CN107920986A

CN107920986A - 用于口腔护理的自成膜组合物

Info

Publication number: CN107920986A
Application number: CN201680041780.1A
Authority: CN
Inventors: J·萨塔斯古特利兹; E·拉扎罗梅兰; J·库恩卡斯特拉纳; J·M·玛丽库布诺; J·L·卡尔沃圭拉多
Original assignee: AB Biotics SA
Current assignee: AB Biotics SA
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2016-07-11
Publication date: 2018-04-17
Also published as: MX2018000488A; JP6993967B2; EP3324928B1; CA2992354C; BR112018000812A2; EP3117822A1; US11478423B2; JP2018521136A; EP3324928A1; US20190000757A1; EP3324928C0; CA2992354A1; WO2017012905A1; CN119656205A; ES2994765T3

Abstract

提供一种呈粉末形式的自成膜组合物、重构配方以及用于口腔使用的试剂盒，其实现了益生菌在口腔中的充分定殖以及足够的滞留时间以实现针对与口腔病况相关的病原体的有益作用。因此，所提供的项目适用于预防和/或治疗与口腔微生物丛的改变相关的病况，尤其是种植体周围炎。呈粉末形式的自成膜组合物包含至少一种胶凝剂和/或至少一种生物粘附剂以及至少一种乳酸菌菌株。

Description

用于口腔护理的自成膜组合物

技术领域

本发明涉及医学和微生物学领域，确切地说，涉及用于牙齿保健和治疗的组合物。具体来说，本发明包括用于治疗和/或预防种植体周围炎和其它与微生物生态失调相关的口腔病况的组合物。

背景技术

在种植体周围的组织中出现的炎性病变统称为种植体周围疾病并且包括两种疾病实体：粘膜炎和种植体周围炎。种植体周围炎和种植体周围粘膜炎具有类似的征象，但是在种植体周围粘膜炎中不存在牙槽嵴顶骨丧失(crestal bone loss)。粘膜炎被定义为种植体周围软组织的可逆修改，无骨丧失。种植体周围炎相反地影响深软组织和种植体周围的骨骼，并且它被定义为按引起支撑性骨骼丧失的丧失以及粘膜发炎的方式影响靠近骨整合种植体的组织的发炎过程。种植体周围炎的流行率取决于用于定义流行率的临床阈值，近期结果在6.6％与47％之间变化[Albertini,M.等人2014]。

种植体周围炎是种植体失效的主要原因之一。已提出牙菌斑累积和细菌不平衡是主要原因之一，因为在牙菌斑累积与牙槽嵴顶骨丧失之间存在正相关。在种植体周围炎中，细菌、胁迫或两者的组合可刺激种植体周围的骨丧失。一旦骨丧失增加并形成深袋，就建立了将增强厌氧性细菌的优势的厌氧性环境。这些接着就变成了继续骨丧失的主要原因。已表明，种植体周围炎周围的生物膜的微生物组成不同于健康种植体中所存在的微生物组成。总的来说，相比于健康的种植体，病变种植体呈现降低的有益细菌物种的比例和增加的假定病原体的比例。种植体周围炎部位常常呈现较高比例的一些来自橙色复合物的已辨认出的牙周病原体，例如具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)或中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)。在这些部位存在其它来自红色复合物的挑剔的病原体，包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)和福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)[Da Silva,E.S.C.等人2013]。尽管有很大的争议，但是我们认为，像是伴放线凝聚杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)的其它平均水平的一些牙周病原体通常与种植体周围炎有关[Persson,G.R.等人2013]。

因为种植牙表面上生物膜的发展对于种植体周围炎的出现起重要作用，所以治疗主要是基于减少种植体表面上的细菌定殖或以机械方式消除细菌微生物丛。已开发出手术和非手术技术来实现这点。

手术程序是基于用于减小袋深度并固定软组织形态的切除术技术和基于通过使用骨骼放置进行引导式骨科手术的再生技术。一般来说，这些程序成本高，令患者感到疼痛或不适，因此只限于作为骨丧失晚期或即使提供初始预防性治疗，骨丧失仍然继续时的治疗选择。[Ata-Ali,J.等人2011]。

因此，作为一线治疗选择，非手术技术是优选的。一般来说，这些技术涉及以0.12％双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)漱洗液(例如12小时，为期15天)和/或抗生素形式通过化学牙菌斑控制来消除牙菌斑。然而，双氯苯双胍己烷的副作用很早以前就众所周知。双氯苯双胍己烷会刺激和破坏口腔粘膜，造成牙齿和其它口腔表面的变色和染色，增加牙垢形成并且改变了味觉感知。还报导过口腔刺激和局部过敏型症状。此外还报导了粘膜的副作用，包括口腔炎、牙龈炎和溃疡。这些作用中的一些是因为双氯苯双胍己烷的抗菌作用所导致的口腔微生物丛改变[L.等人1971]。

抗生素疗法可造成各种副作用和药物相互作用。举例来说，广谱全身性抗生素偶尔会出现改变共生微生物丛的问题，改变共生微生物丛可导致抗生素相关疾病，包括艰难梭菌(Clostridium difficile)相关的结肠炎、腹泻、阴道病、阴道炎等。抗生素的使用还有利于细菌的抗性的发展，这会让治疗打折扣并甚至会使进一步治疗变得更麻烦[Slots,J.等人1990]。

近期研究已转向益生菌，“活的微生物当按适当的量给予时赋予宿主健康益处”。益生菌对口腔健康的影响相对较新，很多研究正在进行。

市场上已知的口腔益生菌是罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)Prodentis。近期研究指示，在大部分慢性牙周炎患者中，用含有益生菌菌株罗伊氏乳杆菌的片剂进行口腔治疗诱导促炎性细胞因子反应显著减少并且临床参数改善[Szkaradkiewicz,A.K.等人2014]。另一项研究的目的是评估含罗伊氏乳杆菌的益生菌锭剂作为辅助在慢性牙周炎患者中进行刮治和根面平整(scaling and root planing，SRP)的作用。在经过益生菌治疗的SRP组中观察到牙龈卟啉单胞菌减少，但是没看到所研究的其它病原菌有变化[Teughels,W.等人2013]。然而，罗伊氏乳杆菌对口腔微生物丛的作用仍然有问题，因为在并行研究中，在实验性牙龈炎期间每天摄入含有罗伊氏乳杆菌(ATCC55730和ATCC PTA5289)的益生菌锭剂似乎并不显著影响牙菌斑累积、炎性状态或生物膜的微生物组成[Flallstroem,H.等人2013]。

近期公开Flichy-Fernandez,A.J.等人2015描述了含有菌株罗伊氏乳杆菌ATCCPTA5289和罗伊氏乳杆菌DSM 17938的罗伊氏乳杆菌Prodentis益生菌片剂对种植体周围粘膜炎的影响。研究招收了十二名种植体周围粘膜炎患者，这些患者持续30天服用益生菌片剂。相比于安慰剂，患者显示牙龈指数下降，这主要是因为炎性细胞因子减少。该文献并未涉及罗伊氏乳杆菌对种植体周围炎的作用。相比于粘膜炎，种植体周围炎的特征在于骨骼结构损坏，这主要是因为病原菌的作用。因为该文献没有描述益生菌片剂对种植体周围炎或对相关病原体的作用，所以益生菌是否适用于治疗种植体周围炎依然是个问题。

另一个实例是一项近期研究，该研究描述了在健康的年轻成年人中经口给予含有鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GG和动物双歧杆菌乳酸亚种(B.animalis subsp.lactis)BB-12的锭剂对牙菌斑的量、牙龈炎症和口腔微生物丛的影响。益生菌锭剂减少了牙菌斑并减小了牙龈指数，但是两组的唾液微生物组成均未发现有益生菌诱导的变化。结论是，就牙龈炎症来说，益生菌锭剂改善了牙周状态，但不影响口腔微生物丛[Toiviainen,A.等人2015]。

已研究了例如短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CD2等其它益生菌在牙周炎中的作用，但是尚未证明在种植体周围炎和粘膜炎中的作用[Maekawa,T.等人2014]。

JP20100053062公开了含有乳酸菌的口腔组合物，所述组合物适用于预防和/或治疗口腔疾病，包括牙周病和龋齿。具体来说，已经证明，属于肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)物种的细菌的菌株具有良好的共聚集和粘附能力，因此能够附着到粘膜上并抑制病原体生物膜。口腔组合物可以包含菌株和赋形剂、粘合剂、润滑剂和增溶剂，根据常规方法配制。

本领域的近期综述[Yanine,N.等人2013]得出以下结论：益生菌关于预防和治疗牙周病的有效性仍有问题。关于主要结果探诊牙周袋深度(probing pocket depth)，不存在益生菌的临床有益作用。关于次要结果，益生菌对牙菌斑指数和牙龈炎症显示出一点益处。总而言之，从现有技术可见，益生菌可有帮助改善牙周和牙龈过程中的炎症，但是益生菌在这些过程中出现的生态失调中是否有作用仍然是个问题，生态失调是种植体周围炎中骨丧失的主要原因。

与当前疗法的功效有关的另一个问题是，用于口腔递送益生菌的技术和方法有重大局限性，这些技术和方法包括并入食物、片剂、口香糖、凝胶或牙膏中。这些局限性包括对益生菌的稳定性的负面作用和其引发有益作用的能力因为其在口腔中的滞留时间短而下降。当益生菌必须递送到口中不可接近的蛀洞中时，例如种植牙周围的部位，这是一项挑战，它会使得益生菌针对口腔病原体的、用于预防或治疗种植体周围炎的拮抗活性打折扣。

此外，与骨骼相邻的种植体区域常常具有有助于种植体粘附和骨整合的创面，并且在进行抗菌治疗之后还是被污染的，伴随着随后进一步骨丧失和种植体周围袋的形成。为管理这些区域的病原性定殖所做的努力取得了有限的成功。因为这些区域不可接近并且比大部分刷头和其它装置都小，所以证实牙齿保健用处很小。全身性预防作用有限，因为细菌往往会迅速聚集成被保护的簇，增加了产生有抗生素耐药性的细菌的可能性。

需要一种能够将益生菌递送到所期望的特定口腔部位的递送系统来有效调节口腔微生物丛。递送系统应该能够将活的、有代谢活性的益生菌缓慢释放到口腔中，允许益生菌充分定殖在所期望部位，并且滞留时间足够长以实现有益作用。

发明内容

有待通过本发明解决的一个问题可视为与一种递送系统的提供相关，所述递送系统能够将益生菌递送到所期望的特定口腔部位，这是有效调节所述部位处参与病理病况的口腔微生物丛所需要的。

解决方案是基于提供一种呈粉末形式的组合物、重构配方以及用于口腔使用的试剂盒，其实现了益生菌在所期望部位的充分定殖以及足够的滞留时间以提供针对与口腔病况相关的病原体的有益作用。

因此，本发明的第一方面涉及一种在液体介质存在下在搅拌下自成膜的呈粉末形式的自成膜组合物，所述组合物包含：(i)至少一种呈粉末形式的胶凝剂，(ii)至少一种呈粉末形式的生物粘附剂，和(iii)至少一种呈粉末形式的乳酸菌菌株，其中(i)、(ii)和(iii)在单个容器中或在单独的容器中，并且其中自成膜组合物局部给予。

因此，本发明提供一种呈粉末形式的自成膜组合物，其中在液体介质存在下在搅拌下自成膜。术语“成膜”意指能够在施用到固体表面之后形成膜；即在表面上留下柔软的、有粘着力的连续覆盖层。术语“自成膜”意指除了所指示的组分或条件，不需要其它组分或条件来形成膜。“在搅拌下”在本说明书中应广泛地加以理解，包括手动搅拌或借助于电动混合器；连续或不连续搅拌，并且持续一段合适的时间，优选介于5秒到60分钟之间，更优选是10秒到30分钟或30秒到10分钟。

通过用胶凝剂增加组合物的粘性并且通过用生物粘附剂增加组合物的粘附性，在表面上形成膜。术语“胶凝剂”在本文中是指增加液体粘性，形成凝胶的物质。胶凝剂能够溶解在液相中呈胶体混合物，胶体混合物形成了粘着力弱的内部结构。在所属领域中还可以将它称作增稠剂、稳定剂或乳化剂。术语“生物粘附剂”是指充当粘合剂的天然产生的聚合物，即施用到材料表面上后将其结合在一起并抗分离。优选的胶凝剂和生物粘附剂在下文进一步详细地加以讨论。

不受限于理论，认为本文提出的解决方案一方面能够将乳酸菌(优选具有益生菌特性)递送到口中不可接近的蛀洞中，例如种植牙周围的蛀洞和间隙以及种植体本身的创面，这些地方经常被病原菌污染。至于第二点优势，在此提出的解决方案实现了益生菌在所期望部位的充分定殖以及足够的滞留时间以实现针对与口腔病况相关的病原体的有益作用。更具体来说，组合物中所包括的胶凝剂和生物粘附剂实现并增强了乳酸菌在所期望部位的生长，从而形成了密封住有问题的蛀洞的有益生物膜(即针对进一步病原体污染形成了物理屏障)。值得注意的是，在所关心的是避免病原体的不合需要的生长的病原菌的情况下，胶凝剂和生物粘附剂的益生元作用可忽略不计。因此，在有益的益生菌生物膜的发展增强的同时，病原性生物膜的发展减少了。因此，益生菌生物膜的形成连同针对口腔病原体的乳酸菌的拮抗活性一起阻止了源自病原菌的作用的恶性循环，即种植体周围区域中的骨丧失。

本发明的第二和第三方面涉及一种用于制备重构配方的方法和由其获得的重构配方，所述方法包含在搅拌下混合第一方面的呈粉末形式的自成膜组合物与液体介质。

本发明的第四方面涉及一种用于口腔使用的试剂盒，包含：(1)第一方面的呈粉末形式的自成膜组合物或第三方面的重构配方；和(2)用于将呈粉末形式的自成膜组合物或重构配方施用到颊腔的装置。

本发明的第五方面涉及一种呈粉末形式的自成膜组合物或重构配方，其用作药物。

本发明的第六方面涉及第一方面的呈粉末形式的自成膜组合物或第三方面的重构配方，用于预防和/或治疗选自种植体周围炎、粘膜炎、牙周炎、牙龈疾病、龋齿、口腔念珠菌病、唇疱疹以及脓疱组成的组的病况。

本发明的第七方面涉及呈粉末形式的自成膜组合物或重构配方的非药物用途，其用作口腔护理。

本发明的第八方面涉及一种属于片球菌属(Pediococcus)的分离的菌株，其用于预防和/或治疗选自种植体周围炎和粘膜炎组成的组的病况。

本发明的第九方面涉及一种保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Spanish TypeCulture Collection)的属于片球菌属的分离的菌株，其选自以下组成的组：以登录号CECT8903保藏的菌株、菌株CECT 8904、菌株CECT 8905、菌株CECT 8906。

本发明的第十方面涉及一种在液体介质存在下在搅拌下自成膜的呈粉末形式的自成膜组合物，所述组合物包含：(i)至少一种呈粉末形式的试剂，其选自胶凝剂和生物粘附剂组成的组，和(ii)至少一种呈粉末形式的片球菌属菌株，其中(i)和(ii)在单个容器中或在单独的容器中。

本发明的第十一和第十二方面涉及一种用于制备重构配方的方法和由其获得的重构配方，所述方法包含在搅拌下混合第十方面的呈粉末形式的自成膜组合物与液体介质。

本发明的第十三方面涉及一种用于口腔使用的试剂盒，包含：(1)第十方面的呈粉末形式的自成膜组合物或第十二方面的重构配方；和(2)用于将呈粉末形式的自成膜组合物或重构配方施用到颊腔的装置。

本发明的第十四方面涉及第十方面的呈粉末形式的自成膜组合物或第十二方面的重构配方，用于预防和/或治疗选自种植体周围炎、粘膜炎、牙周炎、牙龈疾病、龋齿、口腔念珠菌病、唇疱疹以及脓疱组成的组的病况。

下文所示的实施方式和实例是出于向所属领域的技术人员足够清楚且完整地解释本发明的目的而展示的，不应该被视为限于其中所涵盖的必需方面，所述方面如本说明书前面的部分中所展示。

具体实施方式

本发明提供包含乳酸菌的呈粉末形式的自成膜组合物和其制备方法，所述方法包含与液体介质混合。

一方面，自成膜组合物包含至少一种胶凝剂、至少一种生物粘附剂以及至少一种乳酸菌菌株。另一方面，自成膜组合物包含至少一种胶凝剂或至少一种生物粘附剂以及至少一种片球菌属菌株。

呈粉末形式的自成膜组合物

本发明的呈粉末形式的自成膜组合物中所包括的乳酸菌可呈活细胞或非活细胞形式。一般使用呈活细胞形式的菌株。然而，它也可以延伸到非活细胞，例如被杀死的培养物或细胞裂解物(通过例如暴露于改变的pH、超声处理、辐射、温度、压力或其它杀死或裂解细菌的手段获得)或含有先前通过任何菌株产生的有益因子(例如细菌素和抗炎物质)的组合物。

在一个特定实施例中，粉末组合物中所包括的至少一种乳酸菌菌株呈包含活细胞的形式。这意味着组合物基本上由活细胞组成或部分由活细胞组成。

在一个特定实施例中，选自胶凝剂和生物粘附剂组成的组的至少一种呈粉末形式的试剂至少对乳酸菌没有杀菌作用。术语“杀菌(bactericidal)”，又称为“杀菌(bacteriocidal)”，意指杀死细菌，即减少组合物中的活细胞的数量。因此，组合物中所包括的试剂是不杀死乳酸菌的试剂。所属领域的技术人员已知，取决于储存条件和保护试剂的使用，储存条件包括温度、气氛，保护试剂例如低温保护剂或其它载体，含有细菌的产物中的活细胞数量随时间自然减少。在本说明书中，表述“没有杀菌作用”意指当在相同条件下储存或孵育时，在胶凝剂和/或生物粘附剂存在下的活细胞浓度相比于在没有这些试剂的情况下的活细胞浓度并未减小。

优选地，粉末组合物中的活细胞的浓度在胶凝剂和/或生物粘附剂存在下相比于没有这些试剂的相同组合物来说减小不超过10000倍(即4个对数)。举例来说，这意味着如果不含胶凝剂和生物粘附剂的粉末中的活细胞浓度是1E+09cfu/g，那么存在这些试剂时的活细胞浓度就不低于1E+05cfu/g。

更优选地，存在这些试剂时粉末组合物中的活细胞浓度相比于没有这些试剂的相同组合物减小不超过1000倍(3个log)、100倍(2个log)或10倍(1个log)。

在一个特定实施例中，除了没有杀菌作用之外，胶凝剂和生物粘附剂对乳酸菌也没有抑菌作用。这意味着试剂既不杀死细菌，也不抑制细菌的生长(它们不阻止细菌生长和分裂)。因此，组合物中所包括的试剂是不阻止细菌正常生长的试剂。

在一个更特定实施例中，试剂是具有益生元作用的试剂。这意味着它们改善或增强细菌的生长。这种特征显示在以下实例5到7中。

在一个甚至更特定的实施例中，通过在试剂存在下孵育相关乳酸菌来研究相关试剂的益生元作用。用人工唾液将相关试剂补足到最终浓度0.5％(w/v)，所述人工唾液含有1g/L‘Lab-lemco’粉(英国贝辛斯托克的Oxoid(Oxoid,Basingstoke,UK))、2g/L酵母提取物(Oxoid)、5g/L朊间质蛋白胨(proteose peptone)(Oxoid)、2.5g/L猪胃粘蛋白(英国普尔的西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.,Poole,UK))、35g/L氯化钠(英国普尔的BDH化学品公司(BDH Chemicals Ltd))、0.2g/L氯化钙(BDH)、0.2g/L氯化钾(BDH)于蒸馏水中。还制备了没有凝胶成分的人工唾液以比较相关试剂在无补充培养基下在细菌生长方面的作用。在高压灭菌之后，每升人工唾液培养基加入1.25mL含40％尿素的水(w/v)。用移液管移取200微升所制备的不同培养基到96孔板中。之后紧接着加入20微升在PBS中标准化到1E+07CFU/mL的相关乳酸菌的悬浮液。没有细菌接种物的相同量的PBS用作阴性对照。将培养板在37℃下厌氧孵育24小时，并通过测定625nm下的光密度来监测细菌生长。根据以下公式计算益生菌候选者使用相关试剂进行生长的能力：

Δ生长＝(ΔDO_gp-ΔDO_g0)-(ΔDO_sp-ΔDO_s0)

其中ΔDO_gp是补充有相关试剂并接种有相关乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)候选者的孔中，24小时后相比于0小时时在625nm下的光密度之间的差值；

ΔDO_g0是补充有相关试剂但是含有PBS而不是LAB的孔中，24小时时相比于0小时时在625nm下的光密度之间的差值；

ΔDO_sp是没有补充相关试剂并且接种LAB的孔中，24小时时相比于0小时时在625nm下的光密度之间的差值；

ΔDO_s0是没有补充相关试剂并且含有PBS而不是LAB的孔中，24小时时相比于0小时时在625nm下的光密度之间的差值。

基于实例5到7中所述的详细分析，技术人员通常能够重复所述分析以客观地判定特定相关试剂是否具有益生元作用。需要相应说明的是，实例5到7中所公开的分析的描述和条件不限制本发明的范围。分析是适合于测试相关试剂的能力以测试其益生元作用的分析。

在一个特定实施例中，当如上所述确定之Δ生长高于0.005时，试剂视为具有益生元作用。在一个更特定实施例中，Δ生长高于0.01。在一个甚至更特定实施例中，Δ生长高于0.02。

如上文所讨论，呈粉末形式的组合物包含至少一种试剂，所述试剂可以是胶凝剂。在一个特定实施例中，所述至少胶凝剂呈用于为组合物提供粘性的量，并且选自以下组成的组：

(a)淀粉，优选大米淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠；

(b)胶，优选黄蓍胶、金合欢胶、黄原胶、茄替胶(ghatti gum)、结冷胶(gellangum)、剌梧桐树胶、魔芋胶或半乳甘露聚糖胶(尤其是瓜尔胶、剌槐豆胶和塔拉胶(taragum))；

(c)海藻多糖，优选海藻酸、海藻酸钠、琼脂、右旋糖酐(dextran)或卡拉胶(carrageenan)；

(d)多糖，选自果胶和麦芽糊精组成的组；

(e)纤维素衍生物，优选甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或钙、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素或微晶纤维素；

(f)多肽，选自明胶、胶原蛋白和酪蛋白组成的组；以及

(g)聚合物，选自以下组成的组：基于丙烯酸酯的聚合物、基于乙烯基的聚合物(优选聚乙烯吡咯烷酮，又称为聚维酮(polyvidone)或普维酮(povidone))、阳离子多糖(例如阳离子乙酰基-葡糖胺，优选壳聚糖、阳离子环糊精和阳离子右旋糖酐)以及聚烷二醇(优选聚乙二醇)。

至少一种试剂还可以是生物粘附剂。具体来说，生物粘附剂呈用于为组合物提供粘附性的量，并且选自以下组成的组：

(a)胶，优选哈克木胶(hakea gum)、黄原胶、金合欢胶、魔芋胶、结冷胶或半乳甘露聚糖胶(尤其是瓜尔胶)；

(b)海藻多糖，优选海藻酸、海藻酸钠、琼脂、右旋糖酐或卡拉胶；

(c)纤维素衍生物，优选甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟乙基纤维素；

(d)多糖，选自果胶和麦芽糊精组成的组；以及

(e)聚合物，选自以下组成的组：基于丙烯酸酯的聚合物、基于乙烯基的聚合物(优选聚乙烯吡咯烷酮或普维酮)、阳离子多糖(优选壳聚糖)以及聚烷二醇(优选聚乙二醇)。

如之前所提到的，胶凝剂呈用于为组合物提供粘性的量并且生物粘附剂呈用于为组合物提供粘附性的量。用作胶凝剂和生物粘附剂的化合物在所属领域中是众所周知的，因此试剂的量将由所属领域的技术人员确定。在一个特定实施例中，胶凝剂是胶。胶可以是例如黄原胶、阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄蓍胶、剌梧桐树胶、刺槐豆胶、角豆胶、金合欢胶、茄替胶、结冷胶、剌梧桐树胶、魔芋胶、哈克木胶以及塔拉胶。这些胶大体上可归类为整体具有负电荷的糖胶(carbohydrate gum)。更优选地，胶凝剂是瓜尔胶，在所属领域中还被称为瓜尔豆胶(gum cyamopsis)、瓜尔胶粉(guar flour)以及瓜拉那(guaran)。瓜尔胶是从豆科某些植物种子的胚乳中提取的。它们是半乳甘露聚糖，通过D-甘露糖单元(1-4)键结形成直链，单个D-半乳糖(1-6)键结形成分支。瓜尔胶可经过改性或衍生。瓜尔胶衍生物的实例是羟丙基化或羧基羟丙基化衍生物、阳离子衍生物(Ecopol)以及由瓜尔胶解聚产生的产物。

在一个特定实施例中，生物粘附剂是纤维素衍生物。主要衍生物是纤维素醚，即纤维素的烷基改性，通过用烷基替换无水葡萄糖单元的羟基的部分氢原子而产生。纤维素醚的非限制性实例是：甲基纤维素(methylcellulose，MC)、羟乙基甲基纤维素(hydroxyethylmethylcellulose，HEMC)、羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose，HPC)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose，HPMC)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose，HEC)、乙基羟乙基纤维素(ethylhydroxyethylcellulose，EHEC)、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose，CMCNa)、具有三甲基铵取代基的羟乙基纤维素的季铵盐(聚季铵盐10)以及二甲基二烯丙基氯化铵共聚物(聚季铵盐A)。在一个更优选实施例中，生物粘附剂是羟乙基纤维素(HEC)。

淀粉的非限制性实例包括预胶凝淀粉(玉米、小麦、木薯)、预胶凝高直链淀粉含量的淀粉、预胶凝水解淀粉(麦芽糊精、玉米糖浆固体)或化学改性的淀粉，例如预胶凝取代淀粉(例如经过辛烯基琥珀酸盐改性的淀粉)。

在一个特定实施例中，呈粉末形式的自成膜组合物包含至少一种胶凝剂和至少一种生物粘附剂。在一个更特定实施例中，胶凝剂是不同于生物粘附剂的化合物。

在一个特定实施例中，胶凝剂选自胶和海藻多糖组成的组并且生物粘附剂选自纤维素衍生物和基于乙烯基的聚合物组成的组。

更具体来说，胶凝剂是瓜尔胶或海藻酸盐并且生物粘附剂是羟乙基纤维素(HEC)或聚乙烯吡咯烷酮。

因此，在一个特定实施例中，胶凝剂选自瓜尔胶和海藻酸钠组成的组，并且生物粘附剂是HEC。

根据本发明的自成膜组合物呈粉末形式。具体来说，那意味着组合物的水含量小于10％，更优选小于5％。

技术人员通常将对呈粉末形式的胶凝剂和生物粘附剂的量加以选择以获得取决于重构配方的体积提供适当程度的粘性和粘附性的重构配方。

在一个特定实施例中，自成膜组合物中的胶凝剂和生物粘附剂的量是每种试剂在最终重构配方中获得0.05到20％(w/v)的浓度所需的量。更具体来说，呈粉末形式的胶凝剂呈用于在最终重构配方中获得1到5％(w/v)、更具体来说2％、3％或4％(w/v)的浓度的量，并且呈粉末形式的生物粘附剂呈用于在最终重构配方中获得4到10％(w/v)、更具体来说6％(w/v)的浓度的量。

在种植体周围炎应用的一个特定实施例中，自成膜组合物包含用于获得包含4％(w/v)的瓜尔胶和6％(w/v)的HEC的最终重构配方所必需的量的瓜尔胶和HEC。在牙齿应用的一个特定实施例中，自成膜组合物包含用于获得包含2％(w/v)的瓜尔胶和6％(w/v)的HEC的最终重构配方所必需的量的瓜尔胶和HEC。

在一个特定实施例中，呈粉末形式的组合物包含介于0.05与90％之间的胶凝剂(w/w)，更具体来说1％到60％(w/w)。在更特定实施例中，胶凝剂的量是50％、20％、15％和10％(w/w)。在另一个特定实施例中，呈粉末形式的组合物中的生物粘附剂的量介于0.05与90％(w/w)之间，并且具体来说介于30与85％(w/w)之间。在更特定实施例中，生物粘附剂的量是68％、50％和40％(w/w)。

技术人员将根据待处理的表面和病况来选择液体介质的合适体积。在一个特定实施例中，用于重构配方的体积不高于500mL。在一个特定实施例中，所用体积不高于200mL、150mL、100mL、50mL或20mL。在一个更特定实施例中，用于重构配方的体积是6mL。在一个更特定实施例中，用于重构配方的体积在2到3mL的范围内。

所属领域的技术人员将在下文(重构配方和其获得方法部分)找到呈粉末形式的胶凝剂和生物粘附剂的合适的量、最终重构配方以及液体介质的体积的非限制性实例。

胶凝剂和生物粘附剂以及本发明所用的量不仅仅是用作载体、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂或增溶剂、润湿剂，而是经过选择以赋予最终重构的组合物合适的粘性和粘附性特性以改善乳酸菌的给予。合适的组合允许给予乳酸菌，在便于临床实践的一段时间内不降低其功效和稳定性，或甚至增加其功效和稳定性。

如上文所讨论，本发明的呈粉末形式的自成膜组合物还包含至少一种乳酸菌菌株。在一个特定实施例中，乳酸菌菌株能够拮抗至少一种选自以下各属的细菌组成的组的口腔病原体：卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)以及凝聚杆菌属(Aggregatibacter)。更具体来说，它能够拮抗至少一种选自以下组成的组的口腔病原体：牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌以及伴放线凝聚杆菌。举例来说，用实例8到9的分析测试乳酸菌菌株拮抗口腔病原体的能力。

在一个特定实施例中，乳酸菌菌株选自以下各属的细菌组成的组：片球菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)以及明串珠菌属(Leuconostoc)。具体来说，乳酸菌是乳杆菌属(例如罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)或胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、双歧杆菌属或链球菌属。更具体来说，乳酸菌菌株属于片球菌属。更具体来说，菌株是乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)或戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。更具体来说，乳酸菌菌株选自以下组成的组：菌株CECT 8903、菌株CECT 8904、菌株CECT 8905以及菌株CECT 8906。

如上文所指出，形成呈粉末形式的组合物的至少胶凝剂、至少生物粘附剂以及至少乳酸菌菌株是在单个容器中或在单独的容器中。用于获得先前各方面的组合物的方法包含：通过在合适的培养基中培养乳酸菌菌株并将它加工成粉末形式(例如对它进行冷冻干燥)来获得乳酸菌菌株，并且如果组合物是在单个容器中提供的，那么混合乳酸菌菌株与呈粉末形式的胶凝剂和生物粘附剂。用于培养和后处理乳酸菌的方法描述于下文中。组合物也可以在三个或两个不同容器中提供，所述容器包含组合物的各要素，并且这些要素可以在应用之前由使用者混合。

自成膜组合物尤其适用于局部给药。如本文所用的术语“局部”意指施用到身体表面，例如皮肤或粘膜，外表面或内表面。局部给药途径的非限制性实例是表皮给药(直接施用到皮肤上)、施用到眼结膜或施用到耳朵、对口腔表面(例如牙齿和牙龈)给药或阴道给药。

重构配方和其获得方法

如上文所讨论，本发明的一个方面涉及一种用于制备重构配方的方法，所述方法包含在搅拌下混合前述方面的呈粉末形式的自成膜组合物与液体介质。获得重构配方。搅拌可通过手动搅拌或借助于电动混合器进行；连续或不连续搅拌，并且持续一段合适的时间。混合期优选介于5秒到60分钟之间，更优选是10秒到30分钟或30秒到10分钟。在一个更优选实施例中，搅拌进行1、2、3、4或5分钟。配方优选在临用之前重构并且在给予配方之前使配方静置胶凝。在一个特定实施例中，在混合之后，使组合物静置至少10秒。更具体来说，使重构配方在施用之前静置至少30秒，更具体来说至少1分钟。为了避免凝胶在施用之前变得过于浓稠，避免长的时间段也是适宜的，过于浓稠会使得其在待处理表面上的分布变得困难。因此，在一个特定实施例中，配方一旦重构就在不长于120分钟的一段时间内施用于待处理表面上。更具体来说，重构配方在不长于60分钟、更具体来说不长于30分钟、更具体来说不长于10分钟的一段时间内施用。

液体介质优选是人类或动物可接受食用的水。然而，液体介质也可以是例如任何在水、油、甘油或凡士林中的悬浮液。

重构配方可优选采用适用于所期望的口腔的具有合适的粘性和/或粘附性的凝胶形式；如果例如将配方施用于牙齿表面上，那就采用清漆形式；或采用喷雾形式。

最终重构配方中的胶凝剂和生物粘附剂每种试剂的量是0.05到20％(w/v)。优选地，重构配方包含1-5％(w/v)的胶凝剂，更优选2％、3％或4％(总重构配方的w/v)；和1-10％(w/v)的生物粘附剂，更优选4-10％(w/v)，更优选6％(总重构配方的w/v)。

在种植体周围炎应用的一个特定实施例中，重构配方尤其包含4％w/v的瓜尔胶和6％的HEC。在牙齿应用的一个特定实施例中，重构配方包含2％w/v的瓜尔胶和6％的HEC。

优选的呈粉末形式的组合物包含20％(w/w)的瓜尔胶和30％的HEC，并且乳酸菌的量是50％。如果用2.5ml水重构0.5g粉末共混物，那么凝胶中的最终浓度是4％(w/v)的瓜尔胶和6％的HEC。

优选的呈粉末形式的组合物包含10％(w/w)的瓜尔胶和30％的HEC，并且乳酸菌的量是60％(w/w)。如果用2.5ml水重构0.5g粉末共混物，那么凝胶中的最终浓度是2％的瓜尔胶(w/v)和6％的HEC。

在另一个实施例中，呈粉末形式的组合物包含15％(w/w)的海藻酸钠、30％的HEC和1.5％的乙酸钙，并且乳酸菌的量是53.5％(w/w)。如果用2.5ml水重构0.5g粉末共混物，那么凝胶中的最终浓度是3％(w/v)的海藻酸盐和6％的HEC。

在另一个实施例中，呈粉末形式的组合物包含10％(w/w)的海藻酸钠、30％的HEC和1％的乙酸钙，并且乳酸菌的量是59％(w/w)。如果用2.5ml水重构0.5g粉末共混物，那么凝胶中的最终浓度是2％的海藻酸盐和6％的HEC。

在另一个实施例中，呈粉末形式的组合物包含20％(w/w)的瓜尔胶和10％的聚乙烯吡咯烷酮，并且乳酸菌的量是70％(w/w)。如果用2.5ml水重构0.5g粉末共混物，那么凝胶中的最终浓度是4％的瓜尔胶(w/v)和2％的聚乙烯吡咯烷酮。

在另一个实施例中，呈粉末形式的组合物包含50％(w/w)的瓜尔胶，并且乳酸菌的量是50％(w/w)。如果用6ml水重构0.5g粉末共混物，那么凝胶中的瓜尔胶的最终浓度是4％(w/v)。

在另一个实施例中，呈粉末形式的组合物包含72％(w/w)的HEC，并且乳酸菌的量是28％(w/w)。如果用6ml水重构0.5g粉末共混物，那么凝胶中的HEC的最终浓度是6％。

用于口腔使用的试剂盒

本发明的一个特定实施例是一种制品，所述制品包含一个密封容器，所述密封容器内封入了如本文所提供的粉末组合物，优选是以单位剂量并且在无菌条件下。容器优选具有足以允许组合物原位重构的容量。一般来说，发现约1ml到约20ml、优选约5ml到约10ml的容量将是适宜的。

因此，在一些情况下，制品只是具有呈粉末形式的自成膜组合物的容器，因为专家可支配其它元件(例如液体介质、注射器和针以及施用装置)来使用自成膜组合物并为患者施用自成膜组合物。

另一个制品是重构配方，重构配方可在使用之前短时间冷冻储存。

然而，在一些情况下，制品是试剂盒，试剂盒包含用于方便使用和施用的其它元件。因此，本发明的另一方面涉及一种用于口腔使用的试剂盒，包含：(1)如上文所定义的呈粉末形式的自成膜组合物；或重构配方；和(2)用于将呈粉末形式的自成膜组合物或重构配方施用到颊腔的装置。

呈粉末形式的自成膜组合物可直接施用到口腔并例如通过唾液原位重构。然而，优选实施例是在临用之前重构组合物。

在一个特定实施例中，用于施用于颊腔的装置选自以下组成的组：刷子、含有注射针的注射器、含有钝尖端针的注射器以及口腔护套。

在一个更特定实施例中，施用装置是注射器和具有钝尖端的针，类似于牙周探针。借助于注射器和钝尖端针，将重构溶液施用于受影响区域中，即施用于种植体周围袋中。

施用装置是口腔护套，又称为咬合夹板、口腔保护器、口型件、牙龈护罩、牙龈护套、夜间护套、牙合夹板或口腔夹板或牙合面。这是一种贴合上牙弓或下牙弓的可拆卸的牙齿用具。口腔护套或口腔夹板填充上呈粉末形式的组合物或重构配方并贴合到牙齿上。

在另一个实施例中，为了方便使用，试剂盒进一步包含具有用于重构呈粉末形式的自成膜组合物的液体介质的容器。

在另一个实施例中，还是为了方便使用，试剂盒进一步包含用于将液体放到具有呈粉末形式的自成膜组合物的容器中的装置。所述装置优选是配备有一次性打孔针的注射器，它用于将液体从容器中抽出并放到具有呈粉末形式的自成膜组合物的容器中。

术语“容器”在本文中用于表示任何小型接收器，具有适用于包装单位剂量的可重构粉末的封闭件，优选在无菌条件下包装。应理解，本发明的此实施例涵盖同等形式的包装，例如小瓶、安瓿、一次性注射器、注射器筒或预填充注射器。任选地，小瓶可以是包含例如两个隔室的多隔室小瓶，一个隔室含有可重构粉末，一个隔室含有足够溶解粉末的量的液体。在这类小瓶中，两个隔室通过开孔互连，其中可使用塞子来防止在小瓶已准备好使用之前粉末与溶剂液体接触。在使用时，通过任何合适的手段松开塞子或刺破塞子以使液体与粉末接触，例如一种装置，例如施加压力或推动针通过塞子的活塞。所述多隔室小瓶的实例包括用于注射器的双隔室筒和双隔室小瓶，或递送盖和用这个盖子封闭的小瓶。

本发明的特定实施方案由以下步骤组成：将一定量的本发明呈粉末形式的自成膜组合物引入设置有隔片和铝胶囊的玻璃小瓶中。在用注射器加入水、优选去离子水或蒸馏水并用手摇动之后，在很短的时间内形成了重构凝胶。这种凝胶没有很高的粘性以借助于注射器施用并且具有适用于种植牙应用的粘附性。接着例如通过注射器和针、刷子或压力施加器，在牙周袋或手术部位给予重构配方。牙科专家能够操控所述系统，获得与治疗部位的最佳贴合并克服其它系统固有的放置困难。在给予时，薄膜系统留在所期望的部位，从而使得用本发明的配方密封所期望的种植体内部空间是可能的。

医学应用

如上文所讨论，本发明的另一方面涉及呈粉末形式的自成膜组合物或重构配方，其用作药物。具体来说，本发明提供呈粉末形式的自成膜组合物或重构配方，其用于预防和/或治疗与口腔微生物丛的改变相关的病况。更具体来说，这种病况选自以下组成的组：种植体周围炎、粘膜炎、牙周炎、牙龈疾病、龋齿、口腔念珠菌病、唇疱疹以及脓疱。在一个特定实施例中，病况是种植体周围炎。

这些方面或者可表述为本发明组合物中的任一种的用途，其用于制造药品、兽药、药物、食品、食品补充剂、医疗食品或口腔护理产品，用于预防和/或治疗与口腔微生物丛的改变相关的病况，优选种植体周围炎、粘膜炎、牙周炎、牙龈疾病、龋齿、口腔念珠菌病、唇疱疹以及脓疱。这或者也可以表述为一种用于预防和/或治疗与口腔微生物丛的改变相关的病况的方法，所述方法包含给予有需要的受试者有效量的本发明组合物中的任一种。

在治疗和预防种植体周围炎方面的应用

假牙一般包括两个组件：种植体组件(又称为骨内种植体或固定装置)是嵌入切骨术中的螺钉。这部分位于牙龈线下方并被视为人工牙根。另一个组件是牙冠、牙桥或托牙，它被固定到种植体组件上并且在牙冠替代物的情况下，是看得见的牙齿部分。第三个组件可包括基牙，这是一种陶瓷或钛组件，确保种植牙与牙冠之间牢固地贴合。基牙部分是位于牙龈线和牙龈线以上的部分。细菌可从口腔穿透这些结构之间的间隙和蛀洞。随后这些细菌可回到邻近组织并可造成种植体周围炎。

作为本发明的预防和治疗种植体周围炎的特定实施方案，在通过注射器向含有呈粉末形式的自成膜组合物的容器中加入水并用手摇动之后，在很短的时间内形成了重构凝胶。重构凝胶例如通过注射器和钝尖端针给予，置于种植体的间隙、微间隙和蛀洞中。具体来说，因为已出现垂直骨丧失并且因为局部发炎过程已产生种植体周围袋，所以种植牙包含创面暴露于口腔液中，所以将上述组合物施用于所述袋中，其方式为使得组合物粘附于种植体的创面上并同样粘附于所述袋的粘液性表面上。因此，通过折弯钝尖端针，模拟牙周探针，使钝针尖端位于袋底部附近并注入产品，直到溶液到达牙龈上边缘，从而将溶液有利地施用于种植体周围袋中。

有利的是，上述自成膜组合物与将所述组合物给予种植牙附近受发炎过程影响的种植体周围区域的装置有关，具体来说，组合物与包含柔性钝针的牙科试剂盒有关。

具体来说，本发明治疗种植体周围炎的特定实施方案由以下组成：去除牙冠；给予患者局部麻醉；清洁待治疗区域；通过刮削以机械方式去除龈下牙菌斑；施用抗生素，例如双氯苯双胍己烷；施用生理盐水溶液；并且施用本发明的重构配方于种植体的周围环境和蛀洞中以及种植体内部。在从袋中抽出针之后，在经过治疗的区域施用生理盐水溶液洗涤和空气喷射(持续约10秒)。之后紧接着将牙冠放在适当位置。嘱咐患者在治疗后6小时内不要刷牙。

在预防性治疗的情况下，这具体来说由以下组成：去除牙冠；任选地清洁待治疗区域并且通过刮削以机械方式去除龈下牙菌斑；并且施用本发明的重构配方。

其它口腔应用：牙龈炎和龋齿

本发明还可以用于健康受试者的牙齿保健以预防可能的疾病，并且除了种植体周围炎之外，还可治疗或预防与口腔生态失调相关的口腔病况。

在一个特定实施例中，本发明的溶液用于预防和治疗牙周炎和牙龈炎。牙龈炎和牙周组织的炎症以及牙周病的发作通常与牙沟中，即牙齿表面与牙龈之间的龋洞周围的微生物平衡改变有关。它导致形成了菌斑(生物膜)，并且存在于这些沉积物内的革兰氏阴性(Gram-negative)病原性物种增加。由这些细菌产生的外毒素和代谢物累积起来并在牙龈组织周围引起炎症，炎症又导致肿胀和出血。在炎症过程中，结合上皮对牙齿的保护变弱，使得细菌能够穿透龈下区域。大部分哺乳动物都会出现牙周病，尤其是马、猫、啮齿动物、家畜和狗。举例来说，所有年龄超过3岁的狗80％有牙周病。

牙周治疗通常首先通过刮削或通过超声波以机械方式去除龈下牙菌斑；通过这种机械式去除，生物膜中的细菌被释放出来并被冲洗掉。目前在此治疗过程中使用抗生素和其它杀菌组合物，它们被设计成用来预防革兰氏阴性细菌再定殖。然而，有规律地并且大量地使用含有抗生素的组合物的缺点就是有发展出抗生素抗性的风险和这些产品常常会被引发的副作用。如在种植体周围炎的情况下，本发明的重构配方可例如借助于注射器，尤其是具有钝尖端针的注射器施用。

在另一个特定实施例中，本发明的组合物用于预防和治疗龋齿。在这种情况下，本发明的重构配方可采用清漆形式，清漆容易借助于刷子由牙科医生、牙科保健员或其他健康护理专家施用到牙齿表面上。清漆可作为其它治疗形式的佐剂施用于牙齿的牙釉质、牙本质或牙骨质。它们不是永久性清漆，但是其粘合性稠度使得其能够保持与牙齿表面接触长达数小时的时间，实现了益生菌的定殖并提供了本发明组合物的有益作用。

优选的应用程序在下文中加以说明。在施用本发明溶液之前虽然不必进行专业的预防，但是建议用牙刷清洁牙齿并且必要时清洁厚厚的牙菌斑或残渣。牙齿应该略微风干或用棉质纱布擦干。将牙齿隔离(例如用棉卷或吸收性材料)以防止被唾液再污染。分配少量清漆(例如0.5ml)。只用0.3-0.6ml即可处理整个牙列。即使牙齿是湿的，清漆也能粘附。接着用小刷子或施用器施用清漆。嘱咐患者在当天剩下的时间里避免刷牙。第二天可再次开始正常的口腔卫生程序。

在例如牙周炎、牙龈炎或龋齿等应用中，本发明的组合物还可以由患者自己施用。商业产品可以是如上所述的牙科试剂盒，包含方便实施的刷子。

在其它实施例中，本发明的组合物和试剂盒由牙科专家在急性治疗中使用并且患者随后可用口腔护理产品进行维持治疗，口腔护理产品例如口香糖、牙膏、漱口剂、口腔喷雾、锭剂或口服分散片，其包含本发明的呈粉末形式的自成膜组合物或乳酸菌与常见赋形剂。

其它用途和产品形式

本发明还提供了呈粉末形式的自成膜组合物或重构配方，其用于口腔护理，即用于非药物使用。因此，所属领域的技术人员众所周知，本发明中的组合物可以漱口剂、喷雾、口腔凝胶以及牙膏形式配制，借助于这些口服形式所用的常规成分。

如所属领域的技术人员所知，漱口剂是漱口用的水溶液或水-醇溶液，具有众所周知的常规配方。除了水以外，还可包括多羟基化合物和其它用于改善外观、气味和保存的添加剂，多羟基化合物例如甘油或二醇(例如丙二醇、非离子表面活性剂等)。

喷雾是等同于或类似于漱口剂的组合物，但是用喷雾瓶分配，方便施加用于润湿并保护口腔所需的剂量，不需要后续冲洗。

口腔凝胶包括允许直接、稳定地施用于口腔的聚合物。关于这些聚合物，出于本发明的目的，优选使用一般被称为聚卡波非(polycarbophil)和卡波姆(carbomer)的聚合物的组合，因为它们可保持凝胶结构在极端温度条件下稳定非常长的时间。凝胶还可包括一定数量的天然的、不生龋齿的甜味剂，例如山梨糖醇。

牙膏配方是所属领域的技术人员众所周知的。在牙膏组合物中，优选使用非离子(例如含糖的脂肪酸酯)或两性(例如可可衍生的甜菜碱)表面活性剂，因为阴离子表面活性剂对牙龈的脆弱的上皮组织有不利影响。在牙膏的情况下，使用碳酸氢钠中和口腔酸度也是特别优选的。此外，牙膏可含有增稠剂，例如黄原胶；研磨性二氧化硅填料；以及除了牙膏行业中通常所用的试剂以外的其它补充剂。优选地，乳酸菌经过按其它形式封装或保护，引入牙膏中。

乳酸菌菌株

本发明的其它方面涉及片球菌属的新菌株，尤其是有利于预防和治疗种植体周围炎和其它与口腔生态失调相关的口腔病况的菌株。这些新菌株是从健康的人中分离的不同乳酸菌菌株的广泛研究的结果。戊糖片球菌PERI1、乳酸片球菌PERI2、戊糖/乳酸片球菌PERI3、戊糖/乳酸片球菌PERI4由保藏员AB-Biotics,S.A.于2015年6月16日保藏于西班牙典型培养物保藏中心(de Cultivos Tipo，CECT，CUE 3号楼,巴伦西亚大学科学园(Parc Científic Universitat de València),Agustín Escardino教授,9,46980-西班牙巴伦西亚帕特纳(Paterna,Valencia,Spain))，位于UAB研究园(Parc deRecerca UAB),UAB校区(Campus UAB),s/n Edifici Eureka,08193萨尔达尼奥拉-德尔巴列斯(Cerdanyola del Vallès)(西班牙巴塞罗那(Barcelona,Spain))。在国际保藏单位(International Authority of Deposit)宣告菌株有活力之后，菌株分别收到了登录号CECT 8903、CECT 8904、CECT 8905和CECT 8906。

因为以下有区别的特性/能力选择菌株：

·因为菌株能很好地耐受溶菌酶和过氧化氢的存在，所以具有良好的在口腔中存活的能力，溶菌酶和过氧化氢是口腔中所存在的常见的两种杀菌剂。

·在胶凝剂和/或生物粘附剂存在下能很好地耐受并生长的能力。举例来说，所选菌株在唾液中的生长在胶凝剂和/或生物粘附剂存在下增强，胶凝剂例如瓜尔胶，生物粘附剂例如羟乙基纤维素。

·抑制口腔病原体的生长的能力。举例来说，菌株能够拮抗与种植体周围炎有关的细菌，包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌和/或伴放线凝聚杆菌。

·聚集的能力，这是形成生物膜的要求，生物膜可通过形成天然屏障具有防止其它病原体定殖的保护作用。

·各种乳酸菌物种具有长表观安全使用史。欧洲食品安全局(European FoodSafety Authority)已研发出一种系统，所述系统授予证实具有长表观安全使用史的分类单位“安全资格认证(Qualified Presumption of Safety，QPS)”状态。本发明的菌株属于具有QPS状态的细菌物种[Andreoletti,O.等人2008]。

总之认为没有现有技术描述过具有以上所提到的特征并且用于预防和/或治疗种植体周围炎的片球菌属菌株，尤其是乳酸片球菌和戊糖片球菌菌株。值得注意的是，菌株片球菌属CECT 8903、片球菌属CECT 8904、片球菌属CECT 8905、片球菌属CECT 8906全都符合先前提到的所有特性，因此适用于治疗种植体周围炎。

在一个特定实施例中，分离的菌株已在人工培养基中发酵并在发酵之后经过后处理，获得细菌细胞，并且所得细菌细胞是在液体培养基中或呈固体形式。具体来说，后处理选自以下组成的组：干燥、冷冻、冷冻干燥、流化床干燥、喷雾干燥以及在液体培养基中制冷，并且更具体来说是冷冻干燥。

本发明的菌株通过在合适的人工培养基中并且在合适的条件下培养(或发酵)细菌产生。有关微生物的表述“人工培养基”应理解为含有天然物质的培养基，并且任选地含有合成的化学物质，例如聚合物聚乙烯醇，它能够使血清的一些功能再现。常见的合适的人工培养基是营养肉汤，营养肉汤含有元素，包括碳源(例如葡萄糖)、氮源(例如氨基酸和蛋白质)、水以及细菌生长所需的盐。生长培养基可以是液体形式或常常与琼脂或其它胶凝剂混合获得固体培养基。菌株可单独培养以形成纯的培养物，或连同其它微生物一起混合培养，或通过单独培养不同类型的细菌，然后按所期望的比例组合这些细菌。在培养之后，并且取决于最终配方，菌株可以经过纯化的细菌形式使用，或者可使用细菌培养物或细胞悬浮液，按原样使用或在适当的后处理之后使用。在本说明书中，术语“生物质”应理解为在培养(或发酵，发酵是与培养同义的术语)之后获得的细菌菌株培养物。

术语“后处理”在本发明的上下文中应理解为出于获得可储存的细菌细胞的目的而对生物质进行的任何处理。后处理的目的是减少生物质中的细胞的代谢活动，并且因此减慢有害的细胞反应的速率。因为后处理，所以细菌细胞可呈固体或液体形式。呈固体形式时，所储存的细菌细胞可以是粉末剂或颗粒剂。在任何情况下，含有细菌细胞的固体和液体形式均不存在于自然界中，因此不是天然产生的，因为它们是人工后处理方法的结果。后处理方法在特定实施例中可要求使用所谓的后处理试剂中的一种或多种。在本发明的上下文中，表述“后处理试剂”是指用于进行本文所述的后处理方法的化合物。后处理试剂当中非限制性地包括脱水剂、抑菌剂、低温保护试剂(低温保护剂)、惰性填料(又称为冻干保护剂)、载体材料(又称为核心材料)等，单独使用或组合使用。

减少细菌细胞的代谢活动有两种基本方法，因此，进行后处理也有两种方法。第一种是降低所有化学反应的速率，这可以通过使用冰箱、机械冷冻机和液氮冷冻机制冷或冷冻，降低温度来进行。或者，可通过加入抑制细菌细胞生长的物质，即抑菌剂来降低所有化学反应的速率，抑菌剂缩写为Bstatic。

第二种进行后处理的方法是从生物质中去除水，这种方法可包括使用冻干器使水升华。从生物质中去除水的合适技术是干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或流化床干燥。产生固体形式的后处理可以是干燥、冷冻、冷冻干燥、流化床干燥或喷雾干燥。

后处理优选是冷冻干燥，它包括通过在减压下升华，从冷冻后的细菌悬浮液中去除水。这种方法由三个步骤组成：预冷冻产品以形成冷冻结构，初级干燥以去除大部分水，以及二次干燥以去除结合水。因为冻干的细菌培养物的制造和分离的工业工艺的客观的和预期的变化性，所以冻干的细菌培养物通常含有一定量的惰性填料，又称为冻干保护剂。其作用是使产品中的活益生菌的含量标准化。使用市售冻干培养物中的以下惰性填料：蔗糖(sucrose)、蔗糖(saccharose)、乳糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、玉米淀粉、菊糖以及其它药学上可接受的非吸湿性填料。任选地，还使用了其它稳定剂或冷冻保护剂，如抗坏血酸，用于形成粘稠的膏体，使粘稠的膏体经历冷冻干燥。在任何情况下，如此获得的材料都能磨碎成合适的大小，包括粉末。

显然通过使用所保藏的菌株作为起始材料，本领域技术人员能够通过常规突变诱发或再分离技术一般性地获得菌株的进一步突变体，所述突变体保留或增强了形成本发明组合物的菌株的本文所述的相关特征和优势。在一个特定实施例中，通过使用重组DNA技术获得突变体。在另一个实施例中，通过随机突变诱发获得突变体。因此，本发明的另一方面涉及一种获得至少一种片球菌属菌株的突变体的方法，其中菌株选自以下组成的组：菌株CECT 8903、菌株CECT 8904、菌株CECT 8905和菌株CECT 8906，其中所述方法包含使用所保藏的菌株作为起始材料并施加突变诱发，并且其中所获得突变体至少进一步保留或增强了所保藏的菌株拮抗至少一种选自以下各属的细菌组成的组的口腔病原体的能力：卟啉单胞菌属、梭菌属、普雷沃氏菌属和凝聚杆菌属。

本发明的另外的方面是药品、兽药、医疗食品、食品、食品补充剂和口腔护理产品，包含有效量的如上文所定义的菌株中的至少一种以及合适的量的可接受的赋形剂。

鉴于组合物的特殊目的选择赋形剂和最合适的配制方法在药物技术领域的普通技术人员的能力范围内。本发明的菌株可按菌株是唯一活性剂或与一种或多种其它活性剂混合的形式配制。

术语“赋形剂”在本说明书中应按其广泛含义来理解，包括与药品、兽药、药物、食品补充剂、医疗食品和口腔护理产品的活性成分一起配制的任何天然的或合成的物质。赋形剂非限制性地选自包含以下的组：填料/稀释剂/膨化剂、粘合剂、抗粘剂、崩解剂、涂料、抗结块剂(例如硬脂酸镁、胶体二氧化硅或滑石)、抗氧化剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂、表面活性剂以及其它类别的药学上和兽医学上可接受的赋形剂。

组合物中的菌株的菌落形成单位(colony forming unit，cfu)的有效量将由所属领域的技术人员确定并将取决于最终配方。举例来说，当不需要任何其它活性剂口服给予时，单剂量组合物中所存在的本发明的菌株的总量是提供以下有效日剂量的量：10⁷到10¹²cfu，根据当前的法规，优选是10⁹到10¹¹cfu。术语“菌落形成单位”(“cfu”)被定义为如通过琼脂板上的微生物计数所揭示的细菌细胞的数量。食品补充剂通常含有的益生菌菌株的量在10⁷与10¹²cfu/g的范围内。

术语“药品”在本说明书中应按其广泛含义来理解，包括任何包含活性成分以及药学上可接受的赋形剂的组合物，在此情况下，活性成分是优选呈组合物形式的本发明的菌株。此术语不限于药物。如本文中所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与受试者(例如人类)的组织接触，而无过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相匹配的化合物、材料、组合物和/或剂型。每种载体、赋形剂等也必须是在与其它配方成分相容的意义上“可接受的”。合适的载体、赋形剂等可见于标准的药物教科书中。

药品可采用不同形式或不同名称，这取决于产品审批途径并且也取决于国家。举例来说，药物是一种特殊的药品。医疗食品是另一种特殊的药品。术语“医疗食品”或“用于特定医学目的的食品”在一些国家用于指特殊配制并且打算用于对具有特别的营养需要的疾病进行膳食管理的食品，所述特别的营养需要只通过正常的膳食是无法满足的。法规对其作出了定义，例如美国食品药品监督管理局1988年的孤儿药法案修正案(Food and DrugAdministration's 1988 Orphan Drug Act Amendments)，和欧洲委员会指令(CommissionDirective)1999/21/EC。医疗食品不同于较宽类别的食品补充剂和承载健康要求的传统食品。因此，在一个特定实施例中，将本发明的菌株配制为医疗食品。

益生菌组合物常被视为食品补充剂，例如本文中所公开的益生菌组合物。食品补充剂又称为膳食补充剂或营养补充剂，被认为是另一种特殊的药品。这是一种打算用于补充膳食的制剂或产品，由食物中通常所用的化合物制成，其提供正常膳食中通常不会摄入或不会足量食用的营养物或有益成分。食品补充剂主要是被视为食品，但是它们有时也被定义为药物、天然健康产品或营养药产品。在本发明的意义上，食品补充剂还包括营养食品。食品补充剂通常“在柜台(over the counter)”出售，即不需要处方。如果食品补充剂采用丸剂、胶囊、片剂或粉末剂形式，那么它包含与药物中所用的赋形剂相同的赋形剂。然而，食品补充剂还可以采用通过一些营养物(例如营养棒(bar)或酸奶)强化的食品的形式。因此，在一个特定实施例中，将本发明的菌株配制为食品补充剂。食品补充剂可按原样给予；可与合适的可饮用的液体混合，所述液体例如水、酸奶、牛奶或果汁；或可与固体或液体食品混合。在此情况下，食品补充剂可采用片剂或锭剂、丸剂、胶囊、颗粒剂、粉末剂、悬浮液、药囊、甜味剂、营养棒、糖浆形式以及相应的给药形式，通常采用单位剂量形式。

本发明的菌株还可以包括在各种食品中，例如奶制品(酸奶、奶酪、发酵牛奶、奶粉、基于牛奶的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于牛奶的粉末)、面包、营养棒、酱(spreads)、饼干和谷物、饮料、不同类型的油或调味品。术语“食品”在本文中在其最广泛的含义上使用，包括任何类型的产品，呈任何呈现形式，可由动物摄入，但是不包括药品和兽药。其它食品实例是肉制品、巧克力酱(chocolate spreads)、馅料和糖霜、巧克力、糖果、烘烤产品、酱油和汤、果汁和调咖啡白油。特别感兴趣的食品是食品补充剂和婴儿配方。食品优选包含载体材料，例如燕麦粥、乳酸发酵食品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质以及糖基化蛋白质。在一个特定实施例中，本发明的菌株经过封装或涂布。

本发明的组合物打算用于口腔健康应用。因此，本发明的另一方面提供了一种口腔护理产品，所述口腔护理产品包含如上文提到的组合物以及药学赋形剂或化妆品可接受的赋形剂或其它可食用成分。在此意义上，组合物是这样的口腔产品，它不故意吞咽以便特定治疗剂的全身给予，而是相反地出于口腔活性的目的在口腔中保持足够的时间以接触基本上所有的牙齿表面和/或口腔组织。所述产品的非限制性实例是牙膏、洁齿剂、牙粉、局部口腔凝胶、漱口水、托牙产品、口腔喷雾、口香糖、牙线、洁牙带、喷砂粉末、抛光膏、牙科清漆、窝沟封闭剂、填充材料、口腔膏或凝胶、糖果、锭剂、口服分散片或口服片、或可直接撒到口腔中的粉末剂。口腔护理产品此外可包含调味化合物，例如薄荷醇。

以上所述的实施例适用于处理、治疗和预防领域，也适用于兽医学，尤其是狗、猫、牛、马、猴、羊、山羊。特定的动物制品是用于咀嚼、咬和啃的制品、棍子、动物点心、宠物食品、小球或宠物玩具。

因此，应理解，不管组合物的形式如何，即不管是药品、药物、食品、食品补充剂、医疗食品或口腔护理产品，本发明的菌株都适用于管理口腔生态失调。

本发明的另一方面涉及一种固体组合物，所述固体组合物包含低温保护剂；包含至少一种乳酸菌的经过冷冻干燥的生物质；以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体优选选自乳液、凝胶、膏体、颗粒剂、粉末剂以及胶。本发明的另外的方面提供口腔护理产品、药物组合物和可食用产品、膳食补充剂以及化妆品组合物，其包含有效量的如前一个方面中所定义的组合物。在一个特定实施例中，口腔护理产品是口香糖、牙膏、口腔喷雾、锭剂或口服分散片。在一个特定实施例中，药物组合物、可食用产品或膳食补充剂是锭剂或口服分散片。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和其变化形式并不打算排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。对于所属领域的技术人员来说，在查阅了说明书之后，本发明的额外的目的、优势和特征将变得显而易见，或者可通过实施本发明而得知本发明的额外的目的、优势和特征。此外，本发明涵盖本文所述的特定的和优选的实施例的所有可能的组合。以下实例和附图是出于说明性目的而在本文中提供的，并且不希望限制本发明。

附图说明

图1：益生菌菌株在补充有瓜尔胶(guar gum，GG)的人工唾液中相比于在无补充的人工唾液中的生长(G)。

图2：益生菌菌株在补充有羟乙基纤维素(HEC)的人工唾液中相比于在无补充的人工唾液中的生长(G)。

图3：益生菌菌株在补充有海藻酸钠(sodium alginate，SA)的人工唾液中相比于在无补充的人工唾液中的生长(G)。

图4：益生菌菌株在补充有甲基纤维素(MC)的人工唾液中相比于在无补充的人工唾液中的生长(G)。

图5：益生菌候选者对伴放线凝聚杆菌的抑制活性(Inhibitory activity，In)。

图6：通过随机扩增多态DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)进行的菌株基因型分析。关于1，PERI1；2，PERI2；3，PERI3；4，PERI4，在随机扩增之后获得的图。

实例

实例1.微生物的分离

从0-9岁儿童的新鲜粪便和口腔分泌物(oral hyssops)中分离出乳酸菌候选者。将样品溶解在PBS缓冲液(pH 7.4)中，等分并涂于补充有各种抗生素组合的MRS上。在微需氧条件(5％CO₂)下在37或30℃下培养菌株。孵育时间取决于生长速率，但是通常进行24小时到3天。用相同选择培养基进行单独菌株分离，然后为了得到第一鉴别，进行革兰氏染色(Gram staining)。一旦生长，就通过冷冻干燥将分离的菌株储存在含有15％脱脂奶粉的PBS 0.1×中。

实例2.属和种鉴别

通过对16S rRNA基因测序进行种水平鉴别。简单来说，用来自伯乐实验室(Bio-Rad Laboratories)(西班牙巴塞罗那)的100树脂提取菌株DNA。通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，使用用于真细菌27F和1492R的通用引物，扩增16SrRNA基因的完整序列，如先前所述[Weisburg,W.G.等人1991；Muyzer,G.等人1998]。在琼脂糖凝胶中使用SYBR绿色染料(西班牙马德里的英杰生命技术公司(Invitrogen,LifeTechnologies,Madrid,Spain))检查PCR产物的完整性。使用27F、357F、907R和1492引物[Weisburg,W.G.等人的前述文献；Muyzer,G.等人的前述文献]、v3.1循环测序试剂盒以及3130XL遗传分析仪(来自西班牙马德里的应用生物系统生命技术公司(AppliedBiosystems,Life Technologies,Madrid,Spain))，对PCR产物进行测序。将所得序列与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和核糖体数据库项目(Ribosomal Database Project，RDP)中所提供的序列进行比对和比较。基于最高命中得分鉴别菌株。

16S rRNA序列对应于片球菌属。当与NCBI和RDP数据库进行比较时，PERI1的序列对应于戊糖片球菌(100％同一性)；PERI2的序列对应于乳酸片球菌(100％)；PERI3的序列以100％的同一性对应于戊糖片球菌或乳酸片球菌；并且PERI4的序列以99％的同一性对应于戊糖片球菌或乳酸片球菌。它们分别以登录号CECT 8903、CECT 8904、CECT 8905和CECT8906保藏于西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Type Culture Collection，CECT)。

实例3.菌株基因型分析

通过随机扩增多态DNA(RAPD)进行菌株基因型分析以确认所保藏的四种片球菌属菌株彼此之间是不同的。如Nigatu等人1998所述进行RAPD。菌株的RAPD图描绘于图6中，证实了四种菌株是不同的。

实例4：针对口腔病况的存活率

通过评估菌株对不同浓度的已知会降低细菌存活率的试剂的耐受性来研究菌株在口腔中的存活率，所述试剂例如过氧化氢(hydrogen peroxide，HP)和溶菌酶。评估总数50个乳酸菌候选者并与用作对照的商业益生菌菌株进行比较，所述商业益生菌菌株即唾液链球菌(Streptococcus salivarius)K12(新西兰布利斯技术公司(Blis Technologies,New Zeland))和罗伊氏乳杆菌DSM17938(瑞典拜奥(Biogaia,Sweden))。

使益生菌候选者和罗伊氏乳杆菌DSM17938在Man Rogosa Sharpe琼脂培养基(MRSa)中在37℃和微需氧条件(5％CO₂)下生长18-24小时。使唾液链球菌K12在相同条件下生长，但是使用脑心浸液培养基(Brain Hearth Infusion medium，BHI)而不是MRS。使用分离后的菌落在0.1M磷酸盐缓冲盐水(Phosphate Buffered Saline，PBS)中制备光密度对应于麦氏比浊标准(McFarland standard)0.5(大约1E+08CFU/mL)的细菌悬浮液。随后将细菌悬浮液在MRS或BHI液体培养基中进行2倍稀释。在96孔微量培养板上接种200微升的所得稀释液，向其中加入50μl含有溶菌酶或HP于PBS中的溶液。所测试的溶菌酶的浓度是1×10⁶和5×10⁶U/mL(孔中的最终浓度分别是2×10⁵和1×10⁶U/mL)，并且HP的浓度是5mM和25mM(孔中的最终浓度分别是1mM和5mM)。将微孔板在37℃下在微需氧条件(5％CO₂)下孵育6小时。通过测定625nm下的吸光度来监测细菌生长。使用以下公式，通过比较在溶菌酶或HP存在下所观测到的相比于在没有这些试剂的情况下(阳性对照)的细菌菌株生长的增加量，计算生长百分比：

其中OD_LH是含有微生物和溶菌酶或HP的孔的光密度，

OD_C-是具有相同量的溶菌酶但没有微生物的三个孔的平均光密度，

OD_C+是接种有细菌但没有溶菌酶或HP的三个孔的平均光密度(阳性对照)。

结果：

五十个益生菌候选者中的七个即使在对照MRS培养基(没有补充)中也不生长。因此，舍弃这些菌株为潜在候选者。剩余43个根据其在所测试的最高浓度的溶菌酶和HP存在下的生长能力进行排序。结果展示于表1中并且表示为相比于相同菌株在没有补充溶菌酶或HP的培养基中的生长而言的存活率百分比的平均值。

表1：细菌对溶菌酶和过氧化氢浓度的耐受性.

缩写：n.i.＝无抑制(生长100％)；HP＝过氧化氢。

前25个细菌对溶菌酶和HP展示出最高耐受性，被视为最佳候选者并被选用于随后的体外测试以评估其益生菌特性。如可观察到，所有菌株对高浓度溶菌酶都展示出良好耐受性，展示不低于86％的存活率，所述存活率类似于商业对照的存活率。LAB候选者对HP也展示出良好的耐受性，在浓度为5mM的HP下，值高于84％。这些结果与商业对照罗伊氏乳杆菌DSM17938和唾液链球菌K12的存活率(分别是53.4和80.5％)十分相当。

实例5：使用瓜尔胶作为具有益生元作用的胶凝剂

体外研究菌株使用瓜尔胶并增加其生长的能力。为此目的，比较益生菌候选者在补充有瓜尔胶的人工唾液中的生长与益生菌候选者各自在没有补充的人工唾液中的生长。人工唾液含有1g/L‘Lab-lemco’粉(英国贝辛斯托克的Oxoid)、2g/L酵母提取物(Oxoid)、5g/L朊间质蛋白胨(Oxoid)、2.5g/L猪胃粘蛋白(英国普尔的西格玛化学品公司)、35g/L氯化钠(英国普尔的BDH化学品公司)、0.2g/L氯化钙(BDH)、0.2g/L氯化钾(BDH)于蒸馏水中。人工唾液用瓜尔胶(西班牙巴塞罗那的Genox Pharma)补足至0.5％(w/v)的最终浓度。还制备了没有凝胶成分的人工唾液以比较瓜尔胶在无补充培养基下在细菌生长方面的作用。在高压灭菌之后，每升人工唾液培养基加入1.25mL的40％尿素。用移液管移取200微升所制备的不同培养基到96孔板中。之后紧接着加入20微升在PBS中标准化到1E+07CFU/mL的益生菌候选者的悬浮液。没有细菌接种物的相同量的PBS用作阴性对照。将培养板在37℃下厌氧孵育24小时，并通过测定625nm下的光密度来监测细菌生长。根据以下公式计算益生菌候选者使用瓜尔胶进行生长的能力：

Δ生长＝(ΔDO_gp-ΔDO_g0)-(ΔDO_sp-ΔDO_s0)

其中ΔDO_gp是补充有瓜尔胶并接种有益生菌候选者的孔中，24小时后相比于0小时时在625nm下的光密度之间的差值；

ΔDO_g0是补充有瓜尔胶但是含有PBS而不是LAB的孔中，24小时时相比于0小时时在625nm下的光密度之间的差值；

ΔDO_sp是没有补充瓜尔胶并且接种益生菌候选者的孔中，24小时时相比于0小时时在625nm下的光密度之间的差值；并且

ΔDO_s0是没有补充瓜尔胶并且含有PBS而不是LAB的孔中，24小时时相比于0小时时在625nm下的光密度之间的差值。

将结果与用商业益生菌罗伊氏乳杆菌DSM 17938、短乳杆菌CD2、唾液链球菌K12和用病原体具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌获得的结果进行比较。实验一式两份地进行。

结果

使用瓜尔胶作为营养物并相比于无补充的人工唾液而言增强其生长的能力描绘于图1中。瓜尔胶对LAB生长的影响高度取决于所测试的菌株。相比于无补充的唾液，虽然瓜尔胶增强了一些菌株的生长，但是它对其它菌株的生长有有害作用。菌株PERI1、PERI2、PERI3、PERI4、F3163、I1003、I1005、I3028、I3030、I3140、I3142A、I3145以及I3153受益于瓜尔胶的加入。PERI1是展示出最高性能的菌株。在所测试的对照菌株中，短乳杆菌CD2和唾液链球菌K12受益于瓜尔胶的加入，但是瓜尔胶对这些菌株的生长的影响比其它LAB候选者低，其它LAB候选者例如PERI1、PERI2、PERI3、F3163、I1003和3142A。值得注意的是，在所关心的是避免病原体的不合需要的生长的具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的情况下，瓜尔胶的影响可忽略不计。

实例6：使用羟乙基纤维素(HEC)作为具有益生元作用的粘合剂

如上文在实例5中关于瓜尔胶所解释的，分析菌株使用HEC增强其生长的能力。

结果

HEC对益生菌生长的影响对比非人工唾液展示于图2中。少数菌株的生长因为HEC的加入而增强。通过在凝胶中使用HEC而显著受益的菌株是PERI4、I1005和I3142A。包括商业菌株在内的其它菌株使用此成分的能力低下。

实例7：使用其它胶凝剂作为具有益生元作用的成分

其它胶凝剂增加益生菌生长的潜在用途也是通过使用与以上所说明的相同方法来研究的。具体来说，使用海藻酸钠(SA)和甲基纤维素(MC)作为具有益生元作用的潜在胶凝剂。

结果

SA补充对细菌生长的影响对比无补充的人工唾液描绘于图3中。不同菌株能够使用SA作为增加其生长的营养物，所述菌株包括PERI、PERI2、PERI3、PERI4、I1003、I1005、I3028、I3030、I3130、I3142A、I3145以及I3153。相比之下，具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌使用SA进行生长的能力低下。MC的结果呈现于图4中。病原体和对照菌株中没有一个能够使用MC来增加生长。相比之下，不同益生菌菌株受益于MC的补充，所述益生菌菌株包括F2008A、PERI2、F2043、PERI4、I1003、I1005、I3028、I3061、I3118、I3140以及I3142A。

实例8：对牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和中间普雷沃菌的拮抗作用.

评定益生菌候选者对呈现种植体周围炎的患者体内异常丰富的细菌的拮抗活性。具体来说，病原体菌株是牙龈卟啉单胞菌DSM-20709、具核梭杆菌DSM 20482和中间普雷沃菌DSM-20706DSM 8324。来自拜奥(瑞典)的罗伊氏乳杆菌DSM 17938、短乳杆菌CD2(美国VSL制药公司(VSL Pharmaceuticals,Inc.,USA))和唾液链球菌K12(新西兰布利斯技术公司)用作商业对照。通过使用坎贝尔方案(Campbell protocol)判定LAB候选者抑制病原体生长的能力。简单来说，将益生菌候选者和乳杆菌属对照均一地接种在MRS琼脂板中并使其在37℃和5％CO₂下生长汇合24小时。使唾液链球菌K12在相同条件下生长，但是使用BHI培养基。

将病原体菌株培养过夜。使用这些病原体的分离后菌落在磷酸盐缓冲盐水(PBS)培养基中制备悬浮液并且均一地拭抹在适合其生长的固体培养基中：将具核梭杆菌和中间普雷沃菌接种在血琼脂中并将牙龈卟啉单胞菌接种在Schaeder Anaerobe羊血琼脂中。紧接着，将所测试的LAB候选者的汇合琼脂板的直径6mm的圆柱段逐道(lane-to-lane)放置在接种有病原体的培养板上，使接种有病原体的培养板面对圆柱段中的一个的生长琼脂侧和另一个圆柱段的非生长侧。将培养板在37℃下在厌氧条件下孵育48小时。接着，通过将琼脂板平放在尺子上并测量病原体生长被抑制(部分地或完全地)的晕圈(halos)来测量抑制区。接着通过从抑制区直径(inhibition zone diameter，IZD)中减去圆柱直径(cylinderdiameter，CD)来计算生长抑制活性(Growth inhibitory activity，GI)，所述直径以毫米为单位测量。最终抑制活性按照以上所提到的两个圆柱段关于每种益生菌菌株的GI值的平均值来计算，也就是对一式两份取平均。所有实验一式两份地进行。

结果

不同益生菌候选者的拮抗活性详述于表2中。菌株PERI3、PERI4和F3166是对具核梭杆菌展示出最大活性的三种菌株，并且展示出比短乳杆菌CD2、罗伊氏乳杆菌DSM 17938和唾液链球菌K12更高的活性。候选者F1031和PERI2是对中间普雷沃菌展示出最高活性的候选者。若干菌株也可有效抑制牙龈卟啉单胞菌。其中PERI1、F2006、PERI2、F3163、I1003、I3143、I3145和I3153展示出比用于比较目的使用的商业对照更高的活性。

表2.对具核梭杆菌、中间普雷沃菌和牙龈卟啉单胞菌的抑制活性(结果表示为平均值±SD，以mm为单位)

实例9：对伴放线凝聚杆菌的拮抗作用.

在液体培养基中研究益生菌候选者对伴放线凝聚杆菌的抗拮活性。使益生菌候选者和乳杆菌属对照在37℃下在微需氧条件(5％CO₂)下在MRS液体培养基中生长过夜。使唾液葡萄球菌K12在相同条件下生长，但是使用BHI培养基。将培养物离心并通过0.22微米过滤上清液。向含有160ml BHI培养基的96孔微量培养板中加入20微升过滤后的上清液。最后向孔中加入20ml在PBS中标准化到1E+05CFU/mL的伴放线凝聚杆菌悬浮液，并在微需氧条件(5％CO₂)下在37℃下孵育24小时。通过测定625nm下的吸光度来监测伴放线凝聚杆菌。通过使用以下公式，通过比较伴放线凝聚杆菌在补充有益生菌上清液时的生长与其在没有补充时的生长(阴性对照)来判定益生菌上清液的抑制能力：

其中，

DO_C对应于阴性对照并且是含有160μl BHI培养基+20μl伴放线凝聚杆菌悬浮液+20μl MRS或BHI的孔在625nm下的光密度，

DO_B对应于空白并且是含有160μl BHI培养基+40μl MRS或BHI的孔在625nm下的光密度，并且

DO_P对应于益生菌候选者并且是含有160μl BHI培养基+20μl伴放线凝聚杆菌悬浮液+20μl益生菌上清液的孔在625nm下的光密度。

所有实验一式两份地进行。

结果

益生菌候选者对伴放线凝聚杆菌的抑制活性描绘于图5中。在不同菌株中，PERI3展示出最大活性，能够使伴放线凝聚杆菌的生长减少77.9％。这种活性显著高于商业对照，例如短乳杆菌CD2、罗伊氏乳杆菌DSM17938并且尤其是唾液链球菌K12(分别是45.6％、38.8％和2.42％)。

实例10：形成聚集体的能力

细菌的自动聚集能力被视为是形成生物膜所必需的第一步并且可用作用于评估菌株的潜在生物膜形成能力的特征。生物膜形成产生了可减少病原体粘附于口腔表面的保护性屏障。评估益生菌候选者PERI、PERI2、PERI3、PERI4、I3142A、I1005、I3030和I3145形成聚集体的能力。短乳杆菌CD2和唾液链球菌K12用作对照。使菌株在MRS培养基(或对于唾液链球菌K12来说是BHI)中在37℃和微需氧条件(5％CO₂)下生长过夜。在这个阶段之后，使培养物在1000g下离心5分钟，舍弃上清液并将离心块用PBS洗涤两次。最后，加入PBS，直到获得光密度等于麦氏比浊标准1(大约3E+08CFU/mL)的益生菌悬浮液。将3mL悬浮液转移到分光光度计比色皿中并监测620nm下的光密度，持续3小时和6小时。通过使用以下公式确定在此时间间隔下的自动聚集能力：

其中DO₀是在测试开始时(0时)细菌悬浮液在620nm下的净吸光度，并且

DO_t是在3小时或6小时时细菌悬浮液在620nm下的净吸光度。

结果

在3小时和6小时时的聚集百分比概述于表3中。益生菌候选者PERI4是展示出最高自动聚集能力的菌株，而候选者I3030和唾液链球菌K12展示出最低活性。

表3：益生菌候选者的聚集百分比

实例11：制备用于种植体应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将500g经过冷冻干燥的以4E+10cfu/g含有片球菌属CECT 8904、片球菌属CECT8905和片球菌属CECT 8906的粉末、200g瓜尔胶和300g羟乙基纤维素混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有螺帽的玻璃小瓶中。在加入2.5ml水、优选去离子水或蒸馏水并且手动摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的瓜尔胶的浓度是4％并且羟乙基纤维素是6％。

实例12：制备用于种植体应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将535g经过冷冻干燥的以3.75E+10cfu/g含有片球菌属CECT 8904和片球菌属CECT 8905的粉末、150g海藻酸钠、15g乙酸钙和300g羟乙基纤维素混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有隔片和铝胶囊的玻璃小瓶中。在用注射器加入2.5mL水、优选去离子水或蒸馏水并用手摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10CFU/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的海藻酸盐的浓度是3％并且羟乙基纤维素是6％。

实例13：制备用于种植体应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将700g经过冷冻干燥的以2.9E+10cfu/g含有片球菌属CECT 8904、片球菌属CECT8905和片球菌属CECT 8906的粉末、200g瓜尔胶和100g聚乙烯吡咯烷酮混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有隔片和铝胶囊的玻璃小瓶中。在用注射器加入2.5mL水、优选去离子水或蒸馏水并用手摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的瓜尔胶的浓度是4％并且聚乙烯吡咯烷酮是2％。

实例14：制备用于种植体应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将500g经过冷冻干燥的以4E+10cfu/g含有片球菌属CECT 8904、片球菌属CECT8905和片球菌属CECT 8906的粉末和500g瓜尔胶混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有螺帽的玻璃小瓶中。在加入6ml水、优选去离子水或蒸馏水并且手动摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的瓜尔胶的浓度是4％。

实例15：制备用于牙齿应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将600g经过冷冻干燥的以3.35E+10cfu/g含有片球菌属CECT 8903的粉末、100g瓜尔胶和300g羟乙基纤维素混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有螺帽的玻璃小瓶中。在加入2.5ml水、优选去离子水或蒸馏水并且手动摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的瓜尔胶的浓度是2％并且羟乙基纤维素是6％。

实例16：制备用于牙齿应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将590g经过冷冻干燥的以3.4E+10cfu/g含有片球菌属CECT 8903的粉末、100g海藻酸钠、10g乙酸钙和300g羟乙基纤维素混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有螺帽的玻璃小瓶中。在加入2.5ml水、优选去离子水或蒸馏水并且手动摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的海藻酸盐的浓度是2％并且羟乙基纤维素是6％。

实例17：制备用于牙齿应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将280g经过冷冻干燥的以7E+10cfu/g含有片球菌属CECT 8906的粉末和720g羟乙基纤维素混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有螺帽的玻璃小瓶中。在加入6ml水、优选去离子水或蒸馏水并且手动摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的羟乙基纤维素的浓度是6％。

实例18：制备用于牙齿应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将600g经过冷冻干燥的以4E+10cfu/g含有短乳杆菌CD2的粉末、100g瓜尔胶和300g羟乙基纤维素混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有螺帽的玻璃小瓶中。在加入2.5ml水、优选去离子水或蒸馏水并且手动摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的瓜尔胶的浓度是2％并且羟乙基纤维素是6％。

实例19：制备用于牙齿应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将590g经过冷冻干燥的以4E+10cfu/g含有短乳杆菌CD2的粉末、100g海藻酸钠、10g乙酸钙和300g羟乙基纤维素混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有螺帽的玻璃小瓶中。在加入2.5ml水、优选去离子水或蒸馏水并且手动摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的海藻酸盐的浓度是2％并且羟乙基纤维素是6％。

实例20：制备用于牙齿应用的呈粉末形式的可重构的益生菌凝胶

将700g经过冷冻干燥的以2.9E+10cfu/g含有唾液链球菌K12的粉末、200g瓜尔胶和100g聚乙烯吡咯烷酮混合并均质化。将0.5g此粉末共混物引入设置有隔片和铝胶囊的玻璃小瓶中。在用注射器加入2.5mL水、优选去离子水或蒸馏水并用手摇动之后，形成了重构凝胶。益生菌的最终剂量是1E+10cfu/小瓶。在凝胶重构之后，凝胶中的瓜尔胶的浓度是4％并且聚乙烯吡咯烷酮是2％。

实例21.可重构的益生菌凝胶在种植体周围炎患者中的应用

去除牙冠并给予患者局部麻醉。清洁此区域并以机械方式去除龈下牙菌斑。给予双氯苯双胍己烷0.12％，并在这之后，给予生理盐水溶液。通过向经过冷冻干燥的以4E+10cfu/g含有片球菌属CECT 8904、片球菌属CECT 8905和片球菌属CECT 8906的粉末、200g瓜尔胶和300g羟乙基纤维素中加入2.5mL无菌水并剧烈混合1分钟，获得实例11的重构凝胶。使混合物在室温下静置1分钟到10分钟的一段时间并用注射器和钝尖端针将所述混合物给予种植体周围袋，使钝针尖端位于袋底部附近并注入产品，直到溶液到达牙龈上边缘。接着，在从袋中抽出针之后，在经过治疗的区域施用生理盐水溶液洗涤和空气喷射(持续约10秒)。之后紧接着将牙冠放在适当位置。嘱咐患者在治疗后6小时内不要刷牙。

实例22.可重构的益生菌凝胶在患者中预防龋齿的应用

用牙刷清洁牙齿并清洁掉厚厚的牙菌斑或残渣。待处理的牙齿略微风干并用棉卷隔离以防止被唾液再污染。借助于刷子给牙齿分配少量(0.5ml)根据实例15制得的凝胶。嘱咐患者在当天剩下的时间里避免刷牙。

实例23.可重构的益生菌凝胶在患者中预防龋齿的应用.

用牙刷清洁牙齿并清洁掉厚厚的牙菌斑或残渣。用6mL水重构包含50mg益生菌菌株、120mg瓜尔胶和360mg羟乙基纤维素的自成膜组合物，紧接着用注射器抽取。使凝胶在注射器中静置1分钟，然后均一地分布在口腔夹板中。随后，紧接着将夹板用于口腔中并在5分钟之后去除。给患者提供更多含有自成膜组合物的小瓶并嘱咐患者按照相同的程序每48小时就自己给予重构凝胶，优选是在晚上刷牙之后，临睡觉之前。嘱咐患者在施用凝胶之后不要刷牙、吃东西或喝饮料。

实例24：可重构的益生菌凝胶在动物模型中的功效研究.

在作为动物模型的比格犬(Beagle dog)中研究益生菌凝胶对于预防粘膜炎和种植体周围炎的功效。所有程序全都在兽医的监督下进行。通过将乙酰丙嗪(acepromazine)(0.12％-0.25mg/kg)、丁丙诺啡(buprenorphine)(0.01mg/kg)和美托咪定(medetomidine)(35lg/kg)肌肉内注射于股四头肌中，对动物进行预麻醉。将静脉内导管(直径22或20号)插入头静脉中，并以缓慢的恒定的输注速率以0.4mg/kg/min的速率输注丙泊酚(propofol)。在手术部位给予常规的牙齿浸润麻醉(阿替卡因(articaine)40mg，1％肾上腺素)。下颌的两个四分象限(quadrants)第二前臼齿(PM2)和第一臼齿(M1)用作实验部位。用碳化钨钻子将牙齿切开并用钳子去除牙根，而不破坏其余骨壁。沿着肺泡旁的前庭和舌区作出沟缘切口，分离组织以便能看见牙槽嵴顶硬组织壁。在部位愈合两个月之后，将8个种植体放置在牙槽嵴顶并用愈合杯另外再愈合两个月。在愈合两个月之后，在每个基牙周围放置结扎丝线。还在种植体周围给予口腔凝胶。用重构液体凝胶处理五只狗，所述重构液体凝胶含有4％瓜尔胶、6％羟乙基纤维素和4CFU/mL由片球菌属CECT 8904、片球菌属CECT 8905和片球菌属CECT 8906(1:1:1)组成的益生菌混合物。用不含益生菌的相同凝胶处理其中一只动物。接着给动物喂食软食以诱导牙菌斑累积并引起种植体周围炎症和骨丧失。每两周在前述各者和种植体周围放置额外的结扎线。

所有手术后的愈合都很正常，没有观察到暴露或二次伤口愈合。实验性种植体周围炎导致了炎症和骨丧失的征象。一般来说，相比于经过不含益生菌的凝胶处理的动物，经过益生菌凝胶处理的动物展示不太明显的组织丧失、炎症反应、探诊深度(probingdepth)、粘膜凹陷以及探诊时出血。因此，益生菌处理改善了与种植体周围炎有关的临床征象。

实例25：研究胶凝剂和生物粘附剂的流变特性

研究不同试剂的粘性和粘附性。研究以下组合物：

-在水中的浓度在2到8％(w/v)范围内的海藻酸钠，含或不含一定浓度(0.02-0.2％)的乙酸钙。

-在水中的浓度在1到5％(w/v)范围内的瓜尔胶。

-在水中的浓度在1到5％(w/v)范围内的甲基纤维素。

-在水中的浓度在1到6％(w/v)范围内的羟乙基纤维素。

-在水中的浓度在1到3％(w/v)范围内的羧甲基纤维素钠。

表4.粘性和粘附性能力：

试剂	粘性	粘附性	观察结果
				海藻酸钠	高	非常低	在高浓度下结块
瓜尔胶	非常高	非常低	良好的溶解度
				甲基纤维素	低	非常低	在搅拌下形成泡沫
羟乙基纤维素	非常低	非常高	良好的溶解度
				羧甲基纤维素	非常低	低	良好的溶解度

赋予成膜组合物的粘性和粘附性取决于所用试剂，取决于凝胶的临床应用，提供了不同的可能性。与海藻酸钠的组合，并且尤其是瓜尔胶与羟乙基纤维素，视为是形成组合了例如高粘性和高粘附性等特性的凝胶的良好候选者。

参考文献

专利文献

JP20100053062，日本新时代株式会社(Sunstar Inc.)，2010年3月11日。

非专利文献

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Claims

1.一种在液体介质存在下在搅拌下自成膜的呈粉末形式的自成膜组合物，所述组合物包含：

(i)至少一种呈粉末形式的胶凝剂，

(ii)至少一种呈粉末形式的生物粘附剂，以及

(iii)至少一种呈粉末形式的乳酸菌菌株，

其中(i)、(ii)和(iii)在单个容器中或在单独的容器中；

其中所述自成膜组合物局部给予；

其中所述(i)至少一种胶凝剂呈用于为所述组合物提供粘性的量，并且选自以下组成的组：(a)淀粉，(b)胶，(c)海藻多糖，(d)选自果胶和麦芽糊精组成的组的多糖，(e)纤维素衍生物，(f)选自明胶、胶原蛋白和酪蛋白组成的组的多肽；并且

其中所述(ii)至少一种生物粘附剂呈用于为所述组合物提供粘附性的量，并且选自以下组成的组：(a)胶，(b)海藻多糖，(c)纤维素衍生物，(d)选自果胶和麦芽糊精组成的组的多糖，以及(e)选自基于丙烯酸酯的聚合物、基于乙烯基的聚合物和阳离子多糖组成的组的聚合物。

2.根据权利要求1所述的呈粉末形式的自成膜组合物，其中所述胶凝剂和所述生物粘附剂对所述至少一种乳酸菌没有杀菌作用。

3.根据权利要求2所述的呈粉末形式的自成膜组合物，其中所述胶凝剂和所述生物粘附剂对所述至少一种乳酸菌没有抑菌作用。

4.根据权利要求3所述的呈粉末形式的自成膜组合物，其中所述胶凝剂或所述生物粘附剂对所述至少一种乳酸菌具有益生元作用。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的自成膜组合物，其中所述胶凝剂选自胶和海藻多糖组成的组并且所述生物粘附剂选自纤维素衍生物和基于乙烯基的聚合物组成的组。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的自成膜组合物，其中所述乳酸菌菌株属于片球菌属。

7.根据权利要求6所述的自成膜组合物，其中所述片球菌属菌株选自以下组成的组：以登录号CECT 8903保藏的菌株、菌株CECT 8904、菌株CECT 8905、菌株CECT 8906。

8.一种在液体介质存在下在搅拌下自成膜的呈粉末形式的自成膜组合物，所述组合物包含：

(i)至少一种选自胶凝剂和生物粘附剂组成的组的呈粉末形式的试剂，和

(ii)至少一种呈粉末形式的片球菌属菌株，

其中(i)和(ii)在单个容器中或在单独的容器中。

9.根据权利要求8所述的自成膜组合物，其中所述片球菌属菌株选自以下组成的组：以登录号CECT 8903保藏的菌株、菌株CECT 8904、菌株CECT 8905、菌株CECT 8906。

10.一种用于制备重构配方的方法，包含在搅拌下混合根据权利要求1到9中任一项所述的呈粉末形式的自成膜组合物与液体介质。

11.一种重构配方，可通过根据权利要求10所述的方法获得。

12.根据权利要求11所述的重构配方，其中所述最终重构配方中胶凝剂和生物粘附剂每种试剂的量是0.05到20％(w/v)。

13.根据权利要求12所述的重构配方，其中在所述最终重构配方中，胶凝剂的量是1到5％(w/v)并且生物粘附剂的量是4到10％(w/v)。

14.根据权利要求1到9中任一项所述的呈粉末形式的自成膜组合物或根据权利要求11到13中任一项所述的重构配方，用作药物。

15.根据权利要求1到9中任一项所述的呈粉末形式的自成膜组合物或根据权利要求11到13中任一项所述的重构配方，用于预防和/或治疗选自以下组成的组的病况：种植体周围炎、粘膜炎、牙周炎、牙龈疾病、龋齿、口腔念珠菌病、唇疱疹以及脓疱。

16.一种根据权利要求1到9中任一项所述的呈粉末形式的自成膜组合物或根据权利要求11到13中任一项所述的重构配方的用途，用于口腔护理。

17.一种用于口腔使用的试剂盒，包含：

1)根据权利要求1到9中任一项所述的呈粉末形式的自成膜组合物或根据权利要求11到13中任一项所述的重构配方；和

2)用于将根据权利要求1到9中任一项所述的呈粉末形式的自成膜组合物或根据权利要求11到13中任一项所述的重构配方施用于颊腔的装置。

18.一种属于片球菌属的分离的菌株，用于预防和/或治疗选自种植体周围炎和粘膜炎组成的组的病况。

19.一种保藏在西班牙典型培养物保藏中心的属于片球菌属的分离的菌株，选自以下组成的组：以登录号CECT 8903保藏的菌株、菌株CECT 8904、菌株CECT 8905以及菌株CECT8906。