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CN109628405A - 神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化中的应用 - Google Patents

神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化中的应用 Download PDF

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CN109628405A
CN109628405A CN201811572836.3A CN201811572836A CN109628405A CN 109628405 A CN109628405 A CN 109628405A CN 201811572836 A CN201811572836 A CN 201811572836A CN 109628405 A CN109628405 A CN 109628405A
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CN
China
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umbilical cord
nerve growth
mesenchymal stem
stem cells
growth factor
Prior art date
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Application number
CN201811572836.3A
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陈浩浩
郑群
傅晓艳
张宁
王文倩
丁明星
邹立波
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Jinhua Polytechnic
Original Assignee
Jinhua Polytechnic
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一种神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化中的应用，属于生物技术领域。本发明实验发现，经慢病毒介导的神经生长因子过表达脐带间充质干细胞在神经因子Nestin、GFAP、MAP2和Tubulin的mRNA转录上均显著增加，证明神经生长因子具有促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的功能。

Description

神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化 中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化中的应用。
背景技术
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是最早被发现的一种神经细胞生长调节因子，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要调控作用。
脐带间充质干细胞(UmbilicalCord Mesnchymal Stem Cells，UCMSCs)是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。脐带间充质干细胞具有取材方便，无伦理学争议等优点，在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。
脐带间充质干细胞向神经元样细胞的分化能实现对受损神经元细胞的修复。提供一种新的促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞的分化的方法具有重要的医学意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化中的应用。
优选的，所述神经生长因子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述应用包括如下步骤：
(1)将具有神经生长因子编码功能的核苷酸序列导入到慢病毒载体中，得到重组载体；
(2)用所述重组载体转染脐带间充质干细胞，得到转染细胞；
(3)对转染细胞进行培养。
优选的，所述重组载体按照CMV-MCS-NGF-3flag的元件顺序连接。
优选的，所述步骤(3)中培养用培养基为添加有0.8～1.2％体积含量的青链霉素和5～15％体积含量胎牛血清的DMEM/F-12培养基。
优选的，所述步骤(3)中培养的温度为36～38℃；培养环境中的CO2含量为3～8％。
有益效果：本发明提供了一种神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化中的应用。本发明实验发现，经慢病毒介导的神经生长因子过表达脐带间充质干细胞在神经因子Nestin、GFAP、MAP2和Tubulin的mRNA转录上均显著增加，证明神经生长因子具有促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的功能。
附图说明
图1为本发明实施例1所述脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定结果；
图2为本发明实施例3所述荧光显微观测结果；
图3为本发明实施例4所述ELISA法检测细胞上清液β-NGF含量结果；
图4为本发明实施例4所述westernblot检测细胞NGF蛋白的表达量图谱结果；
图5为根据图4计算灰度值得出的细胞NGF蛋白的表达量结果；
图6为本发明实施例4所述qRT-PCR检测ngfmRNA的表达量结果；
图7为本发明实施例4所述qRT-PCR检测神经因子Nestin、GFAP、MAP2和Tubulin的mRNA的表达量结果。
具体实施方式
本发明提供了一种神经生长因子促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的应用。在本发明中，所述神经生长因子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，SEQ ID NO.1所示序列是通过Pubmed检索Human ngfmRNA序列获得，序列编号为XM_006710663.3，长度为943bp。
在本发明中，所述应用优选包括如下步骤：
(1)将具有神经生长因子编码功能的核苷酸序列导入到慢病毒载体中，得到重组载体；
(2)用所述重组载体转染脐带间充质干细胞，得到转染细胞；
(3)对转染细胞进行培养。
本发明先将具有神经生长因子编码功能的核苷酸序列导入到慢病毒载体中，得到重组载体。在本发明中，所述慢病毒载体优选为Hanbio Biotechnology公司提供的pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体。所述NGF编码序列的插入位点优选为MCS区，由CMV启动子调控表达。
得到重组载体后，本发明用所述重组载体转染脐带间充质干细胞，得到转染细胞。本发明对具体的转染方法不做特别限定，本领域常规操作均可。本发明对所述脐带间充质干细胞的来源不做特别限定，合法渠道来源的具有生物活性的脐带间充质干细胞均可。
得到转染细胞后，本发明对转染细胞进行培养。在本发明中，所述培养用培养基优选为添加有青链霉素和胎牛血清的DMEM/F-12培养基。在本发明中，所述青链霉素中青霉素的量优选为8000～12000U/mL，更优选为10000U/mL；所述青链霉素中链霉素的量优选为8～12mg/mL，更优选为10mg/mL。所述青链霉素在所述DMEM/F-12培养基中的体积含量优选为0.8～1.2％，更优选为1％；所述胎牛血清在DMEM/F-12培养基中的体积含量优选为5～15％，更优选为10％。本发明对所述青链霉素、胎牛血清和DMEM/F-12培养基的来源没有特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述青链霉素、胎牛血清和DMEM/F-12培养基均购买自Thermo Fisher Scientific,Inc，其中，所述青链霉素的货号为15140-122，所述胎牛血清的货号为12662-029，所述DMEM/F-12培养基的货号为11320-033。在本发明中，所述培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述培养环境中的CO2含量优选为3～8％，更优选为5％。
本发明经实验发现，慢病毒介导的神经生长因子过表达脐带间充质干细胞在神经因子Nestin、GFAP、MAP2和Tubulin的mRNA转录上较对照组和空白组均显著增加，证明神经生长因子具有促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的功能。
下面结合实施例对本发明提供的一种神经生长因子促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明所用脐带组织为健康产妇自愿捐赠，由金华市思丹姆干细胞生物科技有限公司提供。在本发明的各项实施例中，DMEM/F-12、胎牛血清(FBS)、胰酶、青链霉素均购自Thermo Fisher Scientific,Inc；CD34、CD45、CD19、CD14、CD105、CD90、CD73荧光素偶联抗体购自BD Biosciences；NGF、GAPDH抗体及二抗购自Abcam公司。Humanβ-NGF ELISA检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司，BIO-RAD逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自Bio-Rad Laboratories,Inc.，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例1
脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定：
取脐带组织，用PBS液清洗组织3遍，用眼科剪刀将组织标本剪碎。将剪碎的脐带组织转移至细胞分离管中，加入2mL基础培养基(DMEM/F-12+10％胎牛血清+1％青链霉素)后，组织分离器搅拌3次(每次45s)。然后将组织转移至50mL离心管中加入适量PBS，300g离心15min，弃上清。再加入PBS重复洗涤3次，加基础培养液，置于37℃、5％CO2培养箱培养。待细胞汇合度达到80％以上，收集细胞并传代；传至第3代时，收集细胞用于流式细胞仪检测，观察细胞表面分子CD34、CD45、CD19、CD14、CD105、CD90、CD73的表达情况。
流式细胞术鉴定间充质干细胞的结果如图1所示。其中，图1-A显示细胞表面标记CD34(PE)和CD45(FITC)都为阴性；图1-B显示细胞表面标记CD14(APC)为阴性而CD73(PE)为阳性；图1-C显示细胞表面标记CD19(APC)为阴性而CD105(PE)为阳性；图1-D显示细胞表面标记CD90(FITC)为阳性。根据流式细胞术的结果，可以认定收集的细胞为脐带间充质干细胞。
实施例2
神经生长因子过表达慢病毒载体的构建及细胞转染：
通过Pubmed检索Human ngf mRNA序列为XM_006710663.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_006710663.3)；核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，长度为943bp。
采用pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体(购买自hanbiobiotechnology)，委托杭州赫贝生物技术公司构建合成，最终得到滴度为1×108TU/mL的病毒颗粒。
对鉴定后的细胞传代扩增，收集细胞，配成5×105cells/mL细胞悬液，接种于6孔板中，4h后换液，弃去部分培养基，加MOI值10的病毒液及8ng/mLPolybrene(购买自Sigma-Aldrich,Merck KGaA；货号107689Sigma)，其中转染组携带NGF，对照组只携带GFP。培养6h后，换液，继续培养72h，收集细胞用于后续实验。
实施例3
将实施例2收集的部分细胞接种于小圆玻片铺片的24孔培养板中，待细胞快长满玻片时，吸出上清，用4％的多聚甲醛固定，抗体封闭液37℃封闭1h，加兔抗NGF抗体(1:200，Abcam)4℃过夜，PBS洗3次，TRITC标记山羊抗兔二抗(1:50，Abcam)，37℃温育1h，PBS洗3次，加DAPI染色液(100ng/mL)，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜观察。
荧光显微镜观测结果见图2。其中，图2-A为GFP显色结果(绿色)；图2-B为NGF抗体标记显色结果(TRITC标记，红色)；图2-C为细胞核显色结果(DAPI染细胞核，蓝色)；图2-D为图2-A、图2-B和图2-C三图的叠加图。图2所示标尺长度为20μm。图2结果说明，慢病毒转染72h后，脐带间充质干细胞表达GFP的同时有NGF表达，转染成功。
实施例4
(1)ELISA法检测细胞上清液β-NGF含量：
收集实施例2所述继续培养72h的培养液上清，BCA法检测各样本(转染组、对照组和空白组)的总蛋白浓度。采用Humanβ-NGF ELISA检测试剂盒，参照试剂盒内步骤进行。酶标仪450nm波长读取OD值，绘制标准曲线，计算各样本NGF含量(pg/mL)，最终结果以NGF含量和总蛋白浓度的比值表示每mg蛋白中NGF的含量(pg/mg)。
经ELISA试剂盒检测，得到各样本的OD值。通过换算得出转染组为747.61±208.74pg/mg，而对照组为1.48±0.57pg/mg，空白组为2.04±0.29pg/mg(详见图3)。表明转染组细胞上清液β-NGF的含量显著性增加(P<0.01)。
(2)westernblot检测细胞NGF蛋白的表达量：
收集实施例2得到的部分细胞，加入蛋白裂解液100μL，裂解10min；4℃，12000g条件下离心5min；取上清，BCA法测定蛋白质浓度。取等量蛋白，加5×SDS loading buffer沸水浴变性5min，进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为80V，30min，直至所有样品压成一线，120V，100min；冰盒转膜，200mA，60min；用5％脱脂奶粉室温封闭60min；用兔抗NGF(1:1000，Abcam)、小鼠抗GAPDH(1:1000，Abcam)4℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10min；HRP标记山羊抗兔(1:5000，Abcam)、HRP标记山羊抗小鼠(1:5000，Abcam)，37℃孵育1h；TBST洗3次，每次10min；ECLA液、B液，5min；显影液3min；定影液3min；拍照，照片如图4所示。根据图4计算灰度值，结果如图5所示。图5表明，与对照组相比较，转染组细胞NGF表达显著性增加(P<0.01)，而对照组和空白组之间没有显著性差异。
(3)qRT-PCR检测ngfmRNA及神经因子Nestin、GFAP、MAP2和Tubulin的mRNA的表达量：
收集实施例2得到的部分细胞，Trizol法提取总RNA；取2μL RNA酶标仪测定RNA溶液浓度，采用逆转录试剂盒，管中加入4μL 5×iScript Reaction Mix、1μL iScriptReverse Transcriptase、1μg RNA以及RNase free ddH2O至20μL。在PCR仪上进行逆转录反应：25℃5min，46℃20min，95℃1min。取反转录得到的cDNA各2μL作为模板，分别10μM引物1μL(引物序列见表1)，2×iTaqTM universal SYBR@Green supermix 10μL，ddH2O 7μL，95℃5s，60℃30s，40个循环，PCR仪上进行扩增。每个样品的Ct值从内参基因的值中减去得到ΔCt，然后比较2-ΔΔCt值。
表1由Primer Premier 6设计的特异性引物序列
qRT-PCR检测ngfmRNA的表达结果如图6所示。图6表明，相对于对照组和空白组，转染组细胞NGF mRNA表达显著性增加(P<0.01)，而对照组和空白组之间没有显著性差异。该结果与ELISA及Westernblot结果一致。
转染组神经因子Nestin、GFAP、MAP2和Tubulin的mRNA表达结果如图7所示。图7表明，转染组神经因子Nestin、GFAP、MAP2和Tubulin的mRNA表达量也显著增加(P<0.01)，而对照组和空白组之间没有显著性差异。说明NGF的过表达促进了脐带间充质干细胞向神经元样细胞转化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 金华职业技术学院
<120> 神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 943
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggcgctccg gcacagcaga gagcgctggg agccggaggg gagcgcagcg gtgcatagcg 60
taatgtccat gttgttctac actctgatca cagcttttct gatcggcata caggcggaac 120
cacactcaga gagcaatgtc cctgcaggac acaccatccc ccaagcccac tggactaaac 180
ttcagcattc ccttgacact gcccttcgca gagcccgcag cgccccggca gcggcgatag 240
ctgcacgcgt ggcggggcag acccgcaaca ttactgtgga ccccaggctg tttaaaaagc 300
ggcgactccg ttcaccccgt gtgctgttta gcacccagcc tccccgtgaa gctgcagaca 360
ctcaggatct ggacttcgag gtcggtggtg ctgccccctt caacaggact cacaggagca 420
agcggtcatc atcccatccc atcttccaca ggggcgaatt ctcggtgtgt gacagtgtca 480
gcgtgtgggt tggggataag accaccgcca cagacatcaa gggcaaggag gtgatggtgt 540
tgggagaggt gaacattaac aacagtgtat tcaaacagta cttttttgag accaagtgcc 600
gggacccaaa tcccgttgac agcgggtgcc ggggcattga ctcaaagcac tggaactcat 660
attgtaccac gactcacacc tttgtcaagg cgctgaccat ggatggcaag caggctgcct 720
ggcggtttat ccggatagat acggcctgtg tgtgtgtgct cagcaggaag gctgtgagaa 780
gagcctgacc tgccgacacg ctccctcccc ctgccccttc tacactctcc tgggcccctc 840
cctacctcaa cctgtaaatt attttaaatt ataaggactg catggtaatt tatagtttat 900
acagttttaa agaatcatta tttattaaat ttttggaagc atc 943
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggagcaag cggtcatca 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtcttatcc ccaacccaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgacgtggac atccgcaaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctggaaggtg gacagcgagg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagcactct taacttacg 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tattcctaca gcctccattc 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cactcaatgc tggcttca 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgactcaat cttcctctc 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacacgacac aacgaact 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggagaagga ggcagatta 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acacggatga gacctact 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgttcttgct ctggatgg 18

Claims (6)

1.神经生长因子在促进脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经生长因子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将具有神经生长因子编码功能的核苷酸序列导入到慢病毒载体中，得到重组载体；
(2)用所述重组载体转染脐带间充质干细胞，得到转染细胞；
(3)对转染细胞进行培养。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体按照CMV-MCS-NGF-3flag的元件顺序连接。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中培养用培养基为添加有0.8～1.2％体积含量的青链霉素和5～15％体积含量胎牛血清的DMEM/F-12培养基。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中培养的温度为36～38℃；培养环境中的CO2含量为3～8％。
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