CN106434539A - 一种成骨诱导培养基及骨向分化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种成骨诱导培养基及骨向分化方法。该成骨诱导培养基包括维生素C、地塞米松、β‑甘油磷酸钠、骨形成蛋白‑2、血管内皮生长因子和基础培养基。本发明提供的成骨诱导培养基中多种诱导因子联合应用作用于GMSCs等间充质干细胞，具有协同作用，能有效的诱导间充质干细胞骨向分化，其成骨分化效果显著优于现有常规的诱导方法。

Description

一种成骨诱导培养基及骨向分化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种成骨诱导培养基及骨向分化方法。

背景技术

牙周疾病不仅是引起成年人失牙的主要原因，还是危害人类口腔乃至全身健康的主要口腔疾病。牙周病是牙周组织的慢性炎症刺激下的感染性疾病，是牙菌斑中的微生物在相应的微环境下引起的炎症，它损坏牙周组织，尤其是牙槽骨的破坏和牙周组织的丧失，最终导致牙齿松动脱落以及牙槽骨的吸收。而牙周治疗的目标就是要治疗牙周炎症，改善微环境重新再生出新的结缔组织附着和支持组织，完成牙槽骨、牙骨质和牙周膜的构建。常用的牙周再生方法，如引导组织再生术、根面平整术等，此类方法简单易行，但并不能完全实现功能性和结构性牙周组织再生，具有一定的局限性。牙周组织工程技术的出现和发展为牙周再生提供了崭新的思路和方法。

牙龈属于牙周组织，是附于牙齿周围的分隔下方牙周组织和外部空间的粘膜屏障。牙龈包括上皮和固有层两部分，从发育来源上，上皮来自原始口腔上皮，与口腔粘膜上皮相延续；固有层则发育自早期神经嵴细胞迁移形成的间充质，上皮与间充质不断相互作用，最终形成牙龈组织。牙龈组织的一个典型特点是具有较强的创伤愈合能力，表现为切除、损伤后能够无疤愈合，恢复牙龈外形。

牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)是组成牙龈结缔组织的主要间充质细胞，来源于中胚层的纤维母细胞，不仅具有活跃的自我更新的能力，并且还具有合成和降解胶原等细胞外基质的功能：I型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等。牙龈间充质干细胞取材方便、牙龈组织中细胞含量大、增值速度快，作为成体间充质干细胞中的一员，在体外使用合适的诱导剂同样具有分化为牙骨质的能力。牙龈间充质干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，牙龈间充质干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。虽然有研究采用包括脂肪、骨髓在内的多种组织来源的成体干细胞进行牙周再生，但取材的有创性和伦理性等问题仍然制约了其发展。因此，GMSCs有望成为牙周组织再生的种子细胞。

目前，对于GMSCs成骨分化诱导的研究主要集中于不同细胞因子对其生物学行为产生的不同影响，但是往往局限于单一细胞因子对其作用的研究。由于生物体是一个复杂的存在多诱导因素的有机体，因此在牙周组织复杂的微环境中，多种诱导因子在牙周再生的过程中可能会起到相互协同或拮抗的作用。因此，提供一种具有协同作用的诱导因子组合物具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种成骨诱导培养基及骨向分化方法。该成骨诱导培养基包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、骨形成蛋白-2(BMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)等诱导因子，多种诱导因子联合应用作用于GMSCs等间充质干细胞，能有效的诱导间充质干细胞骨向分化，其成骨分化效果显著优于现有常规的诱导方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种成骨诱导培养基，包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、骨形成蛋白-2、血管内皮生长因子和基础培养基。

目前，现有的常规成骨诱导培养基包括维生素C、地塞米松和β-甘油磷酸钠，本发明提供的成骨诱导培养基在常规诱导因子组合的基础上，添加骨形成蛋白-2和血管内皮生长因子，多种诱导因子联合应用作用于GMSCs等间充质干细胞，更加高效的诱导GMSCs等间充质干细胞的骨向分化。

作为优选，成骨诱导培养基中各组分的用量为：

维生素C：10～100μg/L；

地塞米松：(1～10)×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸钠：1～20mol/L；

骨形成蛋白-2：50～150μg/L；

血管内皮生长因子：10～30μg/L；

基础培养基：补足。

优选地，成骨诱导培养基中各组分的用量为：

维生素C：50μg/L；

地塞米松：1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸钠：10mol/L；

骨形成蛋白-2：50～150μg/L；

血管内皮生长因子：10～30μg/L；

基础培养基：补足。

更优选地，成骨诱导培养基中各组分的用量为：

维生素C：50μg/L；

地塞米松：1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸钠：10mol/L；

骨形成蛋白-2：100μg/L；

血管内皮生长因子：20μg/L；

基础培养基：补足。

在本发明提供的实施例中，基础培养基为含有10％体积分数FBS的低糖DMEM培养基。

本发明还提供了一种诱导间充质干细胞骨向分化的方法，采用本发明成骨诱导培养基培养间充质干细胞。

在本发明提供的实施例中，间充质干细胞为牙龈间充质干细胞。

作为优选，间充质干细胞为第2～5代间充质干细胞。

优选地，间充质干细胞为第3代间充质干细胞。

作为优选，间充质干细胞的接种密度为(1～10)×10⁴cell/mL。

优选地，间充质干细胞的接种密度为1×10⁴cell/mL。

作为优选，间充质干细胞的培养温度为37℃。

作为优选，间充质干细胞的培养时间不低于14天。

优选地，间充质干细胞的培养时间不低于21天。

更优选地，间充质干细胞的培养时间不低于28天。

本发明提供了一种成骨诱导培养基及骨向分化方法。该成骨诱导培养基包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、骨形成蛋白-2、血管内皮生长因子和基础培养基。本发明至少具有如下优势之一：

1)本发明提供一种由多种诱导因子联合应用作用于GMSCs等间充质干细胞，具有协同作用，能有效的诱导间充质干细胞骨向分化，其成骨分化效果显著优于现有常规的诱导方法。

2)GMSCs自体取材方便、易于体外扩增，可以用于自体移植，从而避免了免疫排斥反应。

附图说明

图1示GMSCs形态图；其中，1-1示GMSCs放大40倍图片，1-2示GMSCs放大100倍图片；

图2示GMSCs细胞表面标志物流式检测结果图；其中，2-1～2-6分别示CD146、HLA-DR、CD105、CD34、CD90、CD45的阳性表达率；

图3示对照组和实验组细胞茜素红染色效果图；其中，3-1～3-2分别示对照组1中细胞诱导28天后放大40倍、100倍的图片；

3-3～3-4分别示对照组2中细胞诱导28天后放大40倍、100倍的图片；

3-5～3-6分别示对照组3中细胞诱导28天后放大40倍、100倍的图片；

3-7～3-8分别示对照组4中细胞诱导28天后放大40倍、100倍的图片；

3-9～3-10分别示实验组1中细胞诱导28天放大40倍、100倍的图片；

3-11～3-12分别示实验组2中细胞诱导28天放大40倍、100倍的图片；

3-13～3-14分别示实验组3中细胞诱导28天放大40倍、100倍的图片；

图4示对照组和实验组细胞矿化面积比较(p<0.01)；

图5示不同时间点对照组和实验组的细胞碱性磷酸酶活性比较；

图6示对照组和实验组的OCN、Col-I、Runx2表达水平比较。

具体实施方式

本发明公开了一种成骨诱导培养基及骨向分化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的成骨诱导培养基及骨向分化方法中所用生物材料、试剂和仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 GMSCs原代分离培养、传代及鉴定

1、GMSCs原代分离培养

1)原材料来源：取临床上正畸导萌术切下的牙龈或阻生拔牙需要而切除包绕在恒牙周围的牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。切取的牙龈组织快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中。

其中，3倍双抗浓度为300μ/mL青霉素、300μ/mL链霉素。

2)漂洗：用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中浸泡5min；

其中，3倍双抗浓度为300μ/mL青霉素、300μ/mL链霉素。

其中，间充质干细胞无血清培养基中含有100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素。

3)第一次消化：将牙龈组织剪成1cm³大小，加入适量Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒温摇床中消化45min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，100μm细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。

其中，Ⅰ型胶原酶-Dispase酶的比例为1:1，胶原酶浓度为胶原酶3g/L，Dispase酶浓度为Dispase酶4g/L；

消化环境为37℃，200R恒温摇床中，消化时间为45min；

所用细胞滤网孔径为100μm；

离心速度为1000r/min，离心时间为5min。

4)第二次消化：把步骤3)中过滤下下来未消化的组织加入等体积的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒温摇床中继续消化15min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，70μm细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。

其中，胰蛋白酶与牙龈组织的比例为体积比1:1，胰蛋白酶的浓度为0.125％；

其中，所用细胞滤网孔径为70μm；

其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。

5)接种：步骤3)与步骤4)中收集的细胞用含10ng/mL EGF(表皮生长因子)的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，接种于六孔板，5％CO₂培养箱37℃培养。

其中，基础培养基为间充质干细胞无血清培养基，可市场购买或自制。

其中，完全培养基中EGF(表皮生长因子)的浓度为10ng/mL；

6)纯化：待细胞长满80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min 4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1⁺GMSCs，接种于新的六孔板中，5％CO₂培养箱37℃培养。

2、GMSCs传代

待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入5-10mL含10ng/mL EGF的间充质干细胞无血清培养基，进行细胞计数，按5×10⁴cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO₂培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。培养过程中观察细胞形态，结果如图1所示。细胞接种约4h后开始贴壁，3-4d进入对数生长期，6-8d进入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。大部分细胞呈长梭形，形态不规则。

3、GMSCs表面标志物鉴定

待细胞长满80-90％，收集细胞(约1×10⁶个)，加入3g/L Triton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR抗体各50μL，同时对照组滴加单纯PBS 50μL，4℃处理16h。次日室温放置30min，PBS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常温避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福尔马林固定细胞，流式细胞仪测定抗原的阳性率。试验结果见表1、图2。

检测结果显示，克隆细胞表面抗原CD146、CD105、CD90阳性表达，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，说明本发明中得到的GMSCs属来源于中胚层的间充质干细胞。

表1 GMSCs细胞表面标志物表达率结果

实施例2 GMSCs成骨分化

为了验证本发明成骨分化诱导的效果，同时设置4组对照组和3组实验组，对实验组和对照组进行茜素红染色、碱性磷酸酶活性测定及成骨基因OCN、Col-I的检测。

对照组1：为阴性对照组，为常规培养组，使用的培养液为：含体积分数10％FBS的低糖DMEM培养液。

对照组2：为阳性对照组，为常规间充质干细胞成骨诱导配方，使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸钠，体积分数10％FBS，余量为低糖DMEM培养液。

对照组3：为阳性对照组，使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸钠，100μg/L BMP-2，体积分数10％FBS，余量为低糖DMEM培养液。

对照组4：为阳性对照组，使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/L β-甘油磷酸钠，20μg/L VEGF，体积分数10％FBS，余量为低糖DMEM培养液。

实验组1中使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸钠，50μg/L BMP-2，10μg/L VEGF，体积分数10％FBS，余量为低糖DMEM培养液。

实验组2中使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸钠，100μg/L BMP-2，20μg/L VEGF，体积分数10％FBS，余量为低糖DMEM培养液。

实验组3中使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸钠，150μg/L BMP-2，30μg/L VEGF，体积分数10％FBS，余量为低糖DMEM培养液。

各组培养液的配方如表2：

表2各组培养液的配方

试验方法及结果：

(一)茜素红染色

取实施例1制备的第3代GMSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于6孔培养板内，培养至细胞达到60％～70％融合以上时，各组分别更换表2所示成骨诱导液。诱导分化培养28d对细胞进行茜素红染色。茜素红染色的具体方法为：

弃培养液，用PBS清洗细胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定10-15min；吸弃多聚甲醛，PBS清洗3次；加入2％茜素红，37℃孵育30min。孵育结束后吸弃残液，用37℃预热的去离子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置显微镜下观察并采集图像。各组细胞染色效果如图3。

使用图像分析软件Image-Pro-Plus 5.0(Media Cybernetics,美国)对各组3个复孔中的细胞进行矿化结节面积计算。矿化结节面积如表3和图4所示。

表3矿化面积计算结果

注：*，**表示P﹤0.01。

由表3和图3、图4可知，对照组1不含诱导因子，不对细胞进行成骨分化诱导，因此，没有着色，矿化面积为零。对照组3、4与对照组2无显著性差异，说明在常规诱导培养基的基础上添加单一的BMP-2或VEGF均没有明显提高GMSCs成骨分化能力；各实验组与各对照组之间均有极显著性差异(*，p﹤0.01)，说明在常规诱导培养基的基础上同时添加BMP-2和VEGF两种因子能够有效提高GMSCs成骨分化能力；实验组2与实验组1、3有极显著性差异(**，p﹤0.01)，说明BMP-2和VEGF两者联合作用下，合理的浓度搭配比过高或过低浓度搭配更能有效的提高GMSCs成骨分化能力；实验组2中的矿化面积均值为82.63±1.48％，是对照组2矿化面积的1.96倍，说明本发明实验组2所示的成骨分化诱导液进行成骨分化诱导的效果最好。

(二)碱性磷酸酶活性(ALP)测定

对各组GMSCs分别于诱导分化培养0d、14d、21d和28d对细胞进行碱性磷酸酶活性定量测定。具体测定方法为：

弃原培养液，PBS洗3次，每孔加200μL 0.2％TritonX-100，37℃孵育1h，镜下可见细胞裂解完全，吸出裂解液至新离心管，离心后取上清，留作备用。

对上述裂解液进行蛋白含量测定，于96孔板中进行。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书要求设置测定孔、标准孔和空白孔，每组设3个复孔，每孔液体20μL，37℃孵育30min后检测562nmOD值，空白孔调零。根据标准孔OD值绘制蛋白浓度标准曲线，代入各孔OD值，算出各组的蛋白浓度。

对上述裂解液进行碱性磷酸酶活性测定，于96孔板中进行。按碱性磷酸酶测定试剂盒说明书要求设置测定孔、标准孔和空白孔，37℃孵育15min，每组设3个复孔，每孔加150μL显色液，轻轻震荡孔板混匀。检测520nmOD值，空白孔调零。根据以下公式计算碱性磷酸酶活性：

碱性磷酸酶活性(U/gprot)＝(测定孔吸光度-空白孔吸光度)÷(标准孔吸光度-空白孔吸光度)×酚标准品浓度÷待测样本蛋白浓度(gprot/mL)。

实验结果如表4和图5所示。

表4不同时间点各组细胞碱性磷酸酶活性

实验结果表明，细胞培养14d、21d、28d后，在同一时间内，各诱导组与未诱导组(对照组1)碱性磷酸酶的活性均有极显著性差异(7.44±0.06，p﹤0.01)，实验组1、3与各对照组有极显著性差异(^※，p﹤0.01)，实验组2与实验组1、3有极显著性差异(^※※，p﹤0.01)，实验组2与其他各组均有极显著性差异(**，p﹤0.01)。碱性磷酸酶活性随细胞培养时间增加而升高，但未诱导组(对照组1)上升不明显，实验组2显著升高。

(三)成骨基因OCN、Col-I的检测

各组GMSCs分别于诱导分化培养28d后，RT-PCR法检测成骨细胞标志性基因OCN、Col-I、Runx2的表达。按TRIzol试剂盒说明书进行细胞总RNA提取，M-MLV反转录试剂盒获得cDNA。按SYBR Green定量PCR试剂盒说明书对成骨细胞标志性基因OCN、Col-I、Runx2表达水平进行检测。β-actin作为内参基因。2-△△Ct法定量分析。

表5引物序列表

实验结果如图6所示。由图6可知，细胞培养28d后，各诱导组与未诱导组(对照组1)比较，成骨细胞标志性基因OCN、Col-I表达水平均有极显著性差异(*，p﹤0.01)，实验组1、3与各对照组比较，均有极显著性差异(※，p﹤0.01)，实验组2与其他各诱导组均有极显著性差异(**，p﹤0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种成骨诱导培养基，其特征在于，包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、骨形成蛋白-2、血管内皮生长因子和基础培养基。

2.根据权利要求1所述的成骨诱导培养基，其特征在于，所述成骨诱导培养基中各组分的用量为：

维生素C：10～100μg/L；

地塞米松：(1～10)×10-⁸mol/L；

β-甘油磷酸钠：1～20mol/L；

骨形成蛋白-2：50～150μg/L；

血管内皮生长因子：10～30μg/L；

基础培养基：补足。

3.根据权利要求1或2所述的成骨诱导培养基，其特征在于，所述成骨诱导培养基中各组分的用量为：

维生素C：50μg/L；

地塞米松：1×10-⁸mol/L；

β-甘油磷酸钠：10mol/L；

骨形成蛋白-2：50～150μg/L；

血管内皮生长因子：10～30μg/L；

基础培养基：补足。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的成骨诱导培养基，其特征在于，所述成骨诱导培养基中各组分的用量为：

维生素C：50μg/L；

地塞米松：1×10-⁸mol/L；

β-甘油磷酸钠：10mol/L；

骨形成蛋白-2：100μg/L；

血管内皮生长因子：20μg/L；

基础培养基：补足。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的成骨诱导培养基，其特征在于，所述基础培养基为含有10％体积分数FBS的低糖DMEM培养基。

6.一种诱导间充质干细胞骨向分化的方法，其特征在于，采用权利要求1至5中任一项成骨诱导培养基培养间充质干细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为牙龈间充质干细胞。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为第2～5代间充质干细胞。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的接种密度为(1～10)×10⁴cell/mL。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的培养温度为37℃，培养时间不低于14天。