CN104277976A - 盐生杜氏藻提纯和驯化方法 - Google Patents
盐生杜氏藻提纯和驯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104277976A CN104277976A CN201410563181.9A CN201410563181A CN104277976A CN 104277976 A CN104277976 A CN 104277976A CN 201410563181 A CN201410563181 A CN 201410563181A CN 104277976 A CN104277976 A CN 104277976A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- algae
- liquid
- dunaliella salina
- milliliters
- add
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 241000195632 Dunaliella tertiolecta Species 0.000 title 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims abstract description 50
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 40
- 241000195633 Dunaliella salina Species 0.000 claims abstract description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 14
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000013535 sea water Substances 0.000 claims description 6
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 4
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 2
- -1 24 milligrams Chemical compound 0.000 claims 1
- 241000272875 Ardeidae Species 0.000 claims 1
- 241001131796 Botaurus stellaris Species 0.000 claims 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000003447 Pistacia vera Nutrition 0.000 claims 1
- 240000006711 Pistacia vera Species 0.000 claims 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 claims 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- 235000020233 pistachio Nutrition 0.000 claims 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 13
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 3
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 abstract description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 abstract description 2
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000195634 Dunaliella Species 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 3
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 3
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 3
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 3
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 3
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 2
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 208000003556 Dry Eye Syndromes Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000001140 Night Blindness Diseases 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009318 large scale farming Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 1
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种盐生杜氏藻提纯和驯化方法，属水产养殖领域。微藻提纯传统上常用微吸管分离法，该法易找到特定的种类，设备也较简单，但操作难度较大，往往需要几次至十几次才能成功，且仅适于分离个体较大藻类。本发明提供的盐生杜氏藻的液枪提纯法，原理是：将藻液稀释到每100微升藻液恰好含有1个盐生杜氏藻细胞，后用液枪吸取100微升藻液到装有已经配好的培养基的试管中，放在光照培养箱中培养45-60天后，用显微镜检查试管中藻液，如试管藻液中只含有盐生杜氏藻一种细胞，说明分离成功，抛弃那些有杂藻或原生动物的试管。本法操作简便，省时省力，设备简单，成功率高，易于推广。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种盐生杜氏藻提纯和驯化方法。
背景技术
盐生杜氏藻Dunaliella salina是一种生活在内陆盐湖的双鞭毛单细胞真核生物，可耐高盐度(20-300‰)。杜氏藻在胁迫条件下可大量积累β-胡萝卜素，最高可达干重的14％，为自然界所有生物之首，因此早在1966年，Massyuk就提出可大规模培养杜氏藻生产β-胡萝卜素，另外杜氏藻含有的甘油可达干重的40％，具有生产甘油的潜在前途。β-胡萝卜素有猝灭人体自由基、延缓衰老、抑制肿瘤转化及抗癌等生物活性功能，受到广泛瞩目。临床试验表明，盐生杜氏藻提取的盐藻素对调节血压、降低血脂、降血糖、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、胃溃疡、胃炎、白内障、夜盲症、干眼病有较好疗效且可明显提高机体免疫力。盐生杜氏藻还是一种良好的水产动物饲料，美国、澳大利亚、以色列、日本等很早就开始了杜氏藻研究并逐步进入规模化养殖，我国拥有漫长的海岸线和众多内陆盐湖，具有开展盐生杜氏藻生产优越的自然条件。
在盐生杜氏藻培养过程中，常出现这样一个难题：随着培养时间的延长，藻液中逐渐滋生了很多细菌、原生动物、杂藻等，且数量越来越多，严重影响了藻类的继续繁殖和生长，抑制了藻类产量的提高，需要对藻种进行提纯。微藻提纯传统上最常用的是微吸管分离法，其原理是：在无菌操作条件下，用极细的微吸管，在显微镜下把目标藻样从一个小水体转移到另一个试管，采用同样的方法反复操作，直到镜检水滴中只有目标单种为止。具体方法是：在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管，分离操作时，用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上，在显微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞，放松手指，藻细胞被吸入微吸管；接着把吸出的水滴放在另一载玻片上，显微镜检查水滴中是否只吸到藻细胞，如此反复操作，直至达到单种分离的目的，然后把分离出的藻细胞冲入预先装有培养液的试管内，放在适宜的光照和温度下培养，试管有藻色后镜检，培养为单种的试管，其它不合格的弃掉。该法易找到特定的种类，所用设备也较简单，但操作技术难度较大，吸取一个单细胞往往需要几次至十几次才能成功，且仅适于分离螺旋藻、骨条藻等个体较大或丝状藻类，较小藻类用此法则比较困难。
微藻提纯除微吸管分离法外，还有水滴分离法、固体培养基分离法、喷雾法、划线法等，这几种方法或多或少存在着操作繁琐麻烦、工作量大、目的性差、难度系数高、仪器复杂、设备昂贵等缺点。为了克服传统技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻的液枪提纯法，其原理是：将混有杂藻或原生动物的藻液稀释到每100微升藻液恰好含有1个盐生杜氏藻细胞的程度，然后用液枪吸取100微升藻液到装有已经配好的培养基的试管中，将试管放在光照培养箱中培养45-60天后，用显微镜检查试管中的藻液，如果试管藻液中只含有盐生杜氏藻一种细胞，说明分离成功，抛弃那些有杂藻或原生动物的试管。本法操作简便，省时省力，设备简单，成功率高，易于推广，花钱少，效益高。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻的液枪提纯法，方法如下：
步骤1：培养液的配制：硝酸铵60毫克，尿素24毫克，磷酸二氢钾16毫克，碳酸氢钠300毫克，柠檬酸铁3毫克，海泥浸出液1毫升，f/2微量元素溶液1毫升，f/2维生素溶液1毫升，煮沸冷却后的海水1000毫升；
步骤2：取消毒过且带螺旋盖的试管100只，分别装入上述培养液10毫升，盖上螺旋盖，插入试管架，备用；
步骤3：取一1500毫升消毒过的三角烧瓶，装入步骤1所述培养液100毫升，用液枪转移2微升密度为每毫升50万个细胞、带有杂藻的藻液，摇匀，备用；
步骤4：用液枪吸取100微升步骤3的藻液加入到步骤2中的试管中，盖好螺旋盖，轻轻摇匀，放在光照强度4000lux，温度25℃的光照培养箱中培养，每天轻轻摇动3次，45-60天后可见培养液呈淡草绿色，用显微镜逐一检查，如果藻液中只有盐生杜氏藻而没有杂藻或原生动物，即可将试管中的藻液转移到100毫升的三角烧瓶中，再加入50毫升步骤1所述的培养液，继续培养7天，提纯完毕。
另外，盐生杜氏藻原产地是盐度为350‰的内陆盐湖即饱和卤水，经过驯化以后可以在盐度为30‰的普通海水中生长、发育和繁殖，具体驯化方法是：取一个消毒过的500毫升的的三角烧瓶，加入100毫升饱和卤水培养的藻液，补充20毫升步骤1所述的培养液，加入0.5毫克α-萘乙酸，再用液枪加入3微升丙二醇，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，放在光照4000lux，温度为25℃的光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在同一光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在光照培养箱中继续培养，如此反复，加入30次也就是300毫升蒸馏水，此时用显微镜检查，可见盐生杜氏藻生长正常，游泳活泼，驯化完毕。
有益结果
微藻提纯传统上最常用的是微吸管分离法，其原理是：在无菌操作条件下，用极细的微吸管，在显微镜下把目标藻样从一个小水体转移到另一个试管，采用同样的方法反复操作，直到镜检水滴中只有目标单种为止。该法特点是易找到特定的种类，所用设备也较简单，但操作技术难度较大，吸取一个单细胞往往需要几次至十几次才能成功，且仅适于分离个体较大或丝状藻类，如螺旋藻、骨条藻等，较小藻类用此法比较困难。微藻提纯除微吸管分离法外，还有水滴分离法、固体培养基分离方法、喷雾法、划线法等，这几种方法或多或少存在着工作较繁琐、工作量大、目的性较差、难度系数高、操作麻烦、仪器复杂、设备昂贵等缺点。为了克服传统技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻的液枪提纯法。本法操作简便，省时省力，设备简单，成功率高，易于推广，花钱少，效益高。
附图说明
图1为盐生杜氏藻液枪提纯法具体操作步骤；
图2为盐生杜氏藻驯化方法具体操作步骤。
具体实施方式
一种盐生杜氏藻的液枪提纯方法，步骤如下：
步骤1，培养液的配制：硝酸铵60毫克，尿素24毫克，磷酸二氢钾16毫克，碳酸氢钠300毫克，柠檬酸铁3毫克，海泥浸出液1毫升，f/2微量元素溶液1毫升，f/2维生素溶液1毫升，煮沸冷却后的海水1000毫升；步骤2，取消毒过且带螺旋盖的试管100只，分别装入上述培养液10毫升，盖上螺旋盖，插入试管架，备用；步骤3，取一1500毫升消毒过的三角烧瓶，装入步骤1所述培养液100毫升，用液枪转移2微升密度为每毫升50万个细胞、带有杂藻的藻液，摇匀，备用；步骤4，用液枪吸取100微升步骤3的藻液加入到步骤2中的试管中，盖好螺旋盖，轻轻摇匀，放在光照强度4000lux，温度25℃的光照培养箱中培养，每天轻轻摇动3次，45-60天后可见培养液呈淡草绿色，用显微镜逐一检查，如果藻液中只有盐生杜氏藻而没有杂藻或原生动物，即可将试管中的藻液转移到100毫升的三角烧瓶中，再加入50毫升步骤1所述的培养液，继续培养7天，提纯完毕。
所述的一种盐生杜氏藻的液枪提纯方法得到的盐生杜氏藻的驯化方法，步骤如下：
盐生杜氏藻原产地是盐度为350‰的内陆盐湖即饱和卤水，经过驯化以后能在盐度为30‰的普通海水中生长、发育和繁殖，具体驯化方法是：取一个消毒过的500毫升的的三角烧瓶，加入100毫升饱和卤水培养的藻液，补充20毫升步骤1所述的培养液，加入0.5毫克α-萘乙酸，再用液枪加入3微升丙二醇，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，放在光照4000lux，温度为25℃的光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在同一光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在光照培养箱中继续培养，如此反复，加入30次也就是300毫升蒸馏水，此时用显微镜检查，可见盐生杜氏藻生长正常，游泳活泼，驯化完毕。
步骤1中f/2微量元素溶液配方：ZnSO4·4H2O 23毫克，MnCl2·4H2O 178毫克，CuSO4·5H2O10毫克，FeC6H5O7·5H2O 3.9克，Na2MoO4·2H2O 7.3毫克，CoCl2·6H2O 12毫克，Na2EDTA 4.35克，蒸馏水1000毫升；
步骤1中f/2维生素溶液配方：维生素B12 0.5毫克，维生素B1 100毫克，维生素H0.5毫克，蒸馏水1000毫升；
步骤1中海泥浸出液制备方法：取比较肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2份淡水，充分搅拌均匀，静置2分钟，取上层泥浆于铝锅中，按每1000毫升泥浆加1克NaOH的量加入NaOH，煮沸25分钟。煮时需不断搅拌均匀，煮后静置、冷却24小时取上清液备用；
步骤1中的柠檬酸铁(FeC6H5O7·5H2O)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；
步骤1、2、3、4中所有操作均需在超净工作台上进行，以达无菌操作目的；
步骤1中所用化学药品均需分析纯级别。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.一种盐生杜氏藻的液枪提纯方法，其特征在于步骤如下：
步骤1，培养液的配制：硝酸铵60毫克，尿素24毫克，磷酸二氢钾16毫克，碳酸氢钠300毫克，柠檬酸铁3毫克，海泥浸出液1毫升，f/2微量元素溶液1毫升，f/2维生素溶液1毫升，煮沸冷却后的海水1000毫升；步骤2，取消毒过且带螺旋盖的试管100只，分别装入上述培养液10毫升，盖上螺旋盖，插入试管架，备用；步骤3，取一1500毫升消毒过的三角烧瓶，装入步骤1所述培养液100毫升，用液枪转移2微升密度为每毫升50万个细胞、带有杂藻的藻液，摇匀，备用；步骤4，用液枪吸取100微升步骤3的藻液加入到步骤2中的试管中，盖好螺旋盖，轻轻摇匀，放在光照强度4000lux，温度25℃的光照培养箱中培养，每天轻轻摇动3次，45-60天后可见培养液呈淡草绿色，用显微镜逐一检查，如果藻液中只有盐生杜氏藻而没有杂藻或原生动物，即可将试管中的藻液转移到100毫升的三角烧瓶中，再加入50毫升步骤1所述的培养液，继续培养7天，提纯完毕。
2.如权利要求1所述的一种盐生杜氏藻的液枪提纯方法得到的盐生杜氏藻的驯化方法，其特征在于步骤如下：
盐生杜氏藻原产地是盐度为350％的内陆盐湖即饱和卤水，经过驯化以后能在盐度为30‰的普通海水中生长、发育和繁殖，具体驯化方法是：取一个消毒过的500毫升的的三角烧瓶，加入100毫升饱和卤水培养的藻液，补充20毫升步骤1所述的培养液，加入0.5毫克α-萘乙酸，再用液枪加入3微升丙二醇，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，放在光照40001ux，温度为25℃的光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在同一光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在光照培养箱中继续培养，如此反复，加入30次也就是300毫升蒸馏水，此时用显微镜检查，可见盐生杜氏藻生长正常，游泳活泼，驯化完毕。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410563181.9A CN104277976A (zh) | 2014-10-22 | 2014-10-22 | 盐生杜氏藻提纯和驯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410563181.9A CN104277976A (zh) | 2014-10-22 | 2014-10-22 | 盐生杜氏藻提纯和驯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104277976A true CN104277976A (zh) | 2015-01-14 |
Family
ID=52253324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410563181.9A Pending CN104277976A (zh) | 2014-10-22 | 2014-10-22 | 盐生杜氏藻提纯和驯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104277976A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107889502A (zh) * | 2015-03-31 | 2018-04-06 | 柯碧恩生物技术公司 | 适应于异养培养条件的微藻 |
| CN108048327A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-05-18 | 海南大学 | 一种高效分离硅藻的新方法 |
| CN108220167A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-06-29 | 中盐工程技术研究院有限公司 | 盐藻纯化分离方法及微藻纯化分离方法 |
| CN110577924A (zh) * | 2019-10-10 | 2019-12-17 | 杭州江淮环动科技有限公司 | 一种进化驯化嗜盐微藻的方法 |
| CN115747074A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-03-07 | 宁波浮田生物技术有限公司 | 一种用于培养拟微球藻培养基 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988002662A1 (en) * | 1986-10-17 | 1988-04-21 | Western Biotechnology Limited | A method for improving recovery by centrifugation of fragile materials from suspension in aqueous solutions |
| CN102851214A (zh) * | 2012-08-23 | 2013-01-02 | 王培磊 | 盐生杜氏藻培养基配方及四级培养技术 |
-
2014
- 2014-10-22 CN CN201410563181.9A patent/CN104277976A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988002662A1 (en) * | 1986-10-17 | 1988-04-21 | Western Biotechnology Limited | A method for improving recovery by centrifugation of fragile materials from suspension in aqueous solutions |
| CN102851214A (zh) * | 2012-08-23 | 2013-01-02 | 王培磊 | 盐生杜氏藻培养基配方及四级培养技术 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| NELLIS MAR´ıN等: "Effect of nitrate concentration on growth and pigment synthesis of Dunaliella salina cultivated under low illumination and preadapted to different salinities", 《JOURNAL OF APPLIED PHYCOLOGY》 * |
| 安鑫龙等: "赤潮微藻的分离方法", 《河北渔业》 * |
| 王培磊等: "盐度对盐生杜氏藻生长及其色素积累的影响", 《水产科学》 * |
| 王培磊等: "胁迫因子对杜氏藻生长和色素积累的影响研究进展", 《海洋科学》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107889502A (zh) * | 2015-03-31 | 2018-04-06 | 柯碧恩生物技术公司 | 适应于异养培养条件的微藻 |
| CN108048327A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-05-18 | 海南大学 | 一种高效分离硅藻的新方法 |
| CN108220167A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-06-29 | 中盐工程技术研究院有限公司 | 盐藻纯化分离方法及微藻纯化分离方法 |
| CN110577924A (zh) * | 2019-10-10 | 2019-12-17 | 杭州江淮环动科技有限公司 | 一种进化驯化嗜盐微藻的方法 |
| CN115747074A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-03-07 | 宁波浮田生物技术有限公司 | 一种用于培养拟微球藻培养基 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103805515B (zh) | 一种湛江叉鞭金藻培养基和培养方法 | |
| CN104277976A (zh) | 盐生杜氏藻提纯和驯化方法 | |
| CN103820325A (zh) | 波吉卵囊藻高密度培养方法及藻细胞收集方法 | |
| CN104593262A (zh) | 一种海洋微藻的串联培养和快速收集方法 | |
| CN103834570A (zh) | 三角褐指藻和小新月菱形藻混合培养的培养基及培养方法 | |
| Pachiappan et al. | Isolation and culture of microalgae | |
| CN104480015A (zh) | 一种盐生杜氏藻快速培养方法 | |
| CN102643750B (zh) | 亚心形扁藻培养基配方及三级培养方法 | |
| CN108048327A (zh) | 一种高效分离硅藻的新方法 | |
| CN105368713A (zh) | 一种淡水小环藻培养液及培养方法 | |
| CN112125407A (zh) | 一种利用微藻处理猪粪废水的方法及应用 | |
| CN104450849B (zh) | 胁迫盐生杜氏藻积累β-胡萝卜素的方法 | |
| Perumal et al. | Isolation and culture of microalgae | |
| WO2019214484A1 (zh) | 一种用于微藻大规模培养采收的封闭坡式跑道池系统 | |
| CN118755578B (zh) | 一种微藻沉降剂及其应用 | |
| CN104480178A (zh) | 胁迫雨生红球藻快速积累虾青素的方法 | |
| CN107897127A (zh) | 一种用于水体生态修复的纯种大型溞的培养方法 | |
| CN104789474A (zh) | 一种用塑料薄膜袋充气培养双小核草履虫的方法 | |
| CN103740692B (zh) | 极地雪藻固定化保种方法 | |
| CN105524838A (zh) | 一种用尿液为主要氮源二级培养紫球藻的方法 | |
| CN104480153B (zh) | 促进微拟球藻大量积累高不饱和脂肪酸的方法 | |
| CN104094901B (zh) | 一种适于分子生物学研究的室内高密度轮虫培养采收方法 | |
| CN105543100A (zh) | 一种用间歇光两步法培养洛氏角毛藻的方法 | |
| CN106967611A (zh) | 一种抑制杜氏盐藻养殖过程中杂藻污染的方法 | |
| CN100473719C (zh) | 富含dha的球等鞭金藻h29的室外大面积养殖方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Liu Xiaotian Inventor after: Wang Peilei Inventor before: Wang Peilei |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150114 |