad proteolitica como la enzima de polipéptido, esto es, la habilidad de catalizar la hidrólisis de un enlace de péptido. En una modalidad particular, el término "esencialmente la misma actividad enzimática" significa una actividad con respecto a los sustratos del polipéptido tipo silvestre que es claramente por encima de la actividad de fondo y/o difiere por menos de 3, más preferiblemente 2, aun más preferiblemente un orden de magnitud de los valores KM y/o Kcat que el polipéptido tipo silvestre tiene con respecto a los mismos sustratos. En una modalidad preferida adicional, el término "variante" comprende una secuencia de ácido nucleico o de amino ácidos por lo menos de una parte activa o fragmento de la secuencia de ácido nucleico o amino ácidos. En una modalidad preferida adicional, el término "parte activa" como se usa en la presente, denota una secuencia de amino ácidos o una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una longitud menor que la plena longitud de la secuencia de aminoácidos o codifica para una longitud más pequeña que la plena longitud de la secuencia de amino ácidos, la secuencia de amino ácidos o la secuencia de amino ácidos codificada con una longitud menor que la secuencia de amino ácidos tipo silvestre que tiene esencialmente la misma actividad enzimática como el polipéptido tipo silvestre o una variante del mismo, por ejemplo como un importador de ácido graso, como una enoil-CoA hidratada o FadE o como una acetil-CoA aciltransferasa o FadB. En una modalidad particular, el término "variante" de un ácido nucleico comprende un ácido nucleico, la hebra complementaria del cual se enlaza al ácido nucleico tipo silvestre, preferiblemente bajo condiciones severas. La severidad de la reacción de hibridización es determinable fácilmente para la persona experimentada en el arte y en general depende de la longitud de la sonda, la temperatura durante el lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más largas necesitan temperaturas más altas para la hibridización mientras que las sondas más cortas se manejan con bajas temperaturas. Ya sea que la hibridización tome lugar en general depende de la habilidad del ADN desnaturalizado para fusionarse a hebras complementarias que están presentes en su medio ambiente, es decir por debajo de la temperatura de fusión. La severidad de la reacción de hibridización y condiciones correspondientes son descritas en más detalle en Ausubel et al. 1995. La persona experimentada en el arte encuentra instrucciones para identificación para las secuencias de ADN por medio de hibridización, ínter alia, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH ( annheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255:260 (1991)) . La hibridización toma lugar bajo condiciones severas en una modalidad preferida, esto es solamente híbridos son formados en los cuales la secuencia de sonda y secuencia objetivo (esto es, los poli nucleótidos son tratados con la sonda son por lo menos 70% idénticos) . Es conocido que la severidad de la hibridización que incluye las etapas de lavado es diferenciada o determinada al hacer variar la composición de la solución reguladora del pH, la temperatura y la concentración de sal. La reacción de hibridización se lleva a cabo en general con relativamente baja severidad en comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996) . Para la reacción de hibridización, por ejemplo una solución reguladora del pH correspondiente a una solución reguladora del pH de SSC 5x a una temperatura de alrededor de 50°C-68°C puede ser empleada. Aquí, las sondas también se pueden hibridizar con poli nucleótidos que tienen menos del 70% de identidad a la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y son removidos mediante lavado bajo condiciones severas. Esto se puede obtener, por ejemplo al reducir la concentración de sal a SSC 2x y opcionalmenté de manera subsecuente SCC 0.5x ("The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), una temperatura de, en la secuencia de preferencia incrementada, alrededor de 50°C-68°C, alrededor de 52°C-68°C, alrededor de 54°C-68°C, alrededor de 56°C-68°C, alrededor de 58°C-68°C, alrededor de 60°C-68°C, alrededor de 62°C-68°C, alrededor de 64°C-68°C o alrededor de 66°C-68°C son establecidos. Intervalos de temperatura de alrededor de alrededor de 64°C-68°C o alrededor de 6°C-68°C son preferidos. Es opcionalmenté posible reducir la concentración de sal a una concentración correspondiente a SSC 0.2x o SSC O.lx. mediante el incremento gradual en la temperatura de hibridización en etapas de alrededor de 1-2°C de 50°C a 68°C, fragmentos de polipéptidos pueden ser aislados que, por ejemplo en la secuencia de preferencia incrementada, tiene por lo menos 70% o por lo menos 80% o por lo menos 90% o por lo menos 91% o por lo menos 92% o por lo menos 93% o por lo menos 94% o por lo menos 95% o por lo menos 96% o por lo menos 97% o por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad a la secuencia de la molécula de ácido nucleico empleada.

Instrucciones adicionales para la hibridización son obtenibles en el mercado en forma de "kits" (por ejemplo, DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, No. De catálogo 1603558) . En una modalidad preferida, el término "variante" de un ácido nucleico, como se usa en la presente, comprende cualquier secuencia de ácido nucleico deseada que codifica por la misma secuencia de aminoácidos como el ácido nucleico original o una variante de esta secuencia de aminoácidos en el contexto de la degeneración del código genético.

Con el desarrollo de métodos genéticos, microbiológicos y biológicos moleculares modernos, numerosas herramientas están disponibles para la persona experimentada en el arte que puede medir sistemáticamente e influenciar la actividad de enzimas presentes en células vivientes. Para la determinación de la actividad de una enzima que está presente en formas de una suspensión, de una pelotilla o puede ser removida de un cultivo celular en forma procesada, pruebas estándar enzimáticas pueden ser usadas y evaluadas como se describe en libros de texto, por ejemplo en Cornish-Bowden, 1995. El arte previo revela numerosas pruebas que son especialmente apropiadas para la medición de la actividad de enzimas que catalizan una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos, por ejemplo en Kameda & Nunn (1981), Marrakchi et al. (2003) . Lobo et al (2001) y Xu et al. (2011) . Métodos aplicables sistemáticamente para disminuir la actividad de una enzima en una célula, por ejemplo mediante muta génesis no dirigida de células mediante exposición a radiación relativa seguida por enriquecimiento o selección de los mutantes, mediante introducción dirigida al sitio de mutaciones puntuales o mediante knock-out de un gen que codifica por una enzima activa integrada cromosomalmente a una célula son también descritos en el arte previo, por ejemplo en Maniatis et al. (1989) o en Fuchs & Schlegl (2007) . En el caso particular del producto genético FaD, la sobreexpresión de un represor transcripcional , por ejemplo de FadR, también se presta a si mismo a disminuir la actividad (Fujita et al., 2007) . Una reducción de actividad basada en la interferencia de ARN (Tuschl, 2001) o usando inhibidores específicos es también posible. En una modalidad preferida, la formulación de "la célula que tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre" de una enzima, como se usa en la presente, significa que la actividad de la enzima es reducida en la célula modificada en comparación con la actividad de la misma enzima en una célula tipo silvestre. En una modalidad preferida, la reducción relativa en la secuencia de preferencia incrementada es de 5, 10, 20, 40, 50, 75, 90, 95, 99 o más por ciento de la actividad. En una modalidad particularmente preferida, la actividad de la enzima comparada con el fondo ya no es detectable.

En la segunda etapa del proceso de acuerdo con la invención, el contacto del medio de cultivo acuoso con una solución orgánica hidrofóbica ocurre. En una modalidad preferida de la presente invención, el término "contacto", como se usa en la presente significa gue el medio de cultivo acuoso y la solución orgánica son traídos directamente en contacto sin una barrera mecánica insuperable para un medio de cultivo acuoso y/o una solución orgánica hidrofóbica, por ejemplo una membrana inorgánica, esta interpuesta. Por ejemplo, el medio de cultivo acuoso puede ser introducido a un fermentador y la solución orgánica es agregada al medio de cultivo en el mismo fermentador, de tal manera que ambos líquidos se pueden mezclar. En una modalidad preferida, el contacto toma lugar por lo menos parcialmente con agitación, el flujo de entrada de gas o medidas es similares que son apropiadas para incrementar el área de contacto de las dos fases .

Después de la segunda etapa, la solución orgánica hidrofóbica es separada del medio de cultivo acuoso. A cuenta de la habilidad inherente de este sistema para formar dos fases, este es un proceso que puede fácilmente ser llevado a cabo por la persona experimentada en el arte que puede proceder simplemente al permitir que el recipiente se pare y subsecuentemente decantar una fase. Alternativamente, se puede usar un embudo de separación. En el caso de puntos de ebullición suficientemente diferentes, existe la posibilidad de separar la fase que hierve a temperaturas más bajas, que es en general la fase orgánica, mediante aplicación de presión reducida. Pequeñas cantidades de agua remanente en la fase orgánica pueden ser removidas al utilizar agentes de secado inorgánicos tales como hidruro de calcio, cloruro de calcio anhidro, gel de sílice, sulfato de sodio anhidro, hidróxido de sodio o los semejantes.

El proceso de acuerdo con la invención puede ser llevado acabo utilizando solventes orgánicos hidrofóbicos acostumbrados que comprenden alcanos, cicloalcanos, cicloalquenos , arilos, ácidos grasos, esteres de ácido graso, alcoholes, heterocicloalcanos, heterocicloalquenos y heteroarilos sustituidos y sin sustituir líquidos a temperatura ambiente. Solventes orgánicos hidrofóbicos que no son líquidos per se son también apropiados, a condición de que sean parte de una mezcla de solventes que es líquida en su totalidad. Es opcionalmente hacer tomado en consideración en la presente que numerosos solventes tienen una acción más o menos toxica sobre células metabólicamente activas. Si las células así retienen por lo menos temporalmente su actividad metabólica, concentraciones moderadas apropiadas o aun concentraciones del solvente orgánico hidrofóbico que tienen un efecto no toxico van a ser usadas. En una modalidad particularmente preferida, el solvente es un ácido graso saturado o insaturado que tiene por lo menos ocho, preferiblemente por lo menos doce átomos de carbono, por ejemplo ácido láurico, ácido oleico o ácido erúcico o los metil esteres de los mismos. En una modalidad preferida adicional, el solvente es un ácido graso de formula CH3-(CH2)-COOH, en donde x puede ser 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o más. En una modalidad preferida adicional, es un ácido graso insaturado que tiene un doble enlace, particularmente de preferencia uno en posición 9, particularmente de preferencia ácido oleico. En una modalidad particularmente preferida adicional, el solvente es ácido hexanoico .

El volumen de la solución orgánica hidrofóbica debe ser medido de tal manera que la fase orgánica pueda fácilmente ser separada y en una modalidad preferida es de 2 a 98, más preferiblemente 5 a 95, aún más preferiblemente 10 a 40, más preferiblemente 20 a 30 por ciento del volumen total del medio de cultivo acuoso y solución orgánica hidrofóbica.

Como una célula metabólicamente activa, en general una célula es producida que es apta de producir un producto de particular interés. El uso de una célula recombinante es particularmente ventajoso para lo mismo. En una modalidad preferida, el término "recombinante" se entiende en la presente que significa que la molécula de ácido nucleico designada como "recombinante", introducida a la "célula recombinante" es una molécula de ácido nucleico no tomada de la naturaleza, sino una molécula de ácido nucleico producida utilizando procesos de síntesis biológicos moleculares o químicos o que las células designadas como recombinante comprende una molécula de ácido nucleico recombinante o un polipéptido codificada de la misma. Procesos de rutina biológicos moleculares para preparar moléculas de ácido nucleico recombinante y células son descritos en el arte previo, por ejemplo en xxx.

Es además particularmente ventajoso si la célula contiene o particularmente de preferencia, sobre expresa una enzima que produce un producto o un precursor o intermediario del mismo. Esto puede ser obtenido al introducir un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica por la enzima mediante transformación o los semejantes a la célula o que incorpora la molécula de ácido nucleico que codifica por la enzima a la composición genética de la célula, por ejemplo un cromosoma. Para numerosos tipos biotecnológicamente importantes de células, por ejemplo E. coli procesos y vectores apropiados son conocidos que pueden ser usados para la expresión o sobre expresión de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo los vectores del tipo pET o pGEX y células apropiadas para su expresión ( offatt & Studier (1986), Rosenberg et a. (1987) y Studier et a., (1990)).

El proceso de acuerdo con la invención ofrece particularmente en si mismo cuando una célula metabólicamente activa es usada para metabolizar un solvente orgánico hidrofóbico o para catalizar una reacción química utilizando el solvente orgánico hidrofóbico como sustrato. Estas enzimas incluyen las alcanohidroxilasas .

En una modalidad particularmente preferida, una "alcano hidroxilasa" como se usa en la presente, es una enzima que cataliza la oxidación de un alcano al alcohol aldehído/cetona y/o al acido carboxílico, de preferencia principalmente al alcohol. Alcanos hidroxilasas son descritas extensamente en el arte previo, por ejemplo en Grant et al., (2011) o Koch et al. (2009). En una modalidad particularmente preferida, la alcano hidroxilasa es una "alcano hidroxilasa" del tipo "AlkB". AlkB es una oxido reductasa del sistema AlkBGT de Pseudomonas putida, que es conocida por su actividad de hidroxilasa. Esta es dependiente de dos polipéptidos adicionales AlkG y AlkT. AlkT es caracterizado como como una rubredoxina reductasa FAD-dependiente que transfiere electrones de NADH a AlkG. AlkG es una rubredoxina, una proteína redox que contiene hierro, . que funciona como donador de electrones directos para AlkB. En una modalidad preferida, el término "alcano hidroxilasa del tipo AlkB" como se usa en la presente, se entiende que significa una alcano hidroxilasa membrana-enlazada. En una modalidad preferida adicional, el mismo término "alcano hidroxilasa del tipo AlkB" se entiende que significa un polipéptido que tiene una homología de secuencia incrementada de preferencia de por lo menos 75,80, 85, 90,92, 94,96, '98 o 99% a la secuencia de AlkB o Pseudomonas putida Gpo 1 (código de base de datos: CAB54050.1, este y todos los otros códigos de base de datos utilizados en este documento se originan de la base de datos de proteínas del banco genético de la NCBI en la publicación disponible del 9 de Noviembre de 2011). El término "secuencia", como se usa en la presente, se puede relacionar con la secuencia de amino ácidos de un polipéptido y/o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para esta.

El proceso puede ser usado en primer lugar para oxidar y subsecuentemente para aminar ácidos grasos o sus esteres. Un sistema enzimático como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 2009/77461, por ejemplo es apropiado para esto. La célula metabólicamente activa es en este caso una célula que contiene una alcano hidroxilasa recombinante y una transaminasa, preferiblemente además por lo menos una enzima del grupo que comprende alcohol deshidrogenasa, alanina deshidrogenasa y lactama hidrolasa. En una modalidad preferida, el término "alcohol deshidrogenasa" como se usa en la presente, se entiende que significa una enzima que oxida un aldehido o cetona al alcohol primario o secundario correspondiente. Ejemplos comprenden las alcohol deshidrogenasas de Ralstonia eutropha (ACB78191.1) , Lactobacillus . brevis (YP-795183.1) , Lactobaciullus kefiri (ACF95832.1) de hígado de caballo, de Paracoccus pantotrophus (ACB78182.1) y Sphingobium yanoikuyae (EU427523.1 ) , también como las respectivas variantes de las mismas. En una modalidad preferida, el término "transaminasa" como se usa en la presente, se entiende que significa una enzima que cataliza la transferencia de grupos a-amino de una molécula donadora, preferiblemente un amino acido a una molécula afectora, preferiblemente un ácido a-cetocarboxilico . Por ejemplo, la transaminasa de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (código de base de datos NP_901695) puede ser usada. En una modalidad preferida, el término "alanina deshidrogenasa" como se usa en la presente, se entiende que significa una enzima que cataliza la conversión de L-alanina con el consumo de agua y NAD+ a piruvato, amoniaco y NADH. Por ejemplo, las alanina deshidrogenasas de Bacillus subtilis (código de base de datos AF070716) , Mycobacterium tuberculosis (código de base de datos X63069) , Enterobacter aerogenes (código de base de datos AB013821) pueden ser usadas.

La presente invención es concerniente no solamente con el proceso de acuerdo con la invención sino también con el uso de un nocaut de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos, preferiblemente de una enzima seleccionada del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL, más preferiblemente FadE, como parte de la composición genética de una célula metabólicamente activa para mejorar la separación de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuosos que comprende la célula metabólicamente activa. Asi, si existe la necesidad en el contexto de cualquier proceso deseado para separar una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa en lugar de una célula metabólicamente activa sin modificación apropiada del metabolismo de ácido graso, esto es, una célula con actividad sin cambiar o aun incrementada, en comparación con su tipo silvestre, de las enzimas que catalizan una reacción de la ß-oxidación de ácidos grasos, preferiblemente del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL, más preferiblemente FadE, de acuerdo con la invención, una célula va a ser usada en la cual por lo menos una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de los ácidos grasos es sometida a nocaut, preferiblemente una enzima seleccionada del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL, más preferiblemente FadE.

Este knock-out de un gen de Fad va a ser usado independientemente de si la célula metabólicamente activa va a ser usada para la producción de un ácido graso o un derivado del mismo o de otra molécula que no podría ser degradada por medio déla ruta metabólica de la ß-oxidación.

En una modalidad preferida, el término "knock-out" como se usa en la presente, se entiende que significa la transcripción y/o traducción del gen o su producto genético en comparación con la célula tipo silvestre es reducida, por ejemplo mediante cancelación de una parte de o de todo el gen, mediante la inserción de un codón de retención en un sitio apropiado, mediante remoción de una parte esencial del promotor o mediante remoción del sitio de enlace ribosomal.

En una modalidad más preferida, el proceso de acuerdo con la invención comprende las etapas de a) provisión de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa, b) contacto del medio de cultivo acuoso con una solución orgánica hidrofóbica y c) separación de la solución orgánica hidrofóbica del medio de cultivo acuosa, la célula tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre de FadE o una variante del mismó, en el cual la célula metabólicamente activa es una cepa recombinante de E. coli que contiene un alcano hidroxilasa recombinante, preferiblemente FalkBGT de Pseudomonas putida o una variante de la misma, también como una transaminasa recombinante y el solvente orgánico hidrofóbico comprende una mezcla de ácido láurico o ácido hexanoico el metil éster de los mismos y un ácido graso insaturado, preferiblemente ácido oleico o ácido erúcico, más preferiblemente ácido oleico, la proporción de ácido oleico o ácido erúcico a ácido láurico ácido hexanoico o el raetil éster de los mismos es de 20:80 a 80 a 20, preferiblemente 20:80 a 40:60.

En una modalidad más preferida, el proceso de acuerdo con la invención es un proceso para la producción de un ácido ?-amino carboxilico que comprende las etapas de a) provisión de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa, b) contacto del medio de cultivo acuoso con una solución orgánica hidrofóbica , c) separación de la solución orgánica hidrofóbica del medio de cultivo acuoso, la célula tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre, por lo menos de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos, la célula es preferiblemente de E. coli y la enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos es FadE y las células además es modificada genéticamente de tal manera que produce una cantidad incrementada de ácido ?-amino carboxilico en comparación con su tipo silvestre, preferiblemente que está equipada con un sistema de enzimas recombinantes que comprenden un alcano hidroxilasa, preferiblemente AlkBGT de Pseudomonas putida, opcionalmente un alcohol deshidrogenasa y una ?-transaminasa . En una modalidad más preferida adicional, la invención es concerniente con una célula que tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre, por lo menos de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos, la célula es preferiblemente E. coli y la enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos es FadE y la célula además es modificada genéticamente de tal manera que, en comparación con su tipo silvestre produce una cantidad incrementada de ácido ?-amino carboxilico, preferiblemente en que está equipada con un sistema de enzimas recombinantes que comprende un alcano hidroxilasa, preferiblemente AlkBGT de Pseudomonas putida, opcionalmente una alcohol deshidrogenasa y una ?-transaminasa .

La presente invención es ilustrada además por las siguientes figuras y ejemplos no restrictivos de los cuales elementos, modalidades, aspectos y ventajas adicionales de la presente invención pueden ser inferidos.

La Figura 1 muestra diferencia en la separación de fases en la producción de ALAME utilizando el mutante AFadE W3110 [alkB-alaD-TA] (también designada como "AFadE") (izquierdo) y la cepa idéntica W3110 [alkB-alaD-TA] , aparte de la ausencia de la cancelación de AFadE (también designada como el tipo silvestre ("WT") a continuación ) (derecha) . La flecha muestra la clara separación de la fase orgánica y la fase acuosa con el mutante después de 10 minutos, mientras que cuando se usa la otra cepa la separación de fases todavía no es discernible después del mismo tiempo.

La Figura 2 muestra el mismo experimento como en la Figura 1 aparte del hecho de que el medio de reacción fue llenado con tubos de Falcon después de la fermentación.

La Figura 3 muestra la entrada de oxigeno en forma de la ORT (velocidad de transferencia de oxigeno) y la salida de dióxido de carbono en forma de la CTR (velocidad de transferencia de dióxido de carbono) de ambas cepas en el mismo experimento como en la Figura 1.

La Figura 4 muestra las concentraciones de ALAME con espacio en el tiempo en el medio en el mismo experimento como en la Figura 1.

La Figura 5 (que comprende de la figura 5a a la figura 5d) muestra la concentración de varios productos en la reacción del metil éster de ácido láurico (LAME) como se describe en el Ejemplo 2, es decir ácido amino láurico (ALA), metil éster del ácido amino láurico (ALAME) , ácido ?-carboxi láurico (DDA), metil éster del ácido ?-carboxi láurico (HLA) , ácido ?-hidroxi láurico (HLA) , metil éster del ácido ?-hidroxi láurico (HLAME) y ácido ?-oxoláurico (OLA) . Como cepas, la cepa AFadE (Figura 5a) , el tipo silvestre (W3110) (Figura 5b), la cepa AFadL (Figura 5c) y una cepa que contiene AFadE y AFadL (Figura 5d) fueron investigadas.

La Figura 6 (que comprende de la figura 6a a la figura 6b)muestra las pruebas de OTR (Figura 6a) y CTR (Figura 6b) para experimento descrito en el Ejemplo 2.

La Figura 7 muestra que se observaron diferencias en la separación de fases en la producción de ALAME utilizando la cepa AFadE, tipo silvestre (W3110) , AFadL Y AFadE/AFadL en el Ejemplo 2. Las flechas muestran la clara separación de la fase orgánica y la fase acuosa con los mutantes después de 10 minutos que cuando se usa la separación de fases de la cepa tipo silvestre todavía no es discernible después del mismo tiempo.

Ejemplo 1: Aceleración de la separación de una fase acuosa de una fase hidrofóbica utilizando un mutante de AFadE en la producción biotecnológica del metil éster de ácido amino láurico La biotransformación del metil éster del ácido láurico al metil éster del ácido aminoláurico se llevó a cabo en el sistema de fermentación en paralelo de 8 veces de DASGIP utilizando las cepas W3110 AFadE [alkB-alaD-TA] y W3110 [alkB-alaD-TA] . W3110 [alkB-alaD-TA] es una cepa de E. coli 3110 que comprende un plásmido a base de pBR322 ' con un sistema de oxidación y transaminación que comprende oxido reductasa AlkB, alanina deshidrogenasa y transaminasa, como se describe en WO200977461. W3110 AFadE [alkB-alaD-TA] es idéntica con la última cepa, a parte del hecho de que el gen que codifica por FadE es cancelado y la cepa así no tiene actividad de acil-CoA deshidrogenasa.

Se usaron reactores de 1 L para la fermentación. Las sondas de pH fueron calibradas por medio de una calibración de dos puntos utilizando soluciones estándar de pH .0 y pH 7.0. Los reactores fueron llenados con 300 mi de agua potable y surtidos auto clave por 20 minutos a 121°C para garantizar la esterilidad. Subsecuentemente, las sondas de Oz fueron polarizadas de la noche la mañana (al menos por 6 horas) sobre el sistema de DASGIP. A la siguiente mañana, el agua de bajo del manto claro fue removida y reemplazada por 300 mi del medio de alta densidad celular que contiene 100 mg/1 de ampicilina. Subsecuentemente, las sondas de p02 fueron calibradas utilizando una calibración de un punto (agitador: 400 rpm/gasificación : 10 sl/h de aire) y la alimentación, medios de corrección y pistas de agente de inducción fueron limpiados por medio de Clean in Place. Para esto, la tubería fue enjuagada con etanol al 70%, subsecuentemente con NaOh 1 M, luego con agua completamente desmineralizada estéril y finalmente llenada con el medio respectivo.

Las cepas de E. coli que producen ALA y ALAME fueron cultivadas primero de la noche a la mañana a 37°C y 200 rpm por alrededor de 18 horas de los crio cultivos respectivos en medio LB (25 mi en un vaso de precipitados con reflector de 100 mi) con 100 mg/1 de ampicilina. Subsecuentemente, cada 2 mi de los cultivos fueron re-inoculados con 100 mg/1 de ampicilina en medio de alta densidad celular (glucosa 15 g/1 (30 mi de una solución concentrada de 500. g/1 sometida a autoclave separadamente que contiene MgS04-7H20 al 1% y NH4C1 al 2.2%)), (NH4)2S04 1.76g/l, K2HP04 19.08 g/1, K2HP04 12.5 g/1, extracto de levadura 6.66 g/1, citrato de trisodio deshidratado 2.24 g/1, solución de citrato de amonio hierro 17 ml/1 de una solución concentrada de 1% de intensidad sometida a autoclave separadamente, solución de elementos en trazas 5 ml/1 de solución concentrada sometida a autoclave separadamente (CH1 (37%) 36.50 g/1, MnCl2-4H20 1.91 g/1, ZnS04-7H20 1.87 g/1, ácido etilendiamintetraacetico dihidratado 0.84 g/1, H3BO3 0.30 g/1, Na2MoO4-2H20 0.25 G/L, CaCl2-2H20 4.70 g/1, FeSO4_7H20 17.80 g/1, CuCl2-2H20 0.15 g/1) (25 mi de cada cepa en 1 vaso de precipitados con deflector de 100 mi) e incubados a 37°C/200 rpm por 5.5 horas adicionales.

La densidad óptica de los cultivos a 600 nm fue determinada en la 3110 AFadE [alkB-alaD-TA] como 6.9 y W3110 [alkB-alaD-TA] como 7.4. Para inocular los reactores con una densidad óptica de 0.1, cada 4.0 mi o 4.4 mi (AFadE) fueron extraídos a una jeringa de 5 mi (bajo condiciones estériles) y los reactores fueron inoculados por medio de una cánula vía un septum cubierto con la capa de etanol al 70%.

Se usó el siguiente programa estándar: El experimento llevado a cabo puede ser divido en dos fases, el cultivo en el cual las células deben obtener una cierta densidad óptica y la biotransformación siguiente, en la cual después de la adición del sustrato metil éster de ácido láurico una conversión al éster del ácido amino láurico de enzimas formadas en la expresión debe tomar lugar. Los valores de pH fueron controlados unilateralmente a pH 6.8 utilizando amoniaco (12.5%). Durante el cultivo y biotransformación, el oxigeno disuelto (DO, oxigeno disuelto) en el cultivo fue controlado a 30% por medio de la velocidad del agitador y la velocidad del aireador. La fermentación se llevó a cabo como una alimentación por lotes, el inicio de la alimentación, 5 g/1 de .alimentación de glucosa (500 g/1 de glucosa- que contienen MgSC>-7H20 al 1% y NH4CI al 2.2%), es disparada por medio de un pico de DO. Con el inicio de la alimentación, la temperatura fue también disminuida de previamente 37°C a 30°C. La expresión de la transaminasa fue inducida 2 horas después del inicio de la alimentación por la adición automática de IPTG (1 mM) . La inducción de genes de alk tomo lugar por medio de la adición manual de DCPK (0.025% v/v) 10 horas después del inicio de la alimentación. Antes del inicio de la biotransformación, se determina la densidad óptica de los caldos de cultivo.

El inicio de la fase de biotransformación tomo lugar 14 horas después del inicio de la alimentación. Para esto, 150 mi de una mezcla de metil éster de ácido láurico y el intercambiador iónico ácido oleico (90% técnico) fueron agregados al caldo de fermentación como un lote. Para hacer disponible un donador de grupo amino para la transaminasa, media hora antes del inicio de la biotransformación, 5 mi de una solución de sulfato de amonio 3 M fueron agregados al caldo de fermentación. Para la toma de muestras, 2 mi de caldo de biofermentación fueron removidos del recipiente y una parte del mismo fue diluido 1/20 en una mezcla de acetona/HCl (c(HCl) = 0.1 mol/1)) y extraída. Se tomaron muestras de todos los reactores a 1 h, 2 h, 3 h, 4 h , 5 h, 7.5 h, 10.5 h, 10.6 h y 21 horas después del inicio de la transformación. Las velocidades de rendimiento para oxigeno (OTR = velocidad de transferencia de oxigeno) y carbono (CTR = velocidad de transferencia de carbono) fueron determinadas en el sistema de DASGIP durante la fermentación por medio del análisis de gas de desperdicio. La fermentación fue finalizada durante 21 horas después del inicio de la biotransformación . El agitador, la aeración, la regulación de temperatura y regulación del pH fueron cambiados y se permite que el recipiente permanezca silencialmente por 5-10 minutos. Resultados : durante la fase de biotransformación, en el caso de la 3110 AFadE [alkB-alaD-TA] con formación comparable a un ligeramente incrementada de producto ALA E, se observó un consumo de oxigeno más bajo que con W3110 [alkB-alaD-TA] (véanse Figuras 3 y 4) .

Después de 10 minutos, en el recipiente que contienen las cepas 3110 AFadE [alkB-alaD-TA] una separación de fases marcada en la proporción de alrededor de 40% de fase superior, alrededor de 60% de fase inferior fue observada. Entre las dos fases hubo una interface de capa delgada. Las muestras de la fase inferior y superior fueron llenadas a un tubo Falcon de 15 mi y centrifugadas a 5500 x g durante 10 minutos. Después de esto, apareció en el tubo que contiene la fase acuosa la fase inferior y biomasa estuvieron presentes alrededor de 95%. En el tubo que contiene la fase superior, se iba a discernir que la fase superior consistía de más de 60% de fracción orgánica. En el recipiente que contiene la cepa W3110 [alkB-alaD-TA] una emulsión homogénea estaba presente después de 10 minutos y aun después de 20 minutos adicionales el tiempo de espera sin separación de fases fue observado .

E emplo 2 : Aceleración de la separación de una fase acuosa de una fase hidrofóbica utilizando un mutante de AFadL también como un mutante de AFadE AFadL en la producción biotecnológica del metil éster ácido aminoláurico Análogamente al Ejemplo 1, experimentos adicionales utilizando las cepas W3110 AFadL [alkB-alaD-TA] y W3110 AFadE AFadL [alkB-alaD-TA] también como 3110 AFadE [alkB-alaD-TA] y W3110 [alkB-alaD-TA] se llevaron a cabo como testigos.

Otra vez, el sistema de fermentación en paralelo de 8 veces de DASGIP fue usado con exactamente el mismo protocolo y parámetros como se describe en el Ejemplo 1.

Después del inicio de la biotransformación mediante la adición de la mezcla de metil éster de ácido láurico/ácido oleico, se tomaron muestras después de 1.25, 2.5, 3.5, 20.5, 22.5 y 23.5 horas y trabajadas de acuerdo con el proceso mencionado anteriormente. Los resultados son resumidos en las Figuras 5, 6 y 7.

Después de 24 horas, las biotransformaciones fueron terminadas, pH, temperatura y regulación de DO fueron terminados y se permite que los reactores reposen por 5-10 minutos .

Como en el experimento mencionado anteriormente, aquí también fue posible después de un corto tiempo observar una separación clara de la fase acuosa de la fase orgánica, a condición que por lo menos uno de los genes de Fad fuera cambiado. En el caso del tipo silvestre usado como biocatalizador, esto es, sin cancelación de uno de los genes de Fad, ninguna separación de fases podría ser discernida (véase, Figura 7) .

Se observó a si mismo que en las cepas que tienen por lo menos una cancelación de Fad, el consumo de oxigeno es reducido en comparación con el tipo silvestre (Figura 6a) .

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso que está caracterizado porque comprende las etapas de: a) preparación de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa, b) poner en contacto el medio de cultivo acuoso con una solución orgánica hidrofóbica, c) separación de la solución orgánica hidrofóbica del medio de cultivo acuoso, la célula tiene una actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre, por lo menos de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos es una enzima del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL y sus variantes, preferiblemente FadE y una variante de la misma.

3. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la solución orgánica que comprende por lo menos un solvente del grupo que comprende alcanos, cicloalcanos, cicloalquenos, arilos, ácidos grasos, esteres de ácido graso, alcoholes, heterocicloalcanos , heterocicloalquenos y heteroarilos sustituidos y sin sustituir líquidos a temperatura ambiente.

4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la solución orgánica que comprende un ácido graso que tiene más de 12 átomos de carbono o un éster del mismo, preferiblemente ácido oleico, ácido erúcico o metil éster de ácido láurico.

5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la célula se pone en contacto con una alcano hidrolasa recombinante .

6. El uso de una célula metabólicamente activa que tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos, preferiblemente de una enzima seleccionada del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL y sus variantes, más preferiblemente FadE, caracterizada porque se usa para mejorar la separación de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso que comprende una célula metabólicamente activa.

7. El uso de un nocaut de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos, preferiblemente una enzima seleccionada del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL y sus variantes, más preferiblemente FadE, como parte de una composición genética de una célula metabólicamente activa para mejorar la separación de una solución orgánica hidrofóbica de un medio de cultivo acuoso que comprende la célula metabólicamente activa.

8. Una célula que tiene actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos, caracterizada porque comprende además una mono oxigenasa recombinante, más preferiblemente una alcano hidroxilasa.

9. La célula de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque la enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos es una enzima del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL y sus variantes, más preferiblemente FadE o una variante de la misma.

10. Una mezcla de reacción caracterizada porque comprende una solución acuosa que contiene una célula metabólicamente activa y una solución orgánica hidrofóbica, la célula tiene una actividad disminuida en comparación con su tipo silvestre de una enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos.

11. La mezcla de reacción de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque la enzima que cataliza una de las reacciones de la ß-oxidación de ácidos grasos es una enzima del grupo que comprende FadA, FadB, FadD, FadE y FadL o variantes de las mimas, más preferiblemente FadE y una variante de la misma.

12. La mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, caracterizada porque la solución orgánica hidrofóbica que comprende por lo menos un solvente del grupo que comprende alcanos, cicloalcanos , cicloalquenos, arilos, ácidos grasos, esteres de ácidos grasos, alcoholes, heterocicloalcanos , heterociciloalquenos y heteroarilos sustituidos y sin sustituir líquidos a temperatura ambiente.

13. La mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque la solución orgánica hidrofóbica comprende un ácido graso que tiene más de 12 átomos de carbono o un éster del mismo, preferiblemente ácido oleico, ácido erúcico o metil éster de ácido láurico.

1 . El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 o mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque la célula metabólicamente activa es una célula que contiene una alcano hidroxilasa recombinante y una transaminasa , preferiblemente además por lo menos una enzima del grupo que comprende alcohol deshidrogenasa, alanina deshidrogenasa y lactama hidrolasa.

15. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 14, el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 y 14 o la mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizada porque la célula es una célula eucariontica inferior o una célula procariontica, preferiblemente E. coli.

16. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 14 a 15, el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 y 14 a 15 o la mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizada porque- la célula es una célula recombinante .

17. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 14 a 16, el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 y 14 a 16 o la mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizada porque la solución orgánica hidrofóbica compone hasta por lo menos 5, preferiblemente por lo menos 20% del volumen total de la solución orgánica hidrofóbica y el medio de cultivo acuoso.

18. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 14 a 17, el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 y 14 a 17 o la mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, caracterizado porque el pH del medio de cultivo acuoso y tiempo de contacto entre 5 y 9, más preferiblemente 6 y 8.