[go: up one dir, main page]

CN107889502A - 适应于异养培养条件的微藻 - Google Patents

适应于异养培养条件的微藻 Download PDF

Info

Publication number
CN107889502A
CN107889502A CN201680033198.0A CN201680033198A CN107889502A CN 107889502 A CN107889502 A CN 107889502A CN 201680033198 A CN201680033198 A CN 201680033198A CN 107889502 A CN107889502 A CN 107889502A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
strain
microalgae
group
improved
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680033198.0A
Other languages
English (en)
Inventor
J·L·维
D·袁
W·卢
R·雷根廷
J·维拉里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kirbyn Biotech Corp
Original Assignee
Kirbyn Biotech Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kirbyn Biotech Corp filed Critical Kirbyn Biotech Corp
Publication of CN107889502A publication Critical patent/CN107889502A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了用于制备具有相对于其衍生的株具有改进的特性的微藻株的方法。在说明性实施例中，执行这些方法以产生适应于在微藻衍生的生物质产品的工业生产中使用的微藻株，该生物质产品包括但不限于甘油三酸酯和脂肪酸。还提供了可以使用本文所述的方法获得的微藻株，以及可以从此类微藻株生产的微藻衍生的生物质产品。

Description

适应于异养培养条件的微藻
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2015年3月31日提交的美国临时申请号62/141,167的权益，出于所有目的将该美国临时申请通过引用以其全文结合在此。
政府资助
在加利福尼亚州的加州能源委员会(California Energy Commission)基金号pir-08-048的支持下进行了本发明的某些实施例。该能源委员会时本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及适应于异养培养条件的微藻株和制备此类株的方法。这些株特别适用于生产培养产品例如甘油三酸酯和脂肪酸、以及生产由培养产品制成的下游产品例如油脂化学品。
背景技术
某些微藻能够将固定碳能源转化为更高价值的产品，例如甘油三酸酯、脂肪酸、碳水化合物和蛋白质。另外，微藻本身作为食物来源可能是有价值的。某些物种的微藻已被基因工程化以产生“定制油”，这意味着相对于衍生自这些微藻的株，这些微藻的甘油三酸酯含量显示脂肪酸链长度和脂肪酸饱和度的改变的分布。参见PCT公开号2008/151149、2009/126843、和2010/045358。虽然小球藻属(Chlorella)株一直是在开发甘油三酸酯生产方法方面诸多努力的焦点，但是近来无绿藻属(Prototheca)株已被鉴定为甘油三酸酯(包括用于特定应用的定制油)的一种新来源具有甚至更好的前景。参见PCT公开号2010/063031和2010/063032以及PCT申请号US 11/038463和US 11/038464。
使用微藻用于生产甘油三酸酯和其他有价值的化学品的主要挑战是使用固定碳能源的成本。固定碳原料是指不是二氧化碳的碳源，该二氧化碳具有太低的自由能以致于作为异养微藻培养的能量输入使用不是最佳的。已经用于微藻培养的固定碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖和甘油。当使用纯化的糖(例如蔗糖或葡萄糖)作为固定碳原料用于培养时，从植物材料(例如甘蔗、甜菜和加工的纤维素材料)中纯化糖是整体培养成本的主要贡献者。通常需要纯化，因为固定碳原料可能包含对微藻具有抑制性或毒性的物质。例如，存在于这些低成本糖源中的高水平的钾盐和/或钠盐和化合物(例如木糖和糠醛)可能抑制微藻生长和甘油三酸酯产生。
结合这些问题，由于微藻中的竞争性代谢途径，微藻不能将添加到培养中的许多固定碳源转化为所希望的产品。
最后，许多微藻物种在需要冷却培养基的温度下表现出最佳生长，增加了大量的培养成本。
发明内容
在某些实施例中，本发明提供了能够被异养地培养的微藻物种的适应实验室的株。该适应实验室的株能够在100mM钾离子的存在下生长并且具有小于12小时的倍增时间，其中该物种的未适应的或天然存在的微藻株在100mM钾离子的存在下不能生长或具有大于或等于12小时的倍增时间。例如，该适应实验室的株能够在100mM钾离子的存在下生长并且具有在2小时与12小时之间的倍增时间，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、１１或12小时，例如约4-5小时。在各种实施例中，该适应实验室的株能够在至少约200mM(例如至少约300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、多达约1000mM)的钾离子或钠离子的存在下生长。在某些实施例中，该适应实验室的株能够产生以干细胞重量计至少约10％(例如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、多达约90％)的甘油三酸酯。在具体实施例中，该适应实验室的株衍生自如下物种，该物种不是海洋物种或适盐物种。合适的物种包括无绿藻属或小球藻属的物种，例如桑椹形无绿藻(Prototheca moriformis)或原壳小球藻(Chlorella protothecoides)。
在某些实施例中，本发明的另一个方面包括微藻物种的适应实验室的株，该适应实验窒的株适应限制糖的条件以致于在相同培养条件下相对于亲本株具有增加的甘油三酸酯产率。在说明性实施例中，相对于亲本株，该适应实验室的株的甘油三酸酯产率(油滴度或脂质滴度)增加至少3％、5％、7％或9％。在具体实施例中，适应实验室的株能够以在2小时与24小时之间(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时，例如约4-5小时)的倍增时间生长。在某些实施例中，该适应实验室的株能够产生以干细胞重量计至少约10％(例如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、多达约90％)的甘油三酸酯。在具体实施例中，该适应实验室的株衍生自如下物种，该物种不是海洋物种或适盐物种。合适的物种包括无绿藻属或小球藻属的物种，例如桑椹形无绿藻(Prototheca moriformis)或原壳小球藻(Chlorella protothecoides)。
本发明还提供了一种用于生产微藻产品的方法。在某些实施例中，该方法包括在具有高盐浓度的培养基中异养地培养微藻，其中该微藻适应在高盐条件下生长，然后从培养基中回收微藻产品。在微藻产品包括甘油三酸酯或脂肪酸的情况下，该方法可以进一步包括将甘油三酸酯或脂肪酸从剩余的微藻生物质中分离。在各种实施例中，该微藻能够产生以干细胞重量计至少约20％和多达约90％的甘油三酸酯，例如产生以干细胞重量计在约20％-30％、30％-40％、40％-50％、60％-70％、70％-80％或80％-90％范围内的甘油三酸酯。在某些实施例中，该微藻可以是无绿藻属或小球藻属，例如桑椹形无绿藻或原壳小球藻。在各种实施例中，该方法中使用的钠条件或钾条件可以比用于亲本或天然存在的株的生长的典型条件(例如淡水盐度条件，例如具有小于500百万分率(ppm)溶解盐、约7mg/L或以下的钠离子和约3mg/L或以下的钾离子的水)大至少约100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、多达约600mM。在具体实施例中，向该培养基中供应原料，该原料为衍生自植物的产品，该产品主要是蔗糖、葡萄糖或果糖、水解的纤维素和/或水解的半纤维素。在各种实施例中，向培养基中供应具有至少约100mM(例如至少约150mM、200mM、250mM、多达约300mM)的总的合并的钾离子或钠离子的盐浓度的原料，以便将培养基的总的合并的钾离子或钠离子浓度提高至大于50mM。在某些实施例中，该微藻是通过在高的但亚致死的盐浓度下繁殖例如至少10代(例如至少15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、130、140或150代)使其适应在高盐条件下生长的那些微藻。在此类实施例中，该高的但亚致死的盐浓度可以是例如在约100mM至约1000mM之间、或从约500mM至约900mM的总的合并的钠离子或钾离子。在各种实施例中，该高盐浓度大于或等于约100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mM的总的合并的钠离子或钾离子。在一些实施例中，该方法需要在高的但亚致死的盐浓度的存在下繁殖之前对微藻进行诱变处理。在具体实施例中，该高盐浓度是由在培养基中添加高盐糖原料引起的。在某些实施例中，可以向培养基中供应糖原料，该糖原料被去离子至比没有使用适应的微藻所需要的更少的程度。例如，该糖原料可以被去离子至300mM或150mM总的合并的钠离子和钾离子的水平，并且在这一盐浓度下微藻的倍增时间可以为5小时或更少，例如约4、3、2小时。在具体实施例中，该微藻被基因工程化以产生相对于非工程化的微藻，脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度的改变的分布。例如，该微藻可以包括外源性酰基-ACP硫酯酶、蔗糖转化酶或去饱和酶、和/或内源性脂肪酸去饱和酶或酰基-ACP硫酯酶的敲除或敲低中的一种或多种。在不同实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树(Cinnamomum camphora)、加州月桂(Umbellularia californica)、细叶萼距花(Cuphea hookeriana)、湿地萼距花(Cuphea palustris)、披针叶萼距花(Cuphealanceolata)、德国鸢尾(Iris germanica)、肉豆蔻(Myristica fragrans)、湿地萼距花(Cuphea palustris)和美洲榆(Ulmus Americana)。在一些实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。在各种实施例中，该外源酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQID NO：58。在一些实施例中，外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。在一些实施例中，该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：48。在一些实施例中，该外源性蔗糖转化酶由与SEQ ID NO：53的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的盒表达。在一些实施例中，编码内源性脂肪酸去饱和酶的敲除或敲低的多核苷酸与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44、以及SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47。在说明性实施例中，该微藻生产具有以下脂肪酸分布特征之一的甘油三酸酯：＞25％C12、＞60％C18:1、＞20％C18:0或＞30％C12-C14，并且该方法包括进一步将甘油三酸酯或脂肪酸从剩余的微藻生物质中分离。
本发明的另一个方面是一种用于适应异养微藻的方法，该方法包括在高的但亚致死浓度的盐的存在下繁殖微藻，以便产生能够在高水平盐的存在下增加生长速率的适应的微藻。在某些实施例中，该盐的高的但亚致死浓度可以是在约100mM至约1000mM之间、或从约500mM至约900mM。在具体实施例中，该方法需要选择能够在高的但亚致死浓度的盐的存在下产生以干细胞重量计至少50％甘油三酸酯的适应的微藻。该微藻可以任选地经由引入编码活性外源性硫酯酶的基因、引入编码活性外源性脂肪酸去饱和酶的基因、抑制内源性硫酯酶或抑制内源性去饱和酶中的一种或多种来进行基因工程化以产生改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。在不同实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树(Cinnamomum camphora)、加州月桂(Umbellulariacalifornica)、细叶萼距花(Cuphea hookeriana)、湿地萼距花(Cuphea palustris)、披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)、德国鸢尾(Iris germanica)、肉豆蔻(Myristicafragrans)、湿地萼距花(Cuphea palustris)和美洲榆(Ulmus Americana)。在一些实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。在各种实施例中，该外源酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：58。在一些实施例中，外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。在一些实施例中，该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：48。在一些实施例中，该外源性蔗糖转化酶由与SEQ ID NO：53的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的盒表达。在一些实施例中，编码内源性脂肪酸去饱和酶的敲除或敲低的多核苷酸与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44、以及SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47。可以在高盐存在下培养前或培养后进行基因工程化。本发明的相关方面包括通过这种方法产生的微藻株和使用该株生产的产品。
本发明还提供了一种用于从适应在低糖条件下生长的微藻生产微藻产品的方法。在某些实施例中，该方法包括在培养基中异养地培养微藻，然后从培养基中回收微藻产品。在某些实施例中，该适应的微藻能够产生以干细胞重量计至少20％的甘油三酸酯，并且在相同条件下培养时，与亲本株相比，微藻的适应导致糖转化为脂肪酸的效率更高。在微藻产品包括甘油三酸酯或脂肪酸的情况下，该方法可以进一步包括将甘油三酸酯或脂肪酸从剩余的微藻生物质中分离。在各种实施例中，该适应的微藻能够产生以干细胞重量计至少约20％和多达约90％的甘油三酸酯，例如产生以干细胞重量计在约20％-30％、30％-40％、40％-50％、60％-70％、70％-80％或80％-90％范围内的甘油三酸酯。在某些实施例中，该微藻可以是无绿藻属或小球藻属，例如桑椹形无绿藻或原壳小球藻。在具体实施例中，该微藻在低糖条件的存在下繁殖至少10代，例如至少15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、130、140或150代。在一些实施例中，该方法需要在低糖条件下繁殖之前诱变处理该微藻。在说明性实施例中，该低糖条件是小于约1.0g/L的糖浓度，例如小于0.8g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.08g/L、0.05g/L、0.02g/L、0.01g/L、低至约0.005g/L的糖浓度。在具体实施例中，该微藻被基因工程化以产生相对于非工程化的微藻，脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度的改变的分布。例如，该微藻可以包括外源性酰基-ACP硫酯酶、蔗糖转化酶或去饱和酶、和/或内源性脂肪酸去饱和酶或酰基-ACP硫酯酶的敲除或敲低中的一种或多种。在不同实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树(Cinnamomum camphora)、加州月桂(Umbellularia californica)、细叶萼距花(Cupheahookeriana)、湿地萼距花(Cuphea palustris)、披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)、德国鸢尾(Iris germanica)、肉豆蔻(Myristica fragrans)、湿地萼距花(Cuphea palustris)和美洲榆(Ulmus Americana)。在一些实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。在各种实施例中，该外源酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：58。在一些实施例中，外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。在一些实施例中，该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：42、SEQID NO：45和SEQ ID NO：48。在一些实施例中，该外源性蔗糖转化酶由与SEQ ID NO：53的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的盒表达。在一些实施例中，编码内源性脂肪酸去饱和酶的敲除或敲低的多核苷酸与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44、以及SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47。在说明性实施例中，该微藻生产具有以下脂肪酸分布特征之一的甘油三酸酯：＞25％C12、＞60％C18:1、＞20％C18:0或＞30％C12-C14，并且该方法包括进一步将甘油三酸酯或脂肪酸从剩余的微藻生物质中分离。
本发明的另一个方面是一种用于适应异养微藻的方法，该方法包括在低浓度糖(例如浓度小于约1.0g/L、例如小于约0.8g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.08g/L、0.05g/L、0.02g/L、0.01g/L、低至约0.005g/L)的存在下繁殖该微藻。在具体实施例中，该方法需要选择能够产生以干细胞重量计至少50％甘油三酸酯的适应的微藻。该微藻可以任选地经由引入编码活性外源性硫酯酶的基因、引入编码活性外源性脂肪酸去饱和酶的基因、抑制内源性硫酯酶或抑制内源性去饱和酶中的一种或多种来进行基因工程化以产生改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。在不同实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树(Cinnamomum camphora)、加州月桂(Umbellulariacalifornica)、细叶萼距花(Cuphea hookeriana)、湿地萼距花(Cuphea palustris)、披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)、德国鸢尾(Iris germanica)、肉豆蔻(Myristicafragrans)、湿地萼距花(Cuphea palustris)和美洲榆(Ulmus Americana)。在一些实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQIDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。在各种实施例中，该外源酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：58。在一些实施例中，外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。在一些实施例中，该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：48。在一些实施例中，该外源性蔗糖转化酶由与SEQ ID NO：53的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的盒表达。在一些实施例中，编码内源性脂肪酸去饱和酶的敲除或敲低的多核苷酸与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44、以及SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47。可以在高浓度糖的存在下培养前或培养后进行基因工程化。本发明的相关方面包括通过这种方法产生的微藻株和使用该株生产的产品。
在具体实施例中，本发明还提供适应实验室的微藻株，该适应实验室的微藻株的特征在于在相同条件下培养时，比该物种的亲本株或天然存在的株大5％的生长速率。
在某些实施例中，本发明进一步提供了能够在包括甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁的培养基中被异养地培养的微藻物种的适应实验室的株。该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁包括钾离子和/或钠离子，并且该培养基包括至少100mM总的合并的钾离子和钠离子。在这些条件下，该适应实验室的株具有12小时或更少，例如约11、10、9、8、7、6、5、4、3或2小时的倍增时间，而在100mM总的合并的钾离子和钠离子的存在下，天然存在的株不能生长或具有大于或等于12小时的倍增时间。在具体实施例中，该适应实验室的株能够在100mM总的合并的钾离子和钠离子的存在下生长，并且具有在2小时与12小时之间，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时，例如约4-5小时的倍增时间。优选地，该适应实验室的株能够在100mM总的合并的钾离子和钠离子的存在下生长，并且具有8小时或更少，例如约7、6、5、4、3或2小时的倍增时间。在各种实施例中，该适应实验室的株能够在250mM、350mM、450mM或550mM总的合并的钾离子和钠离子存在下生长。在各种实施例中，该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁是去离子的、部分去离子的或不是去离子的。在各种实施例中，该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁被去离子至约300mM总的合并的钾离子和钠离子的水平。在某些实施例中，该适应实验室的株能够产生以干细胞重量计10％至90％的甘油三酸酯。在具体实施例中，该适应实验室的株衍生自如下物种，该物种不是海洋物种或适盐物种。合适的物种包括无绿藻属或小球藻属的物种，例如桑椹形无绿藻(Prototheca moriformis)或原壳小球藻(Chlorella protothecoides)。
在某些实施例中，本发明的另一个方面包括通过分离暴露于可替代的氧化酶抑制剂(例如线粒体氧化酶抑制剂)的亲本微藻株的突变体而产生的改进的微藻株，该改进的微藻株在将糖转化为甘油三酸酯方面具有改进的效率。在某些实施例中，该改进的微藻株能够产生以干细胞重量计10％和多达约90％(例如在约20％-30％、30％-40％、40％-50％、60％-70％、70％-80％或80％-90％范围内)的甘油三酸酯。在具体实施例中，该改进的微藻株衍生自如下物种，该物种不是海洋物种或适盐物种。合适的物种包括无绿藻属或小球藻属的物种，例如桑椹形无绿藻(Prototheca moriformis)或原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)。该改进的微藻株可以任选地包括至少一种外源性脂肪酸生物合成基因，例如像外源性酰基-ACP硫酯酶和脂肪酸去饱和酶中的一种或多种。
在某些实施例中，本发明的另一个方面包括相对于亲本微藻株具有改进的油滴度的改进的微藻株。在不同实施例中，通过分离已暴露于水杨基氧肟酸(SHAM)的亲本微藻株的突变体来产生该改进的微藻株。在一些实施例中，通过分离已暴露于单糖转运蛋白抑制剂的亲本微藻株的突变体来产生该改进的微藻株。在具体实施例中，通过分离已暴露于2-脱氧葡萄糖的亲本微藻株的突变体来产生该改进的微藻株。在不同实施例中，相对于亲本微藻株，该改进的微藻株具有至少5％的油滴度改进，例如至少6％、7％、8％、9％、10％或更大的油滴度改进。
在某些实施例中，本发明的另一个方面包括改进的微藻株，该改进的微藻株能够生产比亲本微藻株具有更高百分比的C18:0和/或C18:1的油，其中通过分离已暴露于β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂和/或烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂的亲本微藻株的突变体来产生该改进的微藻株。在一些实施例中，该抑制剂包括浅蓝菌素。在一些实施例中，该抑制剂包括三氯生。在一些实施例中，该改进的微藻株具有至少10％的C18:0和/或C18:1百分比改进，例如至少11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更大的C18:0和/或C18:1百分比改进。在一些实施例中，该微藻株能够产生包括至少70％的C18:0和/或C18:1(例如至少73％、75％、78％、80％、83％、85％或更多的C18:0和/或C18:1)的脂肪酸。在一些实施例中，该油滴度为亲本微藻株的至少98％，例如亲本微藻株的至少99％或等同于亲本微藻株。在一些实施例中，该油滴度比亲本微藻株的油滴度大至少5％，例如大至少6％、7％、8％、9％、10％。
在一些实施例中，上述任何改进的微藻株属于如下物种，该物种不是海洋物种或适盐物种。在一些实施例中，该改进的微藻株能够产生以干细胞重量计10％至90％的甘油三酸酯。在一些实施例中，该改进的微藻株是无绿藻属或小球藻属的物种。在不同实施例中，该是桑椹形无绿藻或原壳小球藻物种。在不同实施例中，该改进的微藻株能够产生以干细胞重量计至少50％的甘油三酸酯。在某些实施例中，该改进的微藻株是基因工程化的株。在具体实施例中，该改进的微藻株包括至少一种外源性脂肪酸生物合成基因。在不同实施例中，该改进的微藻株包括外源性酰基-ACP硫酯酶、外源性脂肪酸去饱和酶和外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)中的一种或多种。在不同实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树(Cinnamomum camphora)、加州月桂(Umbellulariacalifornica)、细叶萼距花(Cuphea hookeriana)、湿地萼距花(Cuphea palustris)、披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)、德国鸢尾(Iris germanica)、肉豆蔻(Myristicafragrans)、湿地萼距花(Cuphea palustris)和美洲榆(Ulmus Americana)。在一些实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。在各种实施例中，该外源酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：58。在一些实施例中，外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。在一些实施例中，该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：48。在一些实施例中，该外源性蔗糖转化酶由与SEQ ID NO：53的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的盒表达。在一些实施例中，编码内源性脂肪酸去饱和酶的敲除或敲低的多核苷酸与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44、以及SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47。在不同实施例中，该外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68。在一些实施例中，该微藻被基因工程化以经由以下各项中的一个或多个来产生改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布：(1)引入编码活性外源性硫酯酶的基因、(2)引入编码活性外源性脂肪酸去饱和酶的基因、(3)引入编码活性外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)的基因、(4)抑制内源性硫酯酶、或(5)抑制内源性去饱和酶。在不同实施例中，在将亲本微藻株暴露于单糖转运蛋白抑制剂、2-脱氧葡萄糖、水杨基氧肟酸(SHAM)、或β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂之前进行基因工程化。在不同实施例中，在将亲本微藻株暴露于单糖转运蛋白抑制剂、2-脱氧葡萄糖、水杨基氧肟酸(SHAM)、或β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂之后进行基因工程化。还提供了通过上述改进的微藻株生产的产品。
本发明的另一个方面是用于产生改进的微藻株的方法。在一些实施例中，该方法需要在水杨基氧肟酸(SHAM)抑制剂的存在下培养亲本微藻株，并分离能够在水杨基氧肟酸(SHAM)的存在下生长的亲本微藻株的突变体。在一些实施例中，该方法需要在单糖转运蛋白抑制剂的存在下培养亲本微藻株，并分离能够在单糖转运蛋白抑制剂的存在下生长的亲本微藻株的突变体。在具体实施例中，该方法需要在2-脱氧葡萄糖的存在下培养亲本微藻株，并分离能够在2-脱氧葡萄糖的存在下生长的亲本微藻株的突变体。在一些实施例中，该方法需要在β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂的存在下培养亲本微藻株，并分离能够在该抑制剂的存在下生长的亲本微藻株的突变体。在此类实施例的变型中，该抑制剂包括浅蓝菌素或三氯生。在该方法的一些实施例中，该亲本微藻株属于如下物种，该物种不是海洋物种或适盐物种。在一些实施例中，该改进的微藻株能够产生以干细胞重量计10％至90％的甘油三酸酯。在一些实施例中，该改进的微藻株是无绿藻属或小球藻属的物种，例如或原壳小球藻桑椹形无绿藻。在一些实施例中，该改进的微藻株能够产生以干细胞重量计至少50％的甘油三酸酯。在某些实施例中，该改进的微藻株是基因工程化的株。在具体实施例中，该改进的微藻株包括至少一种外源性脂肪酸生物合成基因。在一些实施例中，该改进的微藻株包括外源性酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸去饱和酶和外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)中的一种或多种。在一些实施例中，该微藻被基因工程化以经由以下各项中的一个或多个来产生改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布：(1)引入编码活性外源性硫酯酶的基因、(2)引入编码活性外源性脂肪酸去饱和酶的基因、(3)引入编码活性外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)的基因、(4)抑制内源性硫酯酶、或(5)抑制内源性去饱和酶。在不同实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树(Cinnamomum camphora)、加州月桂(Umbellularia californica)、细叶萼距花(Cuphea hookeriana)、湿地萼距花(Cuphea palustris)、披针叶萼距花(Cuphealanceolata)、德国鸢尾(Iris germanica)、肉豆蔻(Myristica fragrans)、湿地萼距花(Cuphea palustris)和美洲榆(Ulmus Americana)。在一些实施例中，该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。在各种实施例中，该外源酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQID NO：58。在一些实施例中，外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。在一些实施例中，该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：48。在一些实施例中，该外源性蔗糖转化酶由与SEQ ID NO：53的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的盒表达。在一些实施例中，编码内源性脂肪酸去饱和酶的敲除或敲低的多核苷酸与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44、以及SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47。在不同实施例中，该外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68。在一些实施例中，在将亲本微藻株暴露于单糖转运蛋白抑制剂、2-脱氧葡萄糖、水杨基氧肟酸(SHAM)、或β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂之前进行基因工程化。在一些实施例中，在将亲本微藻株暴露于单糖转运蛋白抑制剂、2-脱氧葡萄糖、水杨基氧肟酸(SHAM)、或β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂之后进行基因工程化。
在上述改进的微藻株和相关方法的说明性实施例中，经由抑制内源性硫酯酶和引入编码活性外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)将该微藻基因工程化以产生改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。例如，可以引入外源性KASII。在不同实施例中，该外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68。在此类实施例中，该微藻株能够产生包含至少70％的C18:0和/或C18:1的脂肪酸。
本发明的这些以及其他方面和实施例将在下面进行更详细地说明并在下面简要地描述的附图中展示。
附图说明
结合参考附图，通过参考以下详细说明，将更容易理解本发明的前述特征，其中：
图1是显示在对照和升高的盐浓度条件下未适应的株与适应的株相比的甘油三酸酯和非甘油三酸酯生物量(NTB)的条形图；
图2是显示未适应的亲本(“对照”)株、亲本株的诱变处理的培养物和一系列适应以更有效地利用葡萄糖作为主要碳源的诱变处理的亲本株的培养物(参见实例2)的倍增时间的条形图；
图3显示使用纯化的蔗糖和甘蔗糖浆、各种细胞适应的培养物和对照培养物随时间的油生产；
图4显示了在蔗糖和甘蔗糖浆中若干种微藻株的钾积累的时程；
图5显示了通过图4在蔗糖和甘蔗糖浆中的微藻株来生产油的时程；并且
图6显示了图4和图5的株就每克可发酵糖生产的油的克数而言的产率的时程。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“适应”或“适应的”是指由从株衍生的微藻群体暴露于选择压力而导致的微藻株的持续改变。这些改变包括任何持续的改变(包括遗传改变和表观改变)。术语“适应实验室的”是指由非自然选择产生的微藻株，即由人类故意暴露于选择压力(无论该选择是否是在“实验窒”或一些其他设备中正确地进行)而产生的微藻株。
如本文所用，短语“改进的微藻株”是指从亲本株衍生的并且具有至少一种相对于亲本株增强的特性的微藻株。
“培养(cultivated)”及其变体例如“培养(cultured)”和“发酵”是指通过使用选择和/或受控的条件有意地培养一个或多个细胞的生长。选择和/或受控的条件的实例包括使用限定性培养基(具有已知特征例如pH、离子强度、和碳源)、指定的温度、氧张力、二氧化碳水平、和在生物反应器中生长。培养不是指自然或以其他方式没有人为干涉的微生物的生长或增殖。
如本文所用，“生长”涵盖细胞大小、细胞内含物和/或细胞活性的增加，和/或经由有丝分裂来增加细胞数量。
“倍增时间”是指细胞或细胞培养物在选择条件下数量倍增的持续时间。在微藻株(例如，适应的株)的倍增时间相对于另一种微藻株(例如亲本株)的倍增时间被表达的情况下，应理解这些倍增时间是在相同的培养条件下确定的。
术语“总的合并的钠离子和钾离子”是指通过将溶液(例如培养基、或糖溶液，包括甘蔗汁、甜菜汁、糖蜜或高粱汁、或解聚纤维素或解聚半纤维素溶液)的钠离子浓度和钾离子浓度相加获得的浓度值。该术语并不旨在暗示两种离子必须存在，而是涵盖在所有离子可以是钠离子、或者相反地所有离子可以是钾离子、或者钠离子和钾离子两者都存在的情况下的浓度值。
术语“微藻产品”是指由微藻生产和/或衍生自微藻的任何材料。该术语涵盖分泌的产品、从微藻中提取的产品(例如甘油三酸酯和/或脂肪酸)、在任何提取过程之后剩余的残留生物质、和微藻生物质的任何组分。该术语还涵盖任何下游产品，该下游产品包含由微藻生产和/或衍生自微藻的任何材料。
术语“原料”是指供应到过程中以转化为不同的物质(输出)的原材料(输入)。这一术语在本文中用于描述当培养物异养地生长时，提供给微藻培养物以提供至少一些藻类的碳和能量需求的一种或多种有机物质。包含糖(简单的单糖或二糖或复合寡糖或多糖)的原料在本文中是指“糖原料”。
如本文所用，当材料(例如甘蔗汁)已经经受用于除去离子的处理步骤(例如像离子交换色谱法)时，材料被描述为“去离子的”。该术语并不暗示所有离子必须从材料中去除。
术语“VHP糖”是指通常称为非常高极性的糖、高极性糖(hi-polsugar)或A级糖。例如，VHP糖可具有在600与1200之间的ICUMSA值。
术语“油滴度”在本文中用于指微藻或微藻培养物中的油的量。如参考本文的适应方法使用时，油滴度通常表达为亲本微藻株的油含量的百分比。
在两个或更多个氨基酸或核苷酸序列的上下文下，术语“同一的”或“百分比同一性”是指如使用以下序列比较算法之一或通过目测进行测量，当比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。
对于确定核苷酸或氨基酸同一性百分比的序列比较，一个序列一般充当参考序列，测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算测试序列的序列同一性百分比。用于比较的最佳序列比对可以使用设置为默认参数的BLAST来进行。
用于制备改进的微藻株的方法
本发明提供了用于制备具有相对于其衍生的株具有改进的特性的微藻株的方法。在说明性实施例中，执行这些方法以产生适应于用于工业生产微藻衍生的生物质产品(包括但不限于甘油三酸酯和脂肪酸)，或从其衍生的产品(包括燃料、食物、表面活性剂和油脂化学品)的微藻株。
根据本发明的说明性实施例，异养微藻株适应于用于工业生产衍生自微藻的生物质产品(包括甘油三酸酯和脂肪酸)。任何异养微藻株都可以用于本文所述的方法，并且合适的起始(亲本)株可以取决于要生产的衍生自微藻的生物质产品而不同。用于本文描述的应用的合适的亲本或未适应的株包括2010年9月23日公开的US 2010/0239712中披露的那些(其通过引用以相关部分并且具体针对本披露特此结合)，以及2011年12月1日公开的US2011/0294174中披露的那些(其通过引用以相关部分并且具体针对本披露特此结合)。适合用于本文所述的方法中的株的具体实例包括无绿藻属或小球藻属的，例如桑椹形无绿藻或原壳小球藻物种，例如UTEX株1435、1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25和CCAP株211/17和211/8d中的任何一种。
由微藻细胞产生的脂肪酸的链长度和饱和度分布可以使用基因工程方法、在适应之前或之后进行定制，这些基因工程方法包括在WO 2008151149(其通过引用针对其基因工程方法和培养方法的描述结合在此)、WO 2010063032(其通过引用针对其基因工程方法和培养方法的描述结合在此)和PCT申请号US 11/38463(其通过引用针对其基因工程方法和培养方法的描述结合在此)中传授的那些。该微藻可以包含外源性酰基-ACP硫酯酶(包括针对C8、C10、C12、C14、C16或C18有活性或有特异性的酰基-ACP硫酯酶)、蔗糖转化酶或脂肪酸去饱和酶中的一种或多种。可替代地或另外，该微藻可以包含内源性脂肪酸去饱和酶或酰基-ACP硫酯酶的敲除或敲低。一种或多种内源性去饱和酶基因(例如，硬脂酰基-ACP去饱和酶或脂肪酸去饱和酶包括Δ12脂肪酸去饱和酶)的突变(包括敲除)或抑制(例如，使用反义或RNAi)可以降低或消除去饱和酶活性以产生更完全饱和的甘油三酸酯谱。该微藻也可以包含内源性酮脂酰合酶基因的突变(包括敲除)或抑制(包括经由反义或RNAi)和/或可以包含外源性酮脂酰合酶基因。在某些实施例中，株适应实验室以改进在高盐培养基中的生长，在可替代的碳源中的生长、在升高的温度下的生长，以改进糖向甘油三酸酯的转化效率，以提高油滴度和/或以增强C18:0和/或C18:1水平。在进一步的实施例中，这些适应的株用于生产产品例如脂肪酸或甘油三酸酯。
适应在不良条件下的生长
在一个实施例中，本发明提供了用于制备适应在不良条件下生长或存活的微藻株的方法。由于株适应，在该条件甚至其他条件下，可以具有基本上不变或增加的所希望的产品(例如微藻甘油三酸酯)的生产。在一些实施例中，在抑制未适应的株的生长的培养条件(即选择压力)下，该方法产生相对于未适应的株表现出增加的生长速率的株(例如，如可以通过倍增时间、比生长速率或速率常数来测量)。例如，该适应实验室的株的特征可能在于在相同条件下培养时，比该物种的亲本株或天然存在的株大5％的生长速率。在各种实施例中，该方法包括在抑制生长条件下培养未适应的株多代，直至产生适应的株。典型地，该培养将继续持续至少10代至20代，包括例如至少50代或至少70代、80代或150代。在选择压力下的多代培养可以在恒化器中或通过连续传代培养(例如在摇瓶中)进行。在一些实施例中，该过程涉及诱变处理的株的适应。合适的突变诱导条件包括暴露于化学诱变剂和/或UV或其他辐射。典型地，在适应期结束时，培养基的分离物被获得、表征并存储以供将来使用。在一个实施例中，选择保持最低水平的甘油三酸酯生产的分离物(例如，与亲本株相当的生产，例如，以％干细胞重量测量的最终产品的生产、产率/培养基体积、和/或甘油三酸酯生产速率/细胞)。在具体实施例中，该适应的株能够产生以干细胞重量计在10％与90％之间(例如20％至30％、30％至40％、40％至50％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或75％至85％)的甘油三酸酯。如本领域技术人员容易理解的，可以使用适合于甘油三酸酯生产的条件来确定产生这些水平的甘油三酸酯的能力。例如，氮耗尽/限制是在产油微生物中已知的脂肪生成诱导剂，并且因此，在某些实施例中，甘油三酸酯生产可以在低氮条件下进行，例如如2011年12月1日公开的US 2011/0294174中所描述(其特别针对本披露通过引用特此结合)。
高盐
在各种实施例中，抑制生长的条件是相对于亲本株的典型浓度具有较高盐浓度的培养基，其中该较高的盐浓度限制生长(本文被称为“高盐浓度”或“高盐条件“)。高盐浓度可以是包括钾、钠、钙和/或镁的阳离子的盐的结果。在各种实施例中，高盐浓度包括，例如且不限于在相同生长条件下，比未适应的株(即，亲本株或天然存在的株)生长的典型浓度高10mM至1000mM、50mM至900mM或100mM至800mM的钾离子和/或钠离子浓度(例如，“总的合并的钠离子和钾离子”)。例如，当在针对该株的常规培养条件下培养时，钾离子或钠离子浓度(单独地，或总和)可以比未适应的株生长的典型水平高10mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、或500mM。用于无绿藻属或小球藻属的物种的常规条件包括，例如，在2010年9月23日公开的US 2010/0239712(其特别针对本披露通过引用特此结合)中披露的那些，以及2011年12月1日公开的US 2011/0294174(其特别针对本披露通过引用特此结合)中披露的那些(例如，在4.2g/LK2HPO4、3.1g/L NaH2PO4、0.24g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L柠檬酸一水合物、0.025g/LCaCl22H2O、2g/L酵母提取物加2％葡萄糖中、在28℃下、伴随搅拌(200rpm)生长7天。在具体实施例中，钾离子和/或钠离子浓度的“典型水平”是在选择条件下提供未适应的株的最高生长速率(例如，细胞数量增加)的水平。这个水平可以通过在不同盐浓度的范围内生长未适应的株并从生长速率对盐浓度的曲线图确定峰值生长速率来确定。作为一个实例，未适应的株的典型的钠和/或钾浓度可以是约40mM。在说明性实施例中，该方法中使用的盐的高的但亚致死浓度为100mM至1000mM的钠离子和/或钾离子，例如，100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mM的钠离子和/或钾离子。在一些实施例中，通过使用廉价的碳源(例如甘蔗汁、VHP糖、甜菜汁、高粱汁、糖蜜、粗甘油或解聚纤维素材料(包括解聚纤维素和/或半纤维素制剂))来提供盐。这些糖制剂可以具有以下盐浓度：当添加到培养基中时，产生比给定株的典型盐浓度更高的盐浓度。
在高盐条件下经过多代(例如5-50代、100代、150代或更多代)培养后，培养基包含在高盐条件下比亲本株繁殖更快的细胞。然后可以从培养基中分离一个或多个细胞以建立新的适应的株，然后将该新的适应的株表征为所希望的生产特征，例如甘油三酸酯生产率、和脂肪酸链长度和饱和度的分布。然后可以在高盐浓度(包括升高到比进化条件更低程度的盐条件)的存在下使用该适应的株以生产甘油三酸酯。因此，可以使用较低成本的高盐碳源而不需要昂贵的盐去除(去离子)步骤，或者使用低盐和高盐碳源的组合来提供甘油三酸酯生产的经济性。此类实施例对于没有天然进化为耐盐的微藻物种(即不是海洋物种或适盐物种的物种)是特别有用的。
可替代的碳源
在具体实施例中，细胞适应于在作为主要或唯一碳源的VHP糖上生长。
在各种实施例中，抑制生长的条件是将除了诸如纯化的葡萄糖之类的典型碳源以外的碳源作为主要碳源。可替代的碳源可以是甘油、蔗糖(特别是以甜菜汁形式的)、VHP糖、糖蜜、高粱汁(典型地，例如通过破碎、打浆或切割从高粱植物的茎提取)、甘蔗汁、和木糖(特别是衍生自纤维素材料的木糖)。在所定义的培养条件下，与常规用于培养的碳源相比，此类“可替代的”碳源产生较低的生长速率。在各种实施例中，该碳源是植物衍生的原料，该原料主要是蔗糖、葡萄糖或果糖或水解的纤维素材料。此类原料的实例包括甘蔗提取物(包括稀汁或浓汁)、甜菜提取物(包括稀汁或浓汁)、棕榈糖或解聚玉米秸秆或甘蔗渣。在各种实施例中，株适应于代谢和/或耐受五碳糖(包括例如木糖、阿拉伯糖和核糖)，或耐受在纤维素材料例如糠醛中发现的抑制性物质。
抑制性物质
在各种实施例中，抑制生长的条件是包含除了钠或钾之外的抑制生长的物质的培养基。在具体实施例中，该抑制生长的物质是存在于解聚纤维素材料中的物质。纤维素生物质是廉价且易于获得的，并且通常构成来自草本和木质能源作物以及农业作物的残余物，即，植物部分(主要是茎和叶)，它们不随主要食物或纤维产物一起从田间去除。实例包括农业废料，例如甘蔗渣、稻壳、玉米纤维(包括茎、叶、外壳、和穗轴)、麦秆、稻秆、甜菜浆、柑橘浆、柑桔皮；林业废料，例如硬木和软木间伐材、和来自木料操作的硬木和软木残余物；木材废料，例如锯木厂废料(木屑、锯屑)和纸浆厂废料；城市废料，例如城市固体废料的纸质部分、城市木材废料和城市绿色废料例如城市碎草；以及木材建筑废料。另外的纤维素包括专用的纤维素作物例如柳枝稷、杂交杨木、芒草、纤维用甘蔗、和纤维用高粱。
纤维素生物质可以被解聚以使其中包含的糖可用作微藻的能源，并且由此产生的解聚纤维素生物质包括可以抑制微藻生长和甘油三酸酯生产的许多材料。此类材料包括但不限于木质素、羟甲基糠醛、乙酸盐(高盐浓度)和木糖。根据本发明的方法适应的微藻株可以用于在抑制性物质(包括高盐浓度的许多解聚纤维素原料)的存在下从糖原料生产甘油三酸酯。高盐水平从解聚纤维素材料天然存在或由解聚过程产生。例如，纤维素材料的解聚可能需要高酸性或碱性条件。高酸性或碱性条件的pH中和导致具有高的钾和/或钠浓度的糖源。使用本发明的适应的株，可以在将糖原料添加到培养基之前减少或消除将糖原料去离子的需要。例如，可以使用离子交换或反渗透进行去离子，并且需要额外的成本。相比之下，本发明的株的培养可以供应“原始”未去离子的原料或部分去离子的原料(即仅除去原料中的一部分盐、或混合去离子的原料与非去离子的原料)。因此，由于对于给定升高的抑制剂浓度，相对于亲本株生长速率或甘油三酸酯生产速率增强，生物质的生产(包括甘油三酸酯和衍生自该生物质的其他产品)变得更具成本效益。(在该背景下，术语“升高的”涵盖通常不存在于常规培养基的抑制剂的存在，以及比通常在常规培养基中的水平更高的抑制剂的存在。)根据本发明的适应性方法，将未适应的株在培养基中连续培养多代(例如，10-50代、100代、150代或更多代)或直到培养物显示生长速率的增加，该培养基包含：升高水平的一种或多种这些抑制性材料、或包含这些抑制材料的组合物，即解聚纤维索材料。
非典型的温度
在各种实施例中，抑制生长的条件是除典型生长温度(对于许多微藻株为约32℃)之外的温度。尽管可以实施本发明的实施例以使株适应于在低于32℃的温度下生长和/或生产甘油三酸酯，更典型地，实施这些实施例以使株适应于在高于32℃的温度下(即37℃和以上)生长和生产甘油三酸酯。根据本发明的适应方法，在所希望的温度下连续培养未适应的株，直到培养基包含比在该温度下未适应的株生长得更快和/或生产更多甘油三酸酯的细胞。可替代地，微藻株适应于针对亲本株以次优速率(例如降低约70％)生长或生产甘油三酸酯的第一升高温度。多代之后，然后该株适应于高于该第一升高温度的第二升高温度。如果需要或希望，可以在进一步升高的温度下重复该过程。如果使用恒化器方法，则可以在观察到培养基的细胞密度增加时升高温度。因此，产生适应的株，该株可以在升高的温度下表现出改进的生长和/或生产甘油三酸酯，从而减少冷却发热的微藻培养所需的能量、材料或资本设备。
非典型的pH
在其他实施例中，抑制生长的条件是除典型生长pH(例如，对于许多微藻株为6.5-8)之外的pH。在本发明的这个实施例中，制备适应于在低pH或高pH下生长和/或生产甘油三酸酯的株。根据本发明的适应方法，在所希望的pH下连续培养未适应的株，直到培养基包含比在该pH下未适应的株生长得更快和/或生产更多甘油三酸酯的细胞。可替代地，微藻株适应于针对亲本株以次优速率(例如降低约70％)生长或生产甘油三酸酯的第一pH。多代之后，然后该株适应于高于该第一pH的第二pH。如果需要或希望，可以在更低pH或更高pH下重复该过程。如果使用恒化器方法，则可以在观察到培养基的细胞密度增加时减少或增加pH。因此，产生适应的株，该株可以在具有压低或升高的pH的培养基中生长和/或生产甘油三酸酯。在具体实施例中，压低或升高的pH为分别低于6.5或高于8的pH。在低于6.5或高于8的pH下培养微藻在最小化培养过程中培养基的污染方面是有用的。
适应于生产甘油三酸酯的增强的效率
在一个实施例中，实施该方法以制备株，该株比未适应的对应株更有效率地将碳源(例如，糖例如葡萄糖、蔗糖或糖醇(例如甘油))转化为所希望的最终产品(例如甘油三酸酯)。以代谢意义来测量效率；每摩尔使用的碳源的甘油三酸酯的摩尔数增加。在这些实施例中，该方法包括在碳源的生长限制浓度下培养未适应的株多代，直到产生适应的株。当碳源是糖时，糖的“生长限制浓度”在本文中被称为“低浓度糖”或“低糖条件”。例如，可用糖的浓度可以小于约1.0g/L，例如小于约0.8g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.08g/L、0.05g/L、0.02g/L、0.01g/L或低至约0.005g/L。如在其他实施例中，在适应条件下的培养继续持续至少10代至20代或更多代，即至少70代，并且有时持续150代或更长。在各种实施例中，该方法需要选择在常规培养条件下能够产生以干细胞重量计至少50％的甘油三酸酯的适应的微藻株，其中生长不受培养基的糖浓度的限制(即，其中糖是“非限制的”)。
在一个实施例中，抑制生长的条件是对可替代的氧化酶(AOX)的抑制。AOX的抑制可以是化学的或通过基因敲除或敲低。化学抑制可以用水杨基氧肟酸(SHAM)实现。例如，可以化学地和/或使用辐射来诱变处理微藻细胞。然后将诱变处理的细胞涂板在抑制剂例如SHAM上并且选择强壮生长的菌落。然后可以分析所选择的菌落的生长速率、甘油三酸酯水平和将糖转化为甘油三酸酯的效率。然后分离突变菌落，该菌落在常规培养条件下将糖转化为甘油三酸酯具有更高的效率。在具体实施例中，该突变菌落能够生产以干细胞重量计10％至90％(例如至少50％)的甘油三酸酯。不受理论的限制，该分离的株可以具有一个或多个突变，这些突变将更多的碳分流到甘油三酸酯且将较少的碳分流到CO2。在各种实施例中，经受该方法的这些微藻不是海洋物种或适盐物种。小球藻属的说明性株和无绿藻属的说明性株包括但不限于桑椹形无绿藻的株或原壳小球藻的株。可以使用本文提供的适应方法产生这些适应的株。该突变株可以用于以高效率从糖生产油。所得的油可以用于制造燃料、化学品、食品或其他产品。
适应于增强的油滴度
在某些实施例中，实施该方法以分离相对于亲本株具有增强的油滴度的改进的微藻株。在一些实施例中，该方法需要在单糖转运蛋白抑制剂的存在下培养亲本微藻株，并分离能够在单糖转运蛋白抑制剂的存在下生长的亲本微藻株的突变体。单糖转运蛋白包括一起进入细胞的结合单糖(例如葡萄糖)和钠离子的膜转运蛋白。然后通过钠-钾ATP酶将钠离子泵出细胞。糖输送的速率和程度取决于钠离子浓度。单糖转运系统的抑制剂是熟知的并且包括根皮苷、细胞松弛素B、2-脱氧葡萄糖、和钠-钾ATP酶系统的抑制剂例如强心苷(例如地高辛和乌本苷)。可以在该方法中使用能够抑制微藻单糖转运蛋白的任何抑制剂。适应于 增强的C18:0和/或C18:1水平
在具体实施例中，实施该方法以分离相对于亲本株具有增加水平的C18:0和/或C18:1水平的改进的微藻株。在一些实施例中，该方法需要在β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂的存在下培养亲本微藻株，并分离能够在该抑制剂的存在下生长的亲本微藻株的突变体。可以抑制在微藻细胞中的任何β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)，包括例如KASI、KASII和/或KASIII。该抑制剂对于这些酶中的一种可以是选择性的，或者可以抑制多于一种。说明性的KAS抑制剂包括来自真菌Cephalosporiumcaerulens的浅蓝菌素、来自放线菌诺卡氏菌属(Nocardia spp.)的硫乳霉素(TLM)、异烟肼(异烟酰肼)、乙硫异烟胺、和三氯生[5-氯-2-(2，4-二氯苯氧基)-苯酚]。可替代地或另外，对于KAS抑制，可以抑制存在于微藻细胞中的任何烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶(ENR)，包括ENR(NADPH，A-特异性)和/或ENR(NADPH，B-特异性)。该抑制剂对于这些酶中的一种可以是选择性的，或者可以抑制多于一种。说明性的ENR抑制剂包括三氯生、三氯卡班、裂盒蕈色素和leucomelone。在一些实施例中，该抑制剂抑制KAS和ENR两者；三氯生，例如，抑制两种酶。
针对方法的一般考虑
在本发明的适应性方法的实施例中，抑制在适应过程中维持的生长和/或生产所希望的产品的条件对于细胞是不致死的，并且不能完全阻止细胞分裂。相反，保持培养条件使得细胞分裂比在常规条件下观察到的细胞分裂更慢，使得对正在进行适应的培养基具有选择压力。例如，可以使用生长速率(延长倍增时间)减慢了从5％至95％的条件。在各种实施例中，将生长速率被减慢了从20％至90％、从30％至85％、从40％至75％、或从50％至70％。在具体的实施例中，生长速率被减慢了约70％。
在本发明的适应方法的实施例中，多代培养可以在恒化器中进行，或者通过在摇瓶中连续传代培养进行。此外，在这些各种实施例中，待适应的株可以在适应的条件下培养之前或在整个适应过程中的任何点或连续地进行诱变处理。诱变处理可以通过本领域技术人员已知的方式容易地实现，这些方式包括但不限于暴露于化学诱变剂；例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、甲磺酸乙酯或2-甲氧基-6-氯-9-[3-(乙基-2-氯乙基)氨基丙胺基]吖啶二盐酸化物或UV、X射线、γ射线或其他电磁或粒子辐射。
在本发明的适应性方法的实施例中，实施这些方法以使微藻株适应许多不同参数，例如上述任何两种或更多种抑制条件。例如但不限于，株可以适应于耐受高温培养和高盐浓度两者。在其他实施例中，该株可以适应于更有效地利用碳源并耐受高盐浓度。在其他实施例中，该株可以适应于高温培养和高盐浓度以及更有效地利用碳源。在各种实施例中，这些多重适应的株适应于同时进行所有适应的过程。在其他实施例中，这些多重适应的株适应于一系列的顺序适应过程。
在本发明的适应性方法的实施例中，从业者可以将单细胞从适应的培养基中分离。单细胞分离物的特征在于证实它们具有适应的培养基的一个或多个希望的属性，例如甘油三酸酯生产的增加、糖向甘油三酸酯转化的效率增加、或生产具有所希望的脂肪酸分布的甘油三酸酯的能力，并且如此确认的分离物将被贮藏或“库存”以供将来使用(包括用于进一步适应)。
改进的微藻株
在另一个方面，本发明还提供了通过本发明的方法生产的微藻株。这些株(本文中可以被称为“适应实验室的株”)相对于那些衍生这些株的株，在抑制未适应的株的生长和/或甘油三酸酯生产的条件下表现出改进的生长和/或甘油三酸酯生产。在各种实施例中，这些适应的株包括对于特定条件与未适应的对应株相比表现出更快的生长速率和/或更高的甘油三酸酯生产的株。在各种实施例中，这些适应的株在一个或多个条件下相对于未适应的株表现出更快的生长速率和/或更高的甘油三酸酯生产，该一个或多个条件例如是：较高的培养温度，例如37℃或更高的温度，其中未适应的株典型地在约32℃的温度下生长)；较高的盐(例如钾盐和/或钠盐)、浓度(例如比典型生长培养基(例如40mM钾)中的盐浓度高100mM至800mM的盐浓度)；以及主要碳源是葡萄糖以外的碳源(例如甘油)的条件。在各种实施例中，这些适应的株能够以比衍生这些株的未适应的株更有效地将特定类型的碳源转化为所希望的最终产品(例如甘油三酸酯)。在各种实施例中，本发明的这些微藻株不是海洋物种或适盐物种。小球藻属的说明性株和无绿藻属的说明性株包括但不限于桑椹形无绿藻的株或原壳小球藻的株。可以使用本文提供的适应方法产生这些适应的株。
盐耐受性
在一个实施例中，本发明提供了能够被异养地培养的微藻物种的适应株。由于适应性，该株能够在高盐浓度的存在下生长，例如比用于培养微藻的典型浓度高100mM至800mM、或高于700mM的盐浓度。在一些实施例中，较高的盐浓度是比用于未适应的株的典型浓度高至少100mM、至少300mM或多达800mM的钠盐和/或钾盐的浓度。例如，该升高的盐浓度可以来自使用具有至少50mM、100mM、150mM、或200mM钠离子和/或钾离子的糖原料。在一些实施例中，该株在高盐浓度中表现出一种比生长速率，该比生长速率比在相同盐浓度下的未适应株的比生长速率快至少5％、至少10％、20％、至少30％或至少50％(例如，如通过近似于一级动力学或倍增时间所测量的)。
在一些实施例中，该适应的株在高盐浓度中具有12小时或更少，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，例如约4-5小时的倍增时间，其中该物种的天然存在的微藻在高盐浓度下具有大于或等于12小时的倍增时间。在各种实施例中，倍增时间的减少可以是至少15分钟、至少30分钟、至少1小时或至少2小时或更长。在各种实施例中，倍增时间的减少可以在15分钟至8小时、2小时至48小时、3小时至24小时、或3.5小时至12小时的范围内。倍增时间可以方便地使用光密度读数来测量，如下面的实例所示以及如在本领域中针对其他应用通常实施的，或者通过任何其他合适的方法来测量。在各种实施例中，该适应的株在其中盐浓度为比未适应的株的典型盐浓度高50mM至800mM、100mM至600mM、或200mM至400mM的范围内的培养基中表现出这样减少的倍增时间。例如，合并的钠和钾浓度可以为100至1000mM、100至200mM、200至300mM、300至400mM、400至500mM、500至600mM、700至800mM、800至900mM、或900至1000mM。
在具体实施例中，适应实验室的微藻株能够异养地培养，以便在100mM钾离子的存在下生长，并且倍增时间为12小时或更少，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，例如约4-5小时，然而适应的微藻株的未适应的亲本株或该物种的天然存在的微藻在100mM钾离子存在下不能生长或具有大于或等于12小时的倍增时间。例如，在某些实施例中，在100mM钾离子的存在下，该适应的株的倍增时间在2与12小时之间。在各种实施例中，该适应实验室的株能够在200、300、400、500、600、700、800、900或1000mM钾离子和/或钠离子的存在下生长。在某些实施例中，该适应实验室的株能够生产以干细胞重量计10％-90％的甘油三酸酯。
重要地，并且如下面关于钾盐和钠盐的实例所示，用于将微藻株适应于高盐浓度的方法可以用一种盐(例如钾)、一种在糖原料(例如甘蔗汁)中发现的常见的生长抑制剂来实施，以产生在高浓度的其他盐(包括但不限于钠盐、钙盐或镁盐)的存在下表现出改进的生长和/或甘油三酸酯生产特性的适应的株。
可替代的碳源耐受性
在某些实施例中，适应实验室的微藻株能够被异养地培养，以便在包含甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁的培养基中生长，其中该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁包含钾离子和/或钠离子，并且其中该培养基包含至少100mM总的合并的钾离子和钠离子。在这些条件下，该适应的株具有12小时或更少，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，例如约4-5小时的倍增时间，然而该适应的微藻的未适应的亲本株或该物种的天然存在的微藻不能在100mM钾离子的存在下生长或具有大于或等于12小时的倍增时间。例如，在某些实施例中，在100mM钾离子的存在下，该适应的株的倍增时间在2与12小时之间，例如小于8小时。在各种实施例中，该适应实验室的株能够在250、350、450、550、600、700、800、900或1000mM钾离子和/或钠离子的存在下生长。该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁可以是去离子的、部分去离子的或不是去离子的。在不同实施例中，该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁被去离子至约300mM总的合并的钾离子和钠离子的水平。在某些实施例中，该适应实验室的株能够生产以干细胞重量计10％-90％的甘油三酸酯。
增强的甘油三酸酯生产的效率
在一个实施例中，本发明提供了微藻物种的适应实验窒的株，该适应实验室的株适应限制糖条件以便在相同培养条件下相对于亲本株具有增加(例如增加至少3％)的甘油三酸酯的产率。在各种实施例中，这种适应实验室的株在常规培养条件下(即，在糖是非限制的情况下)具有在2小时与24小时之间的倍增时间。在某些实施例中，该适应实验室的株能够生产以干细胞重量计10％-90％的甘油三酸酯。
增强的油滴度
本发明的另一个方面包括相对于亲本微藻株具有改进的油滴度的改进的微藻株。在某些实施例中，该改进的微藻株是通过分离已暴露于单糖转运蛋白抑制剂的亲本微藻株的突变体来生产的适应实验室的微藻株，如上所述。在具体实施例中，通过分离已暴露于2-脱氧葡萄糖的亲本微藻株的突变体来产生该改进的微藻株。在不同实施例中，相对于亲本微藻株，该改进的微藻株具有至少5％的油滴度改进，例如至少6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更大，例如高达16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％的油滴度改进。该改进的微藻株也可以具有落入由这些值中任何值限定的任何范围内，例如5％-25％、10％-20％、和11％-15％的油滴度的百分比改进。可以使用任何常规方法测量油滴度；通常使用相同的方法来测量相对于亲本株改进的油滴度。
增强的C18:0和/或C18:1水平
本发明的另一个方面包括改进的微藻株，该改进的微藻株能够生产比亲本微藻株具有更高百分比的C18:0和/或C18:1的油。在某些实施例中，该改进的微藻株是通过分离已暴露于β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂和/或烯酰基：酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂的亲本微藻株的突变体来生产适应实验室的微藻株。在一些实施例中，该抑制剂包括浅蓝菌素。在一些实施例中，该抑制剂包括三氯生。在各种实施例中，相对于亲本株，该改进的微藻株具有至少10％的C18:0和/或C18:1百分比增加，例如至少11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、29％或更多，例如，高达35％、40％、45％、50％、55％或60％的C18:0和/或C18:1百分比增加。该改进的微藻株也可以具有落入由这些值中的任何值限定的任何范围内，例如10％-60％、15％-50％和20％-30％的C18:0和/或C18:1水平的百分比增加。可以使用任何常规方法来测量C18:0和/或C18:1水平；通常使用相同的方法来测量相对于亲本株改进的油滴度。“C18:0和/或C18:1的百分比增加”可以是单独的C18:0的百分比增加或单独的C18:1的百分比增加、或C18:0和C18:1的组合水平的增加。
在一些实施例中，该改进的微藻株能够生产包括至少70％C18:0和/或C18:1，例如至少73％、75％、78％、80％、83％、85％、86％、87％、88％、89％、90％或更多，例如高达93％或95％C18:0和/或C18:1的脂肪酸。该改进的微藻株也可以具有落入由这些值中的任何值所限定的范围内，例如70％-95％、75％-90％和80％-85％的C18:0和/或C18:1百分比。如上所述，这些百分比可以基于单独的C18:0、单独的C18:1、或C18:0和C18:1的组合水平来计算。
在一些实施例中，改进的微藻株的油滴度为亲本微藻株的至少98％，例如亲本微藻株的至少99％或等同于亲本微藻株。在一些实施例中，该油滴度比亲本微藻株的油滴度大至少5％，例如大至少6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更多，例如高达16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。该改进的微藻株也可以具有落入这些值中的任何值限定的任何范围内，例如5％-25％、10％-20％和11％-15％的油滴度的百分比增加。
针对改进的微藻株的一般考虑
在一些实施例中，上述任何改进的微藻株属于如下物种，该物种不是海洋物种或适盐物种。在某些实施例中，该改进的微藻株能够生产以干细胞重量计10％至90％的甘油三酸酯。在具体实施例中，该改进的微藻株是无绿藻属或小球藻属的物种。在不同实施例中，该是桑椹形无绿藻或原壳小球藻物种。在不同实施例中，该改进的微藻株能够产生以干细胞重量计至少50％的甘油三酸酯。
亲本微藻株或改进的微藻株的基因工程化
在本发明的所有方法的各种实施例中，在适应过程之前或之后，亲本株或适应的株被基因工程化以表达一种或多种外源基因。例如，该亲本株或适应的株可以被基因工程化以生产脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度的改变的分布。在具体实施例中，用于本发明的方法的微藻株将被基因修饰以表达外源蔗糖转化酶基因，使得通过该株生产足够的蔗糖转化酶，以使得该株能够有效代谢蔗糖。在许多这些实施例中，该蔗糖转化酶基因将编码分泌到培养基中的蔗糖转化酶。可替代地或另外，该微藻株可以被基因工程化以表达外源性酰基-ACP硫酯酶、外源性去饱和酶或外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)，或被基因工程化以抑制内源性硫酯酶或去饱和酶。
在上述改进的微藻株和相关方法的说明性实施例中，经由抑制内源性硫酯酶和引入编码活性外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)的基因将该微藻基因工程化以生产改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。例如，可以引入外源性KASII。
从改进的微藻株生产产品的方法
在另一个方面，本发明提供了用于从适应的微藻株生产有用的产品的方法。在各种实施例中，实施这些方法以生产甘油三酸酯，该甘油三酸酯进而被用作食品、化学原料、化妆品成分或燃料。在各种实施例中，这些方法涉及在如下碳源(例如糖)上培养适应的株，在该碳源上未适应的株将比适应的株生长更慢或生产更少的所希望的产品。在各种实施例中，这些方法涉及在如下培养基中培养适应的株，在该培养基上未适应的株将比适应的株生长更慢。在各种实施例中，这些方法涉及在如下温度下培养适应的株，在该温度下未适应的株将比适应的株生长更慢。在某些实施例中，这些方法涉及培养改进的微藻株(例如，具有增强的油滴度或C18:0和/或C18:1水平的株)。在各种实施例中，将在此披露的方法中的两种或更多种进行组合，即在葡萄糖上和在高盐培养基中生长更快的适应的株培养在葡萄糖上和在高盐培养基中以生产甘油三酸酯。在各种实施例中，所希望的产品是直接或在处理后掺入食品中的微藻生物质。在各种实施例中，所希望的产品是微藻甘油三酸酯，该微藻甘油三酸酯从微藻生物质中分离，然后直接掺入食品或在进一步处理后掺入食品。在各种实施例中，所希望的产品是微藻甘油三酸酯，该微藻甘油三酸酯从微藻生物质中分离，然后加工成燃料，例如生物柴油、可再生柴油、或喷气燃料、或油脂化学品。
例如，在一个实施例中，本发明提供了一种用于生产微藻产品的方法，其中该方法需要在具有高盐浓度的培养基中异养地培养微藻并且回收微藻产品，其中该微藻适应在高盐条件下生长。该微藻产品可以例如包括甘油三酸酯或脂肪酸，在这种情况下，该方法可以包括将甘油三酸酯或脂肪酸从剩余的微藻生物质中分离。在各种实施例中，该微藻能够生产以干细胞重量计20％和多这约90％的甘油三酸酯，例如生产以干细胞重量计在约20％-30％、30％-40％、40％-50％、60％-70％、70％-80％或80％-90％范围内的甘油三酸酯。在各种实施例中，该微藻不是海洋物种或适盐物种。说明性合适的微藻包括小球藻属的株和无绿藻属的株，这些株包括但不限于桑椹形无绿藻的株或原壳小球藻的株。该适应的微藻可以在如下钠条件或钾条件下进行培养，该钠条件或钾条件比用于亲本或天然存在的株的生长的典型条件(例如淡水盐度条件，例如具有小于500百万分率(ppm)的溶解盐、约7mg/L或以下的钠离子和约3mg/L或以下的钾离子的水)大至少100mM、200mM、300mM、400mM或500mM。在一些实施例中，向该培养基中供应原料，该原料为植物衍生的产品，该产品主要是蔗糖、葡萄糖或果糖、水解的纤维素和/或水解的半纤维素。这种方法的培养基中的高盐浓度可以由将高盐糖原料添加到该培养基中引起。在具体实施例中，向培养基中供应具有至少100mM、150mM、200mM、或250mM总的合并的钾离子或钠离子的盐浓度的原料，以致于将培养基的总的合并的钾离子或钠离子浓度提高至大于50mM。在一些实施例中，可以向培养基中供应糖原料，该糖原料被去离子至比没有使用适应的微藻所需要的程度更少的程度。例如，该糖原料可以被去离子至300mM或150mM总的合并的钠离子和钾离子的水平，并且在某些实施例中，在这一盐浓度下的微藻的倍增时间为5小时或更少，例如约4、3或2小时。如本文所述，该适应的微藻可以通过在高的但亚致死浓度的盐下繁殖而产生，该繁殖可以进行至少10代，例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150代或更多代。在各种实施例中，该盐的高的但亚致死浓度是在100mM至1000mM、或500mM至900mM之间的总的合并的钠离子或钾离子。在各种实施例中，该高盐浓度大于或等于100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mM的总的合并的钠离子或钾离子。在一些实施例中，通过在高的但亚致死浓度的盐的存在下繁殖之前对微藻进行诱变处理来产生该适应的微藻。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于生产微藻产品的方法，其中该方法需要在培养基中异养地培养微藻并且回收微藻产品，其中该微藻适应在低盐条件下生长。在某些实施例中，在常规培养条件下(即，在糖是非限制的情况下)，该适应的微藻产生以干细胞重量计至少20％的甘油三酸酯，并且微藻的适应性导致糖向脂肪酸的更高的转化效率。该微藻产品可以例如包括甘油三酸酯或脂肪酸，在这种情况下，该方法可以包括将甘油三酸酯或脂肪酸从剩余的微藻生物质中分离。在各种实施例中，该微藻能够生产以干细胞重量计20％和多达约90％的甘油三酸酯，例如生产以干细胞重量计在约20％-30％、30％-40％、40％-50％、60％-70％、70％-80％或80％-90％范围内的甘油三酸酯。说明性合适的微藻包括小球藻属的株和无绿藻属的株，这些株包括但不限于桑椹形无绿藻的株或原壳小球藻的株。如本文所述，该适应的微藻可以通过在低糖条件的存在下繁殖至少10代而产生，例如繁殖至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或更多代而产生。在某些实施例中，该低糖条件是小于约1.0g/L的糖浓度，例如小于0.8g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.08g/L、0.05g/L、0.02g/L、0.01g/L、低至约0.005g/L的糖浓度。在一些实施例中，通过在低糖条件的存在下繁殖之前对微藻进行诱变处理来产生该适应的微藻。
任选地，在施加如上所述的选择压力以获得在抑制条件下具有更快生长速率的株，并且任选的进行基因工程化之后，分离多个微藻克隆并测试其生产所希望的产品(例如具有一定的链长度或饱和度的甘油三酸酯)的能力或生产增加量的所希望的产品的能力。然后选择并存储具有增加的生长速率和所希望的生产能力两者的克隆株以供将来使用。
在各种实施例中，该微藻株生产具有＞25％、＞30％、＞40％、＞50％、＞60％、＞70％、＞80％、＞90％C12的甘油三酸酯。可替代地或另外，该微藻株生产具有＞60％、＞70％、＞80％、＞90％C18:1的甘油三酸酯。可替代地或另外，该微藻株生产具有＞20％、＞30％、＞40％、＞50％、＞60％、＞70％、＞80％、＞90％C18:0的甘油三酸酯。可替代地或另外，该微藻株生产具有＞30％、＞40％、＞50％、＞60％、＞70％、＞80％、＞90％C12-C14的甘油三酸酯。在说明性实施例中，该微藻株生产具有以下脂肪酸分布特征之一的甘油三酸酯：＞25％C12、＞60％C18:1、＞20％C18:0或＞30％C12-C14。
改进的微藻细胞的脂肪酸谱
在一些实施例中，本发明提供了包含甘油三酸酯油的微藻细胞(例如，高盐耐受性细胞或具有改进的糖向甘油三酸酯转化的效率的细胞)，其中该甘油三酸酯油的脂肪酸谱选自下组，该组由以下各项组成：至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约7％、至少约10％、或至少约15％C8:0；至少约1％、至少约5％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、或至少约30％C10:0；至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、或至少约80％C12:0；至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％C14:0；至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％C16:0；至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％C18:0；至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％C18:1；小于约7％、小于约5％、小于约3％、小于约1％或约0％C18:2；以及至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％的饱和脂肪酸。
在一些实施例中，该微藻细胞包含甘油三酸酯油，该甘油三酸酯油包含选自下组的脂肪酸谱，该组由以下各项组成：至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的C8:0和C10:0的总的合并的量；至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或约100％的C10:0、C12:0和C14:0的总的合并的量；至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的C16:0、C18:0和C18:1的总的合并的量；至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的C18:0、C18:1和C18:2的总的合并的量；至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的C14:0、C16:0、C18:0和C18:1的总的合并的量；以及小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、或约0％的C18:1和C18:2的总的合并的量。
在一些实施例中，该微藻细胞包含甘油三酸酯油，该甘油三酸酯油具有包含选自下组的脂肪酸的比率的脂肪酸谱，该组由以下各项组成：C8:0比C10:0的比率为至少约5比1、至少6比1、至少7比1、至少8比1、至少9比1、或至少10比1；C10:0比C12:0的比率为至少约6比1、至少7比1、至少8比1、至少9比1、或至少10比1；C12:0比C14:0的比率为至少约5比1、至少6比1、至少7比1、至少8比1、至少9比1、或至少10比1；C14:0比C12:0的比率为至少7比1、至少8比1、至少9比1、或至少10比1；以及C14:0比C16:0的比率为至少1比2、至少1比3、至少1比4、至少1比5、至少1比6、至少1比7、至少1比8、至少1比9、或至少1比10。
来自改进的微藻细胞的甘油三酸酯油组合物的脂肪酸谱
在一些实施例中，本发明提供了一种微藻甘油三酸酯油组合物，其中该甘油三酸酯油的脂肪酸谱选自下组，该组由以下各项组成：至少约1％、至少约2％、至少约5％、在至少约7％、至少约10％、或至少约15％C8:0；至少约1％、至少约5％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、或至少约30％C10:0；至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、或至少约80％C12:0；至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％C14:0；至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％C16:0；至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％C18:0；至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％C18:1；小于约7％、小于约5％、小于约3％、小于约1％或约0％C18:2；以及至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％的饱和脂肪酸。
在一些实施例中，该微藻甘油三酸酯油组合物包括甘油三酸酯油，该甘油三酸酯油包含脂肪酸谱，在该脂肪酸谱中：C10:0、C12:0和C14:0的总的合并的量为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C16:0、C18:0和C18:1的总的合并的量为至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C18:0、C18:1和C18:2的总的合并的量为至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C14:0、C16:0、C18:0和C18:1的总的合并的量为至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C8:0和C10:0的总的合并的量为小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％或约0％。
在一些实施例中，微藻甘油三酸酯油组合物包括甘油三酸酯油，该甘油三酸酯油具有包含选自下组的脂肪酸的比率的脂肪酸谱，该组由以下各项组成：C8:0比C10:0的比率为至少约5比1、至少约6比1、至少约7比1、至少约8比1、至少约9比1、或至少约10比1；C10:0比C12:0的比率为至少约6比1、至少约7比1、至少约8比1、至少约9比1、或至少约10比1；C12:0比C14:0的比率为至少约5比1、至少约6比1、至少约7比1、至少约8比1、至少约9比1、或至少约10比1；C14:0比C12:0的比率为至少约7比1、至少约8比1、至少约9比1、或至少约10比1；C14:0比C16:0的比率为至少约1比2、至少约1比3、至少约1比4、至少约1比5、至少约1比6、至少约1比7、至少约1比8、至少约1比9、或至少约1比10。
在一些实施例中，本发明提供了一种生产微藻甘油三酸酯油组合物的方法，该甘油三酸酯油组合物具有选自下组的脂肪酸谱，该组由以下各项组成：至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约7％、至少约10％、或至少约15％C8:0；至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、或至少约30％C10:0；至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、或至少约80％C12:0；至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％C14:0；至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％C16:0；至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％C18:0；至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％C18:1；小于约7％、小于约5％、小于约3％、小于约1％或约0％C18:2；以及至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％的饱和脂肪酸，其中该方法包括以下步骤：(a)在培养基中培养微藻细胞群体，直到微藻细胞的干细胞重量的至少10％为甘油三酸酯油；并且(b)将甘油三酸酯油组合物从微藻细胞中分离。
在一些实施例中，生产微藻甘油三酸酯油组合物的方法产生包含脂肪酸谱的甘油三酸酯油，在该脂肪酸谱中：C10:0、C12:0和C14:0的总的合并的量为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C16:0、C18:0和C18:1的总的合并的量为至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C18:0、C18:1和C18:2的总的合并的量为至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C14:0、C16:0、C18:0和C18:1的总的合并的量为至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％；C8:0和C10:0的总的合并的量为小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％或约0％。
在一些实施例中，生产微藻甘油三酸酯油组合物的方法产生具有脂肪酸谱的甘油三酸酯油，该脂肪酸谱包含选自下组的甘油三酸酯的比率，该组由以下各项组成：C8:0比C10:0的比率为至少约5比1、至少约6比1、至少约7比1、至少约8比1、至少约9比1、或至少约10比1；C10:0比C12:0的比率为至少约6比1、至少约7比1、至少约8比1、至少约9比1、或至少约10比1；C12:0比C14:0的比率为至少约5比1、至少约6比1、至少约7比1、至少约8比1、至少约9比1、或至少约10比1；C14:0比C12:0的比率为至少约7比1、至少约8比1、至少约9比1、或至少约10比1；以及C14:0比C16:0的比率为至少约1比2、至少约1比3、至少约1比4、至少约1比5、至少约1比6、至少约1比7、至少约1比8、至少约1比9、或至少约1比10。
发现由原壳小球藻生产的油可产生固醇，当通过GC-MS检测时，这些固醇似乎为菜籽固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇及β-谷固醇。然而，据信由小球藻属生产的所有固醇都具有C24β立体化学。因此，据信被检测为菜油固醇、豆固醇和β-谷固醇的分子实际上分别为22，23-二氢菜籽固醇、多孔固醇和穿贝海绵甾醇。因此，在一些实施例中，由上述微藻生产的油因具有C24β立体化学的固醇的存在以及所存在的固醇中C24α立体化学的不存在而可以与植物油相区分。例如，产生的油可能含有22，23-二氧菜籽固醇，但缺乏菜油固醇；含有穿贝海绵甾醇，但缺乏β-谷固醇，和/或含有多孔甾醇但缺乏豆固醇。可替代地或另外，这些油可以含有大量的Δ7-多孔固醇。
因此，本发明包括许多不同的方面和实施例。在一个实施例中，由本发明提供的株已经适应于实验室以能够在高盐条件(包括在粗制甘蔗汁中发现的那些)下具有较高的生长速率和/或甘油三酸酯生产。在其他实施例中，这些株已经适应于更有效地将葡萄糖或其他糖转化为脂肪酸和/或甘油三酸酯。在其他实施例中，这些适应的株用于生产产品例如甘油三酸酯。本发明所描述的实施例仅旨在示例，并且许多变化以及修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。所有此类变化和修改旨在落入本发明的范围之内。
实例
实例1.无绿藻属株对高盐条件的适应
这个实例展示了关于使桑椹形无绿藻株UTEX 1435适应于在高钾浓度(540-640mM)下生长的本发明的方法。将该株在摇瓶中进行适应。为每个测试条件设置五个重复烧瓶。将培养基保持在指数生长期，并且每1-4天(通常1-3天)进行传代培养。培养基在750nm(OD750)下的光密度在0.4与20之间。
所有条件的初始比生长速率如下：对照(葡萄糖碳源)-0.21h-1；升高的温度-0.07h-1；高[KCl]-0.08h-1；甘油碳源-0.15h-1。
适应于升高的温度的五种培养基被适应了85至88代，并表现出在0.15至0.17h-1范围内的生长速率。适应于高KCl浓度的五种培养基被适应了70至73代，并表现出在0.08至0.10h-1范围内的生长速率；对于这些培养基中的四种，适应继续了161至165代，其然后表现出在0.09至0.11h-1范围内的生长速率。适应于甘油的五种培养基被适应了186至188代，并表现出在0.17至0.19h-1范围内的生长速率。
在指示适应许多代之后，将烧瓶内容物库存并用作甘油三酸酯生产测试的接种源。在使用葡萄糖作为碳源的对照条件下，未适应的株UTEX1435产生约17g/L的甘油三酸酯和约6g/L的非甘油三酸酯生物量(NTB)。
在使用甘油作为碳源的对照条件下，未适应的株UTEX 1435产生约6g/L的甘油三酸酯和约5g/L的非甘油三酸酯生物量(NTB)。适应的混合株群体同样在甘油条件下生产约6g/L甘油三酸酯和约4g/L NTB。
在37.6℃的升高的培养温度(最佳温度为32℃)的对照条件下，未适应的株UTEX1435生产约15g/L甘油三酸酯和约5g/L NTB。适应的混合株群体在这一温度下生产约6g/L甘油三酸酯和约5g/L NTB，表明该适应并不导致该株的甘油三酸酯生产增加。
在高KCl浓度(比40mM的最佳[KCl]高300mM)的测定条件下，未适应的株UTEX 1435仅生产约2g/L甘油三酸酯和1g/L NTB，然而适应的混合株群体生产约3至5g/L甘油三酸酯和2至3g/L NTB。简言之，所有五种高[KCl]培养基在生物量和甘油三酸酯生产方面的表现优于未适应的株。
为了获得遗传上纯的克隆分离物，从适应了70代的高[KCl]培养基中分离出约10个单菌落。制备这些分离物的细胞库，并测试了这些分离物的甘油三酸酯生产。在所得的50个分离物中，47个的甘油三酸酯滴度优于未适应的株。
然后测试最高的五个分离物在高KCl浓度下、和单独的高NaCl浓度培养(300mM过量的盐)下的甘油三酸酯生产。在高盐条件下，就甘油三酸酯生产而言，所有分离物的表现均优于未适应的株；甚至在对照条件(正常盐)下，在这一参数方面，这些分离物中的三个表现优于未适应的株。因此，在对照条件下，未适应的株UTEX 1435生产约17g/L的甘油三酸酯，而5个适应的株的该值为约11至19。在高KCl培养基中，未适应的株生产约3g甘油三酸酯，然而5个适应的株的该值在从约8至13的范围内。在高NaCl培养基中，未适应的株生产约4g/L甘油三酸酯，然而5个适应的株的该值在从约8至13的范围内。
然后在各种不同的盐条件下将适应的株中的一个的甘油三酸酯生产与未适应的亲本株进行比较。结果示于图1中。如从图中可以看出，在所有测试的条件下适应的株生产更多的甘油三酸酯，这些测试的条件不仅包括对于未适应的株最佳的低盐条件，而且包括在各种高盐浓度条件(浓度超过最佳条件浓度)：150mM Na；150mM K；300mM Na；300mM K；Na和K各150mM；70mM MgSO4；和150mM MgSO4。
这个实例表明，本发明的方法可以用于制备具有改进特征(包括在生长抑制条件下减少的倍增时间和在抑制甘油三酸酯生产的条件下增加的甘油三酸酯生产)的微藻株。适应于高盐条件的株特别适用于使用具有高盐浓度的廉价原料(例如甘蔗糖浆、甜菜糖浆、糖蜜和许多纤维素衍生的原料)来生产甘油三酸酯。此外，甚至在对照(正常盐浓度)条件下，这些株中的一些也表现出改进的甘油三酸酯生产。另外，适应的细胞中的一些的改变的表型(在对照条件下表现为增加裂解)可以提供关于下游处理的优点，因为这些株的使用可以允许油与生物质/培养基的有效分离。
实例2.使无绿藻适应以增加糖至甘油三酸酯的产率
这个实例展示了关于使专性异养微藻(桑椹形无绿藻)株适应以在含有在生长限制浓度下的葡萄糖作为主要碳源的培养基中增加生长速率和糖向甘油三酸酯的转化产率的本发明的方法。使用桑椹形无绿藻株S1920作为起始株，在培养基中适应之前通过物理(UV辐射)和化学手段(EMS和NTG)诱变处理该株。培养在允许连续培养的恒化器中进行。添加新鲜培养基，以控制的速率除去培养肉汤。细胞生长受到葡萄糖碳源耗尽的限制；因此，这些细胞的生长速率由葡萄糖供应速率(也称为稀释率)控制。S1920是从按服务收费(fee-for-service)的实验室获得的为了增加的脂质滴度而选择的经典诱变处理的株。S1920的亲本株是UTEX 1435。
作为混合群体的一个或多个诱变处理的株首先在分批培养基中生长。然后，将含有葡萄糖的培养基以0.05h-1的稀释率连续供应到恒化器中，使细胞以25％的最大比生长速率生长。在这些葡萄糖限制条件下生长约70代之后，将混合群体涂板以分离单个菌落。然后，将单个分离物在烧瓶培养基中生长以测量甘油三酸酯生产和葡萄糖转化为甘油三酸酯的产率。
结果示于图2中。观察到适应的群体的生长速率随着适应进展而增加。未适应的、经诱变处理的亲本株的倍增时间为约3.4小时(比生长速率为0.21h-1)。经诱变处理的亲本株群体具有约3.7小时的倍增时间。随着适应代数的增加，倍增时间减少：12代-约3.2小时；24代-约3.1小时；48代-约2.95小时；以及71代-约2.9小时；71代适应的培养的生长速率为0.238。因此，71代之后，相对于未经诱变处理的未适应的株，所得异源群体的最大比生长速率增加了16％，并且其倍增时间减少约30分钟。
从适应的培养基获得分离的克隆，与亲本株相比测试的94个分离物中超过50％具有更高的甘油三酸酯滴度(在摇瓶筛选中)，并且一些分离物显示相对于亲本株就每克消耗的葡萄糖产生的甘油三酸酯的克数而言产率增加约3.6％。
然后使用70％试剂级蔗糖作为碳供应，测试这两种适应的分离物在7L规模下的甘油三酸酯生产。进行亲本株的对照培养用于比较。在整个培养中在适应的分离培养中生产的总甘油三酸酯超过对照，在第六天结束时，分离培养基显示增加9％。分离株的峰产率比对照株高约3％-7％。
这个实例证明，本发明的方法可以用于制备微藻株，该微藻株比未适应的株在给定的固定碳源上生长更快并且生产更多的甘油三酸酯、或更多甘油三酸酯/克碳源。该方法适用于除葡萄糖以外的碳源，即例如果糖、甘油和木糖等来源，以及包含葡萄糖的碳源例如蔗糖，包括甘蔗、甜菜汁和纤维素衍生的碳源。
实例3.耐盐无绿藻属株的进化和在粗甘蔗糖浆上的评估
在高浓度钾的培养基中，通过连续分批发酵高产油株桑椹形无绿藻株S1133和S1331，获得了两种都具有耐盐性和高甘油三酸酯生产率的进化突变株(株S2939和S2941)。该进化过程涉及在补充有650mM KCl的种子培养基中培养亲本株。选择钾浓度以将亲本株的最大比生长速率降低约70％，并将其作为选择压力。通过连续传代培养将细胞生长维持在对数期持续70代。在进化过程结束时，将混合培养群体涂板，以分离单个菌落，然后将这些单个菌落在摇瓶中进行筛选以鉴定在对照培养基和补充有300mM KCl的培养基两者中显示高甘油三酸酯滴度和产率的突变体。
发现株S2939(衍生自株S1133)和S2941(衍生自株S1331)是我们烧瓶评估中表现最好的，并用试剂级蔗糖或粗甘蔗糖浆作为碳供应在7-L规模下进行测试。该甘蔗糖浆的可发酵糖含量、钾浓度和钠浓度分别为58％(w/w)、190mM和25mM。进行了用蔗糖代谢株S1868(根据实例11将该株进行工程化以表达蔗糖转化酶)的对照运行用于表现比较。
如图3所示，用粗甘蔗糖浆培养的株S2939和S2941的甘油三酸酯的生产与用试剂级蔗糖培养的株S1868的相当，并且远优于用甘蔗糖浆培养的株S1868。尽管在用粗甘蔗糖浆进行的发酵中积累了＞160mM K，但由S2939和S2941生产的总甘油三酸酯是在用试剂级蔗糖进行的对照发酵中由株S1868生产的总甘油三酸酯的90％-110％。在甘蔗糖浆上由株S2939和S2941生产的总甘油三酸酯分别比在相同原料上由株E生产的总甘油三酸酯分别高70％和40％。鉴于发酵培养基中＞50mM K的积累可以显著降低株S1868生产甘油三酸酯的能力，这些结果清楚地表明了株S2939和S2941的稳健性。
实例4：在可替代的氧化酶抑制剂的存在下选择突变体
使用SHAM作为桑椹形无绿藻产率改进的选择压力。实例2的高产油株S1920通过N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)加紫外线(UV)辐射诱变处理以产生异质细胞群体。然后将细胞涂布在包含生长培养基和具有8mM或10mM的最终SHAM浓度的琼脂平板上。来自诱变处理的群体的细胞在包含SHAM的平板上显示比来自未经诱变处理的群体的细胞(作为对照)更高的存活率。此外，来自诱变处理的群体的一些菌落在包含SHAM的平板上比来自对照群体的菌落生长到大得多的尺寸。最初选择这些较大的菌落(总共96个)用于分批培养中的评估，以确定它们的甘油三酸酯滴度和葡萄糖向甘油三酸酯的转化产率。显示与亲本株相比更高的甘油三酸酯滴度以及转化产率的5个分离物在摇瓶中进行进一步测试，以证实它们的表现改进。在这些突变体中，当与其亲本株S1920相比时，株S3150持续表现出产率增加。
为了评估株S3150在高细胞密度条件下的表现，使用优化的补料分批工艺、用蔗糖作为碳供应，在7-L发酵罐中评估株S3150。也进行了用其亲本株S1920的复制对照用于表现比较。株S3150的表现优于其亲本株S1920，并且株S3150与株S1920相比实现了糖/甘油三酸酯产率约7％的增加。此外，由株S3150生产的脂质的总量与对其亲本株S1920观察到的脂质的总量相当。这些结果表明，使用SHAM作为用于筛选的选择压力是用于分离具有改进的产量的突变体的有效方法。
实例5：将原壳小球藻基因工程化以表达外源蔗糖转化酶
株和培养基：原壳小球藻(UTEX 250)获得自德克萨斯大学(University ofTexas)(美国得克萨斯州奥斯汀(Austin，TX，USA))的藻类培养物保藏中心(CultureCollection of Alga)。储备培养物保持在改性的朊培养基中。改性的朊培养基由0.25gNaNO3、0.09g K2HPO4、0.175g KH2PO4、0.025g、0.025g CaCl2·2H2O、0.075gMgSO4·7H2O和2g酵母提取物/升(g/L)组成。
质粒构建：为了表达原壳小球藻中分泌形式的转化酶，将酿酒酵母SUC2基因放置在以下三种不同启动子的控制下：花椰菜花叶病毒35S启动子(CMV)、小球藻病毒启动子(NC-1A)、以及小球藻HUP1启动子。合成酵母SUC2基因以适应针对原壳小球藻优化的密码子使用，并且该酵母SUC2基因包括引导转化酶胞外分泌所要求的信号序列。在pBluescriptKS+中形成每种构建体，并且通过使用特异性引物进行PCR扩增来将EcoRI/AscI、AscI/XhoI、以及XhoI/BamHI位点分别导入每个启动子、转化酶基因以及CMV 3’UTR中。顺序地克隆纯化的PCR产物。
原壳小球藻的转化：将原壳小球藻培养物在75μmol光子m-2 s-1连续光下在回转振荡器上的改性的朊培养基中生长，直到其达到6x 106个细胞/ml的细胞密度。
对于生物射弹转化，根据制造商的方案制备来自Seashell技术的S550d金载体。简言之，将通过BsaI线性化的构建体(20μg)与50μl结合缓冲液和60μl(3mg)S550d金载体混合并且在冰中孵育1min。添加沉淀缓冲液(100μl)，并且将混合物在冰中再孵育1min。中度涡旋混合后，通过在Eppendorf离心管中以10,000rpm旋转10秒来沉淀DNA包覆的粒子。将金沉淀物用500μl冷的100％乙醇洗涤一次，通过在离心管中短暂离心沉淀，并且用50μl冰冷的乙醇重悬。在短暂(1-2秒)超声波处理后，将10μl DNA包覆的粒子立即转移至载体膜。收获细胞，将其用无菌蒸馏水洗涤一次，重悬于50μl培养基中(1x 107个细胞)，并且涂布在三分之一的非选择性朊培养基平板的中心。用PDS-1000/He生物射弹粒子递送系统(伯乐公司(Bio-Rad))轰击细胞。使用可裂圆片(1100和1350psi)，并且将平板置于筛选/巨载体组件下方9-12cm。允许细胞在25℃恢复12-24h。回收时，将细胞用橡胶刮刀从平板上刮下，与100μl培养基混合并且涂布在具有1％蔗糖的改性的朊平板上。在黑暗中在25℃下孵育7-10天后，在平板上可见代表转化细胞的菌落。
对于通过电穿孔进行转化，收获细胞，将其用无菌蒸馏水洗涤一次，并且重悬于含有50mM蔗糖的Tris-磷酸盐缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.0；1mM磷酸钾)至4x 108个细胞/ml的密度。将约250μL细胞悬浮液(1x 108个细胞)放置在4mm间隙的一次性电穿孔比色皿中。向细胞悬浮液添加5μg的线性化质粒DNA和200μg载体DNA(已剪切鲑精DNA)。然后将电穿孔比色皿在16℃冰水浴中孵育10min。然后使用Gene Pulser II(伯乐实验室(Bio-RadLabs)，加利福尼亚州赫拉克勒斯)电穿孔仪，以25μF容量(未使用分流电阻用于电穿孔)向比色皿施加电脉冲(1100V/cm)。将比色皿在室温下孵育5分钟，之后将细胞悬浮液转移至50ml改性的朊培养基中，并且在回转振荡器上震荡2天。回收后，低速(4000rpm)收获细胞，将其重悬于改性的朊培养基中，并且以低密度涂板在具有1％蔗糖的改性的朊平板上。在黑暗中在25℃下孵育7-10天后，在平板上可见代表转化细胞的菌落。
筛查转化体和基因分型：从具有1％蔗糖的黑暗生长的改性的朊平板中挑出菌落，并且将大约相同量的细胞转移至含有1ml的具有1％蔗糖的改性的朊液体培养基的24孔平板中。将培养物保持在黑暗中并且通过来自Labnet(英国伯克郡(Berkshire，UK))的定轨振荡器以430rpm搅拌5天。
为了验证在小球藻转化体中引入的转化酶基因的存在，将每个转化体的DNA分离并且用如下的一组基因特异性引物进行扩增：CMV构建体：正向引物(CAACCACGTCTTCAAAGCAA)(SEQ ID NO：1)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：2)，CV构建体：正向引物(TTGTCGGAATGTCATATCAA)(SEQ ID NO：3)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：2)171)和HUP1构建体：正向引物(AACGCCTTTGTACAACTGCA)SEQ ID NO：4)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：2)171)。为了快速进行DNA分离，将一定体积的细胞(尺寸大约为5-10μL)重悬浮于50μl的10mM Na-EDTA中。将细胞悬浮液在100℃下孵育10min并进行超声处理10秒。以12000g离心1min后，用3uL上清液进行PCR反应。在DNA热循环仪(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)GeneAmp 9600)中进行PCR扩增。根据制造商的说明书，反应混合物(50uL)包含3uL提取的DNA、如上所述各自的引物各有100pmol、200uM dNTP、0.5个单位的Taq DNA聚合酶(NEB)和Taq DNA聚合酶缓冲液。在95℃下进行DNA的变性持续5min(第一个循环)，然后持续30秒。分别在58℃进行30秒的引物退火并且在72℃下进行1min的延伸反应。然后将PCR产物在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上可视化。
液体培养物中的生长：在黑暗中生长5天后，基因型-阳性转化体显示在黑暗中在基本液体朊培养基+1％蔗糖上的生长，而野生型细胞显示在黑暗中在相同培养基中不生长。
实例6：用衍生自酿酒酵母的分泌的转化酶转化藻株
分泌的转化酶：编码分泌的蔗糖转化酶的基因(来自酿酒酵母的基因库登录号NP_012104)被重新合成为1599bp Asc I-Xho片段，该片段随后被亚克隆到pUC19衍生物(具有花椰菜花叶病毒35s启动子和3’UTR(分别作为EcoR I/Asc I和Xho/Sac I盒))。
藻类细胞的生长：这些实验中使用的培养基是液体基本培养基(2g/L酵母提取物、2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mM K2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.43mM NaCl)和固体基本培养基(+1.5％琼脂糖)(包含1％终浓度的蔗糖或葡萄糖(如所指定)形式的固定碳)。在不存在另外的固定碳源的情况下，本实验中使用的株在基本培养基中在黑暗中不生长。物种在平板上被挑出(strick out)，并在28℃下在黑暗中生长。挑取单个菌落、并且用于接种包含1％葡萄糖的500mL液体基本培养基并允许该单个菌落在黑暗中生长至对数中期，每天测量细胞计数。先前对以下株中的每一种测试了在蔗糖作为唯一碳源下在黑暗中的生长并且表现为没有生长，因此选择其用于分泌的转化酶的转化：(1)原壳小球藻(UTEX 31)；(2)极微小球藻(Chlorella minutissima)(UTEX2341)；和(3)浮水小球藻(Chlorella emersonii)(CCAP 211/15)。
经由通过粒子轰击转化藻类细胞：将足够的培养基离心，得到约1-5x 108个总细胞。所得的沉淀物用没有添加固定碳源的基本培养基进行洗涤。将细胞再次离心，并将沉淀物重悬浮于足以得到5x 107至2x 108个细胞/ml的体积的培养基中。然后将250-1000μl的细胞涂板在补充有1％蔗糖的固体基本培养基上，并允许在无菌罩中在平板上干燥。根据制造商的建议(贝壳科技公司(Seashell Technology)，加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla，CA))，将质粒DNA沉淀在金颗粒上。使用伯乐公司(BioRad)PDS He-1000粒子递送系统进行转化，该系统使用1350psi的可裂圆片和设置距可裂圆片固定器9cm的巨载体组件。转化后，将平板在28℃下在黑暗中进行孵育。所有株产生多个转化体菌落。不适用转化酶插入物转化但以相同方式制备的对照平板不包含菌落。
原壳小球藻转化体的分析：从原壳小球藻野生型细胞和转化体菌落如下提取基因组DNA：将细胞重悬浮于100μl提取缓冲液(87.5mM Tris Cl(pH 8.0)、50mM NaCl、5mM EDTA(pH 8.0)、0.25％SDS)，并在60℃下并且经由翻转偶尔混合下孵育30分钟。对于PCR，在20mMTris Cl(pH8.0)中以1:100稀释样品。
对从WT、转化体和质粒DNA提取的基因组DNA进行基因分型。针对标记基因对样品进行基因分型。在该基因分型的PCR中使用引物2383(5’CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC3’)(SEQ ID NO：5)和2279(5’CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3’)(SEQ ID NO：6)。使用的PCR谱如下：94℃下变性持续5min；35个循环的94℃-30秒、60℃-30秒、72℃-3min；72℃-5min。从阳性对照(质粒)和原壳小球藻(UTEX31)的两个转化体扩增相同大小的条带。
极微小球藻和浮水小球藻转化体的分析：从小球藻WT和转化体如下提取基因组DNA：将细胞重悬浮于100μl提取缓冲液(87.5mM Tris Cl(pH8.0)、50mM NaCl、5mM EDTA(pH8.0)、0.25％SDS)，并在60℃下并且经由翻转偶尔混合下孵育30分钟。对于PCR，在20mMTris-Cl(pH 8.0)中以1:100稀释样品。对从WT、转化体和质粒DNA提取的基因组DNA进行基因分型。针对标记基因对样品进行基因分型。将引物2336(5’GTGGCCATATGGACTTACAA 3’)(SEQ ID NO：7)和2279(5’CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3’)(SEQ ID NO：6)指定为引物组2(1215bp预期产物)，而将引物2465(5’CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG3’)(SEQ ID NO：8)和2470(5’CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG3’)(SEQ ID NO：9)指定为引物组4(1442bp预期产物)。使用的PCR谱如下：94℃下变性持续2min；29个循环的94℃-30秒、60℃-30秒、72℃-1min 30sec；72℃.5min。使用包含分泌的转化酶的质粒对照作为PCR对照。
转化酶构建体的序列对应于SEQ ID NO：10。
实例7：无绿藻物种中的同源重组
转基因的同源重组有几个优点。首先，引入没有同源重组的转基因可以是不可预测的，因为不能控制引入细胞中的质粒的拷贝数。而且，引入没有同源重组的转基因可以是不稳定的，因为质粒可以保持为游离基因并且在随后的细胞分裂中丢失。同源重组的另一个优点是能够“敲除”基因靶标、引入表位标签、切换内源基因的启动子，并以其他方式改变基因靶标(例如引入点突变)。
使用指定为KE858的桑椹形无绿藻(UTEX 1435)基因组的特定区域构建两个载体。KE858是一个1.3kb的基因组片段，它包含蛋白质的编码区的一部分，其中所述蛋白质与转移RNA(tRNA)蛋白质家族共享同源性。DNA印迹已经显示KE858序列在桑椹形无绿藻(UTEX1435)基因组中以单拷贝存在。构建第一类型的载体(被指定为SZ725(SEQ ID NO：11))由整个1.3kb KE858片段组成，该片段被克隆到还包含密码子优化的酵母转化酶(suc2)基因)的pUC19载体骨架中。该KE858片段包含一个独特的SnaB1位点，该位点不会发生在靶向构建体中的任何其他位置。构建第二类型的载体(指定为SZ726(SEQ ID NO：12))，由KE858序列组成，该KE858序列通过在KE858基因组序列中的SnaB1位点处插入酵母转化酶基因(suc2)而被破坏。包含KE858序列(酵母转化酶基因侧翼)的整个DNA片段可以通过用EcoRI消化从载体骨架中切割，其中EcoRI在KE858区域的任一端进行切割。
将两种载体都用于将酵母转化酶基因(suc2)的同源重组引导到桑椹形无绿藻(UTEX 1435)基因组的相应KE858区域。通过用SnaB1消化载体构建体SZ725和用EcoRI消化载体构建体SZ726来暴露与被靶向用于同源重组的基因组区域同源的线性DNA末端。然后使用上述方法将消化的载体构建体引入桑椹形无绿藻培养基。然后使用蔗糖平板来选择来自每个载体构建体的转化体。对来自每个载体转化的十个独立的、遗传上纯的转化体分析酵母转化酶基因在所希望的基因组位置的成功重组(使用DNA印迹)以及转基因稳定性。
SZ725转化体的DNA印迹分析显示，挑选用于分析的10个转化体中有4个包含预期的重组条带，表明载体上的KE858序列与基因组中的KE858序列之间发生了单交换事件。相比之下，所有十个SZ726转化体均包含预期的重组条带，表明在酵母转化酶转基因侧翼携带KE858序列的pSZ726的EcoRI片段与基因组的相应KE858区域之间发生了双交换事件。
通过在不存在选择的情况下使转化体生长超过15代来评估蔗糖转化酶表达和转基因稳定性。选择通过DNA印迹对转基因为阳性的四个SZ725转化体和十个SZ276转化体，并且使来自每个转化体的48个单一克隆进行连续生长：首先在包含葡萄糖的培养基中不进行选择地生长，然后在包含蔗糖作为唯一碳源的培养基中进行选择地生长。所有十个SZ276转化体(100％)保留了它们在15代后在蔗糖上生长的能力，然而约97％的SZ725转化体保留了它们在15代后在蔗糖上生长的能力。通过双交换事件引入的转基因(SZ726载体)在代数倍增中具有极高的稳定性。相比之下，通过单交换事件引入的转基因(SZ725载体)可以导致代数倍增的一些不稳定性，因为如果引入转基因的串联拷贝，在转基因侧翼的重复同源区域可以重组并切割位于它们之间的转基因DNA。
这些实验证明成功使用同源重组以产生包含被稳定整合到生物体的核染色体中的异源蔗糖转化酶基因的无绿藻转化体。同源重组的成功使得无绿藻中的其他基因组改变，包括基因缺失、点突变和标记所希望的基因产物的表位。
使用同源重组以敲除内源性桑椹形无绿藻基因；在桑椹形无绿藻cDNA/基因组筛选中，鉴定出内源性硬脂酰ACP去饱和酶(SAPD)cDNA。硬脂酰ACP去饱和酶是脂质合成途径的部分，并且它们发挥作用以将双键引入脂酰基链中。在一些情况下，为了改变脂肪酸谱，敲除或减少脂质途径酶的表达可能是有利的。产生同源重组构建体以评估是否可以减少(或敲除)内源性硬脂酰ACP去饱和酶的表达，并且在宿主细胞的脂质谱中是否可以观察到不饱和脂肪酸的相应减少。鉴定并克隆了来自桑椹形无绿藻(UTEX1435)的硬脂酰ACP去饱和酶基因的约1.5kb编码序列(SEQ ID NO：13)。使用5’端(5’靶位点)处的0.5kb的SAPD编码序列来构建同源重组构建体，随后是驱动密码子优化的酵母蔗糖转化酶suc2基因(具有普通小球藻(Chlorella vulgaris)3’UTR)的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)β-微管蛋白启动子。然后在普通小球藻3’UTR后插入剩余(约1kb)的桑椹形无绿藻SAPD编码序列以构成3’靶位点。该同源重组盒的序列列于SEQ ID NO：14。如上所示，通过在转化微藻之前将盒线性化，留下暴露的末端，可以增加同源重组盒整合到核基因组中的成功率。将靶向桑椹形无绿藻中的内源SAPD酶的同源重组盒线性化，然后转化到宿主细胞(桑椹形无绿藻，UTEX1435)中。成功的整合将经由双相互重组事件从宿主基因组中消除内源SAPD酶编码区，而新插入的suc2基因的表达将被莱茵衣藻(C.reinhardtii)β-微管蛋白启动子调控。可以使用包含蔗糖作为唯一碳源的平板/培养基筛选所得的克隆。包含成功整合同源重组盒的克隆将具有在蔗糖作为唯一碳源上生长的能力，并且脂质谱中脂肪酸的总体饱和度的变化将作为二次确认因子。另外，使用针对酵母蔗糖转化酶suc2基因特异的探针的DNA印迹测定和RT-PCR也可以证实转化酶基因在阳性克隆中的存在和表达。作为替代方案，可以使用没有β-微管蛋白启动子的相同构建体来切割内源SAPD酶编码区。在这种情况下，新插入的酵母蔗糖转化酶suc2基因将被内源SAPD启动子/5’UTR调控。
实例8：无绿藻属中各种硫酯酶的表达
先前已经在PCT申请号PCT/US 2009/66142中描述了在无绿藻属物种中表达异源硫酯酶基因的方法和作用，将该专利通过引用以相关部分特此结合。进一步研究了来自高等植物物种的其他硫酯酶基因/基因产物的作用。这些硫酯酶包括来自以下高等植物的硫酯酶：
基因库
在所有情况下，使用生物射弹粒子轰击将以上硫酯酶构建体中的每一个转化到Prototheca moriformis(UTEX 1435)中。其他转化方法，包括如在PCT申请号PCT/US 2009/66142中所描述的同源重组，也适合用于感兴趣的基因的异源表达。用以上硫酯酶构建体中的每一个进行桑椹形无绿藻的(UTEX 1435)转化。每一个构建体包含NeoR基因并且使用100μg/ml G418进行阳性克隆选择。所有编码区经密码子优化以反映在桑椹形无绿藻UTEX1435核基因中固有的密码子偏好。在序列同一性列表中列出了所使用的构建体的氨基酸序列和cDNA序列两者。用来自桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：33)或来自原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶(SEQ ID NO：34)的藻类密码子优化的转运肽替代每一种高等植物硫酯酶的转运肽。所有硫酯酶构建体是由莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR驱动的。将所选择的阳性克隆的生长和脂质生产与野生型(未转化的)桑椹形无绿藻(UTEX1435)进行比较。使野生型与所选择的阳性克隆在2％葡萄糖的G418平板上生长。对于每一构建体的所选择的阳性克隆的脂质谱分析总结在以下表1中(以面积％表示)。
表1.表达各种异源硫酯酶的桑椹形无绿藻的脂质谱。
这些结果显示所有表达的硫酯酶都在一定水平上影响脂肪酸谱。参看“总饱和物”行，饱和度受这些硫酯酶中的几种的表达的深刻影响，包括来自加州月桂、樟树的那些，并且最显著地来自美洲榆的那些。在总饱和物百分比方面的这些变化是意料之外的，因为来自高等植物的硫酯酶的异源表达可以明显影响不只是脂质链长；它还可以影响由微藻产生的脂质谱的其他属性，即脂肪酸的饱和度。
用湿地萼距花C8硫酯酶、细叶萼距花硫酯酶、加州月桂和樟树硫酯酶转化的选定克隆进一步在变化量的G418(从25mg/L至50mg/L)中以及在变化的温度(从22℃至25℃)下生长并且测定这些克隆的脂质谱。表2总结了含有各硫酯酶的代表性克隆的脂质谱(表示为面积％)。构建了含有美洲榆硫酯酶的一个第二构建体并且使用以上描述的生物射弹方法将其转化到桑椹形无绿藻(UTEX 1435)中。将这个第二构建体经由同源重组引入细胞中。在无绿藻物种中的同源重组的方法先前描述于PCT申请号PCT/US2009/66142中。使用的同源DNA是来自桑椹形无绿藻UTEX 1435的“6S”的基因组DNA序列。选择剂是使用由莱茵衣藻β微管蛋白启动子驱动的、来自酿酒酵母的密码子优化的suc2基因在蔗糖上生长的能力。用原壳小球藻(UTEX 250)硬脂酰ACP去饱和酶转运肽替代天然美洲榆转运肽。这种构建体的cDNA在序列表中以SEQ ID NO：35列出。在2％蔗糖平板上进行阳性克隆选择并且使产生的用于脂质谱测定的培养物也在含有2％蔗糖的培养基上生长。含有同源重组的异源美洲榆硫酯酶的这个桑椹形无绿藻株的代表性脂质谱总结于表2中。
表2.含有异源硫酯酶基因的桑椹形无绿藻株的脂质谱。
正如以上描述的克隆，与野生型(未转化)桑椹形无绿藻相比，所有含有异源硫酯酶基因的转化体显示出在一定水平上受影响的脂肪酸谱，并且饱和脂肪酸的总百分比也被改变。包含通过同源重组引入的美洲榆硫酯酶的桑椹形无绿藻的总饱和物具有最大增加。
另外，针对新颖的脂质谱评价了包含外源细叶萼距花、樟树、加州月桂或美洲榆硫酯酶的转基因克隆。当在22℃下在2％葡萄糖、25mg/ml G418中生长时，含有细叶萼距花硫酯酶的克隆实现了以下脂质谱：5.10％C8:0、18.28％C10:0、0.41％C12:0、1.76％C14:0、16.31％C16:0、1.40％C18:0、40.49％C18:1、以及13.16％C18:2。当在25℃下在2％蔗糖中生长时，含有樟树硫酯酶的克隆(还含有外源蔗糖转化酶)实现了以下脂质谱：0.04％C10:0、6.01％C12:0、35.98％C14:0、19.42C16:0、1.48％C18:0、25.44％C18:1、以及9.34％C18:2。当在22℃下在2％葡萄糖、25-100mg/ml G418中生长时，含有加州月桂硫酯酶的克隆实现了以下脂质谱：0％C8:0、0.11％C10:0、34.01％C12:0、5.75％C14:0、14.02％C16:0、1.10％C18:0、28.93％C18:1、以及13.01％C18:2。当在28℃下在2％葡萄糖中生长时，含有美洲榆硫酯酶的克隆实现了以下脂质谱：1.54％C10:0、0.43％C12:0、7.56％C14:0、39.45％C16:0、2.49％C18:0、38.49％C18:1、以及7.88％C18:2。
实例9：用多个外源异源硫酯酶基因转化无绿藻属
使用以上披露的方法转化微藻株桑椹形无绿藻(UTEX 1435)以便在单个克隆中表达多种硫酯酶。在单个克隆中表达多种硫酯酶允许微藻产生具有多种脂肪酸谱的油，这些脂肪酸谱与单独表达任何单一硫酯酶时产生的那些完全不同(如在前述实例中所展示的)。首先利用同源重组用樟树硫酯酶(一种C14偏好型硫酯酶)连同蔗糖转化酶基因、来自酿酒酵母的suc2(选择是在蔗糖上生长的能力)转化桑椹形无绿藻(UTEX 1435)。用于这种同源重组构建体的DNA来自桑椹形无绿藻基因组DNA的KE858区域，如在以上第III节所描述的。这种构建体的相关部分在序列表中以SEQ ID NO：36列出。在含有蔗糖的平板上筛选阳性克隆。然后用三个盒中之一对阳性克隆进行再转化，这三个盒中的每一个编码对抗生素G418有抗性以及一种另外的硫酯酶：(1)来自细叶萼距花的硫酯酶基因(C8-10偏好型)，SEQ IDNO：37；(2)来自加州月桂的硫酯酶基因(C12偏好型)，SEQ ID NO：38；或来自美洲榆的硫酯酶基因(广谱；C10-C16偏好型)，SEQ ID NO：39。包括在序列表中的是每一构建体的相关部分的序列。在含有蔗糖的、具有50μg/ml G418的培养基上筛选表达两种硫酯酶基因的克隆。选择阳性克隆并且对生长与脂质谱进行测定。表3汇总了代表性阳性克隆的脂质谱(以面积％表示)。
表3.用多种硫酯酶转化的桑椹形无绿藻的脂质谱。
另外，在22℃下使具有樟树与加州月桂硫酯酶的双硫酯酶克隆在含有2％蔗糖、具有50mg/L G418的培养基中生长。在这些生长条件下从这个株获得的脂肪酸谱是：C8:0(0)、C10:0(0.10)、C12:0(31.03)、C14:0(7.47)、C16:0(15.20)、C18:0(0.90)、C18:1(30.60)、C18:2(12.44)、以及C18:3α(1.38)，具有54.7的总饱和物。
产生了具有两个含有樟树硫酯酶的同源重组构建体(一个靶向6S区域并且另一个靶向KE858区域)的双硫酯酶克隆。代表性阳性克隆具有以下脂肪酸谱：0％C8:0、0.06％C10:0、5.91％C12:0、43.27％C14:0、19.63％C16:0、0.87％C18:0、13.96％C18:1、以及13.78％C18:2，具有69.74％的总饱和物。这个克隆具有超过49％的C12-C14水平，超过野生型细胞中C12-C14水平的37倍。
以上数据显示多种硫酯酶可以成功地在微藻中共表达。多种硫酯酶的共表达导致改变的脂肪酸谱，这些脂肪酸谱不仅与野生型株显著不同，而且与通过表达这些单独的硫酯酶的任何一种而获得的脂肪酸谱也显著不同。具有重叠的链长特异性的多种硫酯酶的表达可以导致那些特异性脂肪酸的累积增加。
在桑椹形无绿藻中表达异源硫酯酶(单独地或组合地)不仅改变宿主株中的脂肪酸/脂质谱，而且当与目前从各种种子作物可获得的油相比时，这些谱是未发现于其他目前可获得的系统中的真正独特的油的谱。这些转基因株不仅显示出与未转化的野生型株的显著差异，而且它们具有与许多商业油显著不同的谱。作为实例，椰子油和棕榈仁油都具有范围从5.5％-17％的C8-C10脂肪酸水平。表达湿地萼距花C8偏好型硫酯酶或细叶萼距花C10偏好型硫酯酶的转基因株在任何地方分别积累从3.66％至8.65％。这些C8-C10脂肪酸水平类似于椰子油和棕榈仁，然而这些转基因藻株缺乏显著更高的C12:0脂肪酸，并且它们具有极高的C16:0(在转基因株中为23％，而在椰子油或棕榈仁油中分别为11％-16％)和/或18:1(在转基因株中为50％-57％，而在椰子油或棕榈仁油中分别为8％-19％)。
实例10：改变微藻桑椹形无绿藻中饱和脂肪酸的水平
作为使用基于生物信息学的方法基于cDNA的基因组筛选法(来自桑椹形无绿藻(UTEX 1435))的基因组DNA的Illumia转录组和Roche 454测序))的部分，鉴定到参与脂肪酸去饱和的两组特定基因：硬脂酰ACP去饱和酶(SAD)和Δ12脂肪酸去饱和酶(Δ12FAD)。硬脂酰基ACP去饱和酶酶是脂质合成途径的部分，并且它们发挥作用以将双键引入脂酰基链中，例如，从C18:0脂肪酸合成C18:1脂肪酸。Δ12脂肪酸去饱和酶也是脂质合成途径的部分，并且它们发挥作用以将双键引入已经不饱和的脂肪酸中，例如，从C18:1脂肪酸合成C18:2脂肪酸。使用基于在生物信息学工作期间已鉴定的两类脂肪酸去饱和酶基因的探针，DNA印迹分析表明每一类去饱和酶基因可能由多个家族成员组成。另外，编码硬脂酰ACP去饱和酶的基因落入两个不同的家族。基于这些结果，设计了三个基因破坏构建体以通过靶向每个去饱和酶酶家族内的更高度保守的编码区潜在地破坏多个基因家族成员。
三个同源重组靶向构建体使用以下来设计：(1)Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)家族成员的编码序列的高度保守部分和(2)靶向两个不同SAD家族的每个成员的两个构建体，每个构建体具有来自每个家族的编码序列保守区域。这种策略将选择标记基因(赋予水解蔗糖的能力的来自酿酒酵母的suc2蔗糖转化酶盒)嵌入这些高度保守的编码区(靶向多个家族成员)内，而不是经典的基因替换策略，其中同源重组将靶向该靶向基因的侧翼区。
通过生物射弹转化，使用上文描述的方法，将全部构建体引入细胞中，并且构建体在射入细胞之前被线性化。在含有蔗糖的平板/培养基上选择转化子，并且使用上述方法测定脂质谱的变化。下文列出来自3个打靶构建体中每一个构建体的相关序列。
挑出来自用每种构建体转化的代表性阳性克隆，然后确定这些克隆的脂质谱(以面积％表示)并且将其汇总在以下表4中。
表4.去饱和酶敲除的脂质谱。
每种构建体对所希望类别的脂肪酸产生可度量的影响，并且在所有3种情况下，C18:0水平明显增加，尤其随着两个SAD敲除的情况下。进一步比较来自SAD敲除的多个克隆表明，SAD2B敲除系在C18:1脂肪酸方面比随SAD2A敲除系所观察到的C18:1脂肪酸水平具有明显更大的减少。
使用上文描述的方法在桑椹形无绿藻背景中产生另外的Δ12脂肪酸去饱和酶(FAD)敲除。为了鉴定Δ12FAD的潜在同源物，使用了以下引物，以便扩增编码假定FAD的基因组区域：
引物1 5’-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3’ SEQ ID NO：49
引物2 5’-GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3’ SEQ ID NO：50
从使用以上引物的桑椹形无绿藻基因组DNA的基因组扩增产生的序列是高度相似的，但是表明多个基因或Δ12FAD等位基因存在于无绿藻属中。
基于这种结果，设计了两个基因破坏构建体以寻求失活一个或多个Δ12FAD基因。该策略会将蔗糖转化酶(来自酿酒酵母的suc2)盒(因此赋予水解蔗糖能力作为选择标记)嵌入高度保守的编码区中，而不是使用经典的基因替换策略。第一构建体，称作pSZ1124，含有在驱动酿酒酵母suc2基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸还原酶3’UTR(酿酒酵母suc2盒)侧翼的5’和3’基因组靶向序列。第二构建体，称作pSZ1125，含有在驱动酿酒酵母suc2基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸还原酶3’UTR侧翼的5’和3’基因组靶向序列。序列表中列出构建体的相关序列：
将pSZ1124和pSZ1125分别引入桑椹形无绿藻背景，并且基于水解蔗糖的能力选择阳性克隆。表5汇总了在使用pSZ1124和pSZ1125靶向载体的两个转基因系中所获得的脂质谱(以面积％表示，使用上文描述的方法产生)。
表5.Δ12FAD敲除的脂质谱
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3α
亲本 0.01 0.03 1.15 26.13 1.32 4.39 57.20 8.13 0.61
FAD2B 0.02 0.03 0.80 12.84 1.92 0.86 74.74 7.08 0.33
FAD2C 0.02 0.04 1.42 25.85 1.65 2.44 66.11 1.39 0.22
含有FAD2B(pSZ1124)的转基因构建体在脂质谱方面产生十分有趣和出乎意料的结果，在于预期下降的C18:2水平仅下降大约一个面积％。然而，C18:1脂肪酸水平显著地增加，几乎完全以显著下降的C16:0水平为代价。含有FAD2C(pSZ1125)的转基因构建体也产生脂质谱变化：C18:2的水平显著降低，同时C18:1水平相应增加。
牛脂模拟
将从如以上所述的SAD2B敲除实验产生的一个阳性克隆选择为用作进一步引入C14偏好型脂肪酰基-ACP硫酯酶基因的背景。引入樟树C14偏好型硫酯酶的构建体包含针对6S基因组区域的靶向序列(允许转化DNA经由同源重组进行靶向整合)并且该表达构建体包含驱动neoR基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸还原酶3’UTR，随后是驱动密码子优化的樟树硫酯酶表达的第二莱茵衣藻β-微管蛋白启动予和原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽和第二普通小球藻硝酸还原酶3’UTR。该5’6S基因组供体序列以SEQ ID NO：56列出；该3’6S基因组供体序列以SEQ ID NO：57列出，并且该樟树硫酯酶的相关表达构建体以SEQ ID NO：58列出。
使用上述的生物射弹方法进行转化并且允许这些细胞在含有2％蔗糖的平板上恢复24小时。在此时间之后，将这些细胞再悬浮并且重新涂板在含有2％蔗糖和50μg/ml G418的用于选择的平板上。从所产生的阳性克隆中选出九个克隆用于脂质生产和脂质谱分析。将这九个转基因克隆(具有SAD2B KO并且表达樟树C14偏好型硫酯酶)如上所述进行培养并且针对脂质谱进行分析。将结果总结在下表6中。动物脂的脂质谱也包括在下表6中(国家研究委员会1976：动物产品的脂肪含量和组成(National Research Council 1976：FatContent and Composition of Animal Product))。
表6.硫酯酶转化的克隆的脂质谱。
如在表6中所见，这些转基因系的脂质谱与动物脂的脂质谱十分类似。从总体上看，这些数据证明了将特定转基因背景(在这种情况下是SAD2B敲除)与C14偏好型硫酯酶(来自樟树)结合来产生转基因藻株的效用，该转基因藻株生产类似于动物脂的脂质谱的油。
用于通过靶向敲除方法下调β-酮脂酰合酶II(KASII)的表达的构建体
将通过靶向敲除方法下调KASII基因表达的载体引入UTEX 1435的经典诱变处理的衍生物(S1331)中。使用酿酒酵母转化酶基因作为选择标记，从而赋予在蔗糖上生长的能力。将在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子的控制下的转化酶表达盒插入315bp长的KASII基因组区域的中间以允许靶向整合(pSZ1503)。
pSZ1503中的相关限制性位点(以小写字母、粗体和下划线指示)分别是5’-3’BspQ1、KpnI、AscI、Xho I、Sac I、BspQI。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’端。粗体、小写字母序列代表允许经由同源重组在KASII基因座处靶向整合的来自S1331的基因组DNA。沿5’到3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动酵母蔗糖转化酶基因(赋予S1331代谢蔗糖的能力)的表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写字母、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。普通小球藻硝酸还原酶3’UTR由小写字母加下划线文本指示。
包含在pSZ1503_[KASII_btub-y.inv-nr_KASII]中的转化DNA的核苷酸序列：
分别在SEQ ID NO：66和68中鉴定KAS II等位基因1和等位基因2的cDNA。分别在SEQ ID NO：67和69中鉴定等位基因1和2的氨基酸序列。
为了确定KASII灭活对脂质组成的影响，将pSZ1503载体DNA转化到S1331中以产生靶向的KASII敲除表型。将初始单个克隆分离并使其在pH 5.0下在标准脂质产生条件下生长。最佳代表性克隆和野生型细胞的所得的谱如下表7所示。
表7.在S1331和用pSZ1503DNA转化的衍生转基因系中的脂肪酸谱。
样品ID C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3α
1331-5 0.01 0.03 0.96 24.28 0.64 3.94 62.69 6.21 0.49
D698-2 0.01 0.01 0.83 38.36 1.38 2.21 48.31 7.60 0.55
实例11.适应高盐后的微藻的基因工程化
使用上述技术将桑椹形无绿藻株S2939鉴定为耐盐突变体。为了赋予在蔗糖上生长的能力，根据在本文实例7以及共同拥有的申请WO 2010/063031、WO 2010/063032、WO2011/150411、WO 2012/106560、WO 2013/158938、PCT/US 2014/059161(所有这些申请通过引用结合在此)中所述的方法，通过在两个基因组整合位点中的一个上进行重组用来自酿酒酵母的蔗糖转化酶转化该株。在使用蔗糖作为唯一碳源的10mL培养基中测试了21个转化体的油生产。获得了包括S1868在内的多个转化体，这些转化体当以蔗糖作为碳源进行培养时，产生由亲本株产生的油的90％或更多，这需要添加蔗糖转化酶用于在蔗糖上进行繁殖和油生产。
实例12：7-L发酵罐中耐盐株在甘蔗糖浆中的表现
通过对高产油的株(桑椹形无绿藻株S1920)的诱变处理的群体在含有高浓度钾的培养基中进行连续分批发酵，获得了具有高油生产率的两个突变的耐盐突变株，株S3303和株S3304。该进化过程涉及在补充有600-650mM KCl的种子培养基中培养诱变处理的细胞。选择这种钾浓度以将亲本株S1920的最大比生长速率降低大约70％。将细胞在50-mL的生物反应器管中的10mL种子培养基中生长，并通过连续传代培养将这些细胞的生长维持在对数期持续约70代。在进化过程结束时，将混合培养群体涂板以分离单个菌落，然后在摇瓶中筛选单个菌落以鉴定在具有或不具有300mM KCl补充的培养基中显示高油滴度和产率的突变体。
株S3303和株S3304是烧瓶中表现最好的两种，然后使用60％(w/w)试剂级蔗糖和粗甘蔗糖浆作为碳源，以7-L规模用高细胞密度方法对其进行测试。该甘蔗糖浆的甘蔗含量、钾浓度和传导率分别为60％(w/w)、214mM钾和42mS/cm。进行了用亲本株的对照运行用于表现比较。向发酵中添加转化酶以催化蔗糖转化为用于其消耗的葡萄糖和果糖。
如图4和图5所示，株S3303和S3304在甘蔗糖浆上的表现优于株S1920。尽管在甘蔗糖浆的发酵中有＞170mM K的积累(图4)，由株S3303和S3304生产的油的总量与那些在试剂级蔗糖的发酵中观察到的相当(图5)。在使用相同甘蔗原料的运行中，这些也分别比由株S1920生产的油的总量高10％和20％。另外，从图5可以看出，由株S3304在甘蔗糖浆上生产的油的总量与由株S1331在试剂级蔗糖上生产的油的总量相当。由酵母株S3303和S3304在甘蔗糖浆和试剂级蔗糖两者上实现的g油/g可发酵糖的峰值产量高于亲本株S1920(图6)。此外，株S3303和S3304保持了其高产率，直到运行结束，而株S1920的产率在发酵90h后急剧下降。这些结果证明了在用粗甘蔗糖浆的高细胞密度发酵中耐盐株的稳健性。
实例13：在2-脱氧葡萄糖的存在下选择突变体以增加油滴度
增加油生产、使在碳上的油产率最大化和调节所生产的油的脂肪酸谱的能力对于用异养产油微藻(桑椹形无绿藻)开发具有成本效益的商业制造方法至关重要。这个实例描述了与亲本株相比，2-脱氧葡萄糖(2-DG)作为选择试剂用于鉴定具有增加的油滴度的突变体的用途。2-DG是葡萄糖的类似物和单糖转运蛋白抑制剂。
为了利用用于鉴定具有增加的油滴度的桑椹形无绿藻突变体的2-DG的用途，通过仅使用N-甲基-N乙硝基-N-亚硝基胍(NTG)、仅使用甲磺酸乙酯(EMS)、或使用EMS加紫外线(UV)辐射来诱变处理高产油株(亲本株S2949、S2952、S3150、S3331和S3332)，以产生如上所讨论的异质突变体群体。亲本株S2949、S2952、S3150、S3331和S3332全部都具有相似的脂质滴度。然后将从亲本株获得的诱变处理的细胞汇集，在含有10g/L果糖与6-20g/L 2-Dg的种子培养基中或在含有10g/L葡萄糖与30-50g/L 2-DG的种子培养基中培养5-7天。然后将在果糖培养基中生长的细胞涂布到含有20g/L果糖和12-20g/L 2-DG的TSA(胰胨豆胨琼脂)平板上，同时将葡萄糖培养基中生长的细胞涂布到含有20g/L葡萄糖和50g/L 2-DG的TSA平板上。根据实例2制备亲本株S2949、S2952、S3150、S3331和S3332。
选择在补充有果糖或葡萄糖的TSA平板上生长的2-DG抗性分离物用于在50mL生物反应器管中进行评估。在该初级筛选中，将突变体在含有葡萄糖和果糖两者作为碳源的生产培养基中进行培养。在所测试的192个分离物中，其中5个显示的油滴度比亲本株S3150的油滴度高约10％(表8-9)。这些突变体中的两个源自于补充有果糖的液体培养基，而另外三个突变体源自于补充有葡萄糖的液体培养基。在二次筛选中证实了它们与亲本株相比油滴度的改进(表10)。将用于该二次筛选的生产培养基在50-mL生物反应器管中生长5天，并向其供应葡萄糖作为唯一碳源。
表8.从补充有果糖和2-DG的固体培养基中分离的最佳2-DG抗性突变体的表现。
表9.从补充有葡萄糖和2-DG的固体培养基中分离的最佳2-DG抗性突变体的表现。
表10.在二次筛选中的最佳2-DG抗性突变体的表现
实例14：在浅蓝菌素或三氯生的存在下选择突变体以增加C18:0或C18:1脂肪酸的水平
这个实例描述了使用浅蓝菌素和三氯生作为选择试剂用于鉴定与亲本株相比具有增加水平的C18:0或C18:1脂肪酸的突变体。
浅蓝菌素是KASI和KASII的抑制剂，而三氯生是脂肪酸生物合成途径中烯酰基：ACP还原酶的抑制剂。对这些抑制剂具有抗性的微生物株可能在其基因组中具有突变，使得这些微生物株能够过表达KASI、KASII或烯酰基：ACP还原酶。这些微生物株还可以表达比野生型的那些株更具活性的这些酶的突变形式。因此，这些抗性株可以具有增加脂肪酸生物合成的能力。
为了鉴定具有改进的油滴度的桑椹形无绿藻的新株，通过NTG、EMS或EMS+UV诱变处理了最重要基础株(株S22949、S2952、S3150、S3331和S3332)，并针对浅蓝菌素或三氯生抗性进行选择。然后将诱变处理的细胞汇集并涂布到含有15-35μM浅蓝菌素和/或4μM三氯生的TSA平板上。然后将抗性分离物在50mL生物反应器管中培养5天，并供应葡萄糖作为碳源，然后进行油滴度和谱测定。没有一个分离物显示的油滴度高于亲本株的油滴度。然而，对浅蓝菌素有抗性的分离物中的两种(株S5100和株S5226)生产的油比亲本生产的油具有显著更高的C18：1水平和显著更低的C16：0水平(表11)。
表11.与亲本株S3150相比两种对浅蓝菌素有抗性的突变体的表现显示C18:1水平增加和C16：0水平降低。
为了证实株S5100产生具有C18:1水平增加的油的能力，在使用补料分批工艺和70％(w/w)蔗糖作为碳源的7-L发酵罐中进一步评估株S5100的表现。添加外源转化酶用于蔗糖水解。如表12所示，由株S5100实现的最终产率和总油生产与亲本株S3150实现的相当。然而，株S5100的C18:1水平显著高于株S3150的C18:1水平。发酵结束时，其达到了生产的脂肪酸总量的75％。此外，这种C18:1水平的升高伴随着C16：0水平的下降。这些结果全部与在初级筛选中管培养观察到的结果一致。
表12.在高细胞密度发酵中，对浅蓝菌素有抗性的突变体株S5100及其亲本株S3150的表现。
*归一化为初始发酵量。
除了我们操作最重要的基础株之外，我们通过单独的NTG或通过EMS+UV对转基因株S3168还进行了诱变处理，并选择了对浅蓝菌素或三氯生有抗性的分离物。株S3168是FATA(在β微管蛋白启动子的控制下表达转化酶的硫酯酶敲除)，并且还具有在amt03启动子(在pH7下具有活性但在pH5下没有)控制下的赖特氏萼距花(Cuphea wrightii)FATB。在共同拥有的申请WO 2012/061647(通过引用结合在此)中披露了质粒pSZ1925：FatA1_Btub:inv:nr::amt03-CwTE2:nr_FatA1和工程化以表达pSZ1925的重组微藻。当在低pH下培养时，这种株是能够生产高达77％的C18:1水平的油的高油酸株。在诱变处理程序后，将这些细胞涂布到含有12μM浅蓝菌素或4μM三氯生的TSA平板上。然后将所得的抗性分离物在50mL的生物反应器管中培养以进行评估。从这个初级筛选中，发现对三氯生有抗性的突变体中的一个(株S5692)与株S3168相比表现出升高的C18:1水平，并且其表现随后在使用补料分批工艺和70％(w/w)蔗糖作为碳源的7-L发酵罐中进行评估。添加外源转化酶用于另外的蔗糖水解。如表13所示，由株S5692实现的最终产率和总油生产与亲本株S3168观察到的非常相似。然而，株T的C18:1水平显著更高，在发酵结束时达到84％-85％。同时，C16:0水平仅占生产的脂肪酸总量的6％-7％。
表13.对浅蓝菌素有抗性的突变体株S5692及其亲本株S3168在索拉兹米(Solazyme)的高细胞密度发酵中的表现。
*归一化为初始发酵量。
由于C18:0的形成是在脂肪酸生物合成途径中C16:0转化为C18:1的中间步骤，所以也可以使用浅蓝菌素和三氯生作为鉴定C18：0水平增加的的桑椹形无绿藻突变体的选择试剂。因此，已经被基因工程化以生产具有C18:0水平升高(在38％-44％范围内)的油的三种不同转基因株(株S4424、株S4440和株S4442)被单独的NTG或EMS+UV诱变处理。株S4424(6SA::Cr(bTub)-syn(yInv)-Cv(nr):Pm(hxt_14757G)-Pm(SAD2hpC)-Cv(nr)::6SB)、株S4440(THI4a5’::Cr(bTub)-syn(yInv)-Cv(nr)::Cr(bTub)-Pm(SAD2hpD)-Cv(nr)::THI4a3)和株S4442(DAO1b5’::Cr(bTub)-syn(yINV)-Cv(nr)::Cr(bTub)-Pm(SAD2hpD)-Cv(nr)::DAO1b3’)全部都表达SAD2发夹RNAi构建体和转化酶，但在不同的整合位点表达。诱变处理后，将所得的细胞涂布到含有15-35μM浅蓝菌素或4μM三氯生的TSA平板上。对这些抑制剂中的任一种有抗性的分离物在50-mL生物反应器管中培养以进行油滴度和谱测定。如表14-17所示，与其亲本株-株S4424、S4440或S4442相比，许多对浅蓝菌素或三氯生有抗性的分离物的C18:0水平显著增加。尽管这些分离物中的大多数的油滴度没有任何改进，但这些分离物中的三种(JV33-1、JV33-104和JV33-125)的油滴度表现出比其亲本株S4424、S4440或S4442的高≥10％。这些结果与上述结果一起清楚地指示，2-DG、浅蓝菌素和三氯生是用于分离桑椹形无绿藻的突变体的有效的选择试剂，该桑椹形无绿藻的突变体具有改进的油滴度和/或能够生产长链脂肪酸(例如C18:0和C18:1)水平增加的油。
表14.与亲本株S4424相比显示C18:0水平增加和C16:0水平降低的对浅蓝菌素有抗性的突变体的表现。将生产培养基在50-mL生物反应器管中生长5天，并供应葡萄糖作为唯一碳源。
表15.与亲本株S4424相比显示C18:0水平增加和C16:0水平降低的对三氯生有抗性的突变体的表现。将生产培养基在50-mL生物反应器管中生长5天，并供应葡萄糖作为唯一碳源。
表16.与亲本株S4440相比显示C18:0水平增加和C16:0水平降低的对浅蓝菌素有抗性的突变体的表现。将生产培养基在50-mL生物反应器管中生长5天，并供应葡萄糖作为唯一碳源。
表17.与亲本株S4442相比显示C18:0水平增加和C16:0水平降低的对浅蓝菌素有抗性的突变体的表现。将生产培养基在50-mL生物反应器管中生长5天，并供应葡萄糖作为唯一碳源。
实例15：在对浅蓝菌素有抗性的桑椹形无绿藻中下调FATA1和过表达酮基-酰基-ACP合酶II(PmKASII)以获得不饱和脂肪酸升高的油
将破坏FATA1等位基因的单拷贝同时过表达桑椹形无绿藻KASII基因的构建体引入高油酸基础株(株S5100)中，该株通过经典的诱变处理和在15微摩尔浅蓝菌素上选择而获得。所得的株之一(S5587)在多次发酵过程中生产85％C18:1(油酸)且总饱和物为约93％。相比于不在浅蓝菌素上选择的相似的株，株S5587的脂质谱和生产率均有显著改善。
酿酒酵母转化酶基因(登录号：NP 012104)被用作选择标记物，以便使用生物射弹转化方法通过同源重组将PmKASII引入桑椹形无绿藻株S5100的FATA1基因座中。为了研究当被不同启动子驱动时的KASII活性，将PmKASII与启动子(例如PmUAPA1、PmLDH1和PmAMT3)融合。注意，将全部整合构建体都设计为与FATA1基因的方向相反，因为发现由具有正向取向的构建体产生的大多数转化体在蔗糖转化酶表达中是不稳定的。因此，已经在株S5100中表达的构建体可以写为：
1)FATA1 3’::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmUAPA1:PmKASII-CvNR::FATA1 5’(pSZ2533)
2)FATA1 3’::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmLDH1:PmKASII-CvNR::FATA1 5’(pSZ2532)
3)FATA1 3’::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmAMT3:PmKASII-CvNR::FATA1 5’(pSZ2750)
参考表18，构建体pSZ2533FATA13’::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmUAPA1:PmKASII-CvNR::FATA1 5’中的相关限制性位点以小写字母、粗体并加下划线指示并且分别为5’-3’BspQ 1、Kpn I、Asc I、Mfe I、EcoRV、SpeI、AscI、ClaI、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’端。粗体、小写字母序列代表允许经由同源重组在FATA1基因座处靶向整合的FATA1 3’基因组DNA。沿5’至3’方向继续向前，驱动酵母蔗糖转化酶基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动予以加框文本指示。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写字母、粗斜体指示，同时编码区以小写字母斜体指示。普通小球藻硝酸还原酶3’UTR由小写字母加下划线文本指示，后接由加框斜体文本指示的桑椹型无绿藻UAPA1启动子。PmKASII的起始子ATG和终止子TGA密码子由大写字母、粗斜体指示，同时该编码区的其余部分以粗斜体指示。原壳小球藻S106硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽位于起始子ATG与Asc I位点之间。普通小球藻硝酸还原酶3’UTR同样由小写字母加下划线文本指示，后接由粗体小写字母文本指示的FATA15’基因组区域。
表18.pSZ2533中包含的转化DNA的核苷酸序列。
除构建体pSZ2533之外，研究了当KASII基因由其他启动子(包括PmLDH1和PmAMT3)驱动时的PmKASII活性。质粒pSZ2532可以写为FATA1 3’::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmLDH1:PmKASII-CvNR::FATA1 5’，而质粒pSZ2750可以写为FATA1 3’::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmAMT3:PmKASII-CvNR::FATA1 5’。由于这两个质粒的序列除了驱动PmKASII的启动子之外与pSZ2533是相同的，表19和20仅显示了PmLDH1和PmAMT3启动子的序列。
表19.驱动PmKASII在pSZ2532中的表达的PmLDH1启动子的核苷酸序列。
表20.驱动PmKASII在pSZ2750中的表达的PmAMT3启动子的核苷酸序列。
结果
将初级转化体以克隆方式纯化，并且取决于驱动PmKASII基因的表达的启动子(AMT3是pH敏感的并且在pH 5下被抑制)，使其在pH 5.0或pH 7.0下在标准脂质产生条件下生长。由于启动子的性质以及桑椹形无绿藻在pH 5.0下生产更多脂质的事实，在pH 5.0下的脂质生产培养基中测定通过用pSZ2533(D1636*)和pSZ2532(D1637*)转化得到的转基因系。在pH7.0下，对由pSZ2750(D1684*)转化产生的转基因系进行测定，以便当由pH调控的PmAMT3启动子驱动时允许最大PmKASII基因表达。由用D1636(pSZ2533)、D1637(pSZ2532)和D1684(pSZ2750)转化产生的代表性克隆得到的谱分别显示于表21、21和23中。
FATA1敲除和同时过表达桑椹形无绿藻KASII基因的影响使得C16:0链长度明显减小并且C18:1显著增加。在pH 5.0下，看起来PmUAPA1强于PmLDH1，因为D1636中的棕榈酸酯水平接近于3％，而D1637中的转化体在相同条件下都不低于7％。与野生型株(例如约54％)相比，油酸(18∶1)升高(例如，高于70％或75％)。
表21.通过用D1636(pSZ2533)DNA转化产生的代表性克隆的脂质谱。
样品ID C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
pH 5；S5100；T523；D1636-3 0.53 3.31 6.15 79.89 7.19
pH 5；S5100；T523；D1636-4 0.48 3.54 5.34 80.78 6.92
pH 5；S5100；T523；D1636-5 0.48 3.59 5.41 81.37 6.55
pH 5；S5100；T523；D1636-12 0.61 3.59 3.67 80.52 8.93
pH 5；S5100；T523；D1636-13 0.55 3.80 4.88 81.83 6.61
pH 5；S5100；T523；D1636-21 0.54 4.18 2.82 82.26 8.17
pH 5；SS100 0.89 17.28 2.69 70.53 6.86
表22.通过用D1637(pSZ2532)DNA转化产生的代表性克隆的脂质谱。
表23.通过用D1684(pSZ2750)DNA转化产生的代表性克隆的脂质谱。
样品ID C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
pH 7；S5100；T532；D1684-14 0.55 5.04 4.90 78.88 8.19
pH 7；S5100；T532；D1684-23 0.58 5.80 4.98 77.51 8.69
pH 7；S5100；T532；D1684-1 0.59 6.37 4.99 77.47 8.03
pH 7；S5100；T532；D1684-24 0.55 6.37 4.83 77.98 7.73
pH 7；S5100；T532；D1684-11 0.61 6.61 4.88 76.14 8.96
pH 7；S5100；T532；D1684-16 0.57 6.61 5.01 77.74 7.83
pH 7；S5100 0.84 20.12 3.52 66.86 6.77
实例16：在桑椹形无绿藻中下调/敲除THI4a并过表达CpalFATB1或CpalFATB2
将破坏THI4a等位基因的单拷贝同时过表达湿地萼距花FATB1或FATB2基因的构建体引入桑椹形无绿藻中。
对于质粒pSZ4440和pSZ4442，酿酒酵母转化酶基因(登录号：NP012104)被用作选择标记，以便使用生物射弹转化方法通过同源重组将CpalFATB2引入桑椹形无绿藻的THI4a基因座中。已经在株S5100中表达的构建体可以写为：
(pSZ4440)：THI4a5’::CrTUB2_ScSUC2_PmPGH::AMT1-1p_CpSAD1tp-CpalFATB2_ExtB_Flag_PmEF1::THI4a3’
(pSZ4442)：THI4a5’::CrTUB2_ScSUC2_PmPGH::PmSAD2-2ver2_CpSAD1tp-CpalFATB2_ExtB_Flag_PmAHCY::THI4a3’
(pSZ4424)：THI4a::CrTUB2-NeoR-PmPGH:PmSAD2-2Ver3-CpSAD1tp_Cpa1FATB1ExtC_M230G_FLAG-CvNR::THI4a
对于pSZ4440和pSZ4442，沿5’至3’方向继续向前，用于靶向的THI4a5’-区域位于选择表达盒之前，该选择表达盒包含驱动酵母蔗糖转化酶基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子，随后是桑椹形无绿藻PGH 3’-UTR。AMT1-1p(pSZ4440)或PmSAD2-2ver2(pSZ4442)启动子驱动融合到湿地萼距花CpalFATB2_ExtB的原壳小球藻S106硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽的表达。Flag标签在用于靶向的桑椹形无绿藻EF1或桑椹形无绿藻AHCY3’UTR和THI4a3’-区域之前。
对于pSZ4424，沿5’至3’方向继续向前，用于靶向的THI4a5’-区域位于选择表达盒之前，该选择表达盒包含驱动新霉素抗性基因表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子，随后是桑椹形无绿藻PGH 3’-UTR。PmSAD2-2ver3启动子驱动原壳小球藻S106硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽的表达，该原壳小球藻S106硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽被融合到湿地萼距花CpalFATB2_ExtC、并在位置230处进行Met至Gly的取代。Flag标签在用于靶向的CvNR3’UTR和THI4a3’-区域之前。
应当理解的是，本文描述的实例和实施例仅是出于说明性目的，并且根据它们进行的不同修改或变更将启发本领域技术人员并且将被包含在本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请都出于所有目的以其全文特此结合。
非正式序列表
SEQ ID NO：1
CAACCACGTCTTCAAAGCAA
SEQ ID NO：2
TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA
SEQ ID NO：3
TTGTCGGAATGTCATATCAA
SEQ ID NO：4
AACGCCTTTGTACAACTGCA
SEQ ID NO：5
CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC
SEQ ID NO：6
CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG
SEQ ID NO：7
GTGGCCATATGGACTTACAA
SEQ ID NO：8
CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG
SEQ ID NO：9
CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG
SEQ ID NO：10
酿酒酵母蔗糖转化酶NP_012104
GAATTCCCCAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTGGCGCGCCATATCAATGCTTCTTCAGGCCTTTCTTTTTCTTCTTGCTGGTTTTGCTGCCAAGATCAGCGCCTCTATGACGAACGAAACCTCGGATAGACCACTTGTGCACTTTACACCAAACAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACGAAAAAGATGCCAAGTGGCATCTGTACTTTCAATACAACCCGAACGATACTGTCTGGGGGACGCCATTGTTTTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAATTGGGAGGACCAACCAATAGCTATCGCTCCGAAGAGGAACGACTCCGGAGCATTCTCGGGTTCCATGGTGGTTGACTACAACAATACTTCCGGCTTTTTCAACGATACCATTGACCCGAGACAACGCTGCGTGGCCATATGGACTTACAACACACCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCGTATAGCCTGGACGGTGGATACACTTTTACAGAGTATCAGAAGAACCCTGTGCTTGCTGCAAATTCGACTCAGTTCCGAGATCCGAAGGTCTTTTGGTACGAGCCCTCGCAGAAGTGGATCATGACAGCGGCAAAGTCACAGGACTACAAGATCGAAATTTACTCGTCTGACGACCTTAAATCCTGGAAGCTCGAATCCGCGTTCGCAAACGAGGGCTTTCTCGGCTACCAATACGAATGCCCAGGCCTGATAGAGGTCCCAACAGAGCAAGATCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTTATTTCCATTAATCCAGGAGCACCGGCAGGAGGTTCTTTTAATCAGTACTTCGTCGGAAGCTTTAACGGAACTCATTTCGAGGCATTTGATAACCAATCAAGAGTAGTTGATTTTGGAAAGGACTACTATGCCCTGCAGACTTTCTTCAATACTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGCATTGCGTGGGCTTCTAACTGGGAGTATTCCGCATTCGTTCCTACAAACCCTTGGAGGTCCTCCATGTCGCTCGTGAGGAAATTCTCTCTCAACACTGAGTACCAGGCCAACCCGGAAACCGAACTCATAAACCTGAAAGCCGAACCGATCCTGAACATTAGCAACGCTGGCCCCTGGAGCCGGTTTGCAACCAACACCACGTTGACGAAAGCCAACAGCTACAACGTCGATCTTTCGAATAGCACCGGTACACTTGAATTTGAACTGGTGTATGCCGTCAATACCACCCAAACGATCTCGAAGTCGGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTTAAAGGCCTGGAAGACCCCGAGGAGTACCTCAGAATGGGTTTCGAGGTTTCTGCGTCCTCCTTCTTCCTTGATCGCGGGAACAGCAAAGTAAAATTTGTTAAGGAGAACCCATATTTTACCAACAGGATGAGCGTTAACAACCAACCATTCAAGAGCGAAAACGACCTGTCGTACTACAAAGTGTATGGTTTGCTTGATCAAAATATCCTGGAACTCTACTTCAACGATGGTGATGTCGTGTCCACCAACACATACTTCATGACAACCGGGAACGCACTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGTGTGGATAACCTGTTCTACATCGACAAATTCCAGGTGAGGGAAGTCAAGTGAGATCTGTCGATCGACAAGCTCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAATTAA
SEQ ID NO：11
KE858同源重组构建体SZ725
GCCCTTTGTCATCGTTGGCATGCTTTTTGCGTATGTACCATATGTTGAATGTATAATACGAACGGTTGACCGTCTGAGATGCGAGCTTTGGGTCTTGTCAAATGCGTGGCCGCACGGCTCCCTCGCACCCAGCCCCGAGGCGTCGCGCACCTGGCGAGGAGCAGACCCACGCCAAGAAAGTCTAGTCCAGCATGTAACAACATCAGGCAATGTGACGTTTTCGGTTCCCGATTTCTCTGCCGCTCTTTGACGGCAGGCACGGGCGAGCAACCGGCGGCGCTCGCGTCAGGCACGATGGATGCGGCGCTGCCCACCTGTCAATGTACCCCACCAGTCTGTCGATCGCTACAAGCAACCTTGTGCTCCACATTCCCACTTGCAGACAGTCTAGTCGATTTTGCCAAGCTGGATGTGAGGATTGGCCATATCTTGGAGGCCAAGATTCACCCGGATGCTGATGGGTACGTACGCGAGCCAGGCAGGCAGCTGCGTTGACTTTCTGATTGGCACAAAGCTTTGGCTACTCTCAATACCAACCACGTGCCCCTTCTGCACACCTGCTTCCTTCTGATGACCACTCGCCACGCATGTCGCAGTCTGTACGTCGAGCAGATCGACCTCGGCGAGGAGGGGGGCCCTCGCACCATCGTGAGTGGCCTGGTCCGGCACGTGACCCTGGAGGACCTTGTCGGCCGGCGGGTGGTGGTGCTGGCCAACCTCAAGCCTCGGAGCATGCGCGGGGTCAAATCGGCTGGGATGCTGCTCTGCGCCGCCAACGCGGATCACACCGCGGTGGAGCCGCTGCGGGTCCCGGACGCCGCCGTGACGGGGGAGCGGGTCTGGGCGGGGGACGAGGCACTCCTGTCCACGGAGCCTGCCACACCCAATCAGGTAAGGACACGTTATTGGTGCGCATGGTGCGAATGCGTGGTCTGACCTGCTGTGGGTATGTGTTGTGGGATTGGAAACCGAATGAGGGCCGTTCAGGATTGAGCCCTTGGCCCCACCCTGCTCATCCTCTCACGCCCGCAGGTCCAGAAGAAGAAAATCTGGGAGGCAGTACAGCCGCTGCTGAGAGTGAACGCCCAGGGGATCGCTACTGTGGCAGGAGAGGCTATGGTGACCAGTGCGGGGCCACTGACCGCGCCCACGCTGGTTGACGCCGCGATTTCCTGACGCGAGCGACTGATTCTTGACCTTTGAGAAGCCACCACAGCACCATTTTCATTGTTCATCCTTGATTTCAGTACGACTTCTCACCATTTCAGTACTGTAGGACCCCCAAAATAGTGTGATCACGCTCGCAAGGCACCTGTGTGATCACGGGGAAGGGCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID NO：12
同源重组构建体SZ726
CCCGTGATCACACAGGTGCCTTGCGAGCGTGATCACACTATTTTGGGGGTCCTACAGTACTGAAATGGTGAGAAGTCGTACTGAAATCAAGGATGAACAATGAAAATGGTGCTGTGGTGGCTTCTCAAAGGTCAAGAATCAGTCGCTCGCGTCAGGAAATCGCGGCGTCAACCAGCGTGGGCGCGGTCAGTGGCCCCGCACTGGTCACCATAGCCTCTCCTGCCACAGTAGCGATCCCCTGGGCGTTCACTCTCAGCAGCGGCTGTACTGCCTCCCAGATTTTCTTCTTCTGGACCTGCGGGCGTGAGAGGATGAGCAGGGTGGGGCCAAGGGCTCAATCCTGAACGGCCCTCATTCGGTTTCCAATCCCACAACACATACCCACAGCAGGTCAGACCACGCATTCGCACCATGCGCACCAAATAACGTGTCCTTACCTGATTGGGTGTGGCAGGCTCCGTGGACAGGAGTGCCTCGTCCCCCGCCCAGACCCGCTCCCCCGTCACGGCGGCGTCCGGGACCCGCAGCGGCTCCACCGCGGTGTGATCCGCGTTGGCGGCGCAGAGCAGCATCCCAGCCGATTTGACCCCGCGCATGCTCCGAGGCTTGAGGTTGGCCAGCACCACCACCCGCCGGCCGACAAGGTCCTCCAGGGTCACGTGCCGGACCAGGCCACTCACGATGGTGCGAGGGCCCCCCTCCTCGCCGAGGTCGATCTGCTCGACGTACAGACTGCGACATGCGTGGCGAGTGGTCATCAGAAGGAAGCAGGTGTGCAGAAGGGGCACGTGGTTGGTATTGAGAGTAGCCAAAGCTTTGTGCCAATCAGAAAGTCAACGCAGCTGCCTGCCTGGCTCGCGTACAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTCGGTACCCGTACCCATCAGCATCCGGGTGAATCTTGGCCTCCAAGATATGGCCAATCCTCACATCCAGCTTGGCAAAATCGACTAGACTGTCTGCAAGTGGGAATGTGGAGCACAAGGTTGCTTGTAGCGATCGACAGACTGGTGGGGTACATTGACAGGTGGGCAGCGCCGCATCCATCGTGCCTGACGCGAGCGCCGCCGGTTGCTCGCCCGTGCCTGCCGTCAAAGAGCGGCAGAGAAATCGGGAACCGAAAACGTCACATTGCCTGATGTTGTTACATGCTGGACTAGACTTTCTTGGCGTGGGTCTGCTCCTCGCCAGGTGCGCGACGCCTCGGGGCTGGGTGCGAGGGAGCCGTGCGGCCACGCATTTGACAAGACCCAAAGCTCGCATCTCAGACGGTCAACCGTTCGTATTATACATTCAACATATGGTACATACGCAAAAAGCATG
SEQ ID NO：13
同源重组：用于破坏桑椹形无绿藻硬脂酰ACP去饱和酶编码区(β-微管蛋白驱动的suc2盒)的靶向盒
TTTGGCCCCGCTTTCCAGCTCCGGATCTGCTGGCGTCCGCCGCGAGACGTGACATCGCACGTCGCCGGGAGCGCCAGCTTGATCACTTGGCAGGGGGCCGTGCTCTACAAATACCAGGCCCCGCGGCGGTCAGTTCGCACATCCAATACCTGCCGAGCCATCTTGCCTACACTTTTTATCGACTCCTCTACTCTGTTCGCGAGAGCGCTCGGTCCAGGCTTGGAATTCGCCGAATTCAGCTCGATCAGTCGCTTCTGCAACTGATCTCGGCCGTTCGCAGACTGCCTTTTCTCAGCTTGTCAGGTAGCGAGTTGTTGTTTTATATTTATTCGATTTCATCTGTGTTGCATGTCTTGTTCGTGCTGTGCGTTCTTTCTGGGCCGCGCTGTCGGGTCGCATGGGCTAGCTGTACTCATGTTAGTCATGCCGGTCCGACCTTGTTCGAGGAAGGCCCCACACTGAGCGTGCCCTCTTTCTACACCCCTTGTGCAGAAATTAGATAGAAAGCAGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGACCGACACGCCCCCGGCCCAGGTCCAGTTCTCCTGGGTCTTCCAGAGGCCCGTCGCCATGTAAAGTGGCAGAGATTGGCGCCTGATTCGATTTGGATCCAAGGATCTCCAATCGGTGATGGGGACTGAGTGCCCAACTACCACCCTTGCACTATCGTCCTCGCACTATTTATTCCCACCTTCTGCTCGCCCTGCCGGGCGATTGCGGGCGTTTCTGCCCTTGACGTATCAATTTCGCCCCTGCTGGCGCGAGGATTCTTCATTCTAATAAGAACTCACTCCCGCCAGCTCTGTACTTTTCCTGCGGGGCCCCTGCATGGCTTGTTCCCAATGCTTGCTCGATCGACGGCGCCCATTGCCCACGGCGCTGCCGCATCCATGTGAAGAAACACGGAAGAGTGCGAAGACTGGAAGTGAATTAAGAGTATAAGAAGAGGTACCAAGGGATTCTCAGGTGCTCTTAGGAACGGCTTTTCCTTCGCCAAGAGAAACTGCTACTGCTCGTGTCGCCACGGTGGTCAAGCCGCCCCATCTGCGATCCACCAGGCCCATCCGCGGACTCGCGATCAGCCTGCTGGATCCGGACTGCCGACCTGACCGCTCGCATCCACCATTACAACCCTCCAATTGGACACCACTCCCACGTCCTAAAGTTCACCATGCAAGCTGATCGATCGCATTCGCCGATGCACTCGCCTGCCACAGAGGTGTGCGCTTCGGACTAGCGTGCAGGCGCCCCGAGGCCACCAGCATGCACCGATGGAAGCGGGCACGGCCGCTGCTCCAGGTCGCTGGCTCGCTCAGACCCATAGCAACCTCCGCTGCGTCCCTAAATGTCACACAGAGCGTCTTTGATGGGTACGGATGGGAGAGAATCTGATTGGGCATTGCTGGTGCAGTGCAGGAAGATGGCAAGTGCACAGTCAGTCATGCTGTACAAACTGGTGCCTCGTAGTATTGACTCGTATAGTGCATAGTATCATGCATGGTCGTTACTTGCAA
SEQ ID NO：14
同源重组：用于破坏桑椹形无绿藻硬脂酰ACP去饱和酶编码区(单独的suc2盒)的靶向盒
TTTGGCCCCGCTTTCCAGCTCCGGATCTGCTGGCGTCCGCCGCGAGACGTGACATCGCACGTCGCCGGGAGCGCCAGCTTGATCACTTGGCAGGGGGCCGTGCTCTACAAATACCAGGCCCCGCGGCGGTCAGTTCGCACATCCAATACCTGCCGAGCCATCTTGCCTACACTTTTTATCGACTCCTCTACTCTGTTCGCGAGAGCGCTCGGTCCAGGCTTGGAATTCGCCGAATTCAGCTCGATCAGTCGCTTCTGCAACTGATCTCGGCCGTTCGCAGACTGCCTTTTCTCAGCTTGTCAGGTAGCGAGTTGTTGTTTTATATTTATTCGATTTCATCTGTGTTGCATGTCTTGTTCGTGCTGTGCGTTCTTTCTGGGCCGCGCTGTCGGGTCGCATGGGCTAGCTGTACTCATGTTAGTCATGCCGGTCCGACCTTGTTCGAGGAAGGCCCCACACTGAGCGTGCCCTCTTTCTACACCCCTTGTGCAGAAATTAGATAGAAAGCAATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACCGACACGCCCCCGGCCCAGGTCCAGTTCTCCTGGGTCTTCCAGAGGCCCGTCGCCATGTAAAGTGGCAGAGATTGGCGCCTGATTCGATTTGGATCCAAGGATCTCCAATCGGTGATGGGGACTGAGTGCCCAACTACCACCCTTGCACTATCGTCCTCGCACTATTTATTCCCACCTTCTGCTCGCCCTGCCGGGCGATTGCGGGCGTTTCTGCCCTTGACGTATCAATTTCGCCCCTGCTGGCGCGAGGATTCTTCATTCTAATAAGAACTCACTCCCGCCAGCTCTGTACTTTTCCTGCGGGGCCCCTGCATGGCTTGTTCCCAATGCTTGCTCGATCGACGGCGCCCATTGCCCACGGCGCTGCCGCATCCATGTGAAGAAACACGGAAGAGTGCGAAGACTGGAAGTGAATTAAGAGTATAAGAAGAGGTACCAAGGGATTCTCAGGTGCTCTTAGGAACGGCTTTTCCTTCGCCAAGAGAAACTGCTACTGCTCGTGTCGCCACGGTGGTCAAGCCGCCCCATCTGCGATCCACCAGGCCCATCCGCGGACTCGCGATCAGCCTGCTGGATCCGGACTGCCGACCTGACCGCTCGCATCCACCATTACAACCCTCCAATTGGACACCACTCCCACGTCCTAAAGTTCACCATGCAAGCTGATCGATCGCATTCGCCGATGCACTCGCCTGCCACAGAGGTGTGCGCTTCGGACTAGCGTGCAGGCGCCCCGAGGCCACCAGCATGCACCGATGGAAGCGGGCACGGCCGCTGCTCCAGGTCGCTGGCTCGCTCAGACCCATAGCAACCTCCGCTGCGTCCCTAAATGTCACACAGAGCGTCTTTGATGGGTACGGATGGGAGAGAATCTGATTGGGCATTGCTGGTGCAGTGCAGGAAGATGGCAAGTGCACAGTCAGTCATGCTGTACAAACTGGTGCCTCGTAGTATTGACTCGTATAGTGCATAGTATCATGCATGGTCGTTACTTGCAA
SEQ ID NO：15
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的樟树FATB1(基因库Q39473)氨基酸序列。
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAPDWSMLFAVITTIFSAAEKQWTNLEWKPKPNPPQLLDDHFGPHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSTSIVAVMNHLQEAALNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLIWVVKRTHVAVERYPAWGDTVEVECWVGASGNNGRRHDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVMMNTRTRRLSKIPEEVRGEIGPAFIDNVAVKDEEIKKPQKLNDSTADYIQGGLTPRWNDLDINQHVNNIKYVDWILETVPDSIFESHHISSFTIEYRRECTMDSVLQSLTTVSGGSSEAGLVCEHLLQLEGGSEVLRAKTEWRPKLTDSFRGISVIPAESSV
SEQ ID NO：16
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的樟树FATB1 cDNA的相关密码子优化的表达构建体。
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCTTGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAGGGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTCAGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCAGCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGTGCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGGGGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCAGGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCCTGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCAGGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCGAATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGGGACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAGCTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGGGAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACCCTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCATGCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTAGCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCGGCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGATGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCCCTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTACCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGATGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID NO：17
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的加州月桂FATB1(基因库Q41635)氨基酸序列。
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAPDWSMLFAVITTIFSAAEKQWTNLEWKPKPKLPQLLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSTSILAVMNHMQEATLNHAKSVGILGDGFGTTLEMSKRDLMWVVRRTHVAVERYPTWGDTVEVECWIGASGNNGMRRDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVLMNTRTRRLSTIPDEVRGEIGPAFIDNVAVKDDEIKKLQKLNDSTADYIQGGLTPRWNDLDVNQHVNNLKYVAWVFETVPDSIFESHHISSFTLEYRRECTRDSVLRSLTTVSGGSSEAGLVCDHLLQLEGGSEVLRARTEWRPKLTDSFRGISVIPAEPRV
SEQ ID NO：18
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的加州月桂FATB1 cDNA的相关密码子优化的表达构建体。
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCTTGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAGGGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTCAGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCAGCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGTGCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGGGGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCAGGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCCTGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCAGGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCGAATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGGGACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAGCTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGGGAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACCCTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCATGCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTAGCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCGGCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGATGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCCCTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCAGCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCAGCACCTCCATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACCACGCCAAGAGCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATGTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCACCATCCCCGACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACCTGAAGTACGTGGCCTGGGTGTTCGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGTCCCACCACATCAGCTCCTTCACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGCCCCGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGATGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID NO：19
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的细叶萼距花FATB2(基因库AAC49269)氨基酸序列。
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAQLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTLEMCKRDLIWVVIKMQIKVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIVNGATEWRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS
SEQ ID NO：20
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的细叶萼距花FATB2 cDNA的相关密码子优化的表述构建体。
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCTTGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAGGGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTCAGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCAGCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGTGCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGGGGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCAGGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCCTGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCAGGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCGAATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGGGACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAGCTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGGGAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACCCTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCATGCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTAGCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCGGCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGATGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCCCTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTGAAGGTGCACAAGTTCAAGGTGAAGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTGACCGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCCGTGTCCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID NO：21
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的湿地萼距花C8偏好型硫酯酶(基因库AAC49179)氨基酸序列。
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAPANGSAVTLKSGSLNTQEDTLSSSPPPRAFFNQLPDWSMLLTAITTVFVAPEKRWTMFDRKSKRPNMLMDSFGLERVVQDGLVFRQSFSIRSYEICADRTASIETVMNHVQETSLNQCKSIGLLDDGFGRSPEMCKRDLIWVVTRMKIMVNRYPTWGDTIEVSTWLSQSGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSVYAMMNQKTRRFSKLPHEVRQEFAPHFLDSPPAIEDNDGKLQKFDVKTGDSIRKGLTPGWYDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLTLEYRRECGRDSVLESVTSMDPSKVGDRFQYRHLLRLEDGADIMKGRTEWRPKNAGTNGAISTGKT
SEQ ID NO：22
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的湿地萼距花C8偏好型硫酯酶cDNA的相关密码子优化的表达构建体。
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCTTGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAGGGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTCAGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCAGCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGTGCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGGGGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCAGGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCCTGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCAGGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCGAATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGGGACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAGCTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGGGAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACCCTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCATGCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTAGCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCGGCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGATGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCCCTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGCGAACGGCAGCGCGGTGACCCTGAAGTCGGGCTCCCTGAACACCCAGGAGGACACGCTGAGCTCGTCCCCCCCCCCCCGCGCGTTCTTCAACCAGCTGCCCGACTGGAGCATGCTGCTGACCGCGATCACCACGGTCTTCGTGGCGCCCGAGAAGCGCTGGACCATGTTCGACCGCAAGTCGAAGCGCCCCAACATGCTGATGGACTCCTTCGGCCTGGAGCGCGTGGTCCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGAGCTTCTCGATCCGCTCCTACGAGATCTGCGCGGACCGCACCGCGAGCATCGAGACGGTGATGAACCACGTCCAGGAGACCTCGCTGAACCAGTGCAAGTCCATCGGCCTGCTGGACGACGGCTTCGGCCGCAGCCCCGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTCACCCGCATGAAGATCATGGTGAACCGCTACCCCACGTGGGGCGACACCATCGAGGTCTCGACGTGGCTGTCCCAGAGCGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCGGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCGACGTCCGTCTACGCGATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCTTCAGCAAGCTGCCCCACGAGGTGCGCCAGGAGTTCGCGCCCCACTTCCTGGACTCGCCCCCCGCGATCGAGGACAACGACGGCAAGCTGCAGAAGTTCGACGTCAAGACGGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGTACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAGCAACGTCAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCGATGCCCACCGAGGTCCTGGAGACGCAGGAGCTGTGCTCCCTGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCGGTGCTGGAGAGCGTCACCAGCATGGACCCCTCGAAGGTGGGCGACCGCTTCCAGTACCGCCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCGCGGACATCATGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCGGGCACGAACGGCGCGATCTCCACCGGCAAGACGTGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTC
SEQ ID NO：23
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的披针叶萼距花C10偏好型硫酯酶(基因库CAB60830)氨基酸序列。
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAPANGSAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLNQLPDWSMLLTAITTVFVAAEKQWTMLDRKSKRPDMLVDSVGLKSIVRDGLVSRQSFLIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPTWGDTVEINTWFSQSGKIGMASDWLISDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHFVDSPHVIEDNDQKLHKFDVKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTAVDPSENGGRSQYKHLLRLEDGTDIVKSRTEWRPKNAGTNGAISTSTAKTSNGNSASDDDDKLG
SEQ ID NO：24
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽的披针叶萼距花C10偏好型硫酯酶的相关密码子优化的编码区。
ACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGCGAACGGCAGCGCGGTGAACCTGAAGTCGGGCTCCCTGAACACCCAGGAGGACACGAGCTCGTCCCCCCCCCCCCGCGCGTTCCTGAACCAGCTGCCCGACTGGAGCATGCTGCTGACCGCGATCACCACCGTCTTCGTGGCGGCGGAGAAGCAGTGGACGATGCTGGACCGCAAGTCGAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACTCCGTCGGCCTGAAGAGCATCGTGCGCGACGGCCTGGTCTCGCGCCAGTCCTTCCTGATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCGGACCGCACCGCGTCGATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACGTCCATCAACCACTGCAAGAGCCTGGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGGCATGTGCAAGAACGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAGATGCAGATCATGGTCAACCGCTACCCCACGTGGGGCGACACCGTCGAGATCAACACGTGGTTCTCGCAGTCCGGCAAGATCGGCATGGCGAGCGACTGGCTGATCTCGGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCGACCTCCGTGTGGGCGATGATGAACCAGAAGACGCGCCGCTTCAGCCGCCTGCCCTACGAGGTCCGCCAGGAGCTGACCCCCCACTTCGTGGACTCGCCCCACGTCATCGAGGACAACGACCAGAAGCTGCACAAGTTCGACGTGAAGACCGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACGCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTCAACCAGCACGTGTCGAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCCATGCCCATCGAGGTCCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCGCTGACCGTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCATGGACTCCGTGCTGGAGTCGGTCACGGCGGTGGACCCCAGCGAGAACGGCGGCCGCAGCCAGTACAAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGACATCGTCAAGTCGCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCGGGCACGAACGGCGCGATCTCCACCAGCACCGCGAAGACGTCGAACGGCAACTCCGCGAGCGATGACGATGACAAGCTGGGATGACTCGAG
SEQ ID NO：25
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶叶绿体转运肽的德国鸢尾C14偏好型硫酯酶(基因库AAG43858.1)氨基酸序列。
MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRAAQAATRVNGSKVGLKTDTNKLEDAPFIPSSAPRTFYNQLPDWSVLLAAITTIFLAAEKQWTLIDWKRGGPDMLSDAFGLPKIIENGLLYRQKFSIRSYEIGADQTASIETLMNHLQETALNHVKCAGLLGNGFGSTPEMSKMNLIWVVTKMQVLVEHYPSWGDVIEVDTWAAASGKNGMRRDWHVRDWQTGQTIMRASSNWVMMNQNTRRLSKFPEEVRAEIEPYFMERAPVIDDDNRKLPKLDDDTADHVRNGLTPRWSDLDVNQHVKNVKYIGWILESAPISILESHELASMTLEYRRECGRDSVLQSLTSVSNNCTDGSEELPIECQHLLRNEGGSEIVKGRTEWRPKKCGPFGAGRP
SEQ ID NO：26
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的德国鸢尾C14偏好型硫酯酶的相关密码子优化的编码区。
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCGCCCAGGCGGCCACCCGCGTGAACGGCAGCAAGGTGGGCCTGAAGACCGACACCAACAAGCTGGAGGACGCGCCCTTCATCCCCTCGTCCGCCCCCCGCACCTTCTACAACCAGCTGCCCGACTGGAGCGTCCTGCTGGCGGCCATCACCACCATCTTCCTGGCGGCCGAGAAGCAGTGGACCCTGATCGACTGGAAGCGCGGCGGCCCCGACATGCTGTCGGACGCGTTCGGCCTGCCCAAGATCATCGAGAACGGCCTGCTGTACCGCCAGAAGTTCTCCATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCCGACCAGACCGCCTCGATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCGCGCTGAACCACGTCAAGTGCGCCGGCCTGCTGGGCAACGGCTTCGGCTCCACCCCCGAGATGAGCAAGATGAACCTGATCTGGGTGGTCACCAAGATGCAGGTGCTGGTCGAGCACTACCCCTCGTGGGGCGACGTGATCGAGGTGGACACCTGGGCGGCCGCGTCCGGCAAGAACGGCATGCGCCGCGACTGGCACGTCCGCGACTGGCAGACCGGCCAGACCATCATGCGCGCCAGCTCGAACTGGGTGATGATGAACCAGAACACCCGCCGCCTGTCCAAGTTCCCCGAGGAGGTCCGCGCCGAGATCGAGCCCTACTTCATGGAGCGCGCCCCCGTGATCGACGACGACAACCGCAAGCTGCCCAAGCTGGACGACGACACCGCGGACCACGTGCGCAACGGCCTGACCCCCCGCTGGAGCGACCTGGACGTGAACCAGCACGTCAAGAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCGGCCCCCATCTCCATCCTGGAGAGCCACGAGCTGGCCTCGATGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTCCTGCAGAGCCTGACCTCGGTGTCCAACAACTGCACCGACGGCAGCGAGGAGCTGCCCATCGAGTGCCAGCACCTGCTGCGCAACGAGGGCGGCTCGGAGATCGTCAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAAGTGCGGCCCCTTCGGCGCCGGCCGCCCCTGACTCGAG
SEQ ID NO：27
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶叶绿体转运肽的肉豆蔻脂酰基硫酯酶(基因库AAB717291.1)氨基酸序列。
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAANAHTVPKINGNKAGLLTPMESTKDEDIVAAPTVAPKRTFINQLPDWSMLLAAITTIFLAAEKQWTNLDWKPRRPDMLVDFDPFSLGRFVQDGLIFRQNFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETALNHVRCIGLLDDGFGSTPEMTRRDLIWVVTRMQVLVDRYPSWGDVIEVDSWVTPSGKNGMKREWFLRDCKTGEILTRATSVWVMMNKRTRRLSKIPEEVRVEIEPYFVEHGVLDEDSRKLPKLNDNTANYIRRGLAPRWSDLDVNQHVNNVKYIGWILESVPSSLLESHELYGMTLEYRKECGKDGLLQSLTAVASDYGGGSLEAGVECDHLLRLEDGSEIMRGKTEWRPKRAANTTYFGSVDDIPPANNA
SEQ ID NO：28
具有桑椹形无绿藻Δ12脂肪酸去饱和酶叶绿体转运肽的肉豆蔻脂酰基硫酯酶的相关密码子优化的编码区。
ACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCGCCAACGCCCACACCGTGCCCAAGATCAACGGCAACAAGGCCGGCCTGCTGACCCCCATGGAGAGCACCAAGGACGAGGACATCGTCGCGGCCCCCACCGTGGCGCCCAAGCGCACCTTCATCAACCAGCTGCCCGACTGGTCGATGCTGCTGGCCGCGATCACCACCATCTTCCTGGCGGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGACTGGAAGCCCCGCCGCCCCGACATGCTGGTCGACTTCGACCCCTTCTCCCTGGGCCGCTTCGTGCAGGACGGCCTGATCTTCCGCCAGAACTTCAGCATCCGCTCGTACGAGATCGGCGCGGACCGCACCGCCTCCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCGCGCTGAACCACGTCCGCTGCATCGGCCTGCTGGACGACGGCTTCGGCAGCACCCCCGAGATGACCCGCCGCGACCTGATCTGGGTGGTCACCCGCATGCAGGTCCTGGTGGACCGCTACCCCTCGTGGGGCGACGTGATCGAGGTCGACTCCTGGGTGACCCCCAGCGGCAAGAACGGCATGAAGCGCGAGTGGTTCCTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCGCCACCTCGGTCTGGGTGATGATGAACAAGCGCACCCGCCGCCTGTCCAAGATCCCCGAGGAGGTCCGCGTGGAGATCGAGCCCTACTTCGTCGAGCACGGCGTGCTGGACGAGGACTCGCGCAAGCTGCCCAAGCTGAACGACAACACCGCCAACTACATCCGCCGCGGCCTGGCGCCCCGCTGGTCCGACCTGGACGTCAACCAGCACGTGAACAACGTCAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGAGCGTGCCCAGCAGCCTGCTGGAGTCGCACGAGCTGTACGGCATGACCCTGGAGTACCGCAAGGAGTGCGGCAAGGACGGCCTGCTGCAGTCCCTGACCGCCGTCGCCAGCGACTACGGCGGCGGCTCGCTGGAGGCCGGCGTGGAGTGCGACCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCTCCGAGATCATGCGCGGCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCGCGCCGCGAACACCACCTACTTCGGCAGCGTCGACGACATCCCCCCCGCCAACAACGCGTGACTCGAG
SEQ ID NO：29
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的湿地萼距花C14偏好型硫酯酶(基因库AAC49180)氨基酸序列。
MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRASMLLSAVTTVFGVAEKQWPMLDRKSKRPDMLVEPLGVDRIVYDGVSFRQSFSIRSYEIGADRTASIETLMNMFQETSLNHCKIIGLLNDGFGRTPEMCKRDLIWVVTKMQIEVNRYPTWGDTIEVNTWVSASGKHGMGRDWLISDCHTGEILIRATSVWAMMNQKTRRLSKIPYEVRQEIEPQFVDSAPVIVDDRKFHKLDLKTGDSICNGLTPRWTDLDVNQHVNNVKYIGWILQSVPTEVFETQELCGLTLEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKEGDRSLYQHLLRLEDGADIVKGRTEWRPKNAGAKGAILTGKTSNGNSIS
SEQ ID NO：30
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的湿地萼距花C14偏好型硫酯酶的相关密码子优化的编码区。
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCAGCATGCTGCTGTCGGCGGTGACCACGGTCTTCGGCGTGGCCGAGAAGCAGTGGCCCATGCTGGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTCGAGCCCCTGGGCGTGGACCGCATCGTCTACGACGGCGTGAGCTTCCGCCAGTCGTTCTCCATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCGATCGAGACGCTGATGAACATGTTCCAGGAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGATCATCGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACGCCCGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTCGTGACCAAGATGCAGATCGAGGTGAACCGCTACCCCACGTGGGGCGACACCATCGAGGTCAACACGTGGGTGAGCGCCTCGGGCAAGCACGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCCGACTGCCACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCGACGAGCGTCTGGGCGATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCCTGTCGAAGATCCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGATCGAGCCCCAGTTCGTCGACTCCGCCCCCGTGATCGTGGACGACCGCAAGTTCCACAAGCTGGACCTGAAGACGGGCGACAGCATCTGCAACGGCCTGACCCCCCGCTGGACGGACCTGGACGTGAACCAGCACGTCAACAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGCAGTCGGTCCCCACCGAGGTGTTCGAGACGCAGGAGCTGTGCGGCCTGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTCACGGCCATGGACCCCTCGAAGGAGGGCGACCGCTCCCTGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCGCGGACATCGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAAGGGCGCCATCCTGACGGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCGATCTCCTGACTCGAG
SEQ ID NO：31
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的美洲榆广谱特异性硫酯酶(基因库AAB71731)氨基酸序列。
MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRAQLPDWSMLLAAITTLFLAAEKQWMMLDWKPKRPDMLVDPFGLGRFVQDGLVFRNNFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETALNHVKSVGLLEDGLGSTREMSLRNLIWVVTKMQVAVDRYPTWGDEVQVSSWATAIGKNGMRREWIVTDFRTGETLLRATSVWVMMNKLTRRISKIPEEVWHEIGPSFIDAPPLPTVEDDGRKLTRFDESSADFIRKGLTPRWSDLDINQHVNNVKYIGWLLESAPPEIHESHEIASLTLEYRRECGRDSVLNSATKVSDSSQLGKSAVECNHLVRLQNGGEIVKGRTVWRPKRPLYNDGAVVDVPAKTS
SEQ ID NO：32
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的美洲榆广谱特异性硫酯酶的相关密码子优化的编码区。
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCATGCTGCTGGCCGCGATCACCACCCTGTTCCTGGCGGCCGAGAAGCAGTGGATGATGCTGGACTGGAAGCCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACCCCTTCGGCCTGGGCCGCTTCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCAACAACTTCAGCATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCGGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCGCCCTGAACCACGTGAAGAGCGTGGGCCTGCTGGAGGACGGCCTGGGCAGCACCCGCGAGATGAGCCTGCGCAACCTGATCTGGGTGGTGACCAAGATGCAGGTGGCGGTGGACCGCTACCCCACCTGGGGCGACGAGGTGCAGGTGAGCAGCTGGGCGACCGCCATCGGCAAGAACGGCATGCGCCGCGAGTGGATCGTGACCGACTTCCGCACCGGCGAGACCCTGCTGCGCGCCACCAGCGTGTGGGTGATGATGAACAAGCTGACCCGCCGCATCAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGTGGCACGAGATCGGCCCCAGCTTCATCGACGCGCCCCCCCTGCCCACCGTGGAGGACGACGGCCGCAAGCTGACCCGCTTCGACGAGAGCAGCGCCGACTTCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAGCGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACGTGAAGTACATCGGCTGGCTGCTGGAGAGCGCGCCCCCCGAGATCCACGAGAGCCACGAGATCGCCAGCCTGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACAGCGTGCTGAACAGCGCCACCAAGGTGAGCGACAGCAGCCAGCTGGGCAAGAGCGCCGTGGAGTGCAACCACCTGGTGCGCCTGCAGAACGGCGGCGAGATCGTGAAGGGCCGCACCGTGTGGCGCCCCAAGCGCCCCCTGTACAACGACGGCGCCGTGGTGGACGTGCCCGCCAAGACCAGCTGACTCGAG
SEQ ID NO：33
密码子优化的桑椹形无绿藻(UTEX 1435)Δ12脂肪酸去饱和酶转运肽cDNA序列。
ACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCC
SEQ ID NO：34
密码子优化的原壳小球藻(UTEX 250)硬脂酰ACP去饱和酶转运肽cDNA序列。
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCC
SEQ ID NO：35
美洲榆广谱特异性硫酯酶的密码子优化的编码区的相关同源重组表达构建体。
GCTCTTCGGCCGCCGCCACTCCTGCTCGAGCGCGCCCGACTCGCGCTCCGCCTGCGCCCGCGCGTGCGCCGCCAGCGCCTTGGCCTTTTCGCCGCGCTCGTGCGCGTCGCTGATGTCCATCACCAGGTCCATGAGGTCTGCCTTGCGCCGGCTGAGCCACTGCTTCGTCCGGGCGGCCAAGAGGAGCATGAGGGAGGACTCCTGGTCCAGGGTCCTGACGTGGTCGCGGCTCTGGGAGCGGGCCAGCATCATCTGGCTCTGCCGCACCGAGGCCGCCTCCAACTGGTCCTCCAGCAGCCGCAGTCGCCGCCGACCCTGGCAGAGGAAGACAGGTGAGGGGGGTATGAATTGTACAGAACAACCACGAGCCTTGTCTAGGCAGAATCCCTACCAGTCATGGCTTTACCTGGATGACGGCCTGCGAACAGCTGTCCAGCGACCCTCGCTGCCGCCGCTTCTCCCGCACGCTTCTTTCCAGCACCGTGATGGCGCGAGCCAGCGCCGCACGCTGGCGCTGCGCTTCGCCGATCTGAGGACAGTCGGGGAACTCTGATCAGTCTAAACCCCCTTGCGCGTTAGTGTTGCCATCCTTTGCAGACCGGTGAGAGCCGACTTGTTGTGCGCCACCCCCCACACCACCTCCTCCCAGACCAATTCTGTCACCTTTTTGGCGAAGGCATCGGCCTCGGCCTGCAGAGAGGACAGCAGTGCCCAGCCGCTGGGGGTTGGCGGATGCACGCTCAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCATGCTGCTGGCCGCGATCACCACCCTGTTCCTGGCGGCCGAGAAGCAGTGGATGATGCTGGACTGGAAGCCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACCCCTTCGGCCTGGGCCGCTTCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCAACAACTTCAGCATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCGGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCGCCCTGAACCACGTGAAGAGCGTGGGCCTGCTGGAGGACGGCCTGGGCAGCACCCGCGAGATGAGCCTGCGCAACCTGATCTGGGTGGTGACCAAGATGCAGGTGGCGGTGGACCGCTACCCCACCTGGGGCGACGAGGTGCAGGTGAGCAGCTGGGCGACCGCCATCGGCAAGAACGGCATGCGCCGCGAGTGGATCGTGACCGACTTCCGCACCGGCGAGACCCTGCTGCGCGCCACCAGCGTGTGGGTGATGATGAACAAGCTGACCCGCCGCATCAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGTGGCACGAGATCGGCCCCAGCTTCATCGACGCGCCCCCCCTGCCCACCGTGGAGGACGACGGCCGCAAGCTGACCCGCTTCGACGAGAGCAGCGCCGACTTCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAGCGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACGTGAAGTACATCGGCTGGCTGCTGGAGAGCGCGCCCCCCGAGATCCACGAGAGCCACGAGATCGCCAGCCTGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACAGCGTGCTGAACAGCGCCACCAAGGTGAGCGACAGCAGCCAGCTGGGCAAGAGCGCCGTGGAGTGCAACCACCTGGTGCGCCTGCAGAACGGCGGCGAGATCGTGAAGGGCCGCACCGTGTGGCGCCCCAAGCGCCCCCTGTACAACGACGGCGCCGTGGTGGACGTGCCCGCCAAGACCAGCGATGACGATGACAAGCTGGGATGACTCGAGTTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTGTAGAGCTCCTTGTTTTCCAGAAGGAGTTGCTCCTTGAGCCTTTCATTCTCAGCCTCGATAACCTCCAAAGCCGCTCTAATTGTGGAGGGGGTTCGAATTTAAAAGCTTGGAATGTTGGTTCGTGCGTCTGGAACAAGCCCAGACTTGTTGCTCACTGGGAAAAGGACCATCAGCTCCAAAAAACTTGCCGCTCAAACCGCGTACCTCTGCTTTCGCGCAATCTGCCCTGTTGAAATCGCCACCACATTCATATTGTGACGCTTGAGCAGTCTGTAATTGCCTCAGAATGTGGAATCATCTGCCCCCTGTGCGAGCCCATGCCAGGCATGTCGCGGGCGAGGACACCCGCCACTCGTACAGCAGACCATTATGCTACCTCACAATAGTTCATAACAGTGACCATATTTCTCGAAGCTCCCCAACGAGCACCTCCATGCTCTGAGTGGCCACCCCCCGGCCCTGGTGCTTGCGGAGGGCAGGTCAACCGGCATGGGGCTACCGAAATCCCCGACCGGATCCCACCACCCCCGCGATGGGAAGAATCTCTCCCCGGGATGTGGGCCCACCACCAGCACAACCTGCTGGCCCAGGCGAGCGTCAAACCATACCACACAAATATCCTTGGCATCGGCCCTGAATTCCTTCTGCCGCTCTGCTACCCGGTGCTTCTGTCCGAAGCAGGGGTTGCTAGGGATCGCTCCGAGTCCGCAAACCCTTGTCGCGTGGCGGGGCTTGTTCGAGCTTGTTCGAGCTTGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID NO：36
樟树C14偏好型硫酯酶的密码子优化的编码区的相关同源重组表达构建体。GAATTCGCCCTCCCGTGATCACACAGGTGCCTTGCGAGCGTGATCACACTATTTTGGGGGTCCTACAGTACTGAAATGGTGAGAAGTCGTACTGAAATCAAGGATGAACAATGAAAATGGTGCTGTGGTGGCTTCTCAAAGGTCAAGAATCAGTCGCTCGCGTCAGGAAATCGCGGCGTCAACCAGCGTGGGCGCGGTCAGTGGCCCCGCACTGGTCACCATAGCCTCTCCTGCCACAGTAGCGATCCCCTGGGCGTTCACTCTCAGCAGCGGCTGTACTGCCTCCCAGATTTTCTTCTTCTGGACCTGCGGGCGTGAGAGGATGAGCAGGGTGGGCCAAGGGCTCAATCCTGAACGGCCCTCATTCGGTTTCCAATCCCACAACACATACCCACAGCAGGTCAGACCACGCATTCCACCATGCGCACCAATAACGTGTCCTTACCTGATTGGGTGTGGCAGGCTCCGTGGACAGGAGTGCCTCGTCCCCCGCCCAGACCCGCTCCCCCGTCACGGCGGCGTCCGGGACCCGCAGCGGCTCCACCGCGGTGTGATCCGCGTTGGCGGCGCAGAGCAGCATCCCAGCCGATTTGACCCCGCGCATGCTCCGAGGCTTGAGGTTGGCCAGCACCACCACCCGCCGGCCGACAAGGTCCTCCAGGGTCACGTGCCGGACCAGGCCACTCACGATGGTGCGAGGGCCCCCCTCCTCGCCGAGGTCGATCTGCTCGACGTACAGACTGCGACATGCGTGGCGAGTGGTCATCAGAAGGAAGCAGGTGTGCAGAAGGGGCACGTGGTTGGTATTGAGAGTAGCCAAAGCTTTGTGCCAATCAGAAAGTCAACGCAGCTGCCTGCCTGGCTCGCGTACAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGACGTTCGGGGTCGCCCTCCCGGCCATGGGCCGCGGTGTCTCCCTTCCCCGGCCCAGGGTCGCGGTGCGCGCCCAGTCGGCGAGTCAGGTTTTGGAGAGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTACCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTGGTACCCGTACCCATCAGCATCCGGGTGAATCTTGGCCTCCAAGATATGGCCAATCCTCACATCCAGCTTGGCAAAATCGACTAGACTGTCTGCAAGTGGGAATGTGGAGCACAAGGTTGCTTGTAGCGATCGACAGACTGGTGGGGTACATTGACAGGTGGGCAGCGCCGCATCCATCGTGCCTGACGCGAGCGCCGCCGGTTGCTCGCCCGTGCCTGCCGTCAAAGAGCGGCAGAGAAATCGGGAACCGAAAACGTCACATTGCCTGATGTTGTTACATGCTGGACTAGACTTTCTTGGCGTGGGTCTGCTCCTCGCCAGGTGCGCGACGCCTCGGGGCTGGGTGCGAGGGAGCCGTGCGGCCACGCATTTGACAAGACCCAAAGCTCGCATCTCAGACGGTCAACCGTTCGTATTATACATTCAACATATGGTACATACGCAAAAAGCATGCCAACGATGACATAGGCGAATTC
SEQ ID NO：37
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的细叶萼距花C10偏好型硫酯酶的密码子优化的编码区的相关表达构建体。
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCTTGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAGGGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTCAGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCAGCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGTGCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGGGGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCAGGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCCTGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCAGGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCGAATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGGGACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAGCTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGGGAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACCCTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCATGCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTAGCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCGGCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGATGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCCCTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACAGCTTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAGATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCCTGAACCACTGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTGCCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTGAAGGTGCACAAGTTCAAGGTGAAGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTGACCGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGCGCCATCTCCACCGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCCGTGTCCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTC
SEQ ID NO：38
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的加州月桂C12偏好型硫酯酶的密码子优化的编码区的相关表达构建体。
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCTTGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAGGGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTCAGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCAGCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGTGCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGGGGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCAGGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCCTGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCAGGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCGAATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGGGACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAGCTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGGGAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACCCTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCATGCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTAGCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCGGCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGATGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCCCTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCAGCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCTGCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCTCCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCAGCACCTCCATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACCACGCCAAGAGCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATGTGGGTGGTGCGCCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGATCGGCGCCAGCGGCAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGCTGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCACCATCCCCGACGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGACGAGATCAAGAAGCTGCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAACAACCTGAAGTACGTGGCCTGGGTGTTCGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGTCCCACCACATCAGCTCCTTCACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCACCCGCGACTCCGTGCTGCGCAGCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGCCCCGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTC
SEQ ID NO：39
具有原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶转运肽的美洲榆广谱特异性硫酯酶的密码子优化的编码区的相关表达构建体。
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGGCGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCTTGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAGGGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTCAGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCAGCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGTGCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGGGGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCAGGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCCTGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCAGGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCGAATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGGGACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAGCTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGGGAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACCCTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCATGCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTAGCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCGGCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGATGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCCCTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCATGCTGCTGGCCGCGATCACCACCCTGTTCCTGGCGGCCGAGAAGCAGTGGATGATGCTGGACTGGAAGCCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACCCCTTCGGCCTGGGCCGCTTCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCAACAACTTCAGCATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCGGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCGCCCTGAACCACGTGAAGAGCGTGGGCCTGCTGGAGGACGGCCTGGGCAGCACCCGCGAGATGAGCCTGCGCAACCTGATCTGGGTGGTGACCAAGATGCAGGTGGCGGTGGACCGCTACCCCACCTGGGGCGACGAGGTGCAGGTGAGCAGCTGGGCGACCGCCATCGGCAAGAACGGCATGCGCCGCGAGTGGATCGTGACCGACTTCCGCACCGGCGAGACCCTGCTGCGCGCCACCAGCGTGTGGGTGATGATGAACAAGCTGACCCGCCGCATCAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGTGGCACGAGATCGGCCCCAGCTTCATCGACGCGCCCCCCCTGCCCACCGTGGAGGACGACGGCCGCAAGCTGACCCGCTTCGACGAGAGCAGCGCCGACTTCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAGCGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACGTGAAGTACATCGGCTGGCTGCTGGAGAGCGCGCCCCCCGAGATCCACGAGAGCCACGAGATCGCCAGCCTGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACAGCGTGCTGAACAGCGCCACCAAGGTGAGCGACAGCAGCCAGCTGGGCAAGAGCGCCGTGGAGTGCAACCACCTGGTGCGCCTGCAGAACGGCGGCGAGATCGTGAAGGGCCGCACCGTGTGGCGCCCCAAGCGCCCCCTGTACAACGACGGCGCCGTGGTGGACGTGCCCGCCAAGACCAGCGATGACGATGACAAGCTGGGATGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTC
SEQ ID NO：40
桑椹形无绿藻Δ12 FAD敲除同源重组靶向构建体的5′供体DNA序列GCTCTTCGGGTTTGCTCACCCGCGAGGTCGACGCCCAGCATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTAGCAGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTACATCGACCCTGCGCCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTATGGCGTCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAGGTGTGTGTGAGGGTTGTGGTTGCCCGTATCGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGGGGAGAAGGCGCCTGTCCCGCTGACCCCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCCTTCGGCACGGGTGTCTGGGTGTGCGCGCACGAGTGCGGCCACCAGGCCTTTTCCTCCAGCCAGGCCATCAACGACGGCGTGGGCCTGGTGTTCCACAGCCTGCTGCTGGTGCCCTACTACTCCTGGAAGCACTCGCACCGCCGCCACCACTCCAACACGGGGTGCCTGGACAAGGACGAGGTGTTTGTGCCGCCGCACCGCGCAGTGGCGCACGAGGGCCTGGAGTGGGAGGAGTGGCTGCCCATCCGCATGGGCAAGGTGCTGGTCACCCTGACCCTGGGCTGGCCGCTGTACCTCATGTTCAACGTCGCCTCGCGGCCGTACCCGCGCTTCGCCAACCACTTTGACCCGTGGTCGCCCATCTTCAGCAAGCGCGAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCC
SEQ ID NO：41
桑椹形无绿藻Δ12 FAD敲除同源重组靶向构建体的3′供体DNA序列CAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGCATCGAGGTGGTCATCTCCGACCTCGCGTTGGTGGCGGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGGGCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGTGCCCTACATGATCGTGAACATGTGGCTGGTGCTCATCACGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCCCTGCCGCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTACGCGGCGCCATGGCCACCGTCGACCGCTCCATGGGCCCGCCCTTCATGGACAGCATCCTGCACCACATCTCCGACACCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCATCCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCCGGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAATCCGACAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGCGCGACTGCCGCTACGTCGTCCCCGACGCGCCCGAGGACGACTCCGCGCTCTGGTTCCACAAGTGAGCGCGCCTGCGCGAGGACGCAGAACAACGCTGCCGCCGTGTCTTTTGCACGCGCGACTCCGGCGCTTCGCTGGTGGCACCCCCATAAAGAAACCCTCAATTCTGTTTGTGGAAGACACGGTGTACCCCCACCCACCCACCTGCACCTCTATTATTGGTATTATTGACGCGGGAGTGGGCGTTGTACCCTACAACGTAGCTTCTCTAGTTTTCAGCTGGCTCCCACCATTGTAAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID NO：42
桑椹形无绿藻Δ12 FAD敲除同源重组靶向构建体
GCTCTTCGGGTTTGCTCACCCGCGAGGTCGACGCCCAGCATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTAGCAGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTACATCGACCCTGCGCCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTATGGCGTCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAGGTGTGTGTGAGGGTTGTGGTTGCCCGTATCGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGGGGAGAAGGCGCCTGTCCCGCTGACCCCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCCTTCGGCACGGGTGTCTGGGTGTGCGCGCACGAGTGCGGCCACCAGGCCTTTTCCTCCAGCCAGGCCATCAACGACGGCGTGGGCCTGGTGTTCCACAGCCTGCTGCTGGTGCCCTACTACTCCTGGAAGCACTCGCACCGCCGCCACCACTCCAACACGGGGTGCCTGGACAAGGACGAGGTGTTTGTGCCGCCGCACCGCGCAGTGGCGCACGAGGGCCTGGAGTGGGAGGAGTGGCTGCCCATCCGCATGGGCAAGGTGCTGGTCACCCTGACCCTGGGCTGGCCGCTGTACCTCATGTTCAACGTCGCCTCGCGGCCGTACCCGCGCTTCGCCAACCACTTTGACCCGTGGTCGCCCATCTTCAGCAAGCGCGAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGCATCGAGGTGGTCATCTCCGACCTCGCGTTGGTGGCGGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGGGCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGTGCCCTACATGATCGTGAACATGTGGCTGGTGCTCATCACGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCCCTGCCGCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTACGCGGCGCCATGGCCACCGTCGACCGCTCCATGGGCCCGCCCTTCATGGACAGCATCCTGCACCACATCTCCGACACCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCATCCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCCGGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAATCCGACAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGCGCGACTGCCGCTACGTCGTCCCCGACGCGCCCGAGGACGACTCCGCGCTCTGGTTCCACAAGTGAGCGCGCCTGCGCGAGGACGCAGAACAACGCTGCCGCCGTGTCTTTTGCACGCGCGACTCCGGCGCTTCGCTGGTGGCACCCCCATAAAGAAACCCTCAATTCTGTTTGTGGAAGACACGGTGTACCCCCACCCACCCACCTGCACCTCTATTATTGGTATTATTGACGCGGGAGTGGGCGTTGTACCCTACAACGTAGCTTCTCTAGTTTTCAGCTGGCTCCCACCATTGTAAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID NO：43
桑椹形无绿藻SAD2A敲除同源重组靶向构建体的5′供体DNA序列
GCTCTTCCGCCTGGAGCTGGTGCAGAGCATGGGTCAGTTTGCGGAGGAGAGGGTGCTCCCCGTGCTGCACCCCGTGGACAAGCTGTGGCAGCCGCAGGACTTCCTGCCCGACCCCGAGTCGCCCGACTTCGAGGACCAGGTGGCGGAGCTGCGCGCGCGCGCCAAGGACCTGCCCGACGAGTACTTTGTGGTGCTGGTGGGCGACATGATCACGGAGGAGGCGCTGCCGACCTACATGGCCATGCTCAACACCTTGGACGGTGTGCGCGACGACACGGGCGCGGCTGACCACCCGTGGGCGCGCTGGACGCGGCAGTGGGTGGCCGAGGAGAACCGGCACGGCGACCTGCTGAACAAGTACTGTTGGCTGACGGGGCGCGTCAACATGCGGGCCGTGGAGGTGACCATCAACAACCTGATCAAGAGCGGCATGAACCCGCAGACGGACAACAACCCTTACTTGGGCTTCGTCTACACCTCCTTCCAGGAGCGCGCCACCAAGTAGGTACC
SEQ ID NO：44
桑椹形无绿藻SAD2A敲除同源重组靶向构建体的3′供体DNA序列
CAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAGGATCGTAGAGCTCCAGCCACGGCAACACCGCGCGCCTGGCGGCCGAGCACGGCGACAAGGGCCTGAGCAAGATCTGCGGGCTGATCGCCAGCGACGAGGGCCGGCACGAGATCGCCTACACGCGCATCGTGGACGAGTTCTTCCGCCTCGACCCCGAGGGCGCCGTCGCCGCCTACGCCAACATGATGCGCAAGCAGATCACCATGCCCGCGCACCTCATGGACGACATGGGCCACGGCGAGGCCAACCCGGGCCGCAACCTCTTCGCCGACTTCTCCGCCGTCGCCGAGAAGATCGACGTCTACGACGCCGAGGACTACTGCCGCATCCTGGAGCACCTCAACGCGCGCTGGAAGGTGGACGAGCGCCAGGTCAGCGGCCAGGCCGCCGCGGACCAGGAGTACGTTCTGGGCCTGCCCCAGCGCTTCCGGAAACTCGCCGAGAAGACCGCCGCCAAGCGCAAGCGCGTCGCGCGCAGGCCCGTCGCCTTCTCCTGGAGAGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID NO：45
桑椹形无绿藻SAD2A敲除同源重组靶向构建体
GCTCTTCCGCCTGGAGCTGGTGCAGAGCATGGGTCAGTTTGCGGAGGAGAGGGTGCTCCCCGTGCTGCACCCCGTGGACAAGCTGTGGCAGCCGCAGGACTTCCTGCCCGACCCCGAGTCGCCCGACTTCGAGGACCAGGTGGCGGAGCTGCGCGCGCGCGCCAAGGACCTGCCCGACGAGTACTTTGTGGTGCTGGTGGGCGACATGATCACGGAGGAGGCGCTGCCGACCTACATGGCCATGCTCAACACCTTGGACGGTGTGCGCGACGACACGGGCGCGGCTGACCACCCGTGGGCGCGCTGGACGCGGCAGTGGGTGGCCGAGGAGAACCGGCACGGCGACCTGCTGAACAAGTACTGTTGGCTGACGGGGCGCGTCAACATGCGGGCCGTGGAGGTGACCATCAACAACCTGATCAAGAGCGGCATGAACCCGCAGACGGACAACAACCCTTACTTGGGCTTCGTCTACACCTCCTTCCAGGAGCGCGCCACCAAGTAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAGGATCGTAGAGCTCCAGCCACGGCAACACCGCGCGCCTGGCGGCCGAGCACGGCGACAAGGGCCTGAGCAAGATCTGCGGGCTGATCGCCAGCGACGAGGGCCGGCACGAGATCGCCTACACGCGCATCGTGGACGAGTTCTTCCGCCTCGACCCCGAGGGCGCCGTCGCCGCCTACGCCAACATGATGCGCAAGCAGATCACCATGCCCGCGCACCTCATGGACGACATGGGCCACGGCGAGGCCAACCCGGGCCGCAACCTCTTCGCCGACTTCTCCGCCGTCGCCGAGAAGATCGACGTCTACGACGCCGAGGACTACTGCCGCATCCTGGAGCACCTCAACGCGCGCTGGAAGGTGGACGAGCGCCAGGTCAGCGGCCAGGCCGCCGCGGACCAGGAGTACGTTCTGGGCCTGCCCCAGCGCTTCCGGAAACTCGCCGAGAAGACCGCCGCCAAGCGCAAGCGCGTCGCGCGCAGGCCCGTCGCCTTCTCCTGGAGAGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID NO：46
桑椹形无绿藻SAD2B敲除同源重组靶向构建体的5′供体DNA序列
GCTCTTCCCGCCTGGAGCTGGTGCAGAGCATGGGGCAGTTTGCGGAGGAGAGGGTGCTCCCCGTGCTGCACCCCGTGGACAAGCTGTGGCAGCCGCAGGACTTCCTGCCCGACCCCGAGTCGCCCGACTTCGAGGACCAGGTGGCGGAGCTGCGCGCGCGCGCCAAGGACCTGCCCGACGAGTACTTTGTGGTGCTGGTGGGCGACATGATCACGGAGGAGGCGCTGCCGACCTACATGGCCATGCTCAACACCTTGGACGGTGTGCGCGACGACACGGGCGCGGCTGACCACCCGTGGGCGCGCTGGACGCGGCAGTGGGTGGCCGAGGAGAACCGGCACGGCGACCTGCTGAACAAGTACTGTTGGCTGACGGGGCGCGTCAACATGCGGGCCGTGGAGGTGACCATCAACAACCTGATCAAGAGCGGCATGAACCCGCAGACGGACAACAACCCTTACTTGGGCTTCGTCTACACCTCCTTCCAGGAGCGCGCCACCAAGTAGGTACC
SEQ ID NO：47
桑椹形无绿藻SAD2B敲除同源重组靶向构建体的3′供体DNA序列
CAGCCACGGCAACACCGCGCGCCTTGCGGCCGAGCACGGCGACAAGAACCTGAGCAAGATCTGCGGGCTGATCGCCAGCGACGAGGGCCGGCACGAGATCGCCTACACGCGCATCGTGGACGAGTTCTTCCGCCTCGACCCCGAGGGCGCCGTCGCCGCCTACGCCAACATGATGCGCAAGCAGATCACCATGCCCGCGCACCTCATGGACGACATGGGCCACGGCGAGGCCAACCCGGGCCGCAACCTCTTCGCCGACTTCTCCGCGGTCGCCGAGAAGATCGACGTCTACGACGCCGAGGACTACTGCCGCATCCTGGAGCACCTCAACGCGCGCTGGAAGGTGGACGAGCGCCAGGTCAGCGGCCAGGCCGCCGCGGACCAGGAGTACGTCCTGGGCCTGCCCCAGCGCTTCCGGAAACTCGCCGAGAAGACCGCCGCCAAGCGCAAGCGCGTCGCGCGCAGGCCCGTCGCCTTCTCCTGGAGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID NO：48
桑椹形无绿藻SAD2B敲除同源重组靶向构建体
GCTCTTCCCGCCTGGAGCTGGTGCAGAGCATGGGGCAGTTTGCGGAGGAGAGGGTGCTCCCCGTGCTGCACCCCGTGGACAAGCTGTGGCAGCCGCAGGACTTCCTGCCCGACCCCGAGTCGCCCGACTTCGAGGACCAGGTGGCGGAGCTGCGCGCGCGCGCCAAGGACCTGCCCGACGAGTACTTTGTGGTGCTGGTGGGCGACATGATCACGGAGGAGGCGCTGCCGACCTACATGGCCATGCTCAACACCTTGGACGGTGTGCGCGACGACACGGGCGCGGCTGACCACCCGTGGGCGCGCTGGACGCGGCAGTGGGTGGCCGAGGAGAACCGGCACGGCGACCTGCTGAACAAGTACTGTTGGCTGACGGGGCGCGTCAACATGCGGGCCGTGGAGGTGACCATCAACAACCTGATCAAGAGCGGCATGAACCCGCAGACGGACAACAACCCTTACTTGGGCTTCGTCTACACCTCCTTCCAGGAGCGCGCCACCAAGTAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGACAGCCACGGCAACACCGCGCGCCTTGCGGCCGAGCACGGCGACAAGAACCTGAGCAAGATCTGCGGGCTGATCGCCAGCGACGAGGGCCGGCACGAGATCGCCTACACGCGCATCGTGGACGAGTTCTTCCGCCTCGACCCCGAGGGCGCCGTCGCCGCCTACGCCAACATGATGCGCAAGCAGATCACCATGCCCGCGCACCTCATGGACGACATGGGCCACGGCGAGGCCAACCCGGGCCGCAACCTCTTCGCCGACTTCTCCGCGGTCGCCGAGAAGATCGACGTCTACGACGCCGAGGACTACTGCCGCATCCTGGAGCACCTCAACGCGCGCTGGAAGGTGGACGAGCGCCAGGTCAGCGGCCAGGCCGCCGCGGACCAGGAGTACGTCCTGGGCCTGCCCCAGCGCTTCCGGAAACTCGCCGAGAAGACCGCCGCCAAGCGCAAGCGCGTCGCGCGCAGGCCCGTCGCCTTCTCCTGGAGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID NO：49
FAD引物1
5′-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3′
SEQ ID NO：50
FAD引物2
5′-GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3′
SEQ ID NO：51
pSZ1124(FAD2B)5′基因组靶向序列
GCTCTTCGAGACGTGGTCTGAATCCTCCAGGCGGGTTTCCCCGAGAAAGAAAGGGTGCCGATTTCAAAGCAGAGCCATGTGCCGGGCCCTGTGGCCTGTGTTGGCGCCTATGTAGTCACCCCCCCTCACCCAATTGTCGCCAGTTTGCGCAATCCATAAACTCAAAACTGCAGCTTCTGAGCTGCGCTGTTCAAGAACACCTCTGGGGTTTGCTCACCCGCGAGGTCGACGCCCAGCATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTAGCAGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTACATCGACCCTGCGCCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTATGGCGTCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAGGTGTGTGTGAGGGTTGTGGTTGCCCGTATCGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGGGGAGAAGGCGCCTGTCCCGCTGACCCCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCCTTCGGCACGGGTGTCTGGGTGTGCGCGCACGAGTGCGGCCACCAGGCCTTTTCCTCCAGCCAGGCCATCAACGACGGCGTGGGCCTGGTGTTCCACAGCCTGCTGCTGGTGCCCTACTACTCCTGGAAGCACTCGCACCGGGTACC
SEQ ID NO：52
pSZ1124(FAD2B)3′基因组靶向序列
CCGCCACCACTCCAACACGGGGTGCCTGGACAAGGACGAGGTGTTTGTGCCGCCGCACCGCGCAGTGGCGCACGAGGGCCTGGAGTGGGAGGAGTGGCTGCCCATCCGCATGGGCAAGGTGCTGGTCACCCTGACCCTGGGCTGGCCGCTGTACCTCATGTTCAACGTCGCCTCGCGGCCGTACCCGCGCTTCGCCAACCACTTTGACCCGTGGTCGCCCATCTTCAGCAAGCGCGAGCGCATCGAGGTGGTCATCTCCGACCTGGCGCTGGTGGCGGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGGGCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGTGCCCTACCTGATCGTGAACATGTGGCTCGTGCTCATCACGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCGCTGCCGCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTGCGCGGCGCCATGGCCACCGTGGACCGCTCCATGGGCCCGCCCTTCATGGACAACATCCTGCACCACATCTCCGACACCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCATCCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCAGGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAGTCCGACAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGCGCGACTGCCGCTACGTCGTCCCGGACGCGCCCGAGGACGACTCCGCGCTCTGGTTCCACAAGTGAGTGAGTGAGAAGAGC
SEQ ID NO：53
酿酒酵母suc2盒
CTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGA
SEQ ID NO：54
pSZ1125(FAD2C)5′基因组靶向序列
GCTCTTCGAGGGGCTGGTCTGAATCCTTCAGGCGGGTGTTACCCGAGAAAGAAAGGGTGCCGATTTCAAAGCAGACCCATGTGCCGGGCCCTGTGGCCTGTGTTGGCGCCTATGTAGTCACCCCCCCTCACCCAATTGTCGCCAGTTTGCGCACTCCATAAACTCAAAACAGCAGCTTCTGAGCTGCGCTGTTCAAGAACACCTCTGGGGTTTGCTCACCCGCGAGGTCGACGCCCAGCATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTAGCAGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTACATCGACCCTGCACCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTACGGCATCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAGGTGTGTTTGAGGGTTTTGGTTGCCCGTATTGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGAGGAGAAGGCGCCTGTCCCGCTGACCCCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCCTTCGGCACGGGTGTCTGGGTGTGCGCGCACGAGTGCGGCCACCAGGCCTTTTCCTCCAGCCAGGCCATCAACGACGGCGTGGGCCTGGTGTTCCACAGCCTGCTGCTGGTGCCCTACTACTCCTGGAAGCACTCGCACCGGGTACC
SEQ ID NO：55
pSZ1125(FAD2C)3′基因组靶向序列
CCGCCACCACTCCAACACGGGGTGCCTGGACAAGGACGAGGTGTTTGTGCCGCCGCACCGCGCAGTGGCGCACGAGGGCCTGGAGTGGGAGGAGTGGCTGCCCATCCGCATGGGCAAGGTGCTGGTCACCCTGACCCTGGGCTGGCCGCTGTACCTCATGTTCAACGTCGCCTCGCGGCCGTACCCGCGCTTCGCCAACCACTTTGACCCGTGGTCGCCCATCTTCAGCAAGCGCGAGCGCATCGAGGTGGTCATCTCCGACCTGGCGCTGGTGGCGGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGGGCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGTGCCCTACCTGATCGTGAACATGTGGCTCGTGCTCATCACGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCGCTGCCGCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTGCGCGGCGCCATGGCCACCGTGGACCGCTCCATGGGCCCGCCCTTCATGGACAACATCCTGCACCACATCTCCGACACCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCATCCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCAGGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAGTCCGACAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGCGCGACTGCCGCTACGTCGTCCCGGACGCGCCCGAGGACGACTCCGCGCTCTGGTTCCACAAGTGAGTGAGTGAGAAGAGC
SEQ ID NO：56
5′6S基因组供体序列
GCTCTTCGCCGCCGCCACTCCTGCTCGAGCGCGCCCGCGCGTGCGCCGCCAGCGCCTTGGCCTTTTCGCCGCGCTCGTGCGCGTCGCTGATGTCCATCACCAGGTCCATGAGGTCTGCCTTGCGCCGGCTGAGCCACTGCTTCGTCCGGGCGGCCAAGAGGAGCATGAGGGAGGACTCCTGGTCCAGGGTCCTGACGTGGTCGCGGCTCTGGGAGCGGGCCAGCATCATCTGGCTCTGCCGCACCGAGGCCGCCTCCAACTGGTCCTCCAGCAGCCGCAGTCGCCGCCGACCCTGGCAGAGGAAGACAGGTGAGGGGGGTATGAATTGTACAGAACAACCACGAGCCTTGTCTAGGCAGAATCCCTACCAGTCATGGCTTTACCTGGATGACGGCCTGCGAACAGCTGTCCAGCGACCCTCGCTGCCGCCGCTTCTCCCGCACGCTTCTTTCCAGCACCGTGATGGCGCGAGCCAGCGCCGCACGCTGGCGCTGCGCTTCGCCGATCTGAGGACAGTCGGGGAACTCTGATCAGTCTAAACCCCCTTGCGCGTTAGTGTTGCCATCCTTTGCAGACCGGTGAGAGCCGACTTGTTGTGCGCCACCCCCCACACCACCTCCTCCCAGACCAATTCTGTCACCTTTTTGGCGAAGGCATCGGCCTCGGCCTGCAGAGAGGACAGCAGTGCCCAGCCGCTGGGGGTTGGCGGATGCACGCTCAGGTACC
SEQ ID NO：57
3′6S基因组供体序列
GAGCTCCTTGTTTTCCAGAAGGAGTTGCTCCTTGAGCCTTTCATTCTCAGCCTCGATAACCTCCAAAGCCGCTCTAATTGTGGAGGGGGTTCGAATTTAAAAGCTTGGAATGTTGGTTCGTGCGTCTGGAACAAGCCCAGACTTGTTGCTCACTGGGAAAAGGACCATCAGCTCCAAAAAACTTGCCGCTCAAACCGCGTACCTCTGCTTTCGCGCAATCTGCCCTGTTGAAATCGCCACCACATTCATATTGTGACGCTTGAGCAGTCTGTAATTGCCTCAGAATGTGGAATCATCTGCCCCCTGTGCGAGCCCATGCCAGGCATGTCGCGGGCGAGGACACCCGCCACTCGTACAGCAGACCATTATGCTACCTCACAATAGTTCATAACAGTGACCATATTTCTCGAAGCTCCCCAACGAGCACCTCCATGCTCTGAGTGGCCACCCCCCGGCCCTGGTGCTTGCGGAGGGCAGGTCAACCGGCATGGGGCTACCGAAATCCCCGACCGGATCCCACCACCCCCGCGATGGGAAGAATCTCTCCCCGGGATGTGGGCCCACCACCAGCACAACCTGCTGGCCCAGGCGAGCGTCAAACCATACCACACAAATATCCTTGGCATCGGCCCTGAATTCCTTCTGCCGCTCTGCTACCCGGTGCTTCTGTCCGAAGCAGGGGTTGCTAGGGATCGCTCCGAGTCCGCAAACCCTTGTCGCGTGGCGGGGCTTGTTCGAGCTTGAAGAGC
SEQ ID NO：58
樟树硫酯酶的相关表达构建体
(βtub::neo::nitred::βtub::C.camphora TE::nitred)
CTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTACCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID NO：59
包含在pSZ1503_[KASII_btub-y.inv-nr_KASII]中的转化DNA的核苷酸序列
gctcttcccgcaccggctggctccaccccaacttgaacctcgagaaccccgcgcctggcgtcgaccccgtcgtgctcgtggggccgcggaaggagcgcgccgaagacctggacgtcgtcctctccaactcctttggctttggcgggcacaattcgtgcgtcggtaccctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacggcgcgccATGctgctgcaggccttcctgttcctgctggccggcttcgccgccaagatcagcgcctccatgacgaacgagacgtccgaccgccccctggtgcacttcacccccaacaagggctggatgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggcacctgtacttccagtacaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggccacgccacgtccgacgacctgaccaactgggaggaccagcccatcgccatcgccccgaagcgcaacgactccggcgccttctccggctccatggtggtggactacaacaacacctccggcttcttcaacgacaccatcgacccgcgccagcgctgcgtggccatctggacctacaacaccccggagtccgaggagcagtacatctcctacagcctggacggcggctacaccttcaccgagtaccagaagaaccccgtgctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttctggtacgagccctcccagaagtggatcatgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatctactcctccgacgacctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctcggctaccagtacgagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagtcctactgggtgatgttcatctccatcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaaccagtacttcgtcggcagcttcaacggcacccacttcgaggccttcgacaaccagtcccgcgtggtggacttcggcaaggactactacgccctgcagaccttcttcaacaccgacccgacctacgggagcgccctgggcatcgcgtgggcctccaactgggagtactccgccttcgtgcccaccaacccctggcgctcctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggccaacccggagacggagctgatcaacctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacgccggcccctggagccggttcgccaccaacaccacgttgacgaaggccaacagctacaacgtcgacctgtccaacagcaccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaccacccagacgatctccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccgaggagtacctccgcatgggcttcgaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaacagcaaggtgaagttcgtgaaggagaacccctacttcaccaaccgcatgagcgtgaacaaccagcccttcaagagcgagaacgacctgtcctactacaaggtgtacggcttgctggaccagaacatcctggagctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttcatgaccaccgggaacgccctgggctccgtgaacatgacgacgggggtggacaacctgttctacatcgacaagttccaggtgcgcgaggtcaagTGAcaattggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaggatcgtagagctcatcttccgaaagtacgacgagtgagcgagctgattctctttgagcggggtcgggtggttcggggagagtgcgcggaaaggcgcagagacgtgcggccggccgtgtccctccgtcttcccctggttggtgctatagtaacctgcctgtgtcgcgtgcgcgtcgggaagagc
SEQ ID No：60
pSZ2533中包含的转化DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO：61
驱动PmKASII在pSZ2532中的表达的PmLDH1启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：62
驱动PmKASII在pSZ2750中的表达的PmAMT3启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：63
pSZ4424的核苷酸序列-用于具有M230G突变的C8 CpalFATB1 ExtC的表达
THI4a：：CrTUB2-NeoR-PmPGH：PmSAD2-2Ver3-
CpSAD1tp_CpalFATB1ExtC_M230G_FLAG-CvNR：：THI4a
SEQ ID NO：64
pSZ4440的核苷酸序列
THI4a5′：：CrTUB2_ScSUC2_PmPGH：：AMT1-1p_CpSAD1tp-CpalFATB2_ExtB_Flag_PmEF1：：THI4a3′
核苷酸位置 元件名称
2723-3166 PmPGH 3′UTR
5327-5732 PmEF1 3′UTR
1118-2716 ScSUC2o
3966-5318 具有转运肽的CpalFATB2_ExtB
3387-3958 pPmAMT11
794-1105 CrTUB2启动子
1-787 THI4a 5′侧翼序列
5739-6441 THI4a 3′侧翼序列
5247-5318 Flag
SEQ ID NO：65-pSZ4442的核苷酸序列
THI4a5′：：CrTUB2_ScSUC2_PmPGH：：PmSAD2-2ver2_CpSAD1tp-CpalFATB2_ExtB_Flag_PmAHCY：：THI4a3′
核苷酸位置 元件名称
794-1105 CrTUB2启动子
3385-4113 PmSAD22启动子ver2
5481-5935 PmAHCY 3′UTR
2723-3166 PmPGH 3′UTR
1118-2716 ScSUC2o
4120-5472 具有转运肽的CpalFATB2_ExtB
1-787 THI4a 5′侧翼序列
3173-3378 THI4a 3′侧翼序列
5401-5472 Flag
SEQ ID NO：66-KAS_II_基因组_等位基因_1_-KASII-等位基因_1_CDS
ATGCAGACCGCGCACCAGCGGCCCCCGACCGAGGGGCACTGCTTCGGTGCGAGGCTGCCCACGGCGTCGAGGCGGGCGGTGCGCCGGGCATGGTCCCGCATCGCGCGCGCGGCGGCCGCGGCCGACGCAAACCCCGCCCGCCCTGAGCGCCGCGTGGTCATCACGGGCCAGGGCGTGGTGACCAGCCTGGGCCAGACGATCGAGCAGTTTTACAGCAGCCTGCTGGAGGGCGTGAGCGGCATCTCGCAGATACAGAAGTTCGACACCACGGGCTACACGACGACGATCGCGGGCGAGATCAAGTCGCTGCAGCTGGACCCGTACGTGCCCAAGCGCTGGGCGAAGCGCGTGGACGACGTGATAAAGTACGTCTACATCGCGGGCAAGCAGGCGCTGGAGAGCGCCGGCCTGCCGATCGAGGCGGCGGGGCTGGCGGGCGCGGGGCTGGACCCGGCGCTGTGCGGCGTGCTCATCGGCACCGCCATGGCGGGCATGACGTCTTTCGCGGCGGGCGTGGAGGCGCTGACGCGCGGCGGCGTGCGCAAGATGAACCCCTTTTGCATCCCCTTCTCCATCTCCAACATGGGCGGCGCGATGCTGGCGATGGACATCGGCTTCATGGGCCCCAACTACTCCATCTCCACGGCCTGCGCGACGGGCAACTACTGCATCCTGGGCGCGGCGGACCACATCCGGCGCGGCGACGCAAACGTGATGCTGGCCGGCGGCGCGGACGCGGCCATCATCCCCTCGGGCATCGGCGGCTTCATCGCGTGCAAGGCGCTGAGCAAGCGCAACGACGAGCCCGAGCGCGCGAGCCGGCCCTGGGACGCCGACCGCGACGGCTTCGTCATGGGCGAGGGCGCCGGCGTGCTGGTGCTGGAGGAGCTGGAGCACGCCAAGCGCCGCGGCGCGACCATTTTGGCTGAATTAGTTGGCGGCGCGGCCACCTCGGACGCGCACCACATGACCGAGCCCGACCCGCAGGGCCGCGGCGTGCGCCTCTGCCTCGAGCGCGCGCTCGAGCGCGCGCGCCTCGCGCCCGAGCGCGTCGGCTACGTCAACGCGCACGGCACCAGCACGCCCGCGGGCGACGTGGCCGAGTACCGCGCCATCCGCGCCGTCATCCCGCAGGACTCACTACGCATCAACTCCACAAAGTCCATGATCGGGCACCTGCTCGGCGGCGCCGGCGCGGTCGAGGCCGTGGCCGCCATCCAGGCCCTGCGCACCGGCTGGCTCCACCCCAACTTGAACCTCGAGAACCCCGCGCCTGGCGTCGACCCCGTCGTGCTCGTGGGGCCGCGGAAGGAGCGCGCCGAAGACCTGGACGTCGTCCTCTCCAACTCCTTTGGCTTTGGCGGGCACAATTCGTGCGTCATCTTCCGAAAGTACGACGAGTGA
SEQ ID NO：67-KAS_II_基因组_等位基因_1_-_KASII-等位基因_1_CDS_翻译
MQTAHQRPPTEGHCFGARLPTASRRAVRRAWSRIARAAAAADANPARPERRVVITGQGVVTSLGQTIEQFYSSLLEGVSGISQIQKFDTTGYTTTIAGEIKSLQLDPYVPKRWAKRVDDVIKYVYIAGKQALESAGLPIEAAGLAGAGLDPALCGVLIGTAMAGMTSFAAGVEALTRGGVRKMNPFCIPFSISNMGGAMLAMDIGFMGPNYSISTACATGNYCILGAADHIRRGDANVMLAGGADAAIIPSGIGGFIACKALSKRNDEPERASRPWDADRDGFVMGEGAGVLVLEELEHAKRRGATILAELVGGAATSDAHHMTEPDPQGRGVRLCLERALERARLAPERVGYVNAHGTSTPAGDVAEYRAIRAVIPQDSLRINSTKSMIGHLLGGAGAVEAVAAIQALRTGWLHPNLNLENPAPGVDPVVLVGPRKERAEDLDVVLSNSFGFGGHNSCVIFRKYDE
SEQ ID NO：68-KAS_II_基因组_等位基因_2_-_KASII-等位基因_2_CDS
ATGCAGACCGCGCACCAGCGGCCCCCGACCGAGGGGCACTGCTTCGGTGCGAGGCTGCCCACGGCGTCGAGGCGGGCGGTGCGCCGGGCGTGGTCCCGCATCGCGCGCGCGGCGGCCGCGGCCGACGCGACCCCCGCCCGCCCTCCGCGCCGCGTGGTCGTGACGGGCCAGGGCGTGGTGACCAGCCTGGGCCAGACGATCGAGCAGTTTTACAGCAGCCTGCTGGAGGGCGTGAGCGGCATCTCGCAGATCCAAAAGTTTGACACCACGGGCTACACGACGACGATCGCGGGCGAGATCAAGTCGCTGCAGCTGGACCCGTACGTGCCCAAGCGCTGGGCCAAGCGCGTGGACGACGTCATCAAGTACGTCTACATCGCGGGCAAGCAGGCGCTGGAGAACGCGGGGCTGCCGATCGAGGCGGCGGGGCTGGCGGGCGCGGGGCTGGACCCCGCGCTGTGCGGCGTGCTCATCGGCACCGCCATGGCGGGCATGACGTCCTTCGCGGCGGGCGTGGAGGCGCTGACGCGCGGCGGCGTGCGCAAGATGAACCCCTTTTGCATCCCCTTCTCCATCTCCAACATGGGCGGCGCGATGCTGGCGATGGACATCGGCTTCATGGGCCCCAACTACTCCATCTCCACGGCCTGCGCGACGGGCAACTACTGCATCCTGGGCGCGGCGGACCACATCCGGCGCGGCGACGCGGACGTGATGCTGGCCGGCGGCGCGGACGCGGCCATCATCCCCTCGGGCATCGGCGGCTTCATCGCGTGCAAGGCGCTGAGCAAGCGCAACGACGAGCCCGAGCGCGCGAGCCGGCCCTGGGACGCCGACCGCGACGGCTTCGTCATGGGCGAGGGCGCCGGCGTGCTGGTGCTGGAGGAGCTGGAGCACGCCAAGCGCCGCGGCGCGACCATCCTGGCCGAATTCGTCGGCGGCGCGGCCACCTCGGACGCGCACCACATGACCGAGCCGGACCCGCAGGGCCGCGGCGTGCGCCTCTGCCTCGAACGCGCGCTCGAGCGCGCGCGCCTCGCGCCCGAGCGCGTCGGCTACGTCAACGCGCACGGCACCAGCACGCCCGCGGGCGACGTGGCCGAGTACCGCGCCATCCGCGCCGTCATCCCGCAGGACTCGCTGCGCATCAACTCCACCAAGTCCATGATCGGGCACCTGCTCGGCGGCGCCGGCGCGGTCGAGGCCGTGGCCGCCATCCAGGCCCTGCGCACCGGCTGGCTCCACCCCAACCTCAACCTCGAGAACCCCGCACCCGGGGTCGACCCCGTCGTGCTCGTGGGGCCGCGCAAGGAGCGCGCCGAAGACCTCGACGTCGTCCTCTCCAACTCCTTTGGCTTCGGCGGGCACAACTCGTGCGTCATCTTCCAAAAGTACGACGAGTGA
SEQ ID NO：69-KAS_II_基因组_等位基因_2_-_KASII-等位基因_2_CDS_翻译
MQTAHQRPPTEGHCFGARLPTASRRAVRRAWSRIARAAAAADATPARPPRRVVVTGQGVVTSLGQTIEQFYSSLLEGVSGISQIQKFDTTGYTTTIAGEIKSLQLDPYVPKRWAKRVDDVIKYVYIAGKQALENAGLPIEAAGLAGAGLDPALCGVLIGTAMAGMTSFAAGVEALTRGGVRKMNPFCIPFSISNMGGAMLAMDIGFMGPNYSISTACATGNYCILGAADHIRRGDADVMLAGGADAAIIPSGIGGFIACKALSKRNDEPERASRPWDADRDGFVMGEGAGVLVLEELEHAKRRGATILAEFVGGAATSDAHHMTEPDPQGRGVRLCLERALERARLAPERVGYVNAHGTSTPAGDVAEYRAIRAVIPQDSLRINSTKSMIGHLLGGAGAVEAVAAIQALRTGWLHPNLNLENPAPGVDPVVLVGPRKERAEDLDVVLSNSFGFGGHNSCVIFQKYDE

Claims (186)

1.一种能够被异养地培养的微藻物种的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在100mM钾离子的存在下生长并且具有小于12小时的倍增时间，其中该物种的未适应的或天然存在的微藻株在至少约100mM钾离子的存在下不能生长或具有大于或等于12小时的倍增时间。
2.根据权利要求1所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在至少约100mM钾离子的存在下生长并且具有在2小时与12小时之间的倍增时间。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在至少约100mM钾离子的存在下生长并且具有在4小时与5小时之间的倍增时间。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在至少约200钾离子或钠离子的存在下生长。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的适应实验室的株，其中该物种不是海洋物种或适盐物种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够生产以干细胞重量计至少约10％的甘油三酸酯。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的适应实验室的株，其中该物种属于无绿藻属或小球藻属。
8.根据权利要求7所述的适应实验室的株，其中该物种是桑椹形无绿藻或原壳小球藻。
9.一种微藻物种的适应实验室的株，该适应实验室的株适应于糖的生长限制条件以便在相同培养条件下相对于亲本株具有增加的甘油三酸酯产率。
10.根据权利要求9所述的适应实验室的株，其中该糖的生长限制条件包括小于约1.0g/L的糖浓度。
11.根据权利要求9至10中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株相对于亲本株具有以干细胞重量计增加至少约3％的甘油三酸酯产率。
12.根据权利要求11所述的适应实验室的株，其中该甘油三酸酯产率的增加是干细胞重量的至少约5％。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够以在2小时与24小时之间的倍增时间生长。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够以在4小时与5小时之间的倍增时间生长。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的适应实验室的株，其中该物种不是海洋物种或适盐物种。
16.根据权利要求9至15中任一项所述的适应实验室的株，其中该株能够生产以干细胞重量计至少约20％的甘油三酸酯。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的适应实验室的株，其中该物种属于无绿藻属或小球藻属。
18.根据权利要求17所述的适应实验室的株，其中该物种是桑椹形无绿藻或原壳小球藻。
19.一种用于生产微藻产品的方法，该方法包括在具有高盐浓度的培养基中异养地培养微藻并且回收该微藻产品，其中该微藻适应于在该高盐条件下生长。
20.根据权利要求19所述的方法，其中该微藻产品包括甘油三酸酯或脂肪酸，并且该方法进一步包括将该甘油三酸酯或脂肪酸从该剩余的微藻生物质中分离。
21.根据权利要求20所述的方法，其中该微藻产生以干细胞重量计从约20％至约90％的甘油三酸酯。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中该微藻属于无绿藻属或小球藻属。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中将该微藻培养在钠条件或钾条件下，该钠条件或钾条件比用于亲本或天然存在的株的生长的典型条件大至少约100mM。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中向该培养基中供应的原料，该原料为植物衍生的产品，该植物衍生的产品主要是蔗糖、葡萄糖或果糖、水解的纤维素和/或水解的半纤维素。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中向该培养基中供应具有至少约100mM总的合并的钾离子或钠离子的盐浓度的原料以致于将培养基的总的合并的钾离子或钠离子浓度提高至大于50mM。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中该微藻通过在高的但亚致死的盐浓度下繁殖来进行适应。
27.根据权利要求26所述的方法，其中该微藻在该高的但亚致死的盐浓度的存在下繁殖至少10代。
28.根据权利要求19至27所述的方法，其中该高的但亚致死的盐浓度为在约100mM至约1000mM之间的总的合并的钠离子或钾离子。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，该方法进一步包括在该高的但亚致死的盐浓度的存在下在繁殖之前诱变处理该微藻。
30.根据权利要求19所述的方法，该方法进一步包括向该培养基中供应糖原料，该糖原料被去离子至与没有使用该适应的微藻的情况下所需要的程度相比更少的程度。
31.根据权利要求30所述的方法，其中该糖原料被去离子至约300mM的总的合并的钠离子和钾离子的水平。
32.根据权利要求30所述的方法，其中该糖原料被去离子至约150mM的总的合并的钠离子和钾离子的水平。
33.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其中该微藻在这种盐浓度下的倍增时间为5小时或更少。
34.根据权利要求19至33中任一项所述的方法，其中该微藻被基因工程化以生产改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度的分布。
35.根据权利要求34所述的方法，其中该微藻包括外源性酰基-ACP硫酯酶、蔗糖转化酶或脂肪去饱和酶去饱和酶中的一种或多种。
36.根据权利要求34所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树、加州月桂、细叶萼距花、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻、湿地萼距花和美洲榆。
37.根据权利要求35至36中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:31。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:58。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQID NO:42、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的方法，其中该外源性蔗糖转化酶由与SEQ IDNO:53的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的盒表达。
42.根据权利要求34至41中任一项所述的方法，其中该微藻进一步包括内源性脂肪酸去饱和酶或酰基-ACP硫酯酶的敲除或敲低。
43.根据权利要求42所述的方法，其中编码内源性脂肪酸去饱和酶的敲除或敲低的该多核苷酸与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQID NO:40和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、以及SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:47。
44.根据权利要求34至43中任一项所述的方法，其中该微藻生产具有以下脂肪酸分布特征之一的甘油三酸酯：>25％C12、>60％C18:1、>20％C18:0或>30％C12-C14，并且该方法包括将该甘油三酸酯或脂肪酸从该剩余的微藻生物质中进一步分离。
45.根据权利要求19至44中任一项所述的方法，其中该高盐浓度大于或等于约100mM总的合并的钠离子或钾离子。
46.根据权利要求19至45中任一项所述的方法，其中该高盐浓度由将高盐糖原料添加到该培养基中引起。
47.一种用于适应异养微藻的方法，该方法包括在高的但亚致死的盐浓度的存在下培养该微藻，以便产生能够在该高水平盐的存在下增加生长速率的适应的微藻。
48.根据权利要求47所述的方法，其中该高的但亚致死的盐浓度在约100mM至约1000mM的范围内。
49.根据权利要求47至48中任一项所述的方法，该方法进一步包括选择能够在高的但亚致死的盐浓度的存在下生产以干细胞重量计至少50％甘油三酸酯的适应的微藻。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中该微藻经由引入编码活性外源性硫酯酶的基因、引入编码活性外源性脂肪酸去饱和酶的基因、抑制内源性硫酯酶或抑制内源性脂肪酸去饱和酶中的一种或多种来进行基因工程化以生产改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。
51.根据权利要求50所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树、加州月桂、细叶萼距花、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻、湿地萼距花和美洲榆。
52.根据权利要求50至51中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:31。
53.根据权利要求50至52中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:58。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQID NO:42、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48。
56.根据权利要求50至55中任一项所述的方法，其中通过引入与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸来实现对内源性去饱和酶的抑制，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、以及SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47。
57.根据权利要求50至56中任一项所述的方法，其中该基因工程化在该培养之前进行以产生在该高盐的存在下能够增加生长速率的该适应的微藻。
58.根据权利要求50至56中任一项所述的方法，其中该基因工程化在该培养之后进行以产生在该高盐的存在下能够增加生长速率的该适应的微藻。
59.一种微藻株，该微藻株通过如权利要求47至58中任一项所述的方法产生。
60.一种产品，该产品通过使用如权利要求59所述的微藻株生产。
61.一种用于生产微藻产品的方法，该方法包括：在培养基中异养地培养适应于在低糖条件下生长的微藻，并且回收该微藻产品。
62.根据权利要求61所述的方法，其中该适应的微藻能够生产以干细胞重量计至少20％的甘油三酸酯，并且其中该微藻的适应导致更高的糖向脂肪酸转化的效率。
63.根据权利要求61至62中任一项所述的方法，该方法进一步包括将该甘油三酸酯或脂肪酸从该剩余的微藻生物质中分离。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中该适应的微藻能够生产以干细胞重量计约20％至约90％的甘油三酸酯。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中该微藻属于无绿藻属或小球藻属。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的方法，其中该微藻在该低糖条件的存在下繁殖至少10代。
67.根据权利要求61至66中任一项所述的方法，该方法进一步包括在该低糖条件下繁殖之前诱变处理该微藻。
68.根据权利要求61至67中任一项所述的方法，其中该低糖条件包括小于1.0g/L的糖浓度。
69.根据权利要求61至68中任一项所述的方法，其中该微藻被基因工程化以生产改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度的分布。
70.根据权利要求61至69中任一项所述的方法，其中该微藻包括外源性酰基-ACP硫酯酶或脂肪酸去饱和酶中的一种或多种。
71.根据权利要求70所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树、加州月桂、细叶萼距花、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻、湿地萼距花和美洲榆。
72.根据权利要求70至71中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:31。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:58。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。
75.根据权利要求70至74中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQID NO:42、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48。
76.根据权利要求70至75中任一项所述的方法，其中该微藻包括内源性脂肪酸去饱和酶或酰基-ACP硫酯酶的敲除或敲低。
77.根据权利要求76所述的方法，其中编码内源性脂肪酸去饱和酶的敲除或敲低的该多核苷酸与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQID NO:40和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、以及SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:47。
78.根据权利要求69至77中任一项所述的方法，其中该微藻生产具有以下脂肪酸分布特征之一的甘油三酸酯：>25％C12、>60％C18:1、>20％C18:0或>30％C12-C14，并且该方法包括将该甘油三酸酯或脂肪酸从该剩余的微藻生物质中进一步分离。
79.一种用于适应异养微藻的方法，该方法包括在低浓度糖的存在下培养该微藻。
80.根据权利要求79所述的方法，其中该糖浓度为小于约1.0g/L。
81.根据权利要求79至80中任一项所述的方法，该方法进一步包括选择能够生产以干细胞重量计至少50％甘油三酸酯的适应的微藻。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的方法，其中该微藻经由引入编码活性外源性硫酯酶的基因、引入编码活性外源性脂肪酸去饱和酶的基因、抑制内源性硫酯酶或抑制内源性脂肪酸去饱和酶中的一种或多种来进行基因工程化以生产改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。
83.根据权利要求82所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树、加州月桂、细叶萼距花、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻、湿地萼距花和美洲榆。
84.根据权利要求82至83中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:31。
85.根据权利要求82至84中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:58。
86.根据权利要求82至85中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。
87.根据权利要求82至86中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQID NO:42、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48。
88.根据权利要求82至87中任一项所述的方法，其中通过引入与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸来实现对内源性去饱和酶的抑制，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、以及SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47。
89.根据权利要求82至88中任一项所述的方法，其中该基因工程化是在通过在低浓度糖的存在下培养使该微藻适应之前进行。
90.根据权利要求82至88中任一项所述的方法，其中该基因工程化是在通过在低浓度糖的存在下培养使该微藻适应之后进行。
91.一种微藻株，该微藻株通过如权利要求79至90中任一项所述的方法产生。
92.一种产品，该产品通过使用如权利要求91所述的微藻株生产。
93.一种适应实验室的微藻株，该适应实验室的微藻株的特征在于当在相同条件下培养时，比该物种的亲本株或天然存在的株大5％的生长速率。
94.一种微藻物种的适应实验室的株，该适应实验室的株能够在包含甘蔗汁、甜菜汁、糖蜜或高粱汁的培养基中被异养地培养，其中该甘蔗汁、甜菜汁、糖蜜或高粱汁包括钾离子和/或钠离子，其中该培养基包含至少100mM总的合并的钾离子和钠离子，其中该适应实验室的株在这些条件下具有小于12小时的倍增时间，并且其中该天然存在的株在100mM总的合并的钾离子和钠离子的存在下不能生长或具有大于或等于12小时的倍增时间。
95.根据权利要求94所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在100mM总的合并的钾离子和钠离子的存在下生长，并且具有在2小时与12小时之间的倍增时间。
96.根据权利要求94所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在100mM总的合并的钾离子和钠离子的存在下生长，并且具有在4小时与5小时之间的倍增时间。
97.根据权利要求94所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在100mM总的合并的钾离子和钠离子的存在下生长，并且具有8小时或更少的倍增时间。
98.根据权利要求94至97中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在250mM总的合并的钾离子或钠离子的存在下生长。
99.根据权利要求94至98中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在350mM总的合并的钾离子或钠离子的存在下生长。
100.根据权利要求94至99中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在450mM总的合并的钾离子或钠离子的存在下生长。
101.根据权利要求94至100中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够在550mM总的合并的钾离子或钠离子的存在下生长。
102.根据权利要求94至101中任一项所述的适应实验室的株，其中该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁是去离子的。
103.根据权利要求94至102中任一项所述的适应实验室的株，其中该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁不是去离子的。
104.根据权利要求94至103中任一项所述的适应实验室的株，其中该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁是部分去离子的。
105.根据权利要求104所述的适应实验室的株，其中该甘蔗汁、甜菜汁或高粱汁被去离子至约300mM总的合并的钾离子和钠离子的水平。
106.根据权利要求94至105中任一项所述的适应实验室的株，其中该物种不是海洋物种或适盐物种。
107.根据权利要求94至106中任一项所述的适应实验室的株，其中该适应实验室的株能够生产以干细胞重量计10％-90％的脂肪酸。
108.根据权利要求94至107中任一项所述的适应实验室的株，其中该物种属于无绿藻属或小球藻属。
109.根据权利要求108所述的适应实验室的株，其中该物种是桑椹形无绿藻或原壳小球藻。
110.一种具有改进的糖转化至甘油三酸酯的效率的改进的微藻株，该改进的微藻株通过分离暴露于可替代的氧化酶抑制剂的亲本微藻株的突变体而产生。
111.根据权利要求110所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株属于不是海洋物种或适盐物种的物种。
112.根据权利要求110至111中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株能够生产以干细胞重量计10％至90％的甘油三酸酯。
113.根据权利要求110至112中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株属于无绿藻属或小球藻属的物种。
114.根据权利要求113所述的改进的微藻株，其中该物种是桑椹形无绿藻或原壳小球藻。
115.根据权利要求110至114中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株能够生产以干细胞重量计至少50％的甘油三酸酯。
116.根据权利要求110至115中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株进一步包括至少一种外源性脂肪酸生物合成基因。
117.根据权利要求116所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株包括一种或多种外源性酰基-ACP硫酯酶和脂肪酸去饱和酶。
118.根据权利要求117所述的改进的微藻株，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树、加州月桂、细叶萼距花、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻、湿地萼距花和美洲榆。
119.根据权利要求116至118中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。
120.根据权利要求116至119中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:58。
121.根据权利要求116至120中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。
122.根据权利要求116至121中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48。
123.一种相对于亲本微藻株具有改进的油滴度的改进的微藻株，其中该改进的微藻株通过分离已暴露于水杨基氧肟酸(SHAM)的亲本微藻株的突变体来产生。
124.一种相对于亲本微藻株具有改进的油滴度的改进的微藻株，其中该改进的微藻株通过分离已暴露于单糖转运蛋白抑制剂的亲本微藻株的突变体来产生。
125.根据权利要求124所述的改进的微藻株，其中该单糖转运蛋白抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：根皮苷、细胞松弛素B、2-脱氧葡萄糖、地高辛和乌本苷。
126.一种相对于亲本微藻株具有改进的油滴度的改进的微藻株，其中该改进的微藻株通过分离已暴露于2-脱氧葡萄糖的亲本微藻株的突变体来产生。
127.根据权利要求123至126中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株相对于该亲本微藻株具有至少5％的油滴度改进。
128.一种能够生产具有比亲本微藻株更高百分比的C18:0和/或C18:1的油的改进的微藻株，其中该改进的微藻株通过分离已暴露于β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂和/或烯酰基:酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂的亲本微藻株的突变体来产生。
129.根据权利要求128所述的改进的微藻株，其中该抑制剂包括浅蓝菌素。
130.根据权利要求128所述的改进的微藻株，其中该抑制剂包括三氯生。
131.根据权利要求128至130中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株具有至少10％的C18:0和/或C18:1百分比改进。
132.根据权利要求128至131中任一项所述的改进的微藻株，其中该微藻株能够生产包含至少70％C18:0和/或C18:1的脂肪酸。
133.根据权利要求128至132中任一项所述的改进的微藻株，其中该油滴度为该亲本微藻株的油滴度的至少98％。
134.根据权利要求128至133中任一项所述的改进的微藻株，其中该油滴度比该亲本微藻株的油滴度大至少5％。
135.根据权利要求128至134中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株属于不是海洋物种或适盐物种的物种。
136.根据权利要求128至135中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株能够生产以干细胞重量计10％至90％的甘油三酸酯。
137.根据权利要求128至136中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株属于无绿藻属或小球藻属的物种。
138.根据137所述的改进的微藻株，其中该物种是桑椹形无绿藻或原壳小球藻。
139.根据权利要求128至138中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株能够生产以干细胞重量计至少50％的甘油三酸酯。
140.根据权利要求128至139中任一项所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株是基因工程化的株。
141.根据权利要求140所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株包括至少一种外源性脂肪酸生物合成基因。
142.根据权利要求141所述的改进的微藻株，其中该改进的微藻株包括一种或多种选自下组的外源基因，该组由以下各项组成：酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸去饱和酶和β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)。
143.根据权利要求140所述的改进的微藻株，其中该微藻经由引入编码活性外源性硫酯酶的基因、引入编码活性外源性脂肪酸去饱和酶的基因、引入编码活性外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)的基因、抑制内源性硫酯酶或抑制内源性脂肪酸去饱和酶中的一种或多种来进行基因工程化以生产改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。
144.根据权利要求142至143中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树、加州月桂、细叶萼距花、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻、湿地萼距花和美洲榆。
145.根据权利要求142至144中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。
146.根据权利要求142至145中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:58。
147.根据权利要求142至146中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。
148.根据权利要求142至147中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48。
149.根据权利要求142至148中任一项所述的改进的微藻株，其中该外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:68。
150.根据权利要求143至149中任一项所述的改进的微藻株，其中通过引入与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸来实现对内源性去饱和酶的抑制，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、以及SEQID NO:46和SEQ ID NO:47。
151.根据权利要求128至150中任一项所述的改进的微藻株，其中在将该亲本微藻株暴露于该单糖转运蛋白抑制剂、2-脱氧葡萄糖、水杨基氧肟酸(SHAM)或β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基:酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂之前进行基因工程化。
152.根据权利要求128至150中任一项所述的改进的微藻株，其中在将亲本微藻株暴露于单糖转运蛋白抑制剂、2-脱氧葡萄糖、水杨基氧肟酸(SHAM)或β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基:酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂之后进行基因工程化。
153.根据权利要求143至152中任一项所述的改进的微藻株，其中将该微藻经由抑制内源性硫酯酶和引入编码活性外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)进行基因工程化以产生改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。
154.根据权利要求153所述的改进的微藻株，其中该引入的基因包括KASII。
155.根据权利要求154所述的改进的微藻株，其中该外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:68。
156.根据权利要求151至155中任一项所述的改进的微藻株，其中该微藻株能够生产包含至少70％C18:0和/或C18:1的脂肪酸。
157.一种产品，该产品通过使用如权利要求128至156中任一项所述的改进的微藻株生产。
158.一种用于产生改进的微藻株的方法，该方法包括在水杨基氧肟酸(SHAM)的存在下培养亲本微藻株，并且分离能够在水杨基氧肟酸(SHAM)的存在下生长的亲本微藻株的突变体。
159.一种用于产生改进的微藻株的方法，该方法包括在单糖转运蛋白抑制剂的存在下培养亲本微藻株，并且分离能够在单糖转运蛋白抑制剂的存在下生长的亲本微藻株的突变体。
160.根据权利要求159所述的方法，其中该单糖转运蛋白抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：根皮苷、细胞松弛素B、2-脱氧葡萄糖、地高辛和乌本苷。
161.一种用于产生改进的微藻株的方法，该方法包括在2-脱氧葡萄糖的存在下培养亲本微藻株，并且分离能够在2-脱氧葡萄糖的存在下生长的亲本微藻株的突变体。
162.一种用于产生改进的微藻株的方法，该方法包括在β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基:酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂的存在下培养亲本微藻株，并且分离能够在该抑制剂的存在下生长的亲本微藻株的突变体。
163.根据权利要求162所述的方法，其中该抑制剂包括浅蓝菌素。
164.根据权利要求162所述的方法，其中该抑制剂包括三氯生。
165.根据权利要求160至164中任一项所述的方法，其中该亲本微藻株属于不是海洋物种或适盐物种的物种。
166.根据权利要求160至165中任一项所述的方法，其中该改进的微藻株能够生产以干细胞重量计10％至90％的甘油三酸酯。
167.根据权利要求160至166中任一项所述的方法，其中该改进的微藻株属于无绿藻属或小球藻属的物种。
168.根据167所述的方法，其中该物种是桑椹形无绿藻或原壳小球藻。
169.根据权利要求160至168中任一项所述的方法，其中该改进的微藻株能够生产以干细胞重量计至少50％的甘油三酸酯。
170.根据权利要求160至169中任一项所述的方法，其中该改进的微藻株是基因工程化的株。
171.根据权利要求170所述的方法，其中该改进的微藻株包括至少一种外源性脂肪酸生物合成基因。
172.根据权利要求171所述的方法，其中该改进的微藻株包括一种或多种选自下组的外源基因，该组由以下各项组成：酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸去饱和酶和β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)。
173.根据权利要求170所述的方法，其中该微藻经由引入编码活性外源性硫酯酶的基因、引入编码活性外源性脂肪酸去饱和酶的基因、引入编码活性外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)的基因、抑制内源性硫酯酶或抑制内源性去饱和酶中的一种或多种来进行基因工程化以产生改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。
174.根据权利要求172至173中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶来自选自下组的植物，该组由以下各项组成：樟树、加州月桂、细叶萼距花、湿地萼距花、披针叶萼距花、德国鸢尾、肉豆蔻、湿地萼距花和美洲榆。
175.根据权利要求172至174中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶与选自下组的多肽具有至少约60％序列同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:31。
176.根据权利要求172至175中任一项所述的方法，其中该外源性酰基-ACP硫酯酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:58。
177.根据权利要求172至175中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶选自下组，该组由以下各项组成：Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)、硬脂酰-ACP去饱和酶2A(SAD2A)和硬脂酰-ACP去饱和酶2B(SAD2B)。
178.根据权利要求172至175中任一项所述的方法，其中该外源性脂肪酸去饱和酶由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48。
179.根据权利要求172至176中任一项所述的方法，其中该外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:68。
180.根据权利要求172至177中任一项所述的方法，其中通过引入与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸来实现对内源性去饱和酶的抑制，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、以及SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47。
181.根据权利要求170所述的方法，其中该基因工程化在将该亲本微藻株暴露于该单糖转运蛋白抑制剂、2-脱氧葡萄糖、或β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基:酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂之前进行。
182.根据权利要求170所述的方法，其中该基因工程化在将该亲本微藻株暴露于该单糖转运蛋白抑制剂、2-脱氧葡萄糖、水杨基氧肟酸(SHAM)或β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)抑制剂或烯酰基:酰基载体蛋白(ACP)还原酶抑制剂之后进行。
183.根据权利要求173至182中任一项所述的方法，其中将该微藻经由抑制内源性硫酯酶和引入编码活性外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)进行基因工程化以产生改变的脂肪酸链长度和/或脂肪酸饱和度分布。
184.根据权利要求180所述的方法，其中该引入的基因包括KASII。
185.根据权利要求180至184中任一项所述的方法，其中该外源性β-酮脂酰-ACP合酶(KAS)由与选自下组的多核苷酸具有至少约60％序列同一性的多核苷酸编码，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:68。
186.根据权利要求180至185中任一项所述的方法，其中该微藻株能够生产包含至少70％C18:0和/或C18:1的脂肪酸。
CN201680033198.0A 2015-03-31 2016-03-30 适应于异养培养条件的微藻 Pending CN107889502A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562141167P 2015-03-31 2015-03-31
US62/141,167 2015-03-31
PCT/US2016/025023 WO2016160999A1 (en) 2015-03-31 2016-03-30 Microalgae adapted for heterotrophic culture conditions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107889502A true CN107889502A (zh) 2018-04-06

Family

ID=55745842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680033198.0A Pending CN107889502A (zh) 2015-03-31 2016-03-30 适应于异养培养条件的微藻

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11352602B2 (zh)
EP (2) EP3447124B1 (zh)
CN (1) CN107889502A (zh)
AU (1) AU2016243648A1 (zh)
BR (1) BR112017020906A2 (zh)
CA (1) CA2981278A1 (zh)
ES (1) ES2908296T3 (zh)
MX (1) MX2017012554A (zh)
WO (1) WO2016160999A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110184379A (zh) * 2019-06-06 2019-08-30 武汉市农业科学院 一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用
CN110241047A (zh) * 2019-06-27 2019-09-17 浙江大学 一种利用三氯生筛选直线形螺旋藻藻丝的方法
TWI869104B (zh) * 2023-12-11 2025-01-01 南亞塑膠工業股份有限公司 藍綠菌的培養方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115485314B (zh) 2019-12-18 2024-03-26 格纹蛱蝶公司 微生物衍生材料在聚合物应用中的用途
EP4208528B1 (en) 2021-09-17 2025-04-02 Checkerspot, Inc. High oleic oil compositions and uses thereof
WO2023091669A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Checkerspot, Inc. Recycled polyurethane formulations
WO2023102069A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Checkerspot, Inc. Polyols, polyurethane dispersions, and uses thereof

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008059562A1 (de) * 2007-11-28 2009-07-23 Roquette Frères Neues Kultivierungsverfahren einer heterotrophen Mikroalge
WO2010127182A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Evolugate, Llc Adapting microorganisms for agricultural products
CN102300996A (zh) * 2008-11-28 2011-12-28 索拉兹米公司 在异养型微生物中制备特制油
CN102656267A (zh) * 2009-09-15 2012-09-05 蓝宝石能源公司 耐盐生物
US20120225472A1 (en) * 2008-11-07 2012-09-06 Kuehnle Agrosystems, Inc. Preservation and composition of bioprocess algae for production of lipids, seedstock, and feed
WO2013005209A2 (en) * 2011-07-04 2013-01-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Enhanced lipid production by algae
US20140113340A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-24 Masdar Institute Of Science And Technology High salinity tolerant microalgae strains, products derived therefrom, and methods of producing the same
WO2014060973A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-24 Indian Oil Corporation Limited Improved microalgae strains and use thereof
CN104277976A (zh) * 2014-10-22 2015-01-14 临沂大学 盐生杜氏藻提纯和驯化方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7135290B2 (en) 2003-04-12 2006-11-14 Solazyme, Inc. Methods and compositions for evolving hydrogenase genes
EP2351845A1 (en) 2007-06-01 2011-08-03 Solazyme, Inc. Renewable chemicals and fuels from oleaginous yeast
DE202007015084U1 (de) 2007-10-30 2009-03-12 Seda S.P.A., Arzano Behälter
WO2009126843A2 (en) 2008-04-09 2009-10-15 Solazyme, Inc. Direct chemical modification of microbial biomass and microbial oils
US8278090B1 (en) 2008-07-03 2012-10-02 Solazyme, Inc. Heterotrophic cultivation of hydrocarbon-producing microalgae
AU2009303354C9 (en) 2008-10-14 2017-09-07 Corbion Biotech, Inc. Food compositions of microalgal biomass
CN102215796B (zh) 2008-10-14 2014-10-29 耳蜗有限公司 植入式听力假体
AU2010226882A1 (en) 2009-10-01 2011-04-21 George Tsohas Method and system for enabling the design, manufacture, and/or acquisition of custom made jewellery
WO2011038463A1 (en) 2009-10-02 2011-04-07 Newcastle Innovation Limited Supercapacitor electrodes
EP2576800B1 (en) * 2010-05-28 2019-01-30 Corbion Biotech, Inc. Method for producing oils from Prototheca
SG10201509035WA (en) 2010-11-03 2015-12-30 Solazyme Inc Microbial Oils With Lowered Pour Points, Dielectric Fluids Produced Therefrom, And Related Methods
JP2014509188A (ja) 2011-01-28 2014-04-17 アルガサイツ リミテッド 微細藻類、藍藻類及びそれらの代謝産物の産生のためのプロセス
CN110066836A (zh) 2011-02-02 2019-07-30 柯碧恩生物技术公司 产自重组产油微生物的定制油
WO2013071029A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 The Texas A&M University System Methods and products for generating oils
US8778643B2 (en) * 2012-03-15 2014-07-15 The Regents Of The University Of California Methods for increasing lipid levels and producing triacylglycerols in algae
EP2839018B1 (en) 2012-04-18 2019-06-05 Corbion Biotech, Inc. Tailored oils
BR112015013193A2 (pt) 2012-12-07 2017-07-11 Solazyme Inc ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula, método para obter óleo microbiano, óleo microbiano, e, método para obter óleo microbiano.
MX369685B (es) * 2013-10-04 2019-11-19 Terravia Holdings Inc Aceites adaptables.

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008059562A1 (de) * 2007-11-28 2009-07-23 Roquette Frères Neues Kultivierungsverfahren einer heterotrophen Mikroalge
US20120225472A1 (en) * 2008-11-07 2012-09-06 Kuehnle Agrosystems, Inc. Preservation and composition of bioprocess algae for production of lipids, seedstock, and feed
CN102300996A (zh) * 2008-11-28 2011-12-28 索拉兹米公司 在异养型微生物中制备特制油
WO2010127182A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Evolugate, Llc Adapting microorganisms for agricultural products
CN102656267A (zh) * 2009-09-15 2012-09-05 蓝宝石能源公司 耐盐生物
WO2013005209A2 (en) * 2011-07-04 2013-01-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Enhanced lipid production by algae
US20140113340A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-24 Masdar Institute Of Science And Technology High salinity tolerant microalgae strains, products derived therefrom, and methods of producing the same
WO2014060973A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-24 Indian Oil Corporation Limited Improved microalgae strains and use thereof
CN104277976A (zh) * 2014-10-22 2015-01-14 临沂大学 盐生杜氏藻提纯和驯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIE-MATHILDE PERRINEAU ET AL.: "Evolution of salt tolerance in a laboratory reared population of Chlamydomonas reinhardtii", 《ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
陈梅等: "高油脂产量微藻的选育方法及研究进展", 《安徽农业科学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110184379A (zh) * 2019-06-06 2019-08-30 武汉市农业科学院 一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用
CN110184379B (zh) * 2019-06-06 2022-12-27 武汉市农业科学院 一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用
CN110241047A (zh) * 2019-06-27 2019-09-17 浙江大学 一种利用三氯生筛选直线形螺旋藻藻丝的方法
CN110241047B (zh) * 2019-06-27 2021-02-02 浙江大学 一种利用三氯生筛选直线形螺旋藻藻丝的方法
TWI869104B (zh) * 2023-12-11 2025-01-01 南亞塑膠工業股份有限公司 藍綠菌的培養方法

Also Published As

Publication number Publication date
MX2017012554A (es) 2018-04-11
EP3447124B1 (en) 2021-12-22
US20180163170A1 (en) 2018-06-14
WO2016160999A1 (en) 2016-10-06
ES2908296T3 (es) 2022-04-28
EP3447124A1 (en) 2019-02-27
US11352602B2 (en) 2022-06-07
BR112017020906A2 (pt) 2018-07-10
EP3277793A1 (en) 2018-02-07
CA2981278A1 (en) 2016-10-06
AU2016243648A1 (en) 2017-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3447124B1 (en) Microalgae adapted for heterotrophic culture conditions
KR101763878B1 (ko) 종속영양성 미생물에서 맞춤 오일의 생성
CN104126006B (zh) 包括原藻脂质通路基因的基因工程化的微生物株系
KR101964965B1 (ko) 재조합 유지성 미생물로부터 생산된 맞춤 오일
EP3167053B1 (en) Novel ketoacyl acp synthase genes and uses thereof
US10125382B2 (en) Acyl-ACP thioesterases and mutants thereof
CN104968788A (zh) 包括原始小球藻脂质途径基因的基因工程化微生物菌株
Kasai et al. Construction of a self-cloning system in the unicellular green alga Pseudochoricystis ellipsoidea
CN110423705A (zh) 用于通过添加交替电子受体改善微生物中的产品收率和产量的方法
EP2970926B1 (en) Engineering microorganisms
KR20150128770A (ko) 티오에스테라아제 및 맞춤형 오일 생산용 세포
US20160251685A1 (en) Thioesterases and cells for production of tailored oils
Zhang et al. Manipulation of triacylglycerol biosynthesis in Nannochloropsis oceanica by overexpressing an Arabidopsis thaliana diacylglycerol acyltransferase gene
CN107208035A (zh) 含油酵母变体、其获得方法及其用于脂质生产的用途
CN116848228A (zh) 具有高脂质生产率的重组藻类
BR112020003772A2 (pt) linhagens microbianas e usos das mesmas
Kasai et al. Development of efficient genetic-transformation-and genome-editing systems, and the isolation of a CRISPR/Cas9-mediated high-oil mutant in the unicellular green alga Parachlorella kessleri strain NIES-2152
CN111433219A (zh) 通过基因修饰信号传导蛋白提高藻类脂质生产力
US20160264985A1 (en) Microorganisms for fatty acid production using elongase and desaturase enzymes
WO2024097353A1 (en) Recombinant algae having high biomass and lipid productivity
Le Gal et al. Marine microorganisms for industry
HK1220485B (zh) 工程化微生物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180406

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication