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CN1074455C - 用曲霉属磷脂酶对植物油脱胶的酶方法 - Google Patents

用曲霉属磷脂酶对植物油脱胶的酶方法

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CN1074455C CN96195847A CN96195847A CN1074455C CN 1074455 C CN1074455 C CN 1074455C CN 96195847 A CN96195847 A CN 96195847A CN 96195847 A CN96195847 A CN 96195847A CN 1074455 C CN1074455 C CN 1074455C
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Abstract

本发明涉及在制备食用油时脱胶的工艺步骤，其中植物油—油中可水合的磷脂优选通过预先进行的水脱胶已尽可能地被消除—通过酶处理，不可水合的磷脂，使它脱胶至可进行物理精制的程度。本发明的最重要的特征是，使用来自曲霉菌的磷脂酶。这种方法节约费用和有益于环境保护。

Description

用曲霉属磷脂酶对植物油脱胶的酶方法
发明领域
本发明涉及在制备食用油时脱胶的工艺步骤，其中植物油-油中可水合的磷脂优选通过预先进行的水脱胶已尽可能地被脱除-通过对不可水合的磷脂进行酶处理，使它脱至可经受物理精制的程度。这种方法是节约费用的和有益于环境保护的。
现有技术
公认的制备优质食用油的精制方法通常包括脱胶，去酸，以及脱色和去臭的方法步骤。特别是为了制定更有效的和费用更低的脱胶方案，近来作了很大的努力。在此力求达到的目的是，使油脱胶至使其接着能蒸馏脱酸。后者的蒸馏脱酸方法与传统的、通过中和脱酸方法相比具有很大的优点，没有废料产生。但它的实施前提是磷脂含量很低，例如油中的磷脂含量低于15ppm，优选低于10ppm。理想是磷脂含量＜5ppm。
植物油的胶质物质主要由磷脂混合物组成，其数量和组成取决于油料果实和油的制取方法。磷脂的绝大部分可以通过水合作用由其在原植物油中的胶胞溶液中分离出，并用于卵磷脂回收。在此人们称为湿脱胶。磷脂的一小部分是不水合的并留在油中。这种不水合的磷脂(NHP)的化学性质还没有彻底阐明。从试验得知，其中大于50％是由磷脂酸的钙盐和镁盐组成的(参见Hermann Purdun，植物卵磷脂，化学工业出版社，H.Ziolkowsky KG，奥古斯堡，1988,181页)。
常用的工业脱胶方法的目的是，尽可能从油中去掉不水合的磷脂。现今常用的方法有乌尼艾费尔公司的“超级脱胶法”和“单脱胶法”，范德姆泰公司的“全脱胶(“TOP”)法”，鱼奇公司的“Alcon法”和克劳伯机械工业股份有限公司的“UF-法”。在这些方法中，为去掉可水合的磷脂，常规的水脱胶大多是不可缺少的或为其前序工段。
所有这些脱胶方法中典型的是，只使用纯机械的或物理化学的方法，这些方法不总是对所有的油的质量都是很理想地适宜的。这些方法的设备消耗和能量消耗都很高，而且不能保证得到为后面蒸馏脱酸必需的低的磷含量。
作为有效的原则，这些脱胶方法的一部分使用了酸处理。已公知，强酸试剂适于用水预先脱胶了的油的后脱胶(参见Pardun,Loc,cit,185-189页或US-A 4698185)。在此优选使用柠檬酸。
在欧洲专利申请0513709中第一次介绍了一种有效的酶的脱胶方法。其中一种用水预先脱胶了的食用油与一种磷脂酶(A2,A1,B)的水溶液进行乳化，然后与这种水相分离。在此过程之后，油中含磷少于5ppm并适合于后面的蒸馏脱酸。重要的过程参数是含酶的水相乳化成＜10微米的小滴，向水溶液中添加柠檬酸盐，温度为50至70℃,pH-值优选为4至6。在酸中这种pH-调整是出乎预料的，因为所有已知的磷脂酶的pH-最佳值都处于pH8。鲁尔公司在食用油工业中采用的酶的脱胶方法为“Enzymax-方法”。
在德国专利DE-A4339556中，作为这种方法的另外的变通方案描叙了酶的再应用，其中由用过的、含污浆的水相通过加入表面活性剂或增溶剂溶解，并尽可能回收无污浆的溶液，该溶液含有至少10％使用过的酶。
在“Enzymax-方法”中，为尽可能地脱胶，可使用柠檬酸的有利作用，确切地说，通过一种在酶处理之前或之后安排的柠檬酸处理。同时使用柠檬酸和酶是不可能的。
由JP-A-2-153997已知，用具有磷脂酶-A-活性的酶来处理粗的或预先脱胶的油。这种现有技术指明，通过添加磷脂酶A，使磷脂改变为可通过吸收剂如活性炭或漂白土而使它去掉。因此在实施例1和2中，由3个实施例用加入漂白土组合成酶处理。在第3个实施例中，取消加入漂白土，代替漂白土的是，这里特别使用大量的酶(2000-20000单位)于大量的水中(100-1000重量-％以油为基准)。此时出现一种油在水中的乳化液。它对油在含酶的水相中的分布、pH-值的调整、柠檬酸盐的共同使用、以及酶的再使用都没有给予说明。
在JP-A-249593中，描述了油的类似酶处理，然而其目的不在于油的脱胶，而是为了回收溶血卵磷脂。此时调整单独的pH-值是多余的。
同样在EP-A0328789的方法中，涉及了通过磷脂酶使大豆油的卵磷脂转化为溶血卵磷脂，以制备蛋黄酱类的产物。
EP-A0622446描叙了一种使油和脂肪脱胶的、含有多个工艺步骤的酶方法。在用磷脂酶处理以后，离心分离出酶溶液，余下的油用pH3-6的水洗涤并最后用漂白土处理。其中的特征是，不仅在酶处理时、而且也在水洗步骤中都使用了大量的水，即30-200重量％，以使用的油为基准。同样，这里生成了油在水中的乳化液。这种情况意味着提高了设备的消耗，因为必须使大容积的液体运动，以及更高的能量耗费和废物处置的费用。对于酶的水溶液的pH-调整没有给予说明。
对于磷脂酶的情况，制造必要数量的酶，以使工业酶方法运转是一个特殊的难题。这里可提供使用的数量是有限的。磷脂酶A1在商业上是买不到的，磷脂B只有实验室的数量；来源是由鼠肝或链霉菌属培养物的提取物。磷脂酶A2来自蛇毒，蝎毒和峰毒。所有这些来源都不适合生产工业上所需酶的数量。现时磷脂酶A2唯一的工业制备方法是由猪胰腺提取。但世界范围收集到的适宜腺体是很有限的，并决不是可任意繁殖的。此外，磷脂酶在提取方法中只是一种次要的副产物。主要产物是胰蛋白酶，特别是胰凝乳蛋白酶，以及猪胰岛素。即使如在EP-A0513709中描叙的酶一样，估计现时的(几乎不可增加的)磷脂酶A2的贸易量只对不多于2至3台油磨机是够用的。
因此需要一种来源，由该来源能不限数量地生产所说酶。按现有技术工业上酶由微生物例如由真菌或细菌可获得任意数量。对磷脂酶A1、A2和B，现时已知没有一种微生物，它能以足够的产率生产这种酶。由少根根霉，大肠杆菌和杆菌属megaterium分离出磷脂酶A1，由特异青霉和链霉菌株分离出磷脂酶B。出乎意料地在文献中没有提示，磷脂酶A1、A2或B可由曲霉属分离出来。
相反，溶血磷脂酶是由EP0219269已知的，它是由黑曲霉获得的。溶血磷脂酶-这里称它们为磷脂酶L1或L2-具有一种与前面提取的磷脂酶相比不同的特性，这是就它能裂解单酰基磷脂例如溶血卵磷脂的意义而言的。纯的溶血磷脂酶在一完全另外的食品技术领域得到应用，即在小麦淀粉过滤时改善产率。
发明目的
本发明的目的是，提供一种有利于保护环境的和费用不大的方法，以降低植物油中的含磷组分的含量，直至能够通过蒸馏脱酸进一步加工处理油的程度，也就是说，直至磷含量少于15ppm、优选少于10ppm、最佳情况少于5ppm。这些要求可以通过酶的方法得到实现。
与此同时，存在一种微生物来源的需求，该来源允许酶的不受限制的数量生产磷脂酶。根据现有技术，仅只具有裂解酰基特性的酶才是满足需要的，即磷脂酶A1,A2和B。在这当中使用一种生产酶的微生物具有不应低估的优点，该种微生物很久以来已在食品工艺中采用，所以是毫无疑虑的。这里的例子是，不同的酵母菌株如克鲁维酵母cerivisiae，杆菌菌丝例如B．枯草杆菌或曲霉菌株如黑曲霉菌株或米曲霉菌株。
另一未解决的任务但成为本发明的目的是，在脱胶方法中将二种已知过程的有效作用、即酸处理和酶处理的作用合并为一步。
最后，本发明的目的是，用尽可能少的酶和酸投料量，以便能够特别经济地实施本发明的方法。
技术方案
通过使用分解酰基的磷脂酶、以其酶的分解来减少植物油中含有的含磷组分的方法，使本发明目的得以达到，其特征是，使用一种来自曲霉菌株的酶。
通过培养曲霉菌株制备工业酶是在生物工程中重要的高度开发的领域。来自黑曲霉芽的酶大量使用于淀粉工业中(淀粉葡萄糖苷酶)，果汁工业中(果胶酶)和在面食工业中(木聚糖酶)。来自曲霉属，特别是来自黑曲霉的酶很久以来已在食品工业中采用，并已知为无害的。由这种来源的磷脂酶A1,A2或B不是已知的，应用这种来源的磷脂酶于脱胶方法中是本发明的一个重要特征。在寻找含磷脂酶的菌株时，发现在申请人出售的产品VERON191或ROHAPECT7104中有足够的磷脂酶A2-活性。在本身已知的菌株改良筛选方法中，较高的活性表现为通过对磷脂酶活性的突变和选择性提高(参见：W.Gerhartz，“工业用酶”，VCH出版有限公司，1990,35页)。
由这种来源获得的磷脂酶的特性可以是多方面的和错综复杂的。不同于由现有技术已知的、来自胰腺的磷脂酶A2，这种酶拟定义只分解在磷脂分子的C2-原子上的酰基，来自曲霉菌属的磷脂酶大多数同时含有不同的酰基分解的特性。因此，除了A1和A2特性外，还发现了溶血磷脂酶特性。提到的酶特性相当于E.C.号3.1.1.32,3.1.1.4和3.1.1.5。溶血磷脂酶(EC-号.3.1.1.5)也称为磷脂酶3；但按文献中的表征(参见Pardun,Loc,Cit.,140页)，是否在溶血磷脂酶和磷脂酶B之间必须区别开是不清楚的。无论如何它们的共同之处是，它们能进一步分解为溶血卵磷脂，而且直至甘油磷酸胆碱。磷脂酶B也能附带损伤卵磷脂。因为本发明的磷脂酶具有这样的二种特性，即不仅为基质卵磷脂，也为基质溶血卵磷脂，所以可称它为磷脂酶B。按申请人至今的理解，来自曲霉菌属的纯溶血磷脂酶-它们先能分解溶血卵磷脂，但不能分解卵磷脂-在本脱胶过程中、特别是在酸性反应条件下是无效的。这也适用于不分解酰基的磷脂酶C和D。
因此卵磷脂的特性、也就是说磷脂酶A1和/或A2活性(在分析上在这两者之间很难区分)是本发明酶的一个重要特征。这种不同特性的同时存在可能成为本发明酶的有利作用的基础。虽然在多数情况下必须称它为单一酶，但它具有复合酶的作用。
在使用本发明酶时，它的纯度不具有很大意义。例如可使用发酵液体本身，超滤后得到的富含酶的滞留液或由此沉淀出的酶蛋白。
属于本发明范畴的是，替代由惯用的曲霉生产菌株获得的酶，使用由基因技术改变的生产菌株获得的酶。在这期间基因技术提供了多种可能性，此为生成磷脂酶必需的基因由曲霉菌属克隆，并在一适宜的宿生菌株中以高产率增殖(exprimieren)。作为宿主菌株例如也可考虑曲霉菌株，但也可考虑其他的真菌菌株和甚至细菌菌株。
酶的使用量与纯度相应，可以在0.0001至1％之间，以要脱胶的油为基准。
本发明使用的酶的一个很大优点和未曾预料的效果是其进行脱胶必需的活性，这种活性只需非常的小。当在现有技术中应用来自胰腺的磷脂酶A2时，使用活性要约为每升油1000卵磷脂酶-单位(LU)(参见EP-A0513709中的实施例1)，而在使用来自曲霉菌属的本发明酶时在上述条件下活性只为5至50LU/每升油已足够。在相应地延长反应时间时，甚至使用量低于5LU/每升油也可进行到底。在纯化的曲霉菌磷脂酶中找到的溶血磷脂酶活性甚至高于磷脂酶A2-活性，更确切地说为约1至100倍。由此得出使用量为5至5000溶血卵磷脂酶-单位(LLU)/每升油，优选50至1000LLU。这种活性数据适用于以批料方式脱胶的物料。在酶再使用时必需的酶添加量以1升油为基明显地较低，例如为上面数值的1/5至1/10。这种微小的酶量甚至允许放弃酶的再使用。
可以使本发明的曲霉菌属磷脂酶与其他的分解酰基的磷脂酶有针对性地混合，例如来自曲霉属的另外的磷脂酶或与来自胰腺的磷脂酶A2。不过在后一情况下必须调整pH值，该两个pH最佳值接近，也就是说pH约为3-5。
使用来自曲霉菌属的磷脂酶意外地也能解决另外提出的任务。这样可能将酶投入柠檬酸溶液中，使酶的作用与柠檬酸的作用合并在一起。在相对浓的柠檬酸溶液中使用酶是不寻常的。在酶学中有一些酶几乎不为人们所知，它们在如此低的pH-值下是稳定的，并甚至此时还具有最佳作用。这类性能谱的少数例子之一是消化道的胃蛋白酶。这种酶溶于1-20％的柠檬酸中。同时调pH-值为pH＜4，优选pH-值为pH＜3。为使用例如5％的柠檬酸溶液，则得出pH-值约为2.3。
也可使用乳酸，乙酸，甲酸，磷酸，以及其他的无机的和有机的酸替代柠檬酸。但优选是食用酸，特别是柠檬酸。应记住，单独用酸溶液、也就是说不添加酶时，得不到足够低的磷含量，特别是对预先脱胶了的油是这样。
在发明方法中，调整了pH-最佳值为2-3，这与按通常方法得到的pH-最佳值不互相协调。后者处在pH=8，其中将蛋黄作为基质、在40℃时乳化在酶溶液中，且活性随pH-值而定。人们可以用特定的相界面条件解释这种出乎预料地低的pH-法最佳值，在相界面或许存在一种比在水相(本体相)中测得的更高的pH-值。
在这种酸性的水溶液中使酶与油密切地混合。为了在随后分离时使体积尽可能小地波动，应努力使水相与油相相比保持尽可能小的水相。一般容积＜10％就可以了(以油相为基)，优选容积＜5％。在各种情况下都产生油包水的乳化液。
要处理的油相可以是大豆油、向日葵油或菜籽油。前者是最重要的油产物。其他的植物油如豆麻子油，椰子油或棕榈油，以及动物油(动物油含有干扰性的磷脂)，同样可以按本发明的方法进行处理。
因为磷脂酶侵蚀卵磷脂，因此高含卵磷脂的油如粗大豆油用于发明方法中是没有太大意义的。所以原料是预先脱胶了的、特别是水脱胶了的油，这种油的特征通常为其磷含量在50和300ppm之间。仅在例外的情况下，预先脱胶了的油具有较高的磷含量，每次几乎都不高于500ppm的磷。质量波动的油可用相同的设备进行加工。部分脱胶了的油、以及压榨油或提取油也可能附带投入，确切地说与预先脱胶了的油相混合。例外地，磷含量同样可以高于500ppm。油的预先干燥不是必需的。
可能使酶起作用，必须使两相、即油相和含酶的水相密切地互相混合。单纯的搅拌绝对不够。
若酶在微量水中溶解约0.5-5重量-％(以油为基准)并以这种形式在油中乳化成小于10微米直径(重量平均值)的微滴时，就可保证酶在油中有很好的分布。优选是小于1微米的微滴。高于100厘米/秒的轴速度激烈搅拌证明是有效的。可在反应器内借肋一外部的离心泵使油翻转来替代这种方法。还可用超声作用、通常的是分散机例如Ultraturrax使含酶的水相分布很细。
酶的反应可在油相和水相之间的界面上进行。所有这种混合措施的目的都是为含酶的水相创造尽可能大的表面。添加表面活性剂强化了水相的均匀分布。因此按具体情况向酶溶液添加具有HLB-值高于9的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠盐，如在EP-A0513709所述。为改善乳化，一种类似有效的方法是添加溶血卵磷脂。添加量可在0.001％至1％，以油为基准。无论如何，对发明方法来讲都制得高分散的油包水的乳化液。
酶处理的温度不是关键的。温度在20至80℃之间是合适的。后者只允许短时间使用。总体上而言，本发明的磷脂酶的耐温性是出众的。所以在使用低的pH值时它不受损害。理想的是应用温度为30-50℃。
处理时间取决于温度，并可用提高的温度使之缩短。通常时间从0.1至10、优选1至5小时足够了。反应在一脱胶反应器中进行，反应器如在DE-A4339556中所述可以分成数层。因此除了间歇方式运行外，也可连续运转，其中也可用不同的温度段进行反应。例如可以在40℃停3小时，此后在60℃培育1小时。分段式的反应过程同时提供了这种可能性，即在各单独的段中调到不同的pH-值。这样在第一段中溶液的pH值例如可调到7，在第二段中在加入柠檬酸的情况下调到2.5。但在至少一段中，酶溶液的pH值按照本发明必须低于4、优选低于3。在这种按本发明的界限之下补充调整pH-值时，可观察到效果恶化。因此柠檬酸优选在其混入油中之前添加到酶溶液中。
在结束酶处理以后，使酶溶液连同其中吸收的NHP的裂解产物(分批地或连续地)与油相分离，优选通过离心分离。因为这种酶有出众的高稳定性且吸收的分解产物的数量很微少，它们作为污浆沉淀出来，所以此相同的含水酶相可多次反复使用。同样也存在这种可能性，相应于DE-A4339556使酶从污浆中分离出来，这样可使在很大程度上不含污浆的酶溶液重新投入使用。
用本发明的脱胶方法得到了这样的油，这些油含有低于15ppm的磷。原来的目的是使磷含量少于10ppm；在理想的情况应是少于5ppm。按照蒸馏脱酸的方法，磷含量低于10ppm油的进一步加工毫无疑问是可能的。在本发明的方法中，从油中也要在很大程度上去掉一系列的其他的离子如镁、钙、锌以及铁。由于已达到的低铁含量，大多低于0.1ppm，所以产物在进一步加工和贮存时具有氧化稳定性好的理想的前提条件。
实施例
实施例1
500g剩余磷含量为190ppm的湿脱胶的大豆油在一圆底烧瓶中加热至40℃。对此加入26g水，该水中已溶解5g柠檬酸和0.19g粉状酶制剂。酶制剂来自黑曲霉菌发酵的生产批料，并每克含有60磷脂酶单位(=卵磷脂酶单位LU)。1卵磷脂酶单位(LU)是在40℃、pH=8下，在一分钟内由蛋黄中释放出1微摩尔脂肪酸的酶量。也可检验酶制剂的溶血磷脂酶活性。测得1001溶血磷脂酶单位(=溶血卵磷脂酶单位LLU)/每g。1溶血卵磷脂单位是在55℃、pH=4.5下，每分钟由溶血卵磷脂-乳液释放出1微毫摩尔脂肪酸的酶量。考虑到磷脂酶含量没有对该制剂进行专门纯化，所以这种酶制剂除磷脂酶A2外还含有一显著高的溶血磷脂酶活性，并可称为磷脂酶B。
对圆底烧瓶的内容物利用一外部循环泵使之进行剧烈分散。此时烧瓶的内容物约每分钟分散一次。其中水相的粒子大小为小于1μm。在1小时的时间间隔内，多次取样并对磷含量进行测定点，其中得出下列数据：
时间小时 0 2 4 6 20
磷含量ppm 190 81 27.9 5.4 4.2
这种用于后面蒸馏脱酸需要的＜10ppm的低磷含量通过本发明的方法在6小时后可得到。
对比实施例1
如实施例1一样操作，只是加入相应数量的乳清蛋白、也就是无酶的蛋白来替代酶制剂。在经相同的处理时间后，如上采取的试样显示：通过无酶的处理，磷含量降低不小于121ppm。因此单独加入柠檬酸是不够的。得到的油不适合蒸馏脱酸。
时间小时 0 2 4 6 20
磷含量ppm 190 152 128 123 121
对比实施例2
如实施例1一样操作，只是来自霉菌属的磷脂酶用商业的纯溶血磷脂酶(G-酶，为酶生物体系，USA,1172.LLU每g)来代替。它不具有磷脂酶A2活性。在经相同的处理时间后，如上采取的试样显示：在上面规定的条件下，通过单独加入溶血磷脂酶磷含量降低不小于85ppm。得到的油蒸馏脱酸是不合适的。
时间小时 0 2 4 6 20
磷含量ppm 190 138 124 119 85

Claims (17)

1．用分裂酰基的磷脂酶通过酶法分解来减少植物油中含有的含磷组分的方法，其特征在于，使用了来自于曲霉菌属的酶，该酶不仅含有磷脂酶A2活性，见EC-号3.1.1.4，和/或磷脂酶A1活性，见EC-号3.1.1.32，而且也含有溶血磷脂酶活性，见EC-号3.1.1.5；调节所使用的酶溶液的pH值至＜4；且在温度为20至80℃时实施该方法。
2．按照权利要求1的方法，其特征在于，调节所使用的酶溶液的pH值至＜3。
3．按照权利要求1的方法，其特征在于，用柠檬酸调节pH值，在柠檬酸存在时使酶起作用。
4．按照权利要求1-3中任一个的方法，其特征在于，在温度为30至50℃时实施该方法。
5．按照权利要求1-3中任一个的方法，其特征在于，使在油中含酶的水相乳化成粒子大小低于10微米的微粒。
6．按照权利要求1-3中任一个的方法，其特征在于，使用至少部分预先脱胶了的油。
7．按照权利要求6的方法，其特征在于，所说预先脱胶了的油是湿法脱胶了的油。
8．按照权利要求7的方法，其特征在于，使油中磷含量为不高于500ppm减少至低于15ppm。
9．按照权利要求8的方法，其特征在于，使油中磷含量为50至300ppm减少至低于15ppm。
10．按照权利要求8或9的方法，其特征在于，使油中磷含量减少至低于10ppm。
11．按照权利要求10的方法，其特征在于，使油中磷含量减少至低于5ppm。
12．按照权利要求8或9的方法，其特征在于，加工大豆油。
13．按照权利要求8或9的方法，其特征在于，加工菜籽油或葵花籽油。
14．按照权利要求1-3中任一个的方法，其特征在于，在反应后将磷脂酶的水溶液与处理了的油分开并重新使用。
15．按照权利要求1-3中任一个的方法，其特征在于，以间歇方式实施。
16．按照权利要求1-3中任一个的方法，其特征在于，连续地实施。
17．按照权利要求1-3中任一个的方法，其特征在于，降低含磷组分含量的同时，也降低油的铁含量。
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