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CN106566810A - 一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法 - Google Patents

一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法 Download PDF

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CN106566810A
CN106566810A CN201610910757.3A CN201610910757A CN106566810A CN 106566810 A CN106566810 A CN 106566810A CN 201610910757 A CN201610910757 A CN 201610910757A CN 106566810 A CN106566810 A CN 106566810A
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CN
China
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cell
growth factor
cells
gingiva
induction
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Application number
CN201610910757.3A
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葛啸虎
陈海佳
王飞
王一飞
戚康艺
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Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及细胞领域，特别涉及一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法。该组合物包括B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和神经生长因子。该诱导方法主要是利用B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)诱导牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志物神经巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白；表明牙龈间充质干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。

Description

一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法
技术领域
本发明涉及细胞领域，特别涉及一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法。
背景技术
中枢神经系统损伤后神经功能的恢复非常困难，主要原因是脑内神经元的再生能力极差。目前研究证明脑内虽然有神经干细胞存在，且能分化成神经元和神经胶质细胞，但是由于神经干细胞存在的部位很局限，数量也非常少，故将其用于神经元损伤修复还是非常困难的。随着干细胞领域的研究不断深入，发现其他部位的干细胞也可以分化成神经细胞。将胚胎神经细胞或脐血干细胞移植到受损伤的鼠脑内，可以适度改善其神经功能，但是由于伦理道德，免疫排斥等因素限制了这些干细胞在临床上的广泛应用。骨髓间充质干细胞可在自体获得且能在体外稳定扩增，并在体外能诱导分化成神经细胞,有望成为神经系统疾病移植治疗的种子细胞。但是目前诱导分化而来的神经样细胞还不能有效稳定地表达神经细胞特性，此类神经样细胞是否具备真正神经元的功能，仍然存在争议，且从正常人体内抽取骨髓，也会给供者造成一定程度的身体伤害。
在牙科学领域的研究中，牙髓、牙周膜、颌骨、根尖牙乳头等成体颌面组织中的牙源性间充质干细胞具有强大的组织再生能力，在一系列研究中展现了缺损修复再生的良好应用前景。如牙周膜干细胞等表现出对免疫细胞活性的调节作用。牙龈作为牙周组织的屏障，对机体状态、口腔环境变化很敏感，容易产生增生等诸多疾病表型，而且牙龈本身具有强大的愈合能力，这些现象暗示牙龈组织中可能存在对组织动态平衡和损伤修复具有重要作用的未分化间充质干细胞。
牙龈属于牙周组织，是附于牙齿周围的分隔下方牙周组织和外部空间的粘膜屏障。牙龈包括上皮和固有层两部分，从发育来源上，上皮来自原始口腔上皮，与口腔粘膜上皮相延续；固有层则发育自早期神经嵴细胞迁移形成的间充质，上皮与间充质不断相互作用，最终形成牙龈组织。牙龈组织的一个典型特点是具有较强的创伤愈合能力，表现为切除、损伤后能够无疤愈合，恢复牙龈外形。牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stemcells,GMSCs)是组成牙龈结缔组织的主要间充质细胞,来源于中胚层的纤维母细胞，不仅具有活跃的自我更新的能力，并且还具有合成和降解胶原等细胞外基质的功能：I型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等。
牙龈间充质干细胞取材方便、牙龈组织中细胞含量大、增值速度快,体外使用不同的诱导剂能将牙龈间充质干细胞诱导分化为神经样细胞,揭示了其在适合的环境条件下具有分化为神经细胞的潜能。牙龈间充质干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，牙龈间充质干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法。本发明的目的在于提供一种牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其主要是利用B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)诱导牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志物神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilamentacidic protein，GFAP)；表明牙龈间充质干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种组合物，包括B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和神经生长因子。
本发明还提供了所述的组合物在诱导牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞中的作用。
本发明还提供了一种诱导制剂，包括本发明提供的组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述诱导制剂中所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为15～25ng/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述诱导制剂中所述表皮生长因子的终浓度为5～15ng/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述诱导制剂中所述神经生长因子的终浓度为20～30ng/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述诱导制剂中所述B27的体积浓度为2％。
在本发明的一些具体实施方案中，所述诱导制剂还包括细胞培养基。
在本发明的一些具体实施方案中，所述诱导制剂中还包括血清。所述血清可以为胎牛血清。
本发明提供了一种牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，取牙龈间充质干细胞与本发明提供的诱导制剂混合后培养。
在本发明的一些具体实施方案中，牙龈间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
1、GMSCs原代分离培养：
1)原材料来源：取临床上正畸导萌术切下的牙龈或阻生拔牙需要而切除包绕在恒牙周围的牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。切取的牙龈组织快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中。
其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。
2)漂洗：用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中浸泡5min；
其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。
其中，间充质干细胞无血清培养基中含有100u/mL青霉素、100u/mL链霉素。
3)第一次消化：将牙龈组织剪成1cm3大小，加入适量Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒温摇床中消化45min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，100um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。
其中，Ⅰ型胶原酶-Dispase酶的比例为1:1，胶原酶浓度为胶原酶3g/L，Dispase酶浓度为Dispase酶4g/L。
其中，消化环境为为37℃，200R恒温摇床中，消化时间为45min；
其中，所用细胞滤网孔径为100um；
其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。
4)第二次消化：把步骤3)中过滤下下来未消化的组织加入等体积的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒温摇床中继续消化15min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，70um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。
其中，胰蛋白酶与牙龈组织的比例为体积比1:1，胰蛋白酶的浓度为0.125％；
其中，所用细胞滤网孔径为70um；
其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。
5)接种：步骤3)与步骤4)中收集的细胞用含10ng/mL EGF(表皮生长因子)的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，接种于六孔板，5％CO2培养箱37℃培养。
其中，基础培养基为间充质干细胞无血清培养基，可市场购买或自制。
其中，完全培养基中EGF(表皮生长因子)的浓度为10ng/mL；
6)纯化：待细胞长满80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+GMSCs，接种于新的六孔板中，5％CO2培养箱37℃培养。
2、GMSCs表面标志物鉴定：
待细胞长满80-90％，收集细胞(约1×106个)，加入3g/L Triton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR抗体各50μL，同时对照组滴加单纯PBS 50μL，4℃处理16h。次日室温放置30min，PBS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常温避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福尔马林固定细胞，流式细胞仪测定抗原的阳性率。检测结果显示，克隆细胞表面抗原CD146、CD105、CD90阳性表达，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，说明本发明中得到的GMSCs属来源于中胚层的间充质干细胞。
3、GMSCs传代：
待细胞长满80～90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含10ng/mL EGF的间充质干细胞无血清培养基，进行细胞计数，按5×104cells/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。
养过程中观察细胞形态，结果如图2所示。细胞接种约4h后开始贴壁，3～4d进入对数生长期，6～8d进入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。大部分细胞呈长梭形，形态不规则。
在本发明的一些具体实施方案中，牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法具体为：选取第3代GMSCs，按1×104cells/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS的DMEM/F12培养基。24h后更换本发明提供的诱导制剂，在37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养，每隔2～3天更换新的培养液。
本发明提供了一种牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其主要是利用B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)诱导牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志物神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilamentacidic protein，GFAP)；表明牙龈间充质干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示GMSCs细胞表面标志物流式检测结果图；
图2示GMSCs形态图；
图3示各组诱导分化率比较。
具体实施方式
本发明公开了一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种GMSCs分化为神经元样细胞的诱导方法，其主要是利用B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)诱导GMSCs分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志物神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilamentacidic protein，GFAP)；表明GMSCs保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。
GMSCs自体取材方便、易于体外扩增，可以用于自体移植，从而避免了免疫排斥反应。
本发明提供一种由多种诱导因子联合应用作用于GMSCs，能有效的诱导GMSCs向神经元样细胞分化。表明GMSCs保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。
本发明提供的组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 GMSCs原代分离培养
4)原材料来源：取临床上正畸导萌术切下的牙龈或阻生拔牙需要而切除包绕在恒牙周围的牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。切取的牙龈组织快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中。
其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。
5)漂洗：用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中浸泡5min；
其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。
其中，间充质干细胞无血清培养基中含有100u/mL青霉素、100u/mL链霉素。
6)第一次消化：将牙龈组织剪成1cm3大小，加入适量Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒温摇床中消化45min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，100um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。
其中，Ⅰ型胶原酶-Dispase酶的比例为1:1，胶原酶浓度为胶原酶3g/L Dispase酶浓度为Dispase酶4g/L。
其中，消化环境为为37℃，200R恒温摇床中，消化时间为45min；
其中，所用细胞滤网孔径为100um；
其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。
4)第二次消化：把步骤3)中过滤下下来未消化的组织加入等体积的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒温摇床中继续消化15min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，70um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。
其中，胰蛋白酶与牙龈组织的比例为体积比1:1，胰蛋白酶的浓度为0.125％；
其中，所用细胞滤网孔径为70um；
其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。
5)接种：步骤3)与步骤4)中收集的细胞用含10ng/mLEGF(表皮生长因子)的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，接种于六孔板，5％CO2培养箱37℃培养。
其中，基础培养基为间充质干细胞无血清培养基，可市场购买或自制。
其中，完全培养基中EGF(表皮生长因子)的浓度为10ng/mL；
6)纯化：待细胞长满80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+GMSCs，接种于新的六孔板中，5％CO2培养箱37℃培养。
GMSCs表面标志物鉴定
待细胞长满80-90％，收集细胞(约1×106个)，加入3g/L Triton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR抗体各50μL，同时对照组滴加单纯PBS 50μL，4℃处理16h。次日室温放置30min，PBS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常温避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福尔马林固定细胞，流式细胞仪测定抗原的阳性率。检测结果显示，克隆细胞表面抗原CD146、CD105、CD90阳性表达，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，说明本发明中得到的GMSCs属来源于中胚层的间充质干细胞。
表1 GMSCs细胞表面标志物表达率结果
细胞表型 CD146 CD105 CD90 HLA-DR CD34 CD45
阳性表达率(％) 100.00 99.90 96.70 0.30 0.00 0.10
GMSCs传代
待细胞长满80～90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶，消化1～3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含10ng/mLEGF的间充质干细胞无血清培养基，进行细胞计数，按5×104cells/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2～3天换液一次。
培养过程中观察细胞形态，结果如图2所示。细胞接种约4h后开始贴壁，3～4d进入对数生长期，6～8d进入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。大部分细胞呈长梭形，形态不规则。
实施例2 GMSCs分化
为了验证本发明分化诱导的效果，同时设置4组对照组和3组实验组，选取第3代GMSCs，按1×104cells/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2mL含10％FBS的DMEM/F12培养基。24h后更换对照组1～对照组4以及实验组1～实验组3中各组对应的培养液，在37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养，每隔2～3天更换新的培养液。
对照组1为阴性对照组，为常规培养组，使用的培养液为：含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液。
对照组2为阳性对照组，使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、10ng/mL EGF的DMEM/F12培养液。
对照组3为阳性对照组，使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、20ng/mL bFGF的DMEM/F12培养液。
对照组4为阳性对照组，使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、25ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
实验组1中使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、5ng/mL EGF、15ng/mL bFGF、20ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
实验组2中使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、10ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、25ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
实验组3中使用的诱导液为：10％FBS、2％B27、15ng/mL EGF、25ng/mL bFGF、30ng/mL NGF的DMEM/F12培养液。
各组培养液的配方如表2：
表2各组分化诱导液配方
组别 基础培养基 FBS B27 EGF bFGF NGF
实验组1 DMEM/F12 10％ 2％ 5ng/mL 15ng/mL 20ng/mL
实验组2 DMEM/F12 10％ 2％ 10ng/mL 20ng/mL 25ng/mL
实验组3 DMEM/F12 10％ 2％ 15ng/mL 25ng/mL 30ng/mL
对照组1 DMEM/F12 10％ 2％ -- -- --
对照组2 DMEM/F12 10％ 2％ 10ng/mL -- --
对照组3 DMEM/F12 10％ 2％ -- 20ng/mL --
对照组4 DMEM/F12 10％ 2％ -- -- 25ng/mL
GMSCs分化形态观察：
12小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，3天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状。
免疫组化:
培养7天后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行Nestin、NSE、GFAP的免疫组化染色，DAB显色。
将放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加适量一抗(Nestin、NSE、GFAP)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
对各组所得细胞经免疫组化检测后，对Nestin、NSE、GFAP染色的细胞按公式：
诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％
进行计数，计算出各组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。统计结果如表3。
表3各组细胞分化率(*表示p<0.05，**表示p<0.01)
表3、图3结果显示，对照组细胞Nestin、NSE、GFAP均未见着色，分化率为零。实验组2中细胞Nestin、NSE、GFAP着色最深，阳性表达率极显著(p<0.01)高于其他各组，实验组1和实验组3中细胞Nestin、NSE、GFAP着色较深，阳性表达率显著(p<0.05)高于各对照组。实验组2中细胞分化率63.15±0.85％(p<0.01)，说明本发明所用分化培养基能有效的诱导GMSCs向神经元样细胞分化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和神经生长因子。
2.根据权利要求1所述的组合物在诱导牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞中的作用。
3.一种诱导制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的组合物。
4.根据权利要求3所述的诱导制剂，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为15～25ng/mL。
5.根据权利要求3或4所述的诱导制剂，其特征在于，所述表皮生长因子的终浓度为5～15ng/mL。
6.根据权利要求3至5任一项所述的诱导制剂，其特征在于，所述神经生长因子的终浓度为20～30ng/mL。
7.根据权利要求3至6任一项所述的诱导制剂，其特征在于，所述B27的体积浓度为2％。
8.根据权利要求3至7任一项所述的诱导制剂，其特征在于，还包括细胞培养基。
9.根据权利要求3至8任一项所述的诱导制剂，其特征在于，还包括血清。
10.一种牙龈间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其特征在于，取牙龈间充质干细胞与如权利要求3至9任一项所述的诱导制剂混合后培养。
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