CN1070176C

CN1070176C - 2,4-二磺酰苯基丁基硝酮,它的盐类及它们作为药物的应用

Info

Publication number: CN1070176C
Application number: CN94194993A
Authority: CN
Inventors: J·M·卡尼
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation; University of Kentucky Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation; University of Kentucky Research Foundation
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2001-08-29
Anticipated expiration: 2014-12-22
Also published as: HU221167B1; AU1552795A; JP2001010953A; EP0736004B1; PL185189B1; DE69424441T2; US5475032A; HK1001768A1; CZ177596A3; TW299315B; ATE192736T1; AU679835B2; HRP950358A2; CN1156447A; CZ289629B6; HK1008294A1; WO1995017876A3; HUT76788A; FI962589A0; ES2145264T3

Abstract

公开了2，4-二磺酰α-苯基叔丁基硝酮及其可药用盐。这些物质可作为口服或非肠道(例如静脉内)用药的药剂使用，用于患有例如中风时发生的急性中枢神经系统氧化或表现为渐进性中枢神经系统机能丧失的中枢神经系统逐渐氧化的患者。这些物质也用于改善由抗肿瘤病治疗造成的氧化性损伤副作用。

Description

2,4-二磺酰苯基丁基硝酮，它的盐类及它们作为药物的应用

发明的背景

本发明涉及一种特殊的硝酮化合物及其盐类，以及它们作为药用硝酮自由基捕获剂的有利应用。

背景资料α-苯基叔丁基硝酮

或“PBN”)在70年代被确认是有用的分析试剂，连同电子自旋共振(“ESR”)一起，帮助检测自由基。PBN会与某些自由基反应，产生能发生特征ESR谱的化学物种，从而有可能确定自由基是否存在。

在70年代后期和80年代初，医学界开始关注自由基在诸如心力衰竭、中风等疾病中所起的作用。越来越多地在体外试验中使用PBN以提供在这些情形中自由基存在的证据。后来还在试验动物体内使用，仍是作为分析助剂，目的是在模拟的局部缺血期间观察自由基。

在80年代中期，当严重的外伤性局部缺血动物试验表明PBN处理过的动物似乎比对照样存活率更高时，第一次暗示了PBN可能有治疗作用。

在1991年5月2日公布了PCT专利申请WO-91-05552。该专利申请与现在颁发的美国专利5,825,032和5,036,097部分相应，它提到了PBN和由以下化学式定义的一组PBN衍生物

其中X是苯基或

，其中的R是H、，或Z；或，n是从1到5的整数；或者X是，Y是叔丁基或羟基化或乙酰化的叔丁基或取代的苯基。提议用这些化合物作为药物制剂治疗中风后遗症和据报道与自由基损伤有关的其它病症。

在1992年提交了涉及PBN和有关的化合物及它们的医学应用的第二份PCT专利申请。该申请以先前的美国专利申请716,952(1991年6月18日提交)为基础，1992年12月23日作为WO92/22290公布。这份1992年的出版物提供了极其广泛和一般的内容，首先，它试图叙述尽可能多的与自由基有关的疾病症状。仅举几个例子来说，它包括从中枢神经系统病症(包括中风、衰老、偏头痛等)、外周器官疾病(包括动脉粥样硬化、褥疮、创伤和肌肉用力过度)，到紫外线曝晒。其次，它试图列出尽可能多的潜在的自旋捕获剂。

除了各式各样的非PBN物质之外，该申请还将可能有用的PBN化合物大大扩展，包括了PBN和化学式如下的它的衍生物其中X是苯基、咪唑基、吩噻嗪基或

，n=1-5，优选1-3；

R²是各自独立的(分子内可以不同)卤素、烷基、烷氧基、烯基、烯氧基、OH、NH₂、NHZ、NZ₂、NO、

-SO₃H、-OSO₃H、SH、-S(烷基)、-S(烯基)和卤代烷基，尤其是-CF₃；

A=O或S；

Z是一个C₁至C₆的直链或支链的烷基或环烷基；

Y是可以在一个或多个位置上羟基化或乙酰化的叔丁基；苯基或以下化学式的基团

PBN在当时被认为是最优选的化合物，据说它对正常的或未受损伤的细胞没有可测量出的影响，而且还提到一些衍生物也有用，包括羟基衍生物，尤其是2-、3-或4-羟基苯基叔丁基硝酮和苯基(一、二或三羟基)叔丁基硝酮；PBN酯，尤其是释放出2-、3-或4-羟基苯基叔丁基硝酮的酯，例如乙酰氧基衍生物；2-、3-或4-羧基苯基叔丁基硝酮；苯基羟丁基硝酮；烷氧基衍生物，尤其是释放出2-、3-或4-羟基苯基叔丁基硝酮的烷氧基衍生物，例如PBN的2-、3-或4-甲氧基苯基衍生物，乙酰胺衍生物，尤其是释放出2-、3-或4-氨基苯基叔丁基硝酮的乙酰胺衍生物；二苯基硝酮(PPN)及类似的二苯基硝酮衍生物；N-叔丁基-α-(4-硝基苯基)硝酮；和N-叔丁基-α-(2-磺苯基)硝酮。

发明的说明

现已发现，一种特殊的PBN衍生物及其盐具有出乎意料的优越的药理性质。虽然这种衍生物2,4-二磺酰PBN属于在前述WO92/022290中一般性提到的很广泛的一类物质的范围，但是它没有被具体地公开。也没有预示它的有利的性质。

本发明化合物带有两个磺酸基，预期会显示出改进的水溶解性，但是因为其疏油特性，所以穿越血/脑屏障的传输能力预期较差。然而，当制成本发明化合物并在体内试验时，它出乎意料地显示出功效比PBN增高。功效的这种增高与效力比PBN高一道发生。与功效和效力的显著增高正好相反，与PBN相比，毒性则大大减小。这些结果是出乎意料的。

这些结果是出乎意料的，因为在关于结构/活性关系的一般文献中，在特别限定的各类化合物中治疗效力通常与毒性一起变化。因此，大多数相关化合物保持它们的治疗效力与毒性之比不变。相反，本发明化合物与这一预期的关系偏高，与紧密相关的类似物相比，它的效力增高而毒性减小。

因此，本发明的一个方面是提供了PBN一二磺酰基化合物

及其可药用的盐。

在第二方面，本发明提供了以这种化合物或其盐作为活性组分的可以非肠道(例如静脉内)和口服用药的药物组合物。

在第三方面，本发明提供了一种治疗患有与中枢神经系统急性氧化性损伤有关的病症的患者(例如中风患者)的方法，其中包括以非肠道用药(例如静脉内)的方式施用以本发明化合物或其盐为基础的药物组合物。

在第四方面，本发明提供了一种治疗方法，用于治疗患有以中枢神经系统受到长期的低度氧化性应力和中枢神经系统机能逐渐丧失为特征的病症的患者。在此方法中，以非肠道(例如静脉内)或者最好是口服用药的方式服用以本发明化合物或其盐为基础的药物组合物。

在第五方面，本发明提供了一种减小或改善患者因癌症治疗产生的氧化性损伤造成的副作用的方法。在此方法中，以非肠道方式(例如静脉内)或口服方式服用以本发明化合物或其盐为基础的药物组合物。

发明的详细描叙

这一详细描叙安排成以下部分：

附图简介。

化合物和盐。

化合物制备。

药物组合物。

治疗的病症和治疗方案。

实施例

附图简介

此说明书涉及以下附图，其中

图1是用来制备化合物的反应示意流程图。

图2(A、B和C)和3(A、B、C和D)是两组图，它们说明了动物体内热调节能力的不良变化与先有技术的硝酮自由基捕获剂剂量水平的关系，以及与此相反，使用本发明化合物时没有这种不良变化。

图4(A、B、C和D)是一组四个图，它显示了本发明化合物与紧密相关的先有技术硝酮化合物相比，在治疗逐渐神经变性症状(例如阿尔茨海默氏病)方面的优越性，这由它们干扰溶液中β-淀粉样蛋白对关键酶的失活作用的相对能力得到说明。

图5说明了本发明化合物在减小鼠内大脑中动脉闭塞后观察到的最终梗塞体积方面的效力。

图6(A、B和C)的三个图说明了本发明化合物减小高剂量抗癌药物在动物中的副作用的能力。

化合物和盐

本发明的化合物是2,4-二磺酰基α-苯基叔丁基硝酮。在本文中还非正式地称为“2,4-二磺酰PBN”或“PBN2,4-二磺酸盐”。它在低pH条件下以酸的形式成为固体或存在于溶液中

在较高的pH下则以离解的盐的形式存在，这可用下式表示：

或作为其中X是药学上可接受的阳离子。此阳离子最常见的是一价阳离子，例如钠、钾或铵，但是也可以是多价阳离子与药学上可接受的一价阴离子相结合，例如钙与氯、溴、碘、氢氧根、硝酸根、磺酸根、乙酸根、酒石酸根、草酸根，丁二酸根、棕榈酸或类似的阴离子；镁与这些阴离子；锌与这些阴离子等。本文在用结构式表示多价阳离子与一价阴离子的这些组合时，一价阴离子用“Y”表示。

在这些物质中，以游离酸和简单的钠、钾或铵盐最为优选，钙和镁盐也是优选的，但稍差。

化合物制备

如图1中详述和实施例1中所说明的，本发明化合物可以用一种两步反应顺序制备。在第一步中，用合适的催化剂(例如活化的锌/乙酸催化剂或铝/汞齐催化剂)将市售的硝酸叔丁酯(2-甲基-2-硝基丙烷)转化成相应的正羟胺。此反应可以在液体反应介质中，例如在锌催化剂的情形于醇/水混合物中或者在铝汞齐催化剂的情形于醚/水混合物中，在约15至100℃的温度下进行0.5至12小时，尤其是2到6小时。

在第二步中，使刚制得的羟胺与4-甲酰-1,3-苯二磺酸反应，通常使用略微过量的胺。此反应可以类似的温度条件下进行，一般在10到24小时内完成。

这样形成的产物是游离酸，其特征是分子量为89g/mole。它是白色粉末，加热时分解。它在水中的溶解度大于1g/ml，D₂O中的¹H NMR谱为8.048ppm(dd,8.4,1.7Hz)；8.836ppm(d,8.4Hz)；8.839ppm(d,1.7Hz)；8.774ppm(s)。

通过将游离酸在水介质中与两当量的合适的碱(例如钾盐用KOH)混合，容易制得各种盐。

药物组合物

本发明化合物(包括它的盐)可以配制成适合口服或非肠道(例如静脉内或肌内注射)用药的药物组合物。

口服用药的组合物可以采用溶液、或悬浮液、粉末、片剂、胶囊等形式。在这些组合物中，PBN2,4-二磺酸酯或其盐常为少量组分(0.1％至例如50％重量)，其余的是各种赋形剂或载体及有助于形成所要剂量形式的加工助剂。液体形式可以包括合适的水基或非水赋形剂以及缓冲剂、悬浮分散剂、着色剂、矫味剂等。

固体形式可以包括例如任何以下组分或性质类似的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸，羟基乙酸淀粉钠或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；矫味剂，例如薄荷、糖水杨酸甲酯或桔子香料。

在可注射的组合物的情形，它们通常以可注射的灭菌的盐水或磷酸盐缓冲的盐水或其它工艺上已知的可注射的载体为基础。活性硝酮一般也是少量组分，常常占0.05-10％重量左右，其余的是可注射的载体及类似物质。

可治疗的病症及治疗方案

用2,4-二磺酰PBN治疗的病症一般分成三类。第一类包括与中枢神经系统的某一区域急性强烈氧化性损伤有关的病症。这些病症的实例包括中风、与中风有关的症状、震荡和蛛网膜下出血。在这种情形，以一种设计成使药物尽可能快而直接地进入患者血流中的方式施用本发明化合物。这常常是指静脉注射。

治疗这些病症所用的静脉注射剂量是从约0.1mg/kg/小时到至少10mg/kg/小时，全都注射约1到120小时，尤其是24到96小时。也可以预先快速浓注约10至500mg以便达到适当的稳态水平。

虽然优选静脉内用药，但也可以使用其它形式的非肠道用药，例如肌内注射。在这种情形，采用类似的剂量水平。2,4-二磺酰PBN的一个出乎意料和关键性的优点是它能够以比PBN本身高得多的剂量用药。如实施例中所示，对于2,4-二磺酰PBN或其盐，已证实可以采用最高达1000mg/kg/小时和更高的剂量，或是从10到2500mg/kg/的静脉快速浓注剂量，而PBN本身在这样的剂量下会致死或急性中毒。对于2,4-二磺酰PBN，在这样的高剂量水平下剂量/响应曲线存在着出乎意料的正的持续期，清楚地表明了在中风或其它损伤后立即施用强力的重剂量，在很多情形对于恢复起到了主要的正面效果。

对2,4-二磺酰PBN治疗作出有利反应的第二类病症是以中枢神经系统受到长期低度的氧化性应力和中枢神经系统机能逐渐丧失为特征的病症。这些病症包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、多发梗塞性痴呆、视网膜病等。这些病症都以机能的逐渐丧失为特征。2,4-二磺酰-PBN或其盐在口服或非肠道用药(例如静脉内)时，可以减慢并且可能逆转这种机能丧失。如果希望非肠道用药(例如静脉内用药)，一般使用与急性病症时相似的剂量，但是在剂量范围的较低一端。

在这些情形，治疗方案可能延续很多月或年，因此从患者方便和耐受性考虑以口服用药为佳。在口服用药时，每天口服1到3次，每次需要约0.02至50mg/kg，优选剂量为约0.04至5.0mg/kg。

当然，可以把2,4-二磺酰PBN作为唯一的活性药剂服用或也可以将它与其它药剂结合服用。这就导致本发明化合物的第三种应用。

对2,4-二磺酰PBN的治疗有反应的第三类病症是由于癌症(肿瘤疾病)治疗产生氧化性损伤而对患者造成的副作用。产生氧化性损伤(因此产生副作用)的治疗包括辐射(例如γ辐射)治疗和用造成氧化性损伤的化学治疗药剂进行治疗。这些药剂的实例包括抗生素，例如道诺霉素、盐酸阿霉素和争光霉素；甲基苄肼；氮芥，例如异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥和苯丁酸氮芥；烷基化试剂；抗代谢物；激素和拮抗剂。

服用2,4-二磺酰PBN对于减小患者在这些治疗期间的不适感有效。此外，服用本发明化合物可以提高患者耐受这些治疗的能力。治疗中的副作用常常迫使治疗中断或妨碍在这些治疗中按最佳的高剂量或快频率用药。在某些情形这些副作用具有破坏性的危害，会导致心力衰竭和其它的主要机能丧失。在动物试验中曾经发现，本发明化合物可以改进患者对这些抗肿瘤病治疗的耐受性。

在这种治疗中，可以在进行辐射或化学治疗之前、之中或之后服用本发明化合物。可以采用非肠道或口服用药，或者采用能使2,4-二磺酰PBN进入患者血流中的任何其它方法。

已观察到正面的剂量-响应关系。就这点而言，并且考虑到副反应的严重性和提供最大可能的保护或改善作用的好处，在某些情形下可能最好是服用大量的2,4-二磺酰PBN，例如前面对于急性强烈氧化性CNS损伤症状提到的那些。在另一些情形，可能使用较低的剂量，例如对于渐进性神经元疾病治疗所提到的那些。

以下是典型的用药方案的实例：在单一疗法中(只用盐酸阿霉素)，两种典型的剂量组合是每平方米面积10-600mg化合物Ⅰ加上每平方米表面积60mg盐酸阿霉素，盐酸阿霉素每7天或21天用药。化合物Ⅰ可以在盐酸阿霉素之前最多60分钟、同时、或之后(例如几小时后或次日)用药。儿科的剂量通常两种药物均低。为治疗耐多次剂量的肿瘤，可以使用更高的剂量。

实施例

实施例1

2,4-二磺酰苯基-N-叔丁基硝酮(后继实施例中化合物“Ⅰ”)的合成。这一优选的合成方法是以R.H.Hinton和E.G.Janzen的工作(J.Org.Chem.57:2646-2651,1992)为基础的。如图1所示，它包括一种醛与一种羟胺的缩合。该羟胺是不稳定的，在使用的当天用活化的锌催化剂新制得。合成方法如下：必要的化学药品

1．95％乙醇

2．2-甲基-2-硝基丙烷

3．锌粉

4．冰乙酸

5．乙醚

6．饱和的氯化钠溶液

7．无水硫酸镁固体

8．4-甲酰-1,3-苯磺酸(MW 310.21g/mole)，二钠盐，水合物

9．甲醇

10．二氯甲烷步骤A．N-叔丁基羟胺的制备

1．一只500ml三颈园底烧瓶装有磁搅子、温度计接口、温度计和加液漏斗。

2．将95％乙醇(350ml)加到烧瓶中，在冰浴中冷却到10℃。

3．一次加入2-甲基-2-硝基丙烷(6.18g,0.060摩尔)和锌粉(5.89g,0.090mole)。

4．将冰乙酸(10.8g,0.180mole)加到加液漏斗中，在激烈搅拌下逐滴加入，加入的速度应保持温度低于15℃。

5．撤除冰浴，在室温下搅拌混合物3小时。

6．从混合物中脱除溶剂，留下叔丁基羟胺、乙酸锌和水。

7．加入二氯甲烷(50ml)，混合物经布氏漏斗过滤。

8．留在滤纸上的乙酸锌滤饼用2×25ml二氯甲烷洗。

9．在分液漏斗中分出滤液中的水，有机层用硫酸镁干燥。

10．通过沟纹滤纸过滤，除掉硫酸镁，然后用旋转蒸发仪脱除二氯甲烷。

11．产物(100％产率=5.34g)为粘性液体，将它溶在甲醇(50ml)中用于部分B。B．2,4-二磺酰苯基-N-叔丁基硝基酮的制备

1．一只250ml三颈园底烧瓶装有搅棒、气体分散管、加液漏斗和用循环冰水冷却的Friedrich冷凝器。

2．向烧瓶中加入200ml甲醇、4-甲酰-1,3-苯二磺酸(9.31g,30mmol)和N-叔丁基羟胺(部分A的25ml甲醇溶液，理论值30mmol)。

3．用加热套将反应物加热回流，同时在搅拌下鼓入氮气。

4．将混合物回流2小时。

5．加入部分A中的剩余的羟胺。

6．继续在鼓入氮气下回流至少18小时，但不超过24小时。

7．将热的反应混合物在布氏漏斗上过滤，固体用热的甲醇洗。

8．用旋转蒸发仪脱除甲醇，得到黄色粘性油状物。

9．加入热的1∶1的乙醇∶丙酮(200ml)，将混合物加热使油溶解。

10．将溶液冷却使却产物结晶。

11．在布氏漏斗上收集产物，真空干燥过夜。

12．反应通常得到产率为75％的白色粉末状化合物Ⅰ。

实施例2

2,4-二磺酰苯基-N-叔丁基硝酮(化合物Ⅰ)的另一种合成方法。这是一种较早发展的方法，用于制备在本说明书实施例中报道的几个实验中使用的化合物样品。此实施例的产物在各方面均与实施例1的相同。这一合成方法如下：必要的化学药品

1·铝箔，切成5cm宽的条状，卷成直径约1cm的园筒。

2·氯化汞(Ⅱ)(9.68g在476ml水中)

3·乙醇

4·乙醚(6L)

5·纯水

6·2-甲基-2-硝基丙烷

7·氢氧化钠，2M(80g在1L水中)

8·硫酸镁，无水固体

9·4-甲酰-1,3-苯磺酸(MW 310,21g/mol)步骤A．N-叔丁基羟胺的制备

1．将铝箔园筒在HgCl₂溶液中浸15-30分钟，然后浸入乙醇中，再浸入乙醚中，随后置于含500ml乙醚和21.4ml水的5L烧瓶中。

2．烧瓶装上250ml的压力平衡滴液漏斗、机械搅拌器、氮气入口和用循环冰水冷却的Friedrich冷凝器。

3．将混合物搅拌10分钟。

4．用滴液漏斗加2-甲基-2-硝基丙烷(71.68g,75.5ml)，加入的速度应保持激烈回流。

注意：加料必须在少于20分钟内完成，否则产率会显著下降。

5．在加料的同时加入500ml一份的乙醚。这样作是为了保持产物浓度尽可能高，而又不形成凝胶。最多可加入2L乙醚，而对产率无不利影响。

6．一旦加完2-甲基-2-硝基丙烷，将反应物再搅拌30分钟。

7．将所形成的灰色悬浮液分三批抽气过滤，除掉铝盐。

8．每块滤饼均用1L乙醚洗。

9．合并的醚层用300ml 2M NaOH洗，然后干燥(MgSO₄)，减压浓缩成软

的白色固体。

10．该固体刚好在室温之上熔化，但可以进一步在真空烘箱中干燥(不超过几分钟)，留下38至45g固体。

11．此固体可以原样使用，或者用戊烷重结晶。

12．分子量为89g/mol。B．2,4-二磺酰苯基-N-叔丁基硝酮的制备

1．在一只250ml的烧瓶上装上搅拌和用循环冰水冷却的Friedrich冷凝器。

2．向烧瓶内装入71.8ml甲醇、14.5g 4-甲酰-1,3-苯二磺酸(46.7mole,1当量)和5.0g N-叔丁基羟胺(56.2mmole,1.2当量)。

3．将混合物回流过夜。

4．将反应产物转移到园底烧瓶中，旋转蒸发至干。

5．将固体残余物与乙醚一起捣碎，倒掉乙醚(黄色)。

6．重复步骤5。

7．产物(“化合物Ⅰ”)自甲醇中结晶，随后进行热甲醇过滤以便除掉不溶性沉淀，自甲醇中重结晶两次。

实施例3

进行一系列实验，以便在体内比较2,4-二磺酰PBN(“化合物Ⅰ”)、PBN和两种一磺酰PBN化合物作为防止在大脑局部缺血和再灌注损伤后神经元损失的药剂的功效。试验步骤是W.Cao、J.M.Carney、A.Duchon、R.A.Floyd和M.Chevion在“Oxygen free radical involvement in ischemia andreperfusion injury to brain”,Neuroscience Letters.88(1988)233一文中报道的步骤。在此实验中，对于每组6只的各组沙土鼠以单剂量的方式腹膜内施用试验化合物，30分钟后将双侧颈动脉闭塞5分钟。在一个100μm的区域内测定神经元核的密度。展示两种对照样，一种不接受试验化合物，另一种不接受试验化合物而且无大脑局部缺血。如表1所示，本发明化合物与先有技术化合物相比显示了出乎意料的优点。首先，可以看出在低剂量(例如3.2mg/kg)时化合物Ⅰ在防止神经元损失方面效力高2-3倍。在高剂量时可以看出化合物Ⅰ能完全保护神经元免遭损失，因为试验的大脑的神经元密度与未局部缺血的对照样相同。在这样的高剂量下先有技术化合物或是有毒，或是保护程度低得多。这些结果表明，化合物Ⅰ与PBN和两种紧密相关的类似物相比，其保护神经元的效力明显增高，同时毒性比PBN出乎意料地减少。表1

神经元核/100微米区域

PBN 2- 3- 化合物

磺基磺基 Ⅰ无局部缺血的对照样 4.21 4.21 4.21 4.21

(.43) (.43) (.43) (.43)局部缺血的对照样 0.58 0.58 0.58 0.58

(.28) (.28) (.28) (.28)3.2mg/kg 0.43 0.73 0.35 1.43

(.18) (.34) (.21) (.31)10mg/kg 1.13 0.68 0.81 2.57

(.39) (.31) (.40) (.25)32mg/kg 1.83 0.73 1.63 3.53

(.21) (.31) (.35) (.41)50mg/kg 3.11 1.01 1.63 4.11

(.29) (.61) (.35) (.43)100mg/kg 3.68 0.93 1.93 4.18

(.71) (.53) (.39) (.49)320mg/kg 3.78 1.11 1.78 4.23

(.43) (.41) (.40) (.39)1000mg/kg 有毒 0.98 1.58 4.11

(.43) (.38) (.41)3200mg/kg 有毒 - - 4.18

实施例4

进行一系列实验，比较化合物Ⅰ与PBN和两种磺酸盐类似物在局部缺血后治疗中的效果。采用实施例1中所述的通用方法，但是试验化合物是在5分钟局部缺血后再灌注的30分钟后以单剂量的方式腹膜内用药。结果总结在表2。表2表明，本发明化合物仍然是在低剂量时更有效，在高剂量时效力强而毒性小。同样，毒性妨碍了先有技术化合物达到本发明化合物能提供极其有效的治疗时的高剂量。表2

神经元核/100微米区域

PBN 2- 3- 化合物

磺基磺基 Ⅰ无局部缺血对照样 4.18 4.18 4.18 4.18

(.59) (.59) (.59) (.59)局部缺血对照样 0.85 0.85 0.85 0.85

(.19) (.19) (.19) (.19)32mg/kg 1.09 未测出未测出 1.83

(.31) (.41)50mg/kg 1.85 0.68 0.73 2.73

(.49) (.31) (.34) (.39)100mg/kg 2.11 0.78 1.09 3.41

(.51) (.23) (.48) (.37)320mg/kg 2.25 0.81 0.93 3.55

(.43) (.31) (.48)1000mg/kg 有毒未测出未测出 3.68

(.39)

实施例5

采用实施例1中所述的通用试验方法对化合物Ⅰ和PBN进行比较，确定在沙土鼠5分钟局部缺血后开始重新灌注的60分钟之后静脉内注射用药时它们防止神经元损失的相对效力。结果总结在表3，它表明化合物Ⅰ在大脑损伤后临床治疗的情形治疗效果大得多。表3N=6每组 mg/kg单剂量

0.0 0.5 1.0 10盐水，无局部缺血 4.11 - - -

(.28)盐水，局部缺血 0.93 - - -

(.17)PBN - 0.83 1.07 1.23

(.23) (.29) (.31)化合物Ⅰ - 1.25 1.75 2.43

(.19) (.28) (.31)PBN或化合物Ⅰ对于大脑无损伤的对照沙土鼠的神经元密度均无影响。

实施例6

大脑损伤可以表现为行为变化。在此实验中，试验幼年的成体沙土鼠(3-4月)，以便确定它们在经历实施例1中所述的局部缺血之后24小时完成一个8分路迷宫试验的能力。与未局部缺血的动物相比，在未治疗时它们犯的错误要多得多，对某些试验动物施用PBN和化合物Ⅰ。如表4中详细列出的，用高剂量的化合物Ⅰ治疗过的沙土鼠的犯错误水平与未局部缺血的动物很难区分。PBN的效力较差。这说明化合物Ⅰ能防止幼年沙土鼠在5分钟局部缺血后在8分路迷宫试验中的局部缺血后(24小时后)暂时性/空间短期记忆丧失。表4N=6(每组) mg/kg/hr 24小时

0.0 1.0 32 50 100对照 4.1 - - -

(.38)局部缺血后 37.6 - - -

(4.85)PBN - 29.8 18.19 6.23 5.83

(7.27)(5.83) (.71) (.49)化合物Ⅰ - 14.63 7.19 4.28 4.11

(3.81) (.81) (.29) (.19)

实施例7

测定了本发明化合物减小局部缺血后梗塞体积的能力。如表5所示，观察到虽然PBN和化合物Ⅰ在低剂量时都有效，但在高剂量时化合物Ⅰ给出最佳保护作用，而PBN有毒性。表5列出了在C57BL/6J小鼠大脑中动脉闭塞后60分钟静脉内施用试验化合物并继续24小时时观察到的闭塞体积。表5

梗塞体积mm³后治疗 0.0 1.0 10 100(mg/kg/hr)对照样，无局部缺血 0 - - -盐水，局部缺血 23 - - -

(2)PBN - 17.7 13.8 毒性

(2.8) (2.3)化合物Ⅰ - 16.8 12.7 8.3

(1.7) (3.93) (.71)

实施例8

在此研究中，比较了化合物Ⅰ和PBN在老年沙土鼠(18-24月，n=12/组)经受10分钟局部缺血之前30分钟用药时，防止沙土鼠致死的能力(存活率％)。如表6所示，化合物Ⅰ在所有剂量水平上都更优越，并且在高剂量时达到完全保护，而PBN只是部分有效。

表6预处理 0.0 10 32 100 320(mg/kg)盐水 11 - - - -PBN - 42 50 75 92化合物Ⅰ - 50 75 100 100

实施例9与工艺上已知的化合物PBN相比，本发明化合物的一个重要优点是它的毒性显著减小。如表7中详细列出的，根据改变单次腹膜内施用的硝酮剂量的大小确定C57BL/6L小鼠中的急性致死率。PBN在560mg/kg剂量时表现出明显的毒性。化合物Ⅰ在将近20倍大的剂量下仍未显示毒性。表7

mg/kg

存活率％ 320 560 1000 3000 10000

n=20只鼠PBN 100 25 0 0 0化合物Ⅰ 100 100 100 100 100

实施例10

对于硝酮自由基捕获剂，已发现的另一个体内全身性不良作用是体温降低。这一毒性会产生严重的健康后果，并且会使其它病症的诊断复杂化。如图2和图4所示，本发明化合物以高达1000mg/kg的剂量对小鼠和沙土鼠施用时测量不出有体温下降。相反，先有技术的化合物PBN在剂量仅为500mg/kg时使体温降低最多达8℃。

实施例11

试验本发明的化合物，以便通过试验它在一种模型中对阿尔茨海默氏病(“AD”)的效力，确定它在治疗以长期对中枢神经系统施以低度氧化性应力和中枢神经系统功能逐渐丧失为特征的病症的效力。这一模型有以下基础：近来的研究证实，在老年个体的脑中存在与年龄有关的蛋白质氧化增加和酶活性丧失。自老年个体的成纤维细胞和不同年龄个体的红血球进行的组织培养都表明，蛋白质羰基含量(蛋白质氧化的量度)指数增加而标记酶的活性减小。在个体的寿命范围内脑蛋白的氧化逐渐增加。

反常的淀粉样蛋白前体肽的形成和代谢在AD中的作用也在许多不同的模型中研究过。在使用胚胎海马神经元和神经元/神经胶质培养物进行的体外试验中已经证实，βAP1-40在长期的共培育中产生细胞毒性。当把这种肽注入鼠脑中时，产生了损害。所指出的这种βAP的某些分解片段也有神经毒性[例如βAP(25-35)]。这种神经毒性似乎是通过谷氨酸受体和非谷氨酸受体两种机构传递的。对于神经元培养物的共焦显微镜研究证实了与βAP(1-40)接触会造成氧化应力[二氯荧光黄和增多的细胞内游离钙Fura-2]。

业已证实，βAP片段可以直接使组织提取物和培育的海马神经元和神经胶质中的谷氨酰胺合成酶(GS)及肌酸激酶(CK)失活(见图4中A和B)。图4中的A和B表示了由AP(25-35)造成的与剂量有关的谷氨酰胺合成酶与肌酸激酶的失活。制备了得自沙土鼠新皮层的细胞溶质级分并测定酶的活性。在鉴定以前将样品在不同浓度的肽存在下培育10分钟。实心符号代表天然存在的25-35片段的影响。园圈表明逆顺序(32-25)对酶活性无影响。空心三角表明，与25-35的影响相比，混乱的氨基酸顺序对于酶活性也没有影响。每个点都是5个观察值的平均值(±标准偏差)。衍生的βAP和自由基的其它细胞源是AD被引发和传播的一个重要的决定因素。

如图4中的C和D所证实的，化合物Ⅰ和PBN均显示出保护GS和CK免受βAP片段影响的能力。图4的C和D表示了细胞溶质级分与βAP25-35(0.4mg/ml)及不同浓度的PBN(园圈)或化合物Ⅰ(实心园圈)一起共培育时的保护作用。每个点都是3个观察值的平均结果(±标准偏差)。如由C和D可见，化合物Ⅰ实现了完全保护，事实上甚至能使氧化的作用逆转。相反，PBN的效力相当有限，因为它在基本上不完全保护的水平上渐近地变平。

实施例12

进行实验以便进一步证实本发明化合物在防止由中风造成的中枢神经系统损伤方面的效能。鼠病灶性局部缺血结果

进行一对研究以便确定化合物Ⅰ在鼠病灶性局部缺血模型中的功效。在此模型中，对Sprague Dawley鼠(200-300g)进行永久性大脑中动脉闭塞术(MCAO)以引发病灶性中风。在永久性闭塞后施用化合物Ⅰ，先在腹膜内(i.p.)快速浓注，然后在其余时间里静脉内(i.v.)连续输注，直到中风后经过24小时。所用的化合物Ⅰ的剂量或是100mg/kg，i.p.,随后4.2mg/kg/小时，i.v.；或者10mg/kg，i.p.,随后0.42mg/kg/小时，i.v.。

在中风3天后将鼠宰杀，使用三苯基四唑鎓染色技术对组织进行组织结构加工，用图象分析法定量测定梗塞体积和细胞坏死总面积。这些实验的结果以图形方式示于图5，它表明化合物Ⅰ在两项研究中都提供了约70％的明显的保护作用。与文献结果的比较

Cao和Phillis近来报道了关于非本发明化合物PBN的类似数据(BrainResearch 664:267-272,1994)。在它们的研究中，对鼠进行永久性大脑中动脉闭塞术(MCAO)和颈总动脉闭塞术。在中风后的不同时间腹膜内施用100mg/kg的PBN。中风2天后将鼠宰杀，用三苯基四唑鎓染色法定量测定梗塞体积。

当在中风后的0.5、5、17、29和41小时或在中风后的5、17、29和41小时施用PBN时，梗塞体积均减小约50％。为达到50％的保护作用而施用的PBN累积剂量最少为达到70％保护作用所需的化合物Ⅰ数量的4倍。因此，化合物Ⅰ在鼠的MCAO病灶式局部缺血模型中能提供比PBN优越得多的保护作用。

实施例13

在此实施例中对本发明化合物(化合物Ⅰ)进行鉴定，以确定它在改善抗癌治疗氧化引起的副作用方面的能力。盐酸阿霉素研究

盐酸阿霉素是广泛应用的抗癌药。已知它很有效，但也知道它的引起氧化性损伤的倾向有严重的副作用。这些副作用包括在高剂量时造成严重的心脏损伤。这些副作用常常限制了这种药剂的使用，或者限制了能够使用的剂量水平低于为达到最大的抗肿瘤疾病效果所要求的水平。

进行实验以便证实本发明化合物在减小诸如盐酸阿霉素抗癌药的副作用方面有效，并且使动物能耐受较高剂量的盐酸阿霉素。

用C57BL/6J和DBA/2J雄性小鼠(35-40g)试验盐酸阿霉素的急性致死作用和通过预先服用化合物Ⅰ防止急性致死。在施用盐酸阿霉素之前30分钟对小鼠注射盐水或化合物Ⅰ。全都采用腹膜内注射。盐酸阿霉素的急性致死量是从10到30mg/kg。在这些试验中盐酸阿霉素的LD₅₀在两种品系的小鼠中均为25mg/kg。在不进行盐酸阿霉素治疗时，剂量高达300mg/kg的化合物Ⅰ对两个品系的小鼠的存活没有影响。

用30和100mg/kg的化合物Ⅰ进行预处理，在盐酸阿霉素致死率-剂量效果曲线中产生与剂量有关的偏移。图6表示了用DBA/2J小鼠得到的结果。剂量为100mg/kg的化合物Ⅰ产生朝右的5倍移动(向减小致死率的方向)。因此，化合物Ⅰ与盐酸阿霉素相组合使最大耐受剂量显著增加。这些较高的剂量是在能有效地杀死抗多种药物的肿瘤的范围内。对照试验

用PBN预处理造成盐酸阿霉素剂量-效应曲线的轻微右移。虽然化合物Ⅰ在与盐酸阿霉素组合时其剂量可增加到300mg/kg，但对于PBN此组合有一上限。剂量为100mg/kg的PBN产生轻微的镇静作用，300mg/kg产生显著的镇静作用和某些兼带的毒性(10-20％致死率)。化合物Ⅰ盐酸阿霉素在化合物Ⅰ的剂量高达300mg/kg时不产生任何兼带的毒性。

实施例14安全性试验

检验化合物Ⅰ和PBN在雄性Sprague Dawley鼠(200-300g)中的急性毒性。对每组6只的各组鼠腹膜内施用1000mg/kg的化合物。3天后鉴定致死率。化合物Ⅰ的致死率为零，而PBN使此试验中使用的6只鼠中的5只死亡。这些数据证实了沙土鼠试验中化合物Ⅰ比PBN安全性高的数据。

Claims

1．2,4-二磺酰α-苯基叔丁基硝酮。

2．一种化学式如下的化合物：

3．化学式如下的一种可药用的盐：

4．化学式如下的权利要求3的盐：

其中X选自Na、K、NH₄、Ca、Mg、CaY和MgY,Y是可药用的一价阴离子。

5．一种药物组合物，其中在可药用的非肠道注射的载体中含有权利要求1的化合物。

6．一种药物组合物，其中在可药用的非肠道注射的载体中含有权利要求2的化合物。

7．一种药物组合物，其中在可药用的非肠道注射的载体中含有权利要求3的盐。

8．一种药物组合物，其中在可药用的非肠道注射的载体中含有权利要求4的盐。

9．一种药物组合物，其中在可药用的口服载体中含有权利要求1的化合物。

10．一种药物组合物，其中在可药用的口服载体中含有权利要求2的化合物。

11．一种药物组合物，其中在可药用的口服载体中含有权利要求3的盐。

12．一种药用组合物，其中在可药用的口服载体中含有权利要求4的盐。

13．权利要求1至4的化合物在制备用于治疗中风的药物方面的用途。

14．按照权利要求13的用途，其中所述药物为以非肠道方式使用的药物。

15．按照权利要求14的用途，其中所述药物为以静脉内方式使用的药物。

16．按照权利要求13的用途，其中所述药物为以口服方式使用的药物。

17．权利要求1至4的化合物在制备用于治疗渐进性中枢神经系统机能丧失症患者的药物方面的用途。

18．按照权利要求17的用途，其中所述药物为以非肠道方式使用的药物。

19．按照权利要求18的用途，其中所述药物为以静脉内方式使用的药物。

20．按照权利要求17的用途，其中所述药物为以口服方式使用的药物。

21．权利要求1至4的化合物在制备用于改善患者因抗肿瘤病治疗产生的氧化性损伤而造成的副作用的药物方面的用途。

22．按照权利要求21的用途，其中所述药物为以口服方式使用的药物。

23．按照权利要求21的用途，其中所述药物为以非肠道方式使用的药物。

24．按照权利要求23的用途，其中所述药物为以静脉内方式使用的药物。

25．下式2,4-二磺酰α-苯基叔丁基硝酮或其可药用的盐在制备治疗振荡的药物方面的用途：

其中X选自Na、K、NH₄、Ca、Mg、Zn、ZnY、CaY和MgY，其中Y是可药用的一价阴离子。

26．按照权利要求25的用途，其中所述药物为以非肠道方式使用的药物。

27．按照权利要求26的用途，其中所述药物为以静脉内方式使用的药物。

28．按照权利要求25的用途，其中所述药物为以口服方式使用的药物。

29．下式2,4-二磺酰α-苯基叔丁基硝酮或其可药用的盐在制备治疗蛛网膜下出血的药物方面的用途：

30．按照权利要求29的用途，其中所述药物为以非肠道方式使用的药物。

31．按照权利要求30的用途，其中所述药物为以静脉内方式使用的药物。

32．按照权利要求29的用途，其中所述药物为以口服方式使用的药物。