CN121203922A

CN121203922A - 一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的戊糖片球菌及其制剂和应用

Info

Publication number: CN121203922A
Application number: CN202511783763.2A
Authority: CN
Inventors: 王永平; 杨树俊; 王永存; 王小珊; 孟祥烁; 格日乐其木格
Original assignee: Weikaihaisi Shandong Bioengineering Co ltd
Current assignee: Weikaihaisi Shandong Bioengineering Co ltd
Priority date: 2025-12-01
Filing date: 2025-12-01
Publication date: 2025-12-26

Abstract

本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的戊糖片球菌及其制剂和应用。该戊糖片球菌已于2023年05月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27356。本发明提供的戊糖片球菌能够显著抑制变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌、粘性放线菌和伴放线聚集杆菌等口腔病原菌的生长繁殖，有利于口腔菌群平衡，可广泛用于预防或治疗龋齿、牙周炎等口腔疾病。

Description

一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的戊糖片球菌及其制剂和应用

技术领域

本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的戊糖片球菌及其制剂和应用。

背景技术

龋齿是一种在细菌为主的多种因素共同作用下发生的牙齿硬组织慢性进行性破坏疾病。龋齿的形成过程主要是口腔中的致病菌代谢食物残渣中的碳水化合物产生酸性物质，长期作用于牙齿硬组织，导致牙釉质和牙本质脱矿化，进而形成龋洞。若不及时干预，病变会持续发展，不仅会引起牙齿疼痛、影响咀嚼功能，还可能引发牙髓炎、根尖周炎等并发症，甚至影响全身健康。牙周病则是一组以牙周组织炎症和破坏为主要特征的疾病，主要包括牙龈炎和牙周炎，其常见临床表现为牙龈红肿出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收，晚期还可能出现牙齿松动、移位甚至脱落，严重影响患者的口颌系统功能和美观。口腔微生态失衡时，条件致病菌转变为优势致病菌，通过侵袭牙周组织、引发炎症反应等机制导致牙周病的发生，给患者的日常生活带来诸多不便。

与龋齿和牙周病发生密切相关的致病菌主要包括变异链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌和伴放线聚集杆菌。变异链球菌是公认的主要致龋菌，其能够产生大量酸性代谢产物，同时具备较强的牙面粘附能力，可在牙齿表面形成生物膜，持续破坏牙体硬组织，是导致龋齿发生和发展的核心致病菌。牙龈卟啉单胞菌则是牙周炎的关键致病菌之一，该菌株能够产生多种毒素和酶类，破坏牙周组织细胞的结构和功能，同时抑制宿主的免疫防御反应，加速牙周袋形成和牙槽骨吸收，对牙周健康造成严重威胁。具核梭杆菌作为一种重要的牙周病相关致病菌，常存在于深牙周袋中，其不仅自身具有致病作用，还能促进菌群在牙周组织的定植和炎症扩散，加重牙周组织的破坏。粘性放线菌可参与牙菌斑生物膜的形成，其代谢产生的酸性物质同样会对牙齿硬组织造成损伤，同时还能引发牙龈组织的炎症反应，是龋齿和牙龈炎的共同相关致病菌。伴放线聚集杆菌则是侵袭性牙周炎的主要致病菌，其具有较强的侵袭能力，可直接侵入牙周组织，导致炎症快速进展，造成严重的牙槽骨吸收，且发病年龄相对较轻，对青少年和年轻成年人的口腔健康危害较大。这些致病菌在口腔内相互作用、协同致病，共同推动了龋齿和牙周病的发生与发展。

传统的口腔疾病治疗方法主要包括机械清洁和药物治疗，机械清洁如刷牙、洗牙等虽然能在短期内减少牙菌斑和牙结石，但难以彻底清除牙周袋等隐蔽部位的细菌，且无法从根本上调节口腔微生态平衡；药物治疗如抗生素的使用，虽然能暂时抑制致病菌生长，但长期使用容易导致细菌耐药性增加，还会破坏口腔内正常的菌群结构，进一步加剧口腔微生态失衡。因此，寻找更加安全、温和且有效的干预方式具有重要意义。益生菌作为一类对宿主健康有益的活的微生物，通过调节肠道微生态平衡发挥益生功效的研究已较为成熟，近年来其在口腔健康领域的应用也受到广泛关注。益生菌能够通过分泌抗菌物质、与致病菌竞争性定植、调节宿主免疫反应等机制抑制口腔致病菌的生长繁殖，改善口腔微生态环境，为龋齿和牙周病的防治提供了新的思路。

公开号为CN 118146972 A的中国发明专利申请公开了一种改善口腔健康的益生菌组合物，该益生菌组合物包含瑞士乳杆菌K6以及嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、戊糖片球菌等多种益生菌，能够有效凝聚口腔有害菌，改善口腔微生态环境，预防龋齿的发生，减缓牙龈肿痛，同时减少口腔异味。根据其说明书记载，该戊糖片球菌所起到的作用是能够抑制食源性致病菌，有助于提高免疫力，可以降低机体的胆固醇，调节机体的代谢问题，其功能定位与龋齿、牙周病相关的致病菌抑制无关，未能针对龋齿和牙周病的核心致病菌发挥直接的拮抗作用，在口腔疾病针对性防治方面存在局限性。

公开号为CN 120888446 A的中国发明专利申请公开了一种预防和/或抑制口腔病原菌的益生菌组合物，该益生菌组合物包含鼠李糖乳酪杆菌菌株A21149、植物乳植杆菌菌株A21241、戊糖片球菌菌株A21358等多种菌株，其代谢物能有效抑制变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌等多种病原菌，在预防和缓解龋齿、牙周炎、口臭等口腔问题方面具有应用前景。该技术方案提供的益生菌组合物中虽然包含戊糖片球菌菌株A21358，但其说明书明确记载该菌株的核心功效是能够通过增强凝集、降低尿素酶活性、调节炎症因子等多种机制，有效抑制幽门螺旋杆菌的生长和感染，减轻其引起的炎症反应，并非针对龋齿和牙周病的核心致病菌发挥主要抑制作用。更重要的是，该组合物需要多种菌株按特定的质量份比例配合使用才能实现较好的常见口腔病原菌抑制效果，单一菌株的作用有限，且菌株组合较为复杂，增加了产品制备和质量控制的难度。

公开号为CN 116445367 A的中国发明专利申请公开了一种改善口腔健康的戊糖片球菌JYPR 9330及其菌剂，该戊糖片球菌JYPR 9330的功能仅局限于抑制龋齿的致病菌变异链球菌。对于牙周病相关的关键致病菌如牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌等，该菌株并未表现出抑制作用，无法满足牙周病防治的需求，适用范围较为狭窄，难以全面解决口腔微生态失衡引发的多种口腔健康问题。

此外，上述三篇技术方案还存在共同的不足。一方面，这些方案均未对所涉及菌株本身的潜在危害性进行系统评价，口腔益生菌直接作用于口腔环境，与牙齿硬组织和口腔黏膜直接接触，其产酸能力、对牙齿的腐蚀性等特性直接关系到使用安全性，若菌株产酸能力过强，可能会对牙齿硬组织造成额外损伤，反而增加龋齿风险，但现有技术均未针对这一关键安全性指标进行评估。另一方面，这些方案缺乏对牙齿炎症水平的评价，未能明确菌株在缓解口腔炎症方面的具体效果，也未涉及对牙龈上皮细胞免疫调节功能的研究。口腔疾病的发生发展与宿主的免疫反应密切相关，致病菌引发的炎症反应是导致牙周组织损伤的重要机制，而牙龈上皮细胞作为口腔黏膜的重要组成部分，其免疫调节功能的平衡对于维持口腔健康至关重要，现有技术未能关注菌株对牙龈上皮细胞免疫反应的调节作用，无法从炎症调控层面实现对口腔疾病的有效干预，使得其在口腔健康维护方面的功效不够全面，难以满足人们对口腔护理产品多功能、深层次的需求。

因此，开发一种能够针对性抑制龋齿和牙周病致病菌，具有良好生物安全性且能调节口腔免疫炎症反应的益生菌菌株及相关产品，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

发明内容

针对目前缺少具有口腔安全性，且可以调节口腔致病菌引起的炎症免疫反应，同时能够抑制变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、粘性放线菌和伴放线聚集杆菌等多种口腔病原菌的戊糖片球菌的技术问题，本发明提供一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的戊糖片球菌及其制剂和应用，该戊糖片球菌能够显著抑制变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌、粘性放线菌和伴放线聚集杆菌等口腔病原菌的生长繁殖，有利于口腔菌群平衡，可广泛用于预防或治疗龋齿、牙周炎等口腔疾病。

本发明技术方案如下：

第一方面，本发明提供一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus ）HC3368，该菌株已于2023年05月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27356。

第二方面，本发明提供一种由上述戊糖片球菌HC3368制备的益生菌制剂。

进一步的，益生菌制剂中包含戊糖片球菌HC3368和/或戊糖片球菌HC3368的发酵产物。

进一步的，益生菌制剂的制备方法为：

按体积百分比1%的接种量将戊糖片球菌HC3368接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24 h，然后将新鲜菌液以8000 r/min转速离心10 min，弃去上清液，获得菌体；将菌体洗涤后重悬成悬浮液，即得。

进一步的，益生菌制剂的制备方法为：

按体积百分比1%的接种量将戊糖片球菌HC3368接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养24 h，然后将新鲜菌液在4℃下8000 r/min离心10 min，获取发酵上清液，即得。

进一步的，益生菌制剂可以为保健品、功能性食品、药品或口腔护理用品。作为优选，益生菌制剂为口腔护理用品，口腔护理用品限定于口腔内部局部作用，具体是指可在口腔黏膜、牙齿表面等口腔内部接触区域，通过涂抹、冲洗、清洁等方式发挥功效，常见品类包括牙膏、抛光粉、牙粉、牙线、牙齿清洁液、漱口水、口腔喷雾或牙齿清洁泡沫等。

第三方面，本发明提供一种上述戊糖片球菌HC3368在制备具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的益生菌制剂中的应用。

进一步的，由戊糖片球菌HC3368制备的益生菌制剂对口腔致病菌具有抑制作用，口腔致病菌包括变异链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌和伴放线聚集杆菌。

进一步的，由戊糖片球菌HC3368制备的益生菌制剂能够调节口腔致病菌引起的炎症免疫反应，降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8水平。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的戊糖片球菌HC3368对人工肠胃液具有很强的耐受性，在人工肠胃液中能进行萌发。该菌株不产生溶血素，不能够溶解血细胞，具有良好的生物安全性。该菌株能够清除DPPH和HRS自由基，抑制脂质过氧化，具有一定的抗氧化功能活性，能够降解胆固醇，具有降低血清胆固醇的益生特性。

本发明提供的戊糖片球菌HC3368产酸能力和对牙齿的腐蚀性弱于口腔致病菌，对牙齿无潜在危害性。戊糖片球菌HC3368能够产生一定的胞外多糖，无论是对牙齿还是牙龈上皮细胞均具有良好的粘附性能，有利于该菌株在口腔中定植。戊糖片球菌HC3368还能够通过产生细菌素等蛋白类物质对变异链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌和伴放线聚集杆菌等口腔致病菌发挥抑制作用，菌悬液和发酵上清液均可发挥该作用。其发挥抑制作用的机制包括与口腔致病菌发生共聚集效应，降低口腔致病菌在牙齿表面形成的生物膜，从而减少龋齿和牙周病等口腔疾病的发生风险。此外，戊糖片球菌HC3368还可以调节口腔致病菌引起的炎症免疫反应，降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8水平。

本发明提供的戊糖片球菌HC3368无需与益生元和/或其它益生菌复配即可对口腔健康起到保护功效，且长期服用不会有副作用及过量的风险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中戊糖片球菌HC3368的菌落形态图。

图2是实施例1中戊糖片球菌HC3368的结晶紫染色显微镜检照片。

图3是实施例2中戊糖片球菌HC3368的API 50 CHL碳源代谢鉴定图谱。

图4是实施例2中戊糖片球菌HC3368的RAPD指纹图谱。

图5是实施例2中戊糖片球菌HC3368的rep-PCR指纹图谱。

图6是实施例5中戊糖片球菌HC3368对牙齿腐蚀性结果图。

图7是实施例6中实验1的戊糖片球菌HC3368产糖性结果图。

图8是实施例6中实验2的戊糖片球菌HC3368模拟牙齿粘附性结果图。

图9是实施例9中实验1的戊糖片球菌HC3368自凝集效果图，图9中（a）是2 h的自凝集效果图，（b）是4 h的自凝集效果图，（c）是6 h的自凝集效果图。

图10是实施例9中实验2的戊糖片球菌HC3368与致病菌共凝集效果图，图10中（a）是戊糖片球菌HC3368与变异链球菌的共凝集效果图，（b）是戊糖片球菌HC3368与致病菌的共凝集效果图，（c）是戊糖片球菌HC3368与具核梭杆菌的共凝集效果图，（d）是戊糖片球菌HC3368与粘性放线菌的共凝集效果图，（e）是戊糖片球菌HC3368与伴放线聚集杆菌的共凝集效果图。

图11是实施例10的戊糖片球菌HC3368对口腔致病菌生物膜消除结果图。

图12是实施例11中实验1的不同处理组的促炎细胞因子浓度柱状图，图12中（a）是IL-1β浓度柱状图，（b）是IL-6浓度柱状图，（c）是IL-8浓度柱状图。

图13是实施例11中实验2的不同处理组的促炎细胞因子浓度柱状图，图13中（a）是IL-1β浓度柱状图，（b）是IL-6浓度柱状图，（c）是IL-8浓度柱状图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

除特别说明的以外，本发明具体实施方式中所指的接种液均按照如下方法获得：

在无菌条件下，取适量新鲜的戊糖片球菌HC3368菌液，5000 r/min离心5 min，用PBS缓冲液洗两次，再用等体积PBS缓冲液重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。

除特别说明的以外，本发明具体实施方式中所指的戊糖片球菌HC3368菌悬液均按照如下方法获得：

按体积百分比1%的接种量将菌株接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24 h，然后将新鲜菌液以8000 r/min转速离心10 min，弃去上清液，获得菌体。用PBS缓冲液（pH=7.0）洗涤两次后重悬菌体，直至吸光度OD_{600 nm}达到0.5~0.6之间，得到菌悬液备用。

除特别说明的以外，本发明具体实施方式中所指的戊糖片球菌HC3368发酵上清液均按照如下方法获得：

按体积百分比1%的接种量将菌株接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养24 h，然后将新鲜菌液在4℃下8000 r/min离心10 min，获取发酵上清液。

实施例1 戊糖片球菌HC3368的分离筛选

1、初筛

2022年12月，在广东省阳江市对新鲜的发酵豆豉样品取样，经100 mL无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100 μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后37℃厌氧培养48 h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，共筛选出35株潜在乳酸杆菌，依次命名为HC3350、HC3351、……、HC3383、HC3384。

2、复筛

配制1 L的MRS液体培养基，121℃高压灭菌15 min，待培养基冷却后，加入3.2 g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置于37℃水浴摇床中保温1 h，制成耐酸性培养基。将初筛得到的35株乳酸杆菌按6%接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃下厌氧静置培养48 h，取发酵液进行菌量计数。

结果显示，经耐酸性培养基复筛后，35株乳酸杆菌中的HC3368菌株活菌量最多，对数值高达11.03 Log₁₀CFU/mL，说明HC3368菌株的耐酸能力最高。

将HC3368菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24 h后，如图1所示，HC3368单菌落呈米白色，菌落直径在1.5-2.5 mm左右，表面湿润光滑，边缘整齐且不透明，表面隆起。经结晶紫染色后，光学显微镜下HC3368菌株呈球形，光滑，成单、成团或成簇状排列，革兰氏染色阳性，不形成芽孢（如图2所示）。

实施例2 戊糖片球菌HC3368的鉴定

1、API 50 CHL碳源代谢实验

利用API 50 CHL试剂条验证HC3368菌株的碳源代谢能力。实验方法及结果分析具体参考API 50CHL试剂盒说明书。API试验结果见图3，HC3368菌株与戊糖片球菌的ID值为99.9%且T值=0.98，碳水化合物代谢活性基本相同，鉴定结果为极好。

因此，根据碳源代谢结果，可初步鉴定HC3368菌株为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus ）。

2、分子生物学鉴定

挑取平板上HC3368菌株的单菌落于MRS液体培养基中，37℃培养24 h，然后取500μL发酵液，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）操作得到该菌株的基因组，该基因组用于后面的分子生物学鉴定。

2.1 16S rDNA 基因序列鉴定

采用27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCA，SEQ ID NO.1）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT，SEQ ID NO.2）为引物。PCR扩增体系共50 μL，包含10×PCR扩增缓冲液5 μL、脱氧核糖核苷酸（dNTPs）4 μL、27F上游引物2 μL、1492R下游引物2 μL、DNA模板2.5 μL、重组Taq DNA聚合酶（rTaq）0.5 μL和双蒸水（ddH₂O）34 μL。电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500 bp左右时符合要求。

测序结果显示HC3368菌株的16S rDNA序列（SEQ ID NO.3）如下：

CAGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGTAACTGTTTACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTAAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAA。

2.2 RAPD指纹图谱鉴定

采用M13（GAGGGTGGCGGTTCT，SEQ ID NO.4）为引物。RAPD反应体系共20 μL，包含Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、10×缓冲液（含Mg²⁺）2 μL、脱氧核糖核苷酸（dNTPs，2.5mM）0.8 μL、M13引物（10 μM）1 μL、DNA模板2 μL、双蒸水（ddH₂O）14 μL。制备1.5%的琼脂糖凝胶板，以DL2000 DNA Marker作为结果对照，在稳压100 V条件下电泳80 min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图，HC3368菌株的RAPD指纹图谱如图4所示。

2.3 rep-PCR指纹图谱鉴定

rep-PCR引物序列为GTGGTGGTGGTGGTG（SEQ ID NO.5）。rep-PCR的反应体系共20 μL，包含重组Taq DNA聚合酶（rTaq）0.2 μL、10×Ex Taq DNA缓冲液（含Mg²⁺）2 μL、脱氧核糖核苷酸（dNTPs，2.5 mM）2 μL、引物（10 μM）1 μL、DNA模板2 μL、双蒸水（ddH₂O）12.8 μL。制备1.5%的琼脂糖凝胶板，以DL2000 DNA Marker作为结果对照，在稳压100 V条件下电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图，HC3368菌株的rep-PCR指纹图谱如图5所示。

将HC3368菌株的16S rRNA序列上传至EzBioCloud网站，进行比对。综合生理生化特性的鉴定结果，确定HC3368菌株为一株新的戊糖片球菌，将其命名为戊糖片球菌HC3368。

2023年05月15日，将该戊糖片球菌HC3368保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.27356，分类命名为戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus 。

实施例3 戊糖片球菌HC3368理化性质

实验1、盐度耐受性测定

向96孔板中分别加入190 μL盐浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的BSM液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10 μL接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50 μL高压灭菌过的石蜡油，以防止培养过程中水分蒸发。37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。

盐度耐受性试验结果显示，戊糖片球菌HC3368的最大耐受盐浓度为6%。

实验2、温度生长范围实验

将接种液按体积百分比10%的接种量接种到10 mL MRS液体培养基中，并以不接菌的10 mL MRS液体培养基作为对照。将两种MRS液体培养基分别置于15℃恒温振荡培养箱中培养7天，37℃、45℃和60℃恒温振荡培养箱中培养2天，观察各MRS液体培养基的培养液是否变浑浊。

结果显示，15℃恒温培养7天后，培养基仍澄清；37℃恒温培养2天后，培养基变浑浊，45℃和60℃恒温培养2天后，培养基澄清。因此，戊糖片球菌HC3368在15℃及以下和45℃及以上条件下不能生长，在37℃条件下能正常生长。

实验3、对人工胃肠液的耐受性测定

准确称取0.5144 g KCl、0.1225 g KH₂PO₄、2.75085 g NaCl、2.1002 g NaHCO₃、0.0203 g MgCl₂·6H₂O、0.0480 g (NH₄)₂CO₃、0.0083 g CaCl₂，定容至1000 mL，得到胃液缓冲液。将3 g胃蛋白酶溶于1000 mL胃液缓冲液中，用1 M HCl调节pH值至3.0，0.22 μm滤膜过滤除菌，得到模拟胃液，模拟胃液现用现配。

准确称取0.5069 g KCl、0.1089 g KH₂PO₄、2.2442 g NaCl、7.1408 g NaHCO₃、0.0067 g MgCl₂·6H₂O、0.0333 g CaCl₂，定容至1000 mL，得到肠液缓冲液。将1 g胰蛋白酶和1 g胆盐溶于1000 mL肠液缓冲液中，用1 M NaOH调节pH值至8.0，0.22 μm滤膜过滤除菌，得到模拟肠液，模拟肠液现用现配。

将9 mL人工胃液置于37℃水浴摇床中保温1 h，以模拟人体温度。取1 mL接种液，加入到9 mL人工胃液中，置于37℃水浴摇床（200 r/min）孵育。分别于接种前和孵育2 h后取样1 mL加入到99 mL的PBS缓冲液中，用匀浆机拍打混匀，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15 mL，37℃厌氧培养72 h进行菌落计数，并进行两组平行测定。

将24 mL人工肠液置于37℃水浴摇床中保温1 h，以模拟人体温度。取1 mL消化2 h后的人工胃液，加入到24 mL人工肠液中，置于37℃水浴摇床（200 r/min）孵育。于3 h时取样1 mL加入到99 mL PBS缓冲液中，用匀浆机拍打混匀，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15 mL，37℃厌氧培养72 h进行菌落计数，并进行两组平行测定。

戊糖片球菌HC3368经过人工胃肠液消化后的活菌量（Log₁₀CFU/mL）如下表1所示。

表1 人工胃肠液消化后的活菌量（单位：Log₁₀CFU/mL）

由表1可知，戊糖片球菌HC3368经人工胃液后活菌量下降0.08Log₁₀CFU/mL，再经过人工肠液消化后活菌量还剩9.56Log₁₀CFU/mL，活菌总量仅下降0.13 Log₁₀CFU/mL，说明戊糖片球菌HC3368具有良好的耐胃酸耐胆盐能力，能够在胃肠道环境中耐受严苛的环境。

实验4、溶血性实验

称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121°C高压灭菌15 min，等培养基冷却到50℃的时候加入5%的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板，得到血细胞平板。将戊糖片球菌HC3368划线接种于血细胞平板上，37℃培养箱培养，24~48 h观察戊糖片球菌HC3368是否有溶血现象。

结果显示，血细胞平板没有变化，戊糖片球菌HC3368不能生长，说明戊糖片球菌HC3368不产生溶血素，不能够溶解血细胞，生物安全性良好。

实验5、抗生素耐受性实验

采用微量肉汤稀释法测定抗生素对戊糖片球菌HC3368的最低抑菌浓度（MIC值），具体结果见下表2所示。

表2 抗生素对戊糖片球菌HC3368的MIC值（单位：μg/mL）

由表2可以看出，戊糖片球菌HC3368对红霉素、链霉素、氨苄西林和克林霉素等常见抗生素敏感，生物安全性良好。

实验6、疏水性细胞表面测试

挑取纯化好的戊糖片球菌HC3368菌落接种于MRS液体培养基中，于40℃振荡培养24~48 h。再按体积百分比1%的接种量接至新的MRS液体培养基中，于40℃继续振荡培养24~48 h，然后6000×g离心10 min，收集菌体后用无菌生理盐水冲洗两次，再用1 mL浓度为0.1M的灭菌KNO₃溶液重悬菌体，作为待测菌液。

吸取50 μL上述待测菌液加入到2450 μL浓度为0.1 M的KNO₃溶液中，测试该溶液的OD_{600 nm}值并记为A₀；取1.5 mL上述待测菌液与500 μL二甲苯混匀后在室温下静置10min，将形成的两相体系涡旋振荡2 min后再静置20 min，重新形成水相和有机相。小心吸取水相测试OD_{600 nm}值并记为A₁。细胞疏水性按疏水性%=(A₀-A₁)/A₁×100%计算，进行三次平行实验，并对所得数据取平均值。

结果显示，戊糖片球菌HC3368的细胞表面疏水性为70.96%±10.12%。

实验7、黄曲霉毒素B1清除能力测定

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等多种真菌产生的次级代谢产物。现已分离出的黄曲霉毒素达18种，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）因其极强的致癌、致突变和致畸性，被国际癌症研究机构确认为I类致癌物，微量的黄曲霉毒素都会对人和动物产生有害影响。参照黄曲霉毒素B1测定试剂盒说明书配制所需溶液，并进行检测操作。

结果显示，戊糖片球菌HC3368的黄曲霉毒素B1清除能力为68.43%±6.55%。

实验8、体外胆固醇降解试验

准确称取1 g胆固醇，溶于无水乙醇中，并定容至100 mL，在无菌条件下用0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，得到胆固醇溶液。

称取蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、硫酸镁0.1 g、硫酸锰0.05 g、磷酸氢二钾2.0 g、蒸馏水1000 mL，溶解后调节pH值7.3，115℃灭菌30 min，然后加入胆固醇溶液使胆固醇终浓度为0.1%，得到含胆固醇的液体培养基。

将接种液接种至按照体积百分比0.1%的接种量接种至含胆固醇的液体培养基中，于37℃下静止培养48 h，然后取0.2 mL菌液，加入1.8 mL无水乙醇，混匀，静止10 min，3000r/min离心5 min，取上清液，按照GB 5009.128-2016《食品中胆固醇的测定》规定的方法测定胆固醇含量，计算胆固醇降解率。

结果显示，戊糖片球菌HC3368的体外胆固醇降解率为73.76%±2.57%。

实施例4 戊糖片球菌HC3368的抗氧化功能测定

实验1、戊糖片球菌HC3368清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）能力的测定

分别取1 mL戊糖片球菌HC3368菌悬液和1 mL戊糖片球菌HC3368发酵上清液，各加入1 mL浓度为0.4 mM的现配DPPH自由基溶液，混合均匀后置于室温下遮光反应30 min，然后测定样品在波长517 nm处的吸光度A_样品，进行三次平行实验，并对所得数据取平均值。

实验过程中，以等体积PBS缓冲液与乙醇的混合液作为空白，用于仪器调零，吸光度记为A_空白；以等体积PBS缓冲液与DPPH乙醇溶液的混合液作为对照，吸光度记为A_对照。DPPH自由基清除率按清除率%=[1-（A_样品-A_空白）/A_对照]×100%计算，结果如下表3所示。

表3 戊糖片球菌HC3368对DPPH自由基的清除率（单位：%）

实验2、戊糖片球菌HC3368清除羟基自由基（HRS）能力的测定

取200 μL戊糖片球菌HC3368菌悬液和200 μL戊糖片球菌HC3368发酵上清液，分别与100 μL浓度为5 mM的水杨酸钠-乙醇溶液、100 μL浓度为5 mM的硫酸亚铁溶液以及500 μL去离子水混匀，然后各加入100 μL浓度为3 mM的过氧化氢溶液，37℃水浴15 min后，在510nm波长处测量样品吸光度，记为A_样品。以等体积去离子水代替上述菌悬液或发酵上清液，与100 μL浓度为5 mM的水杨酸钠-乙醇溶液、100 μL浓度为5 mM的硫酸亚铁溶液以及500 μL去离子水混匀，然后各加入100 μL浓度为3 mM的过氧化氢溶液，37℃水浴15 min后，在510nm波长处测量样品吸光度，记为A_控制。以等体积去离子水代替上述菌悬液或发酵上清液和过氧化氢溶液，与100 μL浓度为5 mM的水杨酸钠-乙醇溶液、100 μL浓度为5 mM的硫酸亚铁溶液以及500 μL去离子水混匀，37℃水浴15 min后，在510 nm波长处测量样品吸光度，记为A_空白。HRS自由基清除率按清除率%=（A_样品-A_控制）/（A_空白-A_控制）×100%计算，结果如下表4所示。

表4 戊糖片球菌HC3368对HRS自由基的清除率（单位：%）

实验3、戊糖片球菌HC3368抗脂质过氧化实验

量取0.1 mL亚油酸、0.2 mL Tween20、19.7 mL去离子水、0.5 mL PBS缓冲液（pH=7.4），将上述组分充分混合并搅拌均匀，得到亚油酸乳化液，备用。

取1 mL上述制备好的亚油酸乳化液，加入1 mL FeSO₄溶液（1%），再加入0.5 mL待测样品（戊糖片球菌HC3368的菌悬液或发酵上清液），轻轻振荡使混合液均匀。将混合液置于37℃水浴锅中，保温反应1.5 h。反应结束后，向混合液中依次加入0.2 mL TCA溶液（4%）和2 mL TBA溶液（0.8%），混匀后置于100℃水浴锅中加热30 min。显色完成后，迅速冷却混合液，随后以4000 r/min的转速离心15 min，去除体系中的沉淀杂质。收集离心后的上清液，在532 nm下测定吸光度，记为A。同时以0.5 mL蒸馏水代替待测样品重复上述操作，测得的吸光度记为A₀。脂质过氧化抑制率按抑制率%=(A₀-A)/A₀×100%计算，结果如下表5所示。

表5 戊糖片球菌HC3368的脂质过氧化抑制率（单位：%）

实施例5 戊糖片球菌HC3368的潜在危害性评价

实验1、产酸能力评价

采用终点pH法对戊糖片球菌HC3368的产酸能力进行评价。将戊糖片球菌HC3368在MRS液体培养基中培养24 h，利用pH计对培养液的酸性进行测定，并以市售产品中的戊糖片球菌CECT8330和牙龈卟啉单胞菌BNCC353909作为对照。结果如下表6所示，戊糖片球菌HC3368的终点pH值高于对照菌株，表明其产酸能力弱于对照菌株，可见使用戊糖片球菌HC3368可降低因菌株产酸导致的龋齿风险。

表6 菌株的发酵终点pH值

实验2、腐蚀性评价

采用等量元素法测量戊糖片球菌HC3368对牙齿的腐蚀性。将发酵上清液与羟基磷灰石混合，搅拌均匀后37℃下共同孵育，分别在30 min、1 h、2 h和3 h时取等量发酵液进行离心，获取上清液，用酸-钼酸盐分光光度法测定上清液的OD_{620 nm}值，OD_{620 nm}值能够反映上清液中磷含量的变化，进而表征羟基磷灰石被腐蚀情况。同时，以牙龈卟啉单胞菌BNCC353909的发酵上清液作为对照，牙龈卟啉单胞菌BNCC353909的发酵上清液的获取方法同戊糖片球菌HC3368。以0 min的发酵上清液作为空白，以校正样品中的内源性磷含量。

结果如图6所示，戊糖片球菌HC3368的腐蚀能力在1 h时达到最大，从1 h后几乎不再有腐蚀发生。而牙龈卟啉单胞菌BNCC353909对羟基磷灰石的腐蚀效果持续增强，说明戊糖片球菌HC3368具有较弱的腐蚀能力，其对牙齿的破坏效果远小于牙龈卟啉单胞菌等口腔致病菌。

实施例6 戊糖片球菌HC3368的粘附性能评价

实验1、产糖性评价

益生菌可通过产生胞外多糖增强自身在口腔黏膜、牙齿表面等部位的粘附能力，而稳定的粘附是益生菌在宿主体内成功定植并进一步发挥益生作用的关键前提。因此，可通过测定益生菌发酵液中胞外多糖的含量，间接评估其在口腔环境中的粘附性能和定植潜力。

取10 mL发酵上清液，向其中加入2 mL浓度为80%的三氯乙酸，混合后置于冰上搅拌30 min，离心去除上清液中残留的菌体和蛋白，收集离心后的上清液并加入三倍体积的提前0℃预冷的无水乙醇，随后将该混合液置于4℃冰箱下冷藏24 h，观察胞外多糖（EPS）的析出情况。将混合液在4℃下10000 r/min离心15 min获取多糖沉淀，随后用10 mL蒸馏水将沉淀重新溶解成多糖溶液，采用苯酚-硫酸法对多糖溶液中的多糖含量进行测定。同时，以市售产品中的鼠李糖乳酪杆菌LGG作为对照。

结果如图7所示，戊糖片球菌HC3368的胞外多糖产量为106 mg/L，而对照菌株鼠李糖乳酪杆菌LGG的胞外多糖产量为84 mg/L，显著低于本发明提供的戊糖片球菌HC3368（*P <0.05）。

实验2、牙齿粘附性评价

测定戊糖片球菌HC3368菌悬液在600 nm波长下的吸光度，记为OD_600前。在戊糖片球菌HC3368的菌悬液中加入10 mg灭菌羟基磷灰石粉末（d=82 μm），混匀后置于37℃水浴锅中温浴1 h。温浴结束后，用0.45 μm针孔滤膜过滤并收集滤液，然后用PBS缓冲液冲洗针孔滤膜两次，将冲洗得到的液体与之前收集的滤液合并。接着对合并后的过滤液体进行离心处理，收集离心管底部的菌体沉淀，再向菌体沉淀中加入1 mL的PBS缓冲液进行重悬，测量其在600 nm波长下的吸光度，记为OD_600后。同时以鼠李糖乳酪杆菌LGG作为对照。模拟牙齿粘附率按如下公式计算：

。

结果如图8所示，戊糖片球菌HC3368和鼠李糖乳酪杆菌LGG都具有一定的粘附性能，鼠李糖乳酪杆菌LGG的模拟牙齿粘附率为36.18%，显著低于戊糖片球菌HC3368的87.86%（**P <0.01）。戊糖片球菌HC3368的高粘附率使其可以粘附在牙齿表面，并且可以有效降低菌株被唾液冲刷和吞咽等作用带入消化道，增强其驻留时间。

实验3、细胞粘附性评价

人牙龈上皮细胞C1052经复苏、培养和计数后，以2×10⁶个/孔的接种量接种于6孔板中，并在CO₂培养箱中培养24 h。实验组的处理方法为：将处于对数生长期的戊糖片球菌HC3368用MRS液体培养基重悬至5×10⁷CFU/mL，取1 mL该悬浮液加入上述已有细胞贴壁的6孔板中，在CO₂培养箱中培养2 h。培养结束后用PBS缓冲液反复洗涤三次，以去除未粘附的细菌。加入500 μL胰酶消化3 min，再加入1.5 mL细胞培养液终止消化并反复吹打，将所得溶液收集至无菌EP管中，依次进行10倍、100倍、1000倍和10000倍的梯度稀释，涂板计数。以未加入戊糖片球菌HC3368悬浮液的6孔板作为空白组，按照与实验组相同的操作进行细胞计数。根据以下公式计算戊糖片球菌HC3368的细胞粘附能力：

粘附能力（CFU/细胞）=每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。

结果显示，戊糖片球菌HC3368粘附能力为52.05±9.39 CFU/细胞，说明该菌株对口腔上皮细胞具有较强的粘附能力，有利于其在口腔环境中的定植。

实施例7 戊糖片球菌HC3368对口腔致病菌的抑菌试验

分别培养市售产品变异链球菌ATCC25175、具核梭杆菌BNCC336949、粘性放线菌ATCC27044、牙龈卟啉单胞菌BNCC353909和伴放线聚集杆菌BNCC336945，按照体积百分比1%的接种量，将变异链球菌ATCC25175、具核梭杆菌BNCC336949、粘性放线菌ATCC27044、牙龈卟啉单胞菌BNCC353909和伴放线聚集杆菌BNCC336945的菌液分别接种到BHI肉汤培养基（添加5%的牛血清），37℃厌氧培养48 h后，8000 r/min离心10 min收集菌体。将菌体用PBS缓冲液（pH=7.0）洗涤两次，然后用PBS缓冲液（pH=7.0）重悬菌体，调整菌悬液的初始吸光度OD_{600 nm}为0.5~0.6备用。

采用牛津杯双层平板法测定戊糖片球菌HC3368的菌悬液和发酵上清液对上述口腔致病菌的抑菌效果。准备0.7%琼脂含量的BHI培养基灭菌，待培养基温度降至47℃以下，加入0.2%混合好的致病菌菌液并摇匀。取7 mL培养基倾倒至底层琼脂平板上，待培养基凝固后放上牛津杯，并在牛津杯孔里加入150 μL的戊糖片球菌HC3368菌悬液或发酵上清液，37℃培养48 h后测量抑菌圈直径，结果如下表7所示。

表7 戊糖片球菌HC3368对口腔致病菌的抑菌效果（单位：mm）

由表7可以看出，戊糖片球菌HC3368对变异链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌和伴放线聚集杆菌这五种口腔致病菌都有明显的抑制效果，表现出了一定的广谱抑菌性。其中，戊糖片球菌HC3368的菌悬液抑菌效果要优于发酵上清液，并且对变异链球菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌抑菌效果最突出，抑菌圈直径均达到了20 mm以上。

实施例8 戊糖片球菌HC3368抑菌物质确定试验

有研究表明，乳酸菌能够通过产生有机酸、过氧化氢、细菌素和粘附抑制剂等物质来发挥口腔健康保护作用。基于此，设计本实施例确定戊糖片球菌HC3368中起主要抑菌作用的物质。

将戊糖片球菌HC3368的发酵上清液用5 M的NaOH调节pH值至5.5~6之间，用0.22 μm滤膜过滤中和后的发酵上清液，得到排除酸的发酵上清液，将其作为待测样品1。

将戊糖片球菌HC3368的发酵上清液用5 M的NaOH调节pH值至5.5~6之间，向其中加入过氧化氢酶，混合均匀后置于37℃下温育30 min，进一步得到排除H₂O₂的发酵上清液，将其作为待测样品2。

将戊糖片球菌HC3368的发酵上清液用5 M的NaOH调节pH值至5.5~6之间，向其中加入过氧化氢酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理，混合均匀后置于37℃下温育30 min，进一步得到排除蛋白质的发酵上清液，将其作为待测样品3。

分别采用上述待测样品1、待测样品2和待测样品3进行抑菌试验，观察各待测样品对五种口腔致病菌的抑菌效果，抑菌实验方法参照实施例7。结果如下表8所示。

表8 不同处理的发酵上清液对口腔致病菌的抑菌效果（单位：mm）

注：表8中每一列内的字母不同表示具有显著性差异（P <0.05），字母相同表示没有显著性差异（P 0.05）。

由表8可以看出，戊糖片球菌HC3368的发酵上清液在经过酸中和以及去除H₂O₂后对口腔致病菌仍然具有明显抑制作用，其抑菌圈大小与未经过处理的发酵上清液相比没有显著性差异，而在经过蛋白酶处理后其抑菌圈大小显著减小，说明戊糖片球菌HC3368对口腔致病菌的抑菌物质为蛋白类物质，因此推测HC3368菌株能够产生蛋白类细菌素来抑制口腔病原菌，从而发挥口腔健康保护作用。

实施例9 戊糖片球菌HC3368对口腔致病菌的凝集率测定

益生菌的自凝集能力越强其在口腔内的定植效果就越好，菌体可以通过自凝集作用而不容易被唾液冲刷，同时高自凝集作用有利于提高益生菌在口腔内的浓度，有利于其在口腔内的存活和健康功能发挥。同时益生菌还可以通过与致病菌的共凝集反应，与其竞争生物膜表面的结合位点及争夺营养物质，使其失去吸附在牙齿表面的能力。基于此，对益生菌的自凝集率及其与致病菌的共凝集率进行测定，可用于表征菌株的定植效果。

实验1、自凝集率测定

取1 mL戊糖片球菌HC3368的菌悬液加入24孔板内室温下静置，取100 μL菌悬液测定其在600 nm处的初始吸光值A₀，在随后的6 h内每隔2 h吸取菌悬液上层测量其在600 nm处的吸光度A_t，计算自凝集率R_自=（1-A_t/A₀）×100%，样品取三个平行。戊糖片球菌HC3368在不同时间点的自凝集效果如图9所示，自凝集率结果如下表9所示。

表9 戊糖片球菌HC3368的自凝集率（单位：%）

由表9可以看出，戊糖片球菌HC3368在6 h时的自凝集率达到52.15%，说明戊糖片球菌HC3368能够在口腔中有效定植。

实验2、共凝集率测定

取100 μL戊糖片球菌HC3368菌悬液，测定其在600 nm处的初始吸光值A₀；取100 μL致病菌（变异链球菌ATCC25175、具核梭杆菌BNCC336949、粘性放线菌ATCC27044、牙龈卟啉单胞菌BNCC353909或伴放线聚集杆菌BNCC336945）的菌悬液测定其在600 nm处的初始吸光值B₀。

将等量的戊糖片球菌HC3368菌悬液和致病菌菌悬液混合，摇匀后加入24孔板内室温下静置。每隔2 h取上层悬浮液100 μL测定其在600 nm处的吸光值A_t，计算共凝集率R_共=[1-2A_t/(A₀+B₀)]×100%，每个样品取三个平行。戊糖片球菌HC3368与不同致病菌在6 h时的共凝集效果如图10所示，共凝集率结果如下表10所示。

表10 戊糖片球菌HC3368与不同致病菌的共凝集率（单位：%）

由表10可以看出，戊糖片球菌HC3368能够与变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、粘性放线菌和伴放线聚集杆菌这五种口腔致病菌产生共凝集反应，在2 h、4 h和6 h时内共凝集效果均高于戊糖片球菌HC3368的自凝集效果。其中，戊糖片球菌HC3368对变异链球菌、具核梭杆菌和伴放线聚集杆菌的共凝集效果能够达到59%以上。

可见，戊糖片球菌HC3368菌株在6 h内展现出了良好的自凝集能力，有利于该菌株在口腔内的定植。同时，戊糖片球菌HC3368还能够与变异链球菌、具核梭杆菌等产生共凝集效果，有效降低了口腔致病菌的相对含量。

实施例10 戊糖片球菌HC3368对口腔致病菌生物膜的消除作用

采用孔板法培养变异链球菌ATCC25175、牙龈卟啉单胞菌BNCC353909和具核梭杆菌BNCC336949的生物膜。在24孔板的孔内加入300 μL添加有2%（m/v）蔗糖的BHI培养基，然后按体积百分比2%的接种量接种活化好的口腔致病菌。将24孔板置于微厌氧条件下37℃培养48 h，培养结束后，可见致病菌的成熟生物膜出现在孔的内壁及底部。弃去孔内培养液和未粘附的菌体，用PBS缓冲液（pH=7.0）洗涤2次。实验组在孔内加入300 µL的戊糖片球菌HC3368发酵上清液继续共培养24 h，每组做三个平行并以等量MRS液体培养基代替戊糖片球菌HC3368发酵上清液作为对照组。培养结束后，除去含有浮游细胞的上清液，同时保持生物膜的完整性，随后用无菌PBS缓冲液洗涤三次后加入甲醇固定15 min，将微孔板倒空并晾干45 min。生物膜用0.1%（m/v）结晶紫染色30 min，然后除去多余的染色剂。向每个孔中加入300 µL无水乙醇，将结合的结晶紫重新释放回孔中。最后将溶液转移到新的孔板中测其在600 nm处的吸光度。

结果如图11所示，对于变异链球菌生物膜，其与戊糖片球菌HC3368发酵上清液共培养后生物膜减少了73.65%，实验组与对照组相比具有显著性差异（**P <0.01）；对于牙龈卟啉单胞菌生物膜，其与戊糖片球菌HC3368发酵上清液共培养后生物膜减少了70.00%，实验组与对照组相比具有显著性差异（**P <0.01）；对于具核梭杆菌生物膜，其与戊糖片球菌HC3368发酵上清液共培养后生物膜减少了57.83%，实验组与对照组相比具有显著性差异（**P <0.01）。

生物膜能够有效地帮助细菌抵御外界环境的变化，有利于细菌的生长繁殖。口腔病原菌以生物膜的形式存在于口腔中，当生物膜内的细菌稳态发生变化时即会导致发生龋齿和牙周病等口腔问题。戊糖片球菌HC3368能够显著降低变异链球菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的生物膜，从而减少口腔发生龋齿和牙周病的风险，有助于改善口腔健康问题。

实施例11 戊糖片球菌HC3368对牙龈上皮细胞免疫调节作用

实验1、戊糖片球菌HC3368对变异链球菌感染的牙龈上皮细胞的免疫调节

将复苏传代好的人牙龈上皮细胞C1052按照5×10⁵个/孔铺在6孔板中，待细胞贴壁后分为三组，开展后续感染实验。

第一组作为对照组，不进行细菌感染。第二组采用DMEM培养基（含10% FBS）重悬变异链球菌ATCC25175的菌悬液，菌悬液制备方法同实施例7，以感染复数MOI=250感染人牙龈上皮细胞C1052，将第二组命名为变异链球菌组。第三组采用DMEM培养基（含10% FBS）重悬同体积的变异链球菌ATCC25175的菌悬液与戊糖片球菌HC3368的菌悬液，以致病菌数量计算，按照感染复数MOI=250感染人牙龈上皮细胞C1052，将第三组命名为变异+益生菌组。每个处理组设三个平行。上述三组细胞分别在含5% CO₂培养箱中37℃培养24 h，培养完成后1000×g离心20 min，收集上清液用于细胞炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8检测，检测步骤参照ELISA试剂盒说明进行。

实验结果如图12所示，经过变异链球菌感染后人牙龈上皮细胞上清液中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8浓度分别达到了85.16 pg/mL、464.03 pg/mL和1835.67 pg/mL，远高于对照组正常牙龈上皮细胞的炎症水平（**P <0.01）；而经过戊糖片球菌HC3368干预后，IL-1β、IL-6和IL-8浓度分别下降至60.47 pg/mL、169.54 pg/mL和1247.96 pg/mL，分别减少了28.99%、63.46%和32.02%，与变异链球菌组相比具有显著性差异（**P <0.01）。

实验2、戊糖片球菌HC3368对具核梭杆菌感染的牙龈上皮细胞的免疫调节

实验2的步骤与实验1基本相同，区别仅在于：

（1）使用具核梭杆菌BNCC336949代替变异链球菌ATCC25175单独感染人牙龈上皮细胞C1052，并将该处理组命名为具核梭杆菌组；

（2）使用具核梭杆菌BNCC336949代替变异链球菌ATCC25175与戊糖片球菌HC3368共同感染人牙龈上皮细胞C1052，并将该处理组命名为具核+益生菌组。

实验结果如图13所示，经过具核梭杆菌感染后人牙龈上皮细胞上清液中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8浓度分别达到了108.49 pg/mL、557.36 pg/mL和1249.00 pg/mL，远高于对照组正常牙龈上皮细胞的炎症水平（**P <0.01）；经过戊糖片球菌HC3368干预后，IL-1β、IL-6和IL-8浓度分别下降至55.14 pg/mL、226.21 pg/mL和643.96 pg/mL，分别减少了49.18%、59.41%和48.44%，与具核梭杆菌组相比具有显著性差异（**P <0.01）。

上述实验结果说明戊糖片球菌HC3368能够有效改善变异链球菌、具核梭杆菌等口腔致病菌引起的口腔炎症问题，有利于口腔健康的恢复。

实施例12 使用戊糖片球菌HC3368制备益生菌制剂

（1）按体积百分比1%的接种量将戊糖片球菌HC3368接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24 h；

（2）将新鲜菌液以8000 r/min转速离心10 min，分离上清液和底部菌体；

（3）收集上清液，作为一种益生菌制剂；

（4）收集底部菌体，用PBS缓冲液（pH=7.0）洗涤两次后重悬菌体，直至吸光度OD_{600 nm}达到0.5~0.6之间，得到另一种益生菌制剂。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的戊糖片球菌HC3368，其特征在于，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus ）HC3368已于2023年05月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27356。

2.一种由如权利要求1所述的戊糖片球菌HC3368制备的益生菌制剂。

3.如权利要求2所述的益生菌制剂，其特征在于，益生菌制剂中包含戊糖片球菌HC3368和/或戊糖片球菌HC3368的发酵产物。

4.如权利要求2所述的益生菌制剂，其特征在于，益生菌制剂的制备方法为：

5.如权利要求2所述的益生菌制剂，其特征在于，益生菌制剂的制备方法为：

6.如权利要求2所述的益生菌制剂，其特征在于，益生菌制剂为口腔护理用品。

7.如权利要求6所述的益生菌制剂，其特征在于，口腔护理用品选自牙用凝胶、牙粉、牙膏、漱口剂、口喷剂、牙线、牙齿清洁液、牙齿清洁泡沫中的任意一种。

8.一种如权利要求1所述的戊糖片球菌HC3368在制备具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的益生菌制剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，益生菌制剂对口腔致病菌具有抑制作用，口腔致病菌包括变异链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌和/或伴放线聚集杆菌。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，益生菌制剂能够调节口腔致病菌引起的炎症免疫反应，降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8水平。