CN111000874A - 一株具有防治龋齿功效的植物乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有防治龋齿功效的植物乳杆菌，属于微生物技术领域。本发明建立了大鼠龋齿模型，并通过比较空白对照组、模型组、干预组、预防组的小鼠的血清生化指标、口腔菌群、牙齿脱矿、龋齿情况，确定了植物乳杆菌CCFM8724具有预防和治疗龋齿的作用，并且植物乳杆菌CCFM8724的应用效果优于传统的防龋药物洗必泰，具有广大的市场应用前景。同时，植物乳杆菌CCFM8724可应用于菌粉、酸奶、咀嚼片、口香糖、牙膏、漱口水等益生菌功能食品和日化产品，有望为益生菌防治龋齿打开一个新的功能市场。

Description

一株具有防治龋齿功效的植物乳杆菌

技术领域

本发明涉及一种益生菌防治由变异链球菌(以下简称变链)和白色念珠菌(以下简称白念)感染导致的龋齿，尤其是一株具有防治龋齿功效的植物乳杆菌，属于微生物技术领域。

背景技术

龋病是发生于牙釉质及牙本质上的细菌感染性疾病，而牙菌斑生物膜的形成是龋病发生的先决条件。成熟的牙菌斑生物膜是口腔细菌嵌于不溶性多糖为主的基质内形成的一种三维立体的生态环境，富含空隙及管道系统，具有一定厚度。一旦由于宿主、饮食、微生物的生长等因素的变化而导致该生态失衡时，牙菌斑生物膜中的致龋微生物成为优势菌群，它们快速代谢分解碳水化合物，尤其是蔗糖，产生有机酸，使pH降低到5.5以下，导致牙釉质脱矿化和牙齿硬组织结构损坏从而形成龋洞。

变异链球菌是公认的主要致龋菌。虽然变异链球菌不是口腔中最丰富的细菌，但它能快速协调致龋性生物膜的形成，并能结合其他致龋菌形成毒力更强的致龋生物膜。与口腔中浮游细菌不同的是，生物膜中的细菌通常营养受限，处于近似休眠状态，这种近似休眠状态下的细菌比浮游的代谢活性细菌更耐抗生素和抑菌剂。

白色念珠菌与变异链球菌的关联能够增强变异链球菌的致病性并强化致龋生物膜的形成。白色念珠菌粘附牙面的能力较弱，但与变异链球菌结合后，口腔定植能力大大增强。变异链球菌产生的葡萄糖基转移酶(GTF)可与白色念珠菌细胞壁上的甘露聚糖粘附，将其募集到早期牙菌斑生物膜上(Ellepola K等人，Journal of dental research,2017,96(10):1129-1135.)。具有更大表面积的白色念珠菌可为更多的变异链球菌提供结合位点，增多的变异链球菌数量反过来又增加了白色念珠菌的数量。双种生物膜比单种生物膜具有更高的生物量和细胞数量，且已有研究证实白色念珠菌和口腔链球菌的生物膜对抗生素的耐药性高于单一物种(Shirtliff M E等人，FEMS microbiology letters,2009,299(1):1-8.)，双菌生物膜的这些特性无疑加大了由其导致的龋病治疗的难度。

传统对龋齿的处理方法都是外科手术的方式，这种方式除了机械性地挖除并填补龋损部位，并没有达到从根源上减少龋病发生率的作用。而另外的处理方法则是杀菌剂，但是几乎所有的药物通过物理化学的手段会杀死大部份的微生物，而残存的口腔微生物也并不能维持口腔菌群的平衡。并且，许多治疗剂在它们作用细菌之前就先与生物膜中的胞外多糖结合，从而失去了效用。这也是抗菌剂和抗生素在临床上防治龋齿效果不佳的原因之一。此外，龋齿的发生是个不可逆的过程，一旦釉质受损只有通过物理手段填补或是种植假牙，因此防治龋齿预防大于治疗。传统的刷牙洁牙手段并不能对抗顽固的牙菌斑，且儿童往往还受其意愿限制。采用普通的中草药制品预防时，虽然可能抑制致龋菌群，但同时会对其他维持口腔平衡的优势菌群具有削弱作用，中草药制品的使用还会存在牙齿色素沉积的风险。

发明内容

【技术问题】

现有技术中缺少能够在体内兼具预防、治疗作用的益生菌。

【技术方案】

本发明提供一种具有预防、治疗龋齿的作用的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌是植物乳杆菌CCFM8724，保藏编号是CGMCC No.5492，已经在“CN102533618A一种植物乳杆菌CCFM8724及其用途”这篇专利申请中公开。

所述植物乳杆菌CCFM8724能够用于预防、治疗变异链球菌和白色念珠菌双菌侵染导致的龋齿。

本发明还提供所述植物乳杆菌CCFM8724在制备预防龋病的功能性食品和日化产品方面的应用。

本发明还提供一种具有预防、治疗龋齿作用的酸奶，所述酸奶的制备步骤包括：将奶粉、菊粉、甜菊糖、水混料、均质，制成发酵原材料，并杀菌、冷却，接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌粉进行发酵，发酵结束后，加入植物乳杆菌CCFM8724冻干菌粉，搅拌、罐装、后熟，制成具有预防、治疗龋齿作用的益生菌酸奶。

具体地，所述酸奶的制备步骤包括：将奶粉、菊粉、甜菊糖、水按重量比：20：5：5：75进行混料，均质，制成发酵原材料；以121℃超高温灭菌300s杀菌，然后冷却到42℃，接种发酵菌保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌粉，发酵菌接种量为发酵原材料总重量的0.3％；在42℃下发酵12h后进行调配；将发酵产物冷却至37℃，加入植物乳杆菌CCFM8724冻干菌粉，投料量为CFU 10⁹/ml酸奶，搅拌，罐装，在4℃下保存2天自然完成后熟，制成益生菌酸奶。

本发明还提供一种具有预防、治疗龋齿作用的口香糖，所述口香糖的制备步骤包括：将口香糖胶基软化后加入植物乳杆菌CCFM8724，按10¹⁰个益生菌/粒口香糖比例加入，搅拌均匀冷却，挤压切割制成益生菌口香糖。

在本发明的一种实施方式中，口香糖中还可以添加对变异链球菌有抑制作用的物质，例如蔓越莓提取物。

具体地，所述口香糖的制备步骤包括：将口香糖胶基置于60℃烘箱软化4h，匀速降温至37℃后加入植物乳杆菌CCFM8724按10¹⁰个益生菌/粒口香糖比例加入，搅拌均匀冷却，投入切面机中挤压3次，保持温度20℃，相对湿度56％，老化12～22h，制成益生菌口香糖。所述植物乳杆菌CCFM8724冻干粉的形式添加到口香糖中，冻干粉中益生菌数量为10¹²个/g。

本发明还提供一种具有预防、治疗龋齿作用的牙膏，所述牙膏的制备步骤包括：将牙膏基料、天然矿物盐、益生菌搅拌得到混合物，对混合物进行抽真空处理，然后脱气，获得膏体，研磨后制得益生菌牙膏。

在本发明的一种实施方式中，牙膏中还可以添加对变异链球菌有抑制作用的物质，例如蔓越莓提取物。

具体地，所述牙膏的制备步骤包括：按以下重量份称取原料：牙膏基料100份、天然矿物盐3份、益生菌7份和蔓越莓提取物(浓缩至1000μg/mL)40份加入搅拌器中搅拌得到混合物，对混合物进行抽真空处理，然后脱气，获得膏体，研磨后制得益生菌牙膏。所述植物乳杆菌CCFM8724冻干粉的形式添加到口香糖中，冻干粉中益生菌数量为10¹²个/g。

本发明还提供一种大鼠龋齿模型，所述模型的构造方法是：选择SPF级Wistar大鼠、雄性、3周龄、体重40～50g，对大鼠用变链和白念进行侵染，每天一次，连续5天。所述侵染的具体操作手法为用无菌棉棒饱和吸收变异链球菌和白色念珠菌的菌悬液各200μL，涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时。

应用所述大鼠龋齿模型筛选具有预防、治疗龋齿作用的物质的方法，将大鼠龋齿模型的大鼠分为模型组、干预组，其中，模型组喂以致龋饲料并在饮食中添加蔗糖，干预组喂以致龋饲料、饮食中添加蔗糖并使用待筛选物质进行处理；另外，设置空白对照组和干预组，其中，空白对照组没有用变异链球菌和白色念珠菌进行感染，空白对照组喂以致龋饲料并在饮食中添加蔗糖，干预组先用待筛选物质进行处理然后感染变异链球菌和白色念珠菌，干预组喂以致龋饲料并在饮食中添加蔗糖；饲喂过程中，监测大鼠的体重、血清生化指标和口腔菌群，饲喂结束后，利用Micro-CT检测大鼠牙齿脱矿情况，并利用体式显微镜观察大鼠牙齿龋齿情况。

【有益效果】

本发明提供了植物乳杆菌CCFM8724在预防、治疗龋病中的用途，与其他治疗手段相比，益生菌具有远远超过其他手段的优势。益生菌在口腔中定植后就可以发挥预防作用，不需要像其他药物一样必须长期使用。

植物乳杆菌CCFM8724的预防能力还适用于已经有牙菌斑或是龋洞或是已经填补过龋洞的情况，能够维持一个健康的口腔菌群，不让龋病加重或是发生二次龋齿。

植物乳杆菌CCFM8724能够从根源上维持口腔菌群的发展，从源头阻遏龋病的发生，从而达到防治龋病的目的。这一点，是现有的治疗龋齿的手段所无法达到的，因为，现有的治疗龋齿的手段，只能在发病后，被动地治疗，不能起到预防的效果，并且一次治疗后，还有可能复发。

植物乳杆菌CCFM8724针对由变异链球菌与白色念珠菌双菌作用导致的严重的龋齿，有很好的预防和治疗的效果。

附图说明

图1：实验流程图。

图2：大鼠体重趋势图。

图3：大鼠口腔菌群计数；a.变链的计数结果；b.白念的计数结果；c.乳杆的计数结果。

图4：Micro-CT扫描大鼠的磨牙图。

图5：Micro-CT处理下大鼠的磨牙釉质的体积。

图6：a.大鼠下颌磨牙颊舌面计分单位的划分示意图；b.大鼠下颌磨牙窝沟计分单位的划分示意图。

图7：体式显微镜下大鼠磨牙染色图；A、B、C、D、E、F、G、H分别为空白对照组、龋齿模型组、洗必泰干预组、洗必泰预防组、CCFM8724干预组、CCFM8724预防组、CCFM634干预组、CCFM634预防组的大鼠磨牙光滑面染色照片；a、b、c、d、e、f、g、h为对应的窝沟面(纵切面)染色照片。

*表示处理组与模型组有显著性差异(P<0.05)。

具体实施方式

MRS培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、吐温-80 1mL这几种成分，pH6.2～6.4。

TSBY培养基：添加了0.6％酵母粉的胰蛋白胨大豆肉汤培养基。它含有酵母粉6.0g/L、大豆蛋白3.0g/L、胰蛋白胨17.0g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L和磷酸氢二钾2.5g/L，pH 7.0～7.4。

YPD培养基：酵母粉1.0g/L、葡萄糖2.0g/L和蛋白胨2.0g/L。

BIGGY培养基：酵母提取物1.0g/L、甘氨酸10.0g/L、葡萄糖10.0g/L、柠檬酸铋铵5.0g/L、亚硫酸钠3.0g/L、琼脂16.0g/L，pH 6.6～7.0。

MS(mitis salivarius agar)培养基：酪蛋白胨15.0g/L，动物组织胃酶水解物5.0g/L，D-葡萄糖1.0g/L，蔗糖50.0g/L，磷酸氢二钾4.0g/L，锥虫蓝0.075g/L，结晶紫0.0008g/L，琼脂15.0g/L，pH 6.8～7.2。

植物乳杆菌CCFM8724菌液：将植物乳杆菌CCFM8724在MRS液体培养基中以2％接种量接种，于37℃培养箱培养24h后调节菌悬液浓度为1×10⁹cfu/ml。

变异链球菌悬液：将变异链球菌株ATCC 25175在TSBY培养基中在37℃，培养12h时间，调节菌悬液浓度为1×10⁹cfu/ml。

白色念珠菌悬液：将白色念珠菌在YPD培养基中37℃，培养12h时间，调节其菌悬液浓度为1×10⁶cfu/ml。

实施例1植物乳杆菌CCFM8724在防治龋齿中的用途的动物实验

实验动物及菌株：

SPF级Wistar大鼠，雄性，3周龄，体重40～50g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许可证号SCXK(京)2012-0001)。

变异链球菌采用变异链球菌ATCC 25175，购买于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC。白色念珠菌从志愿者口腔分离得到。

植物乳杆菌CCFM634(CGMCC No.9740)作为另一株体外抑制双菌生物膜效果较好的植物乳杆菌(24h介导抑制生物膜量>60％)，同样用于动物实验中做一个对比。关于抑制双菌生物膜的实验，介导组是在96孔板中加入变异链球菌和白色念珠菌菌悬液各50μL，于24加入植物乳杆菌上清100μL，37℃培养24h，在双菌生物膜生长至24h时用PBS小心清洗生物膜2遍，加入植物乳杆菌上清100μL，37℃培养24h；双菌生物膜对照以空白MRS液体培养基代替植物乳杆菌上清，每组设置6个平行；培养结束后用PBS小心清洗生物膜2遍，室温静置晾干生物膜后以向每孔加入100μL 0.1％结晶紫溶液，将生物膜染色30min，染色结束后用PBS清洗2遍，每孔以95％乙醇溶解，于酶标仪OD600nm下读取吸光度值。生物膜介导后的减少量计算方式为减少量(％)＝(双菌生物膜对照-介导后生物膜量)/双菌生物膜对照。植物乳杆菌CCFM8724介导后，双菌生物膜减少85.32％，植物乳杆菌CCFM634介导后，双菌生物膜减少65.57％。

实验流程参考图1。

实验方案和分组：

表1大鼠实验分组情况

Groups division of experimental wistar rats

(注：致龋饲料Diet 2000的主要成分如下：全麦粉6％，蔗糖56％，精炼奶粉28％，苜蓿叶粉3％，脱水全干粉1％，酵母4％，盐2％)

根据体重随机将大鼠分成8组，参照表1，无龋对照组(即空白对照)整个实验过程中正常饮食，其他组所有大鼠均喂以致龋饲料Diet 2000(购自于南通特洛菲饲料科技有限公司)并在饮食中辅以添加有5％蔗糖的蒸馏水。

龋齿模型组和干预组都需经历连续5天(1～5days)的白念和变链的侵染(侵染的具体操作手法为用无菌棉棒饱和吸收变异链球菌和白色念珠菌的菌悬液各200μL，涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时)，从大鼠牙齿用棉签擦拭取样，将棉签置于1mL的生理盐水中，使得棉签上的菌转移到生理盐水中，将1mL生理盐水进行稀释涂布并对变链和白念的数量进行计数，计数结果>10²CFU/mL就算定植成功，确保变链和白念定植后(大约在第6～7天定植成功)，干预组再用植物乳杆菌CCFM8724、CCFM634或0.02％的洗必泰(CHX)分别连续介导5天(第8～12天)，之后每周进行三次介导、介导6周。所有侵染和介导的具体操作手法为，用无菌棉棒饱和吸收菌悬液200μL或者0.02％的洗必泰(CHX)200μL，涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时。

特别地，本实验还设置了预防组，将益生菌优先定植口腔并表征其预防效果。采用植物乳杆菌CCFM8724或植物乳杆菌CCFM8724的预防组，是实验的第1～5天连续5天用无菌棉棒饱和吸收乳杆菌菌悬液200μL，涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时来定植乳杆菌，从大鼠牙齿取样涂布对乳杆的数量进行计数>10²CFU就算定植成功。然后，在第8～12天连续5天感染变链和白念，感染(侵染)方式是用无菌棉棒饱和吸收菌悬液200μL，涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时。采用洗必泰的预防组，是先连续5天使用0.02％的洗必泰，再连续5天感染变链和白念，第13、14天取样涂布对变链和白念计数。然后，蔗糖饮食6周。

实验结果：

(1)体重

每个星期对大鼠进行称重，比较各组大鼠的生长情况。

从图2的结果可以看到，正常饮食的空白对照组相比较于其他龋齿饮食组，体重增加趋势更为明显，体重增量显著高于其他组，而龋齿饮食各组无论是干预、预防还是模型组之间体重增量都没有显著性差别。说明龋齿饮食和双菌侵染的龋齿模型会对体重有影响。

(2)血清生化

杀鼠前禁食14h，麻醉后断颈处死，心脏取血后采血管静置半小时，在4℃下3000xg离心15min取得血清，-20℃保存。血清指标均由全自动生化分析仪测定，检测项目包括血糖Glu(血液中葡萄糖含量)，总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)指标，见表2。

表2各组大鼠血清生化指标

Tab.2 Serum biochemical indexes of rats in each group

注：a,b,c,d表示每个指标各组之间的显著性差异P<0.05)；

从表2中可以看出，空白组和模型组在各个指标上都有显著性差异，其中，只有血糖指标在不同预防和治疗手段之后有所下降，且CCFM8724的干预组和预防组比洗必泰的干预组和预防组对血糖指标的下调效果更好，说明CCFM8724可能在某种程度上减轻了蔗糖饮食的副作用，可能是其发挥龋齿防治的途径之一。

(3)大鼠口腔菌群计数

采样方式为用无菌棉棒来回旋转刮取大鼠口腔牙面样本，进行稀释涂布计数。整个实验为期8周，期间进行四次采样，第一次取样在第6天作为致龋菌或植物乳杆菌CCFM8724的定植检验，第二次取样定植检验是在另外连续5天的菌悬液处理过后，即实验第13天。第三次取样为实验第28天，第四次取样为实验第56天即大鼠处死前做最后一次取样。菌落计数共用到3种固体平板，分别为MS(mitis salivarius agar)加200U/L的杆菌肽对变异链球菌进行计数；添加20μg/ml万古霉素的MRS固体培养基对大鼠口腔中的乳杆菌进行计数；BIGGY固体培养基(BBL,No.211027,BD Diagnostic Systems)对白色念珠菌计数。

计数结果见图3。

由图3a和图3b可见，四次采样中模型组的计数结果都没有显著性差异。第一次采样是在白念和变链连续5天的定植之后，模型组和干预组的计数结果都没有显著性差别，干预组在连续5天的洗必泰和CCFM8724介导后，变链和白念数量都显著下降(P<0.05)。CCFM8724干预组在接下来的三次采样中都维持着较低的变链水平，而洗必泰不能抑制白念数量的增加。从预防组情况来看，乳杆菌的定植抑制了变链在口腔中的定植，其定植水平显著低于模型组(P<0.05)，且在第三第四次采样时，洗必泰预防组的变链数量几乎上升至模型组水平，而植物乳杆菌CCFM8724预防组一直控制变链数量级在10⁴CFU/mL左右，比洗必泰显示出了更优的预防效果。白色念珠菌数量在两组预防组中的变化并不明显，洗必泰显然是对白色念珠菌无效，而植物乳杆菌CCFM8724定植后并没有显著影响白念的最初定植，但在后续的过程中显著降低了白念的水平。从图2c植物乳杆菌CCFM8724定植情况看，起初，植物乳杆菌CCFM8724的定植都在10⁶CFU/mL左右，致病菌的存在并不影响植物乳杆菌CCFM8724的定植，而随着时间的变化，干预组的植物乳杆菌CCFM8724稳定在10⁵CFU/mL，而预防组在最初的植物乳杆菌CCFM8724定植后再也没有补充过乳杆菌，其数量也稳定在了10⁴CFU/mL，说明植物乳杆菌CCFM8724这株乳杆菌在大鼠口腔有一定的定植能力，如果定期补充的话更能增强其定植效果。

(4)Micro-CT检测大鼠牙齿脱矿情况

所有大鼠的下颌骨均用微计算机断层扫描(Micro CT)系统(Quantum Gx2；Perkinelmer，Hopkinton，MA，USA)成像。参数：90kv，88μA；视野范围：18μm；采集时间：4min；相机模式：高分辨率。将每个样本旋转360°并将所有图像导入Analyze 12.0软件(AnalyzeDirect，Overland Park，KS，USA)，分别重建下颌骨的三维图像进行分析。以固定阈值将牙釉质与整个下颌骨分离并计算牙釉质的体积。三维重建视图和剖面图以及釉质分离图见图4，各组釉质体积变化见图5。

如图4，从完整的3D重建的牙体硬组织中可以明显看到模型组的龋损部位以及剥离的釉质的缺失情况，相比之下，空白对照组无龋损，且釉质完整，两组对照符合预期。比较洗必泰干预组和洗必泰预防组，发现洗必泰预防组能从图上看到明显的龋损部位，而洗必泰干预组、CCFM8724干预和CCFM8724预防组则相对看不出特别明显的龋损部位，从剖面图看龋损深度也较浅。根据剥离的釉质计算釉质体积来直观呈现釉质的龋损情况，如图5，四组处理组都与模型组的釉质流失情况有显著性差别(P<0.05)，按龋损情况从低到高排序为：CCFM8724预防组<CCFM8724干预组<洗必泰干预组<洗必泰预防组。

(5)体式显微镜下大鼠龋齿评分

实验结束后对大鼠牙齿处理操作如下：麻醉后断颈处死大鼠，取出大鼠头骨，用手术刀剥离牙齿颌骨上的软组织，超声清洗颌骨20min，洗掉其牙缝里的残留渣滓，将上下颌骨泡于10％多聚甲醛中24h，结束后洗净晾干。配制0.4％紫脲酸铵染液，将上下颌骨泡于染液中12h，取出后清水漂洗干净，晾干后用金刚砂片沿大鼠的上下和磨牙牙面近远中向矢状半切，在体式显微镜下观察、评估大鼠磨牙龋损情况，并根据Keyes(keyes，Journal ofDental Research，1958)评分标准进行打分。

评分标准如下：染色后的大鼠磨牙的龋损部位呈现出红色，而正常的未龋损部位几乎没有染色或者颜色很浅。将牙齿的龋坏程度分为四个等级：E级龋，龋坏仅在牙釉质；Ds级龋，牙釉质损坏及龋坏范围不超过1/4的牙本质外层；Dm级龋，龋坏范围处于1/4～3/4牙本质；Dx级龋，龋坏范围超过3/4的牙本质。根据大鼠磨牙的颊面、舌面、邻面及窝沟情况将其分成若干个牙面单位，如表3所示。大鼠下磨牙颊舌面和窝沟计分单位划分示意图见图6。累及牙本质的龋损计分，仍是在E级龋计分的基础上加上龋损深入发展到各级牙本质龋的得分，即龋损较深的牙齿的总得分是各级的叠加，E级龋得分不受影响，且D级龋损的分值永远不可能超过E级龋。具体方法简述如下：光滑面龋包括颊面龋、舌面龋、邻面龋。其中，颊、舌面的评分是对龋损波及的釉质面的比例进行大体估算(必要时探测龋损深度，而本实验主要研究釉质龋，故未做深度探测)，即将牙面平均分为若干等份(如图6a所示)，龋损波及一份范围就计1分，小范围的位置分散的龋损可以用叠加法大致估算其波及的总范围；每个邻面按一个单位计1分，但是由于第一磨牙近中面几乎很少发生龋坏故一般不算入总分(但若真的发现龋损，也可视为一个单位计为1分)，第三磨牙远中面视为颊面的延续，被包含于所划分的四个单位之一中。窝沟龋是在纵切面上，将磨牙各窝沟壁曲线虚拟平铺后，平分成若干个线性单位(如图6b所示)，每个单位计1分，下颌第一、二、三磨牙窝沟数目依次为3、2、1，上颌依次为2、2、1。同一颌骨标本被半切后得到颊舌两侧，将其切面窝沟分别计分，最终选取分值较大者作为该标本的得分。大鼠磨牙各类龋损划分的总单位数目(即总分)如表3所示。注：各项评分结果均取正整数，没有小数。

表3大鼠磨牙牙面单位总数分布

注：①1^st 2^nd 3^rd分别表示大鼠第一、二、三磨牙

②大鼠第二磨牙包含一个近中邻面和一个远中邻面

在体式显微镜下对各组大鼠牙齿进行观察拍照，根据龋损破坏范围进行相应的龋齿打分，得分结果如表4所示。

表4大鼠龋齿得分情况

注：*表示与模型组差异显著(P<0.05)

体式显微镜下大鼠下颌磨牙龋损情况见图7。从图7可以看到每组的光滑面图和窝沟图，染上红色的部位为龋损部位，根据红色部位的单位计分来评判龋齿的严重程度，而空白对照没有被染上颜色则说明没有龋损。单从体式显微镜结果来看，相比模型组的严重程度，植物乳杆菌CCFM8724无论是从预防还是干预的角度都展现出显著效果，而植物乳杆菌CCFM634却在体内没有显著的效果甚至和模型组差不多。从所有大鼠的龋齿计分结果来看(表4)，相比较龋齿模型，植物乳杆菌CCFM634意外地在动物实验中没有预防或者干预龋齿地效果，甚至有加重龋齿地趋势；其他四组处理组除洗必泰预防组之外都显著减轻光滑面以及窝沟釉质龋(E)、牙本质浅龋(Ds)的发生，而洗必泰预防组只减轻了光滑面釉质龋(E)，说明药物预防效果并不明显。植物乳杆菌CCMFM8724在干预和预防组中都表现出了显著得缓解龋齿作用，甚至乳杆菌预防组未出现牙本质中龋(Dm)，说明早期阻断致龋细菌的定植有利于后期龋齿的发展进程。而洗必泰干预组并未能显著减轻窝沟Dm，治疗效果比较表面。总体而言，按防治龋齿效果排序为：植物乳杆菌预防CCMFM8724>植物乳杆菌CCMFM8724干预>洗必泰干预>洗必泰预防。植物乳杆菌CCFM634无论是干预还是预防都没有发挥出体外实验中的效果，说明体外实验有效果的菌在体内不一定能够发挥同样的效果，因为口腔环境的复杂性，还需要进行体内实验验证。

实施例2制备含有植物乳杆菌CCFM8724活菌的菌粉

植物乳杆菌CCFM8724以10％的接种量添加到MRS液体发酵罐中培养12h，控制发酵过程pH5.4-5.8，终止发酵并降温至20℃以下，采用离心设备收集菌体，按照菌泥质量比1:1添加冻干保护剂(甘油4％、脱脂乳粉25％、抗坏血酸4％、碳酸钠1.5％)将保护剂直接加至菌泥中平衡乳化，乳化时间为30min。将加入菌泥的乳化液置于冻干机中-40℃、4Pa冷冻干燥48h，将冻干产品进行低强度粉碎过筛，制得高活性益生菌冻干粉。

实施例3制备含有植物乳杆菌CCFM8724活菌的酸奶

奶粉、菊粉、甜菊糖、水按重量比：20：5：5：75进行混料，均质，制成发酵原材料；以121℃超高温灭菌300s杀菌，然后冷却到42℃，接种发酵菌保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌粉，发酵菌接种量为发酵原材料总重量的0.3％；在42℃下发酵12h后进行调配；将发酵产物冷却至37℃，加入植物乳杆菌CCFM8724冻干菌粉，投料量为10⁹CFU/ml酸奶，搅拌，罐装，在4℃下保存2天自然完成后熟，制成益生菌酸奶。

实施例4制备含有植物乳杆菌CCFM8724活菌的口香糖

植物乳杆菌CCFM8724以4％的接种量添加到MRS液体培养基中培养18h；培养后的益生菌离心收集菌体置于冻干机中-40℃、4Pa冷冻干燥48h；冻干粉于-80℃冰箱备用，冻干粉中益生菌数量为10¹²CFU/g。将口香糖胶基置于60℃烘箱软化4h，匀速降温至37℃后加入CCFM8724按10¹⁰CFU益生菌/粒口香糖比例加入，搅拌均匀冷却，投入切面机中挤压3次，保持温度20℃，相对湿度56％，老化12～22h，制成益生菌口香糖。

实施例5制备含有植物乳杆菌CCFM8724活菌的牙膏

植物乳杆菌CCFM8724以4％的接种量添加到MRS液体培养基中培养18h；培养后的益生菌离心收集菌体置于冻干机中-40℃、4Pa冷冻干燥48h；冻干粉于-80℃冰箱备用，冻干粉中益生菌数量为10¹²CFU/g。按以下重量份称取原料：牙膏基料100份、天然矿物盐3份、益生菌7份和蔓越莓提取物(浓缩至1000μg/mL)40份加入搅拌器中搅拌得到混合物，对混合物进行抽真空处理，然后脱气，获得膏体，研磨后制得益生菌牙膏，此实例中加了蔓越莓提取物因其对变链也有较好得抑制效果。

将按照上述实施例3的方法制备的酸奶应用于患龋儿童，实验方法为：选取30名确诊为龋齿的8—12岁儿童，随机分为2组，对照组给予市售普通酸奶，实验组给予添加了CCFM8724活菌的酸奶。所有儿童在实验前，在舌头背部一侧收集唾液样品，梯度稀释后用MS(mitis salivarius agar)平板对变异链球菌进行计数；实验组和对照组每日食用100g酸奶。两组儿童每日早晚刷牙一次，所用牙膏无任何抗菌成分。2个月后，在所有儿童舌头背部吸取唾液样本，将唾液样本梯度稀释后用MS(mitis salivarius agar)平板对变异链球菌进行计数。实验结果如表5所示：

表5儿童口腔变链水平变化情况

组别	实验前(10<sup>5</sup>CFU)	实验第60天(10<sup>5</sup>CFU)
			对照组	5.5±2.1	5.2±2.5
实验组	5.8±1.9	0.3±1.2*

注：*表示实验组与对照组差异显著(P<0.05)

从上述实验结果可以看出，食用含有CCFM8724活菌的酸奶后，患龋儿童口腔内变异链球菌数量显著减少，说明该菌的应用产品能够有效对抗口腔中变链的生长情况，缓解儿童龋齿情况。

同样，经试验证明实施例2、4、5在人体口腔中都能起到降低变链数量水平的效果，证明了CCFM8724这株植物乳杆菌无论是动物实验还是人体试验都具有显著防治龋齿的效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.植物乳杆菌CCFM8724在制备用于预防、治疗龋齿的物品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述龋齿是由变异链球菌和白色念珠菌双菌侵染导致的龋齿。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物品包括功能性食品、日化产品。

4.一种具有预防、治疗龋齿作用的酸奶，其特征在于，所述酸奶的制备步骤包括：将奶粉、菊粉、甜菊糖、水混料、均质，制成发酵原材料，并杀菌、冷却，接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌粉进行发酵，发酵结束后，加入植物乳杆菌CCFM8724冻干菌粉，搅拌、罐装、后熟，制成具有预防、治疗龋齿作用的益生菌酸奶。

5.一种具有预防、治疗龋齿作用的口香糖，其特征在于，所述口香糖的制备步骤包括：将口香糖胶基软化后加入植物乳杆菌CCFM8724，按10¹⁰ CFU益生菌/粒口香糖比例加入，搅拌均匀冷却，挤压切割制成益生菌口香糖。

6.根据权利要求5所述的一种具有预防、治疗龋齿作用的口香糖，其特征在于，口香糖中还添加对变异链球菌有抑制作用的物质，包括：蔓越莓提取物。

7.一种具有预防、治疗龋齿作用的牙膏，其特征在于，所述牙膏的制备步骤包括：将牙膏基料、天然矿物盐、植物乳杆菌CCFM8724搅拌得到混合物，对混合物进行抽真空处理，然后脱气，获得膏体，研磨后制得益生菌牙膏。

8.根据权利要求7所述的一种具有预防、治疗龋齿作用的牙膏，其特征在于，牙膏中还添加对变异链球菌有抑制作用的物质，包括：蔓越莓提取物。

9.一种大鼠龋齿模型，其特征在于，所述模型的构造方法是：选择SPF级Wistar大鼠、雄性、3周龄、体重40～50g，对大鼠用变异链球菌和白色念珠菌进行侵染，每天一次，连续5天；所述侵染的具体操作手法为将变异链球菌和白色念珠菌的菌悬液涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时。

10.应用权利要求9所述所述大鼠龋齿模型筛选具有预防、治疗龋齿作用的物质的方法，其特征在于，将大鼠龋齿模型的大鼠分为模型组、干预组，其中，模型组喂以致龋饲料并在饮食中添加蔗糖，干预组喂以致龋饲料、饮食中添加蔗糖并使用待筛选物质进行处理；另外，设置空白对照组和干预组，其中，空白对照组没有用变异链球菌和白色念珠菌进行感染，空白对照组喂以致龋饲料并在饮食中添加蔗糖，干预组先用待筛选物质进行处理然后感染变异链球菌和白色念珠菌，干预组喂以致龋饲料并在饮食中添加蔗糖；饲喂过程中，监测大鼠的体重、血清生化指标和口腔菌群，饲喂结束后，利用Micro-CT检测大鼠牙齿脱矿情况，并利用体式显微镜观察大鼠牙齿龋齿情况。

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